FR2504142A1 - Ribonucleotides d'analogues de lincomycine et clindamycine, leur preparation et composition pharmaceutique les contenant - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A DES 3-(5-RIBONUCLEOTIDES) D'ANALOGUES DES SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES LINCOMYCINE ET CLINDAMYCINE, A LEUR PREPARATION AINSI QU'A LA COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES CONTENANT. SUIVANT L'INVENTION, CES RIBONUCLEOTIDES S'AVERENT HAUTEMENT ACTIFS VIS-A-VIS DE STREPTOCOCCUS HEMOLYTICUS ET DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN VIVO.

Description

i Les caractéristiques et la préparation de la substance antibiotique

lincomycine sont décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 086 912 La clin- damycine est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 496 163 Ces antibiotiques ont été

largement utilisés comme médicaments pour les êtres hu-

mains et les animaux Un certain nombre de brevets dans

le monde entier ont été délivrés concernant ces substan-

ces antibiotiques et une série de leurs dérivés.

Les formules structurales de la lincomnycine ( 1) et de la clindamycine ( 2) sont données dans le Schéma 1 ci-après: Schéma 1 Ilia CH 3 H N H i I

HO-C-H

-N C-H

H H 6

HO H

K n ( 1) H OH

CH 3 CH 3

H H 1

t CH 3 H-C-Cl

H I

-N _ C-H ( 2)

H)H 2

H HO HO

H S CH 3

H OH

Des 3-nucléotides de lincomycine et de clin-

damycine sont décrits et revendiqués dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 671 647 Tous les composés

de lincomycine et de clindamycine décrits dans le bre-

vet des Etats-Unis d'Amérique n 3 671 647 ont le frag-

ment d'acide hydraté du type propyle On a constaté au moyen d'essais contre S aureus in vivo que ces 3-nucléotides avaient une activité de l'ordre d'un

dixième du composé dont ils proviennent.

La présente invention est relative aux 3-ribo-

nucléotides de composés du type lincomycine et clindamy-

cine dans lesquels le fragment d'acide hydraté du type

propyle a été remplacé par différents aminoacides cy-

cliques D'une façon inattendue, ces nucléotides mon-

trent une activité antibactérienne in vivo aussi éle-

vée que les composés dont ils proviennent A cau-

se de ces caractéristiques hautement significatives,

les nucléotides de la présente invention sont considé-

rés comme pouvant être des composés de premier ordre pour une utilisation en médecine Ces composés sont

également intéressants pour le traitement prophylacti-

que et thérapeutique des sujets porteurs d'un parasite protozoaire Par exemple, lorsque le protozoaire est un parasite malarien, les sujets peuvent être des animaux, par exemple des souris infectées par

Plasmodium berqhei, des oiseaux, par exemple des ca-

nards infectés par P lophurae et des poulets infectés par P qallinaceum, des mammifères, tels que des primates, par exemple des singes infectés par P cvnomolqi, et des êtres humains infectés par P falciparum, P.

vivax et P malariae.

la Les mammifères porteurs d'un parasite protozo-

aire de la classe des parozoairs,de l'ordre des coccidies (un microparasite produisant la coccidiose) peuvent être traités par administration des composés de la présente

invention On peut, par exemple, traiter le bétail con-

taminé par Eimeria zurnn,E bovis, E ellipsoidalis, les moutons et chèvres contaminés par E_ parva, E faurei, les porcs contaminés par E debliecki, E -scabra et Isospora suis, les chiens et chats contaminés par Isospora biqemina, I felis, EB canis, E felina, la volaille contaminée par E tenella, les lapins contaminés par E_ stiedae, E perforans, et le vison contaminé par

E mustelae.

Les composés du type lincomycine et clinda-

mycine qui peuvent être convertis en les 3-ribonucléoti-

desosont représentés dans le Schéma 2: Schéma 2 R 2 o R 1, qui peut être simplement substitué ou substitué de façon multiple en n'importe quelle position du noyau de pyridine non déjà substitué par R 2, est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, les radicaux alkyle et les radicaux alkyle substitués, o la portion alkyle comporte de 1 à 8 atomes de carbone inclusivement, et leurs formes isomères, les radicaux cycloalkyle et cy- cloalkyle substitués, les oxygènes substitués, les azotes substitués, les halogènes, le phényle et les phényl 6 substitués, les groupes -(CH 2)n-OH, -(CH 2) -NR 4 R 5 et leurs formes isomères, dans lesquels N est un nombre entier de 1 à 8 inclusivement, R 4 et R 5 représentent H ou un groupe alkyle de 1 à 8 atomes de carbone inclusivement,ou; leurs formes isomères; R 2,

qui peut être simplement substitué en une position quel-

conque du noyau de pyridine non déjà substitué par R 1, représente le groupe: et X représente la fonction amino d'un composé choisi parmi les 7 (R)-hydroxy-méthyl l-thio-a-lincosaminide,

7 (S)-hydroxy-méthyl l-thio-ac-lincosaminide, 7 (S)-halo-

méthyl l-thio-a-lincosaminide, 7 (R)-halo-méthyl l-thio-

a-lincosaminide, 7 (S)-méthoxy-méthyl l-thio-a-linco-

saminide, 7-désoxy-7 (S)-(méthylthio)-méthyl 1-thio-a-

lincosaminide, 7-désoxy-7 (S)-( 2-hydroxyéthylthio)-

méthyl l-thio-a-lincosaminide et 7-désoxy-7 (S)-( 3-

hydroxypropylthio)-méthyl l-thio-a-lincosaminide, et leiis

sels pharmaceutiquement acceptables.

CH 2) ns R 2 N O R 1 et R 2, qui peuvent être en position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 du noyau, sont tels que définis précédemment,

R 3 est choisi parmi les radicaux H, CH 3, C 2 H 5 et -CH 2-

CH 2-OH, N est un nombre entier de 1 à 4 inclusivement, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. R. R 2 Ri

E A

B

o R A, B et E sont choisis parmi l'azote, l'oxygène, le

soufre et CR 1 R, R 1 et R 2 sont tels que définis précé-

demment, et peuvent être fixés à un atome de carbone ou d'azote cyclique quelconque, R 1 peut être relié par une

liaison multiple à un atome de carbone cyclique quelcon-

que, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Ri

R 2

EBA o A, B, D et E sont choisis parmi l'azote, l'oxygène,

le soufre et CR 1 R 1, R 1 et R 2 sont tels que définis pré-

cédemment et peuvent être reliés à un atome de carbone ou d'azote cyclique quelconque, R 1 peut être relié par une liaison multiple à un atome de carbone cyclique, et

leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

A la place du radical hydroxyle en position

3 du fragment de lincosaminide, on y a substitué un nu-

cléotide choisi dans le groupe comprenant l'acide adény-

lique, l'acide guanylique, l'acide cytidylique et l'aci-

de uridylique.

Les 3-ribonucléotides de la présente inven-

tion peuvent être préparés par des processus de trans-

formation microbiologiques Les 3-( 5 '-ribonucléotides) obtenus par transformation du composé U-57930 sont re- présentés dans le Schéma 3 ciaprès: Schéma 3

C

CH 2 CH 3 CH 3

CH:3 s '043 H-C-C 1 i' 2 '

N N CONH-CH

,H HO

HO SH 3

1: R=H

OH OH

NH 2 NH 2

L 4 N

0 "

Il I'

2: R= -P-O-CH 2 -P-O-CH 2

o 3: R H OH b-H t '

OH OH N

OH OH

OH OH

| 1 6

N N 5 NXN

d Nt X 6 NH N 1 N Fie il Il

4: R= -P-O-CH 2 5: R= -P-O-CH 2

-, 5 ' Q

OH W 'OH

2 2

OHOH OH OH

1: U-57930

2: 3-( 5 '-cytidylate) de U-57930 3: 3-( 5 ' adénylate) de U-57930 4: 3-(5 '-uridylate) de-U-57930 3-( 5 '-gwanylate) -de U-57930 Les composés apparentés décrits dans le Schéma 2 peuvent 8 tre préparés par les procédés décrits dans la demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique

n 148 056.

Les 3-( 5 '-ribonucléotides) des composés du Schéma 2 peuvent 8 tre préparés en suivant les procédés décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique

n 3 671 647 Les sels de ces nucléotides peuvent égale-

ment être préparés suivant les procédés du brevet des

Etats-Unis d'Amérique n 3 671 647.

On peut obtenir des formulations des nucléo-

tides de la présente invention suivant les exemples de

composition donnés dans la demande de brevet aux Etats-

Unis d'Amérique n 148 056 Les formulations sont pré-

parées en substituant un nucléotide de l'invention au composé actif dans les exemples La substitution peut

se faire sur une base équimolaire.

Les processus de détermination et de carac-

térisation généraux que l'on peut utiliser poui déter-

miner et caractériser les nucléotides de l'invention sont donnés ciaprès: Détermination des 3-( 5 '-ribonucléotides)

Puisque les 3-ribonucléotides de la présen-

te invention n'ont pas d'activité antibactérienne in vitro, leur formation à partir des composés apparentés actifs du point de vue antibactérien peut être suivie

aisément en mesurant la perte de cette activité anti-

biotique Pour déterminer les quantités de composé.

apparenté actif du point de vae antibactérien dans des mélanges de réaction ou filtrats de culture, on

utilise un essai standard avec Sarcina lutea ATCC 9341.

Pour déterminer la présence des 3-ribonucléotides dans

des bières de fermentation, extraits et matières pu-

rifiées, on hydrolyse d'abord la liaison phosphodi-

ester avec de la phosphatase alcaline, ou bien avec de la phosphodiestérase provenant de venin de serpent,

par les procédés décrits ci-après Le composé antibac-

tériennement actif dans l'hydrolysat est déterminé par

un essai standard.

Hydrolyses enzymatiques

Phosphatase alcaline: Des solutions de ré-

serve ( 0,5 mg/ml; 0,54 unité/mg) de phosphatase alcaline d'intestin de pigeon, EC 3 1 3 1 (Sigma) sont préparées

dans un tampon de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)-

aminométhane, 0,01 M de p H 8,0 Les solutions à trai-

ter sont diluées-à 1/2 avec le mélange de tampon et d'en-

zyme et son incubas à 28 C pendant 18 heures.

Phosphodiestérase de venin de serpent: Des solutions de réserve ( 100 mg/ml; 0,026

unité/mg) de phosphodiestérase de venin de serpent puri-

fiée EC 3 1 4 1 (Sigma) sont préparées dans de l'eau dis-

tillée Les mélanges d'incubation contiennent 0,2 ml d'une solution ( 1 mg/ml) de l'échantillon à traiter dans de l'eau, 0,6 ml de tampon trischlorhydrate 0,01 M, p H 9,0, 0,1 ml de Mg C 12 0,3 M, et 0,1 ml de la solution de réserve enzymatique L'incubation est réalisée à

37 C pendant 18 heures.

Phosphodiestérase de rate: Des solutions de réserve de phosphodiestérase de rate EC 3 1 4 18 (Sigma) sont préparées ( 1 mg/ml; 19,6 unités/mg) dans de l'eau distillée Les mélanges d'incubation contiennent 0,4 ml d'une solution ( 0,5 mg/ ml) de l'échantillon à traiter dans de l'eau, 0, 5 ml de

tampon Tris 0,02 M, p H 7,0 et 0,1 ml de la solution de ré-

serve enzymatique L'incubation est réalisée à 37 C pen-

dant 18 heures.

Analyse chromatographique sur couche mince des Préparations et Hydrolysats enzymatiques

La production et la purification des 3-ribo-

nucléotides sont suivies d'un essai contre S lutea

(voir ci-dessus) et d'une chromatographie sur couche min-

ce utilisant du gel de silice G et un mélange de méthyl éthyl cétoneacétone-eau ( 186/52/20 en volume/volume) ou d'acétate d'éthyle-acétoneeau ( 8/5/1) comme systèmes solvants Les composés apparentés biologiquement actifs sont décelés par bioautographie sur de l'agar ensemencé

avec S lutea.

Les produits d'hydrolyse enzymatique ou chimi-

que des 3-nucléotides sont séparés par les systèmes de chromatographie sur couche mince suivants: A: plaques de gel de silice GF (Analtech Inc);

eau comme système solvant.

B: plaques de gel de silice GF; alcool n-

propylique-hydroxyde d'ammonium concentré-eau ( 55/10/35; volume/volume). C: cellulose 300 NM-Polygram (Brinkman Instruments Inc); l-butanol-eauacide formique ( 77/13/

; volume/volume).

Les matières absorbant dans l'ultraviolet

sont décelées par une lampe UV à courte longueur d'onde.

Les matières n'absorbant pas dans l'ultraviolet, inac-

o 10 tives du point de vue biologique sont décelées par un

réactif sous forme de pulvérisation à base de perman-

ganate-periodate Les matières nucléotidiques biolo-

giquement actives sont décelées par bioautographie sur

de l'agar ensemencé avec S lutea.

L'exemple suivant montre les processus de fer-

mentation et de purification utilisés pour la prépara-

tion du nucléotide du composé appelé U-57930 E La formule structurale du composé U-57930 E est donnée dans le Schéma 3 En suivant les procédés de cet exem Fle,

ou bien des processus équivalents à ceux-ci, on peut ob-

tenir les 3-ribonucléotides des autres composés représen-

tés dans le Schéma 2.

L'exemple suivant illustre le procédé et les produits de l'invention, mais ne constitue en aucun cas une limition à celle-ci Tous les pourcentages sont en

poids et toutes les proportions des mélanges de sol-

vants sont en volume, sauf indications contraires.

Exemple 1

A Processus de fermentation On fait crottre Streptomyces rochei, NRRL 3533, dans un milieu formé de glucose, 10 g/litre, de peptone Difco, 4 g/litre, d'extrait de levure de Difco, 4 g/litre, de Mg 504 7 H 20, 0,5 g/litre, de KR 2 P 04, 2,0 g/ litre, et de K 2 HP 04, 4 g/litre, pendant 3 jours à 28 C sur une secoueuse rotative Le mycélium provenant de cette croissance est utilisé pour inoculer un milieu de fermentation contenant les mêmes ingrédients On ré- alise la fermentation pendant 48 heures à 28 C sur une

secoueuse rotative A la fin de cette période d'incuba-

tion de 48 heures, on ajoute du U-57930 à une concen-

tration finale de 50 mg/litre et l'on poursuit la fermen-

tation à 32 C Après 12 heures, on ajoute une quantité supplémentaire de U-57930 pour obtenir la concentration totale de 150 mg/litre Après une nouvelle période de

12 heures, la concentration en U-57930 est élevée jus-

qu'à 250 mg/litre On poursuit la fermentation à 320 C

pendant 24 heures après la dernière addition de U-57930.

A ce moment, on recueille les filtrats de la culture et on constate qu'ils ne contiennent pas plus de 1 mg/

litre de U-57930 Les 249 mg/litre restants sont con-

vertis en matière biologiquement inactive.

S rochei, NRRL 3533, est un microbe connu qui est disponible au public sur demande sous le numéro de dépôt NRRL L'adresse de ce dépôt est la suivante: Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, Département U S d'Agriculture, Peoria, Ill U S A. B Processus d'isolement et de purification Isolement des 3-ribonucléotides de U-57930 à partir de bouillon de fermentation _ Adsorption sur Amberlite XAD-2: Du bouillon

de fermentation (environ 12 litres) contenant 3 g de U-

57930 inactivé est filtré au p H de récolte ( 7,7) en uti-

lisant un adjuvant pour filtrage Le gateau mycélien est lavé avec 1,2 litre d'eau et écarté Le filtrat clair et le lavage sont combinés et ajustés à p H de 6,0 et amenés sur une colonne préparée à partir de 600 ml d'Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co, Philadelphie, PA),

à un débit de 40 ml/minute Le liquide épuisé est tes-

té pour son activité biologique avant et après traite- ment avec de la phosphatase alcaline et est écarté La colonne est lavée avec 2 litres d'eau On constate également que le lavage aqueux est biologiquement inactif

avant et après traitement avec de la phosphatase alcali-

ne et on l'écarte La colonne est ensuite éluée avec

un mélange de méthanol et d'eau ( 70/30 en volume/volume).

On recueille des fractions de 20 ml à un taux de 20 ml/ minute L'essai relatif à l'activité biologique avant (-E) et après (+E) traitement avec de la phosphatase alcaline donne les résultats suivants: Zone (S lutea) Fraction No -E +E O o

O O

11 O O

13 O 36

33 55

32 54

31 50

29 48

26 39

23 38

60 21 37

19 27

17 26

17 26

2504 142

Zone (S lutea) Fraction No -E +E

16 26

16 26

16 26

16 26

16 26

110 16 21

15 21

15 21

15 21

15 21

15 21

15 21

15 21

190 15 21

15 21

Les fractions 12 à 80 sont combinées, con-

centrées en une solution aqueuse et séchées par congé-

lation pour donner la préparation ADA-34,1, 12,22 g.

Dans une autre série d'expériences, on traite 6 litres de bouillon de fermentation contenant 2 g de U-57930 "inactive" comme décrit ci-dessus Les éluats méthanoliques provenant de la colonne d'Amberlite XAD-2 sont gardés comme ADA-143 B Cette solution n'est pas concentrée à sec; à la place de cela, elle est purifiée

par chromatographie sur Dowex-l, comme décrit ci-après.

Chromatoqraphie sur Dowex-l: On prépare la colonne à partir de 300 ml de Dowex-l (X-4) sous la

forme acétate On fait passer la solution méthanoli-

que, ADA-143 B, pli 8,2, à travers la colonne Le liquide épuisé est recueilli à raison de 2,5 ml/minute sous la forme de fractions de 20 ml (fractions 1 à 60) On lave la colonne avec 1,5 litre d'eau ( 10 ml/minute; fractions 66 à 108) La colonne est ensuite éluée avec de l'acide

acétique à 5 % (taux de 10 ml/minute, fractions 109 à 310).

Les portions suivantes sont réalisées:

2504 142

* Portion 1 Fractions 1-80 1000 ml (ADA-1 A) 2 Fractions 81-110 600 ml (ADA2 A) 3 Fractions 111-130 450 ml (ADA-3 A) 4 Fractions 131-150 450 ml (ADA4 A) 5 Fractions 151-190 900 ml (ADA-5 A) 6 Fractions 191-230 900 ml (ADA6 A) 7 Fractions 231-270 900 ml (ADA-7 A) 8 Fractions 271-310 900 ml (ADA8 A) L'essai avant (-E) et après (+E) traitement

avec de la phosphatase alcaline donne les résultats sui-

vants: Zone (S lutea)

-E + E

Portionl 31 52 f 2 36 49

3 34 45

4 18 40

25 30

6 27 29

7 27 29

8 29 31

Les portions 1 et 2 sont combinées, concen-

trées en une solution aqueuse et séchées par congélation

pour donner la préparation ADA-2,1; 1,48 g.

Les portions 3 et 4 sont également combinées

et traitées d'une façon similaire pour donner la prépa-

ration ADA-2,2; 2,5 g.

Les préparations ADA-2,1 et -2,2 donnent du composé U-57930 après traitement avec de la phosphatase alcaline. Les préparations ADA-34,1, -2, 1 et -2,2 sont combinées et purifiées par le processus de distribution

à contre-courant double décrit ci-après.

Distribution à contre-courant double: La ma-

tière obtenue en combinant les préparations ADA-34,1, -2,1

et -2,2, 16,20 g, est dissoute dans 25 ml de chaque pha-

2504 1 42

se du système solvant formé de volume égaux de I-buta-

nol et d'eau ( 1/1) Les solutions sont ajoutées dans les

tubes centraux d'un appareil de distribution à contre-

courant double tout en verre ( 100 tubes; 25 ml/phase).

On analyse la distribution, après 150 transferts, pour

son activité biologique avant (-E) et après (+E) trai-

tement avec de la phosphatase alcaline Les résultats sont donnés ciaprès: Collecteur inférieur Zone (sensible a S. -E o O o O o O o O o O lutea) +E 33 5 43,5 Machine inférieure Zone (sensible à S lutea)

-E +E -

0 45

traces 46

47

17 47,5

17 47

18 47

17,5 48

17 48

16 48

50

traces 50 - w t'i (A Ili F-4 Lri f-J vi e Pl ty, Fil j (D (O -e CD% ft P. (D r, 1 I CD n F -j (D n r (D I P, c -h Mt q H M e n F b rlo r,- W W 't> -> Ln Ln M CY% -j -4 oe W te UD C) Ln M Ln CD tyl C) Ln CD ui m ui CD (n CD ui CD Ul CD ui O w 4 P -> W W W W W W " rla r\> r\) N) M) b- F, b-d Ln W LI) W F te ce) (il W r,j CD OD 0) -P t'a k CD te -4 -4 %b cn Un F-J a% rli F k rt b Ch ui -1 w n CD O

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1

Ln un Ln Ln Ln un lui un un r U vi C> -t I m w + -I C-t + C+

CD -1 -1 -1 " 1

ci ai W Cu w 0 N N O n CD ( 8 z Co (D O m m On prépare les portions suivantes Chaque

portion est concentrée en une solution aqueuse et sé-

chée par congélation de manière à obtenir les prépara-

tions correspondantes.

Portion I: collecteur inférieur 1-50; Portion II:collecteur inférieur 51100; machine inférieure 50-30; Portion III: machine inférieure 29-0; machine

supérieure 1-50; collecteur supé-

rieur 100-30.

Les préparations obtenues sont les suivantes: A partir de la portion I; préparation ADA-47,1;

9,78 g.

A partir de la portion II; préparation ADA-47,2;

0,30 g.

A partir de la portion III;préparation ADA-47,3; ,29 g.

Les préparations ADA-47,2 et -47,3 sont com-

binées et purifiées par chromatographie sur Séphadex

DEAE, comme décrit ci-après.

Chromatoqraphie sur Séphadex DEAE:

On agite 300 g de Séphatex DEAE (A-25) pen-

dant 1 heure avec de l'eau et pendant 2 heures avec de l'hydroxyde de sodium aqueux 0,5 N L'échangeur ionique

est lavé avec de l'eau jusqu'à ce que le p H soit d'envi-

ron 7,5 La matière est ensuite agitée pendant 2 heures avec de l'acide acétique aqueux 0,5 N, lavée avec de

l'eau à un p H neutre, versée dans une colonne et tas-

sée sous une pression de 0,9 kg à une hauteur constante.

La colonne est lavée avec 4 litres d'eau, 8 litres d'une

solution aqueuse à 0,1 % de tris-(hydroxyméthyl)aminomé-

thane (THAM), et 3 litres de tampon acétate de THAM 0,03 M, p H 8,0 (préparé en dissolvant 3,64 g de THAM dans 800 ml d'eau, en ajustant le p H à 8,0 avec de

l'acide acétique glacial et en ajustant ensuite le vo-

lume à 1 litre).

La matière de départ, à savoir les prépara- tions ADA-47,2 et 47,3, environ 5,50 g, est dissoute dans 20 ml de tampon acétate de THAM 0,03 M, p H de 8,0,

et ajoutée au sommet de la colonne La colonne est en-

suite éluée par écoulement avec du tampon acétate de THAM 0,3 M de p H 8, 0 On recueille les fractions 1 à ( 20 ml) A ce moment, on poursuit l'élution de la

colonne au moyen d'un écoulement par remontée On re-

cueille les fractions A, B, C, D et E ( 1 litre chacune).

L'essai pour l'activité biologique avant (-E) et après

(+E) le traitement avec de la phosphatase alcaline don-

ne les résultats suivants: Zone (sensible à S lutea) Fraction No -E +E

3 O O

6 O O

9 O O

12 O O

O O

18 O O

21 O O

24 O O

27 O O

30 O O

33 O O

36 38 39

39 43)5 44

42 36 3

23,5 23

2504 1 42

Zone (sensible à S lutea) Fraction No. -E o O on on 22 5 22,5 5 +E o O 52; 5 -52 ou o 52,5 54 5 Les portions suivantes sont effectuées: Portion I Fractions 34-38; 280 ml (ADA-69 B) Portion II Fractions 75-90; 330 ml (ADA-69 C) Portion III Fractions 101-111; 180 ml (ADA-69 D) Portion IV Fractions 114-150; 580 ml (ADA-69 E) Portion V Fractions 151-164; 100 ml (ADA-69 F) Portion VI Fractions 165-186; 125 ml (ADA-69 G) Portion VII Fraction C; 1 litre (ADA-69 A) La portion I (ADA-69 B) contient du U-57930

non modifié et est écartée.

La portion II (ADA-69 C) contient une matière inconnue qui donne du U57930 par retraitement avec de

la phosphatase alcaline UV:X max 275 nm.

La portion III (ADA-69 D) contient du cytidyla-

te de U-57930 et est traitée comme décrit ci-après.

UV:> max 270 nm.

La portion IV (ADA-69 E) contient de l'adé-

nylate de U-57930 et est traitée comme décrit ci-après.

UV:X max 260 nm.

La portion V (ADA-69 F) contient un mélange d'adénylate de U-57930, duridylate de U-57930 et de guanylate de U-57930 Cette solution est traitée comme

décrit ci-après.

La portion VI (ADA-69 G) contient du guanylate

de U-57930 et est traitée comme décrit ci-après.

UV:\ max 254;ép à 275.

La portion VII (ADA-69 A) contient un mélan-

ge de guanylate de U-57930 et d'uridylate de U-57930.

Cette solution est traitée comme décrit ci-après.

Isolement de cytidylate de U-57930, d'adény-

late de U-57930 et de guanylate de U-57930 essentiellement purs respectivement à partir des portions III, IV et VI Séparation du tampon acétate de THAM par chromatographie sur Amberlite XAD-2 On fait passer les portions III, IV et VI,

obtenues comme décrit ci-après, sur des colonnes con-

tenant de l'Amberlite XAD-2 Les liquides épuisés sont écartés Les colonnes sont lavées avec de l'eau et ensuite éluées avec un mélange de méthanol et d'eau ( 70/30 en volume/volume) Les fractions sont analysées par UV et en déterminant leur bioactivité avant et après traitement avec de la phosphatase alcaline Les fractions appropriées sont combinées, concentrées en une solution aqueuse et séchées par congélation Les

détails relatifs à la quantité d'Amberlite XAD-2 utili-

sée pour chaque portion, la quantité de lavage aqueux, la quantité d'éluat méthanolique et la quantité de ma-

tière obtenue sont donnés dans le Tableau suivant.

Portion Amberlite Lavage Eluat métha Matière iso-

XAD-2 uti aqueux nolique (ml) lée (mg) lisée (m Il (ml)

III 50 200 300 150

IV 200 800 600 3510

VI 50 200 300 470

La matière provenant de la portion III est gardée sous la dénomination de ADA-73,1, celle de la portion IV sous la dénomination de ADA-74,1, et celle de

la portion VI sous la dénomination de ADA-75,1.

Séparation du tampon d'acétate de THAM de la portion V (ADA-69 F) et de la portion VII (ADA-69 A) par chromatographie sur Amberlite

XAD-2

On prépare la colonne à partir de 300 ml d'Amberlite XAD-2 ' On fait passer à travers la colonne les portions V et VII contenant un mélange d'adénylate de U-57930, d'uridylate de U-57930 et de guanylate de U-57930 On écarte le liquide usé ou épuisé On lave

la colonne avec 600 ml d'eau On écarte le liquide épui-

sé On élue la colonne avec un mélange de méthanol et

d'eau ( 70/30) Les fractions donnant une matière biolo-

giquement active après traitement de la phosphatase alca-

line sont combinées ( 300 ml), concentrées en une solu-

tion aqueuse et séchées par congélation de manière à ob-

tenir la préparation ADA-71,1 ( 670 mg) On traite la

préparation -71,1 comme décrit ci-après.

Séparation de l'uridylate de U-57930 de

l'adénylate de U-57930 et du guanylate de U-

57930 Chromatoqraphie sur Sephadex DEAE 600 ml de Séphadex DEAE sous la forme acétate, préparé comme décrit ci-après, sont lavés avec du tampon

acétate de THAM 0,03 M (p H 8,0) et tassés dans une co-

lonne de verre (diamètre interne de 4,5 cm; hauteur de

cm) sous une pression hydrostatique.

On dissout la préparation ADA-71,1 (voir ci-

dessus) dans 10 ml de tampon acétate de THAM 0,03 M, p H 8,0, et on l'ajoute au sommet de la colonne On élue la colonne avec: 1) acétate de THAM 0,03 M, p H 8,0 (fractions

1 à 79)

2) acétate de THAM 0,12 M, p H 8,0 (fractions

à 395)

3) acétate de THAM 0,25 M, p H 8,0 (fractions

396 à 750).

On recueille des fractions de 20 ml et on

les analyse par UV et on détermine leur activité biolo-

gique avant et après traitement avec de la phosphatase

alcaline Les fractions 51-60 contiennent de l'adényla-

te de U-57930, les fractions 62 à 73 (ADA-94,B) con-

tiennent de l'uridylate de U-57930, et les fractions

à 100 contiennent du guanylate de U-57930.

Isolement de l'uridylate de U-57930 essentiel-

lement pur Séparation du tampon acétate-THAM par chromatoqraphie sur Amberlite XAD-2 On prépare la colonne à partir de 50 ml d'Amberlite XAD-2 On fait passer la portion ADA-94 B, contenant de l'uridylate de U-57930,sur la colonne à raison de 2 ml/minute, On écarte le liquide épuisé On

lave la colonne avec 200 ml d'eau On écarte le lavage.

On élue la colonne avec un mélange de méthanol et d'eau ( 70/30 en volume/volume) Les fractions contenant (par UV) de l'uridylate de U-57930 sont combinées ( 200 ml), concentrées en une solution aqueuse, et séchées par

congélation pour donner 60 mg de ADA-95,1.

Caractérisation du 3 '( 5 '-cytid Ylate) de U-57930 Résultats concernant l'absorption IR Les Tableaux donnant les absorptions IR (Nujol et K Br) sont les suivants:

Fréq Fréq.

de ban Inte Type de ban-

de Inten de Inten Type

3417,3

3341,1

3211,8

3108,6

2951,4

2926 t 3

2854,9

2729 X 6

2693,9

2535,7

1649,3

1610,7

1575,0

1528,7

1489,2

1462,2

1404,3

1377,3

1368,6

1286,6

24 SH

19 BRD

19 BRD

BRD

2 BRD M

1 BRD M

2 BRD M

48 BRD M

51 SH

SH

8 AVG

26 AVG

AVG

31 AVG

23 AVG

9 AVG M

41 BRD

18 AVG M

31 SH M

34 AVG

1249, O

1214,3

1146,8

1089,9

1070,6

1056,1

992,4 972,2 955,8 930,7 889,2 860,3 849,7 804,4 788,9 721,4 705,0 654,9 632,7

33 SH

21 AVG

42 SH

BRD

12 AVG

14 SH

39 AVG

39 AVG

49 SH

51 AVG

36 AVG

52 AVG

53 AVG

46 SH

AVG

44 AVG M

47 BRD

SH

38 AVG

Fréq de bande: fréquences des bandes en nombres d'ondes (cm-1) Inten: intensité en % de transmission (%T) Type des résultats dans région de pics locale BRD-large AVG moyen; SHP étroit (accentué):; * SH épaulement Liste de pics publiée Indique uln

addition de pics.

M: Interférence possible provenant de l'huile minérale.

r%) N) 1-A tj èo Dè Di ft J (D

(D CD M:J

O x :i CD O

0 CD P"

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W) 10 W Ln 4 r 1 j O W rla ro > W b-, > >-I F) rj rj j f 1 l) r- J W W CD CD CD -p (:ri Co to O Co e -J Co ul -J M > Ln N ra t Z -4 l'o Cn CD rl) km 4 w O % r-J CD r'j CO c D ui r, CO W rj w W W W W W ( 1) 00 C 7, Ln pl w %,O cn Co Ln r) r'j W Cil O % %.O W OD - 4 CO -> ( 7) N) b-, CD ro N) r, i O Ln a) 'p'o M CD Co -'i - -lll , 1 1, , 1 N. F W c > CD LM CD Ln c (pli Ln r\) t-I CD cn Ili VI Il, m -n (D ', JD F- (D m Q t

-1 F"

r. m P. 5 c CD -ti zi 1 m

(D ' CD

in q "C iz M M) (M IC) 41- -à 4- M) Fréq de bande: fréquences des bandes en nombres d'ondes (cm-l) Inten: intensité en pourcentage de transmission (Y/T) Type (caractéristique) des résultats dans région de pics locale: BRD large; AVG moyen; SHP étroit (accentué); SH épaulement

Liste de pics publiée * Indique une addition de pics.

Les 25 pics les Fréa.

1649,2

1071,5

3408,5

1057, 10

1088 8

1215, 1

1614 5

1491,0

2930 1

2963; 8

1528,6

1576, O

plus intenses I Freq.

1251,8

1286 5

889,1 525,5

1462,1

1384,0

595,0 572,8

788, 8

I 450,5

992,3 634 5 Prép: pastille de KBR e max: 100 à 403,1 %T à 4000 (cm-l): 78 Densité (cm-l/pt): 0,964 2 Spectre d'absorption UV lA max (a)l Dans l'eau: p H 2,0; 279 nm ( 6,5) p H 7,0; 270 nm ( 9,9) p H 11,0; 271 ( 9,6) 3 Composition élémentaire

Formule Mol: C 26 H 43 N 5012 S Cl P Poids molécu-

laire: 715.

Calculé: C: 43,64; H: 6,01; N: 9,79; 0: 26,88; S: 4,47;

Cl: 4,89; P: 4,33.

4 Rotation optique lalD 25: + 107 (C: 0,854, eau) D 5 Solubilités Fortement soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol Légèrement soluble dans l'acétone et les autres cétones, l'acétate d'éthyle et les autres esters, le chloroforme, le chlorure de méthylène Insoluble dans

les solvants hydrocarbonés saturés.

6, Activité antibactérienne Le 3-( 5 '-cytidylate) de U-57930 n'est pas actif in vitro Toutefois, le traitement avec de la

phosphatase alcaline ou de la phosphodiestérase I don-

ne du U-57930 qui est fortement actif vis-à-vis d'une

série d'organismes G, aussi bien in vitro que in vivo.

7 Point de fusion: 2050-2070 C (avec décompo-

sition) Caractérisation du 3 '( 5 '-adénylate) de U-57930 1 Résultats concernant l'absorption IR Les Tableaux donnant les absorptions IR (Nujol et I Cr) sont les suivants: (il p ui I-J N) ui Fi 0 i<:j (D rt, CD

(D CL

Ft CD ni f-h m W m

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CD CD%:C Fi m (D éd M rt, CD, 0 Ln

CD (D (D

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CD (D CD

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W N) W Cn 4:> W rl,) F r% M 4 F-

m Ln > ui (n W W F Co 4 h ro F cn 4 > O '1 rj W -J -4 c tn D- > -r Ln LA:> Ln W W ' > VI M Co CD W m -< < Po:0 < -r;v m m -M CD W O CD m c: c Z m t O t O -00 m a r-J

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I, G') C) m M 7 e i ai

(D CD F 4

Ili 1 b, CD% ni a pi O :3 rt (D p i Co t\ l ai m Fd CD (D Fi (D% d 4 pi :1 r+ ro p i l":5 1 1 f D r-J Lri C> -P, -L- 1li Cl l 4 r t- Nt CD Ln C\j ai CL >l F- c ai 4-) c ai Tu O le? 1 $ 4 tu r%, n cm C D C-13 Ci CD ci CD CM m C D C C-1 m CD O cm CD CD > =::- " = :: -=::> cc 0: Ér ::: x: MC:> :a: < tn -:: < tn -r -Y < Ln < W m m <C -:c v < CA < M Ln M r o' m " -gr oe CD to -M c c -f t O %M m to r Uà Ln c'a " çl -e " m çt m m cn mt m cn cm " clli cli CI-J " cm %O m ln cm m " cn - O oe cn %O fl, cn Ln U' CY M r e C a CD CD Cj #D O % C% M r, W W O M O - e CI) Cj M 01 O U') a% r, U) CM CO D Ln -4 CD e uo Cli CD -e CI) W r Pl C\j C CD CD C) O % CI% ol m Co oe W CO oe fl r r r 10 o LO LO tn Ln U' im im CM LM CD N in m cm CD CD CD CM LD CD CD CD c c = > cy:: = C-1 cà cle::>:: : = =::: >:::;: = x w m V) W -cc VI cm m m cn -e < <C (n (n -< < < < cr V) < V) r, CD r CM -4 cn to CD to Ui r C) M Ln M r M Cj l m O CIJ %a -4 cm Cj r, cn t q M r 4 cm cm r' -& cm cm cn ,-) CM m W -Cr CD CD C i -0 to clu U) C\j Ln CD CD oe r r l', CD C> -f -f to CI) -Cr CI) 101 M M % O m m CI) rj to CI) -l U') -e -1 qO Ln in r çu cm %O Cj r 10 Ln Cj m r, -çt C> r Ln 1-4 r cm m en CD -e -4 r ( 1) CM 1-f 01 % Olb W oe r UI -4 t D tn UD LO Ln tn r -e c) m cn cli cj f ( 1) cn cn " " " Cli cj CM " -4 -1 1-4 1-1 1 i -1 -4 1 i 1-4 1-1 -4 14 q -4 cn a) cn a) -P z 1 i ul zs r-i çi lm m 0) r-l U) ci -j p in N U) ID c, cj c D c D c D Ln -i c i o Ln Ln e Lx 1 ', t r Un ( (Dr, f O i ( r Co r e CD r m m %t O % C\j qD m t.úD C,' u UD U, to W tm C'i -e c- , o 1 1-1 1-4 l c 0) SI.L. F b-Z Qj Li- f- b-k CM nt -rt W 1-1 1-1 cm cn Mt Ln Ln U-J cm clli cm clli el m m m rl m Cr) CI) cn Cj oe ce) Ln m C) Ln C) Cj r_ r, ce Co cy% 0) Ln U' f CD Cr) clli ") Ln to t D M Ln - e O cn c 1-9 1-0 01 c oe oe CD CD CD to t CI) CM clli cm (Ni Cu cli clli cm m t O C) m cn Ln to t-I r 9 le w m j 4 J P 4 à u %O 0) r. Q) Q 9) c F c ci 4 à C :o ro ca % O 1-1 go'' Txi In l* r-1 Co le O CD - r-i r-i

4 E

u in Co C)

4 CD

X cn (c E 4 m TR tn r A mi C) N ci Ln

250414 ?

Fréq de bande: fréquences des bandes en nombres d'ondes (cm-l) Inten: intensité en pourcentage de transmission (%T) Type(caractéristique) des résultats dans région de pics locale: BRD large; AVG moyen; SHP étroit(accentué); SH épaulement

Liste de pics publiée Indique une addition de pics.

Les 25 pics les plus intenses

XT F Fre %T Freq.

1069, 5 23 1576,0

7 3375,7 24 889,1

7 1643,5 25 522,6

8 1090,7 25 503,3

8 1050,2 26 648,0

3223,3 26 636,5

12 1215,1 26 571,8

15 1678,1 27 1475,6

17 3124,0 27 990,5

19 1246,0 27 533,2

1602,0 28 1301,0

22 2963,0 28 584,5

22 2929, 1

Prép: pastille de KBR %r max: 95 à 405,0 %T à 4000 (cm-1): 77 Densité (cm1/pt): 0,964 2 Spectre d'absorption UV Dans eau à: p H 2,0; 258 ( 16,0) p H 7,0; 261 ( 16,5)

p H 11,0; 261 ( 16,0).

3 Composition élémentaire Formule moléculaire: C 27 H 43 N 7010 o S Cl P Poids moléculaire; 723. Calculé: C: 44,81; H: 5,94; N: 13,55; o: 22,13; S: 4,42;

Cl: 4,84; P: 4,28.

2504 1 42

Trouvé: N: 12,87; S: 5,39; Cl: 4,76; P: 3,83.

4 Rotation optique la J 25: + 94 '(C:q 887,eau) 5.Solubilités Fortement soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol Légèrement soluble dans l'acétone et les autres cétones, l'acétate d'éthyle et les autres esters, le chloroforme et le chlorure de méthyle Insoluble dans

les solvants hydrocarbonés saturés.

6 Activité antibactérienne Le l 3-( 5 '-adénylate)l de U-57930 n'est pas actif in vitro Toutefois, le traitement avec de la

phosphatase alcaline ou du phosphodiester I donne du U-

57930, qui est fortement actif vis-à-vis d'une série d'organismes G+ aussi bien in vitro que in vivo On a constaté que le 3-( 5 '-adénylate) de U-57930 était actif

in vivo (par voie sous-cutanée; souris) avec une va-

leur de CD 50 de 0,62 ( 0,48-0,79) mg/kg vis-à-vis de

S Pyoqenes.

7 Point de fusion: 203,5 -205 C (avec décom-

position) Caractérisation du 3-( 5 '-uridylate)de U-57930 1 Résultats concernant l'absorption IR Les Tableaux donnant les absorptions IR (Nujol et K Br) sont les suivants: tu H pli 0 % (n CD CD A 0 pi 0 m CD 0 t 7 l toi tri M CD ft (t ID% 1-h Fi

(D (D%

Fi (D:J a p z fi rd (D ta O l 0 m fl (D 0 %:c m

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97) C;

Ln (n c c C) -J j -4 -4 m 00 oe m q M q M UD o C) 4-1 rli m W W Ità CI a m 00 ( O k F tn oe N) Ln -J %O tn w -J Ln o im 14 Co rla 00 W ( O - 0 ci W M) Ln

w o r\) m W rla W m r O -P >-

-P p -> 4 à 4 W 4 4 W W k-

O 4 (Do -4 CD W W m W W CD CD a à M U, Cé Ln M > > v) LA Ln > c CO:r LA >:C D> (A De c (A Zr < -< = Gi D C) C') G') CI a,) GI) G') G') G') N G-J t-I (D lm N) ui -0 P. (n F- (D in ô F-à c 1 (n P, :j rt O i::% cn CD 1 M

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1,4 ' 'S '% -

w CD È-D ru > cn cn Ln in k W r,,i -S CD i a m ru t.n CD -P, M) Fréq de bande: fréquences des bandes en nombres d'1 ondescm) Inten: intensité en pourcentage de transmission (% T) Type(caractéristique) des résultats dans région de pics locale: BRD large; AVG moyen; SHP étroit(accentué); SH épaulement

Liste de pics publiée Indique une addition de pics.

Les 25 pics les plus intenses

%T Fre'q %T F req.

6 1685 t O 32 1384,0

7 1070,5 34 567,0

109017 35 1605,8

1055 S 0 35 1423 * 5

12 3387,3 35 992,3

17 1647 t,3 35 523;,6

17 1214,2 36 2879,0

24 1255,7 36 973; 1

25 3114,3 37 1576,0

26 2962,0 37 634,5

26 2931; 0 38 2863 _,5

31 1463 _,0 38 1297; 1

31 889 1

Prép: pastille de KBR % T max: 101 à 405,0 % T à 4000 (cm-1): 76 Densité (cm-i/pt):' 0,964 2 Spectre d'absorption UV lAmax (a)l Dans l'eau à: p H 2,O 261 ( 11,5) p H 7,0; 262 ( 10,7) p H 11,0 O 262 ( 11,5) 3 Co mosition élémentaire Formule moléculaire: C 26 H 42 N 4013 S Cl P Poids moléculaire:

716.

Calculé: C: 43,57; H: 5,86; N: 7,82; 0: 29,05;

S: 4,46; Cl: 4,89; P: 4,33.

4 Rotation optique lalD 25: + 105 (C: 0,94, eau) Solubilités Fortement soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol Légèrement soluble dans l'acétone et les autres cétones, l'acétate d'éthyle et les autres esters, le chloroforme et le chlorure de méthylène Insoluble

dans les solvants hydrocarbonés saturés.

6 Activité antibactérienne

Le 3-( 5 '-uridylate) de U-57930 n'est pas ac-

tif in vitro Toutefois, le traitement avec de la phos-

phatase alcaline ou de la phosphodiestérase I donne

du U-57930 qui est fortement actif vis-à-vis d'une sé-

rie d'organismes G+ aussibien _in vitro que'in vivo.

7 Point de fusion: 202 -203 C(avec décompo-

sition). Caractérisation du 3-( 5 '-uanvlate de U-57930 1 Les Tableaux donnant les absorptions IR (Nujol et K Br) sont les suivants: i Fréq de Fréq de bande Inten Type bande Inten Type

3335,3 16 BRD 1250; O 36 SH

322772 19 BRD 1213,3 21 AVG

2953,3 2 AVG M 1173 > 8 39 AVG

2925,3 1 BRD M 1149,7 41 AVG

2868 4 6 SH M 108739 14 SH

2855,9 4 AVG M 1071,5 9 AVG

273773 51 BRD M 991,5 42 AVG

2521,2 73 BRD 972,2 42 AVG

1684,0 6 AVG 956,8 52 SH

1635 8 11 AVG 929,8 51 AVG

1598,2 21 AVG 890,2 36 AVG

1572,1 26 AVG 860,3 51 AVG

1534,5 34 AVG 800,5 46 AVG

1462)2 18 AVG M 783,1 42 SHP

1414,9 44 AVG 720 4 43 AVG M

1377,3 24 AVG M 707,9 a 5 RD

1365,7 31 AVG 681,9 40 AVG

1312,7 44 AVG 635 6 34 AVG

250 4 1 4

Fréq de bande: fréquences des bandes en nombres d'ondes (cm-1) Inteno: intensité en pourcentage de transmission (% T) Type (caractéristique) des résultats dans région de pics locale: BRD large; AVG moyen; SHP étroit (accentué); SH épaulement

Liste de pics publiée * Indique une addition de pics.

M: interférence possible provenant de l'huile minérale. Les 25 pics les plus intenses

%T Freq %T Freq.

1 2925,2 24 1377 X 2

2 2953,2 26 1572,0

4 2855,8 31 1365 6

6 2868,3 34 153475

6 168470 34 635,5

9 1071 5 36 1250,0

11 1635; 7 36 890; 1

14 1087,8 39 1173,7

16 3335,2 40 681,8

18 1462 1 41 1149,6

19 3227,1 42 991,5

21 1598,1 42 972,1

21 1213,2

Prép: pate d'huile minérale % T max: 97 à 3762,6 % T à 3800 (cm-l): 97 Densité (cm-1/pt): 0,964 LA r%) Fi Ln O > b b F b F b b > b > k b N) r%) rj r) ra ri W w rli rj W W W 4 4 > 4 Ln ui Ln CN O % ui -4 m W 10 'O rj w b Ln F Ln Co è Ate ( 71 m W -4 o W Co N) M m -4 rli C W Co w CD r,> 'oe W W b rla -> F OD e W N) 4 à rli Co to W j> CD %& % 1 % % l ' % w q M -4 qo a t D I-J rl) 4 > Ul rj r\) Co CD PO C) -J O ru CD CD cm p VI PO co ch r,,) o cn W qo -, 1 % 3 t'a -, W b-, oa c-n to ,o Ln rlj ui r-J c W a CI (el Co W a) rli -j k UD W Co m -J W M Co 00 e O> CD CD w ui CD CD Co (il tn 4 C) L'i p q H FI O <:j CD ti (D ou CD

CD 1 1 (DI, Z 04

1.0 fi

0 CD

in ID

CD CD M CD

m O (D :j

0 &

Ai CD m cn c O (D ti (O

O O

ti fti eii : (Dt m (D m C-t (D l m CD rb Ln Ln Ln ( ri C 7 Cl -J 14 - J m Co Co o m %D' O Z) ci > CD r 1 j -J W W j (D > W C) m ro FI,% (n - 14 O j ry D 4 li, 4 Ln -0 VI rn W CD CD -0 %,O Ci r-J S C) CO - 4 Ln ui -4 10 ui ali %M CD Cn > Ln W r 1 l) Co CD rll> ul Q % O -4 li e CD W Co Co rj Ci b Co -> W -P W C% "O w ul LA Dl V > 'LI t A t

Z-C < -4 = -C

W, ON CI 1-d j Fî :i O % 2, e D a ai (D :3 -M CD p

% rlà F r J > b-, k-

W Ln -4 Ln Cr% 1 W 01 W r Ij W 4 a- -1 Co " l'i - 4 -J c Ln un CO

-J j Il A o D r%) to CD e-

Za, G m Co CD C 7 % Lri c% CD Ln Co CO in -4 r: (D rlo Ln C> -e. 4- m Prép: pastille de KBR % T max: 97 à 405,0 % T à 4000 (cm-l): 77 Densité (cm-l/pt): 0,964 2 Spectre d'absorption UV l> max (a)l Dans l'eau à:

p H 2,0; 256 ( 13,4); 280 ( 8,4)ép.

p H 7,0} 254 ( 14,5); 273 ( 9,7) ép.

p H 11,0 O 259 ( 12,6); 266 ( 12,4 ép.

* 3 Composition élémentaire Formule moléculaire: C 27437 H' S Cl P Poids molé culaire 739. Calculé: C: 43,84; H: 5,81; N: 13,26; 0: 23,27;

S: 4,33; Cl: 4,73; P: 4,19.

Trouvé: N: 13,32; S: 4,86; Cl: 4,49; P: 3,25.

4 Rotation optique lalD 25: + 97 o (C= 0,855, eau) D Solubilités Fortement soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol Légèrement soluble dans l'acétone et les autres cétones, l'acétate d'éthyle et les autres esters, le chloroforme et le chlorure de méthylène Insoluble

dans les solvants hydrocarbonés saturés.

6 Activité antibactérienne Le 3-( 5 '-guanylate)de U-57930 n'est pas actif

in vitro Toutefois, le traitement avec de la phospha-

tase alcaline ou de la phosphodiestérase I donne du U-57930 qui est fortement actif vis-à-vis d'une série

d'organismes G aussi bien in vitro que in vivo.

7 Point de fusion: 219 -220 C(avec décomposi-

tion). Puisque les composés de la présente invention sont actifs contre divers microbes Gram positifs et

Gram négatifs, on peut les utiliser dans différents en-

vironnements pour inhiber ces microbes Par exemple, on peut les utiliser comme désinfectants pour inhiber S aureus sur des ustensiles alimentaires lavés et rangés contaminés par cette bactérie On psut éga- lement les utiliser comme désinfectants sur différents appareillages dentaires et médicaux contaminés par S aureus De plus, on peut utiliser les composés de l'invention comme rinçages bactériostatiques pour les vêtements passés au blanchissage, et pour imprégner

les papiers et les matières textiles; et on peut éga-

lement les utiliser pour supprimer la croissance d'or-

ganismes sensibles dans des essais sur plaques et

d'autres milieux microbiologiques.

Les composés de la présente inv Eition s'avè-

rent également intéressants dans le traitement des ma-

ladies provoquées par les membres du genre Mycoplasmes, les formes les plus usuelles étant les PPLO (organismes du type pleuropneumonie), tels que M hominis, M salivarium, M, mycoides, M hyopneumonia,

M hyorhinis, M 'callisepticum, M arthriditis et d'au-

tres espèces chez l'être humain et les animaux, y compris les animaux domestiques, tels que le mouton, les chiens,

le bétail, le porc, et la volaille (par exemple les pou-

lets, dindons, canards et oies),ainsi que les animaux

de laboratoire (par exemple les rats et souris).

On peut utiliser les 3-( 5 '-ribonucléotides)

de U-57930 dans le traitement du rein et d'autres in-

fections lorsque des formes L de bactéries Gram négatives et Gram positives sont présentes, par exemple les formes

L de P mirabilis.

Puisque les composés de la présente invention sont des substances amphotères, ils peuvent former des sels aussi bien avec les acides qu'avec les bases en

utilisant des processus standards Des exemples d'aci-

des inorganiques que l'on peut utiliser pour former des sels sont les acides chlorhydrique, sulfurique, phospho- rique, etc Des exemples de bases inorganiques sont le sodium, le potassium, le calcium, le lithium, etc Les sels des composés peuvent être utilisés pour les mêmes

applications que les composés dont ils proviennent.

Les composés de la présente invention sont

intéressants comme agents antibactériens dans des compo-

sitions appropriées Ces compositions sont de préféren-

ce présentées pour l'administration aux êtres humains et

aux animaux sous des formes posologiques unitaires, tel-

les que des comprimés, des capsules, des pilules, des

poudres, des granules, des solutions ou suspensions pa-

rentérales stériles, des solutions ou suspensions orales, et des émulsions d'huile-eau contenant des quantités

appropriées du composé actif sous la forme de la base li-

bre, ou de ses sels pharmacologiquement acceptables.

Pour l'administration orale, on peut préparer

des formes posologiques unitaires solides ou liquides.

Pour la préparation de compositions solides, telles que des comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec des ingrédients ordinaires, tels que du talc, du

stéarate de magnésium, du phosphate dicalcique, du sili-

cate de magnésium et d'aluminium, du sulfate de calcium,

de l'amidon, du lactose, de la caroube, de la méthyl-

cellulose, et des matières fonctionne Jlement similaires

comme diluants ou supports pharmaceutiques Les compri-

més peuvent être stratifiés ou combinés de n'importe

quelle autre manière de façon à obtenir une forme poso-

logique offrant l'avantage d'une action prolongée ou retardée ou d'une action conesé:tive prédéterminée du

médicament enfermé Par exemple, le comprimé peut com-

prendre un dosage intérieur et un composant de dosage extérieur, ce dernier étant sous la forme d'une enve- loppe sur le premier Les deux composants peuvent être séparés par une couche entérique qui sert à résister à

la désagrégation dans l'estomac et qui permet au com-

posant intérieur de passer intact dans le duodénum ou d'en retarder sa libération On peut utiliser une série de matières pour ces couches ou enrobages entériques,

ces matières englobant un certain nombre d'acides poly-

mères ou les mélanges d'acides polymères avec des ma-

tières telles que la gomme-laque, l'alcool cétylique, le phtalate d'acétate de cellulose, les copolymères de styrène et d'acide maléique, etc Ou bien, on peut

utiliser le système à deux composants pour la prépara-

tion de comprimés contenant deux ou plus de deux in-

grédients actifs incompatibles On prépare les cachets de la même manière que les comprimés, les cachets ne se différentiant que par la forme et par l'introduction de sucrose ou d'un autre adoucissant et édulcorant Dans leur frme de réalisation la plus simple, on prépare les capsules comme les comprimés, en mélangeant le composé de la formulation avec un diluant pharmaceutique inerte

et en introduisant le mélange dans une capsule de géla-

tine dure de dimension appropriée Suivant une autre

forme de réalisation, on prépare les capsules en remplis-

sant des capsules de gélatine dure avec des billes ou

perles recouvertes d'acide contenant un composé de l'in-

vention On prépare des capsules de gélatine molle par encapsulation à la machine d'une pate d'un composé de l'invention avec une huile végétale acceptable, du

pétrolatum liquide léger ou d'autres huiles inertes.

On peut préparer des formes posologiques uni-

taires liquides pour l'administration orale, telles que des sirops, des élixirs et des suspensions Les formes solubles dans l'eau d'un composé de l'invention peuvent être dissoutes dans un véhicule aqueux en même temps qu'avec du sucre, des agent édulcorants aromatiques et des agents de conservation pour former un sirop On

prépare un élixir en utilisant un véhicule hydro-

alcoolique (éthanol) avec-des édulcorants appropriés,

tels que du sucrose en même temps qu'avec un agent aro-

matisant du type aromatique On peut préparer des sus-

pensions des formes insolubles avec un véhicule sirupeux à l'aide d'un agent de mise en suspension, tel que de la caroube, de la gomme adragante, de la méthylcellulose, etc. On peut préparer des pommades ou onguents topiques en dispersant le composé actif dans une base de pommade appropriée, telle que du pétrolatum, de la lanoline, des polyéthylène glycols, des mélanges de ces matières, etc D'une manière avantageuse, le composé est finement divisé au moyen d'un broyeur à colloïde en utilisant du pétrolatum liquide léger comme agent de

lévigation avant la dispersion dans la base de pommade.

On prépare des crèmes et lotions topiques en dispersant le composé dans la phase d'huile avant l'émulsification

de la phase d'huile dans l'eau.

Pour l'administration parentérale, on prépare des formes posologiques unitaires liquides en utilisant un composé de l'invention et un véhicule stérile, l'eau

étant préférée Le composé, suivant la forme et la con-

centration utilisées, peut être soit mis en suspension soit dissous dans le véhicule Pour la préparation de solutions, on peut dissoudre une forme soluble dans l'eau d'un composé de l'invention dans de l'eau pour injection et la stériliser au moyen d'un filtre avant le rem- plissage dans une fiole ou ampoule appropriée et le scellement D'une manière avantageuse, des adjuvants

tels qu'un anesthésique local, un agent de conserva-

tion et des agents tampons peuvent être dissous dans

le véhicule Pour accroître la stabilité, la composi-

tion peut être réfrigérée avant l'introduction dans la fiole et l'eau peut être séparée sous vide La poudre lyophilisée sèche est ensuite scellée dans la fiole et

une fiole d'eau pour injection accompagnatrice est pré-

vue pour reconstituer la poudre avant utilisation On prépare des suspensions parentérales pratiquement de la même manière à l'exception que le composé est mis en suspension dans le véhicule à la place d'être dissous et que la stérilisation ne peut pas être réalisée par

filtration Le composé peut être stérilisé par exposi-

tion à de l'oxyde d'éthylène avant la mise en suspension dans le véhicule stérile Pour une action soutenue, on prépare une suspension intramusculaire avec une forme insoluble, telle que l'éther triméthylsilylique ou le sel de pamoate D'une manière avantageuse, on incorpore

un agent tension-actif ou de mouillage dans la composi- tion pour faciliter la distribution uniforme du compo-

sé. L'expression "forme posologique unitaire" utilisée dans le présent mémoire désigne des unités physiquement distinctes qui conviennent comme doses unitaires pour des êtres humains et des animaux, chaque

unité contenant une quantité prédéterminée de matière ac-

tive calculée pour produire l'effet thérapeutique désiré

en association au diluant, support ou véhicule pharma-

ceutique requis Les spécifications concernant les nouvelles formes posologiques unitaires de l'invention sont dictées par, et en relation directe avec (a) les caractéristiques propres de la matière active et de l'effet thérapeutique particulier recherché, et (b) les limitations inhérentes à la pratique de la formulation

d'une telle substance active pour une utilisation théra-

peutique chez des êtres humains et des animaux, comme

décrit en détail dans le présent mémoire pour des for-

mes de réalisation préconisées qui constituent des parti-

cularités de la présente invention Des exemples de formes posologiques unitaires convenables, conformément

à la présente invention, sont des comprimés, des cap-

sules, des pilules, des dragées, des suppositoires, des sachets de poudre, des granules, des cachets, des cuillerées à thé, des cuillerées à soupe, des contenus de flacon compte-gouttes, des ampoules, des fioles, des

multiples distincts de l'un quelconque des types précé-

dents, et d'autres formes telles que décrites dans le

cadre de la présente invention.

On combine un composé actif avec un support

pharmaceutique approprié sous une forme posologique uni-

taire pour une administration appropriée efficace Dans

les formes de réalisation préférées de la présente inven-

tion, les unités posologiques contiennent des quantités

de 10, 25, 50, 100, 250 et 500 mg d'un composé de l'in-

vention pour un traitement général, et de 5 à 65 % en poids/volume pour un traitement parentéral Le dosage des compositions contenant un composé actif et un ou plusieurs autres ingrédients actifs doit être déterminé en se référant au dosage habituel de chaque ingrédient

de ce type.

Les exemples suivants illustrent le meilleur

mode envisagé pour réaliser l'invention mais ne consti-

tue en aucun cas une limitation à celle-ci.

Ces exemples utilisent le 3-( 5 '-ribonucléoti-

de) de U-57930 E ou de U-60970 E comme composé actif, mais on notera que ceux-ci ne représentent que des exemples

parmi les autres composés actifs de la présente in-

vention Le U-60970 E est l'amide d'acide 4-cis-n-butyl-

L-pipécolique et de 7-Cl-méthylthiolincosaminide Sa préparation est donnée dans l'Exemple 7 de la demande

de brevet aux Etats-Unis d'Amérique N O 148 056.

Lorsque l'on se réfère ci-après au U-57930 E ou au U-60970 E, on entend par là le 3-( 5 '-ribonucléotide) de ces composés Les 3-ribonucléotides sont ceux tels

que décrits dans le cas présent.

Exemple de composition 1 capsules On prépare 1000 capsules de gélatine dure constituées par deux pièces pour une utilisation orale, chacune d'entre elles contenant 250 mg de U-57930 E ou U-60970 E, à partir des types suivants et des quantités suivantes de matières: U-57930 E ou U60970 E 250 g Amidon de mais 100 g Talc 75 g Stéarate de magnésium 25 g Les matières sont mélangées intimement et

ensuite encapsulées de la manière usuelle.

Les capsules précédentes s'avèrent intéres-

santes pour le traitement général d'infection chez les êtres humains adultes par l'administration orale d'une

capsule toutes les six heures.

En utilisant le processus ci-dessus, on pré-

pare d'une façon similaire des capsules contenant du U-57930 E ou du U60970 E en des quantités de 10, 25, 50, 100 et 500 mg en substituant 10, 25, 50, 100 et 500 g de

U-57930 E ou de U-60970 E aux 250 g utilisés ci-dessus.

Exemple de composition 2 -Capsules

On prépare 1000 capsules de gélatine dure cons-

tituées par deux pièces pour une utilisation orale, cha-

cune d'entre elles contenant 200 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et 250 mg de chlorhydrate de tétracycline, à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 200 g Chlorhydrate de tétracycline 250 g Talc 75 g Stéarate de magnésium 25 g Les ingrédients sont mélangés intimement et

ensuite encapsulés de la manière habituelle.

Les capsules précédentes s'avèrent intéres-

santes pour le traitement général d'infection chez les êtres humains adultes par l'administration orale d'une

capsule toutes les six heures.

En utilisant le processus ci-dessus, on pré-

pare d'une façon similaire des capsules contenant du

U-57930 E ou du U-60970 E et chacun des antibiotiques sui-

vants à la place de la tétracycline en substituant 250 g

de ces autres antibiotiques à la tétracycline: chloramphé-

nicol, oxytétracycline, chlortétracycline, fumagilline, érythromycine, streptomycine, dihydronovobiocine et novobiocine Lorsque l'on doit utiliser une pénicilline, telle que de la pénicilline G potassium, à la place de

la tétracycline, on utilise 250 000 unités par capsule.

Ces produits de combinaison s'avèrent in-

téressants pour le traitement général d'infections

mixtes chez les êtres humains adultes par l'administra-

tion orale d'une capsule toutes les six heures. Exemple de composition 3 Comprimés

On prépare 1000 comprimés pour une utilisa-

tion orale, chacun d'entre eux contenant 500 mg de U-57930 E ou de U60970 E, à partir des types suivants et des quantités suivantes de matières: U-57930 E ou U-60970 E 500 g Lactose 125 g Amidon de mats 65 g Stéarate de magnésium 25 g Les ingrédients sont intimement mélangés et agglomérés Les agglomérats sont brisés en les faisant traverser un tamis N O 16 Les granules résultants sont

ensuite amenés sous la forme de comprimés, chaque com-

primé contenant 500 mg de U-57930 E ou de U-60970 E.

Les comprimés précédents s'avèrent intéres-

sants pour le traitement général d'infections, notam-

ment des infections malariennes, chez les êtres humains adultes par l'administration orale d'un comprimé trois

fois par jour.

En utilisant le processus ci-dessus, à l'exception du fait que l'on réduit la quantité de

U-57930 E ou de U-60970 E à 250 g, on prépare des compri-

més contenant 250 mg de U-57930 E ou de U-60970 E. Exemple de composition 4 Comprimés On prépare 1000 comprimés oraux, chacun de ceux-ci contenant 250 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et 250 mg en tout ( 83,3 mg de chaque) de sulfadiazine, de sulfamérazine et de sulfaméthazine, à partir des types suivants et des quantités suivantes de matières: U-57930 E ou U- 60970 E 250 g Sulfadiazine 83,3 g Sulfamérazine 83,3 g Sulfaméthazine 83, 3 g Lactose 50 g Amidon de mats 50 g Stéarate de calcium 25 g Pétrolatum liquide léger 5 g Les ingrédients sont intimement mélangés et

agglomérés Les agglomérats sont brisés en les fai-

sant passer au travers d'un tamis n 16 Les granules

résultants sont ensuite amenés sous la forme de com-

primés, chaque comprimé contenant 250 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et une quantité totale de 250 mg ( 83,3 mg

de chaque) de sulfadiazine, desulfamérazine et de sul-

faméthazine. Les comprimés précédents s'avèrent intéressants

pour le traitement général d'infections par l'administra-

tion orale de quatre comprimés d'abord et ensuite d'un

comprimé toutes les six heures.

Pour le traitement des infections urinaires, on remplace avantageusement les trois composés sulfas

dans la formulation précédente par 250 g de sulfaméthyl-

thiadiazole ou par 250 g de sulfacétamide.

Exemple de composition 5 Sirop oral On prépare 1000 cc d'une suspension aqueuse pour utilisation orale, contenant dans chaque dose de 5 cc 250 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et 500 mg de

la totalité des composés sulfas, à partir des types sui-

vants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 50 g Sulfadiazine 33,3 g Sulfamérazine 33,3 g Sulfaméthazine 33,3 g Acide citrique 2 g Acide benzoique 1 g Sucrose 700 g Gomme adragante 5 g Essence de citron 2 cc Eau désionisée, quantité suffisante pour faire 1000 cc L'acide citrique, l'acide benzotque, le sucrose, la gomme adragante, et l'essence de citron sont dispersés dans uns quantité suffisante d'eau pour faire

800 cc de solution Le U-57930 E ou U-60970 E et les com-

posés sulfas finement divisés sont agités dans le sirop jusqu'à ce qu'ils soient uniformément distribués On

ajoute une quantité suffisante d'eau pour faire 1000 cc.

La composition ainsi préparée s'avère intéres-

sante dans le traitement général de la pneumonie chez les âtres humains adultes à raison de 1 cuillerée à

soupe ( 10 cc) quatre fois par jour.

Exemple de composition 6 Solution parentérale On prépare une solution aqueuse stérile pour une utilisation intramusculaire, contenant 200 mg de U-'7930 E ou de U-60970 E dans 1 cc, à partir des types suivants et des quantités suivantes de matières: U-57930 E ou U-60970 E 200 g Chlorhydrate de lidocaine 4 g Méthylparaben 2,5 g Propylparaben 0,17 g Eau pour injection, quantité suff 1000 cc Les ingrédients sont dissous dans l'eau et la solution est stérilisée par filtration La solution stérile est versée dans des fioles et les fioles sont scellées. Exemple de composition 7 Préparation paren- térale On prépare une composition aqueuse stérile pour une utilisation intramusculaire, contenant dans 1

cc 200 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et 400 mg de sul-

fate de spectinomycine, à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou-U-60970 E 200 g Sulfate de spectinomycine 400 g Lactose 50 g Eau pour injection, quant suff 1000 cc

Le U-57930 E ou U-60970 E, le sulfate de spec-

tinomycine, et le lactose sont dispersés dans l'eau et stérilisés La composition stérile, à raison de 2 cc,

est versée de manière aseptique dans des fioles sté-

riles.

Exemple de composition 8 Pommade topique On prépare 1000 g de pommade à 0, 25 % à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 2,5 g Oxyde de zinc 50 g Calamine 50 g Pétrolatum liquide (lourd) 250 g Graisse de laine 200 g Pétrolatum blanc, quant suff 1000 g Le pétrolatum blanc et la sont fondues et on y ajoute 100 g de graisse de laine pétrolatum liquide On ajoute le U-57930 E ou U-60970 E, l'oxyde de zinc et la calamine au pétrolatum liquide restant et on broie le mélange jusqu'à ce que les poudres soient finement

divisées et uniformément dispersées On agite le mé-

lange pulvérulent dans le mélange de pétrolatum blanc et on poursuit l'agitation jusqu'à ce que la pommade se congèle.

La pommade précédente est appliquée utile-

ment par voie topique sur la peau des mammifères pour

le traitement d'infection.

La composition précédente peut ttre préparée

en omettant l'oxyde de zinc et la calamine.

En suivant le processus ci-dessus, on prépa-

re d'une façon similaire des pommades contenant du U-57930 E ou U-60970 E en des quantités de 0,5, 1, 2 et % en substituant 5, 10, 20 et 50 g de U57930 E ou de

U-60970 E aux 2,5 g utilisés ci-dessus.

Exemple de composition 9 Crème On prépare 1000 g d'une crème vaginale à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U57930 E ou U-60970 E 50 g Tegacide régulier 1 150 g Spermaceti 100 g Propylène glycol 50 g Polysorbate 80 5 g Méthylparaben 1 g Eau désionisée, quant suff pour faire 1000 g 1 Glyd 6 Iyl monostéarate autoémulsifiant délivré par Goldschmidt Chemical Corporation, New York, N Y.

Le Tegacide et le spermaceti sont fondus en-

250414 E

semble à une température de 70 -80 C On dissout le méthylparaben dans environ 500 g d'eau et on ajoute à leur tour le propylène glycol, le Polysorbate 80 et le U-57930 E ou U-60970 E, en maintenant une température de 75 -80 C On ajoute lentement le mélange à base de méthylparaben aux Tegacide et spermaceti fondus, tout

en agitant constamment On poursuit l'addition pen-

dant au moins 30 minutes tout en poursuivant l'agita-

tion jusqu'à ce que la température tombe à 40 -45 C.

Le p H de la crème finale est ajusté à 3,5 par l'incor-

poration de 2,5 g d'acide citrique et de 0,2 g de phos-

phate sodique dibasique dissous dans environ 50 g d'eau Finalement, on ajoute uns quantité suffisante d'eau pour amener le poids final à 1000 g et on agite la préparation pour maintenir l'homogénéité jusqu'au

moment o elle est refroidie et congelée.

La composition précédente s'avère intéressan-

te pour le traitement d'infections vaginales chez les

tres humains.

Exemple de composition 10 Pommade ophthal-

mique On prépare 1000 g d'une pommade ophthalmique contenant 0,5 % de U57930 E ou de U-60970 E à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 5 g Bacitracine 12,2 g Sulfate de polymyxine ( 10 000 unités/ mg 1 g Pétrolatum liquide léger 250 g Graisse de laine 200 g

Pétrolatum blanc, quantité suffi-

sante pour faire 1000 g

Les ingrédients solides sont finement divi-

sés au moyen d'un microniseur à air et ajoutés au pé-

trolatum liquide léger On fait passer le mélange dans

un broyeur à colloîde de manière à distribuer uniformé-

ment les particules micronisées La graisse de laine

et le pétrolatum blanc sont fondus ensemble, et fil-

trés, et la température est ajustée à 45 -50 C On ajoute la pate à base de pétrolatum liquide et on agite la pommade jusqu'à ce qu'elle se congèle D'une façon appropriée, on emmagasine la pommade dans des tubes

ophthalmiques de 3,7 cm 3.

La pommade précédente est utilement appli-

quée sur l'oeil pour le traitement d'infections locali-

sées chez les êtres humains et chez les animaux.

D'une manière avantageuse, la composition

précédente peut contenir 5 g ( 0,5 %) de méthylpredni-

solone pour le traitement d'inflammation, et, suivant

une variante, on peut omettre la bacitracine et le sul-

fate de polymyxine B. Exemple de composition 11 Gouttes pour les veux et les oreilles

On prépare 1000 cc d'une solution aqueuse sté-

rile pour les yeux ou les oreilles contenant 10 mg de

U-57930 E ou de U-60970 E et 5 mg de méthylpredniso-

lone dans chaque cc, à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 10 g Phosphate de méthylprednisolone sodique 5 g Citrate de sodium 5 g Bisulfite de sodium 1 g Polyéthylène glycol 4000 120 g Chlorure de myristyl-y-picolinium 0,2 g Polyvinylpyrrolidone 1 g Eau désionisée ajoutée,quant suff pour faire 1000 cc Les ingrédients sont dissous dans l'eau et

la solution résultante est stérilisée par filtration.

La solution est versée aseptiquement dans des récipients

du type flacons compte-gouttes.

La composition ainsi obtenue s'avère inté- ressante dans le traitement topique d'inflammation et d'infection de l'oeil et de l'oreille ainsi que d'autres

* tissus sensibles du corps de l'être humain ou de l'ani-

mal. Exemple de composition 12 Dragées

On prépare 10 000 dragées à partir des ty-

pes suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U60970 E 100 g Sulfate de néomycine 50 g Sulfate de polymyxine ( 10 000 unités/mg) 1 g Aminobenzoate d'éthyle 50 g Stéarate de calcium 150 g

Sucrose pulvérulent,quantité suffi-

sante pour faire 5000 g Les matières pulvérulentes sont mélangées intimement et ensuite amenées sous la forme de dragées de 0,5 g en utilisant les techniques usuelles pour la

préparation de comprimés.

Les dragées sont maintenues dans la bouche

et on les laisse se dissoudre lentement pour le trai-

tement de la bouche et de la gorge des êtres humains.

Exemple de composition 13 Suppositoire rectal On prépare 1000 suppositoires, chacun de ceux-ci pesant 2,5 g et contenant 100 mg de U57930 E

ou de U-60970 E, à partir des types suivants et des quan-

tités suivantes d'ingrédients:

2504 142

U-57930 E ou U-60970 E 100 g Sulfate de polymyxine B ( 10 000 unités/mg) 1,25 g Méthylprednisolone 1 g Aminobenzoate d'éthyle 75 g Oxyde de zinc 62,5 g Propylène glycol 162,5 g Polyéthylène glycol 4 000, quant suff 2 500 g

On ajoute le U-57930 E ou U-60970 E, le sulfa-

te de polymyxine B, la méthylprednisolone, l'aminoben-

zoate d'éthyle, et l'oxyde de zinc au propylène glycol et on broie le mélange jusqu'à ce que les poudres soient finement divisées et uniformément dispersées On fond le polyéthylène glycol 4 000 et on ajoute lentement la

dispersion à base de propylène glycol avec agitation.

La suspension est versée dans des moules non refroidis

à 40 C.

On laisse la composition se refroidir et se

solidifier et on la sépare ensuite du moule et on enrou-

le chaque feuille de suppositoire.

Les suppositoires précédents sont introduits

par la voie rectale pour le traitement local d'inflam-

mations et d'infections.

Suivant une variante, la composition suivante

peut être préparée en omettant le stéro 5 de.

Exemple de composition 14 Pommade pour la mastite

On prépare 1000 g d'une pommade pour le trai-

tement de la mastite des vaches laitières à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 25 g Acétate de méthylprednisolone 0,5 g Pétrolatum liquide léger 300 g Chlorobutanol, anhydre 5 g Polysorbate 80 5 g Gel d'huile d'arachides contenant 2 % de monostéarate d'aluminium 400 g Pétrolatum blanc, quant suff pour faire 1000 g

Le U-57930 E ou U-60970 E et l'acétate de mé-

thylprednisolone sont broyés avec le pétrolatum liquide

léger jusqu'à ce qu'ils soient finement divisés et uni-

formément dispersés On chauffe le chlorobutanol, le

polysorbate 80, le gel d'huile d'arachides et le pétrola-

tum blanc jusqu'à 49 C de manière à former une masse fondue et on agite dans celle-ci la dispersion à base de pétrolatum liquide Tout en poursuivant l'agitation, on laisse la dispersion se refroidir (et se congeler) jusqu'à la température ambiante et on la verse dans des

seringues pour mastite disponibles en doses de 10 g -

Exemple de composition 15 Aliment pour ani-

maux On prépare 1000 g d'un mélange alimentaire à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 10 g Farine de soja 400 g Farine de poissons 400 g Huile de germe de blé 50 g Mélasse de sorgho 140 g

Les ingrédients sont mélangés ensemble et ame-

nés sous forme de boulettes La composition peut être donnée à des animaux de laboratoire, c'est-à-dire des rats, des souris, des cobayes et hamsters, pour la

prophylaxie au cours du transport.

Pour d'autres animaux tels que la volaille, par exemple les poulets, les canards, les dindes et les oies, la composition peut être ajoutée à l'alimentation

régulière de l'animal en une quantité calculée pour con-

férer la dose désirée de U-57930 E ou de U-60970 E. Exemple de composition 16 En suivant le processus de chacun des exemples

de composition 1 à 15 précédents, on substitue chaque com-

posé antibactériennement actif de l'invention en une quantité équivalente au U-57930 E ou U-60970 E donné

dans l'exemple pour conférer des propriétés thérapeuti-

ques.

D'une façon similaire, on peut utiliser chacun des composés de base libres sous la forme d'un

sel pharmaceutiquement (ou pharmacologiquement) accep-

table, par exemple le chlorhydrate, le sulfate, les sels phosphorique de sodium, de potassium, de calcium

et de lithium.

Exemple de composition 17 Capsules

On prépare 1000 capsules de gélatine dure for-

mées de deux pièces pour une utilisation orale, chacune d'entre elles contenant 200 mg de U-57930 E ou de U-60970 E et 200 mg de sulfate d'hydroxychloroquine, à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U-60970 E 200 g Sulfate d'hydroxychloroquine 200 g Talc 75 g Stéarate de magnésium 25 g Les ingrédients sont intimement mélangés et

ensuite encapsulés de la manière habituelle.

Les capsules précédentes s'avèrent intéres-

santes pour empêcher les attaques répétées de P vivax chez les être humains adultes par l'administration

orale de 1 capsule chaque semaine.

Exemple de composition 18 Comprimés On prépare 1000 comprimés oraux, chacun de ceux-ci contenant 125 nf de U-57930 E ou de U-60970 E et

325 mg de sulfate de quinine, à partir des types sui-

vants et des quantités suivantes de matières: U-57930 E ou U-60970 E 125 g Sulfate de quinine 325 g Lactose 50 g Amidon de mals 50 g Stéarate de calcium 25 g Pétrolatum liquide léger 5 g Les ingrédients sont intimement mélangés et agglomérés Les agglomérats sont brisés en les faisant

passer à travers un tamis N O 16 Les granules résul-

tants sont ensuite amenés sous la forme de comprimés, chacun d'entre eux contenant 125 mg de U-57930 E ou de

U-60970 E et 325 mg de sulfate de quinine.

Les comprimés précédents s'avèrent intéres-

sants pour le traitement de la malaria par l'administra-

tion orale de deux comprimés toutes les 8 heures pendant

7 jours, ensuite de 1 comprimé trois fois par jour pen-

dant 7 jours.

Exemple de composition 19 Sirop oral On prépare 1000 cc d'une suspension aqueuse pour une utilisation orale, contenant dans chaque dose de 10 cc 25 mg de pyriméthamine, 250 mg de U-57930 E ou

de U-60970 E et 500 mg de sulfadiazine, à partir des ty-

pes suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U-57930 E ou U60970 E 25 g Pyriméthamine 2,5 g Sulfadiazine 50 g Acide citrique 2 g Acide benzoique 1 g Sucrose 700 g Gomme adragante 5 g Essence de citron 2 cc Eau désionisée, quantité suffisante pour faire 1000 cc

L'acide citrique, l'acide benzoique, le sucro-

se, la gomme adragante, et l'essence de citron sont dis-

persés dans une quantité suffisante d'eau pour faire

850 cc de solution Le U-57930 E ou U-60970 E, la pyri-

méthamine et la sulfadiazine sont agités dans le sirop jusqu'à ce qu'ils soient uniformément distribués On

ajoute une quantité suffisante d'eau pour faire 1000 cc.

La composition ainsi obtenue s'avère inté-

ressante dans le traitement prophylactique de la malaria chez les êtres humains adultes à raison de 1 cuillerée

à soupe ( 10 cc) par semaine.

Exemple de composition 20 Préparation paren-

térale On prépare une composition aqueuse stérile pour une utilisation intramusculaire, contenant dans 1 cc 200 mg de U-57930 E ou de U-60970 E à partir des types suivants et des quantités suivantes d'ingrédients: U57930 E ou U-60970 E 200 g Lactose 50 g Eau pour injection, quantité suffisante pour faire 1000 cc

C 4 1 4 2

Le U-57930 E ou U-60970 E et le lactose sont dispersés dans l'eau et stérilisés La composition stérile, à raison de 2 cc, est versée aseptiquement

dans des fioles stériles.

Exemple de composition 21

En suivant le processus de chacun des exem-

ples suivants, on substitue chaque composé actif du point de vue antimalarien de la présente invention en une quantité équivalente au U57930 E ou U-60970 E donné

dans l'exemple pour conférer des propriétés thérapeuti-

ques D'une manière similaire, on peut utiliser chacun

des composés ci-dessus sous la forme d'un sel pharmaceu-

tiquement (ou pharmacologiquement) acceptable, par

exemple du chlorhydrate, du sulfate, ou un sel phospho-

rique, de sodium, de potassium, de calcium ou de lithium.

Résultats in vivo vis-à-vis de P berqhei Composé MED l(mg/kg) CD 502 (mg/kg) Sous-cut 3 Orale Sous-cut Orale

U-57930 E 0,16 1,6 16 ( 12-22) > 50

U-21251 F < 20 53 ( 46-61)

U-24729 A < 1,25 4,7 ( 3,2-6,9)

U-8284 chloroquine < 5-10 12,5 11,5 ( 8,8-15) 14 Chloroquine (PO 4)2 < 5 < 20

4 - 20-

1 MED = dosage auquel le temps de survie moyen (ST 50) est accru de façon significative (p= 0,05) par rapport

au ST 50 de témoins non traités.

CD = dose protectrice moyenne en mg/kg,limites de 95 % 3 50 Voie d'administration Essai antimalarien (P berghei) Méthode d'essai:

Des souris CF-1 males ( 18-20 g) sont ras-

semblées en groupes de dixetscntinfctsparvoieintrapéri-

tonéale avec du sang entier provenant de souris infectées avec P berqhei 3 jours avant la saignée Une quantité de 0,2 ml de sang héparinisé, dilué à 1/10 avec

une solution saline, sert d'inoculum Ce volume con-

tient approximativement 106 parasites. 4-heures après l'infection, chaque groupe de souris est traité,sit larvaie sous -cutanée avec 0,2 ml

soit par voie orale par gavage, avec 0,5 ml de la con-

centration en médicament désirée On poursuit le trai-

tement une fois par jour pendant 4 jours On observe

les animaux pendant 28 jours et on enregistre leur mort.

Les morts enregistres avant le sixième jour sont consi-

dérées comme étant traumatiques.

L'évaluation pour déterminer l'efficacité

des différents analogues et des concentrations en médi-

cament des analogues individuels est basée sur le temps

de survie moyen des animaux à chaque niveau de traite-

ment et sur la dose protectrice moyenne de l'analogue

individuel Les calculs sont enregistrés sur un ordina-

teur numérique IBM 370 Les résultats basés sur les groupes traités sont comparés aux résultats obtenus avec des groupes non traités ou avec des groupes traités avec

de la chloroquine.

D'autres protozoaires entrant dans le cadre du procédé de la présente invention sont les parasites intracellulaires, par exemple les espèces appartenant

aux plasmodies, toxoplasmes, et leishmanies, les protozo-

aires qui digèrent les globules rouges de patients trai-

tés, par exemple Entamoeba histolytica et certains trypanosomes, ainsi que d'autres helminthes qui ingèrent les globules rouges au cours des processus morbides, par

exemple les schistosomes.

250414 E

Claims (11)

REVENDICATIONS

1 Le 3-( 5 '-ribonucléotide) d'un composé répon-

dant à la formule: :H 2 t: CH 3 HO O

R 3

H SCH 3

OH dans laquelle R 1, qui peut être substitué une ou plusieurs fois en position 3, 4, 5, 7, 8 ou 9 du noyau, est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, un radical alkyle et alkyle substitué dont la portion alkyle comprend 1 à

8 atomes de carbone, et les formes isomériques correspon-

dantes, un radical cycloalkyle et cycloalkyle substitué, l'oxygène substitué, l'azote substitué, un halogène, un radical phényle et phényle substitué, -(CH 2)n-OH, -(CH 2)n-NR 4 R 5 et les formes isomériques correspondantes, N étant un nombre entier de 1 à 8, R 4 et R 5 représentent H ou un radical alkyle

ayant 1 à 8 atomes de carbone et les formes isomériques cor-

respondantes; R 3 est choisi dans le groupe comprenant H, CH 3, C 2 H 5 et -CH 2-CH 2-OH; N est un nombre entier ayant une valeur de 1 à 4, Y est choisi entre un radical 7 (S)-halogéno

et 7 (R)-halogéno; et ses sels pharmaceutiquement accepta-

bles.

2 Composé suivant la revendication 1, carac-

térisé en ce que le radical 7 (S)-halogéno est un radical

7 (S)-chloro ou 7 (S) 7 (S)-chloro.

3 Le 3-( 5 '-ribonucléotide) d'un composé de formule:

C 2 H 5

H I C-X

dans laquelle X est choisi entre les groupements 7 (S)-

halogénométhyl-l-thio-a-lincosaminide et 7 (R)-halogéno-

méthyl-l-thio-a-lincosaminide; ou un sel pharmaceutique-

ment acceptable de ce composé.

4 Le 3-( 5 '-ribonucléotide) d'un composé de formule: ou

2 H 5

Call IC H C-x H

dans laquelle X a la définition donnée dans la revendica-

tion 4, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ce composé. 0 ú e HN i oz HO

A 1

H:) -0-d -

Il N

N S 1

4 HLI 4 ueuiacino xb un aquasa-zdaz E OT Tanbt,-l surp, 0 L H

1 1

CH:) r HDHD : e Tnmzoj op qsodwoz un -S ú 9 N O I -P-O-ii O Hk OH OH ou

OH

NH 2 N

'I

-P-0-CH 2

OH

OH OH 4

6 Procédé de préparation des 3-< 5 '-ribornucléo-

tides) d'un composé de formule CH 3 C-t H Ra HO Ä OH

2504 142

dans laquelle R 1, qui peut être substitué une ou plusieurs fois en position 3, 4, 5, 7, 8 ou 9 du noyau, est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, un radical alkyle et alkyle substitué dont la portion alkyle comprend 1 à 8 atomes de carbone, et les formes isomériques correspondantes, un radical cycloalkyle et cycloalkyle substitué, l'oxygène substitué, l'azote substitué, un halogène, un radical phényle et phényle substitué, -(CH 2)n-OH, -(CH 2)n-NR 4 R 5 et les formes isomériques correspondantes, N étant un nombre entier de 1 à 8, R 4 et R 5 représentent H ou un radical alkyle ayant 1 à 8 atomes de carbone et les formes isomériques correspondantes; R 3 est choisi dans le groupe comprenant H, CH 3, C 2 H 5 et -CH 2-CH 2-OH; n est un nombre entier ayant une valeur de I à 4, Y est choisi entre un radical 7 (S)- halogéno et 7 (R)-halogéno; et de ses sels pharmaceutiquement acceptables, procédé caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver

Strentomyces rochei NRRL 3533 dans un milieu aqueux con-

tenant des substances nutritives convenables, en présence d'un composé de la formule ci-dessus, et à isoler du milieu

de culture le 3-( 5 '-ribonucléotide) désiré.

7 Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou en ce qu'elle contient un 3-( 5 '-ribonucléotide) suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 5.