CH653037A5

CH653037A5 - Ribonukleotide von clindamycinanalogen, verfahren zu ihrer herstellung sowie diese verbindungen enthaltende arzneimittel.

Info

Publication number: CH653037A5
Application number: CH2386/82A
Authority: CH
Inventors: Alexander Demetrios Argoudelis; David Womack Stroman
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1981-04-20
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1985-12-13
Also published as: IL65385A; SU1303036A3; DE3213921A1; ES8308927A1; CA1163938A; GB2097002B; FR2504142A1; IT8220810A0; SE8202433L; FR2504142B1; PL236043A1; HU191085B; GB2097002A; ES511499A0; AU8198882A; IL65385A0; KR830010195A; IT1151719B; SE459861B; KR880002416B1

Description

Die Erfindung betrifft 3-(5'-Ribonukleotide) von clindamycin-artigen Verbindungen, bei denen die Propylhygrinsäureeinheit durch verschiedene zyklische Aminosäuren ersetzt ist. In unerwarteter Weise besitzen diese Nukleotide eine ebenso hohe in-vivo-Aktivität gegen Bakterien wie die Mutterverbindungen. Wegen dieser hochrelevanten Eigenschaften können diese erfin-dungsgemässen Nukleotide der genannten Verbindungen als Hauptkandidaten zum medizinischen Gebrauch angesehen werden. Die Verbindungen eignen sich ferner zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von durch parasitäre Protozoen befallene Menschen und Tieren. Wenn das Protozon beispielsweise ein Malariaparasit ist, kann es sich bei dem befallenen Tier beispielsweise um eine mit Plasmodium berghei befallene Maus handeln. Vögel, z. B. Enten, können mit P. lophurae,

Hühner von P. gallinaceum befallen sein. Säugetiere, wie Prima- 15 ten, z. B. Affen, können mit P. cynomolgi infiziert sein. Menschen können mit P. falciparum, P. vivax und P. malariae infiziert sein.

Mit parasitären Protozoen der Klasse Sporazoa, Ordnung Coccidia (Mikroparasit, der Coccidiosis hervorruft) befallene 20 Säugetiere können durch Verabreichung der erfindungsgemäs-sen Verbindungen behandelt werden. So können beispielsweise mit Eimeria zurnii, E. bovis oder E. ellipsoidalis infizierte Rinder, mit E. parva oder E. faurei infizierte Schafe und Ziegen, mitE. debliecki, E. scabra oder Isospora suis infizierte Schweine, mit Isospora bigemina, I. felis, E. canis oder E. felina infizierte Hunde und Katzen, mit E. tenella infiziertes Geflügel, mit E. stiedae oder E. perforans infizierte Kaninchen und mit E.

mustelae infizierte Nerze erfolgreich behandelt werden.

Die erfindungsgemässen 3-(5'-Ribonukleotide) von Clinda-mycinanalogen sind solche Verbindungen, bei welchen die 3-Stellung des Clindamycinanalogens mit der 5'-Stellung des Ribo-nukleotidteils verbunden ist. Diese Verbindungen weisen die folgenden Formeln auf 35

HC-Cl

NH-CH

S-CH3

CH,

HC-Cl

C-NH — CH

30

S-CH,

Im speziellen weisen bevorzugte Verbindungen gemäss der Erfindung folgende Formeln auf:

CH,CH,

N H

CH3

I

H-C-Cl

-C0NH— CH

40

(I)

SCH3

worin R für

SCH3

worin bedeuten:

Ri einen oder mehrere Substituenten in 3-, 4-, 5-, 7-, 8- oder 9-Stellung des Ringes, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff, Halogen, gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiertes Cyclo-alkyl, substituierter Sauerstoff oder Stickstoff, und gegebenenfalls substituiertes Phenyl,

R, H, CH3, C2H5 oder -CH2-CH2-OH;

n eine ganze Zahl von 1-4 und Y 7(S)-Halogen oder 7(R)-Halogen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können auch als pharmazeutisch annehmbare Salze vorliegen.

Bevorzugte Gruppen Rj sind neben unsubstituiertem Alkyl auch substituierte Alkylgruppen der Formel -(CH2)„ OH oder der Formel -(CH2)n-NR4R5 mit n gleich einer ganzen Zahl von 1 bis 8 und R4 und R5 gleich Wasserstoff oder Alkylresten mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen.

Bevorzugte erfindungsgemässe Verbindungen sind 3-(5'-Ribonukleotide) von Clindamycin-Analogen der folgenden Formeln:

•OH OH

steht,

CH2CHs

60

65

CH3 !

H-C-Cl

I

-C0NH— CH

SCH3

653 037

oh

L JI JJ

io

•n

0 II

-p-o-ch2

1

oh .

oh oh.

steht.

15 Alle dieser bevorzugten 3-(5'-Ribonukleotide) können auch als pharmazeutisch verträgliche Salze vorliegen.

Das Verfahren zur Herstellung von 3-(5'-Ribonukleotiden) einer Verbindung der Formel

(I)

SCH-j worin die Substituenten weiter oben definiert sind, ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium mit geeigneten Nährstoffen Streptomyces rochei NRRL 3533 in 35 Gegenwart einer Verbindung der oben angegebenen Formel I züchtet und das gewünschte 3-(5 '-Ribonukleotid) der definierten Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert. Erhaltene Verbindungen können in die entsprechenden Salze überführt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist also eine mikrobiologi-40 sehe Umwandlung, wobei sich eine Mischung von Ribonukleoti-den bildet, die über die 5'-Stellung des Ribonukleotidteils mit der 3-Stellung der Clindamycin-Ausgangsverbindung verbunden sind. Beim erfindungsgemässen Verfahren ist das Clindamycin-Analoge das Haupt-Ausgangsmaterial. Ebenfalls sind die Nähr-43 stoffe sowie die Mikroorganismen Streptomyces rochei NRRL 3533 als Ausgangsmaterialien zu betrachten. Aus dem Mikroorganismus sowie Gruppen der Nährstoffe bildet sich durch ein mikrobiologisches Verfahren der Ribonukleotid-Teil der Endverbindung.

50 An die 3-Stellung der Clindamycin-Ausgangsverbindung lagert sich ein Nukleotid der Adenyl-, Guanyl-, Citidyl- oder Uridylsäure an.

Eine unter die Formel I fallende Verbindung, nämlich U-57930, entspricht der nachfolgend angeführten Formel Ia. Nach-55 folgend sind ebenfalls die genannten Nukleotide dargestellt.

60

65

jet Eri R = H

653 037

ii. r- -

iv: r>

oh oh

A_.

-p-o-ch2

ìh b0

nha o

Il 5 v:r= -p-0-ch2

I

oh oh oh la. U-57930

II. U-57930 3-(5'-Cytidylat)

III. U-57930 3-(5'-Adenylat)

IV. U-57930 3-(5'-Uridylat)

V. U-57930 3-(5'-Guanylat)

P

oh oh n 15

20

25

30

Die Ausgangsverbindung Ia-IV kann man gemäss den Lehren des US-PS 4278789 erhalten.

Die3-(5'-Ribonukleotide) der Verbindungen Ia-IV erhält man z. B. gemäss der US-PS 3 671647. Die Salze dieser Nukleo- 35 tide kann man ebenfalls gemäss den Lehren der US-PS 3 671647 erhalten.

Die erfindungsgemässen Nukleotide können entsprechend der DE-OS 3 043 502 zu Arzneimitteln verarbeitet werden. Diese Arzneimittel erhält man, indem man die jeweils aktive Verbindung der aaO angegebenen Beispiele durch ein Nukleotid gemäss der Erfindung ersetzt. Der Ersatz kann auf äquimolarer Basis erfolgen.

Im folgenden werden die Test- und Charakterisierungsmass-nahmen zur Bestimmung und Charakterisierung der erfindungs gemässen Nukleotide näher erläutert:

40

45

Test der 3-(5'-Ribonukleotide)

Da den erfindungsgemässen 3-Ribonukleotiden eine in-vitro-Aktivität gegen Bakterien fehlt, lässt sich ihre Bildung aus den antibakteriell wirksamen Ausgangsverbindungen ohne weiteres durch Messen des Verlusts dieser antibiotischen Aktivität verfolgen. Zur Bestimmung der Mengen an antibakteriell aktiver Ausgangsverbindung in Kulturfiltraten oder Reaktionsgemi- 55 sehen bedient man sich eines Standardtests mit Sacrina lutea ATCC9341.

Zur Bestimmung der Anwesenheit der 3-Ribonukleotide in Gärbrühen, Extrakten und gereinigten Substanzen wird zunächst die Phosphodiesterbindung mit roher alkalischer Phosphatase 60 oder Schlangengiftphosphodiesterase in der im folgenden beschriebenen Weise hydrolysiert. Die antibakteriell aktive Verbindung im Hydrolysat wird dann nach einem Standardtest bestimmt.

Enzymatische Hydrolysemassnahmen Alkalische Phosphatase:

Vorratslösungen (0,5 mg/ml, 0,54 Einheiten/mg) von alkali-

65

scher Phosphatase aus Taubendarm, EC 3.1.3.1 (Sigma) werden inTris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid-Puffer (0,01M, pH-Wert 8,0) zubereitet. Zu behandelnde Proben werden im Verhältnis 1:2 mit dem Enzym/Puffer-Gemisch verdünnt und 18 h bei 28° C inkubiert.

Schlangengiftphosphodiesterase:

Es werden Vorratslösungen (100 mg/ml, 0,026 Einheiten/mg) gereinigter Schlangengiftphosphodiesterase EC 3.1.4.1 (Sigma) in destilliertem Wasser zubereitet. Die Inkubationsgemische enthalten 0,2 ml einer Lösung (1 mg/ml) der zu behandelnden Probe in Wasser, 0,6 ml 0,01 M Tris-(hydrochlorid)-Puffer, pH-Wert: 9,0,0,1 ml 0,3 M MgCl2 und 0,1 ml der Enzymvorratslösung. Die Inkubation dauert 18 h bei 37° C.

Milzphosphodiesterase :

Es werden Vorratslösungen von Milzphosphodiesterase EC 3.1.4.18 (Sigma) (lmg/ml, 19,6 Einheiten/mg) in destilliertem Wasser zubereitet. Die Inkubationsgemische enthalten 0,4 ml einer Lösung (0,5 mg/ml) der zu behandelnden Probe in Wasser, 0,5 ml 0,02 M Tris-Puffer, pH-Wert: 7,0 und 0,1 ml der Enzymvorratslösung. Die Inkubation dauert 18 h bei 37° C.

/

Dünnschichtchromatographische Analyse der Zubereitungen und enzymatischen Hydrolysate Die Herstellung und Reinigung der 3-Ribonukleotide wird durch einen Test gegen S. lutea (vgl. oben) und dünnschichtchro-matographische Massnahmen unter Verwendung von Silikagel G und Methylethylketon/Aceton/Wasser (Volumenverhältnis: 186/ 52/20) oder Ethylacetat/Aceton/Wasser (8:5:1) als Laufmittel überwacht. Die bioaktiven Ausgangsverbindungen werden durch Bioautographie auf mit S. lutea beimpftem Agar nachgewiesen.

Die Produkte der enzymatischen oder chemischen Hydrolyse der 3-Nukleotide werden mittels folgender dünnschichtchroma-tographischer Systeme getrennt:

A: Silikagel-GF-Platten: Wasser als Laufmittel. B: Silikagel-GF-Platten: n-Propanol/konz. Ammoniumhydroxid/Wasser (Volumenverhältnis 55:10:35).

C: NM-Polygramcellulose300:1-Butanol/Wasser/Ameisensäure (Volumenverhältnis: 77:13:10) als Laufmittel.

UV-absorbierende Substanzen werden mittels einer kurzwelliges UV-Licht abstrahlenden Lampe nachgewiesen. Bioinaktive, UV-nicht-absorbierende Substanzen werden mittels eines Per-manganat/Perjodat-Sprühreagenzes nachgewiesen. Der Nachweis bioaktiver Nukleotidsubstanzen erfolgt durch Bioautographie auf mit S. lutea beimpftem Agar.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Züchtungs- bzw. Fermentierungs- und Reinigungsmassnahmen zur Herstellung des Nukleotids der mit U-57930E bezeichneten Verbindung. In entsprechender oder äquivalenter Weise erhält man auch die 3-Ribonukleotide der anderen Ausgangsverbindungen 1 bis 4.

Sofern nicht anders angegeben bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gew.-%». Sämtliche Lösungsmittelgemische sind, sofern nicht anders angegeben, durch ihre Volumenverhältnisse definiert.

Beispiel (Herstellung von 3-(5'-Ribonukleotiden) A. Züchtung

Streptomyces rochei NRRL 3533 wird auf einem Drehrüttler in einem Medium aus 10 g/1 Glukose, 4 g/1 Difco-Pepton, 4 g/1 Difco-Hefeextrakt, 0,5 g/1 MgS04-7H20,2,0 g/1 KH2P04 und 4 g/1K2HP04 drei Tage lang bei 28°C wachsen gelassen. Das gewachsene Mycel dient zum Beimpfen eines dieselben Bestandteile enthaltenden Gärmediums. Die Gärung bzw. Fermentation erfolgt 48 h lang bei 28° C auf einem Drehrüttler. Nach beendeter 48-stündiger Inkubation wird so viel U-57930 zugesetzt, bis eine

7

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Endkonzentration von 50 mg/1 erreicht ist. Danach wird bei 32° C weiter fermentiert. Nach 12 h wird weitere Verbindung U-57930 bis zu einer Gesamtkonzentration von 150 mg/1 zugesetzt. Nach weiteren 12 h wird die Konzentration U-57930 auf 150 mg/1 erhöht. Nach der letzten Zugabe der Verbindung U-57930 wird noch 24 h lang bei 32° C weiter fermentiert. Danach werden die Kulturfiltrate gesammelt. Es zeigt sich, dass sie nicht mehr als 1 mg/1 Verbindung U-57930 enthalten. Die restlichen 249 mg/1 sind in eine bioinaktive Substanz umgewandelt.

S. rochei NRRL 3533 stellt einen bekannten Mikroorganismus dar. Dieser ist auf Anforderung von der NRRL-Hinterlegungs-stelle (Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, III., USA) erhältlich.

B. Isolierungs- und Reinigungsmassnahmen: Isolierung von U-57930-3-Ribonukleotiden aus der Gärbrühe: Adsorption auf Amberlite XAD-2: Etwa 121 Gärbrühe mit 3 g inaktiviertem U-57930 wird bei dem Ernte-pH-Wert von 7,7 unter Verwendung eines Filterhilfsmittels filtriert, worauf der Mycelkuchen mit 1,21 Wasser gewaschen und dann verworfen wird. Das klare Filtrat und das Waschwasser werden miteinander vereinigt, auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und über eine aus 600 ml Amberlite XAD-2 hergestellte Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/min laufengelassen. Das ausgebrauchte Material wird vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf seine Bioaktivität hin getestet und dann verworfen. Die Säule wird mit 21 Wasser gewaschen. Auch die wässrige Waschflüssigkeit hat sich vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase als bioinaktiv erwiesen und wird verworfen. Danach wird die Säule mit Methanol/Wasser (Volumenverhältnis: 70:30) eluiert. Mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min werden 20 ml Fraktionen aufgefangen. Eine Prüfung auf die Bioaktivität vor (—E) und nach (+E) der Behandlung mit alkalischer Phosphatase zeigt folgende Ergebnisse:

Fraktion Nr.

Zone (S. lutea) -E

+E

5

0

10

0

11

0

13

0

36

20

33

55

25

32

54

40

31

50

45

29

48

50

26

39

55

23

38

60

21

37

65

19

27

70

17

26

75

17

26

80

16

26

85

16

26

90

16

26

95

16

26

100

16

26

110

16

21

120

15

21

130

15

21

140

15

21

150

15

21

160

15

21

170

15

21

180

15

21

190

15

21

200

15

21

Die Fraktionen 12 bis 80 werden miteinander vereinigt, zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 12,22 g prep ADA-34.1 erhalten werden.

Bei einer weiteren Versuchsreihe werden 61 Gärbrühe mit 2 g «inaktiviertem» U-57930 in der geschilderten Weise aufgearbeitet. Die methanolischen Eluate aus der Amberlite XAD-2-Säule werden als AD A-143B bezeichnet. Diese Lösung wird nicht zur Trockene eingedampft, stattdessen wird sie in der im folgenden beschriebenen Weise durch Dowex-l-Chromatographie gereinigt.

Dowex-l-Chromatographie: Die Säule wird aus 300 ml Dowex-1 (X-4) in Acetatform hergestellt. Danach wird durch die Säule die methanolische Lösung ADA-143B pH-Wert 8,2) laufengelassen. Die durchgelaufene Flüssigkeit wird in 20 ml-Fraktionen mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min aufgefangen (Fraktionen 1 bis 60). Danach wird die Säule mit 1,51 Wasser gewaschen (10 ml/min; Fraktionen 66 bis 108). Schliesslich wird die Säule mit 5%iger Essigsäure (Geschwindigkeit: 10 ml/min; Fraktionen 109 bis 310) eluiert. Folgende Pools werden gebildet:

Pool 1 Fraktionen 1- 80 1000 ml (ADA-1A)

Pool 2 Fraktionen 81-110 600 ml (ADA-2A)

Pool 3 Fraktionen 111-130 450 ml (ADA-3A)

Pool 4 Fraktionen 131-150 450 ml (ADA-4A)

Pool 5 Fraktionen 151-190 900 ml (ADA-5A)

Pool 6 Fraktionen 191-230 900 ml (ADA-6A)

Pool 7 Fraktionen 231-270 900 ml (ADA-7A)

Pool 8 Fraktionen 271-310 900 ml (ADA-8A)

Eine Prüfung vor (-E) und nach (+E) der Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergibt folgende Ergebnisse:

-E

Zone (S. lutea) +E

Pooll

31

52

2

36

49

3

34

49

4

18

40

5

24

30

6

27

29

7

27

29

8

29

31

Die Pools 1 und 2 werden miteinander vereinigt, zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 1,48 g prep ADA-2.1 erhalten werden.

Die Pools 3 und 4 werden miteinander vereinigt und in entsprechender Weise aufgearbeitet, wobei 2,5 g AD A-2.2 erhalten werden.

Die Produkte AD A-2.1 und -2.2 liefern nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase U-57930.

Die Produkte ADA-34.1, -2.1 und -2.2 werden miteinander vereinigt und in der im folgenden geschilderten Weise durch Gegendoppelstromverteilung gereinigt:

Gegendoppelstromverteilung :

16,20 g des durch Vereinigung der Produkte AD A-34.1, -2.1 und -2.2 erhaltenen Materials werden jeweils in 25 ml eines Lösungsmittelsystems aus gleichen Volumina 1-Butanol und Wasser gelöst, worauf die Lösung in die zentralen Röhrchen einer vollständig aus Glas bestehenden Gegendoppelstromver-teilungsvorrichtung (100 Röhrchen, 25 ml/Phase) gegossen werden. Die Verteilung wird nach 150 Übergängen auf die Bioaktivität vor (-E) und nach (+E) der Behandlung mit alkalischer Phosphatase analysiert. Hierbei werden folgende Ergebnisse erhalten:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

653

Unte

5

10

15

20

25-

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Unte

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

Obei

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Obe

100

95

90

85

80

75

70

65

60

Zone (S. lutea-empfindlich) -E

+E

29 31

30 27 22 17

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Zone (S. lutea-empfindlich)

Zone (S. lutea-empfindlich) -E

17,5 17

19

20

21

22 24 26 28

31 33 33 33

33

34 34 33,5

33

34

35

36

38

39

40

41

42

43 43,5

Zone (S. lutea-empfindlich -E +E

0

45

Spuren

46

15

47

17

47,5

17

47

18

47

17,5

48

17

48

16

48

15

50

Spuren

50

-E

+E

Spuren

49

Spuren

48,5

Spuren

48

Spuren

48,5

Spuren

49

30

50

Spuren

51

15

52-

16

53

21

54

io

55

30

52,5

50

32,5

52

45

33

52

40

35

52

35

36

52

30

39

49

25

41

47

20

43

48

15

43

46

10

43

5

35

Es werden folgende Pools gebildet. Jeder Pool wird zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet, wobei fol-15 gende Produkte erhalten werden:

Pool I: Unterer Sammler 1-50

Pool II: Unterer Sammler 51-100

untere Maschine 50-30 Pool III: Untere Maschine 29-0

obere Maschine 1-50 oberer Sammler 100-30

Die erhaltenen Produkte sind folgende:

20

25

Aus Pool I - Produkt ADA-47.1 (9,78 g)

Aus Pool II - Produkt ADA-47.2 (0,30 g) Aus Pool III - Produkt ADA-47.3 (5,29 g)

30

Die Produkte ADA-47.2 und -47.3 werden miteinander vereinigt und in der im folgenden beschriebenen Weise durch die DEAE-Sephadex-Chromatographie gereinigt.

DEAE-Sephadex-Chromatographie: 300 gDEAE-Sephadex (A-25) werden 1 h lang mit Wasser und 2 h lang mit 0,5 N 35 wässriger Natriumhydroxidlösung verrührt, worauf der Ionenaustauscher so lange mit Wasser gewaschen wird, bis der pH-Wert etwa 7,5 beträgt. Danach wird der Ionenaustauscher 2 h lang mit 0,5 N wässriger Essigsäure verrührt, mit Wasser auf einen neutralen pH-Wert gewaschen, in eine Säule gegossen und 40 unter einem Druck von etwa 920 g auf konstante Höhe gepackt. Danach wird die Säule mit 41 Waser, 810,1 %iger wässriger Lösung von tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan (THAM) und 310,03 M THAM-Acetatpuffer (pH-Wert 8,0), der durch Auflösen von 3,64g THAM und 800 ml Wasser, Einstellen des pH-45 Werts auf 8,0 mit Eisessig und Auffüllen auf ein Volumen von 11 zubereitet worden war, gewaschen.

Das Ausgangsmaterial, nämlich 5,50 g der Produkte ADA-47.2 und -47.3, wird in 20 ml 0,03 M THAM-Acetat-Puffer eines pH-Werts von 8,0 gelöst und auf die Säule gegossen. Die Säule 50 wird dann im Abwärtsstrom mit 0,3 MTHAM-Acetat-Puffer eines pH-Werts von 8,0 eluiert. Jeweils 20 ml-Fraktionen 1 bis 190 werden aufgefangen. Danach wird die Säule im Aufwärtsstrom eluiert, wobei jeweils 11 umfassende Fraktionen A, B, C, D und E aufgefangen werden. Eine Prüfung der Bioaktivität vor 55 (—E) und nach (+E) der Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergibt folgende Ergebnisse:

+E Fraktion Nr.

54

53,5

60

65

3 6 9 12 15 18 21 24

Zone (S. lutea-empfindlich)

-E +E

0 0

9

653 037

27

0

30

0

33

0

36

38

39

43,5

44

42

36

45

23,5

23

48

15

16

51

0

54

0

57

0

60

0

63

0

66

0

69

15

16

72

17

20

75

21

26

78

23

27

81

23

30

84

23

29

87

22

24

90

21

23

93

21

24

96

22

26

99

21

35

102

22

44

105

23

51

108

22,5

54

111

22,5

52,5

114

22

52

117

22

54,5

120

20,5

56

123

20

56

Es werden folgende Pools gebildet:

Pool I Fraktionen 34-38,280 ml (ADA-69B)

Pool II Fraktionen 75-90, 330 ml (AA-69C)

Pool III Fraktionen 101-111,180 ml (ADA-69D)

Pool IV Fraktionen 114-150, 580 ml (ADA-69E)

Pool V Fraktionen 151-164,100 ml (ADA-69F)

Pool VI Fraktionen 165-186,125 ml (ADA-69G)

Pool VII Fraktion C, 1 Liter (ADA-69A)

Der Pool 1 (ADA-69B) enthält nicht veränderte Verbindung U-57930 und wird verworfen.

Der Pool II (ADA-69C) enthält eine unbekannte Substanz, die bei der Behandlung mit alkalischer Phosphatase die Verbindung U-57930 liefert. UV-Spektrum: Xmax 275 nm.

Der Pool III (AD A-69D) enthält U-57930-Cytidylat und wird in der später beschriebenen Weise weiterverarbeitet. UV-Spek-trum: lmax 270 nm.

Der Pool IV (ADA-69E) enthält U-57930-Adenylat und wird in der später beschriebenen Weise weiterverarbeitet. UV-Spek-trum: Xmax 260 nm.

Der Pool V (AD A-69F) enthält ein Gemisch aus U-57930-Adenylat, U-57930-UridylatundU-57930-Guanylat. Diese Lösung wird in der später beschriebenen Weise weiterverarbeitet.

Der Pool VI ( AD A-69G) enthät U-57930-Guanylat und wird in der später folgenden Weise weiterverarbeitet. UV-Spektrum: Xmax 254 nm (Schulter bei 275).

Der Pool VII (ADA-69A) enthält ein Gemisch aus U-57930-Guanylat und U-57930-Uridylat. Diese Lösung wird in der später beschriebenen Weise weiterverarbeitet.

Isolierung von im wesentlichen reinem U-57930-Cytidylat, U-57930-Adenylat und U-57930-Guanvlat aus den Pools III, IV

bzw. VI. Entfernung des THAM-Acetat-Puffers durch Amberlite XAD-2-Chromatographie:

Die in der geschilderten Weise erhaltenen Pools III, IV und VI werden über Amberlite XAD-2-Säulen laufengelassen. Die durchgelaufenen Flüssigkeiten werden verworfen. Danach werden die Säulen mit Wasser gewaschen und mit einem Methanol/ Wasser-Gemisch (Volumenverhältnis 70:30) eluiert. Die Fraktionen werden mittels UV-Licht analysiert und vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf ihre Bioaktivität hin untersucht. Geeignete Fraktionen werden miteinander vereinigt, zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet. Einzelheiten bezüglich der Menge an für jeden Pool verwendetem Amberlite XAD-2, der Menge an Waschwasser, der Menge an methanolischem Eluat und der Menge an erhaltenem Produkt finden sich in der folgenden tabellarischen Zusammenstellung:

Pool verwendete

Waschwasser methano isoliertes Pro

Menge Am in ml lisches Eluat dukt in mg

berlite XAD-2

in ml

III

50

200

300

150

IV

200

800

600

3510

VI

50

200

300

470

Das aus Pool III erhaltene Produkt wird als ADA-73.1, das aus Pool IV erhaltene Produkt als ADA-74.1 und das aus Pool VI erhaltene Produkt als ADA-75.1 bezeichnet.

Entfernung des THAM-Acetatpuffers aus Pool V (ADA-69F) und Pool VII (AD A-69 A) durch Amberlite XAD-2-Chromato-graphie:

Die Säule wird aus 300 ml Amberlite XAD-2 hergestellt. Die ein Gemisch aus U-57930-Adenylat, U-57930-Uridylat und U-57930-Guanylat enthaltenden Pools V und VII werden durch die Säule laufengelassen. Die durchgelaufene Flüssigkeit wird verworfen. Danach wird die Säule mit 600 ml Wasser gewaschen. Das durchgelaufene Wasser wird ebenfalls verworfen. Schliesslich wird die Säule mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (Volumenverhältnis: 70:30) eluiert. Fraktionen mit bioaktivem Material nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden miteinander vereinigt (300 ml), zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 670 mg Produkt ADA-71.1 erhalten werden. Das Produkt ADA-71.1 wird in der später beschriebenen Weise weiterbehandelt.

Trennung von U-57930-Uridylat von U-57930-Adenylat und U-57930-Guanylat. DEAE-Sephadex-Chromatographie: 600 ml von in der geschilderten Weise zubereitetem DE AE-Sephadex in Acetatform werden mit 0,03 M THAM-Acetat-Puffer eines pH-Werts von 8,0 gewaschen und in eine Glassäule eines Innendurchmessers von 4,5 cm unter hydrostatischem Druck bis zu einer Höhe von 40 cm gepackt.

Nun wird das Produkt ADA-71.1 in 10 ml 0,03 M THAM-Acetat-Puffer eines pH-Werts von 8,0 gelöst und auf die Säule gegossen. Die Säule wird eluiert mit:

1.0,03 M THAM-Acetat eines pH-Werts von 8,0 (Fraktionen 1-79)

2.0,12 M THAM-Acetat eines pH-Werts von8,0 (Fraktionen 80-395)

3.0,25 M THAM-Acetat eines pH-Werts von 8,0 (Fraktionen 396-750).

Aufgefangen werden 20 ml umfassende Fraktionen. Sie werden mit Hilfe von UV-Licht analysiert und auf ihre Bioaktivität vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase hin untersucht. Die Fraktionen 51-60 enthalten U-57930-Adenylat, die Fraktionen 62-73 (ADA-94.B) enthalten U-57930-Uridylat und die Fraktionen 75-110 enthalten U-57930-Guanylat.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

653 037

10

Isolierung von im wesentlichen reinem U-57930-Uridylat. Entfernung des THAM-Acetat-Puffers durch Amberlite XAD-2-Chromatographie:

Die Säule wird aus 50 ml Amberlite XAD-2 hergestellt. Der U-57930-Uridylat enthaltende Pool ADA-94B wird mit einer 5 Geschwindigkeit von 2 ml/min über die Säule laufengelassen. Die durchgelaufene Flüssigkeit wird verworfen. Danach wird die Säule mit 200 ml Wasser gewaschen. Das durchgelaufene Waschwasser wird ebenfalls verworfen. Schliesslich wird die Säule mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (Volumenverhältnis10 70:30) eluiert. Die-mittels UV-Licht bestimmt-U-57930-Uridylat enthaltenden Fraktionen (200 ml) werden miteinander vereinigt und zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 60 mg Produkt ADA-95.1 erhalten werden.

15

Charakterisierung von U-57930-3'-(5'-Cytidylat) 1. Tabellarische Auflistung des IR-Spektrums:

Folgende tabellarische Auflistungen enthalten Angaben über die IR-Absorptionen (Nujol und KBr):

Bandenfrequenz Inten- Art Bandenfrequenz Inten- Art

sität

3417.3

24

SH

1249.0

33

3341.1

19

BRD

1214.3

21

3211.8

19

BRD

1146.8

42

3108.6

25

BRD

1089.9

15

2951.4

2

BRD M

1070.6

12

2926.3

1

BRD M

1056.1

14

2854.9

2

BRD M

992.4

39

2729.6

48

BRD M

972.2

39

2693.9

51

SH

955.8

49

2535.7

65

SH

930.7

51

1649.3

8

AVG

889.2

36

1610.7

26

AVG

860.3

52

1575.0

35

AVG

849.7

53

1528.7

31

AVG

804.4

46

1489.2

23

AVG

788.9

40

1462.2

9

AVG M

721.4

44

1404.3

41

BRD

705.0

47

1377.3

18

AVG M

654.9

45

1368.6

31

SHM

632.7

38

1286.6

34

AVG

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Intensität: Die Intensität ist als prozentuale Durchlässigkeit (%T) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks. M: Mögliche Störung durch das Mineralöl.

25 stärkste Peaks

%T Frequenz %T Frequenz

1 2926.2 24 3417.2

2 2951.3 25 3108.5

2 2854.8 26 1610.6

8 1649.2 ' 31 1528.6

9 1462.1 31 1368.5

12 1070.5 33 1249.0 14 1056.0 34 1286.5

15

1089.8

35

1575.0

18

1377.2

36

889.1

19

3341.0

38

632.6

19

3211.7

39

992.3

21

1214.2

39

972.1

23

1489.1

Präparat: Mineralölgemisch Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 87 Ç 1848.0 Prozentuale Durchlässigkeit bei 3800 (cm"1): 83 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

Bandenfrequenz

Intensität

Art

Bandenfrequenz

Intensität

Art

3408.6

10

BRD 1088.9

12

BRD

3102.8

26

SH

1071.5

9

AVG

2963.9

28

AVG

1057.1

11

SH

2930.2

27

BRD

992.4

35

AVG

2878.1

37

AVG

972.2

36

AVG

2862.7

39

SH

956.8

45

SH

2768.1

51

SH

928.8

48

AVG

2511.6

65

BRD

889.2

32

AVG

1649.3

4

AVG

859.3

47

AVG

1614.6

20

SH

851.6

47

SH

1576.0

30

AVG

804.4

39

SH

1528.7

28

AVG

788.9

34

AVG

1491.1

21

AVG

743.6

47

SH

1462.2

33

AVG

705.0

40

AVG

1450.6

35

SH

654.9

39

SH

1404.3

37

AVG

634.6

35

AVG

1384.0

33

AVG

595.1

33

AVG

1360.9

42

SH

572.9

33

AVG

1286.6

32

AVG

525.6

32

AVG

1251.9

30

SH

447.5

36

AVG

1215.2

18

AVG

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

SH

AVG 25

SH

BRD

AVG

SH

AVG 30

AVG

SH

AVG

AVG 35

AVG

SH

AVG

AVG M

BRD 40

SH

AVG

45 BRD = breit

AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter so Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks.

25 stärkste Peaks

55

• 60

65

%T

Frequenz

%T

Frequenz

4

1649.2

30

1251.8

9

1071.5

32

1286.5

10

3408.5

32

889.1

11

1057.0

32

525.5

12

1088.8

33

1462.1

18

1215.1

33

1384.0

20

1614.5

33

595.0

21

1491.0

33

572.8

26

3102.7

34

788.8

27

2930.1

35

1450.5

28

2963.8

35

992.3

28

1528.6

35

634.5

30

1576.0

11

653 037

Präparat: KBR-Pellet

Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 100 Ç 403.1 Prozentuale Durchlässigkeit bei 400 (cm"1): 78 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

2. UV-Absorptionsspektrum [/.max (a)]: 5

In Wasser bei pH-Wert von 2,0: 279 nm (6,5)

pH-Wert von 7,0: 270 nm (9,9)

pH-Wert von 11,0: 271 nm (9,6).

10

3. Elementaranalyse:

Molekülformel: C26H43N5012 SCIP;

Molekulargewicht: 715

Berechnet: C 43,64 H 6,01 N 9,79 O 26,88 S 4,47 Cl 4,89 P 4,33

15

4. Optische Drehung:

[cc]d = +107° (C, 0,854, Wasser).

5. Löslichkeitsverhalten:

Sehr gut löslich in Wasser, Methanol und Ethanol. Schwach 20 löslich in Aceton und sonstigen Ketonen, Ethylacetat und sonstigen Estern, Chloroform und Methylenchlorid. Unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln.

25

6. Antibakterielle Aktivität:

U-57930-3-)5'-Cytidylat) ist in vitro nicht aktiv. Bei der

Behandlung mit alkalischer Phosphatase oder Phosphodiesterase I entsteht U-57930, das gegen die verschiedensten G+-Organis-men sowohl in vitro als auch in vivo hochaktiv ist.

30

7. Fp: 205 bis 207°C (unter Zersetzung).

Charakterisierung von U-57930-3'-(5'-Adenylat) 1. Tabellarische Auflistung des IR-Spektrums: 35

Bandenfrequenz Intensität

Art

Bandenfrequenz

Intensität

Art

3335.3

16

BRD

1245.1

24

SH

3667.8

17

BRD

1213.3

17

AVG

3210.8

17

BRD

1175.7

43

SH

2954.3

3

BRD M

1146.8

40

SH

2924.4

2

BRD M

1089.9

13

AVG

2868.4

6

SHM

1069.6

10

AVG

2854.9

4

AVG M

1055.1

13

SH

2727.6

46

BRD M

991.5

35

AVG

2520.2

61

BRD

972.2

36

AVG

1684.0

22

SH

957.7

45

SH

1641.6

14

AVG

930.7

48

AVG

1600.1

28

AVG

889.2

32

AVG

1576.0

31

AVG

861.3

47

AVG

1550.9

43

SH

848.7

49

AVG

1509.4

53

SH

818.8

45

AVG

1463.1

15

AVG M

798.6

40

AVG

1420.7

35

AVG

722.4

36

AVG M

1377.3

24

AVG M

708.9

40

SH

1367.6

35

SHM

647.1

33

SH

1332.0

36

AVG

635.6

31

AVG

1299.2

34

AVG

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks. M: Mögliche Störung durch das Mineralöl.

25 stärkste Peaks

%T

Frequenz

%T

Frequenz

2

2924.3

22

1684.0

3

2954.2

24

1377.2

4

2854.8

24

1245.0

6 .

2868.3

28

1600.0

10

1069.5

31

1576.0

13

1089.8

31

635.5

13

1055.0

32

889.1

14

1641.5

33

647.0

15

1463.0

34

1299.1

16

3335.2

35

1420.6

17

3267.7

35

1367.5

17

3210.7

35

991.5

17

1213.2

Präparat: Mineralölmischung Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 85 t, 1864.4 Prozentuale Durchlässigkeit bei 3800 (cm"1): 81 Dichte (cm'Vpt): 0,964

Bandenfrequenz

Intensität

Art

Bandenfrequenz

Intensität

Art

3375.8

7

BRD

1090.8

8

AVG

3223.4

10

BRD

1069.6

5

AVG

3124.0

17

SH

1050.3

8

SH

2963.0

22

AVG

990.5

27

AVG

2929.2

22

BRD

972.2

29

AVG

2878.1

31

AVG

956.8

38

SH

2863.6

33

SH

929.8

42

AVG

2756.6

45

BRD

889.2

24

AVG

2521.2

60

BRD

861.3

38

AVG

2188.5

75

BRD

851.6

40

SH

1678.2

15

SH

818.8

36

AVG

1643.5

7

AVG

807.3

36

BRD

1602.0

20

AVG

798.6

30

AVG

1576.0

23

AVG

768.7

41

BRD

1553.8

35

SH

721.4

30

AVG

1511.4

49

SH

706.9

31

BRD

1475.7

27

AVG

648.1

26

AVG

1421.7

29

AVG

636.5

26

AVG

1384.0

32

AVG

584.5

28

SH

1332.0

31

AVG

571.9

26

AVG

1301.1

28

AVG

533.3

27

SH

1246.1

19

SH

522.7

25

AVG

1215.2

12

AVG

503.4

25

AVG

1176.7

36

SH

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks.

653 037 12

25 stärkste Peaks

2952.4

1

BRD M

1251.9

28

BRD

2924.4

0

BRD M

1215.2

19

AVG

%T

Frequenz

%T

Frequenz

2867.5

4

SHM

1089.9

13

AVG

2854.0

3

AVG M

1071.5

9

AVG

5

1069.5

23

1576.0

5

2733.4

49

SHM

1056.1

13

SH

7

3375.7

24

889.1

2695.8

53

SH

991.5

39

AVG

7

1643.5

25

522.6

2532.8

67

SH

973.2

39

AVG

8

1090.7

25

503.3

1757.3

73

SH

957.7

48

SH

8

1050.2

26

648.0

1685.9

8

AVG

931.7

49

AVG

10

3223.3

26

636.5

10

1647.4

21

SH

890.2

34

AVG

12 *

1215.1

26

571.8

1602.0

41

AVG

858.4

50

AVG

15

1678.1

27

1475.6

1574.1

42

AVG

813.0

43

AVG

17

3124.0

27

990.5

1555.7

43

BRD

798.6

47

AVG

19

1246.0

27

533.2

1462.2

12

AVG M

767.7

50

AVG

20

1602.0

28

1301.0

15

1425.5

37

SH

721.4

42

AVG M

22

2963.0

28

584.5

1378.3

22

AVG M

634.6

35

AVG

22

2929.1

1367.6

37

SHM

Präparat: KBR-Pellet

Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 95 £ 405.0 Prozentuale Durchlässigkeit bei 4000 (cm"1): 77 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

25

2. UV-Absorptionsspektrum [Xmax (a)]:

In Wasser bei einem pH-Wert von 2,0: 258 nm (16,0)

pH-Wert von 7,0: 261 nm (16,5)

pH-Wert von 11,0: 261 nm (16,0) 30

3. Elementaranalyse:

Molekülformel: C27H43N7OH) SCIP;

Molekulargewicht: 723

Berechnet: C 44,81 H 5,94 N 13,55 O 22,13 S 4,42 Cl 4,84 35 P 4,28

Gefunden: N 12,87 S 5,39 Cl 4,76 P 3,83

4. Optische Drehung:

[cc]d = 94° (C, 0,887, Wasser). 40

5. Löslichkeitsverhalten:

In hohem Masse löslich in Wasser, Methanol und Ethanol; schwach löslich in Aceton und sonstigen Ketonen, Ethylacetat und sonstigen Estern, Chloroform und Methylenchlorid. Unlös- 45 lieh in gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln.

6. Antibakterielle Aktivität:

U-57930-[3-(5'-Adenylat)] ist in vitro nicht aktiv. Bei der

Behandlung mit alkalischer Phosphatase oder Phosphodiesterase 5Q I entsteht jedoch U-57930, das gegen die verschiedensten G+-Organismen sowohl in vitro als auch in vivo hochaktiv ist. U-57930-3-(5'-Adenylat) hat sich bei subkutaner Verabreichung an Mäuse in vivo mit einem CD50 von 0,62 (0,48 bis 0,79) mg/kg gegen S. pyogenes aktiv erwiesen. 55

7. Fp: 203,5 bis 205°C (unter Zersetzung).

Charakterisierung von U-57930 3-(5'-Uridylat) 1. Tabellarische Auflistung des IR-Spektrums: 60

Bandenfrequenz Inten- Art Bandenfrequenz Inten- Art sität sität

3330.4 19 BRD 1332.9 44 BRD

3224.4 21 BRD 1296.3 40 SH

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

Diese Peak-Liste ist nicht ausgegeben.

M: Mögliche Störung durch Mineralöl.

25 stärkste Peaks

%T

Frequenz

%T

Frequenz

0

2924.3

22

1378.2

1

2952.3

28

1251.8

3

2854.0

34

890.1

4

2867.5

35

634.5

8

1685.8

37

1425.5

9

1071.5

37

1367.5

12

1462.1

39

991.5

13

1089.8

39

973.1

13

1056.0

40

1296.2

19

3330.3

41

1602.0

19

1215.1

42

1574.0

21

3224.3

42

721.3

21

1647.3

Präparat: Mineralölmischung Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 86 Ç 3764.5 Prozentuale Durchlässigkeit bei 3800 (cm"1): 85 Dichte (cm'Vcp): 0,964

Bandenfrequenz Inten- Art Bandenfrequenz Inten- Art

sität

3387.4

12

BRD

1055.1

10

SH

3114.4

25

SH

992.4

35

AVG

2962.0

26

AVG

973.2

36

AVG

2931.1

26

BRD

956.8

45

SH

2879.1

36

AVG

929.8

48

AVG

2863.6

38

SH

889.2

31

AVG

2833.7

43

SH

859.3

46

AVG

2509.6

64

BRD

813.0

40

AVG

13

653 037

1685.0

6

BRD

811.1

40

SH

1647.4

17

SH

798.6

43

AVG

1605.9

35

SH

782.2

48

BRD

1576.0

37

AVG

768.7

48

AVG

1556.7

39

BRD

707.9

43

AVG

1463.1

31

AVG

669.3

43

SH

1423.6

35

AVG

649.1

40

SH

1384.0

32

AVG

634.6

37

AVG

1331.0

43

AVG

585.4

38

SH

1297.2

38

SH

567.1

34

AVG

1255.8

24

AVG

523.7

35

AVG

1214.3

17

AVG

447.5

39

AVG

1090.8

10

AVG

1070.6

7

AVG

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm'1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks.

25 stärkste Peaks

%T

Frequenz

%T

Frequenz

6

1685.0

32

1384.0

7

1070.5

34

567.0

10

1090.7

35

1605.8

10

1055.0

35

1423.5

12

3387.3

35

992.3

17

1647.3

35

523.6

17

1214.2

36

2879.0

24

1255.7

36

973.1

25

3114.3

37

1576.0

26

2962.0

37

634.5

26

2931.0

38

2863.5

31

1463.0

38

1297.1

31

889.1

Präparat: KBR Pellet.

Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 101 Ç 405.0 Prozentuale Durchlässigkeit bei 4000 (cm"1): 76 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

2. UV-Absorptionsspektrum: [>.max (a)]:

In Wasser bei einem pH-Wert von 2,0: 261 nm (11,5)

pH-Wert von 7,0: 262 nm (10,7)

pH-Wert von 11,0: 262 nm (11,5)

3. Elementaranalyse:

Molekülformel: SCIP;

Molekulargewicht: 716;

Berechnet: C 43,57 H 5,86 N 7,82 O 29,05 S 4,46 Cl 4,89 und P 4,33

4. Optische Drehung:

[ajo = +105° (C, 0,94, Wasser).

5. Löslichkeitsverhalten:

Hochlöslich in Wasser, Methanol und Ethanol. Schwach löslich in Aceton und sonstigen Ketonen, Ethylacetat und sonstigen Estern, Chloroform und Methylenchlorid. Unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln.

6. Antibakterielle Aktivität:

U-57930-3-(5'-Uridylat) ist in vitro nicht aktiv. Bei der

Behandlung mit alkalischer Phosphatase oder Phosphodiesterase I entsteht U-57930, das gegen die verschiedensten (^-Organismen sowohl in vitro als auch in vivo hochaktiv ist.

7. Fp: 202 bis 203°C (unter Zersetzung).

Charakterisierung von U-57930-3-(5'-Guanylat) 1. Tabellarische Auflistung des IR-Spektrums: Folgende tabellarische Auflistungen enthalten Angaben über die IR-Absorptionen (Nujol und KBr):

Bandenfrequenz

Intensität

Art

Bandenfrequenz

Intensität

Art

3335.3

16

BRD

1250.0

36

SH

3227.2

19

BRD

1213.3

21

AVG

2953.3

2

AVG M

1173.8

39

AVG

2925.3

1

BRD M

1149.7

41

AVG

2868.4

6

SHM

1087.9

14

SH

2855.9

4

AVG M

1071.5

9

AVG

2737.3

51

BRD M

991.5

42

AVG

2521.2

73

BRD

972.2

42

AVG

1684.0

6

AVG

956.8

52

SH

1635.8

11

AVG

929.8

51

AVG

1598.2

21

AVG

890.2

36

AVG

1572.1

26

AVG

860.3

51

AVG

1534.5

34

AVG

800.5

46

AVG

1462.2

18

AVG M

783.1

42

SHP

1414.9

44

AVG

720.4

43

AVG M

1377.3

24

AVG M

707.9

45

BRD

1365.7

31

AVG

681.9

40

AVG

1312.7

44

AVG

635.6

34

AVG

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

25 stärkste Peaks

%T Frequenz %T Frequenz

1 2925.2 24 1377.2

2 2953.2 26 1572.0 4 2855.8 31 1365.6 6 2868.3 34 1534.5 6 1684.0 34 635.5 9 1071.5 36 1250.0

11 1635.7 36 890.1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

653 037

14

1087.8

39

1173.7

21

2929.1

32

571.8

16

3335.2

40

681.8

22

2963.0

33

2862.6

18

. 1462.1

41

1149.6

26

1534.5

33

1147.6

19

3227.1

42

991.6

28

889.1

21

1598.1

42

972.1

5

21

1213.2

Präparat: KBR Pellet.

Präparat: Mineralölmischung Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 97 £ 3762.6 Prozentuale Durchlässigkeit bei 3800 (cm"1): 97 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

BRD = breit AVG = Durchschnitt SHP = scharf SH = Schulter

Ausgegebene Peak-Liste: * zeigt zusätzliche Peaks.

25 stärkste Peaks

10

Bandenfrequenz Intensität

Art

Bandenfrequenz

Intensität

Art

15

3380,6

9

BRD

1174.7

31

AVG

3234.0

13

BRD

1147.7

33

BRD

2963.0

22

AVG

1088.9

9

BRD

20

2929.2

21

BRD

1070.6

6

AVG

2878.1

31

AVG

991.5

33

AVG

2862.7

33

SH

972.2

34

AVG

2744.0

44

BRD

956.8

43

SH

25

2522.2

61

BRD

929.8

44

AVG

1683.0

4

BRD

889.2

28

AVG

1634.8

6

AVG

860.3

41

AVG

1598.2

14

AVG

800.5

36

AVG

1571.2

19

AVG

783.1

32

AVG

1534.5

26

AVG

715.6

38

SH

30

1482.4

38

AVG

705.0

38

SH

1461.2

36

AVG

679.9

33

AVG

1448.7

36

BRD

635.6

31

AVG

1413.9

34

AVG

584.5

34

SH

35

1384.0

29

AVG

571.9

32

AVG

1359.9

30

AVG

523.7

31

AVG

1312.7

37

AVG

502.5

30

AVG

1250.9

29

SH

447.5

34

AVG

1213.3

16

AVG

40

Bandenfrequenz: Die Bandenfrequenzen sind in Wellenzahlen (cm"1) angegeben.

Intensität: Die Intensitätist als prozentuale Durchlässigkeit (%T) angegeben.

Datenarten in lokalen Peak-Bereichen:

%T

Frequenz

%T

Frequenz

4

1683.0

29

1384.0

6

1634.7

29

1250.8

6

1070.5

30

1359.8

9

3380.5

30

502.5

9

1088.8

31

2878.0

13

3234.0

31

1174.6

14

1598.1

31

635.5

16

1213.2

31

523.6

19

1571.1

32

783.0

45

50

55

60

65

Maximale prozentuale Durchlässigkeit: 97 Ç 405,0 Prozentuale Durchlässigkeit bei 4000 (cm"1): 77 Dichte (cm'Vpt): 0,964.

2. UV-Absorptionsspektrum [Xmax (a)]:

In Wasser bei einem pH-Wert von 2,0: 256 nm (13,4);

280 nm (8,4) Schulter pH-Wert von 7,0: 254 nm (14,5);

273 nm (9,7) Schulter pH-Wert von 11,0: 259 nm (12,6); 266 nm (12,4) Schulter.

3. Elementaranalyse:

Molekülformel: C27H43N70n SCIP;

Molekulargewicht: 739

Berechnet: C 43,84 H 5,81 N 13,26 O 23,27 S 4,33 Cl 4,73 P 4,19;

Gefunden: N 13,32 S 4,86 Cl 4,49 P 3,25.

4. Optische Drehung: [a] d = +97° (C, 0,855, Wasser).

5. Löslichkeitsverhalten:

Hochlöslich in Wasser, Methanol und Ethanol.

Schwach löslich in Aceton und sonstigen Ketonen, Ethylacetat und sonstigen Estern, Chloroform und Methylenchlorid. Unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln.

6. Antibakterielle Aktivität:

U-57930-3-(5'-Guanylat) ist in vitro nicht aktiv. Bei der

7. Fp: 219 bis 220°C (unter Zersetzung).

Die erfindungsgemässen Verbindungen eignen sich insbesondere zur Behandlung von durch Mitglieder der Gattung Mycoplasma hervorgerufenen Erkrankungen. Die bekanntesten Formen dieser Gattung sind PPLO (pleuropneumonia-artige Organismen), wie M. hominis, M. salivarium, M. mycoides, M. hypopneumonia, M. hyorhinis, M. gallisepticumundM. arthridi-tis sowie sonstige Arten bei Mensch und Tier, einschliesslich domestizierten Tieren, wie Schafen, Hunden, Rindern, Schweinen und Geflügel (beispielsweise Hühnern, Truthähnen, Enten und Gänsen) sowie Labortieren (wie Ratten und Mäusen).

Die U-57930-3-(5'-Ribonukleotide) lassen sich zur Behandlung von Niereninfektionen und sonstigen Infektionen bei Vorhandensein der L-Formen gram-negativer und gram-positiver Bakterien, beispielsweise der L-Formen von P. mirabilis, verwenden.

Da es sich bei den erfindungsgemässen Verbindungen um amphotere Substanzen handelt, können sie in üblicher bekannter Weise sowohl mit Säuren als auch Basen Salze bilden. Beispiele für zur Salzbildung verwendbare anorganische Säuren sind Chlorwasserstoff-, Schwefel-und Phosphorsäure. Beispiele für verwendbare anorganische Basen sind die Basen von Natrium, Kalium, Calcium und Lithium. Die Salze der erfindungsgemässen Verbindungen lassen sich zum selben Zweck einsetzen wie die Ausgangsverbindungen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind vor allem als antibakterielle Mittel in geeigneten Zusammensetzungen verwendbar. Diese Zusammensetzungen sind vorzugsweise zubereitet für die Verabreichung an Menschen und Tieren in einheitli

15

653 037

chen Dosierformen, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulvern, Granulaten, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen und oralen Lösungen oder Suspensionen sowie Öl-in-Wasser-Emulsionen, die geeignete Mengen an aktiver Verbindung in Form der Mutterverbindung oder eines pharmakologisch akzep- 5 tablen Salzes hiervon enthalten.

Für die orale Verabreichung können sowohl feste als auch flüssige Dosiereinheiten hergestellt werden. Für die Herstellung fester Zusammensetzungen, wie Tabletten, kann der aktive Bestandteil mit herkömmlichen Bestandteilen, wie Talkum, 10 Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat, Magnesiumaluminiumsilikat, Calciumsulfat, Stärke, Lactose, Akaziengummi, Methyl-cellulose und funktionell vergleichbare Materialien, als pharmazeutische Verdünnungs- oder Trägermaterialien vermischt werden. Die Tabletten können laminiert oder in sonstiger Weise 15 zusammengesetzt werden, um eine Dosierungsform zu ergeben, welche den Vorteil einer verlängerten oder aufgeschobenen Wirkung aufweist oder eine vorausbestimmte sukzessive Wirkung des eingeschlossenen Medikaments aufweist. Beispielsweise kann eine Tablette eine innere Dosierungs- und eine 20 äussere Dosierungskomponente umfassen, wobei letztere in Form einer Hülle über ersterer liegt. Beide Komponenten können durch eine enterische Schicht voneinander getrennt sein.

Diese enterische Schicht dient dazu, die Zersetzung im Magen zu verhindern. Dadurch wird es der im Inneren befindlichen Kom- 25 ponente möglich, intakt in den Zwölffingerdarm zu gelangen oder verzögert freigegeben zu werden. Zur Ausbildung einer solchen enterischen Schicht bzw. eines solchen enterischen Überzugs können die verschiedensten Substanzen verwendet werden. Beispiele hierfür sind polymere Säuren oder Gemische von polymeren Säuren mit beispielsweise Schellack, Cetylalkohol, Celluloseacetatphthalat, Styrolmaleinsäuremischpolymerisaten und dergleichen. Andererseits kann das Zweikomponentensystem dazu verwendet werden, Tabletten herzustellen, die zwei oder mehrere miteinander unverträgliche aktive Bestandteile enthalten. Oblatenkapseln werden im allgemeinen in der gleichen Art und Weise hergestellt wie Tabletten, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die Form anders ist und ferner noch Saccharose oder andere Süssmittel und Geschmacksstoffe mitverwendet werden. In der einfachsten Ausführungsform wer- 40 den Kapseln wie Tabletten hergestellt, indem man den aktiven Bestandteil der Rezeptur mit einem inerten pharmazeutischen Verdünnungsmittel vermischt und dann das erhaltene Gemisch in eine harte Gelatinekapsel geeigneter Grösse abfüllt. In ande rer Ausführungsform können die Kapseln durch Füllen der harten Gelatinekapseln von mit polymerer Säure überzogenen Kügelchen, die die aktive Verbindung enthalten, hergestellt werden. Weichgelatinekapseln erhält man in der Regel durch maschinelle Einkapselung einer Aufschlämmung der aktiven Verbindung in einem akzeptablen Pflanzenöl, z. B. leichter flüssiger Vaseline oder einem sonstigen inerten Öl.

Es können auch fliessfähige Einheitsdosen oder Dosiereinheiten zur oralen Verabreichung, z.B. Sirupe, Elixiere und Suspensionen zubereitet werden. Die wasserlöslichen Formen können zusammen mit Zucker, aromatischen Geschmacksstoffen und 55 Konservierungsmitteln in einem wässrigen Träger gelöst werden, wobei ein Sirup erhalten wird. Ein Elixier kann man unter Verwendungeines wässrig-alkoholischen, z. B. wässrig-ethanoli-schen Trägers und geeigneten Süssungsmittels, wie Zucker und künstlichen Süssstoffen sowie aromatischen Geschmacksstoffen 60 erhalten.

Suspensionen erhält man gewöhnlich mit einem wässrigen Träger unter Mitverwendung eines Suspendiermittels, wie Akaziengummi, Traganth, Methylcellulose und dergleichen. Topisch zu applizierende Salben kann man durch Dispergieren der akti- 65 ven Verbindung in einer geeigneten Salbengrundlage, wie Vaseline, Lanolin, Polyethylenglykolen und Mischungen hiervon erhalten. Zweckmässigerweise wird die Verbindung mittels einer

30

35

45

50

Kolloidmühle unter Ausnutzung leichter flüssiger Vaseline als Glättmittel vor dem Dispergieren in der Salbengrundlage fein verteilt. Topisch zu applizierende Crèmes und Lotionen erhält man vorzugsweise durch Dispergieren der Verbindung in der Ölphase vor deren Emulgierung in Wasser.

Unter Verwendung der betreffenden Verbindung und eines sterilen Trägers, vorzugsweise von Wasser, lassen sich fliessfähige Dosiereinheiten oder Einheitsdosen zur parenteralen Verabreichung zubereiten. Die Verbindung kann je nach ihrer Form und der vorgesehenen Konzentration in dem Träger entweder suspendiert oder in Lösung gebracht werden. Zur Zubereitung von Lösungen können die Verbindungen in Wasser zu Injektionszwecken gelöst und die erhaltenen Lösungen vor dem Einfüllen in geeignete Phiolen und Ampullen und dem Versiegeln derselben filtrationssterilisiert werden. Zweckmässigerweise werden in dem Träger Hilfsmittel, z. B. Lokalanästhetika, Konservierungsstoffe und Puffer, mitgelöst. Zur Verbesserung der Stabilität können die erhaltenen Zubereitungen nach dem Einfüllen in die Phiolen und Entfernen des Wassers im Vakuum gefroren werden. Das trockene lyophilisierte Pulver wird dann gewöhnlich in der Phiole eingeschmolzen, wobei eine weitere Phiole mit Wasser zu Injektionszwecken zur Wiederaufbereitung des Pulvers vor Gebrauch beigepackt wird. Parenterale Suspensionen kann man in praktisch derselben Weise erhalten, wobei jedoch die betreffende Verbindung, anstatt in dem Träger gelöst zu werden, darin suspendiert wird. In diesem Falle ist allerdings eine Filtrationssterilisation nicht möglich. Die Verbindung lässt sich aber durch Einwirkenlassen von Ethylenoxid vor dem Suspendieren in dem sterilen Träger sterilisieren. Zweckmässigerweise wird der Zubereitung zur gleichmässigeren Verteilung der betreffenden Verbindung ein oberflächenaktives Mittel oder Netzmittel einverleibt.

Der Ausdruck «Einheitsdosis» oder «Dosiereinheit» dient zur Bezeichnung physikalisch unterteilter Einheiten, die sich als Einzeldosis für Patienten und Tiere eignen. Jede Einheit enthält eine so grosse Menge an aktivem Material, wie sie zusammen mit dem jeweiligen pharmazeutischen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel, die gewünschte therapeutische Wirkung herbeiführen soll. Die Vorschrift für die Dosiereinheiten oder Einheitsdosen richtet sich nach den jeweiligen Eigenschaften des aktiven Materials und der zu erreichenden Wirkung sowie den dem Fachmann bekannten Rezeptiergrenzen.

Beispiele für geeignete Dosiereinheiten oder Einheitsdosen sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Suppositorien, Pulverbeutelchen, Oblaten, Granulat, Pastillen, Teelöffelvoll, Esslöffelvoll, Tropfervoll, Ampullen, Phiolen, Aerosole mit Dosiervorrichtungen, unterteilte Mehrfache der genannten Zubereitungsformen und sonstige Zubereitungsformen.

Die aktive Verbindung wird in der Regel mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger zu einer Einheitsdosis oder Dosiereinheit zur bequemen und wirksamen Verabreichung verarbeitet. Vorzugsweise enthalten die Dosiereinheiten zur systemischen Behandlung 10,25,50,100,250 bzw. 500 mg an aktiver Verbindung. Zur parenteralen Behandlung bedient man sich vorzugsweise 5- bis 65gew. %iger Einheitsdosen oder Dosiereinheiten . Die Dosierung der eine aktive Verbindung und einen oder mehrere sonstige aktive(n) Bestandteil(e) enthaltenden Zubereitungen ergibt sich aus der üblichen Dosierung der Einzelbestandteile.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Selbstverständlich können anstelle der in den Beispielen als aktive Verbindung verwendeten 3-(5'-Ribonukleotide) von U-57930E oderU-60970E auch andere aktive Verbindungen gemäss der Erfindung verwendet werden. U-60970E ist das 4-cis-n-Butyl-L-pipecolsäureamid von 7-Cl-Methylthiolincosaminid. Bezüglich seiner Herstellung vgl. Beispiel 7 der DE-OS 3 043 502.

653 037

16

U-57930Ebzw. U-60970E steht für die 3-(5'-Ribonukleotide) dieser Verbindungen. Bei den 3-Ribonukleotiden handelt es sich um die beschriebenen Ribonukleotide.

Beisiel 1 - Kapseln 5

Unter Verwendung folgender Bestandteile:

U-57930E oder U-60970E 250 g

Maisstärke 100 g

Talkum 75 g

Magnesiumstearat 25gi°

werden 1000 doppelstückige Hartgelatinekapseln zum oralen Gebrauch mit jeweils 250 mg U-57930E bzw. U-60970E hergestellt.

Die verschiedenen Substanzen werden gründlich miteinander gemischt und dann in üblicher bekannter Weise eingekapselt. 15

Die erhaltenen Kapseln eignen sich zur systemischen Behandlung von Infektionen bei Erwachsenen durch orale Verabreichung von jeweils einer Kapsel alle 6 h.

Inder geschilderten Weise lassen sich auch Kapseln mit 10,25, 50,100 bzw. 500 g U-57930E bzw. U-60970E herstellen, indem 20 man anstelle der verwendeten 250 g Wirkstoff 10,25,50,100 bzw. 500 g verwendet.

In der geschilderten Weise lassen sich bei Reduzieren der Mengen an U-57930Ebzw. U-60970E auf250 g auchTabletten mit 250 mg Wirkstoff herstellen.

Beispiel 4 - Tabletten Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E Sulfadiazin Sulfamerazin Sulfamethazin Lactose Maisstärke Calciumstearat helle flüssige Vaseline

250 g 83,3 g 83,3 g 83,3 g 50 g 50 g 25 g 5g

25

35

Beispiel 2 - Kapseln

Unter Verwendung der folgenden Bestandteile:

U-57930E bzw. U-60970E 200 g

Tetracyclin-hydrochlorid 250 g

Talkum 75 g

Magnesiumstearat 25 g werden 1000 doppelstückige Hartgelatinekapseln zum oralen 30 Gebrauch mit jeweils 200 mg U-57930E bzw. U-60970E und 250 mg Tetracyclin-hydrochlorid zubereitet.

Zunächst werden die verschiedensten Bestandteile gründlich miteinander gemischt und dann in üblicher bekannter Weise eingekapselt.

Die erhaltenen Kapseln eignen sich zur systemischen Behandlung von Infektionen bei Erwachsenen durch orale Verabreichung jeweils einer Kapsel alle 6 h.

In entsprechender Weise lassen sich auch Kapseln mit U-57830E bzw. U-60970E und anstelle des Tetracyclins Chloram- 40 phenicol, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Fumagillin, Erythromycin, Streoptomycin, Dihydronovobiocin oder Novobiocin zubereiten, indem man die 250 g Tetracyclin-hydrochlorid durch 250 g der genannten anderen Antibiotika ersetzt. Wird anstelle des Tetracyclins ein Penicillin, z. B. Kaliumpenicillin G, verwen- 45 det, erhält eine Kapsel 250000 Einheiten.

Solche Kombinationspräparate eignen sich zur systemischen Behandlung von Mischinfektionen bei Erwachsenen durch orale Verabreichung von jeweils einer Kapsel alle 6 h.

50

Beispiel 3 - Tabletten Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930Ebzw. U-60970E Lactose Maisstärke Magnesiumstearat helle flüssige Vaseline werden 1000 Tabletten zur oralen Verabreichung mit jeweils 500 mg U-57930E bzw. U-60970E hergestellt.

Beim gründlichen Vermischen der Bestandteile kommt es zu einer Brockenbildung. Die gebildeten Brocken werden zerkleinert, indem sie durch ein Sieb Nr. 16 gedrückt werden. Danach wird das hierbei erhaltene Granulat zu Tabletten verpresst, wobei jede Tablette 500 mg U-57930E bzw. U-60970E enthält.

Die erhaltenen Tabletten eignen sich zur systemischen Behandlung von Infektionen einschliesslich von Malariainfektionen bei Erwachsenen durch orale Verabreichung einer Tablette dreimal pro Tag.

500 g 125 g 65 g55 25 g 3g

60

65

werden 1000 oral zu verabreichende Tabletten mit jeweils 250 mg U-57930E bzw. U-60970E und insgesamt 250 mg (jeweils 83,3 mg) Sulfadiazin, Sulfamerazin und Sulfamethazin zubereitet.

Beim gründlichen Vermischen der Bestandteile kommt es zu einer Brockenbildung. Die gebildeten Brocken werden zerkleinert, indem sie durch ein Sieb Nr. 16 gedrückt werden. Das hierbei erhaltene Granulat wird dann zu Tabletten mit jeweils 250 mg U-57930E bzw. U-60970E und insgesamt250 mg (jeweils 83,3 mg) Sulfadiazin, Sulfamerazin und Sulfamethazin verpresst.

Die erhaltenen Tabletten eignen sich zur systemischen Behandlung von Infektionen durch orale Verabreichung von zunächst 4 Tabletten und dann 1 Tablette alle 6 h.

Zur Behandlung von Infektionen des Urogenitaltrakts werden die drei zusätzlichen Bestandteile der angegebenen Rezeptur zweckmässigerweise durch 250 g Sulfamethylthiadiazol oder 250 g Sulfacetamid ersetzt.

Beispiel 5 - oral einzunehmender Sirup Aus folgenden Bestandteilen U-57930E bzw. U-60970E 50 g

Sulfadiazin 33,3 g

Sulfamerazin 33,3 g

Sulfamethazin 33,3 g

Zitronensäure 2 g

Benzoesäure 1 g

Saccharose 700 g

Traganth 5 g

Zitronenöl 2 ml mit entionisiertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt,

werden 1000 ml einer wässrigen Suspension zur oralen Verabreichung mit jeweils 250 mg U-57930E bzw. U-60970E und insgesamt 500 mg Sulfadiazin, Sulfamerazin und Sulfamethazin pro 5 ml zubereitet.

Bei der Zubereitung werden zunächst die Zitronensäure, Benzoesäure und Saccharose, das Traganth und das Zitronenöl in soviel Wasser dispergiert, dass 850 ml Lösung erhalten werden. Danach werden U-57930E bzw. U-60970E und die feinteili-gen sonstigen Wirkstoffe bis zur gleichmässigen Verteilung in den Sirup eingerührt, worauf das Ganze mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt wird.

Der erhaltene Sirup eignet sich zur systemischen Behandlung von Pneumonie bei Erwachsenen in einer Dosis von einem Esslöffelvoll (10 ml) 4 mal pro Tag.

Beispiel 6 - parenteral zu verabreichende Lösung Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 200 g

Lidocain-hydrochlorid 4 g

Methylparaben 2,5 g

Propylparaben 0,17 g mit Wasser zu Injektionszwecken aufgefüllt auf 1000 ml wird eine sterile wässrige Lösung zur intramuskulären Verabreichung mit 200 mg U-57930E bzw. U-60970E pro ml zubereitet.

17

653 037

io

Bei der Zubereitung werden die Bestandteile in Wasser gelöst, worauf die erhaltene Lösung filtrationssterilisiert wird. Die erhaltene sterile Lösung wird in Phiolen gefüllt, worauf diese verschweisst werden.

Beispiel 7 - parenteral zu verabreichende Zubereitung

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 200 g

Spectinomycinsulfat 400 g

Lactose 50 g mit Wasser zu Injektionszwecken aufgefüllt auf 1000 ml wird eine sterile wässrige Lösung zur intramuskulären Verabreichung mit 200 mg U-57930E bzw. U-60970E und 400 mg Spectinomycinsulfat pro 1 ml zubereitet.

Die Wirkstoffe U-57930E bzw. U-60970E und Spectinomycin- 15 sulfat sowie Lactose werden in Wasser dispergiert und sterilisiert. Die erhaltene sterile Zubereitung wird in einer Menge von 2 ml aseptisch in sterile Phiolen abgefüllt.

Beispiel 8 - lokal zu applizierende Salbe 20

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 2,5 g

Zinkoxid 50 g

Calamin 50g25

flüssige Vaseline (schwer) 250 g

Wollfett 200 g mit weisser Vaseline auf 1000 g aufgefüllt werden 1000 g einer 0,25%igen Salbe zubereitet.

Die weisse Vaseline und das Wollfett werden aufgeschmolzen 30 und mit 100 g flüssiger Vaseline versetzt. Danach werden U-57930E bzw. U-60970E, Zinkoxid und Calamin in die restliche flüssige Vaseline eingetragen, worauf das Gemisch so lange vermählen wird, bis ein feinteiliges und gleichmässig dispergier-tes Pulver erhalten wird. Das Pulvergemisch wird dann in das weisse Vaselinegemisch eingerührt. Das Ganze wird dann so lange weitergerührt, bis die Salbe erstarrt.

Die erhaltene Salbe eignet sich zur topischen Applikation auf die Haut von Säugetieren zur Behandlung von Infektionen.

Ferner kann man die Salbe auch ohne Zinkoxid und Calamin zubereiten.

In entsprechender Weise erhält man auch Salben mit 0,5,1,2 bzw. 5 % U-57930E bzw. U-60970E, indem man die 2,5 g U-57930Ebzw. U-60970Edurch5,10,20 und 50 g Wirkstoff ersetzt.

45

35

40

50 g 150 g 100 g 50 g 50 5g lg

Beispiel 9 - Crème

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E selbstemulgierendesGlycerylmonostearat Spermaceti Propylenglykol Polysorbat80 Methylparaben mit entionisiertem Wasser aufgefüllt auf 1000 g werden 1000 g einer Vaginalcrème zubereitet.

Zunächst werden das selbstemulgierende Glycerylmonostea- 55 rat und Spermaceti miteinander bei einer Temperatur von 70-80° C aufgeschmolzen. Das Methylparaben wird in etwa 500 g Wasser gelöst, worauf das Propylenglykol, Polysorbat 80 und der Wirkstoff U-57930E bzw. U-60970E in der angegebenen Reihenfolge zugegeben werden. Hierbei wird die Temperatur auf 75 bis 60 80°C gehalten. Schliesslich wird das Methylparabengemisch langsam unter konstantem Rühren in die Glycerylmonostearat-und Spermacetischmelze eingetragen. Die Zugabe dauert mindestens 30 min unter fortgesetztem Rühren, bis die Temperatur auf 40 bis 45° C gesunken ist. Der pH-Wert der fertigen Crème wird 65 durch Zusatz von 2,5 g Zitronensäure und 0,2 g dibasischen Natriumphosphats in etwa 50 g Wasser auf 3,5 eingestellt. Schliesslich wird so viel Wasser zugegeben, dass das Endgewicht

1000 g beträgt. Nach der Wasserzugabe wird die Zubereitung zur Aufrechterhaltung einer homogenen Mischung so lange gerührt, bis sie erkaltet und erstarrt ist.

Die erhaltene Crème eignet sich zur Behandlung von Vaginalinfektionen bei Frauen.

Beispiel 10 - ophthalmische Salbe Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 5 g

Bacitracin 12,2 g

Polymyxin-B-sulfat (10000 Einheiten/mg) lg leichte flüssige Vaseline 250 g

Wollfett 200 g mit weisser Vaseline aufgefüllt auf 1000 g werden 1000 g einer 0,5 % U-57930E bzw. U-60970E enthalten- : den opthalmischen Salbe zubereitet.

Die festen Bestandteile werden zunächst mittels eines Luftmi-kronisators feinverteilt und dann in die leichte flüssige Vaseline. -eingetragen. Zur gleichmässigen Verteilung der mikronisierten Teilchen wird das Gemisch durch eine Kolloidmühle laufengelassen. Nun werden das Wollfett und die weisse Vaseline miteinander aufgeschmolzen, geseit und auf eine Temperatur von 45 bis 50° C eingestellt. Nach Zugabe der flüssigen Vaselineauf schlämmung wird die Salbe bis zum Erstarren gerührt. Zweckmässigerweise wird die Salbe in 3,88 g opthalmischen Röhrchen verpackt.

Die erhaltene Salbe kann zur Behandlung lokaler Infektionen bei Menschen und Tieren auf das Auge appliziert werden.

Die Salbe kann ferner 5 g (0,5 %) Methylprednisolon zur Behandlung von entzündlichen Zuständen enthalten. Ferner können auch das Bacitracin und Polymyxin-B-sulfat weggelassen werden.

Beispiel 11 - Augen- bzw. Ohrentropfen Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930Ebzw. U-60970E 10 g

Methylprednisolonphosphat, Natriumsalz 5 g

Natriumeitrat 4,5 g

Natriumbisulfit lg

Polyethylenglykol4000 120 g

Myristyi-Y-picoliniumchlorid 0,2 g

Polyvinylpyrrolidon lg mit entionisiertem Wasser aufgefüllt auf 1000 ml werden 1000 ml einer sterilen wässrigen Lösung zur Application ins Auge oder Ohr mit 10 mg U-57930E bzw. U-60970E und 5 mg Methylprednisolon zubereitet.

Die Bestandteile werden in Wasser gelöst, worauf die erhaltene Lösung filtrationssterilisiert wird. Schliesslich wird die sterile Lösung aseptisch in sterile Tropfbehälter gefüllt.

Die Zubereitung eignet sich zur topischen Behandlung entzündlicher und infektiöser Zustände des Auges und Ohrs sowie sonstiger empfindlicher Gewebe des menschlichen oder tierischen Körpers.

Beispiel 12 - Pastillen Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 100 g

Neomycinsulfat 50 g

Polymyxin-B-sulfat (10 000 Einheiten/mg) lg

Ethylaminobenzoat 50 g

Calciumstearat 150 g mit pulverisierter Saccharose auf 5000 g aufgefüllt werden 10000 Pastillen zubereitet.

Die pulverisierten Substanzen werden gründlich miteinander gemischt und dann in für die Herstellung von Presstabletten üblicher bekannter Weise zu 0,5-g-Pastillen verpresst.

Die Pastillen werden im Mund belassen und gehen dabei langsam in Lösung, wobei eine Mund- und Rachenbehandlung von Menschen erfolgt.

653 037

18

100 g 1,25 g. lg 75 g 62,5 g 162,5 g

Beispiel 13 - rektales Suppositorium

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930Ebzw. U-60970E Polymyxin-B-sulfat (10000 Einheiten/mg)

Methylprednisolon Ethylaminobenzoat Zinkoxid Propylenglykol mit Polyethylenglykol 4000 auf 2500 g aufgefüllt werden 1000 Suppositorien eines Gewichts von jeweils 2,5 g mit 100 mg U-57930E bzw. U-60970E zubereitet.

Der Wirkstoff U-57930E bzw. U-60970E, das Polymyxin-B-sulfat, das Methylprednisolon, das Ethylaminobenzoat und das Zinkoxid werden zu dem Propylenglykol zugegeben, worauf das Gemisch so lange vermählen wird, bis ein feinteiiiges und gleichmässig dispergiertes Pulver erhalten wird. Danach wird das Polyethylenglykol 4000 aufgeschmolzen und langsam unter Rühren mit der Propylenglykoldispersion versetzt. Schliesslich wird die Suspension bei 40° C in nicht-gekühlte Formen gegossen.

Darin wird die Zubereitung sich abkühlen und erstarren gelassen. Schliesslich werden die einzelnen Suppositorien aus der Form entnommen und in eine Folie verpackt.

Die erhaltenen Suppositorien werden zur lokalen Behandlung entzündlicher und infektiöser Zustände rektal eingeführt.

Bei den Suppositorien kann das Steroid auch weggelassen werden.

15

20

25

30

25 g 0,5 g 300 g

5 g 35

5g 400 g

Beispiel 14 - Mastitissalbe Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E Methylprednisolonacetat leichte helle Vaseline Chlorbutanol, wasserfrei Polysorbat80

2%igesAluminiummonostearat-Erdnussölgel mit weisser Vaseline auf 1000 g aufgefüllt werden 1000 g einer Salbe zur Behandlung von Mastitis bei Milchkühen zubereitet. 40

Bei der Zubereitung der Salbe werden zunächst der Wirkstoff U-57930E bzw. U-60970E und das Methylprednisolonacetat mit der leichten flüssigen Vaseline so lange vermählen, bis das Ganze feinteilig und gleichmässig dispergiert ist. Nun werden das Chlorbutanol, Polysorbat 80, Erdnussölgel und die weisse Vaseline bei 45 einer Temperatur von 48,9° C aufgeschmolzen. In die Schmelze wird die flüssige Vaselinedispersion eingerührt. Unter fortgesetztem Rühren darf sich die Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen, wobei sie erstarrt. Schliesslich wird sie in Einmai-Mastitisspritzen in 10 g-Dosen abgefüllt.

Beispiel 15 - Tierfutter

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E So j abohnenmehl Fischmehl Weizenkeimöl Sorghummelasse werden 1000 g einer Futtermittelmischung zubereitet.

Zu diesem Zweck werden die genannten Bestandteile miteinander vermischt und zu Pellets verpresst. Die Pellets können an Versuchstiere, z. B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und Hamster zur Prophylaxe während des Versands verfüttert werden.

Für andere Tiere, z. B. Geflügel, wie Hühner, Enten, Truthähne und Gänse, kann die Zubereitung dem normalen Tierfutter in einer die gewünschte Dosis U-57930E bzw. U-60970E liefernden Mengen zugesetzt werden.

Beispiel 16

Entsprechend Beispielen 1 bis 15 werden verschiedene antibakteriell wirksame Verbindungen gemäss der Erfindung in äquivalenter Menge anstelle des Wirkstoffs U-57930E bzw. U-60970E eingesetzt, wobei entsprechende therapeutische Wirkungen erzielt werden.

Ferner können auch die als freie Base eingesetzten Verbindungen, als pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptable Salze, z. B. Hydrochloride, Sulfate oder Phosphate oder als Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Lithiumsalze zum Einsatz gelangen.

Beispiel 17 - Kapseln

Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 200 g

Hydroxychlorochinsulfat 200 g

Talkum 75 g

Magnesiumstearat 25 g werden 1000 doppelstückige Hartgelatinekapseln zum oralen Gebrauch mit jeweils 200 mg U-57930E bzw. U-60970E und 200 mg Hydroxychlorochinsulfat zubereitet.

Bei der Zubereitung werden die Bestandteile gründlich mitein ander gemischt und dann in üblicher bekannter Weise eingekapselt.

Die Kapseln eignen sich zur Verhinderung wiederkehrender Attacken durch P. vivax bei Erwachsenen durch orale Verabreichung von einer Kapsel wöchentlich.

Beispiel 18 - Tabletten Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E Chininsulfat Lactose Maisstärke Calciumstearat leichte flüssige Vaseline

50

10g55

400 g55 400 g 50 g 140 g

60

65

125 g 325 g 50 g 50 g 25 g 5g werden 1000 oral zu verabreichende Tabletten mit jeweils 125 mg U-57930E bzw- U-60970E und 325 mg Chininsulfat zubereitet.

Bei der Tablettenherstellung werden zunächst die Bestandteile gründlich miteinander gemischt, wobei Brocken entstehen. Die Brocken werden zerkleinert, indem sie durch ein Sieb Nr. 16 gepresst werden. Das hierbei erhaltene Granulat wird dann zu Tabletten mit jeweils 125 mg U-57930E bzw. U-60970E und 325 mg Chininsulfat verpresst.

Die erhaltenen Tabletten eignen sich zur Behandlung von Malaria durch orale Einnahme von 2 Tabletten alle 8 Tage während 7 Tagen und dann von 1 Tablette dreimal pro Tag während 7 Tagen.

Beispiel 19 - oral einzunehmender Sirup Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 25 g

Pyrimethamin 2,5 g

Sulfadiazin 50 g

Zitronensäure 2 g

Benzoesäure 1 g

Saccharose 700 g

Traganth 5 g

Zitronenöl 2 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt auf 1000 ml werden 1000 ml einer wässrigen Suspension zur oralen Einnahme mit jeweils pro 10 ml 25 mg Pyrimethamin, 250 mg U-57930E bzw. U-60970E und 500 mg Sulfadiazin zubereitet.

Zunächst werden die Zitronensäure, Benzoesäure und Saccharose, das Traganth und das Zitronenöl in so viel Wasser dispergiert, dass 850 ml Lösung entstehen. Danach werden der Wirkstoff U-57930E bzw. U-60970E, das Pyrimethamin und das Sulfadiazin in den Sirup eingerührt, bis sie gleichmässig verteilt sind. Schliesslich wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

19

653 037

Die erhaltene Zubereitung eignet sich zur prophylaktischen Behandlung von Malaria bei Erwachsenen in einer Dosis von einem Esslöffelvoll (10 ml) wöchentlich.

Beispiel 20 - parenteral zu verabreichende Zubereitung Aus folgenden Bestandteilen:

U-57930E bzw. U-60970E 200 g

Lactose 50 g mit Wasser zu Injektionszwecken aufgefüllt auf 1000 ml wird eine sterile wässrige Lösung zur intramuskulären Verabreichung mit pro 1 ml 200 mg U-57930E bzw. U-60970E zubereitet.

Nach dem Eintragen des Wirkstoffs U-57930E bzw. U-60970E und der Lactose in Wasser wird das Ganze sterilisiert. Die sterile Zubereitung wird in einer Menge von 2 ml aseptisch in sterile Phiolen abgefüllt. 15

10

Beispiel 21

Entsprechend den vorherigen Beispielen können die Wirkstoffe U-57930E bzw. U-60970E in äquivalenter Menge durch andere gegen Malaria wirksame Verbindungen gemäss der Erfindung ersetzt werden, wobei entsprechende therapeutische Wirkungen erzielt werden.

Die verschiedenen Verbindungen können auch in Form pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptabler Salze, z. B. als Hydrochloride, Sulfate oder Phosphate oder als Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Lithiumsalze eingesetzt werden.

Beispiel 22 In vivo-Ergebnisse gegen P. berghei:

Verbindung

MED1

mg/kg

CDso2

mg/kg

Sub. Q3

Ol

Sub Q

Ol

U-57930E

0,16

1,6

16

(12-22)

>50

U-21251F

<20

-

53

(46-61)

-

U-24729A

<1,25

-

4,7

(3,2-6,9)

-

U-8284 Chlorochin

<5-10

12,5

11,5

(8,8-15)

14

Chlorochin (P04)2

<5

-

<20

-

'MED = Dosis, bei der sich die mittlere Überlebensdauer (ST50) signifikant (p = 0,05) gegenüber der ST50 unbehandelter Versuchstiere erhöht.

2CD50 = mittlere Schutzdosis in mg/kg 95 % Grenzen.

3 = Verabreichungsweg.

Antimalaria-Test (P. berghei)

Testverfahren:

18-20 g schwere männliche CF-1 Mäuse werden in Gruppen von 10 Versuchstieren gehalten und intraperitoneal mit Vollblut von 3 Tage vor dem Eingehen mit P. Berghei infizierten Mäusen infiziert. Als Inokulat dient 0,2 ml heparinisiertes Blut, das 1:10 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt ist. Dieses Volumen enthält etwa 106 Parasiten.

4 h nach der Infektion wird jede Gruppe aus 10 Mäusen behandelt, und zwar entweder subkutan mit 0,2 ml oder oral (mittels einer Magensonde) mit 0,5 ml der gewünschten Wirkstoffkonzentration. Die Behandlung wird einmal pro Tag über 4 Tage fortgesetzt. Die Versuchstiere werden 28 Tage lang beobachtet, wobei Todesfälle aufgezeichnet werden. Todesfälle vor dem 6. Tag werden als traumatische Todesfälle angesehen.

Die Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Analogen 35 und Wirkstoffkonzentrationen der einzelnen Analogen basiert auf der mittleren Überlebensdauer der Versuchstiere bei der jeweiligen Behandlungsdosis und der mittleren Schutzdosis der einzelnen Analogen. Die mit den behandelten Gruppen erzielten Ergebnisse werden mit den Ergebnissen unbehandelter Gruppen 40 oder mit Chlorochin behandelter Gruppen verglichen.

Andere mit den erfindungsgemässen Verbindungen behandelbare Protozonen sind intrazelluläre Parasiten, beispielsweise die Arten Plasmodia, Toxoplasma und Leishmania, Protozonen, die die roten Blutkörperchen behandelter Patienten verdauen, bei-45 spielsweise Entamoeba histolytica und bestimmte Trypanosoma sowie sonstige Helminthen, die die roten Blutkörperchen während krankhafter Prozesse auffressen, z. B. Schistosomen.

M

Claims

653 037

PATENTANSPRÜCHE 1. 3-(5'-Ribonukleotide) einer Verbindung der Formel ch2ch3

(ch2)^^

ch,

c-nh ch3 I

h-c-cl

I

conh— ch ch

(I)

10

ho^ \0h sch3

worin R für

SCH,

15

OH

1

oh

25

worin bedeuten:

Ri einenodermehrereSubstituentenin3-,4-,5-,7-,8-oder9-

Stellung des Rings, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff, 20 $ Halogen, gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit Ibis 8 -P-0- CH2 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiertes Cycloal-kyl, substituierter Sauerstoff oder Stickstoff, und gegebenenfalls substituiertes Phenyl R3 H, CH3, C2H5 oder -CH2-CH2-OH;

n eine ganze Zahl von 1-4 und Y 7(S)-Halogen oder 7(R)-Halogen,

und deren pharmazeutisch akzeptable Salze.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass sie der angegebenen Formel entsprechen, worin Y für7(S)-Chlor steht.

3.3-(5'-Ribonukleotid) einer Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel

W

oh oh steht.

C2H5
6. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

30 çh2ch.3 ch;j

I

h-c-cl

I

conh— ch

HoJ—0V

/

40

scha worin R für nh2

N

ÜO

und der pharmazeutisch akzeptablen Salze. 0

4.3-(5'-Ribonukleotid)einerVerbindunggemässAnspruchl 50 ii der Formel c,h9

-p-o-ch2

!)H

55

/0 oh 0h steht.
7. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel ch2ch3

oh und der pharmazeutisch akzeptablen Salze. 5. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel sch3

3

653 037

worin R für oh

A

II

-p-o-çha oh steht.

OH OH
8. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel CH2CH3 CHa

I

H-C-C1

I

-CONH— CH HO

Y N

oh worin R für

OH OH.

steht.
9. Verfahren zur Herstellung von 3-(5'-Ribonukleotiden) einer Verbindung der Formel

R3 H, CH3, C2H5 oder -CH2-CH2-OH;

n eine ganze Zahl von 1 bis 4 und Y 7(S)-Halogen oder 7(R)-Halogen,

und deren pharmazeutisch akzeptablen Salze, dadurch gekenn-5 zeichnet, dass man in einem wässrigen Medium mit geeigneten Nährstoffen Streptomyces roch ei NRRL 3533 in Gegenwart einer Verbindung der oben angegebenen Formel I züchtet und das gewünschte 3-(5'-Ribonukleotid) der definierten Verbindung aus dem Kulturmedium isoliert und eine erhaltene Verbin-i° dung gegebenenfalls in ein pharmazeutisch akzeptables Salz überführt.
10. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoffkomponente mindestens ein 3-(5'-Ribonu-kleotid) einer Verbindung der Formel

15

(I)

sch3

worin bedeuten:

30 Ri einen oder mehrere Substituenten in 3-, 4-, 5-, 7-, 8- oder 9-Stellung des Rings, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff, Halogen, gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiertes Cycloal-kyl, substituierter Sauerstoff oder Stickstoff, und gegebenenfalls substituiertes Phenyl,

H, CH3, C2H5 oder -CH2-CH2-OH;

eine ganze Zahl von 1-4 und 7(S)-Halogen oder 7(R)-Halogen,

oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, enthält.

40

35

R3

n

Y

Die Eigenschaften und die Herstellung des Antibiotikums 45 Clindamycin sind aus der US-PS 3 496163 bekannt. Dieses Antibiotikum kann als Medikament für Menschen und Tiere eingesetzt werden.

Clindamycin besitzt folgende Formel:

50

CH3

« X h sch3

worin bedeuten:

R! einen oder mehrere Substituenten in 3-, 4-, 5-, 7-, 8- oder 9-Stellung des Rings, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff, Halogen, gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiertes Cycloal-kyl, substituierter Sauerstoff oder Stickstoff und gegebenenfalls substituiertes Phenyl

55 H

60

c3h7 h t —

H 0

CH3

H-C-Cl

H !

N— C-H

HO/ 0^i

\0H H/ hN V SCH3

(1)

H OH

Clindamycin-3-Nukleotide sind aus der US-PS 3 671647 65 bekannt. Sämtliche aus der US-PS 3 671647 bekannten Clinda-mycinverbindungen besitzen die Propylhygrinsäureeinheit. Bei Tests hat es sich gezeigt, dass diese 3-Nukleotide etwa 1/10 derin-vivo-Aktivität der Mutterverbindung gegen S. aureus aufweisen.

653 037

io