FI95578B - Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulphide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes - Google Patents
Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulphide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes Download PDFInfo
- Publication number
- FI95578B FI95578B FI933868A FI933868A FI95578B FI 95578 B FI95578 B FI 95578B FI 933868 A FI933868 A FI 933868A FI 933868 A FI933868 A FI 933868A FI 95578 B FI95578 B FI 95578B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- process according
- mol
- mmol
- concentration
- carried out
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
5 955785,95578
Menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen Tämä hakemus on jakamalla erotettu kantahakemuksesta 872753.Method for activating genetically engineered heterologous eukaryotic proteins comprising disulfide bridges in prokaryotes after expression This application is divided by division from application 872753.
Keksintö kohdistuu menetelmään geeniteknisesti valmistettu-10 jen, disulfidisiltoja sisältävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämisen jälkeen.The invention relates to a method for activating genetically engineered eukaryotic proteins containing disulfide bridges after expression in prokaryotes.
Ilmennettäessä heterologisia proteiineja prokariooteissa nämä proteiinit muodostavat isäntäsoluissa usein inaktiivi-15 siä, vaikeasti liukoisia kasaumia (nk. valoa taittavia kappaleita, "refractile bodies"), ja ne käsittävät lisäksi epäpuhtauksina isäntäsolun proteiineja. Oletetaan, että tällaisten "valoa taittavien kappaleiden" muodostuminen johtuu ilmennettäessä syntyvästä suuresta proteiinipitoisuudesta 20 solussa. On tunnettua, että suurien entsyymimäärien muodostuessa solussa nämä entsyymit kasautuvat liukenemattomiksi, suurimolekyylisiksi, useimmiten inaktiivisiksi hiukkasiksi. Ennen kuin tällaisia proteiineja voidaan käyttää esimerkiksi terapeuttisiin tarkoituksiin, ne on näin ollen puhdistettava 25 ja saatettava aktiiviseen muotoonsa.When expressing heterologous proteins in prokaryotes, these proteins often form inactive, sparingly soluble clumps (so-called refractile bodies) in host cells, and further comprise host cell proteins as impurities. It is hypothesized that the formation of such "refractive bodies" is due to the high protein content of the 20 cells upon expression. It is known that when large amounts of enzymes are formed in a cell, these enzymes accumulate into insoluble, high molecular weight, most often inactive particles. Thus, before such proteins can be used, for example, for therapeutic purposes, they must be purified and brought into active form.
Tällaisten kasautumina esiintyvien proteiinien uudestaanak-tivointi voidaan toteuttaa tunnettujen menetelmien mukaisesti useassa vaiheessa (katso esimerkiksi julkaisut R.Reactivation of such agglomerated proteins can be accomplished according to known methods in several steps (see, e.g., R.).
30 Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, Voi. 52 (1979) 187-198; R. Rudolph et ai., Biochemistry 18. (1979) 5572-5575) :30 Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, Vol. 52 (1979) 187-198; R. Rudolph et al., Biochemistry 18. (1979) 5572-5575):
Ensimmäisessä vaiheessa proteiini tehdään liukoiseksi lisää-35 mällä siihen vahvaa denaturointiainetta, esimerkiksi guani-diini-hydrokloridia tai ureaa suurina pitoisuuksina, tai lisäämällä vahvasti happamia aineita, esimerkiksi glysiinin * ja fosforihapon seoksia. Käyttökelpoisiksi apuaineiksi ovat 2 95578 osoittautuneet pelkistävät SH-reagenssit (esim. ditioerytri-toli, DTE) ja EDTA, esimerkiksi renaturoitaessa LDH-proteii-nia. Mikäli proteiini sisältää epäpuhtautena isäntäsolun proteiineja, niin tällöin seuraavana vaiheena on puhdistami-5 nen sinänsä tunnetuilla tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi geeli- tai ioninvaihtokromatografisesti. Tämän jälkeen proteiini laimennetaan voimakkaasti, jotta denaturointlaineen pitoisuus saataisiin pienemmäksi. Käytettäessä guani-diini-hydrokloridia proteiini laimennetaan arvoon, joka on 10 alle 0,5 moolia/1. Vapaita SH-ryhmiä käsittävien entsyymien tapauksessa SH-ryhmiä suojaavien aineiden lisääminen on osoittautunut edulliseksi (katso esimerkiksi julkaisu R. Jaenicke, Journal Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143-2160.In the first step, the protein is solubilized by adding a strong denaturant, for example guanidine hydrochloride or urea in high concentrations, or by adding strongly acidic substances, for example mixtures of glycine * and phosphoric acid. Reducing SH reagents (e.g., dithioerythritol, DTE) and EDTA have been found to be useful excipients, e.g., for renaturation of LDH protein. If the protein contains host cell proteins as an impurity, then the next step is purification by conventional methods known per se, for example by gel or ion exchange chromatography. The protein is then diluted vigorously to reduce the concentration of denaturant. When guanidine hydrochloride is used, the protein is diluted to less than 0.5 mol / L. In the case of enzymes with free SH groups, the addition of SH-protecting agents has proved advantageous (see, for example, R. Jaenicke, Journal of Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143-2160).
1515
Patenttijulkaisussa EP-A 0 114 506 kuvataan menetelmä eräiden heterologisten ilmennettyjen tuotteiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi bakteeriviljelmistä sekä näiden tuotteiden uudestaanaktivointi: tuotteen uudestaanaktivoimiseksi "valoa 20 taittavien kappaleiden" liuokset vahvasti denaturoivassa aineessa a) muunnetaan suoraan heikommin denaturoivassa aineessa olevaksi liuokseksi, joka saatetaan sitten hapettaviin olosuhteisiin disulfidisiltojen palauttamiseksi; b) proteiini sulfonoidaan, ja liuotetaan sitten heikosti dena-25 turoivaan aineeseen, minkä jälkeen S-sulfonaattiryhmät muunnetaan sulfhydryylireagenssilla käsittelemällä pelkistyneeseen ja hapettuneeseen muotoonsa, esimerkiksi GSH/GSSG-rea-genssilla -S-S-ryhmiksi; tai c) heikosti denaturoivassa aineessa oleva liuos käsitellään suoraan sulfhydryylireagens-30 silla, esimerkiksi GSH/GSSG-reagenssilla. Tyypillinen esimerkki, jossa törmätään edellä kuvattuihin vaikeuksiin, on t-PA.EP-A 0 114 506 describes a method for isolating and purifying certain heterologous expressed products from bacterial cultures and reactivating these products: to reactivate the product, solutions of "refractive bodies" in a strongly denaturing agent are a) directly converted into to restore; b) the protein is sulfonated and then dissolved in a weakly dena-swelling agent, after which the S-sulfonate groups are converted to their reduced and oxidized form by treatment with a sulfhydryl reagent, for example GSH / GSSG reagent, to -S-S groups; or c) the solution in the weakly denaturing agent is treated directly with a sulfhydryl reagent, for example GSH / GSSG. A typical example of encountering the difficulties described above is t-PA.
Pääasiallinen komponentti hyytyneen veren proteiinimatrii-35 sissa on polymeerinen fibriini. Tämä proteiinimatriisi liukenee plasmiinin vaikutuksesta, jota plasmiinia muodostuu plasminogeenista nk. plasminogeeniaktivaattoreiden, esimerkiksi t-PA:n (tissue type plasminogen activator; kudosplas- <a m..i mu i.i t st 3 95578 minogeenin aktivaattori), aktivoinnin seurauksena. Luonnollisen t-PA:n tai eukariooteista geeniteknisesti saadun t-PA:n entsymaattinen aktiivisuus (plasminogeenin katalyyttinen aktivointi plasmiiniksi) on hyvin alhainen fibriinin tai 5 fibriinin pilkkoutumistuotteiden (FPT) puuttuessa, mutta tämä aktiivisuus saadaan olennaisesti suuremmaksi (yli 10-kertaiseksi) näiden stimuloijien läsnäollessa. Tämä aktiivisuuden nk. stimuloitavuus on t-PA:n ratkaiseva etu verrattuna muihin tunnettuihin plasminogeeniaktivaattoreihin, kuten 10 urokinaasi tai streptokinaasi (katso esimerkiksi julkaisut M. Hoylaerts et ai., J. Biol. Chem. 257 (1982) 2912-2919; Nieuwenhuizen et ai., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531-533. Näin ollen kirjallisuudessa esitetään erilaisia kertoimia aktiivisuuden stimuloitavuudelle BrCN-pilk-15 koutumistuotteita käyttäen, tämän kertoimen saavuttaessa j opa arvon 3 5.The major component in the coagulated blood protein matrix is polymeric fibrin. This protein matrix is soluble by the action of plasmin, which is formed from plasminogen as a result of the activation of so-called plasminogen activators, for example t-PA (tissue type plasminogen activator; 95578 minogen activator). The enzymatic activity (catalytic activation of plasminogen to plasmin) of natural t-PA or genetically engineered t-PA from eukaryotes is very low in the absence of fibrin or fibrin cleavage products (FPTs), but this activity is substantially increased (more than 10-fold) acid. This so-called stimulatability of activity is a crucial advantage of t-PA over other known plasminogen activators, such as urokinase or streptokinase (see, for example, M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem. 257 (1982) 2912-2919; Nieuwenhuizen et al. ai., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531-533. Thus, various coefficients for stimulatory activity using BrCN-pilk-15 accumulation products are reported in the literature, with this coefficient reaching 3 5.
t-PA:n kaltaista, glykosyloitumatonta tuotetta saadaan myös muodostumaan geneettisesti manipuloiduissa prokariooteissa 20 (cDNA:n istuttamisen jälkeen); tämän tuotteen aktiivisuus ei ole kuitenkaan stimuloitavissa eukariootista saadun t-PA:n tavoin. Tämä johtuu mahdollisesti siitä, että hapetus-pelkistys -olosuhteet prokarioottisolussa eroavat eukariootti-solussa, josta geeni on peräisin, vallitsevista olosuhteista 25 siten, että prokariootissa muodostuu alusta pitäen inaktiivinen tuote. Tämä voi puolestaan johtua esimerkiksi siitä, että luonnollisen, aktiivisen molekyylin sisältämät lukuisat SS-sillat ovat kytkeytyneet väärällä tavalla, tai niitä ei ole muodostunut lainkaan. t-PA:n terapeuttisen käytön edel-30 lytyksenä ei ole ainoastaan entsymaattinen aktiivisuus sinänsä, vaan lisäksi myös sen stimuloitavuus. Julkaisussa The EMBO Journal 4, Nr. 3 (1985) 775-780 korostetaan muiden aineiden tapauksessa sitä tosiseikkaa, ettei prokarioottiso-luihin todennäköisesti saada aikaan sellaisia asianmukaisia 35 olosuhteita, joissa eukarioottisten proteiinien aktiivisuus muodostuisi oikealla tavalla.a t-PA-like, non-glycosylated product is also induced to form in genetically engineered prokaryotes 20 (after cDNA implantation); however, the activity of this product is not stimulable like e-karyotic-derived t-PA. This is possibly due to the fact that the oxidation-reduction conditions in the prokaryotic cell differ from those in the eukaryotic cell from which the gene is derived, so that the prokaryote initially forms an inactive product. This, in turn, may be due, for example, to the fact that the numerous SS bridges contained in the natural, active molecule are incorrectly coupled, or not formed at all. A prerequisite for the therapeutic use of t-PA is not only its enzymatic activity per se, but also its stimulability. In The EMBO Journal 4, Nr. 3 (1985) 775-780 emphasizes, in the case of other substances, the fact that prokaryotic cells are unlikely to be provided with the appropriate conditions under which the activity of eukaryotic proteins would be properly generated.
4 955784,95578
Patenttijulkaisun EP-A O 093 639 mukaisesti t-PA:n uudes-taanaktivointi toteutetaan siten, että E. coli -soluista saadut solukasaumat suspendoidaan pitoisuudeltaan 6 moolia/1 olevaan guanidiinihydrokloridiin, ne käsitellään ultraäänel-5 lä, niitä inkuboidaan, minkä jälkeen niitä dialysoidaan neljä tuntia tuotteita Tris-HCl (pH 8,0), EDTA ja Tween 80 sekä natriumkloridia sisältävää liuosta vastaan. Dialyysin jälkeen preparaatti sentrifugoidaan, minkä jälkeen plasminogee-nin aktivaattori on löydettävissä supernatantista. Tällä 10 tavalla renaturoitu t-PA on tosin proteolyyttisesti aktiivista, mutta sen stimuloitavuus fibriinistä saaduilla BrCN-pilkkoutumistuotteilla (BrCN-FPT) on kuitenkin mittauskyn-nystä pienempi käytettäessä menetelmää, joka esitetään julkaisussa J. H. Verheijen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 15 260-269 (1982).According to EP-A 0 093 639, the reactivation of t-PA is carried out by suspending cell pellets obtained from E. coli cells in 6 mol / l guanidine hydrochloride, sonicating them, incubating them and then dialyzing them. four hours against Tris-HCl (pH 8.0), EDTA and Tween 80 and sodium chloride solution. After dialysis, the preparation is centrifuged, after which the plasminogen activator is found in the supernatant. Although t-PA renated in this way is proteolytically active, its stimulability with fibrin-derived BrCN cleavage products (BrCN-FPT) is still below the measurement threshold using the method described in J. H. Verheijen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 15 260-269 (1982).
Tällä hetkellä alalla ei tunneta ainoatakaan yleisesti käyttökelpoista menetelmää denaturoituneiden proteiinien uudes-taanaktivoimiseksi; tämä pätee erityisesti t-PA:lie, koska 20 luonnollinen proteiini on rakenteeltaan hyvin monimutkainen. Se sisältää vapaan tioliryhmän ja 17 SS-siltaa, jotka teoreettisesti tarkastellen voivat olla kytkeytyneet 2,2 x 1020 erilaisella tavalla, vain yhden ainoan rakenteen vastatessa proteiinin luonnollista tilaa. Alalla tällä hetkellä tunne-25 tuilla menetelmillä t-PA:n uudelleenaktivoimiseksi päästään tosin proteolyyttisesti aktiiviseen t-PA-proteiiniin, jolla ei ole kuitenkaan mitattavaa stimuloitavuutta. Alalla ei tunneta sellaista aktivointimenetelmää, jolla päästäisiin stimuloitavissa olevaan t-PA-proteiiniin.At present, no commonly used method for reactivating denatured proteins is known in the art; this is especially true for t-PA because the 20 natural proteins are very complex in structure. It contains a free thiol group and 17 SS bridges, which could theoretically be linked in 2.2 x 1020 different ways, with only a single structure corresponding to the natural state of the protein. However, methods currently known in the art for reactivating t-PA yield a proteolytically active t-PA protein that does not have measurable stimulation. There is no known method in the art for activating a stimulable t-PA protein.
30 Näin ollen esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä geeniteknisesti valmistettujen, heterologis-ten, disulfidisiltoja käsittävien eukarioottisten proteiinien täydelliseksi aktivoimiseksi prokariooteissa ilmentämi-35 sen jälkeen. Tähän tavoitteeseen päästään esillä olevan keksinnön kohteena olevalla menetelmällä.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for the complete activation of genetically engineered heterologous eukaryotic proteins comprising disulfide bridges after expression in prokaryotes. This object is achieved by the method which is the subject of the present invention.
5 955785,95578
Keksintö kohdistuu patenttivaatimuksen l mukaiseen menetelmään geeniteknisesti valmistettujen, heterologisten, disulfidisilto-ja sisältävien eukarioottisten proteiinien aktivoimiseksi pro-kariooteissa ilmentämisen jälkeen siten, että solut rikotaan, 5 proteiini saatetaan liukoiseksi denaturoivissa ja pelkistävissä olosuhteissa, ja se aktivoidaan (renaturoidaan) hapettavissa olosuhteissa GSH/GSSG-reagenssin läsnäollessa, joka menetelmä on tunnettu siitä, että aktivointivaiheessa vallitseva pH on 8-12, GSH-pitoisuus on 0,1-20 mmoolia/1, GSSG-pitoisuus on 10 0,01-3 mmoolia/1, ja denaturoivaa ainetta, joka valitaan ryh mästä arginiini, metyyliurea, etyyliurea, dimetyyliurea, forma-midi, metyyliformamidi, asetamidi, propionamidi ja butyramidi, käytetään ei-denaturoivina pitoisuuksina.The invention relates to a method according to claim 1 for the activation of genetically engineered heterologous disulfide bridged and eukaryotic proteins after expression in prokaryotes by disrupting the cells, solubilizing the protein under denaturing and reducing conditions, and activating (renaturing) in the presence of a reagent which is characterized in that the pH prevailing in the activation step is 8-12, the GSH content is 0.1-20 mmol / l, the GSSG content is 0.01-3 mmol / l, and a denaturant which selected from the group consisting of arginine, methyl urea, ethyl urea, dimethyl urea, formamide, methyl formamide, acetamide, propionamide and butyramide, are used in non-denaturing concentrations.
15 Muut patenttivaatimukset kohdistuvat tämän menetelmän muihin edullisiin suoritusmuotoihin.Other claims relate to other preferred embodiments of this method.
Denaturoivana aineena voidaan käyttää tavallisesti sellaista denaturoivaa ainetta, jota käytetään yleensä proteiineja hapet-20 tavissa olosuhteissa aktivoitaessa, tai arginiinia; tunnetuista denaturoivista aineista käytetään mielellään guanidiini-hydro-kloridia tai ureaa tai niiden johdannaisia. Tämän lisäksi sopivaksi on todettu arginiini. Edelleen näiden denaturoivien aineiden seoksia voidaan käyttää. Tämä aktivointivaihe toteute-25 taan mielellään lisäksi jonkin vieraan proteiinin läsnäollessa; ’ sopiva vieras proteiini voi olla yleensä mikä tahansa sellainen proteiini, joka ei ole proteolyyttisesti aktiivista. Menetelmässä käytetään mielellään naudan seerumin albumiinia (BSA), sen määrän ollessa esimerkiksi 1-3 mg/ml. BSA:n lisääminen joh-30 taa saannon lievään kasvuun, ja se stabiloi proteiinia (mikä johtuu todennäköisesti siitä, että vieras proteiini suojaa pinnan denaturoitumiselta ja/tai proteolyyttiseltä hajoamiselta).As the denaturing agent, a denaturing agent commonly used for activating proteins under oxidizing conditions, or arginine, can be usually used; of the known denaturants, guanidine hydrochloride or urea or their derivatives are preferably used. In addition, arginine has been found to be suitable. Furthermore, mixtures of these denaturing agents can be used. This activation step is preferably further performed in the presence of a foreign protein; ‘A suitable foreign protein can generally be any protein that is not proteolytically active. The method preferably uses bovine serum albumin (BSA) in an amount of, for example, 1-3 mg / ml. The addition of BSA results in a slight increase in yield and stabilizes the protein (probably due to the foreign protein protecting the surface from denaturation and / or proteolytic degradation).
Muut menetelmässä vallitsevat olosuhteet voivat vastata tek-35 niikan tason mukaisissa uudestaanaktivointivaiheissa vallitsevia tunnettuja ja tavanomaisia olosuhteita. Aktivointiaika (inkubointiaika) on mielellään 20-48 tuntia huoneen lämpötilassa. Aktivoitumisen puoliaika, kun läsnä on 0,5 mmoolia/1 6 95578 pelkistettyä (GSH) ja hapetettua (GSSG) glutationia, on noin 10-15 tuntia 20°C:n lämpötilassa. Mikäli inkubointia jatketaan pitemmän aikaa (48 tuntia) uudestaan hapettavissa olosuhteissa, niin stimuloitavuus BrCN-pilkkoutumistuotteilla 5 heikkenee tavallisesti. Aktivointivaihe toteutetaan mielellään EDTA:n läsnäollessa, jolloin tarkoituksenmukaisin pitoisuus on noin 1 mmooli/1 yhdistettä EDTA.Other conditions in the process may correspond to known and conventional conditions in the reactivation steps of the prior art. The activation time (incubation time) is preferably 20-48 hours at room temperature. The half-life of activation in the presence of 0.5 mmol / 165,578 reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione is about 10-15 hours at 20 ° C. If the incubation is continued for a longer time (48 hours) under re-oxidizing conditions, the stimulability with BrCN cleavage products 5 is usually reduced. The activation step is preferably performed in the presence of EDTA, with the most appropriate concentration being about 1 mmol / L EDTA.
Menetelmässä aktivointivaihetta (uudelleenhapetus/aktivoin-10 ti) edeltävät ja seuraavat vaiheet, kuten solujen rikkominen, liukoiseksi tekeminen (liukoiseksi tekeminen/pelkistys) sekä aktivointivaihetta mahdollisesti edeltävät ja/tai sitä seuraavat puhdistustoimenpiteet voidaan toteuttaa tekniikan tason, esimerkiksi patenttijulkaisujen EP-A 0 114 506 tai 15 EP-A 0 093 619 perusteella tällaisille toimenpiteille tunnettujen ja tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Kuitenkin saantoa ja aktivoitumista ajatellen optimaalisen tuloksen saavuttamiseksi saattaa olla tarkoituksenmukaista, että menetelmän eräät tai kaikki vaiheet toteutetaan yhden tai 20 useamman ohessa esitetyn suoritusmuodon mukaisesti. Mahdollista on myös erityisesti se, että keksinnön mukainen aktivointivaihe toteutetaan solujen rikkomisen jälkeen saadulla seoksella ilman edeltävää denaturointia ja/tai pelkistämistä, saannon jäädessä tällöin kuitenkin alhaiseksi. Ilmentä-25 minen toteutetaan prokariooteissa, mielellään P. putida -bakteerissa ja erityisesti E. coli -bakteerissa. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan kuitenkin käyttää yhtä hyvin silloinkin, kun ilmentäminen toteutetaan muissa prokariooteissa (esimerkiksi basilleissa).In the process, the steps before and after the activation step (reoxidation / activation), such as cell disruption, solubilization (solubilization / reduction), and purification steps, possibly before and / or after the activation step, can be carried out according to the prior art, e.g. or EP-A 0 093 619 according to known and conventional methods for such measures. However, for optimum results in terms of yield and activation, it may be appropriate to carry out some or all of the steps of the method in accordance with one or more of the embodiments set forth herein. It is also possible, in particular, that the activation step according to the invention is carried out with the mixture obtained after disruption of the cells without prior denaturation and / or reduction, but the yield is still low. Expression is carried out in prokaryotes, preferably P. putida and especially E. coli. However, the method of the invention can be used just as well when the expression is carried out in other prokaryotes (e.g. bacilli).
3030
Solujen rikkominen voidaan toteuttaa tähän tarkoitukseen tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi ultraäänellä, korkeapaineisella dispersiolla tai lysotsyymillä. Solut rikotaan tavallisesti neutraalin tai heikosti happaman pH-arvon 35 aikaansaamiseksi sopivassa, suspension väliaineena toimivassa puskuriliuoksessa, kuten esimerkiksi Tris-HCl-liuoksessa, jonka pitoisuus on 0,1 moolia/1. Solujen rikkomisen jälkeen liukenematon aines ("valoa taittavat kappaleet") erotetaan ii m f nm i i < in 7 95578 halutulla tavalla, mielellään sentrifugoimalla suuria g-ar-voja ja pitkiä sentrifugointiaikoja käyttäen, tai suodattamalla. Kasauma pestään aineilla, jotka eivät häiritse t-PA-proteiinia, mutta jotka kuitenkin mahdollisesti liuottavat 5 vieraita soluproteiineja, esimerkiksi vedellä tai fosfaatti-puskuriliuoksella, johon on lisätty mahdollisesti laimeita pinta-aktiivisia aineita, kuten Tritonia, minkä jälkeen kasauma (pelletti) tehdään liukoiseksi (liukoistaminen/pelkis-täminen). Liukoiseksi tekeminen tapahtuu mielellään alkali-10 sella pH-alueella, erityisesti pH-arvossa 8,6 + 0,4, merkap-tääniryhmästä peräisin olevan pelkistimen ja denaturoivan aineen läsnäollessa.Disruption of the cells can be accomplished for this purpose by conventional methods, for example, ultrasound, high-pressure dispersion, or lysozyme. The cells are usually disrupted in a suitable buffer medium, such as Tris-HCl, at a concentration of 0.1 mol / l to provide a neutral or weakly acidic pH of 35. After disruption of the cells, the insoluble material ("refractive bodies") is separated in the desired manner, preferably by centrifugation using high g-values and long centrifugation times, or by filtration. The agglomerate is washed with substances which do not interfere with the t-PA protein but which nevertheless potentially dissolve 5 foreign cellular proteins, for example water or phosphate buffer solution to which possibly dilute surfactants such as Triton have been added, after which the agglomeration (pellet) is soluble (solubilization / deoxidating-ION). The solubilization is preferably carried out in an alkaline pH range, in particular at a pH of 8.6 + 0.4, in the presence of a reducing agent derived from the mercaptan group and a denaturing agent.
Denaturoivana aineena voidaan käyttää tekniikan tason, esi-15 merkiksi patenttijulkaisun EP-A 0 114 506 perusteella tunnettuja, liukoistamiseen tavanomaisia denaturoivia aineita, erityisesti guanidiini-hydrokloridia tai ureaa. Guanidiini-hydrokloridin pitoisuus on tarkoituksenmukaisesti noin 6 moolia/1, ja urean noin 8 moolia/1. Menetelmässä voidaan 20 samoin käyttää yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä.As the denaturing agent, conventional denaturing agents, in particular guanidine hydrochloride or urea, known from the prior art, for example according to EP-A 0 114 506, can be used. The concentration of guanidine hydrochloride is suitably about 6 mol / l, and of urea about 8 mol / l. Compounds of general formula I can likewise be used in the process.
Merkaptaaniryhmästä peräisin olevana pelkistimenä voidaan käyttää esimerkiksi pelkistettyä glutationia (GSH) tai 2-merkaptoetanolia, esimerkiksi pitoisuutena, joka on noin 25 50-400 mmoolia/1, ja/tai erityisesti ditioerytritolia (DTE) tai ditiotreitolia (DTT) esimerkiksi pitoisuutena, joka on noin 80-400 mmoolia/1. Liukoiseksi tekeminen toteutetaan tarkoituksenmukaisesti huoneenlämpötilassa, sen (inkuboin-nin) kestäessä yhdestä useampaan tuntiin, mielellään kaksi 30 tuntia. Jotta voitaisiin estää pelkistimen hapettuminen ilmassa läsnäolevan hapen vaikutuksesta, yhdisteen EDTA lisääminen saattaa olla tarkoituksenmukaista. Liukoistamisvai-heella on liukoiseksi tekemisen ja pelkistämisen lisäksi puhdistavaa vaikutusta, koska suurin osa siitä materiaalis-35 ta, joka ei ristireagoi immunologisesti t-PA:n kanssa (vieraista proteiineista), ei muutu liukoiseksi.As the reducing agent derived from the mercaptan group, for example, reduced glutathione (GSH) or 2-mercaptoethanol can be used, for example in a concentration of about 50 to 400 mmol / l, and / or in particular dithioerythritol (DTE) or dithiothreitol (DTT), for example in a concentration of about 80-400 mmol / l. The solubilization is conveniently carried out at room temperature, with one (incubation) lasting one to several hours, preferably two to 30 hours. In order to prevent oxidation of the reducing agent by the presence of oxygen in the air, the addition of EDTA may be appropriate. In addition to solubilization and reduction, the solubilization step has a purifying effect because most of the material that does not cross-react immunologically with t-PA (foreign proteins) does not become soluble.
8 955788 95578
Liukoiseksi tekemisen jälkeen ja ennen aktivointivaihetta voidaan toteuttaa sinänsä tunnettuja ja tavanomaisia puhdis-tusvaiheita; puhdistavina menetelminä voidaan käyttää esimerkiksi steeriseen poissulkemiseen (ekskluusio) perustuvaa 5 kromatografiaa (SEC) (guanidiini-hydrokloridin tai urean läsnäollessa) tai ioninvaihtoa (urean tai sen johdannaisten läsnäollessa). Epäspesifinen hapettuminen uudestaan voidaan estää lisäämällä pelkistintä (esimerkiksi 2-merkaptoetano-lia) tai pitämällä pH arvossa 4,5 (katso esimerkiksi julkai-10 su R. Rudolph, Biochem. Soc. Transactions 13. (1985) 308-311). Mikäli edeltävässä liukoistamisvaiheessa käytetään yhdistettä DTE, se on erotettava jossakin puhdistusvaihees-sa.After solubilization and before the activation step, purification steps known per se and conventional can be carried out; purification methods include, for example, steric exclusion chromatography (SEC) (in the presence of guanidine hydrochloride or urea) or ion exchange (in the presence of urea or its derivatives). Nonspecific oxidation can be prevented again by the addition of a reducing agent (e.g., 2-mercaptoethanol) or by maintaining the pH at 4.5 (see, e.g., R. Rudolph, Biochem. Soc. Transactions 13. (1985) 308-311). If DTE is used in the previous dissolution step, it must be separated in one of the purification steps.
15 Puhdistaminen voidaan toteuttaa esimerkiksi SEC-kromatografisesta käyttäen Sephadex G-100 -geeliä, guanidiini-hydrokloridin ja pelkistimen, esimerkiksi yhdisteen GSH, läsnäollessa, pH-arvossa 1-4 (tässä vaiheessa voidaan erottaa suuri osa vieraasta proteiinista); tai se voidaan toteuttaa erot-20 tamalla denaturointiaine ja pelkistin siten, että suolat poistetaan Sephadex G-25 -geelillä pitoisuudeltaan 0,01 moo-lia/1 olevassa HC1-liuoksessa tai pitoisuudeltaan 0,1 moo-lia/1 olevassa etikkahapossa. Denaturoiva aine ja pelkistin voidaan erottaa vaihtoehtoisesti dialysoimalla näitä samoja 25 liuoksia vastaan.Purification can be performed, for example, by SEC chromatography using Sephadex G-100 gel, in the presence of guanidine hydrochloride and a reducing agent, e.g. GSH, at pH 1-4 (at this stage a large part of the foreign protein can be separated); or it can be carried out by separating the denaturant and the reducing agent so that the salts are removed on a Sephadex G-25 gel in a 0.01 mol / l HCl solution or in a 0.1 mol / l acetic acid solution. Alternatively, the denaturing agent and the reducing agent can be separated by dialysis against these same solutions.
Uudestaanaktivoivan vaiheen jälkeen voidaan toteuttaa toinen puhdistusvaihe; tämän vaiheen puhdistaminen toteutetaan tavallisesti dialysoimalla tai eristämällä aktivoitu t-PA tä-30 män jälkeen, esimerkiksi affiniteettikromatografisesti, käyttäen esimerkiksi Lys-Sepharose -geeliä.After the reactivation step, a second purification step can be performed; the purification of this step is usually carried out by dialysis or isolation of the activated t-PA after this, for example by affinity chromatography, using, for example, a Lys-Sepharose gel.
Keksinnön mukaisesti prokariooteista peräisin oleva t-PA saadaan aktivoiduksi siten, että normaalin biologisen aktii-35 visuuden lisäksi päästään myös edellä määritellyllä tavalla stimuloitavuuteen, joka on huomattavasti suurempi kuin luonnollisen t-PA:n stimuloitavuus, siihen verrattuna suurempi . kuin 10-, jopa 50-kertainen.According to the invention, t-PA derived from prokaryotes can be activated in such a way that, in addition to the normal biological activity, a stimulatability which is considerably higher than that of native t-PA is also achieved, as defined above. than 10-, even 50-fold.
9 955789 95578
Eräs toinen eukarioottinen proteiini, joka voidaan aktivoida keksinnön mukaisesti prokariooteissa ilmentämisen jälkeen, on beeta-interferoni.Another eukaryotic protein that can be activated according to the invention after expression in prokaryotes is interferon beta.
5 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.The essential features of the invention are set out in the appended claims.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä edelleen, sitä kuitenkaan millään tavalla rajoittamatta. Mikäli toisin ei mai-10 nita, prosenttiset osuudet ovat painoprosentteina, ja lämpötilat on esitetty Celsius-asteina.The following examples further illustrate the invention without, however, limiting it in any way. Unless otherwise indicated, percentages are by weight and temperatures are in degrees Celsius.
Esimerkki 1 a) "Valoa taittavien kappaleiden" valmistaminen 15 100 g E. coli -bakteerin kosteata solumassaa sekoitettuna 1,5 litraan liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA, homogenoitiin (Ultra-Turrax, 10) ja homo-genaattiin lisättiin 0,25 mg/ml lysotsyymiä. Seosta inkuboitiin 20 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se homogenoi tiin uudestaan ja jäähdytettiin 3°C:n lämpötilaan. Solut rikottiin korkeapaineisella dispersiolla (550 kg/cm2) . Tämän jälkeen seos huuhdottiin vielä 300 millilitralla liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA. Seos sent-25 rifugoitiin (2 tuntia nopeudella 27 000 x g 4°C:n lämpötilassa) , minkä jälkeen kasauma sekoitettiin 1,3 litraan liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5), 20 mmoolia/1 EDTA ja 2,5 % Triton X-100, ja se homogenoitiin. Seos sentrifugoi-tiin toistamiseen (30 minuuttia nopeudella 27 000 x g 4°C:n 30 lämpötilassa), minkä jälkeen kasauma sekoitettiin 1,3 litraan liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5), 20 mmoo-' '· lia/1 EDTA ja 0,5 % Triton X-100, ja se homogenoitiin. Kasauman sentrifugointi (30 minuuttia nopeudella 27 000 x g 4°C:n lämpötilassa) ja homogenointi 1 litrassa liuosta, joka sisältää 0,1 35 moolia/1 Tris-HCl (pH 6,5) ja 20 mmoolia/1 EDTA, toistettiin vuorotellen vielä kolmasti.Example 1 a) Preparation of "light refracting bodies" 15 100 g of moist cell mass of E. coli mixed with 1.5 liters of a solution containing 0.1 mol / l Tris-HCl (pH 6.5) and 20 mmol / l EDTA , was homogenized (Ultra-Turrax, 10) and 0.25 mg / ml lysozyme was added to the homogenate. The mixture was incubated for 20-30 minutes at room temperature, after which it was homogenized again and cooled to 3 ° C. The cells were disrupted by high pressure dispersion (550 kg / cm 2). The mixture was then rinsed with a further 300 ml of a solution containing 0.1 mol / l Tris-HCl (pH 6.5) and 20 mmol / l EDTA. The mixture was centrifuged (25 hours at 27,000 xg at 4 ° C for 2 hours), after which the pellet was stirred in 1.3 liters of a solution containing 0.1 M Tris-HCl (pH 6.5), 20 mmol / 1 EDTA and 2.5% Triton X-100 and homogenized. The mixture was centrifuged again (30 minutes at 27,000 xg at 4 ° C), after which the pellet was stirred in 1.3 liters of a solution containing 0.1 mol / L Tris-HCl (pH 6.5), mmol / l EDTA and 0.5% Triton X-100 and homogenized. Centrifugation of the pellet (30 minutes at 27,000 xg at 4 ° C) and homogenization in 1 liter of a solution containing 0.1 to 35 mol / l Tris-HCl (pH 6.5) and 20 mmol / l EDTA were repeated alternately. thrice.
t-PA-pitoisuus "valoa taittavien kappaleiden" preparaatissa määritettiin kvantitatiivisesti SDS-PAGE-menetelmällä, jossa 40 t-PA-vyöhykkeet tunnistettiin "Westernin täplinä" ja ne ana- 10 95578 lysoitiin densitometrisesti. "Valoa taittavat kappaleet” tuottavat SDS-PAGE-menetelmässä ja "Westernin täpliin" perustuvassa menetelmässä voimakkaan t-PA-vyöhykkeen, jossa molekyylipaino on noin 60 kDa. t-PA:n osuus "valoa taittavi-5 en kappaleiden" kokonaisproteiinipitoisuudesta on noin 21 %.The t-PA content in the preparation of "light refracting bodies" was quantified by SDS-PAGE, in which 40 t-PA bands were identified as "Western spots" and analyzed by densitometry. The "light-refracting bodies" produce a strong t-PA band with a molecular weight of about 60 kDa in the SDS-PAGE method and the "Western blot" method, with t-PA accounting for about 21% of the total protein content of the "light-refracting bodies". %.
b) "Valoa taittavien kappaleiden" tekeminen liukoiseksi ja pelkistäminen 10 "Valoa taittavia kappaleita" inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2-3 tunnin ajan liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl (pH 8,6), 6 moolia/1 guanidiini-hydrokloridia, 0,15-0,4 moolia/1 DTE ja 1 mmooli/1 EDTA ja jossa proteiinipitoisuus on 1-5 mg/ml. Tämän jälkeen liukenematon materiaa-15 li (soluseinämän kappaleet, jne.) erotettiin sentrifugoimal-la (esimerkiksi 30 minuuttia nopeudella 35000-50000 x g 4°C:n lämpötilassa). Supernatantin pH asetettiin väkevällä suolahapolla HC1 arvoon 3. Denaturoiva aine ja pelkistin poistettiin tämän jälkeen dialyysillä 4°C:n lämpötilassa 20 pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevaa HC1-liuosta vastaan.b) Solubilization and reduction of "refractive bodies" 10 "Refractive bodies" were incubated at room temperature for 2-3 hours in a solution containing 0.1 mol / l Tris-HCl (pH 8.6), 6 mol / l guanidine hydrochloride, 0.15-0.4 mol / l DTE and 1 mmol / l EDTA and with a protein content of 1-5 mg / ml. Insoluble material-15 (cell wall bodies, etc.) was then separated by centrifugation (e.g., 35,000-550,000 x g for 30 minutes at 4 ° C). The pH of the supernatant was adjusted to 3 with concentrated hydrochloric acid HCl. The denaturing agent and reducing agent were then removed by dialysis at 4 ° C against a 0.01 mol / l HCl solution.
c) Uudestaanhapetus ja aktivointic) Reaoxidation and activation
Uudestaanhapetus ja aktivointi toteutettiin laimentamalla 25 seos suhteessa 1:50 - 1:200 liuoksella, joka sisältää 0,1 ‘ moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 moolia/1 L-arginiinia, 2 mmoolia/1 GSH, 0,2 mmoolia/1 GSSG. Aktivoitumisen annettiin edetä 17-24 tuntia noin 20°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen saanto määritettiin ver-30 taamalla aktiivisuutta eukariooteista saadun luonnollisen glykosyloituneen t-PA:n aktiivisuuteen.Reacoxidation and activation were performed by diluting the mixture 1:50 to 1: 200 with a solution containing 0.1 M mol / L Tris / HCl (pH 10.5), 1 mmol / l EDTA, 1 mg / ml BSA, 0, 5 mol / l L-arginine, 2 mmol / l GSH, 0.2 mmol / l GSSG. Activation was allowed to proceed for 17-24 hours at a temperature of about 20 ° C, after which the yield was determined by comparing the activity to the activity of natural glycosylated t-PA from eukaryotes.
Saanto laskettuna "valoa taittavien kappaleiden" kokonaisproteiinipitoisuudesta: 2,5 +/- 0,5 % 35 stimuloitavuus: 10 +/- 5 %.Yield calculated on the total protein content of the "light refracting bodies": 2.5 +/- 0.5% 35 Stimulability: 10 +/- 5%.
Saanto laskettuna t-PA-osuudesta "valoa taittavissa kappa-·' leissa": noin 12 %.Yield based on the proportion of t-PA in "light refracting pieces": about 12%.
11 95578 d) Uudestaanhapetus ja aktivointi denaturoivaa ainetta ja pelkistintä erottamatta "Valoa taittavia kappaleita" inkuboitiin 2 tuntia huoneen 5 lämpötilassa liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 moolia/1 guanidiini-hydrokloridia, 0,2 moolia/1 DTE ja 1 mmoolia/1 EDTA, ja jossa proteiinipitoisuus on 1,25 mg/ml. Uudestaanhapetus käynnistettiin sitten välittömästi laimentamalla suhteessa 1:100 liuoksella, joka sisältää 0,1 10 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 moolia/1 L-arginiinia sekä taulukossa esitetyt määrät yhdistettä GSSG. Tämän lisäksi aktivointiseoksessa oli läsnä guanidiini-hydrokloridia jäännöspitoisuutena 0,06 moolia/1 sekä 2 mmoolia/1 yhdistettä DTE.11 95578 d) Reacoxidation and activation without separation of denaturing agent and reducing agent "Refractive bodies" were incubated for 2 hours at room temperature in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl (pH 8.6), 6 mol / l guanidine hydrochloride , 0.2 mol / l DTE and 1 mmol / l EDTA, and having a protein content of 1.25 mg / ml. The reoxidation was then started immediately by diluting 1: 100 with a solution containing 0.1 M Tris / HCl (pH 10.5), 1 M EDTA, 1 mg / ml BSA, 0.3 M L arginine and the amounts of GSSG shown in the table. In addition, guanidine hydrochloride was present in the activation mixture at a residual concentration of 0.06 mol / l and 2 mmol / l of DTE.
1515
Seuraavassa taulukossa esitetään aktivointisaannon riippuvuus GSSG-pitoisuudesta, kun aktivointi toteutetaan denaturoivaa ainetta ja pelkistintä erottamatta.The following table shows the dependence of the activation yield on the GSSG concentration when the activation is carried out without separating the denaturing agent and the reducing agent.
20 GSSG Saanto* Stimuloitavuus (mmoolia/1) (%) (kerroin) 0,2 0 1 0,13 4,0 25 5 1,49 7,4 6 1,28 5,4 7 1,04 5,8 9 0,98 5,2 10 1,77 10,0 30 15 0 20 0 = aktiivisen t-PA:n saanto laskettuna "valoa taittavien 35 kappaleiden" kokonaisproteiinipitoisuudesta.20 GSSG Yield * Stimulability (mmol / l) (%) (coefficient) 0.2 0 1 0.13 4.0 25 5 1.49 7.4 6 1.28 5.4 7 1.04 5.8 9 0.98 5.2 10 1.77 10.0 30 15 0 20 0 = yield of active t-PA calculated from the total protein content of the "light-refracting 35 bodies".
95578 1295578 12
Esimerkki 2 "Valoa taittavien kappaleiden" (VTK) preparaattia (noin 5 mg) inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2-3 tuntia 1 ml:ssa liuosta, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 5 moolia/1 guanidiini-hydrokloridia ja 0,15-0,2 moolia/1 DTE. Tämän jälkeen liukenematon materiaali (soluseinämien kappaleet, jne.) erotettiin sentrifugoimalla (20 minuuttia nopeudella 17 000 x g). Denaturoiva aine ja pelkistin poistettiin geelisuodatuksella käyttäen Sephadex G-25 -geeliä ("sulo perfine") pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa. Näyte laimeni tällöin 5-10-kertaisesti. Pelkistettyä materiaalia säilytettiin -20°C:n lämpötilassa pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa.Example 2 A preparation of "refractive bodies" (VTK) (about 5 mg) was incubated at room temperature for 2-3 hours in 1 ml of a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl (pH 8.6), 6 5 mol / L guanidine hydrochloride and 0.15-0.2 mol / l DTE. The insoluble material (pieces of cell walls, etc.) was then separated by centrifugation (20 minutes at 17,000 x g). The denaturing agent and reducing agent were removed by gel filtration using Sephadex G-25 gel ("Sulo perfine") in 0.01 mol / L HCl solution. The sample was then diluted 5-10-fold. The reduced material was stored at -20 ° C in a 0.01 mol / L HCl solution.
15 Esimerkki 315 Example 3
Seuraavissa taulukoissa esitetään useiden keksinnön mukaisten parametrien vaikutus t-PA:n aktivoitumiseen ja stimuloi-tavuuteen. Esimerkin 2 mukaisesti liukoiseksi tehtyä ja pelkistettyä proteiinia ei puhdistettu edelleen näitä uudel-20 leenhapetuskokeita varten.The following tables show the effect of several parameters of the invention on t-PA activation and stimulation. The protein solubilized and reduced according to Example 2 was not further purified for these reoxidation experiments.
Pelkistetty proteiini (pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa) aktivoitiin laimentamalla se suhteessa 1:10-1:500 "uudestaan hapettavalla puskurilla". Aktivoitu-25 minen määritettiin 22-48 tuntia huoneen lämpötilassa kestäneen inkuboinnin jälkeen. Uudestaan hapetetun proteiinin aktiivisuus lasketaan "uudestaanhapettumisstandardista" (100 %) liuoksessa, joka sisältää:The reduced protein (in 0.01 mol / L HCl solution) was activated by diluting it 1:10 to 1: 500 with "reoxidizing buffer". Activation was determined after 22-48 hours of incubation at room temperature. The activity of the reoxidized protein is calculated from the "reoxidation standard" (100%) in a solution containing:
30 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5) +1 mmoolia/1 EDTA0.1 mol / l Tris / HCl (pH 10.5) +1 mmol / l EDTA
+0,5 moolia/1 L-arginiinia + 1 mg/ml BSA+0.5 mol / l L-arginine + 1 mg / ml BSA
+ 0,5 mmoolia/1 GSH (pelkistetty glutationi) + 0,5 mmoolia/1 GSSG (glutationidisulfidi).+ 0.5 mmol / l GSH (reduced glutathione) + 0.5 mmol / l GSSG (glutathione disulfide).
3535
Stimuloitavuus lasketaan kaavalla AE+CNBrFSP AE-CNBrFSP (katso: W. Nieuwenhuizen et ai., Biochimica et Biophysica Acta m 755 (1983) 531-533). Aktiivisuus (prosentteina) ja stimuloi- I mt nm MIU : i 13 95578 tavuus (kerroin) määritettiin julkaisussa J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269, (1982) esitetyllä taval la.Stimulability is calculated by the formula AE + CNBrFSP AE-CNBrFSP (see W. Nieuwenhuizen et al., Biochimica et Biophysica Acta m 755 (1983) 531-533). The activity (as a percentage) and the stimulus (mt nm MIU) of 13,95578 (coefficient) were determined in J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48 (3), 266-269, (1982).
5 Tällöin saatiin seuraavat tulokset: 1. Aktivoitumissaannon riippuvuus L-arginiinin tai guani-diinihydrokloridin lisäyksestä: 10 Uudestaan hapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moo-lia/1 Tris/HCl (pH 10,5)5 The following results were obtained: 1. Dependence of the activation yield on the addition of L-arginine or guanidine hydrochloride: 10 Reoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl (pH 10.5)
+ 1 mmoolia/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH 15 +0,5 mmoolia/1 GSSG+ 1 mmol / l EDTA + 1 mg / ml BSA + 0.5 mmol / l GSH 15 +0.5 mmol / l GSSG
a) L-arginiini L-arginiini Aktiivisuus Stimuloitavuus 20 (mooli/1) (%) (kerroin) 0 4 2,5 0,25 98 7,5 0,5 100 21,9 25 0,75 27 16,3 1,0 23 3,5 Tässä esimerkissä on otettava huomioon se, että L-arginiini 30 inhiboi t-PA:ta. Näin ollen suurempien L-arginiinipitoisuuk-sien tapauksessa aktivoitumissaannon pienentyminen on korjattava inhibitiota vastaavalla tavalla.a) L-arginine L-arginine Activity Stimulability 20 (mol / l) (%) (coefficient) 0 4 2.5 0.25 98 7.5 0.5 100 21.9 25 0.75 27 16.3 1 .0 23 3.5 In this example, it should be noted that L-arginine 30 inhibits t-PA. Thus, in the case of higher L-arginine concentrations, the decrease in activation yield must be corrected in a manner corresponding to inhibition.
14 95578 b) Guanidiini-hydrokloridi (Gdn/HCl) (Gdn/HCl) Aktiivisuus (moolia/1) (%) 5 ............................14 95578 b) Guanidine hydrochloride (Gdn / HCl) (Gdn / HCl) Activity (moles / l) (%) 5 ....................... .....
0 11 0,25 22 0,5 53 0,75 58 10 1,0 12 2. Aktivoitumissaannon riippuvuus urean ja urean johdannaisten lisäyksestä: 150 11 0.25 22 0.5 53 0.75 58 10 1.0 12 2. Dependence of activation yield on the addition of urea and urea derivatives: 15
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,2 mmoolia/1 GSSG.Reaoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris (pH 10.5), 1 mmol / l EDTA, 1 mg / ml BSA, 5 mmol / l GSH, 0.2 mmol / l GSSG.
20 a) Urea20 a) Urea
Urea Aktiivisuus (moolia/1) (%) 25 0 1 0,5 20 1 59 1,5 126 2 162 30 2,5 141 3 72 4 12 5 0 35 15 95578 b) MetyyliureaUrea Activity (moles / l) (%) 25 0 1 0,5 20 1 59 1,5 126 2 162 30 2,5 141 3 72 4 12 5 0 35 15 95578 b) Methyl urea
Metyyliurea Aktiivisuus (moolia/1) (%) 5 ------------------------------------- 0,5 22 1 174 1.5 313 2 375 10 2,5 332 3 215 4 12 5 0 15 c) EtyyliureaMethyl urea Activity (moles / l) (%) 5 ------------------------------------- 0, 5 22 1 174 1.5 313 2 375 10 2,5 332 3 215 4 12 5 0 15 c) Ethyl urea
Etyyliurea Aktiivisuus (moolia/1) (%) 20 ------------------------------------- 0,5 46 1 212 1.5 323 2 300 25 2,5 107 3 19 4 0 5 0 30 16 95578 d) Dimetyy1iureaEthyl urea Activity (moles / l) (%) 20 ------------------------------------- 0, 5 46 1 212 1.5 323 2 300 25 2,5 107 3 19 4 0 5 0 30 16 95578 d) Dimethyl urea
Dimetyyliurea Aktiivisuus Stimuloitavuus (moolia/1) (%) (kerroin) 5 ---------------------------------------------------------- 0,5 167 8,8 1 256 8,9 1.5 283 9,4 2 177 7,7 10 2,5 78 8,9 3 23 9,9 4 4 8,6 5 2 3,5 15 3. Aktivoitumissaannon riippuvuus rasvahappoamidien lisäyksestä:Dimethylurea Activity Stimulability (moles / l) (%) (coefficient) 5 ---------------------------------- ----------------------- 0.5 167 8.8 1 256 8.9 1.5 283 9.4 2 177 7.7 10 2.5 78 8.9 3 23 9.9 4 4 8.6 5 2 3.5 15 3. Dependence of activation yield on the addition of fatty acid amides:
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 20 Tris (pH 10,5), 1 mmoolia/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,2 mmoolia/1 GSSG.Reoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris (pH 10.5), 1 mmol / l EDTA, 1 mg / ml BSA, 5 mmol / l GSH, 0.2 mmol / l GSSG.
a) Formamidi 25 Formamidi Aktiivisuus : (moolia/1) (%) 0 42 0,5 59 30 1 175 1.5 245 2 325 2.5 423 3 444 35 4 416 5 341 · > su-.* mtu . . ί 17 95578 b) Metyyliformamidia) Formamide 25 Formamide Activity: (moles / l) (%) 0 42 0,5 59 30 1 175 1.5 245 2 325 2.5 423 3 444 35 4 416 5 341 ·> su -. * mtu. . ί 17 95578 (b) Methylformamide
Metyyliformamidi Aktiivisuus (moolia/1) (%) 5 ------------------------------------- 0,5 100 1 135 1.5 304 2 389 10 2,5 466 3 452 4 425 5 121 15 c) AsetamidiMethylformamide Activity (moles / l) (%) 5 ------------------------------------- 0, 5 100 1 135 1.5 304 2 389 10 2,5 466 3 452 4 425 5 121 15 c) Acetamide
Asetamidi Aktiivisuus (moolia/1) (%) 20 ------------------------------------- 0,5 72 1 134 1.5 207 2 261 25 2,5 204 :· 3 237 4 198 5 141 30 is 95578 d) PropionamidiAcetamide Activity (moles / l) (%) 20 ------------------------------------- 0, 5 72 1 134 1.5 207 2 261 25 2.5 204: · 3 237 4 198 5 141 30 is 95578 d) Propionamides
Propionamidi Aktiivisuus (moolia/1) (%) 5 ------------------------------------- 0,5 95 1 99 1.5 197 2 150 10 2,5 101 3 39 4 2 5 0 15 e) ButyramidiPropionamide Activity (moles / l) (%) 5 ------------------------------------- 0, 5 95 1 99 1.5 197 2 150 10 2.5 101 3 39 4 2 5 0 15 e) Butyramide
Butyramidi Aktiivisuus (moolia/1) (%) 20 ------------------------------------- 0,5 55 1 52 1.5 17 2 0 25 ------------------------------------- 4. Aktivoitumissaannon riippuvuus pH-arvostaButyramide Activity (moles / l) (%) 20 ------------------------------------- 0, 5 55 1 52 1.5 17 2 0 25 ------------------------------------ 4. Dependence on activation yield The pH-value
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 30 Tris/HCl + 1 mmoolia/1 EDTA + 0,5 moolia/1 L-arginiini + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG 35 19 95578Reaoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl + 1 mmol / l EDTA + 0.5 mol / l L-arginine + 1 mg / ml BSA + 0.5 mmol / l GSH + 0.5 mmol / 1 GSSG 35 19 95578
Aktiivisuus Stimuloitavuus pH (%) (kerroin) 7 1 58 22 3,0 9 89 13,6 10 105 20,3 11 95 21,3 10 5. Aktivoitumissaannon riippuvuus GSH/GSSG-pitoisuudestaActivity Stimulability pH (%) (factor) 7 1 58 22 3.0 9 89 13.6 10 105 20.3 11 95 21.3 10 5. Dependence of activation yield on GSH / GSSG concentration
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 10,5,Reoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl, pH 10.5,
15 +1 mmooli/1 EDTA15 +1 mmol / l EDTA
+ 0,5 moolia/1 L-arginiini + 1 mg/ml BSA+ 0.5 mol / l L-arginine + 1 mg / ml BSA
a) + 1 mmooli/1 GSHa) + 1 mmol / l GSH
20 (GSSG) Aktiivisuus Stimuloitavuus (mmoolia/1) (%) (kerroin) 0,1 239 14,9 25 0,2 273 15,3 0,5 193 13,3 1 198 12,5 5 17 2,1 10 0 30 20 0 20 9557820 (GSSG) Activity Stimulability (mmol / l) (%) (coefficient) 0.1 239 14.9 25 0.2 273 15.3 0.5 193 13.3 1 198 12.5 5 17 2.1 10 0 30 20 0 20 95578
b) + 0,2 mmoolia/1 GSSGb) + 0.2 mmol / l GSSG
(GSH) Aktiivisuus Stimuloitavuus (imnoolia/1) (%) (kerroin) 5 ------------------------------------------------- 0,05 15 2,2 0,1 40 3,8 0,2 112 6,8 0,5 142 7,4 10 1 273 6,8 5 260 7,9 10 143 6,3 20 55 5,1 15 6. Aktivoitumissaannon riippuvuus proteiinin pitoisuudesta uudestaanhapetettaessa (laimennos suhteessa 1:20 - 1:500)(GSH) Activity Stimulability (imnols / 1) (%) (coefficient) 5 -------------------------------- ---------------- 0.05 15 2.2 0.1 40 3.8 0.2 112 6.8 0.5 142 7.4 10 1,273 6.8 5,260 7.9 10,143 6.3 20 55 5.1 15 6. Dependence of the activation yield on the protein content during reoxidation (dilution ratio 1:20 - 1: 500)
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 20 Tris/HCl (pH 10,5)Reoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl (pH 10.5)
+ 1 mmooli/1 EDTA +0,5 moolia/1 L-arginiinia + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 GSH 25 +0,5 mmoolia/1 GSSG+ 1 mmol / l EDTA +0.5 mol / l L-arginine + 1 mg / ml BSA + 0.5 mmol / l GSH 25 +0.5 mmol / l GSSG
Laimennos Aktiivisuus Stimuloitavuus (%) (kerroin) 30 1:10 29 15,3 1:20 45 25,4 1:50 69 37,9 1:100 100 37,9 1:200 79 52,7 35 1:500 29 28,7 7. Aktivoitumissaannon riippuvuus BSA:n lisäyksestä 95578 21Dilution Activity Stimulability (%) (factor) 30 1:10 29 15.3 1:20 45 25.4 1:50 69 37.9 1: 100 100 37.9 1: 200 79 52.7 35 1: 500 29 28.7 7. Dependence of activation yield on BSA supplement 95578 21
Uudestaanhapettaminen liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH 10,5)Reoxidation in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl (pH 10.5)
5 +1 mmooli/1 EDTA5 +1 mmol / l EDTA
+ 0,5 moolia L-arginiinia + 0,5 mmoolia/1 GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG+ 0.5 moles of L-arginine + 0.5 mmol / l GSH + 0.5 mmol / l GSSG
10 BSA Aktiivisuus (mg/ml) (%) 0 47 0,5 83 15 1 100 3 102 5 52 20 Kuviot 1 ja 2 esittävät aktiivisuutta fibriinin CNBr-pilk- koutumistuotteiden läsnäollessa ja niiden puuttuessa 17 tuntia huoneen lämpötilassa kestäneen uudelleenhapettamisen jälkeen, joka uudelleenhapettaminen toteutettiin seuraavassa liuoksessa: 0,1 moolia/1 Tris/HCl (pH =10,5) +1 mmooli/1 25 EDTA + 0,5 moolia/L-arginiini + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmoolia/1 ' GSH + 0,5 mmoolia/1 GSSG. Kuvioissa 1 ja 2 käyrät (A) esit tävät aktiivisuutta CNBr-pilkkoutumistuotteiden läsnäollessa, ja käyrät (B) aktiivisuutta CNBr-pilkkoutumistuotteiden puuttuessa.10 BSA Activity (mg / ml) (%) 0 47 0.5 83 15 1 100 3 102 5 52 20 Figures 1 and 2 show the activity in the presence and absence of CNBr cleavage products of fibrin after reoxidation for 17 hours at room temperature, which the reoxidation was carried out in the following solution: 0.1 mol / l Tris / HCl (pH = 10.5) +1 mmol / l EDTA + 0.5 mol / L-arginine + 1 mg / ml BSA + 0.5 mmol / l GSH + 0.5 mmol / l GSSG. In Figures 1 and 2, curves (A) show activity in the presence of CNBr cleavage products, and curves (B) show activity in the absence of CNBr cleavage products.
3030
Esimerkki 4Example 4
Geeniteknisesti valmistetun beeta-interferonin aktivointi "Valoa taittavat kappaleet" valmistettiin edellä kuvatulla 35 menetelmällä. "Valoa taittavien kappaleiden" pelkistäminen ja liukoiseksi tekeminen toteutettiin seuraavasti: kasaumaa inkuboitiin 3 tuntia 25°C:n lämpötilassa 10 millilitrassa t« : liuosta, joka sisältää 9,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,6, 6 moo- 22 95578 lia/1 Gdn.HCl, 1 mmooli/1 EDTA ja 0,2 moolia/1 DTE:tä, seosta sentrifugoitiin 30 minuuttia nopeudella 48 000 x g 4°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen supernatantin pH asetettiin arvoon 3 väkevällä suolahapolla HC1. Sitten seos geelisuoda-5 tettiin käyttäen Sephadex G25 F -geeliä pitoisuudeltaan 0,01 moolia/1 olevassa HC1-liuoksessa.Activation of genetically engineered interferon beta "Light-refracting bodies" was prepared by the method described above. The reduction and solubilization of the "refractive bodies" was carried out as follows: the pellet was incubated for 3 hours at 25 ° C in 10 ml of a solution containing 9.1 mol / l Tris / HCl, pH 8.6, 6 mol / l. 95578 lia / l Gdn.HCl, 1 mmol / l EDTA and 0.2 mol / l DTE, the mixture was centrifuged at 48,000 xg for 30 minutes at 4 ° C, after which the pH of the supernatant was adjusted to 3 with concentrated hydrochloric acid HCl. The mixture was then gel-filtered using Sephadex G25 F gel in a 0.01 mol / L HCl solution.
Eluentin johtokyky, proteiinipitoisuus ja uudelleenaktivoi-tavuus määritettiin.The conductivity, protein content and reactivability of the eluent were determined.
1010
Uudestaan hapetetun proteiinin aktiivisuus perustuu "stan-dardiaktivoitumiseen" (= 100 %) liuoksessa, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 10,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia.The activity of the reoxidized protein is based on "standard activation" (= 100%) in a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl, pH 10.5, 1 mmol / l EDTA, 5 mmol / l GSH, 0.5 mmol / 1 GSSG and 0.25 mol / l L-arginine.
15 a) Aktivoitumissaannon riippuvuus L-arginiinin lisäyksestä15 a) Dependence of activation yield on the addition of L-arginine
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 20 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG, ja sitä aktivoitiin 20 tuntia 0°C:n lämpötilassa.The eluent was diluted 1:50 with 0.1 M Tris / HCl, pH 8.5, 1 mmol / l EDTA, 5 mmol / l GSH, 0.5 mmol / l GSSG, and activated hours at 0 ° C.
Aktivoitumisen riippuvuus L-arginiinista 25 L-arginiini (moolia/1) Aktiivisuus (%) 0 8 0,25 8 0,5 15 30 0,75 15 b) Aktivoitumissaannon riippuvuus urean lisäyksestä 35 Aktivoimisliuos vastaa kohdan a) mukaista liuosta; aktivoimisen annettiin kuitenkin edetä 17 tuntia 0°C:n lämpötilas-sa.Dependence of activation on L-arginine 25 L-arginine (moles / l) Activity (%) 0 8 0.25 8 0.5 15 30 0.75 15 b) Dependence of activation yield on urea addition 35 The activation solution corresponds to the solution according to a); however, activation was allowed to proceed for 17 hours at 0 ° C.
2323
Aktivoitumisen riippuvuus ureasta 95578Dependence of activation on urea 95578
Urea (moolia/1) Aktiivisuus (%) 5 0 13 0,5 100 1 200 1,5 100 10 c) Aktivoitumissaannon riippuvuus formamidin lisäyksestäUrea (moles / l) Activity (%) 5 0 13 0,5 100 1 200 1,5 100 10 c) Dependence of activation yield on the addition of formamide
Aktivoiminen toteutettiin kohdassa a) kuvatulla tavalla; näytteet tutkittiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli 15 edennyt 17 tunnin ajan 0°C:n lämpötilassa.Activation was performed as described in a); samples were examined after activation progressed for 17 hours at 0 ° C.
Aktivoitumisen riippuvuus formamidistaDependence of activation on formamide
Formamidi Aktiivisuus 20 (moolia/1) 0 13 1 13 2 13 25 3 0 4 0 d) Aktivoitumissaannon riippuvuus hapetus-pelkistys-pusku- 30 ristaFormamide Activity 20 (moles / l) 0 13 1 13 2 13 25 3 0 4 0 d) Dependence of activation yield on oxidation-reduction buffer 30
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris-HCl, pH 8,5, l mmoolia/1 EDTA ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia, ja näytteet analysoitiin sen 35 jälkeen, kun aktivoituminen oli edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.The eluent was diluted 1:50 with a solution containing 0.1 mol / L Tris-HCl, pH 8.5, 1 mmol / l EDTA and 0.25 mol / l L-arginine, and the samples were analyzed after activation. had progressed for 17 hours at 0 ° C.
Aktivoitumisen riippuvuus yhdisteistä GSH ja GSSGDependence of activation on GSH and GSSG
24 95578 GSH GSSG Aktiivisuus (mmoolia/1) (mmoolia/1 (%) 5 ------------------------------------------- 1 0,5 6 5 0,5 13 10 0,5 25 20 0,5 25 10 ------------------------------- -..............24 95578 GSH GSSG Activity (mmol / l) (mmol / l (%) 5 -------------------------------- ----------- 1 0,5 6 5 0,5 13 10 0,5 25 20 0,5 25 10 ------------------ ------------- -..............
5 0,1 13 5 0,5 13 5 1,0 13 5 5 6 15 ----------------------------------------- e) Aktivoitumissaannon riippuvuus BSA:n lisäyksestä5 0.1 13 5 0.5 13 5 1.0 13 5 5 6 15 ------------------------------ ---------- e) Dependence of activation yield on the addition of BSA
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka si-20 sältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmooli/1 EDTA, 5 mmoolia/1 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-argi-niinia, ja se analysoitiin sen jälkeen, kun aktivoituminen 011 edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.The eluent was diluted 1:50 with a solution of 0.1 mol / L Tris / HCl, pH 8.5, 1 mmol / l EDTA, 5 mmol / l GSH, 0.5 mmol / l GSSG and 0, 25 mol / l L-Arginine and was analyzed after activation of 011 for 17 hours at 0 ° C.
25 Aktivoitumisen riippuvuus yhdisteestä BSA25 Dependence of activation on BSA
BSA (mg/ml) Aktiivisuus (%) 0 13 30 1 13 2 25 5 13 35 f) Aktivoitumissaannon riippuvuus pH-arvostaBSA (mg / ml) Activity (%) 0 13 30 1 13 2 25 5 13 35 f) pH dependence of activation yield
Eluentti laimennettiin suhteessa 1:50 liuoksella, joka sisältää 0,1 moolia/1 Tris/HCl, 1 mmoolia/1 EDTA, 5 mmoolia/1 95578 25 GSH, 0,5 mmoolia/1 GSSG ja 0,25 moolia/1 L-arginiinia, ja se analysoitiin sen jälkeen, kun aktivoituminen oli edennyt 17 tuntia 0°C:n lämpötilassa.The eluent was diluted 1:50 with a solution containing 0.1 mol / l Tris / HCl, 1 mmol / l EDTA, 5 mmol / l 95578 GSH, 0.5 mmol / l GSSG and 0.25 mol / l L- arginine and was analyzed after 17 hours of activation at 0 ° C.
5 Aktivoitumisen riippuvuus pH-arvosta pH Aktiivisuus (%) 6.5 0 10 7,5 6 8.5 13 9.5 50 10,5 1005 Dependence of activation on pH pH Activity (%) 6.5 0 10 7.5 6 8.5 13 9.5 50 10.5 100
Claims (21)
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853537708 DE3537708A1 (en) | 1985-10-23 | 1985-10-23 | METHOD FOR ACTIVATING T-PA AFTER EXPRESSION IN PROKARYONTS |
DE3537708 | 1985-10-23 | ||
EP8600610 | 1986-10-23 | ||
PCT/EP1986/000610 WO1987002673A2 (en) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | Process for activating heterologous, eucaryotic proteins genetically engineered and presenting disulphide bridges after their expression in procaryotic cells |
FI872753A FI94050C (en) | 1985-10-23 | 1987-06-22 | Method for activating gene-technologically produced heterologous eukaryotic proteins exhibiting disulfide crosslinks after expression in prokaryotes |
FI872753 | 1987-06-22 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI933868A FI933868A (en) | 1993-09-03 |
FI933868A0 FI933868A0 (en) | 1993-09-03 |
FI95578B true FI95578B (en) | 1995-11-15 |
FI95578C FI95578C (en) | 1996-02-26 |
Family
ID=6284269
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI872753A FI94050C (en) | 1985-10-23 | 1987-06-22 | Method for activating gene-technologically produced heterologous eukaryotic proteins exhibiting disulfide crosslinks after expression in prokaryotes |
FI933868A FI95578C (en) | 1985-10-23 | 1993-09-03 | Method for activating genetically engineered heterologous disulfide bridge eukaryotic proteins after expression in prokaryotes |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI872753A FI94050C (en) | 1985-10-23 | 1987-06-22 | Method for activating gene-technologically produced heterologous eukaryotic proteins exhibiting disulfide crosslinks after expression in prokaryotes |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP0393725B1 (en) |
JP (2) | JPH0728745B2 (en) |
KR (1) | KR900009139B1 (en) |
AT (2) | ATE98648T1 (en) |
AU (2) | AU590029B2 (en) |
CA (1) | CA1329157C (en) |
CZ (1) | CZ280727B6 (en) |
DD (1) | DD260517A5 (en) |
DE (3) | DE3537708A1 (en) |
DK (2) | DK175091B1 (en) |
ES (2) | ES2061434T3 (en) |
FI (2) | FI94050C (en) |
GR (2) | GR920300062T1 (en) |
HK (2) | HK153596A (en) |
HR (1) | HRP921075B1 (en) |
HU (2) | HU204855B (en) |
IE (1) | IE62634B1 (en) |
IL (1) | IL80325A (en) |
PT (1) | PT83609B (en) |
SI (1) | SI8611796B (en) |
SK (1) | SK278317B6 (en) |
SU (1) | SU1607689A3 (en) |
UA (1) | UA6023A1 (en) |
WO (1) | WO1987002673A2 (en) |
YU (1) | YU47185B (en) |
ZA (1) | ZA868012B (en) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
JP2581668B2 (en) * | 1985-11-27 | 1997-02-12 | 三井東圧化学株式会社 | Novel DNA sequence encoding human tissue plasminogen activator derived from normal human cells and vectors and cells containing the same |
US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
AU621051B2 (en) | 1987-04-28 | 1992-03-05 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
DE3722082A1 (en) * | 1987-07-03 | 1989-01-12 | Behringwerke Ag | METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF SERINE PROTEASES OR SERINE PROTEASE INHIBITORS |
CA1340586C (en) * | 1988-09-23 | 1999-06-08 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-beta |
DE3832898A1 (en) * | 1988-09-28 | 1990-04-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | PRAEPARATE OF EXPRESSED PLASMINOGEN ACTIVATOR IN PROKARYONS |
DE3835350A1 (en) * | 1988-10-17 | 1990-04-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | ACTIVATION OF GENETICALLY MANUFACTURED ANTIBODY EXPRESSED IN PROKARYONS |
DE3903581A1 (en) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | FABRIC PLASMINOGEN ACTIVATOR DERIVATIVE |
DE3942143A1 (en) * | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | T-PA PRO STABILIZATION |
DE69126434D1 (en) * | 1990-08-20 | 1997-07-10 | Novo Nordisk As | Process for the production of biologically active IGF-1 by using amino-terminally extended IGF-1 |
AU664021B2 (en) * | 1990-09-05 | 1995-11-02 | Natinco Nv | Solubilization of proteins in active forms |
DE4037196A1 (en) * | 1990-11-22 | 1992-05-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR REACTIVATING DENATURED PROTEIN |
DE4113750A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | IMPROVEMENT OF RENATURATION IN THE SECRETION OF DISULFID-BRIDGED PROTEINS |
DE4139000A1 (en) | 1991-11-27 | 1993-06-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD OF GENERATING BIOLOGICALLY ACTIVE SS-NGF |
US5212091A (en) * | 1992-03-02 | 1993-05-18 | Monsanto Company | Method of producing tissue factor pathway inhibitor |
WO1993019084A1 (en) * | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Synergen, Inc. | Refolding and purification of insulin-like growth factor i |
DK0600372T3 (en) | 1992-12-02 | 1997-08-11 | Hoechst Ag | Process for the preparation of proinsulin with properly connected cystine bridges. |
DE4405179A1 (en) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Method of obtaining insulin with correctly connected cystine bridges |
FR2729972B1 (en) * | 1995-01-31 | 1997-04-18 | Sanofi Sa | PROCESS FOR THE EXTRACTION OF PERIPLASMIC PROTEINS FROM PROKARYOTIC MICROORGANISMS IN THE PRESENCE OF ARGININ |
US5714371A (en) * | 1995-05-12 | 1998-02-03 | Schering Corporation | Method for refolding insoluble aggregates of hepatitis C virus protease |
US5728804A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-17 | Research Corporation Technologies, Inc. | Use of cyclodextrins for protein renaturation |
US6342585B1 (en) * | 1996-06-11 | 2002-01-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Method of activating denatured protein |
WO2001087925A2 (en) | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
US6653098B1 (en) * | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
DE19850429A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Andre Schrattenholz | Fragments |
EP1048732A1 (en) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for producing natural folded and secreted proteins |
EP1077263A1 (en) * | 1999-07-29 | 2001-02-21 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Process for producing natural folded and secreted proteins by co-secretion of chaperones |
DE10105912A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Recombinant Proteinase K |
DE10105911A1 (en) | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Expression of the recombinant proteinase K from Tritirachium album in yeast |
DE102005033250A1 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Process for purifying G-CSF |
DE102006009437A1 (en) | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF liquid formulation |
AR062069A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-10-15 | Genentech Inc | REPLEGED OF RECOMBINANT PROTEINS |
US8617531B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-12-31 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine |
NZ601759A (en) | 2010-03-17 | 2013-07-26 | Biogenerix Gmbh | Method for obtaining biologically active recombinant human g-csf |
EP2630153A4 (en) * | 2010-10-20 | 2015-06-03 | Medimmune Llc | Methods for processing inclusion bodies |
HUP1200171A1 (en) | 2012-03-19 | 2013-09-30 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for the production of polypeptides |
HUP1200172A2 (en) | 2012-03-19 | 2013-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for refolding g-csf from inclusion bodies |
CN103852527B (en) * | 2012-12-05 | 2015-05-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | High-flux protein sample pre-treatment device |
US10457716B2 (en) | 2014-08-06 | 2019-10-29 | University Of Notre Dame Du Lac | Protein folding and methods of using same |
CA3048735A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Biogend Therapeutics Co., Ltd. | Recombinant polypeptides, compositions, and methods thereof |
WO2022129460A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Richter Gedeon Nyrt. | Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5135481A (en) * | 1974-09-18 | 1976-03-25 | Fujiwa Kako Kk | KOJUNDOHITOROKINAAZE NO SEIHO |
US4468633A (en) | 1982-04-28 | 1984-08-28 | The Bendix Corporation | Adjustable microwave power combiner for a plurality of coaxially mounted impatt diodes |
IL68561A (en) | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
US4432895A (en) * | 1982-11-24 | 1984-02-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Monomeric interferons |
GR79124B (en) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
ATE107356T1 (en) * | 1983-03-25 | 1994-07-15 | Celltech Ltd | METHOD OF PRODUCING A PROTEIN. |
JPS6051119A (en) * | 1983-08-30 | 1985-03-22 | Green Cross Corp:The | Dried pharmaceutical preparation of urokinase |
US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
FR2596360B1 (en) * | 1986-04-01 | 1989-02-17 | Sotralentz Sa | CONTAINER ON PALLET WITH FOLDED AND REINFORCED MESH PROTECTION DEVICE |
JPH0651119A (en) * | 1992-07-28 | 1994-02-25 | Sekisui Chem Co Ltd | Production of phase difference plate |
-
1985
- 1985-10-23 DE DE19853537708 patent/DE3537708A1/en active Granted
-
1986
- 1986-10-10 IE IE268386A patent/IE62634B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-15 IL IL80325A patent/IL80325A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-17 CZ CS867526A patent/CZ280727B6/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-17 SK SK7526-86A patent/SK278317B6/en unknown
- 1986-10-21 SI SI8611796A patent/SI8611796B/en unknown
- 1986-10-21 YU YU179686A patent/YU47185B/en unknown
- 1986-10-22 ZA ZA868012A patent/ZA868012B/en unknown
- 1986-10-22 CA CA000521121A patent/CA1329157C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-22 DD DD29546886A patent/DD260517A5/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 ES ES86114731T patent/ES2061434T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AU AU65993/86A patent/AU590029B2/en not_active Ceased
- 1986-10-23 UA UA4202987A patent/UA6023A1/en unknown
- 1986-10-23 EP EP90109721A patent/EP0393725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 HU HU865290A patent/HU204855B/en unknown
- 1986-10-23 HU HU865290A patent/HUT43643A/en unknown
- 1986-10-23 PT PT83609A patent/PT83609B/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 AT AT86114731T patent/ATE98648T1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 ES ES90109721T patent/ES2020498T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP86906320A patent/EP0253823A1/en active Pending
- 1986-10-23 WO PCT/EP1986/000610 patent/WO1987002673A2/en active IP Right Grant
- 1986-10-23 EP EP86114731A patent/EP0219874B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 KR KR1019870700536A patent/KR900009139B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 AT AT90109721T patent/ATE131489T1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 DE DE3650449T patent/DE3650449D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 DE DE86114731T patent/DE3689404D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 JP JP61505882A patent/JPH0728745B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-22 SU SU874202987Q patent/SU1607689A3/en active
- 1987-06-22 FI FI872753A patent/FI94050C/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-23 DK DK198703203A patent/DK175091B1/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-09-13 AU AU41321/89A patent/AU607083B2/en not_active Expired
-
1991
- 1991-04-12 JP JP3079762A patent/JPH0824594B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-08-31 GR GR92300062T patent/GR920300062T1/en unknown
- 1992-10-16 HR HRP-1796/86A patent/HRP921075B1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-09-03 FI FI933868A patent/FI95578C/en not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-14 GR GR950403376T patent/GR3018410T3/en unknown
-
1996
- 1996-08-08 HK HK153596A patent/HK153596A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-08 HK HK153496A patent/HK153496A/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-12-18 DK DK200001897A patent/DK175109B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI95578B (en) | Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulphide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes | |
EP0364926B1 (en) | Activation of recombinant antibodies expressed in prokaryotes | |
US5453363A (en) | Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes | |
Macartney et al. | Latent and active human polymorphonuclear leukocyte collagenases: Isolation, purification and characterisation | |
Gellerfors et al. | Isolation of the Cytochrome‐bc1 Complex from Rat‐Liver Mitochondria | |
Takahashi et al. | Isolation and Characerization of Three Forms of Cathepsin B from Porcine Liver | |
EP0208539A2 (en) | Folding disulfide-cross-linkable proteins | |
FI85877B (en) | MEASURES FOR PERFORMANCE OF PEROXIDE ACTIVITIES, FOER FARING FOR EXAMINATION OF CHARACTERISTICS. | |
EP0067293A2 (en) | Method for isolating alpha-1-antitrypsin | |
US4390629A (en) | Polypeptide degrading enzymes | |
Berti et al. | Purification and characterization of rabbit muscle acylphosphatase in the thiol (‐SH) form | |
CZ280848B6 (en) | Activation method of heterologous proteins obtained by genetic technology and containing disulfide bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms | |
KR100337010B1 (en) | Human Serum Albumin with Increased Antioxidation Activity and Process for Preparing the Same | |
Bergström et al. | Large-scale production of intermediate-purity, soluble human plasminogen | |
Kishimura et al. | Characteristics of trypsin from the starfish Asterias amurensis | |
JPH062060B2 (en) | Purification method of porcine pancreatic kallikrein | |
JPS6226298A (en) | Improvement for folding protein containing disulfide bridge | |
JPH04135488A (en) | Production of active human lysozyme |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MA | Patent expired |