FI93228C - Menetelmä vankomysiinityyppisen glykopeptidiantibiootin talteenottamiseksi - Google Patents

Description

! 93228

Menetelmä vankomysiinityyppisen glykopeptidiantibiootin taiteenottamiseksi Tämä keksintö tarjoaa menetelmän tärkeän antibioot-5 tiryhmän muodostavien vankomysiinityyppisten glykopeptidi-antibioottien talteenottamiseksi. Vankomysiini on kaupallista menestystä omaava antibiootti, jota on ollut saatavilla 1950-luvun loppupuolelta lähtien. Esimerkkejä vankomysiini tyyppisistä glykopeptidiantibiooteista ovat: 10 Vankomysiini (US-patentti no. 3 067 099), M43A (US- patentti no. 4 548 925), M43D (US-patentti no. 4 547 488), M43B ja M43C (US-patentti no. 4 548 924), Ά82846Α, A82846B ja A82846C (US-patenttihakemus no. 909 791), ristosetiini (US-patentti no. 2 990 329), ristosetiini A-pseudoaglykoni 15 (Williams et. ai. J.C.S. Chem. Comm. 1979 906 - 908), A41030-tekijät A-G (US-patentti no. 4 537 770), A47934 (US-patentti no. 4 462 942), A35512-tekijät A-D ja H (US-patentti no. 4 122 168), A35512B-pseudoaglykoni (US-patentti no. 4 029 769, jossa kyseistä antibioottia kutsutaan 20 A35512B:ksi, mutta jota tässä kutsutaan A35512B-pseudoagly- koniksi, koska siinä on aminosokeri tallella), aktaplanii-ni- (A-4696) tekijät A ja B (US-patentti no. 4 116 662), aktaplaniinitekijät B^, Bg, Bg, Cla, Cg ja (US-patentti no. 4 322 406) aktaplaniinitekijä G (US-patentti no.

25 4 461 723), aktaplaniinitekijä H (US-patentti no.

4 558 036), aktaplaniinitekijät K-0 (US-patentti no.

4 479 897), aktaplaniinipseudoaglykoni (US-patentti no.

4 322 343), teikomysiini (teikoplaniini) A^, Ag ja Ag (US-patentti no. 4 239 751), teikomysiini Ag tekijät 1-5 (US-30 patentti no 4 542 018), L 17054 (US-patentti no 4 594 187) ja L 17046 (EP-patentti no. 119 574-A).

Käytännöllisyyssyistä tämän yhdisteryhmän antibiootteja kutsutaan oheisessa hakemusjulkaisussa vankomysiini-tyyppisiksi antibiooteiksi.

35 Vankomysiini tyyppi set antibiootit ovat hyödyllisiä terapeuttisia aineita erityisesti gram-positiivisia baktee- 2 93228 reja vastaan sekä samoin hyödyllisiä eläinten kasvua edistäviä aineita.

Yleensä ottaen otettaessa antibioottia talteen fer-mentaatiolietteestä, jossa sitä on tuotettu, talteen saa-5 daan maksimimäärä antibioottia käyttämällä mahdollisimman vähäistä lukumäärää eri vaiheita. Maksimaalinen talteenotto on vaikeampaa tuotettaessa antibioottia suuressa mittakaavassa. Suuren mittakaavan ferementaatiolla tarkoitetaan käyttämistä astioissa, joiden tilavuus on vähintään 4 000 10 litraa. Tällaisissa tapauksissa antibiootti joudutaan eristämään suuristä määristä kompleksista vesipohjaista fermen-taatioseosta. Koko fermentaatioliemi, jossa antibiootti on tuotettu, ei sisällä ainoastaan antibioottia, vaan myös liukenematonta sienihuovastoa suspendoituneena laimeaan 15 liuokseen reagoimattomia kasvualustaravinteita sekä sekalaisia metaboliavälituotteita ja -tuotteita. Antibiootin eristys on täten usein vaikeaa ja vaatii lukuisia eristys-, konsentrointi- ja puhdistusvaiheita.

Useimmissa tapauksissa ensimmäinen vaihe otettaessa 20 talteen fermentoimalla tuotettua antibioottia on suodatus-apuaineen kuten Hyflo Supercelin lisääminen. Pääasiallinen suodatusapuaineella saatava etu on sienihuovaston tehokkaampi erotus. Fermentoitaessa suuressa mittakaavassa tarvitaan kuitenkin suuria määriä kyiseistä suodatusapuainet-25 ta. Koska suodatusapuaineet ovat biologisesti huonosti hajoavia, on niiden käytöstä suuren mittakaavan prosesseissa seurauksena huomattavia jätteenkäsittelyongelmia.

Sienihuovaston poiston jälkeen fermentoimalla tuotetun antibiootin talteenotossa tavallisesti käytetty toinen 30 vaihe on suodatetun liemen pH:n säätäminen sopivalle tasolle. Tässä vaiheessa tarvittavat suuret happo- tai emäsmää-rät muodostavat kuitenkin turvallisuusongelman, ne ovat hankalia käsitellä sekä nostavat käsiteltävän liuosmäärän kokonaistilavuutta.

35 Aiemmin vankomysiinin kau eilisessä tuotannossa suo- 3 93228 datettiin koko liemi emäksisessä pH:ssa noin 8-10, suo-doksen pH säädettiin noin 6 - 7:ksi ja suodos vietiin sitten ioninvaihtohartsin läpi, tavallisesti vähän ristisidok-sia sisältävän polystyreeni-divinyylibentseeninatrium ka-5 tionivaihtohartsin läpi. Vankomysiini adsorboitiin hartsiin. Liemen poiston jälkeen hartsia pestiin vedellä ja vankomysiini eluoitiin emäksisellä vesiliuoksella, pH 9 - 11. Tyypillinen käytetty eluentti oli natriumhydroksidin vesiliuos, pH 10 - 11. Vankomysiinin sisältävä emäksinen 10 eluaatti neutraloitiin ja aktiivisuutta nostettiin edelleen uudelleenadsorboimalla vankomysiini funktionaalisia ryhmiä sisältämättömään hartsiin (katso US-patentti no. 4 440753).

Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

15 Menetelmä käsittää: 1) fermentaatioliemen, jossa antibiootti on tuotettu, sekoittamisen polystyreenidivinyylibents-eenihartsiin kuten Dow XFS 43278.00-hartsiin, 2) hartsin erottamisen kasvualustasta ja 3) antibiootin eluoinnin hartsista. Eräs tällä menettelyllä saavutettava etu on, 20 että se sallii fermentaatiolieteen käytön sellaisenaan ilman pH-säätöä ja suodatusta. Täten adsorptiosta myseeliin ja liittyvistä mekaanisista syistä johtuvat antibioottihä-vikit eliminoituvat. Lisäksi vältetään tietyt jäteongelmat kuten ne, jotka liittyvät suodatusapuaineen käyttöön tai 25 pH:n säätöön.

Huomattava näkökohta tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on tietyn tyyppisen ioninvaihtohartsin käyttö. Kätevyyden vuoksi tätä hartsia, joka on sulfonoitu styreeni -di vinyylibentseenikopolymeeri, kutsutaan tässä polysty- 30 reenidivinyylibentseenihartsiksi. Kyseinen hartsi on mikro- huokoinen, vahvahappokationihartsi, joka käsittää vain vä hän ristisidoksia (nimellisesti 2 %) ja joka tavallisesti on suola- kuten natriumsuolamuodossa. Esimerkkejä tähän menetelmään sopivista hartseista on Dow XFS43278.00 (Dow 35 Chemical Co., Midland, MI, USA) ja Diaion SK-102 (Mitsubis- 4 93228 hi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japani). Olemme todenneet, että tämäntyyppistä hartsia voidaan käyttää vankomy-siinityyppisen glykopeptidiantibiootin adsorboimiseksi suorittamatta ensin aiemmin välttämätöntä koko fermentaatio-5 liemen suodatusta.

Menetelmässä käytetty hartsimäärä vaihtelee riippuen fermentaatioalustan tilavuudesta ja fermentaatiolla tuotetun antibioottiaktiivisuuden määrästä. Yleensä hartsi sekoitetaan koko fermentaatioliemeen joko lisäämällä koko 10 liemi hartsiin tai hartsi koko liemeen riittävän pitkäksi ajaksi, jotta antibiootti ehtii adsorboitua hartsiin.

Antibootin adsorboimiseksi hartsiin tarvittava kon-taktiaika vaihtelee. Esimerkiksi liemen lämpötila vaikuttaa vaadittavan ajan pituuteen. Edullisessa muodossa liemen 15 lämmittäminen lämpötilaan noin 30° - noin 60 °C, lyhentää tarvittavaa kontaktiaikaa sekä samoin tekee liemestä vähemmän viskoosia ja sellaisena helpommin käsiteltävää. Tarvittava aika on yleensä korkeintaan noin 6 tuntia.

Kun antibiootti on adsorboitu hartsiin, fermentaa-20 tioalusta voidaan erottaa hartsista käyttämällä tunnettuja menetelmiä, esim. suodatusta (kun hartsi on lisätty eräkä-sittelyllä) tai mekaanista erotusta (kun hartsi ja liemi on sekoitettu käyttäen adsorptiota ylävirtaan).

Antibiootti voidaan sitten eluoida erotetusta hart-25 sista käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä. Menettely käsittää 1) hartsin pesemisen vedellä, 2) antibiootin eluoin-nin liettämällä hartsia eräkäsittelynä veteen, jonka pH on säädetty arvoon noin 9 - noin 12, kunnes antibiootti on vapautunut hartsista ja 3) antibiootin sisältävän eluaatin 30 erottamisen hartsista. Käytettäessä tätä menettelyä pH vaiheessa 2) on erityisen edullisesti noin 10 noin 11.

Antibiootti voidaan ottaa talteen eluaatista ja sitä voidaan jatkopuhdistaa lukuisten tunnettujen menetelmien mukaan. Esimerkiksi liukoista antibioottia voidaan jatko-35 puhdistaa adsorboimalla se funktionaalisia ryhmiä sisältä- 5 93228 mättömään hartsiin kuten edellä mainittiin. Toinen menetelmä on antibiootin eristys liukenemattomana kuparikompleksi-na. Kuparikompeksia voidaan siten käsitellä rikkivedyllä happamissa olosuhteissa antibiootin saattamiseksi liukoi-5 seen muotoon, joka sitten voidaan eristää vapaana emäksenä sopivalla pH-säädöllä.

Vapaata emästä voidaan käyttää suun kautta annettavissa koostumuksissa tai se voidaan muuttaa sopivaksi hap-poadditiosuolaksi kuten hydrokloridiksi tai fosfaatiksi 10 käytettäväksi suun kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuo-lisesti annettavissa koostumuksissa.

Vaikka tämän keksinnön mukainen menetelmä on edullinen minkä tahansa mainitun vankomysiinityyppisten antibioottien ryhmän jäsenen kyseessä ollen, parhaiten se so-15 veltuu käytettäväksi fermentaatioprosesseilla tuotettujen antibioottien kyseessä ollen, eli kun kyseessä on vankomy-siini, Μ43Ά, B, C tai D, A82846A, B tai C, ristosetiini, A41030-tekijät A-G, A47934, A35512-tekijät A-D tai H, akta-planiinitekijä A, Bj, B2, Bg, Cla, Cg, G tai H tai tei- 20 komysiini A^ tai A2~tekijät 1-5 ja Ag. Tämä menetelmä soveltuu erityisen hyvin käytettäväksi vankomysiinin yhteydessä, jota sen kaupallisesta menestyksestä johtuen usein tuotetaan erittäin suuressa mittakaavassa.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat tämän keksin-25 nön suorittamista.

Valmistus 1 A82846-antibiootin valmistus (a) A82846-antibioottia tuottavien viljelmien fer-mentointi 30 (1) NRRL 18098-viljelmää käyttäen.

A. NRRL 18098:n fermentointi ravistelukasvatuksena.

Siirrostetaan Nocardia orientalis NRR1 18098-viljel-mää joko kylmäkuivattuna pellettinä tai nestetypessä säilytettynä suspensiona siemenkasvualustaan, jonka koostumus on 35 seuraava: 6 93228 S iemenalus ta: aineosa_määrä (%) glukoosi 1 ,0 5 liukoinen tärkkelys 2,0 hiivauute 0,5 kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti* 0,5

CaC03 0,1 deionisoitu vesi qs. 1 litra 10

Kasvualustan pH säädetään noin 7,5:een NaOH:lla ennen sterilointia.

* NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NY Vinopinnat tai maljat valmistetaan lisäämällä 2,5 % 15 agaragaria siemenkasvualustaan. Inokuloitua vinopintaa in- kuboidaan 30 °C:ssa noin 10 - noin 14 päivän ajan. Kasvanutta vinopintaa raaputetaan steriilillä työvälineellä itiöiden irrottamiseksi ja myseelimaton poistamiseksi ja rikkomiseksi. Noin 1/4 näin saadusta irrotetusta itiömäärästä ja 20 viljelmäkasvustosta siirrostetaan 50 mitään ensivaiheen siemenkasvualustaa.

Inokuloitua ensivaiheen kasvualustaa inkuboidaan 250 ml:n erlenmeyerkolvissa 30 °C:ssa noin 24 - 48 tuntia ra-vistelijassa, joka kiertää 5,08 cm:n (2 tuuman) kehää no-25 peudella 250 kierrosta/min.

Tätä inkuboitua ensivaiheen viljelmäalustaa (0,5 ml) siirrostetaan 50 ml:aan tuotantoalustaa, jonka koostumus on seuraava: 30 aineosa_määrä (%) glukoosi 2,5 soijajauho 1,5 perunadekstriini 3,0

CaC03 0,25 35 jätemelassi 0,3 \ 7 93228 aineosa_ määrä (%) happohydrolysoitu kaseiini* 0,5 deionisoitu vesi qs. 1 litra (pH säädetään ennen sterilointia 7,5:een NaOH:lla.) 5 *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

Inokuloitua tuotantoalustaa inkuboidaan 250 ml:n laa-jasuisessa erlenmeyerkolvissa 30 °C:ssa 4-5 päivän ajan ravistelijassa, joka kiertää 5,08 cm:n (2 tuuman) kehää 10 nopeudella 250 kierrosta/min.

B. NRRL 18098:n fermentointi tankkifermentorissa Jotta saataisiin suurempi tilavuus siirrostetta, siir- rostetaan 10 ml osassa A kuvatun mukaisesti valmistettua in-kuboitua ensivaiheen kasvualustaa 400 ml:aan toisen vaiheen 15 kasvualustaa, jonka koostumus on sama kuin ensivaiheen alustan koostumus. Tätä toisen vaiheen kasvualustaa inkuboidaan 2 litran laajasuisessa erlenmeyerkolvissa noin 48 tunnin ajan 30 °C:ssa ravistelijassa, joka kiertää 5,08 cm:n (2 tuuman) kehää nopeudella 250 kierrosta/min.

20 Täten valmistettua toisen vaiheen kasvualustaa (1 000 ml) siirrostetaan 100 litran eriin steriiliä tuotantoalustaa, joka valmistetaan kuten kuvattu osassa A paitsi että lisätään P-2000-vaahdonestoainetta (0,3 g/litra). Inokuloi-dun tuotantoalustan annetaan käydä sekoittajalla varuste-25 tussa 165 litran fermentorissa 90 - 100 tunnin ajan 30 °C:een lämpötilassa. Astian, jonka sisältöä sekoitetaan (80 kierrosta/min) , ilmavirtaus säädetään siten, että liuenneen hapen määrä pysyy yli 50 %:ssa ilman kyllästyspisteestä.

C. Vaihtoehtoinen menettely NRRL:n 18098 fermentoimi- 30 seksi tankkifermentorissa

Seurataan osan B mukaista menettelyä lukuunottamatta, että sopiva määrä kasvualustaa siirrostetaan noin 3 400 litraan (1 200 US-gal) tuotantoalustaa 4 500 litran (1 600 US-gal) fermentorissa.

8 93228 (2) Fermentointi NRRL 18099-viljelmää käyttäen Kasvatetaan Nocardia orientalis NRRL 18099-viljelmää joko kylmäkuivatusta pelletistä tai nestetypessä säilytetystä suspensiosta osassa (1) kuvatun menettelyn mukaan 5 lukuunottamatta tuotantoalustan koostumusta, joka on seu-raava: aineosa_määrä (%) glukoosi 1 ,0 10 perunadekstriini 2,0 peptoni* 1,0

CaC03 0,2 jätemelassi 2,0 deionisoitu vesi qs. 1 litra 15 (ei pH:n säätöä) * Bacto-peptone (Difco Laboratories) (3) Fermentointi NRRL 18100-viljelmää käyttäen Kasvatetaan Nocardia orientalis NRRL 18100-viljelmää 20 joko kylmäkuivatusta pelletistä tai nestetypessä säilytetystä suspensiosta osassa (1) kuvatun menettelyn mukaan lukuunottamatta, että happohydrolysoituna kaseiinina käytetään Amicasea (Sheffield Chemical Co.)· (b) A82846-raaka-antibiootin valmistus 25 Osassa (a)(1)(A) kuvatun mukaisesti 4 500 litran fer- mentorissa tuotetun fermentaatioliemen ( 4 200 litraa) pH säädettiin 10,5:een 5N NaOH:lla ja lisättiin 3 % Celite 545-suodatusapuainetta. Seos suodatettiin suodatuspuristimella ja puristin pestiin vedellä. Yhdistettyjen suodoksen ja pe-30 suliuoksen (4 200 litraa) pH säädettiin 7:ään 5 N HCl:llä (tai H2SO^:llä) ja liuos panostettiin Dow XFS-43278 (ΝΗ^+)-hartsikolonniin (200 litraa suodosta/10 litraa hartsia). Kolonnia eluoitiin virtausnopeudella 750 ml/min. Fraktiot analysoitiin joko biologisella määrityksellä Bacillus subti-35 lista käyttäen tai HPLC:llä.

9 93228

Kolonnia pestiin 5 kolonnitilavuudella vettä 100 litran neste-eriä keräten.

Aktiivinen aines eluoitiin hartsista 5 kolonnitilavuudella 0,05 N NH^OH-liuosta keräten 25 litran fraktioita.

5 A82856:tta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroi tiin in vacuo noin 30 litraksi. Tämä liuos panostettiin 10 litran Diaion HP-20-hartsilla vedessä pakattuun kolonniin. Kolonnia pestiin 3 kolonnitilavuudella vettä virtausnopeuden ollessa 300 ml/min. Pesuvesi heitettiin pois. Aktiivinen 10 aines eluoitiin kolonnista 1,0 % etikkahappoa sisältävällä I^O/iPrOH- (95:5) liuoksella virtausnopeuden ollessa 100 ml/min ja kerättäessä 4 litran fraktioita, jotka analysoitiin biomäärityksellä ja HPLC:llä. A82856:tta sisältävt fraktiot (no:t 6 - 14) yhdistettiin, konsentroitiin in vacuo 15 ja kylmäkuivattiin 356 g:ksi A82856-raaka-antibioottia.

(c) A82846-määritys HPLC:llä

Seuraavat analyyttiset HPLC-järjestelmät soveltuvat A82856-yhdisteille: (1) Kationinen ioninvaihtohartsi.

20 Kolonnikantomateriaali: Zorbax* SCX (4,6 x 150 mm).

Järjestelmä: gradienttieluutio A:B (4:1) -» A:B (1:9) /5 min. py- säytys 15 min A = MeOH/0,1 M NaH2P04-liuos (1:9).

25 B = MeOH/0,9 M NaH2P04~liuos (1:9).

Virtausnopeus: 1,0 ml/min.

Detektio: UV, 225 nm.

Retentioajat: pitoisuudesta riippuvaisia, mutta ovat noin: A82846C = 6,6 min 30 A82846B = 8,9 min A82846A = 9,5 min.

(2) Käänteisfaasikolonni.

Kolonnikantomateriaali: Zorbax* ODS (4,6 x 150 mm) Järjestelmä: 35 gradienttieluutio 1 %:nen (NH4)H2P04 -liuos/CH CN, (95:5) -» (1:1) 20 minuutissa.

,0 93228

Virtausnopeus: 1,0 ml/min Detektio: UV, 225 nm Retentioajat: A82846A = 7,3 min 5 A82846C = 7,6 min A82846B = 8,0 min.

* Zorbax-kolonneja valmistaa E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898.

(d) A82846-antibioottien eristys 10 (1) A82846A:n ja A82846B:n eristys A. Rikastetun A82846A:n ja A82846B:n erottaminen Osassa (b) kuvatun mukaisesti valmistettua A82856:tta (30 g) liuotettiin veteen (500 ml) ja liuos panostettiin paineistettuun 30 litran ruostumattomasta teräksestä valmis- 15 tettuun kolonniin, joka oli pakattu 1 %:sella NH^HjPO^-liuok- sella tasapainotetulla LP-1/C^g-silikageelillä. Kolonnia eluoitiin käyttäen gradienttia 1 %:nen NH H PO -liuos (60 4 2 4 litraa) ------> 1 %:n NH^I^PO^iää sisältävä vesi/asetoni- triiliseos (88:12) (60 litraa) virtausnopeuden ollessa 250 - 2 20 300 ml/min (maksimipaine 42 kp/cm ), keräten 4 litran frak tioita ja seuraten eluution kulkua UV-detektorin avulla 254 nm:n aallonpituudella. Yksittäiset fraktiot analysoitiin käyttäen analyyttistä HPLC:ttä. Runsaasti A82856A:ta sisältävät fraktiot (n:ot 6-9) ja vastaavasti runsaasti 25 A82856B:tä sisältävät fraktiot (no:t 10 - 17) yhdistettiin ja konsentroitiin in vacuo.

B. A82846A:n puhdistus

Kahdesta 30 g:n ajoerästä suoritettuina kuten kuvattu osassa A saadusta runsaasti A82846A:ta sisältävästä kon-30 sentraatista poistettiin suolat 1 750 ml:n Diaion HP-20 SS-kolonnissa, jota pestiin vedellä ja eluoitiin 0,5 % etikka-happoa sisältävällä H20/iPr0H:11a (95:5) analysoiden fraktiot analyyttisellä HPLC:llä. A82856A:tta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmäkuivattiin, mikä 35 tuotti 7,4 g A82846A-rikasta valmistetta.

A82846A-pitoinen valmiste (7,2 g) liuotettiin veteen ja liuos panostettiin preparatiiviseen HPLC-kolonniin, jo- li 93228 1 1 ka oli pakattu LP-1/C^g-silikageelillä 1 %:sessa liuoksessa. Kolonnia eluoitiin käyttäen gradienttia 1 %:nen (NH4)H2P04~liuos ------> 1 %:nen (NH4)H2P04~liuos/asetoni- triili (9:1) ja seuraten eluution kulkua analyyttisen HPLC:n 5 avulla 254 nm:n aallonpituudella eluution virtausnopeuden ollessa 48 ml/min. Ensimmäisten 10 litran eluoiduttua kerättiin 500 ml:n fraktioita.

Yhdistettiin A82846A:ta sisältävät fraktiot (n:ot 4 -10) ja vastaavasti A82846B:tä sisältävät fraktiot (n:ot 12 -10 20) ja konsentroitiin in vacuo. Yhdistettiin 3 ajoerästä saadut A82846A-konsentraatit ja panostettiin ne 1 750 ml:n Diaion HP-20 SS-kolonniin suolojen poistamiseksi liuoksesta. Kolonnia pestiin vedellä ja A82846A eluoitiin käyttäen 0/5 % etikkahappoa H20/iPrOH:ta (95:5). Eluution kulkua tarkkail-15 tiin HPLC:n avulla. A82846A:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja kylmäkuivattiin, mikä tuotti 7,9 g puhdasta A82846A:ta.

C. A82846B:n puhdistus.

Osassa B kuvatun mukaisesti A82846A:n ja A82846B:n 20 erottamiseksi suoritetuista kolmesta preparatiivisesta HPLC-ajosta saadut A82846B-pitoiset fraktiot yhdistettiin ja panostettiin suolojen poistamiseksi 1 750 ml:n Diaion HP-20 SS-kolonniin, jota pestiin vedellä ja eluoitiin 0,5 % etikkahappoa sisältävällä H20/iPrOH:lla (95:5). Eluution kulkua 25 tarkkailtiin HPLC:n avulla, yhdistettiin A82846B:tä sisältävät fraktiot, konsentroitiin ne in vacuo, kylmäkuivattiin ja saatiin 8,8 g puhdasta A82846B:tä.

D. Suolojen poistaminen.

Suolojenpoisto voidaan suorittaa myös käyttäen Diaion 30 HP-20-hartsia, jota eluoidaan 0,1 % etikkahappoa sisältävällä MeOH/H20:11a (4:1).

(2) A82846C:n eristys A. A82846:n erottaminen.

Osassa (a)(1)(B) kuvatun mukaisesti suoritetuista nel-35 jästä 165 litran fermentaatiosta saadun fermentaatioliemeen (461 litraa) pH säädettiin 10,5:een NaOH-liuoksella 12 93228 ja suodatettiin liete käyttäen 3 % Hyflo Supercel-suodatus-apuainetta. Suodoksen (430 litraa) pH säädettiin 7:ään 5N HClrllä ja panostettiin se sitten 10 litraa Dowex-XFS-43278 (NH^ )-hartsia sisältävään kolonniin. Kolonnia pestiin 50 5 litralla vettä ja fiktiivinen aines eluoitiin 0,05N NH^OH-liuoksella (50 litraa) keräten 4 litran fraktioita. Eluu-tion kulkua seurattiin bioraäärityksen avulla. Aktiiviset fraktiot (n:ot 1 - 7) yhdistettiin, konsentroitiin in vacuo noin 1 700 ml:n tilavuuteen ja kylmäkuivattiin, mikä tuot-10 ti 283,9 g A82846-raakatuotetta.

B. A82846A:n, A82846B:n ja A82846C:n erottaminen.

Osassa A kuvatun mukaisesti saatua A82846-raakatuotet- ta (2 g) liuotettiin veteen ja panostettiin liuos 5 x 115 cm ruostumattomasta teräksestä valmistettuun preparatiivi-15 seen HPLC-kolonniin, joka oli pakattu 2 110 ml:11a LP-1/C^g-silikageelihartsia 1 %:sessa (NH^J^PO^-liuoksessa. Kolonnia eluoitiin käyttäen gradienttia 1 %:nen (NH^)H2PO^-liuos ---> ---> 1 %:nen (NH^)H2PO^-liuos/astonitriili (92:8) virtausnopeuden ollessa 70 ml/min, keräten 400 ml:n fraktioita ja 20 seuraten eluutiota UV:n avulla 254 nm:n aallonpituudella.

A82846A:ta sisältävät fraktiot (n:ot 11 - 14) yhdistettiin yhteisliuokseksi 1, A82846C:tä sisältävät fraktiot (n:ot 16 - 20) yhdistettiin yhteisliuokseksi 2 ja A82846B:tä sisältävät fraktiot (n:ot 21 - 25) yhdistettiin yhteis-25 liuokseksi 3.

C. A82846C:n puhdistus.

Yhteisliuos 2 konsentroitiin noin 200 ml:n tilavuuteen ja panostettiin 7 x 45 cm:n lasikolonniin, joka oli pakattu 1 800 ml:lla suoloja· poistavaa Diaion HP-20-hartsia. Aktii-30 vinen aines eluoitiin 0,1 % etikkahappoa sisältävällä

Me0H/H20:lla (4:1) keräten 1 litran fraktioita virtausnopeuden ollessa 25 ml/min. A82846C:tä sisältävät fraktiot (n:ot 9 - 12) yhdistettiin, konsentroitiin in vacuo ja kylmäkuivattiin, mikä tuotti 662,2 mg puolittain puhdistettua 35 A82846C:tä.

13 93228

Puolittain puhdistettua A82846C:tä (500 mg) puhdistettiin edelleen toistamalla käänteisfaasi-HPLC:n eri vaiheet käyttäen 2,5 x 120 cm:n ruostumattomasta teräksestä valmistettua kolonnia, joka oli pakattu 450 ml:11a LP-1/C^g-si-5 likageeliä ja jota eluoitiin käyttäen gradienttia 1 %:nen (NH^)i^PO^-liuos------> 1 %:nen (NH^)H2P04-liuos/asetoni- triili (92:8) virtausnopeuden ollessa 11 ml/min ja keräten 25 ml:n fraktioita, jotka analysoitiin 254 nm:n aallonpituudella A82846C:tä sisältävät fraktiot (n:ot 169 - 210) 10 yhdistettiin ja niistä poistettiin suolat HP-20-hartsilla pakatussa 5 x 45 cm:n lasikolonnissa. Kolonnia eluoitiin 0,1 % etikkahappoa sisältävällä Me0H/H20:lla (4:1) 100 ml:n fraktioita keräten ja seuraten eluution kulkua analyyttisen HPLC:n ja UV-absorbanssin 225 nm:n aallonpituuden avul-15 la. A82846C:tä sisältävät fraktiot (n:ot 5-11) yhdistettiin, konsentroitiin in vacuo, kylmäkuivattiin ja saatiin 127,3 mg A82846C:tä.

A82846A:ta sisältävää yhteisliuosta 1 ja A82846B:tä sisältävää yhteisliuosta 3 puhdistettiin samalla tavalla 20 kuin kuvattu A82846C:lle lisämäärän puhdasta A82846A:ta ja puhdasta A82846B:tä saamiseksi.

D. A82846C:n edelleenpuhdistus.

A82846C:tä (70 mg) puhdistettiin edelleen käyttäen seuraavaa preparatiivista kromatografiamenettelyä: 25 Kolonni: Zorbax SCX (9,2 x 250 mm), kationivaihtohartsi. Liikkuva faasi: lineaarinen gradientti lähtien liuoksesta 10 % MeOH:ta 0,15M Nafl^PO^-puskurissa ja päättäen liuokseen 10 % MeOH:ta 0,9M Nal^PO^-puskurissa + 5 min pysäytys (puskuria ei muuteta).

30 Virtausnopeus: 6,0 ml/min.

Detektio: UV, 280 nm.

Panostus: 6,0 mg:n injektio H20:ssa.

A82846C kerättiin käyttäen automaattista fraktionke-rääjää (Gilson 201C), joka oli varustettu huippujen detek-35 tiomekanismilla. Liikkuva faasi aikaansaatiin käyttäen

Millipore Waters M 600 - HPLC-gradienttijärjestelmää ja näy-teliuos ruiskutettiin käyttäen Hitachi-autoinjektoria.

,4 93228 A82846C:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin 30 ml:n tilavuuteen ja panostettiin HP-20-kolon-niin (50 ml). Kolonnia pestiin H20:lla ja eluoitiin 0,5 % etikkahappoa sisältävällä I^O/isopropanolilla (95:5) 25 5 ml:n fraktioita keräten. A82846C:tä sisältävät fraktiot (n:ot 9 - 14) yhdistettiin, konsentroitiin, kylmäkuivattiin ja saatiin 37 mg puhdasta A82846C:tä.

(e) A82846-antibioottien ominaisuudet

(1) A82846A

10 Molekyylipaino: 1 556.

Empiirinen kaava: C73H89N10 °26C1* FAB-ms (tioglyseroli): (M+1) todettu: 1557,5803, laskennallinen: C73H90N1 0^26C1- = "*^57, 5716.

15 UV (Ho0) λ : 281 nm (£ 5,052), siirtyy emäksellä 300 nm:ään. 2 mdx IR (KBr): 1716, 1655, 1611, 1586, 1552, 1504, 1410, 1340, 1310, 1230, 1212, 1132, 1066, 1028 ja 1015 cm"1 pKa (HjO): 4,7, 9,5.

20 (66 % DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3.

(näennäinen mp. = 1542)

(2) A82846B

Molekyylipaino: 1 590.

Empiirinen kaava: C73Hg3Nio°26C1'2* 25 FAB-ms (tioglyseroli): (M+1) todettu: 1591,5315; laskennallinen: C73HQ9Nio°26('1'2:1‘1'e = 1591, 5327.

UV (H_) Λ : 280 nm (£5,192); siirtyy emäksellä 300 nm:ään.

2 max IR (KBr): 30 1656, 1586, 1562, 1504, 1403, 1264, 1230, 1135, 1105, 1065, 1023 ja 1018 cm 1. pKa (H20): 4,65, 9,5.

(3) A82846C.

Molekyylipaino: 1 522.

35 Empiirinen kaava: C73H90N10°26' il is 93228 FAB-ms (tioglyseroli): (M+Na) todettu: 1545,5998; laskennallinen: C^2HgoN10°26Na:= 1545,5925.

UV (H00)Λ : 280 nm (85,198); siirtyy emäksellä 3 nm:ään.

6 ItlclX

5 IR (KBr): 3600—>3004 (leveä), 2999, 2991 , 2950, 1687—>1650 (leveä), 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449, 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 ja 1014 cm"1.

(4) Muut ominaisuudet 10 Hydrolyysin 6N HCl:llä jälkeisestä A82846A:n, A82846B:n ja A82846C:n aminohappoanalyysistä ilmeni aspara-giinihapon läsnäolo sekä kaksi leveää piikkiä glysiinijäämien ohella. Kyseiset kaksi piikkiä vastaavat ilmeisesti aktinoidiniini- ja vankomysiniiniaminohappoja, joista kum-15 paakin sisältyy vankomysUniryhmän glykopeptideihin.

Vertailevat nmr-tutkimukset viittaavat siihen, että A82846A, A82846B ja A82846C kukin sisältävät uutta amino-sokeria, 4-epi-vankosamiinia (3-metyyliakosamiini). A82846A:n molekyylikaava vastaa vankomysiiniä 20 ^66H75N9°25C1'2^ ' ^osta on vähennetty yksi klooriatomi ja johon on lisätty ylimääräisen vankosamiinityyppisen amino-sokerin (C^H^NC^) mukanaan tuomat alkuaineet. A82846B:n molekyyl-kaava vastaa A82846A:ta, jossa yhden vetyatomin on korvannut klooriatomi. A82846C:n molekyylikaava vastaa 25 A82846A:ta, jossa klooriatomin on korvannut vetyatomi. Tä ten A82846-antibiootit näyttävät muodostavan uuden glyko-peptidiluokan, jonka jäsenmolekyylit yleisen koostumuksensa osalta selvästi muistuttavat vankomysiinimolekyyliä eroten tästä pääasiassa klooripitoisuuden osalta sekä ylimää-30 räisen vankosamiinikoostumuksen omaavan alayksikön osalta.

(f) A82846-antibioottien bakteerinvastainen aktiivisuus A82846-antibioottien on osoitettu omaavan in vivo mikrobivastaista aktiivisuutta laboratorioeläimissä ko-35 keellisesti aikaansaatuja tulehduksia vastaan. Annettaessa kaksi annosta testiyhdistettä testiorganismilla kokeelli- ie 93228 sesti tartutetuille hiirille mitattiin todettu aktiivisuus ED^Q-arvona (tehokas annos mg/kg suojaamaan 50 % koe-eläi-mistä: katso Warren Wick et. a. J. Bacteriol. 81 (1961) 233-235). Esimerkkiydisteillä todetut ED^-arvot on esitetty 5 taulukossa II:

Taulukko II: A82846-antibioottien aktiivisuus in-vivo

9 J

ED,, q-arvo

Yhdiste Staphylo- Strepto- Streptococcus coccus coccus aureus pyogenes pneumoniae A82846A 0,19 0,19 0,17 A82846B 0,19 0,20 0,18 15 A82846C 2,18 2,71 5,87

Vankomysiini 1,3 0,72 1,52 mg/kg x 2; annokset annettiin hiirille ihonalaisesti 1 ja 4 tunnin kuluttua tartutuksesta.

20

Esimerkki 1

Vankomysiinikokoliemen adsorptio

Lisättiin regeneroitua Dow XFS-43278.00-hartsia (1 litra) vankomysiinikokoliemeen, joka sisälsi 45,4 g aktii-25 visuutta. Kuuden tunnin sekoituksen huoneen lämpötilassa jälkeen liemi erotettiin hartsista 100 mesh-seulalla. Käytetty liemi analysoitiin hävikkiaktiivisuuden suhteen ja heitettiin pois.

Panostettua hartsia pestiin puhtaalla vedellä ja 30 eluoitiin sitten eräeluutiona säätämällä hartsiliemen pH 10,5:een NaOH-liuoksella ja sekoittamalla kahden tunnin ajan pitäen samalla hartsilietteen pH 10,5:ssä. Eluoitu hartsi erotettiin sitten eluaatista vakuumisuodatuksella ja pestiin se puhtaalla vedellä. Kerätty eluaatti ja pesu-35 erät yhdistettiin, säädettiin pH 3,1:een suolahapolla liuoksen stabiloimiseksi ja analysoitiin. Suoritettujen analyysien mukaan aktiivisuudesta saatiin talteen 37,1 g.

• ,7 93228

Eluoitu hartsi regeneroitiin liettämällä sitä 20 minuutin ajan vesiliuoksessa, jonka pH oli säädetty 2,0:aan suolahapolla, pesemällä puhtaalla vedellä happoylimäärän poistamiseksi, sekoittamalla edelleen 20 minuutin ajan 5 NaCl-liuoksessa hartsin muuttamiseksi sen Na+-muotoon ja huuhtomalla sitten puhtaalla vedellä mahdollisen suolaliuos-ylimäärän poistamiseksi.

Vastoin kuin edellä käytettäessä sama määrä koko-lientä ja pH säädöistä ja suodatuksista koostuvaa alan par-10 haan aiemman taitamuksen mukaista talteenottomenettelyä voitaisiin hartsieluaatista odottaa saatavan vain 23,2 g vankomysiiniaktiivisuutta.

Esimerkki 2 M43A-kokoiiemen adsorptio 15 M43A-antibioottia tuotetaan US-patentin no. 4 548 925, esimerkki 2, mukaisella menettelyllä lukuunottamatta, että osassa B jätetään pois vaihe 1) kokoliemen suodatus ja vaihe 2) suodoksen käsittely kationivaihtohartsilla. Tämän asemasta kokoliemeen lisätään Dow XSF-43278.00-hartsia, 20 seosta sekoitetaan 6 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja liemi erotetaan hartsista seulan avulla. Panostettua hartsia käsitellään kuten esimerkissä 1 M43A:n talteenottamiseksi.

M43A:n puhdistus suoritetaan kuten kuvattu US-paten-tissa no. 4 548 925, esimerkki 2, osa C.

25 Esimerkki 3

Aktaplaniinikokoliemen adsorptio

Aktaplaniini tuotetaan kuten kuvattu US-patentissa no. 4 322 406, esimerkki 1, lukuunottamatta, että eristys-vaiheessa osassa C jätetään pois vaihe 1) suodatusapuai-30 neen lisäys, vaihe 2) täyslietteen suodatus, vaihe 3) suodoskakun uudelleensuspendointi veteen, vaihe 4) vesi-suspension pH;n säätäminen 10,5:een ja vaihe 5) suodatus. Tämän asemasta kokoliemeen lisätään Diaion SK-102:ta ja käytetään esimerkin 1 menettelyitä aktaplaniinikomplek-35 sin talteenottamiseksi. Aktaplaniinitekijät , B2, B^, C^a, ja E.j eristetään kuten kuvattu patentin esimerkissä 1 osissa D ja F.

ie 93228

Esimerkki 4

Teikoplaniinikokoliemen adsorptio

Teikoplaniini tuotetaan kuten kuvattu US-patentissa no. 4 239 751 (palstat 4-6) lukuunottamatta, että seu-5 raavat vaiheet jätetään pois: lietteen suodatus, suodatetun kasvalustan pH-säätö, kasvualustan uuttaminen butaanilla, myseelikakun pesu vedellä pH:ssa 3,5, sen kuivatus vakuu-missa, sen uuttaminen asetonin vesiliuoksella, asetoni-uutteen konsentrointi, sen pH-säätö ja sen uuttaminen 10 butanolilla. Tämän asemasta käytetään esimerkin 1 menettelyitä teikoplaniinikompleksin talteenottamiseksi.

Esimerkki 5 A8246-kokoliemen adsorptio A82846-antibiootti valmistetaan kuten on kuvattu valmis-15 tuksessa 1, osat (a)(3) ja (b) lukuunottamatta, että osassa (b) käytetään esimerkin 1 menettelyitä ja seuraavat vaiheet jätetään pois: pH:n säätö, suodatusapuaineen lisäys, seoksen suodatus suodatuspuristimella, puristimen pesu vedellä ja yhdistetyn suodospesuliuoksen pH-säätö.

li

Claims (5)

19 93228

1. Menetelmä vankomysiinityyppisen glykopeptidian-tibiootin talteenottamiseksi, tunnettu siitä, 5 että l) antibiootti adsorboidaan fermentaatiokasvualus-tasta vain vähän ristisidoksia sisältävään sulfonoituun polystyreenidivinyylibentseenihartsiin ilman pH-säätöä ja ilman suodatusta, 2) hartsi erotetaan kasvualustasta ja 3. antibiootti eluoidaan hartsista vesiliuoksella, jonka 10 pH-arvo on 9 - 12.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsi sekoitetaan fermen-taatiokasvualustaan lisäämällä hartsi kasvualustaan erä-panostuksena.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti on vankomysiini.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti on Ά82846.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että antibiootti on M43A, akta- planiini tai teikomysiini. 93228