HU199873B

HU199873B - Process for separating glycopeptides

Info

Publication number: HU199873B
Application number: HU88931A
Authority: HU
Inventors: Suzanne L Glass; Charles W Johnson; John L Spencer
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1990-03-28
Also published as: EP0280570A2; HUT46338A; ES2085260T3; CA1338002C; FI93228B; CN88101111A; IL85557A; US4845194A; KR880009990A; DE3855145D1; IE71520B1; EP0280570B1; FI880889A0; CN1032426C; GR3019978T3; JP2659388B2; DE3855145T2; JPS63237794A; ATE136037T1; FI93228C

Description

A találmány tárgya új eljárás vankomicin típusú antibiotikumok kinyerésére. A vankomicin típusú glikopeptidek az antibiotikumok értékes csoportját képezik. A vankomicin, ez a keresett antibiotikum az ötvenes évek végétől kezdve kereskedelmileg beszerezhető. A vankomicin típusú antibiotikumok közül példaként említhető antibiotikumok: a vankomicin (3.067.099. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az M43A (4.548.925. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az M43D (4.547.488. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az M43B és M43C (4.548.924. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) az A82846A, A82846B és az A82846C (0265071. számú európai nyílvánosságrahozatali irat), a risztocetin (2.990.329. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), a risztocetin A pszeudoaglikon (Williams és munkatársai, J. C. S. Chem. Comm. 1979, 906-908), az A41030 A-G faktorok (4.537.770. sz. Amerikai Egyesült államok-beli szabadalmi leírás), az A47934 (4.462.942. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az A355512B. pszeudoaglikon (4.029.769. sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, ebben A35512B ágiikon elnevezéssel szerepel, de itt A35512B pszeudoaglikonként említjük, minthogy az aminocukor megmarad); az aktaplanin (A —4696) A és B faktor (4.115.552. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az aktaplanin Bj, B₂, B₃, Ci_a, C₃ és Ej faktorok (4.322.406. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az aktaplanin G faktor (4.461.723. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az aktaplanin K —O faktorok (4.479.897. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az aktaplanin pszeudoaglikon (4.322.343. sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás), a teikomicin (teikoplamin) Aj, A₂ és A₃ faktorok (4.239.751. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), a teikomicin A₂ 1 — 5 faktorok (4.542.018. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), az L17054 (4.594.187. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), és az L17046 (119.574-A. számú európai szabadalmi leírás).

Az egyszerűség szempontjából a vegyületeknek ezt a csoportját a továbbiakban vankomicin típusú antibiotikumoknak nevezzük.

A vankomicin tí, usú antibiotikumok terápiás céllal használhatók elsősorban a gram-pozitív baktériumokkal szemben. Ugyancsak felhasználhatjuk őket állati növekedésserkentőkként is.

Általában az antibiotikumoknak a fermentléből való kinyerésénél akkor maximális a kinyert anyag mennyisége, ha a folyamat lépéseinek száma minimális. Különösen nehéz a maximális kinyerés nagy térfogatú fermentációnál. Nagyméretű fermentáción azt értjük, ha a fermentáció legalább 4000 literes fermentorban történik. Ilyen esetben az antibiotikumot nagy mennyiségű, összetett vizes fermentléből kell kinyerni. A fermentlé, melyben az antibiotikum termelődött, nemcsak az antibiotikumot tartalmazza, hanem az el nem reagált tápkomponensek, más anyagcsere köztitermékek és a termékek oldatában szuszpendált szilárd micéliumot is. Az antibiotikum elválasztása ezért rendszerint nehéz és számos elválasztási, betöményítési, tisztítási lépésből áll.

A legtöbb esetben a fermentlében termelődő antibiotikum kinyerésének első lépése, hogy szűrést elősegítő anyagot, például Hyflo Supercelt adnak a fermentléhez. Ennek célja, hogy a micéliumot hatékonyabban választhassák el. Nagy mértékben végzett fermentálásnál nagy mennyiségű szűrési segédanyagra van szükség. Minthogy ezek a segédanyagok biológiailag nem könnyen bonthatók le, a nagy mennyiségben történő alkalmazásuk súlyos hulladékmegsemmisítési problémákat okoz.

A micélium eltávolítása után az antibiotikum kinyerésének következő lépése gyakran abból áll, hogy a leszűrt fermentlé kémhatását megfelelő pH értékre állítják be. A lépéshez szükséges nagy mennyiségű sav vagy bázis biztonsági és kezelési gondokat okoz, és növeli a feldolgozandó oldat térfogatát.

Az eddigi eljárásoknál a vankomicin előállításához a fermentlevet pH= 8 — 10 kémhatásnál leszűrték, a szűrlet kémhatását pH = 6,7 értékre állították be, majd a szűrletet ioncserélő gyantán, tipikusan alacsony térhálósítási fokú polisztirol-divinil-benzol-nátrium kationcserélő gyantán engedték át. A vankomicin adszorbeálódik a gyantán. Miután a fermentlevet átvezették, a gyantát vízzel mosták, és a vankomicint pH = 9-11 kémhatású vizes lúgos oldattal eluálták. Az elucióhoz általában pH = 10—11 kémhatású vizes nátrium-hidroxid-oldatot használtak. A vankomicint tartalmazó lúgos eluátumot semlegesítették, és az antibiotikumot tovább tisztították, újból megkötve a vankomicint egy nemfunkcionális gyantán (lásd 4.440.753. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás).

A találmány javított eljárása a következő lépésekből áll:

1) Az antibiotikumot tartalmazó teljes fermentlevet 2% vagy annál kisebb mértékben térhálósított mikroporózus szulfonált polisztiroldivinil-benzol gyantával, például Dow XFS— 43278.00 gyantával keverjük össze;

2) elválasztjuk a gyantát a közegtől;

3) leoldjuk az antibiotikumot a gyantáról.

Az eljárás egyik előnye, hogy közvetlenül használjuk fel a teljes fermentlevet anélkül, hogy a kémhatást beállítanánk és/vagy szűrnénk. így csökken az a veszteség, mely abból adódik, hogy az antibiotikum egy része a micéliumon adszorbeálódik. Elkerülünk továbbá bizonyos hulladékmegsemmisítő problémákat is, minthogy nem használunk szűrési segédanyagokat és nem történik pH-beállítás. A gyantát az eljárás után regeneráljuk, és így visszavezethető a folyamatba, és így csak a micéliumot kell deponálni.

Az eljárás lényeges tényezője a speciális típusú ioncserélő gyanta. Ezt a gyantát, mely a sztirol és a divinil-benzol szulfonált kopolimerje, poli-21

HU 199873 Β sztirol-divinil-benzol gyantának hívjuk. A gyanta mikropórusos, alacsony térhálósítási fokú (névlegesen 2%-os), erősen savas kationcserélő gyanta, mely rendszerint só, például nátriumsó alakjában van. Az eljárásban alkalmazható gyanta például a Dow XFS-43278.00 (Dos Chemical Industries, Ltd., Tokió, Japán). Felismertük, hogy ezek a gyanták felhasználhatók a vankomicin típusú glikopeptid antibiotikumok megkötésére anélkül, hogy fermentlevet előzőleg le kellene szűrni.

A felhasznált gyanta mennyisége a fermentlé térfogatától és a termelődött antibiotikum mennyiségétől függően változik. Vagy a gyantát adjuk a teljes fermentléhez, vagy a teljes fermentlevet adjuk a gyantához, majd annyi ideig kevertetjük a gyantát a fermentlével, hogy az antibiotikum adszorbeálódjon a gyantán.

Az antibiotikum adszorbeálódásához szükséges idő változó. Befolyásolja ezt például a fermentlé hőmérséklete. Előnyösen a fermentlevet 30 ’C-ról 60 ’C-ra emelve, csökken az ehhez szükséges idő, ugyanakkor csökken a viszkozitása, és ezáltal könnyebben kezelhető is. A szükséges idő általában maximum hat óra.

Az antibiotikum megkötését követően a fermentációs közeget ismert eljárásokkal elválaszthatjuk a gyantától; például szűréssel, amikor szakaszosan keverjük a gyantát a fermentlével, vagy mechanikai elválasztással, amikor a fermentlevet ráfolyatjuk a gyantára.

Az antibiotikumot ismert módon oldhatjuk le a gyantáról. Különösen előnyös eljárás, amikor

1) vízzel mossuk a gyantát; 2) a gyantát pH = 9—10 kémhatású vízben kevertetjük, amíg az antibiotikum le nem oldódik; 3) elválasztjuk a gyantát az antibiotikumot tartalmazó eluátum tói. Az eljárás 2) lépését előnyös pH= 10—11 kémhatásnál végezni.

Az antibiotikumnak az eluátumból történő kinyerését és adott esetben a további tisztítását az ismert eljárások szerint végezhetjük. így például az oldott antibiotikumot tovább tisztíthatjuk oly módon, hogy a fentiek szerint nem-ioncserélő gyantán adszorbeáljuk. Egy másik eljárás szerint az antibiotikumot oldhatatlan rézkomplexként választjuk el. A rézkomplexet savas körülmények között hidrogén-szulfiddal reagáltatva az antibiotikum oldatba megy, és szabad bázisként elválasztható az oldat kémhatásának kellő értékre való beállításával.

A szabad bázist készítményként dolgozhatjuk szájon át történő bevitelhez, vagy megfelelő savaddíciós sóvá, például hidrokloriddá vagy foszfáttá alakíthatjuk a szájon keresztüli vagy parenterális bevitelhez.

Noha a találmány szerinti eljárás a vankomicin típusú antibiotikumok bármelyik tagjánál előnyösen alkalmazható, különösen alkalmas a fermentációval előállított vankomicin, M43A, M43B, M43C, M43D, A82846A, A8284ÓB, risztocetin, A41030 A-G faktor, A47934, A35512 A—D foktorok, A355512 H faktor, aktaplanin A, B], B₂, Bj, Cj,, Cj, Ei, G és H faktorok, teikomicin Αχ, tcikomicin Aj 1-5 faktorok és teikomicin Aj antibiotikumok esretében. Az eljárás különösen alkalmas a vankomicin kinyerésére, minthogy kereskedelmi haszna miatt gyakran nagyon nagy mértékben állítják elő.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. (referencia) példa

Az A82846 antibiotikum termeléséhez a fogyasztva szárított pelletként vagy folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárolt Nocardia orientalis NRRL 18099 mikroorganizmust ráoltjuk az alábbi összetételű táptalajra: alkotórész_mennyiség (%) glükóz 1,0 oldható keményítő 2,0 élesztőkivonat 0,5 enzimmel hidrolizált kazein 0,5 kálcium-karbonát 0,1 ionmentes vízzel feltöltve 1 literre *NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwichn NY, USA.

Sterilizálás előtt a kémhatást pH = 7,5 értékre állítjuk be. A ferdeagar vagy lemez elkészítéséhez 2,5% agart adunk a tápközeghez. A beoltott ferdeagart 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 10-14 napon keresztül. A kinőtt tenyészetet steril eszközzel lekaparjuk. A spórákból és széttöredezett micéliumból álló anyag egynegyedével oltunk be egy 50 milliliter térfogatú első lépésű táptalajt.

A beoltott táptalajt 250 milliliteres Erlenmeyer lombikban rázatjuk 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen percenként 250 fordulatszámmal, 30 ’C hőmérsékleten 24 — 48 órán keresztül.

Az így kapott első lépésű tenyészet 0,5 milliliterével oltjuk be a 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban levő 50 ml termelő táptalajt, mely az alábbi összetételű:

alkotórész_mennyiség (%)

glükóz	2,50
szójaliszt	1,50
burgonyadextrin	3,00
kálcium-karbonát	0,25
melasz	0,30
savhidrolizált kazein*	0,5
ionmentes vízzel
feltöltve	1 literre

Sterilezés előtt a táptalaj kémhatását nátrium-hidroxiddal pH = 7,5 értékre állítjuk be.

*Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

A beoltott táptalajt 30 ’C hőmérsékleten rázatjuk 4—5 napon át percenként 250 fordulatszámnál egy 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen.

Tankfermentációhoz nagyobb térfogatú oltóanyagra van szükség. 10 ml első lépésű tenyészetet használunk 400 ml második lépésű táptalaj beoltásához, melynek összetétele azonos az első lépésű táptalajéval. A második lépésű vegetatív tenyészetet egy kétliteres széles szájú Erlen-31

HU 199873 Β meyer lombikban készítjük, 48 órán át 30 ’C hőmérsékleten rázatva egy 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen percenként 250 fordulatszám mellett.

1000 ml második lépésű vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril termelő táptalajt, melynek összetétele azonos az előzőekben ismertetett termelő táptalajéval, azzal a különbséggel, hogy literenként 0,3 g P-2000 habzásgátlöt is adunk hozzá. A beoltott táptalajt egy 165 literes kevert tankfermentorban fermentáljuk 90-100 órán át 30 ’C hőmérsékleten. A percenként 80 fordulatszámmal kevert tenyészet levegőztetését úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a levegőtelítettség 50%-a felett legyen.

A tenkfermentálást elvégezhetjük úgy is, hogy megfelelő mennyiségű vegetatív tenyészettel egy 4536 literes (1600 gallon) tankfermentorban levő 3400 (1200 gallon) termelő táptalajt oltunk be.

Az A82846 antibiotikum előállításához használhatunk Nocardia orientalis NRRL 18099 termelő törzset is. A fagyasztva szárított pelletként vagy folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárói törzset az előbbiek szerint tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy a termelő táptalaj ez esetben az alábbi:

alkotórész_mennyiség (%)

glükóz	1,0
burgonyadextrin	2,0
pepton (Bactopepton;
Difco Láb.)	1,0
kálcium-karbonát	0,2
melasz	2,0
ionmentes vízzel
feltöltve	1 literre
pH beállítás nem szükséges.

A82286 antibiotikumot Nocardia orientalis NRRL 18100 törzzsel is előállíthatunk. A fagyasztva szárított pelletként vagy a folyékony nitrogén alatt tartott szuszpenzióként tárolt törzszsel ugyan úgy járunk el, mint a Nocardia orientalis NRRL 18098 törzs esetében leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a savhidrolizált kazeinként Amicase készítményt (Sheffield Chemical Co.) használunk.

A 4536 literes nagy térfogatú fermentálásokból származó 4200 liter tenyészlé kémhatását 5 n nátrium-hidroxiddal pH= 10,5 értékre állítjuk be, és a 3%-nak megfelelő mennyiségű Celite 545 szűrési segédanyagot adunk hozzá. A keveréket présszűrőn szűrjük, a kiszűrt anyagot vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóvizet egyesítjük, a 4200 liter oldat kémhatását 5 n sósavval vagy kénsawal pH= 7 értékre állítjuk be, és NH⁺4 formában levő Dow XFS—43278 gyantaoszlopra visszük 200 liter szűrletre 10 liter gyantát számolva. Az oszlopot 7S0 ml/perc áramlási sebesség mellett eluáljuk. A frakciókat biológiai módszerrel - tesztorganizmusként Bacillus substilist használva — vagy HPLC-vel vizsgáljuk.

Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi vízzel mossuk, 100 literes frakciókat gyűjtve.

Az aktív anyagot 5 oszloptérfogatnyi 0,05 n ammónium-hidroxiddal oldjuk le a gyantáról 25 literes frakciókat gyűjtve. Az A82846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldat térfogatát csökkentett nyomáson 30 liter körülire töményítjük. Ezt az oldatot vízágyban levő 10 liter Diaion HP —20 gyantából készült oszlopra visszük. Az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi vízzel mossuk 300 ml/perc áramlási sebesség mellett. A mosóvizet eldobjuk. Az aktív anyagot 1,0% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohol, 95:5 elegyével oldjuk le a gyantáról 100 ml/perc áramlási sebesség mellett. A 4 literes frakciókat biológiai módszerrel vagy HPLC-vel vizsgáljuk. Az A82846 antibiotikumot tartalmazó frakciókat (6—14. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson betöményitjük és fagyasztva szárítjuk, 356 g nyers A82846 antibiotikumot nyerve.

Az A82846 komponensek analitikai vizsgálatára kétféle HPLC rendszert használhatunk:

A) Kationcserélő gyantaoszlop: oszloptöltet: Zorbax SCX (E. J. du Pont de Nemours et Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898, USA); 4,6x150 mm oszlopméret; eluens: grádiens elució; 5 perc alatt A:B, 4:1 elegyből A:B, 1:9 elegybe áttérve, majd ezt tartva 15 percen át.

A oldat = metanol/Ο,ΙΜ nátrium-dihidrogénfoszfát, 1:9;

B oldat = metanol/0,9M nátrium-dihidrogénfoszfát,

1:9 áramlási sebesség: 1,0 ml/perc;

detektálás: 225 nm.

A retenciós idők függnek a koncentrációktól, de általában az alábbiak:

A82846C = 6,6 perc A82846B = 8,9 perc A82846A = 9,5 perc.

b) Fordított fázisú oszlopon: oszloptöltet: Zorbax ODS (EJ. du Pont de Nemours et Co., Inc., Wilmington, Delaware 19898, USA); 4,6x150 mm oszlopméret; eluens: grádiens elució; 1% ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril 95:5 arányú elegyet elegyet 20 perc alatt 1:1 arányú elegyre változtatjuk;

áramlási sebesség: 1,0 ml/perc;

detektálás: 225 nm;

retenciós idők: A82846A= 7,3 perc

A82846C- 7,6 perc A82846B= 8,0 perc.

Az alábbiakban ismertetjük az A82846 komponensek elválasztását és tisztítását.

a) Az A82846A és az A82846B komponensek kinyeréséhez 30 g, a fentiekben ismertetett módon nyert nyers A82846 antibiotikumot 500 ml vízben oldunk, és egy 30 literes rozsdamentes acélhengerbe töltött LP-l/Qg szilikagél oszlopra visszük, melyet 1%-os ammónium-dihidro· gén-foszfáttal egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot gradiens elucióval eluáljuk 60 liter 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáthoz 60 liter 1% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó víz/acetonitril, 88:12 elegyet vezetve. Az áramlási sebesség 250 - 300 ml/perc; maximális nyomás 600 psi. 4 literes frakciókat gyűjtünk, az eluálást 254 nm-en detektálva. Az egyes frakciókat analitikai

HU 199873 Β

HPLC-vel vizsgáljuk meg. Az A82846A komponensben (6-9. frakció) és az A82846B komponensben (10-17. frakció) gazdag frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson betöményítjük.

Az A82846A-t tartalmazó betöményített oldatot, melyet a fentiek szerint kétszer 30 g nyers A82846-ból nyertünk 1750 ml-es Diaion HP— 20SS oszlopon sótalanitjuk oly módon, hogy az oszlopot először vízzel mossuk, majd 0,5% ecetsavat tartalmazó vfz/izopropilalkohol, 95:5 elegygyel eluáljuk. A frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk. Az A82846A komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, betöményítjük és fagyasztva szárítjuk, 7,4 g A82846A komponensben gazdag preparátumhoz jutva. 7,2 g ilyen preparátumot Vízben oldunk, és preparativ LP — l/Cjg szilikagél oszlopra viszünk, melyet 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatban készítünk el. Az oszlopot grádiens elúcióval eluáljuk 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatból kiindulva, és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát oldatból kiindulva, és 1% ammónium-dihidrogénfoszfát oldat/acetonitril, 9:1 eleggyel befejezve. Az áramlási sebesség 48 ml/perc. A detektálást analitikai HPLC-vel végezzük 254 nm-nél.

Az A82846A komponenst (4-10. frakció) és az A82846B komponenst (12—20. frakció( tartalmazó frakciókat külön-külön egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Három kromatografálásból származó egyesített A82846A koncentrátumot 1750 ml-es Diaion HP —20SS oszlopra víve sótalanitjuk oly módon, hogy az oszlopot vízzel mossuk, majd az A82846A komponenst 0,5% ecetsavat tartalmazó víz/izopropilalkohollal, 95:5 eleggyel eluáljuk. Az A82846A komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, fagyasztva szárítjuk, 7,9 g tisztított A82846A antibiotikumot kapva.

Az előzőek szerint kapott A82846B komponensben gazdag preparátumot 1750 ml-es diaion HP-20SS oszlopon sótalanitjuk, először vízzel mosva az oszlopot, majd 0,5% ecetsavat tartalmazó vfz/izopropilalkohol, 95:5 eluenssel eluálva. Az elúciót HPLC-vel követjük nyomon, az A82846B komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk. 8,8 g tisztított A82846B komponenst kapunk.

A sótalanítást végezhetjük Diaion HP —20 gyantán is, eluensként 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 elegyet használva.

Az A82846C faktor kinyeréséhez 461 liter fermentléből indulunk ki, amit négy 165 literes fermentálásból kapunk az előzőekben elmondottak szerint. A fermentlé kémhatását 5n nátriumhidroxid-oldattal pH = 10,5 értékre állítjuk be, és 3% Hyflo Supercel szűrési segédanyagot hozzáadva szűrjük. A 430 liter szűrlet kémhatását 5n sósavval pH * 7 értékre beállítva, az oldatot 10 liter Dowex XFS-43278, NH⁺4 formában levő gyantából készített oszlopra visszük. Az oszlopot 50 liter vízzel mossuk, az aktív anyagot 50 liter 0,05n ammónium-hidroxiddal eluáljuk, 4 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót biológiai módszerrel követjük nyomon. Az aktív frakciókat (1 — 7. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson 1700 ml térfogatra töményftjük és fagyasztva szárítjuk, 283,9 g nyers A82846 antibiotikumot nyerve.

g nyers A82846 antibiotikumot vízben oldunk és egy 5,08x103,3 cm (2” x 45”) méretű rozsdamentes acélköpenyű preparativ HPLC oszlopra visszük, melynek töltete 2110 ml LP- 1/C₁₈ szilikagélből készült 1%-os ammóniumdihidrogén-foszfátban. Az oszlopot grádiens eluciónak vetjük alá 1%-os ammónium-dihidrogénfoszfát oldattal kezelve és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfátoldat/acetonitril, 92:8 eleggyel befejezve. Áramlási sebesség percenként 70 ml. 400 ml-es frakciókat gyűjtünk az elúciót 254 nmen nyomonkövetve.

Külön-külön összegyűjtjük az A82846A (11— 14. frakciók), az A82846C (16-20. frakciók) és az A82846B komponenst (21—25. frakciók) tartalmazó frakciókat.

Az A82846C komponenst tartalmazó egyesített frakciókat 200 ml térfogatra pároljuk, és egy 7x45 cm-es üvegcsőben 1800 ml Diaion HP—20 gyantából készített oszlopra visszük sótalanitás céljából. Az aktfv anyagot 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk 25 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az A82846C komponenst tartalmazó frakciókat (9—12. frakciók) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 662,2 mg félig tisztított A82846C antibiotikumot nyerve. Ebből 500 mg-t tovább tisztítunk fordított fázisú HPLC-vel, 2,5x122 cm (1” x 48”) acéloszlopra töltölt 450 ml LP — l/C^g szilikagél tölteten. Az eluálást grádiens elúcióval végezzük 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfáttal indulva és 1%-os ammónium-dihidrogén-foszfát/acetonitril, 92:8 eleggyel befejezve. Az áramlási sebesség percenként 11 ml. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk, az elúciót 254 nm-en detektáljuk. Az A82846C komponenst tartalmazó frakciókat (169 — 210. frakciók) egyesítjük, 5x45 cm-es üvegcsőben elkészített HP—20 gyantaoszlopon sótalanitjuk. Az oszlopot 0,1% ecetsavat tartalmazó metanol/víz, 4:1 eleggyel eluáljuk, 100 mles frakciókat gyűjtve. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon, 225 nm-en detektálva. Az A82846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat (5 — 11. frakció) egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és fagyasztva szárítjuk, 127,3 mg A82846C antibiotikumot nyerve.

mg A82846C antibiotikumot preparativ kromatográfiával tovább tisztítunk az alábbi kromatográfiás rendszert használva:

oszlop: Zorbax SCX, kationcserélő; 9,2x250 mm; mozgófázis: lineáris grádiens: 10% metanolt tartalmazó 0,15M nátrium-dihidrogén-foszfát pufferról 6 perc alatt átváltva 10% metanolt tartalmazó 0,9M nátrium-dihidrogén-foszfátra, majd ezzel eluálva további 5 percen át (a puffer kémhatását nem állítjuk be);

áramlási sebesség: 280 nm-en;

felvitt anyag: egy injektálásnál 6,0 mg vízben oldott anyag.

HU 199873 Β

Az A82846C antibiotikumot tartalmazó frakciókat Gilson 201C automata frakciógyűjtővel gyűjtjük össze. A gradienst Millipore Waters M600 Gradient HPLC rendszerrel hozzuk létre, az injektáláshoz Hitachi automata mintavevőt 5 használunk.

Az A82846C komponenst tartalmazó egyesített frakciókat 30 ml térfogatra pároljuk, és 50 ml HP-20 gyantával készített oszlopra visszük.

Az oszlopot vízzel mossuk, és 0,5% eeetsavat tartalmazó víz/izonropanol, 95:5 eleggyel eluáljuk, 25 ml-es frakciókat gyűjtve. Az A82846C komponenst tartalmazó frakciókat (9-14. frakciók) egyesítjük, betöményítjük és fagyasztva szárítjuk, 37 mg tisztított A82846C antibio- 13 tikumhoz jutva.

Az egyes A82846 komponensek jellemző adatai:

1) A82846A molekulasúly: 1556 20 tapasztalati képlet: C7₃Hg9N₁₀O26Cl FAB-tömegspektrum (tioglicerin), (M +1) mért: 1557,5803, számított: 1557,5716

UV (víz) A_max— 281 nm (e- 5052); bázissal eltolódik 300 nm-re. 25

IR (KBr): 1716,1655,1611, 1586,1552,1504,

1410,1340,1310,1230,1212,1132,1066, 1028 és 1015 cm'¹.

pKa (víz) = 4,7 és 9,5.

(66% dimetil-formamid) - 5,5; 6,8; 7,9; 9,4; 30

12,3.

(látszólagos mólsúly: 1542)..

2) A82846B molekulasúly: 1590 tapasztalati képlet: C73HggN₁₀O26Cl₂ 35

FAB-tömegspektrum (tioglicerin), (M +1) mért: 1591,5315, számított: 1591,5327.

UV (víz) A_max - 280 nm (t - 5192), bázissal eltolódik 300 nm-re.

IR (KBr): 1656, 1586, 1662, 1504, 1403, 1264, 40

1230,1135,1105,1065,1023 és 1018 cm¹.

pKa (víz): 4,65 és 9,5.

3) A82846C molekulasúly: 1522 tapasztalati képlet: C73H90N10O26 45

FAB-tömegspektrum (tioglicerin) M + Na), mért: 1545,5998, számított (CTaH^NjoO^Na): 1545,5925.

UV (víz) A_max« 280 nm (í- 5198), bázissal eltolódik 300 nm-re.

IR (KBr): 3600- -3004 (széles), 2999, 2991, 2950, 1687--1650 (széles, 1585, 1570, 1509, 1503, 1453, 1449. 1402, 1212, 1130, 1102, 1060, 1032 és 1014 cm¹.

pKa(víz): 4,6 és 9,4.

Az A82846A, A82846B és A82846C 6n sósavban készült hidrolizátumának aminosavanalízise aszparaginsavat jelez, és két széles csúcs jelenik meg nyomnyi glicinnel. A két csúcs megfelel az aktinoidin és a vankomicin aminosavaknak; mindkettő jelen van a vankomicin típusú glikopeptidekben,

Az összehasonlító NMR vizsgálatok azt mutatják, hogy az A82846A, A82846B és az A82846C mindegyike tartalmaz egy új aminocukrot, a 4-epi-vankozamint (3-metil-akozamin).

Az A82846A tapasztalati képletét megkapjuk, ha a vankomicinból (C66H75N9O24CI2) elveszünk egy klóratomot és hozzáadjuk a vankózamin típusú aminocukor elemeit (C7H14NO2). Az A82846B tapasztalati képlete megfelel az A82846A képletének, azzal a különbséggel, hogy annak egyik hidrogénatomját klóratom helyettesíti. Az A82846C képlete megfelel az A82846A képletének, azzal a különbséggel, hogy annak klóratomját hidrogénatom helyettesíti. Ezek értelmében az A82846 komponensek a glikopeptidek új csoportját alkotják, melyek kétségtelenül hasonlítanak a vankomicin molekulához, de eltérnek tőle a klórtartalmat és egy vankózamin alegységet illetően.

Az A82846 antibiotikumok in vivő antimikrobiális hatást mutatnak a kísérleti állatokban kísérleti úton kiváltott fertőzésekkel szemben. Két dózis vizsgálandó anyagot adva be kísérleti úton fertőzött egereknek, meghatározzuk az ED30 értéket [a kísérleti állatok 50%-át megvédő menynyiség mg/testsúlykilogramm érdekében kifejezve; Warren Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81: 233 - 235 (1961)]. A kapott ED₅₀ értékeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze.

Az A82846 antibiotikum in vivő aktivitása


Vegyület	Staphylococcus aureus	ED₅₀ értékek· Streptococcus pyogenes	Streptococcus pneumoniae
A82846A	0,19	0,19	0,17
A82846B	0,19	0,20	0,18
A82846C	2,18	2,71	5,87
Vankomicin	1,30	0,72	1,52

• mg/kg értékben megadott dózis az egérnek szubkután beadva a fertőzés utáni 1. és 4. órában.

HU 199873 Β

2. példa liter regenerált Dow XFS-43278.00 gyantát adunk a 45,4 g vankomicin aktivitással rendelkező teljes fermentléhez. Miután hat órán át kevertük szobahőmérsékleten, a gyantát egy 100 mesh-számú szitán elválasztjukl a fermentlétől. Meggyőződtünk, hogy a fermentlé már nem tartalmaz jelentős mennyiségű antibiotikumot, és az üres fermentlevet eldobjuk.

Az antibiotikumot hordozó gyantát tisztított vízzel mossuk, és adagonként eluáljuk oly módon, hogy a gyantazagy kémhatását nátrium-hidroxid-oldattal pH = 10,5 értékre állítjuk be, és két órán keresztül keverjük, mialatt a kémhatást az adott pH-értéken tartjuk. Az eluált gyantát vákuumszűréssel elválasztjuk, és tisztított vízzel mossuk. Az eluátumot és a mosóvizeket egyesítjük, a kémhatást sósavval pH = 3,1 értékre állítjuk be, hogy az oldat stabilitását biztosítsuk. A vizsgálatok szerint 37,1 g vankomicinnek megfelelő aktivitást nyerünk ki.

Az eluált gyanta regenerálásához a gyantazagy kémhatását sósavval pH = 2,0 értékre állítjuk be, és 20 percen át kevertetjük. Tisztított vízzel kimossuk a savat, újabb 20 percen keresztül nátrium-klorid-oldatban kevertetve a gyantát, visszaállítjuk Na⁺ formává. Tisztított vízben áztatva a gyanta mellől eltávolítjuk a felesleges sóoldatot.

Ezzel szemben, azonos mennyiségű teljes fermentléből az eddig ismert, kémhatás beállítást és szűrést alkalmazó legjobb eljárással csak 23,2 g vankomicinnek megfelelő aktivitást találtunk a gyanta eluátumában.

3. példa

Az M43A antibiotikumot a 4.548.925. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 2. példája szerint nyerjük ki, azzal a különbséggel, hogy a (B) szakaszból elhagyjuk a teljes fermentlé szűrését és a szűrlet kationcserélővei való kezelését. Ehelyett a teljes fermentléhez regenerált Dow XSF-43278.00 gyantát adunk, a keveréket 6 órán át szobahőmérsékleten keverjük, és szitán a gyantát a fermentlétől elválasztjuk. Az antibiotikumot a 2. példában leírtak szerint eluáljuk a gyantáról.

Az M43A antibiotikum tisztítását a 4.548.925. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 2. példájának (C) szakasza szerint végezzük.

4. példa

Az aktaplanint a 4.322.406. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 1. példája szerűt állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a (C) szakaszból elhagyjuk a következő elválasztási lépéseket: 1) szűrési adalékanyag hozzáadása; 2) a teljes fermentlé leszűrése; 3) a kiszűrt anyag vízben történő szuszpendálása; 4) a vizes szuszpenzió kémhatásának pH = 10,5 értékre történő beállítása; 5) szűrés. Ehelyett Diaion SK-102 gyantát adunk a teljes fermentléhez és a 2. példában leírtak szerint kinyerjük az aktaplanin komplexet. Az aktaplanin Βμ B₂, B₃, C_la, C₃ és E| faktorait az említett szabadalom 1. példájának (D) és (F) szakasza szerint választjuk el.

5. példa

Teikoplanint a 4.239.751. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy elhagyjuk a következő lépéseket: a fermentlé szűrése; a szűrlet kémhatásának beállítása; az oldat extrahálása butanollal; a kiszűrt micélium mosása pH = 3,5 kémhatású savas vízzel; csökkentett nyomáson való szárítása; vizes acetonnal történő extrahálása; az acetonos extraktum betöményítése; kémhatásának beállítása; butanolos extrahálás. Ehelyett a 2. példában leírtak szerint nyerjük ki a teikoplanin komplexet.

6. példa

Az 1. példában leírt módon előállított A82846 antibiotikumot a leírtaktól eltérően a 2. példában leírtak szerint nyerjük ki, elhagyva az A82846 komplex izolálásából az alábbi lépéseket: kémhatás beállítása; szűrési segédanyag hozzáadása; szűrőprésen való szűrés; a kiszűrt anyag vízzel történő mosása; az egyesített szűrlet és mosóié kémhatásának beállítása.

Claims

1. Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok kinyerésére fermentlevekből, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumot tartalmazó teljes fermentlevet 2% vagy annál kisebb mértékben térhálósított mikroporózus szulfonált polisztiroldivinil-benzol-gyantával hozzuk össze; a gyantát elválasztjukl a közegtől; az antibiotikumot leoldjuk a gyantáról.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gyantát úgy hozzulk össze a fermentlével, hogy a fermentlevet a gyantára folyatva adszorbeáltatunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentléhez szakaszosan adjuk hozzá a gyantát.

4. Az 1 — 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eluensként pH « 9-12 kémhatású vizes oldatot használunk.