FI93163C - Menetelmä metalloproteiinien laktoferriini ja laktoperoksidaasi eristämiseksi valikoivasti herasta adsorptiolla ja eluusiolla - Google Patents

Description

93163

Menetelmä metalloproteiinien laktoferriini ja laktoperoksi-daasi eristämiseksi valikoivasti herasta adsorptiolla ja eluusiolla

Keksintö koskee menetelmää eristää valikoivasti tietyt proteiinit herasta, nimittäin rautaa sitovat metalloproteiinit laktoferriini ja laktoperoksidaasi.

Kuten tiedetään, on olemassa useita tuhansia proteiineja.

Hera sisältää niistä satoja sisältäen joitakin määriä metal-loproteiineja.

"Metalloproteiineilla" tarkoitetaan proteiineja, joilla on hyvä yhtymistaipumus metalleihin, etenkin rautaan. Nämä proteiinit ovat yhä halutumpia, ei ainoastaan niiden ravintoarvon vuoksi, etenkin biologisena raudantuojana imeväisille (laktoferriinin suhteen), vaan etenkin niiden farmakologisten ominaisuuksien tähden, varsinkin antibakteerisina vaiku-tusaineina.

Tunnetaan jo useita menetelmiä proteiinien eristämiseksi herasta.

Asiakirjassa GB-A-871 541 on ehdotettu proteiinien eristämistä yleensä asettamalla hera yhteyteen ioninvaihtoaine-hartsin kanssa, joka on muodostunut neutraalista perustasta (piimaat), jolla on suuri spesifinen pinta, joka on päällystetty vaihtoainegeelillä (sekapolymeeri styreeni/divinyyli-bentseeni). Tämä aikaisenqpi tekniikka tekee mahdolliseksi eristää proteiinit massana ilman valikointia.

Asiakirjassa FR-A-2 505 615 (vastaa US-A-4 436 658:aa) on esitetty haluttujen metalloproteiinien, nimittäin laktoferriinin ja laktoperoksidaasin, talteenottamista valikoivasti suodattamalla ensiksi hera tukevan jäykän alustan läpi, ku- 2 931 63 ten erityisesti piidioksidi lievästi emäksisessä ympäristössä (pH 7,9 - 8,5) ja sitten eluoiden adsorboituneet proteiinit happoliuoksen avulla. Tämä menetelmä antaa erinomaisia tuloksia valikoivan eristyksen suhteen, mutta sitä ei ole juuri lainkaan kehitetty, sillä käsitelty hera ottaa heti emäksisen luonteen, mikä tekee sen silloin sopimattomaksi eläinten ravinnoksi ilman myöhempää kallista käsittelyä.

Asiakirjassa FR-A-2 359 634 (vastaa US-A-4 100 149:ää) on esitetty heran asettamista yhteyteen kationinvaihtoaine-hartsin kanssa, joka on muodostunut huokoisesta epäorgaanisesta alustasta, jolla on soveltuva rakeisuus (pallomainen piidioksidi), joka on päällystetty verkkomaisella synteettisellä polymeerikalvolla, jossa on kationinvaihtoaineryhmit-tymiä happofunktioiden edustamina, kuten karboksyyli-, sul-foni- tai fosfonihapporyhmät. Tämä ratkaisu tekee mahdolliseksi ottaa talteen metalloproteiinit mutta liittyneinä hyvin suureen määrään immunoglobuliineja (ks. erityisesti tämän US-A-4 100 149 patentin esimerkkiä 3 ja jäljempänä olevaa esimerkkiä 7). Lisäksi on metalloproteiinien eristysmää-rä alhainen ja näiden proteiinien puhtausastetta pidetään riittämättömänä taloudelliselta näkökannalta, jollei jälleen tehdä myöhempiä ja siis kalliita käsittelyjä.

Asiakirjassa FR-A-2 319 299 (vastaa GB-A-1 544 867:ää ja US-A-4 673 734:ää) on suositeltu eristää yleensä proteiinit, joita tiedetään olevan useita tuhansia, asettaen ne yhteyteen huokoisen epäorgaanisen alustan kanssa, joka on pinnalta päällystetty aminopolysakkaridibiopolymeerillä. Tämä ratkaisu, joka antaa erinomaisia tuloksia, kun on kyse biologisten makromolekyylien puhdistamisesta tai erotuksesta, kuten gammaglobuliinien, hemoglobiinin, albumiinin, ei toimi heran suhteen, sillä silloin sidotaan proteiinien pääosa mutta metalloproteiinien kaltaiset kationiluonteiset proteiinit päästetään kulkemaan. Siten tämä tekniikka ei voi soveltua näiden metalloproteiinien valikoivaan erotukseen herasta.

3 93163

Keksintö vähentää näitä haittoja. Sen päämääränä on menetelmä metalloproteiinien laktoferriini ja laktoperoksidaasi eristämiseksi herasta adsorptiolla kiinteällä alustalla ja sitten adsorboituneiden proteiinien eluusiolla. Sen pyrkimyksenä on erityisesti menetelmä, joka on valikoiva, taloudellinen ja helppo toteuttaa ja joka tekee mahdolliseksi ennen muuta ottaa talteen todella valikoivasti ja taloudellisesti metalloprote-iinit herasta muuttamatta tätä, toisin sanoen jättäen sen täysin käyttökelpoiseksi etenkin eläinten ruokintaan samalla kertaa ravintotekijänä ja energian tuojana, mitä ei tähän asti ole osattu tehdä.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Tälle menetelmälle näiden metalloproteiinien eristämiseksi herasta adsorptiolla rakeiden muodossa olevalla huokoisella epäorgaanisella kantajalla ja sitten näin adsorboituneiden proteiinien eluusiolla liuosten avulla on tunnusomaista, että mainittujen rakeiden seinät on päällystetty dietyyliaminoetyyli-dekstraanilla, jolla on pinnalla funktionaalisia happoryhmiä.

Jäljempänä olevassa kuvauksessa sekä patenttivaatimuksissa tarkoitetaan "aminopolysakkarideilla" kationiluonteista biopolymeeriä, kuten dekstraani, tärkkelys, selluloosa, arkoosi ·;·. ja muut "-oosi"-päätteiset sokerit. Keksinnön mukaan näillä biopolymeereillä on lisäksi toiminnallisia happoryhmiä, kuten erityisesti karboksyyli- tai sulfoniryhmiä.

Keksintö koskee toisin sanoen metalloproteiinien spesifistä eristämistä herasta, jonka tiedetään sisältävän satoja prote-iineja, valitsemalla epäorgaaninen huokoinen kantaja, kuten esimerkiksi piidioksidi, jonka pääasiallinen tunnusmerkki on yhtäältä, että se ei ole enää synteettisen polymeerin peittämä, vaan erityisen biopolymeerin, nimittäin aminopo-lysakkaridin, kun tiedossa oli (FR-A-2 319 299), että tämäntyyppinen kationiluonteinen biopolymeeri ei soveltunut tähän eristykseen, ja toisaalta, että sillä on happoryhmiä, kuten tiedetään lisäksi (FR-A-2 359 634), että nämä happoryhmät joh- 4 931 63 tivat keskinkertaiseen valikointiin teollisuustasolla riittämättömiksi arvioidun tuoton ja puhtauden johdosta.

Kun aikaisempi tekniikka sai luopumaan biopolymeerien käytöstä, on keksinnön merkitys juuri siinä, että se on todennut täysin odottamattomasti, että spesifisten biopolymeerien käyttö, joihon on oksastettu tässä tapauksessa happoryhmiä, tekee mahdolliseksi ei ainoastaan eristää valikoivasti metalloprote-iinit herasta, vaan erityisesti erottaa ne hyvin immunoglobu-liineista ja lopuksi toimia niin, että tuotto ja puhtausaste ovat selvästi parantuneet, ja olosuhteissa, jotka sopivat hyvin yhteen teollisen prosessin kanssa. Tämä valikoiminen on sitäkin hämmästyttävämpää, kun mikään aikaisemmassa tekniikassa ei antanut ammattimiehelle ideaa yhdistää kationiluonteisen aineen opetuksia anioniluonteisen toisen aineen kanssa näiden aineiden ollessa ristiriitaisia luonteeltaan.

On sitäkin hämmästyttävämpää, että tämä voidaan saavuttaa päällystämällä huokoiset piidioksidirakeet happoryhmiin oksastetulla polysakkaridilla ja saatiin tämänkaltainen valinta-tarkkuus, kun oli tiedossa, että tämän tyyppinen kationinvaih-toainehartsi, jolla on happofunktioita, oli kielletty (ks. edellä mainittua asiakirjaa FR-A-2 359 654, s. 1, rivi 17 ja seuraavat) kationinvaihtoainehartsina proteiineille (teknistä laatua oleva ennakkokäsitys kumottu).

Täten keksintö muodostuu erityisestä valikoinnista täsmällisellä vaiintätarkkuudella suuren joukon sisällä, kun taas aikaisempi tekniikka sai luopumaan sellaisesta valikoinnista, joka tekee mahdolliseksi ratkaista edullisesti ja taloudellisesti ongelma vähentäen valmistuskustannuksia ja lisäten tuottavuutta .

Aivan odottamattomalla tavalla ovat patentinhakijat todenneet, että näiden epäorgaanisten huokoisten spesifisten rakeiden valinta tekee mahdolliseksi: - yhtäältä parantaa huomattavasti eristystuottoa (kaksi kertaa enemmän); 5 93163 - toisaalta ja ennen muuta eristää spesifisesti ja valikoivasti sekä helposti halutut metalloproteiinit herasta, ilman että ne sekoittuvat toisiin proteiineihin ja tämä selvästi parantuneiden tuoton ja puhtausasteen kera (ajan ja välineiden säästöt ja tuottavuuden nousu); - lopuksi jättää käsitelty hera koskemattomaksi, joten se pysyy kokonaan soveliaana kulutukseen ja säilyttää koko ravintoarvonsa .

Tämä valikointi tekee lisäksi mahdolliseksi toiminnan lähes neutraaleissa pH-olosuhteissa, etenkin niissä oloissa, jotka tekevät mahdolliseksi ottaa valikoivasti talteen mainitut metalloproteiinit liukenevassa muodossa.

Voitaisiin ajatella, että keksinnön valikointi on sekoitus aikaisemmista opetuksista. Yhtäältä ovat nämä opetukset ristiriitaisia keskenään ja toisaalta ja ennen muuta tiedetään, että kemiallinen tuote ei ole eri aineosiensa sekoitus.

Käytännössä on edullista: - että epäorgaanisten rakeiden seiniä peittävä polysakkaridi on dekstraania tai dekstraanin johdannainen, kuten aminojohdannainen; - mieluiten turvaudutaan dietyyliaminoetyylidekstraaniin (DEAE), jonka molekyylipaino on ainakin 104, mieluiten 10^ - .·: 106 daltonia; - happoryhmät ovat karboksyyli- tai sulfoniryhmiä; nämä happo-ryhmät sidotaan edullisesti sakkaridibiopolymeeriin kahdenar-voisilla hydrokarbonoiduilla radikaaleilla, etenkin alkyleeni-ryhmillä, kuten metyleeni tai propyleeni; - on edullista, että huokoiset epäorgaaniset rakeet ovat epäorgaanisia oksideja, kuten mieluiten pallomaisia piidioksidi-rakeita, jotka on saatu varsinkin pyrogenisaatiolla; - piidioksidirakeet ovat pallomaisia rakeita, joiden: . raekoostumus sisältyy kymmenen ja tuhannen mikrometrin välille, mieluiten sadan ja kolmen sadan mikrometrin; o . spesifinen pinta-ala sisältyy yhden ja neljän sadan m /g

O

v välille ja mieluiten viidentoista ja kahdensadan m /g välille; 93163 6 . huokosten keskimääräinen läpimitta sisältyy viiden ja kahden sadan nm:n välille; - eräässä toisinnossa on hera käsitelty ensiksi päästämällä se ensimmäisen kerran kyseessä olevaa tyyppiä olevan ensimmäisen ryhmän piidioksidirakeiden läpi sisältäen happoryhmiä, jotka ovat heikkoja kationinvaihtoaineita, kuten erityisesti kar-bosyyliryhmät, ja tämä tapahtuu laktoferriinin ottamiseksi, ja sitten toisella kerralla näin käsitelty hera kulkee sarjana toisen ryhmän rakeiden läpi, joka käsittää happoryhmiä, jotka ovat voimakkaita kationinvaihtoaineita, kuten erityisesti sul-fonihapporyhmät, ja tämä tapahtuu laktoperoksidaasin haltuunottamiseksi; - hera on makeaa heraa, toisin sanoen heran pH sisältyy 6,3sn ja 6,6:n välille; eräässä toisinnossa voidaan turvautua happa-meen heraan, toisin sanoen heraan, jonka pH sisältyy 4,3:n ja 4,6:n välille.

Se tapa, jolla keksintö voidaan toteuttaa, ja ne edut, jotka siitä johtuvat, käyvät paremmin selville seuraavista suori-tusesimerkeistä, jotka on annettu opastukseksi eikä rajoitukseksi liitteenä olevan kuvion avulla, joka on tiivistetty kaavamainen esitys keksinnön mukaisesta laitteistosta menetelmän toteuttamiseksi.

Esimerkki 1 ·, Säiliöön (1) johdetaan neljäsataa litraa mietoa juustomeijeri- heraa (2) (pH 6,4), jota hämmennetään hitaasti, jotta se pysyisi homogeenisena. Tämä hera jäähdytetään tunnetulla tavalla 3-8°C välille sisältyvään lämpötilaan. Tämä hera (2) sisältää litraa kohden noin 74,6 mg laktoferriiniä ja 50,5 mg laktoper-oksidaasia.

Säiliöön (3) johdetaan kaksikymmentä litraa ensimmäistä liuosta (4), joka sisältää litraa kohden (g/1) noin 3 grammaa nat-riumkloridia (pH neutraali).

Pylvääseen (5) asetetaan neljä kiloa huokoisen piidioksidin (6) ' pallomaisia rakeita, joita IBF-Biotechnics markkinoi rekisteröidyllä tavaramerkillä "CM-SPHERODEX-LS", jolla on 100 ja 300 7 93163 mikronin välille sisältyvä raekoostumus, huokosläpimitta noin 100 nm, spesifinen pinta-ala noin 25 m2/g ja jonka huokosten seinät on päällystetty pysyvällä hienolla kerroksella DEAE-dekstraania, johon on oksastettu karboksyylihapporyhmityksiä.

Ensimmäisellä kerralla annetaan aivan ensiksi heran (2) valua säiliöstä (1) piidioksidin päälle neljän ja puolen tunnin ajan.

Käsitelty hera (7) otetaan talteen säiliöön (8) ja siirretään sitten kohtaan (9) tullakseen tiivistetyksi ja kuivatuksi tavanomaisella tavalla. Tämä hera, jonka pH:ta ei ole muutettu, sisältää vielä suurimman osan proteiineista. Täten sitä voidaan käyttää sellaisenaan eläinten ruokinnassa ravinnon lisänä.

Kun kaikki hera (2) on kulkenut piidioksidin (6) läpi, kallistetaan venttiiliä (10), jotta voitaisiin siirtää kaksikymmentä litraa ensimmäistä pesuliuosta (4), jolla on neutraali pH, adsorbenssipatsaaseen, jota on merkitty viitteellä (11).

Piidioksidi (6) on adsorboinut halutut metalloproteiinit herasta (2) .

Heti kun pesuliuos (4) on valunut, johdetaan säiliöön (3) toinen viidentoista litran suolaliuos (12), joka sisältää litraa kohden kolmetoista grammaa natriumkloridia.

Tämän toisen liuoksen (12) annetaan valua vapaasti adsorbenssipatsaaseen (11). Venttiilin (13) kautta otetaan pesuneste talteen altaaseen (14). Adsorboitunut piidioksidi ’ (6, 11) pestään sitten neljätoista litraa käsittävän kolman nen suolaliuoksen avulla, jossa on 45 g/1 natriumkloridia, joka siirretään säiliöstä (3) ja joka otetaan talteen erilliseen altaaseen (15).

Altaan (14) sisältö siirretään toiseen altaaseen (20) ja sieltä ultrasuodatinlaitteeseen (21), jossa suihkutetaan dialyysi- 8 931 63 vettä (31)vähentämään mineraalipitoisuutta. Sisältö saa

kulkea orgaanisten kalvojen (33) yli, joiden huokosten 4 O

läpimitta on 10 daltonia, 12-50 C välille sisältyvässä lämpötilassa.

Altaan (15) sisältö siirretään sitten altaaseen (20) ja menetellään samalla tavalla.

Saadut päästöt otetaan talteen (34), ennen kaikkea tullakseen käytetyiksi uudelleen toisissa eluusioissa.

Yhdisteet (22) otetaan talteen ultrasuodatinlaitteen (21) uloskäynnillä. Venttiilin (23) ansiosta voidaan nämä yhdisteet (22) siirtää: - joko lyofiililaitteeseen (24), jossa halutut metallopro-teiinit otetaan talteen massana; - tai kuivaustorniin (35), missä ne samoin otetaan talteen massana; - tai mieluiten laitteeseen fraktioimista varten ioninvaih-tokromatografiällä (25) orgaanisella geelillä, tyypiltään IBF BIOTECHNIX'in markkinoimaa rekisteröidyllä merkillä "SP-TRISACRYL LS" tullakseen käytetyksi kummassakin halutuista proteiineista, vastaavasti laktoferriinissä (26) ja laktoperoksidaasissa (27).

Piidioksidi (6) pestään sitten vedellä (29), joka on siirretty säiliöstä (3). Tätä pesua seuraa toinen happopesu (N/10 suolahappoliuos). Piidioksidi (6) on lopuksi uudistettu suodattamalla kaksikymmentä litraa natriumasetaatti-liuosta, jonka pH on 5.5.

Täten saadaan alussa olleesta neljästä sadasta litrasta heraa (2) : - yhtäältä käytännöllisesti katsoen neljä sataa litraa eristettyä heraa (9) soveltuvaa käytettäväksi suoraan eläinten ruokinnassa, koska sillä on tallella koko ravintoarvonsa; - toisaalta: . 23,6 g laktoferriiniä , eli 79 %:n eristysmäärä puhtausasteen ollessa suhteessa muihin tässä liuoksessa oleviin proteiineihin ainakin 80 %; 9 93163 . 2,8 g laktoperoksidaasia, eli 14 %:n eristysmäärä puhtaus-asteen ollessa yli 50 %.

Esimerkki 2 :

Toistetaan esimerkki 1 ruiskuttaen dialyysiveteen (31) vesipitoista liuosta, jossa on litraa kohden 2 g (2 g/1) ammonium-rautasulfaattia, joka on stabilisoitu askorbiinihapolla. Halutut proteiinit kyllästetään täten raudalla, mikä lisää niiden ravintotehoa.

Esimerkki 3:

Esimerkki 1 toistetaan jäljessä olevin toisinnoin.

Ensiksi korvataan piidioksidi (6) samalla määrällä huokoisen piidioksidin rakeilla, jota merkkinoidaan nimellä SP-SPHEKODEX-LS (rekisteröity merkki), joiden seinät on päällystetty kerroksella DEAE dekstraania, johon on liitetty sulfopropyyliryhmityksiä ja fysikaaliset tunnuspiirteet lähes samat kuin esimerkin 1.

Käsitellään 306 litraa makeaa juustomeijeriheraa, jonka pH on 6,4 ja joka sisältää 46,2 mg/1 laktoferriiniä ja 44,7 mg/1 laktoperoksidaasia. Virtausnopeus säädellään sadaksi litraksi/tun-nissa. Säiliöön (3) johdetaan seitsemäntoista litraa ensimmäistä liuosta (4), joka sisältää kolme grammaa/litra natriumklori-dia.

Liuotin (12) on muodostunut kahdestakymmenestäkahdeksasta litrasta suolaliuosta, jossa on 15 g/1 natriumkloridia ja joka tekee mahdolliseksi ottaa talteen (14) l,23g laktoferriiniä ja 0,6 g laktoperoksidaasia.

Toinen liuotin (32) on muodostunut kahdestakymmenestäseitsemäs-tä litrasta, joka sisältää 45 g/1 natriumkloridia ja tekee mahdolliseksi ottaa talteen (15) 2,7 g laktoferriiniä ja 5,1 g laktoperoksidaasia.

Lopuksi käsitellään toisella liuottimena (30), joka on muo- 10 931 63 dostunut kahdestakyrnrnenestäyhaestä litrasta, joka sisältää 60 g/1 natriurnkloridia. Saadaan 4,0 g laktoferriiniä.

Täten on voitu ottaa talteen: . 7,93 g laktoferriiniä (tuotto: 57 %), . 5,7 g laktoperoksidaasia (tuotto: 42 %).

EsimerkKi 4:

Toistetaan, esimerkki 1 korvaten makea juustomeijerihera 198 litralla kaseiinituotannon hapanta heraa, jonka pH on 4,5 ja joka sisältää 84,0 mg/1 laktoferriiniä ja 37,0 mg/1 laktope-roksiaaasia.

Säädetään heran virtausnopeus piidioksidirakeilla, joissa on karboksyyliryhrnityksiä, sadaksi litraksi tunnissa.

Kuten edellä, pestään kahdellakymmenellä litralla liuosta (4) joka sisältää 3 g/1 natriurnkloridia.

Ensimmäinen eluusio (12) toteutetaan kahdenkymmenen litran liuoksen avulla, joka sisältää 15 g/1 natriurnkloridia. Saadaan 2,08 g laktoferriiniä ja 1,6 g laktoperoksidaasia.

Toinen eluusio (32) toteutetaan kolmenkymmenenyhöen litran liuoksella, joka sisältää 45 g/1 natriurnkloridia. Saadaan 3,7 g laktoferriiniä.

• o

Talteen otetaan täten: . 5,78 g laktoferriiniä (tuotto: 35 %), . 1,6 g laktoperoksidaasia (tuotto: 22 %).

Esimerkki 5: « < k V Toistetaan esimerkki 3 180 litralla kaseiinituotannon hapan ta heraa (pH = 4,59),joka sisältää 87 mg/1 laktoferriiniä ja 33 mg/1 laktoperoksidaasia.

Suolainen pesuliuos (4) sisältää kaksitoista litraa, jossa on 3 g/1 natriurnkloridia.

11 93163

Ensimmäinen eluusio (12) toteutetaan kolmenkymmenenkahdeksan litran liuoksella, joka sisältää 15 g/1 natriumkloridia. Saadaan 1,3 g laktoferriiniä ja 0,16 g laktoperoksidaasia.

Toinen eluusio (32) toteutetaan kahdenkymmenenkahdeksan litran liuoksen avulla, jossa on 45 g/1 natriumkloridia. Saadaan 3,0 g laktoferriiniä ja 3,9 g laktoperoksidaasia.

Täten otetaan talteen: . 4,3 g laktoferriiniä (tuotto: 27 %), . 4,06 g laktoperoksidaasia (tuotto: 69 %).

Esimerkki 6: Tämä esimerkki kuvaa keksinnön mukaista käsittelyä, joka on toteutettu siirtämällä sama hera kahteen pylvääseen sarjana, kummankin sisältäessä eri tyyppiä olevia piidioksidirakeita, joiden seinät ovat aminoidun polysakkaridikerroksen peittämät.

Ensimmäiseen pylvääseen, joka sisältää 4 kiloa piidioksidi-rakeita CM SPHERODEX LS, samanlaisia kuin esimerkissä 1 (kar-boksyyliryhrnät), suodatetaan kahdessa ja puolessa tunnissa 250 litraa makeaa juustomeijeriheraa, joka sisältää 81,5 mg/1 laktof erriiniä ja 52,0 mg/1 laktoperoksidaasia.

Täten käsitelty hera varastoidaan sopivaan säiliöön ja pestään sitten piidioksidi (6,11) viidellätoista litralla vesipitoista -· liuosta (4) joka sisältää 3 g/1 natriumkloridia.

Sitten suoritetaan ensin eluusio ensimmäisellä viidentoista litran liuoksella (12) jossa on natriumkloridia 13 g/1 ja otetaan talteen liuos joka sisältää 1,87 g laktoperoksidaasia ja 0,85 g laktoferriiniä, ja sitten kuudentoista litran toinen eluusio (32) liuoksella, joka sisältää natriumkloridia 45 g/1 ja tekee mahdolliseksi ottaa talteen 19,0 g laktoferriiniä.

Täten on siis otettu talteen: . 19,85 g laktoferriiniä (tuotto: 98 %), . 1,87 g laktoperoksidaasia (tuotto: 14 %) 12 951 63

Jo käsitelty varastoitu 250 litran erä heraa suodatetaan sitten toisen pylvään läpi, joka sisältää 2,5 kiloa SP SPHERODEX LS rakeita (sulfopropyyliryhmät), jotka ovat samanlaisia kuin esimerkin 3 rakeet, virtausnopeudella joka on 100 litraa/tunnissa.

Tämä hera, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen enää lak-toferriiniä, sisältää vielä 42,1 mg/1 laktoperoksidaasia.

Suodatuksen jälkeen pestään pylväs 20,5 litran liuoksella, jossa on natriumkloridia 3 g/1.

Pylväs eluoidaan sitten kolmellakymmenelläseitsemällä litralla natriumkloridiliuosta, jossa on 15 g/1, ja saadaan 1,7 g laktoperoksidaasia.

Sitten eluoidaan pylväs 18 litran liuoksella, jossa on 45 g/1 natriumkloridia, ja saadaan 9,3 g laktoperoksidaasia.

Täten on siis tällä toisella käsittelyllä saatu yksitoista grammaa (11 g) laktoperoksidaasia eli melkein koko se määrä, joka sisältyi alkuperäiseen heraan (11 + 1,87 = 12,87 13 g/1 kohden).

Toisin sanoen molemmat toisiaan seuraavat heran suodatintoimen-piteet tekevät siis mahdolliseksi eristää melkein kokonaan lak-tof emiini ja laktoperoksidaasi, jotka ovat alkuperäisessä herassa, kahdentyyppisten eri piidioksidirakeiden läpi.

Esimerkki 7:

Toistetaan esimerkki 1 korvaten piidioksidi CM-SPHERODEX-LS huokoisella hydrofiilisellä piidioksidilla, jolla on samat fysikaaliset tunnuspiirteet kuin esimerkissä 1. Tämä hydro-fiilinen huokoinen piidioksidi on päällystetty synteettisellä : akryylipolymeerillä, johon on oksastettu karboksimetyylihappo- ryhmityksiä asiakirjan Fr-A-2 359 634 opetusten mukaisesti, kuten johdannossa on mainittu.

2,5 kilon suuruisen määrän läpi tätä piidioksidia valutetaan kolme sataa litraa makeaa heraa (pH 6,4) virtausnopeudella joka » 13 93163 on 75 litraa tunnissa ja joka sisältää 50,2 mg/1 laktofer-riiniä ja 33,8 mg/1 laktoperoksidaasia.

Eluusioiden jälkeen saadaan: - yhtäältä kolmesataa litraa heraa (9), jota voidaan käyttää ravintoaineena karjalle, - toisaalta satakaksikymmentä grammaa erilaisia proteiineja, jotka sisältävät pääasiallisesti immunoglobuliineja, . 7,1 g laktoferriiniä (tuotto: 47 % verrattuna 79 %:iin esimerkissä 1, puhtausasteen ollessa alle 40 % verrattuna 80 %:iin, . 0,9 g laktoperoksidaasia (tuotto: 9 % verrattuna 14,9 %:iin) puhtausasteen ollessa alle 30 % verrattuna 50 %:iin esimerkissä 1.

Näin ollen edellä mainitut laktoferriini ja 1aktoperoksidaa-si ovat olennaisesti sekoittuneet hyvin suureen määrään immunoglobuliineja, joista ne täytyy erottaa.

Toisin sanoen tämän aikaisemman tekniikan tuotto ei pelkästään ole selvästi alempi metalloproteiinien suhteen, vaan myös näiden metalloproteiinien puhtausaste on vähäisempi, mikä vaatii silloin myöhempiä puhdistustoimenpiteitä.

Esimerkki 8:

Toistetaan esimerkki 1 huokoisella piidioksidilla, joka on samanlaista kuin esimerkissä 1 käytetty, mutta päällystetty dietyyliaminoetyylidekstraanilla (DEAE), jota IBF-BIOTECHNICS markkinoi nimellä DEAE SPHERODEX-LS (patentin US-A-4 673 734 opetukset).

: Suurin osa heran proteiineista siis sidotaan, poikkeuksena halutut laktoferriini ja laktoperoksidaasi, jotka siirtyvät heran (9) mukana.

Nämä kaksi viimeistä esimerkkiä kuvaavat täysin keksinnön mukaisen valikoinnin hämmästyttävää tehoa.

Aminoidulla mutta oksastamattomalla biopolymeerillä päällyste- i4 951 63 tyn piiaioksiäin käyttö ei anna toivottuja tuloksia, nimittäin laktoferriinin ja laktoperoksiaaasin spesifistä eristystä.

Käyttämällä näitä samoja piiaioksiairakeita, mutta päällystettyinä synteettisellä polymeerillä jossa on funktionaalisia hap-poryhruityksiä, on mahdollista ottaa talteen metalloproteiinit, mutta ynaistettyinä muihin proteiineihin, ja tuotto sekä puhtausaste ovat selvästi riittämättömät (katso eaellä olevaa esimerkkiä 7).

Laktoferriinin ja laktoperoksiaaasin eristämismenetelmä keksinnön mukaisesti erottuu tähän asti ehdotetuista menetelmistä pääasiallisesti : - näiden kahden halutun proteiinin valikoivasta eristämisestä. Liitä on ollut tähän asti vaikea eristää, sillä niitä on ollut liian vahainen määrä ja ne ovat olleet sekoittuneina muihin proteiineihin ; - toteuttamisen yksinkertaisuudesta; - erityisen korkeasta eristämistuotosta (melkein kaksi kertaa Korkeammasta) aikaisempaan tekniikkaan nähden, katso erityisesti esimerkkejä 7 ja 8; - eristettyjen metalloproteiinien korkeasta puhtaudesta, joka johtuu epäilemättä paremmasta eristyksen yksilöinnistä.

Nain talteenotetut metalloproteiinit, nimittäin ennen muuta ne, jotka sitovat rautaa, kuten laktof emiini ja laktoperoksidaasi, voidaan käyttää hyvällä menestyksellä nykyään tunnetuissa sovellutuksissa, kuten esimerkiksi: - eläinten ravintona ruuansulatuskanavan suojaamiseksi sekä kasvu te kijana; - eläinlääkinnän alalla suoliston anti-infektiotoiminnassa ja imeväistasolla; : - dieetti- ja ihmisravinnon alalla, etenkin raudan tuojana; - laäkeaineopin alalla: oftamolotia, ^astro-enteroloLia, paro-dontologia, dermatolo^ia, £ynekolO£,ia jne.

Claims (6)

93163 15

1. Menetelmä metalloproteiinien laktoferriini ja laktope-roksidaasi eristämiseksi valikoivasti herasta, jossa menetelmässä metalloproteiinit adsorboidaan kiinteiden partikke-leiden muodossa olevalle huokoiselle epäorgaaniselle kantajalle ja näin adsorboidut metalloproteiinit eluoidaan liuosten avulla, tunnettu siitä, että mainittujen partikkeleiden seinät ensin päällystetään dietyyliaminoetyylidekstraaniker-roksella, jossa on karboksyyli- tai sulfonihapporyhmiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happoryhmät sidotaan dietyyliaminoetyylidekstraaniin kaksiarvoisilla hydrokarbonoiduilla radikaaleilla.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrokarbonoidut kaksiarvoiset radikaalit ovat al-kyyliryhmiä.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että huokoiset epäorgaaniset partikkelit ovat pallomaisia piidioksidirakeita, joiden: raekoostumus on kymmenen ja tuhannen mikrometrin välillä; spesifinen pinta-ala on yhden ja neljänsadan m2/g välillä; huokosten keskimääräinen läpimitta on viiden- ja kahdensadan nanometrin välillä. • I

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hera käsitellään ensiksi valuttamalla se piidioksidirakeiden läpi, joiden seinät on päällystetty dietyyliaminoetyylidekstraanikerroksella ja joilla on pinnalla karboksyylihapporyhmiä, ja täten käsitelty hera vie- * ' dään sarjana piidioksidirakeiden läpi, joiden seinät on päällystetty toisella kerroksella dietyyliaminoetyylideks-traania, jolla on pinnalla sulfonihapporyhmiä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hera on makeaa heraa. 16 93163