FI92709C - Fosfopeptidejä, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö sekä niitä sisältäviä suunhuoltokoostumuksia - Google Patents

Description

92709

Fosfopeptidejå, niiden valmistusmenetelmå ja kåyttO sekå niitå sisåltåviå suunhuoltokoostumuksia Tåmån keksinndn kohteena ovat fosfopeptidit ja nii-5 tå sisåltåvat suunhuoltokoostumukset.

Tåmån keksinnån kohteena on mytts menetelmå nåiden fosfopeptidien valmistamiseksi sekå niiden kåyttii suun-huoltolisåaineena elintarvikkeissa, makeisissa tai juo-missa.

10 FI-patenteista 67655 ja 67656 tunnetaan fosfoamino- happoja sisåltåviå polypeptidijakeita, jotka ovat hyddyl-lisiå ravinteina tai lååkkeinå. Fosfopeptidien rakennetta ei ole ilmoitettu.

Tåmån keksinndn mukaiselle fosfopeptidille on tun-15 nusomaista, ettå sillå on sekvenssi:

Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-

Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys;

Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-

Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg; 20 Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-

Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys;

Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; tai

Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

25 Aminohapposymbolit ovat seuraavia: Pse-fosfoserii- ni, Ser-seriini, Pth-fosfotreoniini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspara-giini, Gln-glutamiini, Gly-glysiini, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-leusiini, Lys-lysiini, 30 Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Val-valiini.

Fosfopeptidi on edullisesti pååasiallisesti puh-taassa muodossa.

Tåmå keksintO mahdollistaa koostumuksen, joka si-såltåå peptidin tai sen suolan, tåmån keksinndn mukaisesti 35 ja fysiologisesti hyvåksyttåvån laimentimen.

li , 92709 L·»

Koostumus voi olla suun kautta annettavissa.

Fosfopeptidien ja/tai niiden suolojen seosta voi-daan kåyttåå koostumuksessa.

Fosfopeptidi tai fosfopeptidien seos on edullises-5 ti pååasiallisesti puhdas, ainakin siinå måårin, etta se ei sisållå pahanmakuisia epapuhtauksia.

Fosfopeptidi voidaan valmistaa synteettisesti ke-miallisella synteesilia tai geeniteknologian avulla tai se voidaan uuttaa luonnollisesti esiintyvasta aineesta. Kek-10 sinndn mukaiselle menetelmålle on tunnusomaista, etta fraktioidaan kaseiinin, ae-kaseiinin, β-kaseiinin tai niiden suolan uute.

Kustannussyista johtuen on nykyaan edullisempaa uuttaa fosfopeptidi kaseiinista ja erityisesti alfa-s-15 kaseiinista tai beeta-kaseiinista. Fosvitiinia voidaan myds kåyttaa peptidin lahteena. Lisåksi fosfoproteiineja viljakasveista, påhkindistå ja kasviksista, erityisesti riisin, vehnan, kauran, ohran tai rukiin leseakanoista tai kuorista voidaan kayttaa tuottamaan edelia mainittua pep-20 tidia. Soijapapu ja liha sisåltavat fosfoproteiineja, joi-ta voidaan kayttaa edellå mainitun peptidin saamiseksi.

Kaseiini ja erityisesti alfa-s-kaseiini tai beeta-kaseiini tai niiden suolat, kuten natriumkaseinaatti, si-saitavat polypeptideja, jotka voidaan lohkaista yksinker-. 25 taisemmiksi peptideiksi. Tailainen lohkaisu voidaan suo-rittaa uuttamalla, tailainen uutto voi olla kemiallinen tai proteolyyttinen.

Tållå hetkelia on edullista uuttaa kaseiini jolla-kin seuraavista aineista, trypsiini, pepsiini, kymotryp-30 siini, papaiini, termolysiini tai pronaasi. Nåistå trypsiini on edullinen.

Uutettu kaseiini voidaan fraktioida peptideiksi, kåsittåen keksinndn mukaiset ja muut peptidit. Mainittujen muiden peptidien låsnåolo ei ole vahingollista tehokkuu-35 delle, kuitenkin, tietyillå mainituilla muilla peptideillå 3 92709 on epamiellyttava maku ja senmukaisesti, mikaii jonkin mainituista muista peptideista on oltava mukana, on edul-lista poistaa ne, joilla on epamiellyttava maku. Yleensa ne mainituista peptideista, joilla on epamiellyttava maku, 5 vaikuttavat olevan hydrofobisia.

Seuraavilla peptideilia on havaittu olevan epamiellyttava maku: 1. Glu-Val-Leu-Asn 2. Asn-Glu-Asn-Leu-Leu 10 3. Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly 4. Leu-Arg-Phe 5. Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly-Lys 6. Leu-Arg-Leu 7. Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu-Phe 15 (Glu-glutamaatti; Val-valiini; Leu-leusiini; Asn-aspara- giini; Ala-alaniini; Pro-proliini; Phe-fenyylialaniini; Gln-glutamiini; Gly-glysiini; Arg-arginiini; Lys-lysiini; Tyr-tyrosiini.)

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa 20 ainakin 15 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vahen-tymista tassa maaritetyissa koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 26 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vahenty-mista tassa maaritetyissa koeolosuhteissa.

. 25 Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 30 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vahen-tymista tassa maaritetyissa koeolosuhteissa.

Edullisesti peptidi on sellainen, joka osoittaa ainakin 32 %:n hydroksiapatiittiliukenemisnopeuden vahen-30 tymista tassa maaritetyissa koeolosuhteissa.

.. Edullisesti peptidia on lasna 0,01 - 10 paino-%

Edullisesti peptidia on lasna 0,01 - 5 paino-%

Edullisesti peptidia on lasna 0,01 - 2 paino-%.

Taman keksinnOn mukainen koostumus voi olla syOta-35 vaksi kelpaavassa muodossa, kuten hammaspuhdistusaineen, • 4 92709 tabletin muodossa tai se voi kåsittåå fysiologisesti hy-våksyttåvån apuaineen tai suspension liuoksen paikallista kåyttGå vårten hampaille tai suun pesuun. Muut peptidin antomuodot ovat hyvåksyttåviå, mikåli ne ovat fysiologi-5 sesti hyvåksyttåviå.

Erityisen kiinnostavia koostumuksia, joihin fosfo-peptidit voidaan lisåtå, ovat purukumi, aamiaisruoat, jåå-telG ja muut jåådytetyt makeiset, leivokset, makeiset ja kakut.

10 Erityisen kiinnostavia ovat myGs hampaanpuhdistus- aineet, suunpesunesteet ja valmisteet paikallista levittå-mistå vårten hampaille.

Koska tåmån keksinnGn mukaisen koostumuksen, joka on vesipitoinen liuos, kåytGllå hampaiden pinnoille, jotka 15 ovat muodostuneet poistettaessa vaurioitunut aine olemassa olevista rei'istå tai murtumalla, on epåtodennåkGisesti pitkåaikainen vaikutus, on lisåksi yritetty valmistaa koostumuksia, joilla voi olla tåmå haluttu pitkåaikainen vaikutus.

20 Tåmån mukaisesti tåmån keksinnGn kohteena on myGs tåmån keksinnGn mukainen koostumus, joka on sovellettu py-symåån kosketuksessa hammaspinnan kanssa pitkitetty aika. Tåmå keksintO mahdollistaa myOs menetelmåt ja keinot tå-mån keksinnGn mukaisten koostumusten yllåpitåmiseksi kos-. 25 ketuksessa hampaan pinnan kanssa pitkitetyn ajanjakson ajan.

Tåhån viimeiseen nåhden, pitkitetty ajanjakso tuli-si tulkita sopusoinnussa haluttuun tehokkuuteen ja aikaan nåhden, joka tarvitaan saavuttamaan tåmå riittåvå tehok-30 kuus, jolla on arvoa. Kuitenkin, joissakin tapauksissa .. tåmå pitkitetty aika voi olla niin lyhyt kuin yksi påivå, mutta on edullisemmin viikkojen tai kuukausien jakso.

Erååsså mallissa koostumus on formuloitu, niin, ettfi se on sovellettu pysymåån paikoillaan pitkitetty 35 ajanjakso. Tåsså tapauksessa keksinnGn mukainen koostumus voi muodostaa osan hampaiden tåytekoostumuksesta.

5 92709

Tdman mukaisesti taman keksinnOn kohteena on myiis hampaiden taytekoostumus, joka sisaltaa keksinnOn mukaista fosfopeptidia, ja sita vårten sovellettu kannin, joka pi-taa koostumuksen hampaan pinnalla.

5 Tailainen hampaantaytekoosturnus voi sisaitaa ham- paantayttOaineita, jotka ovat sinansa tunnettuja, mukaan lukien amalgaamit ja kovettumiskykyiset polymeerit.

Erityisen kiinnostavia ovat hampaan taytekoostu-mukset, jotka sisåltavat kalsiumia. Kalsium on halutusti 10 kalsiumfosfaatin tai hydroksiapatiitin muodossa.

KeksinnOssa kaytettavat fosfopeptidit voidaan erot-taa monilla tavoilla, mutta fraktiointitekniikan kayttd on yleensa edulllsta.

Fosfopeptidit voidaan erottaa fraktioimalla, perus-15 tuen molekyylin kokoon tai ominaisvarauksiin. Johtuen pep-tidien ainutlaatuisesta negatiivisesta varaustiheydesta ja kyvysta muodostaa kaksiarvoisia ionikomplekseja, edullinen fraktiointimenetelmå on anioni-ioninvaihtokromatografia tai selektiivinen sakkauttaminen tai niiden molempien yh-20 distelma.

Seuraavat menetelmat kuvaavat erasta erotusmuotoa.

Erotusmenetelma I

Esimerkki fosfopeptideista ovat ne, jotka on val-mistettu uuttamalla trypsiinilia sarvikarjan maidon ka-. 25 seiini. Koko natriumkaseinaatin tai fraktioiden (alfa-s tai beeta), jotka on valmistettu selektiiviselia sakkaut-tamisella (Zittle, C.A. ja Custer J.H; J. Dairy Sci 46L 1183 - 1188, 1963) uutto suoritetaan kayttaen proteiini: trypsiinia suhteessa 50:1. 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 2,5 mM 30 NaCl 37 °C:ssa yksi tunti. Peptidit fraktioitiin kayttaen .. Pharmacia FPLC -systeemia Mono Q HR 5/5 pylvaassa ja eluoitiin NaCl-gradientilla; puskuri A 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 2,5 mM NaCl; puskuri B 20 mM Tris HC1 pH 8,0, 500 mM NaCl, gradientti 0 - 100 % puskuri B/30 min; vir-35 tausnopeus 1 ml/min. Fraktiot pestiin ja vakevOitiin kayt- 4

II

6 92709 •tåen Amicon Ultrafiltration Cell' iå UM05 suodattimella. Peptidit tunnistettiin kåyttåen Water Associates PICO-TAG aminohappoanalyysisysteemiå, kåyttåen fenyyli-isotiosya-naatti-aminohappojohtamista. Fosfaatti mååritettiin 5 Itaya'n ja Ui'n (Clin. Chim. Acta. 14:361-366, 1960) me- netelmållå. Peptidit sekvensoitiin (fosfaatin poiston jål- keen alkalisella fosfataasilla) kåyttSen manuaalista Edman-menetelmSå ja saadut PTH-aminohapot tunnistettiin kåyttåen kåånteisfaasi HPLC:tå Zorbax ODS pylvSSsså 25 x 10 0,46 cm (DuPont).

Seuraavat fosfopeptidit saatiin yksittaisesti nat-riumkaseinaatin trypsiiniuutolla kåyttåen edellå esitet-tyå menetelmåå.

TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu- 15 Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-

Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-

Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

20 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-

Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

LisSksi saatiin myds seuraavat peptidit: T6. Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-. 25 Met-Glu-Asp-Ile-Lys.

T7. Val-Pro-Gln-Leu-Gln-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Ala-

Glu-Glu-Arg.

T8. Thr-Val-Asp-Met-Glu-Pse-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-

Lys.

30 T9. Leu-Pth-Glu-Glu-Lys.

·. Peptidit TI, T6 ja T7 saatiin myds alfael-kaseinaa- tin (sisåltåen alfa8l'sen ja alfae0'n) TPCK-trypsiiniuutos-ta. Peptidi T2 saatiin myos beeta-kaseinaatin TPCK-tryp-siiniuutosta. Peptidit T3, T4, T5, T8 ja T9 saatiin my6s 35 alfae2-kaseinaatin (kåsittåen alfa62, alfae3, alfa„4 ja 7 92709 alfas6) TPCK-trypsiiniuutosta. Aminohapposymbolit ovat seuraavat: Pse-fosfoseriini, Ser-seriini, Pth-fosfotreo- niini, Thr-treoniini, Glu-glutamaatti, Asp-aspartaatti, Ala-alaniini, Asn-aspargiini, Gln-glutamiini, Gly-glysii-5 ni, Arg-arginiini, His-histidiini, Ile-isoleusiini, Leu-leusiini, Lys-lysiini, Met-metioniini, Pro-proliini, Tyr-tyrosiini, Val-valiini.

Erotusmenetelmfl II

Seuraava menetelma kuvaa yhta selektiivista sak-10 kauttamismallia.

Natriumkaseinaattiliuosta uutettiin trypsiinilia (50:1, kaseiini:trypsiini) yksi tunti 37 °C:ssa, samalla kun pH pidettiin 8,0:ssa lisååmaiia NaOH. HC1 (0,1 M) li-sattiin sitten liuokseen huoneen lampdtilassa pH-arvoon 15 4,7 ja aikaansaatu sakka poistettiin BaCl2 lisåttiin sa- kan yiapuolella olevaan liuokseen arvoon 0,25 % paino/ tilavuus, mita seurasi yhta suuri tilavuus absoluuttista etanolia ja saatu sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin kynunenesosaan alkuperaisesta tilavuudesta vet-20 ta (liukenemisen helpottamiseksi pH nostettiin NaOH:11a) ja liuos tehtiin happamaksi pH-arvoon 3,5 1 M HCl:lia. Yhta suuri tilavuus asetonia lisåttiin ja sakka poistettiin ja kuivattiin. Sakka liuotettiin sitten uudelleen H20:hon ja tehtiin happamaksi arvoon pH 2,0 lisaamaiia HC1.

, 25 Saatu sakka poistettiin ja hyiattiin ja sakan yiapuolella olevan liuoksen pH saadettiin takaisin 3,5:een NaOH:lla ja yhta suuri tilavuus asetonia lisåttiin. Saatu sakka kerat-tiin, liuotettiin uudelleen veteen ja H2S04 lisåttiin sak-kauttamaan BaS04, joka hyiattiin. Sitten sakan yiapuolella 30 oleva liuos dialysoitiin ja kylmakuivattiin tai sumutus- kuivattiin. Tålla menetelmaiia saatiin viiden fosfopepti- din seos.

Seuraavassa ovat saadut fosfopeptidit: TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-35 Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

8 92709 T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

5 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-

Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Asn-Ser-Lys.

Fosfopeptidien (T1:T2:T3:T4:T5) suhde lopullisessa valmisteessa riippuu lahtOaineesta ja hydrolyysiolosuh-10 teista. Natriumkaseinaatin uutto TPCK-trypsiinilia antaa enimmSkseen T2, joissa oli pienia maaria TI, T3 ja T4. Kuitenkin T2 osoittaa suurempaa epavakaisuutta kuin muut peptidit niin, etta voimakkaampi uutto, kuten tapahtuu joissakln kaupallisissa kaseiiniuutoissa, antaa valmis-15 teen, joka sisåltaa eninunåkseen Tl, jossa on pienia maaria T3 ja T4.

Mikaii tassa menetelmassa kaytetaan natriumkaseinaatin asemesta alfa-sl-kaseiinia, saadaan puhdasta Tl. Kun beeta-kaseiini on lahtOaineena, saadaan puhdasta T2.

20 Tavallisimpia aktiivisten peptidien sekvensseja on pentapeptidi Pse-Pse-Pse-Glu-Glu. Fosfaatti- ja karboksyy-liryhmien etaisyydet taman pentapeptidin beeta-konformaa-tiossa on esitetty kuviossa 1.

Fosfaattien ja karboksyylien 6,88 Angstrom:in etai-: 25 syys sallii spesifisen kiinnittymisen kalsiumatomeihin hydroksiapatiittikiteiden c-akselia pitkin. Tama penta-peptidisekvenssi tapahtuu peptideissa Tl - T4 ja tapahtuu modifioituna peptideissa T 5 - Pse-Pth-Pse-Glu-Glu, mita seuraa fosfoseriinin varovainen korvaaminen fosfotreonii-30 nilla.

;; Varovaiset substituutiot aktiivisessa sekvenssissa olisivat fosfoseriinin korvaaminen fosfotreoniinilla ja pienemmassa maarassa fosfotyrosiinilla tai fosfohistidii-nilia, vaikka fosfoseriini on edullinen. Toinen mahdolli-35 nen fosfoseriinin korvaaminen saattaisi olla glutamaatilla 9 92709 tai aspartaaatilla, mutta jaileen fosfoseriini on edulli-nen. Mahdollinen korvaaja glutamaatille on aspartaatti.

Aktiiviset peptidit voivat muodostaa komplekseja kalsiumfosfaatin ja mulden kaksiarvolsten metalli-ioni-5 suolojen kanssa. Yksi mooll TI sitoo 16 moolla CaHP04, niin etta 10 mg/ml Tl-liuosta pH 7,0:ssa vol liuottaa 60 mM CaHP04, muodostaen metastabiilin ylikyliastetyn liuoksen suhteessa kalsiumfosfaattiyhdisteisiin. Kun kloridi on vastaionina, 1 mooll TI sitoo ainoastaan 5 moolla Ca++, 10 joka sitoutuu ainoastaan seriinifosfaatteihin. Yhteen moo-liin TI, johon on sitoutunut 16 moolla CaHP04 (M.W. 4883) viitataan tåmSn jSlkeen kalsiumfosfaatti TI:nå. Kalsiumfosfaatin TI tårkeå kemiallinen ominaisuus on, ettå se yli 2 % paino/tilav. vesikoostumuksessa on tiksotrooppinen 15 geeli. TI - T5:n on osoitettu olevan potentiaalisesti ham-masmåtåå vastustavia aineita, kåyttåmaiia seuraavia koeme-netelmia:

Testi 1

Hydroksiapati itin liukenemi snopeuskoe 20 Tåma koe on jo kuvatun testimenetelman (Reynolds, E.C., Riley, P.F. ja Storey, E. Calcif. Tiss Int 34:s52 -s56, 1982) modifiointi. Taman kokeen tarkoituksena on maa-rittaa peptidien vaikutus hydroksiapatiitin liukenemiseen ja tassa suhteessa, koska hammaskiille koostuu suurelta : 25 osalta hydroksiapatiitista, on uskottu, etta voidaan teh-da hyOdyllisiå vertailuja.

Kaytettiin kahdesti tislattua, deionisoitua vetta (18 mega ohmia/cm). Puhtaat analyysireagenssikemikaalit saatiin Ajax Chemicals'ilta, Australia. Pallomainen hyd-30 roksiapatiitti ostettiin BDH’lta. Kromatografiapylvasta, ;; joka sisalsi 0,1 g hydroksiapatiittipalloja, kaytettiin kivennaisaineiden poistokokeessa. Tris 5 mM, pH 8,3, joka sisalsi 50 mM NaCl, kaytettiin pylvaan puskurina 20 °C:ssa ja sita pumpattiin pylvaan lapi nopeudella 0,1 ml/min. 35 Peptidiliuosta 0,1 mg/ml puskuria laskettiin pylvaåseen ja li 10 92709 0,2 ml:n fraktiot kerattiin sekå ennen peptidin kSyttdå etta sen jaikeen ja analysoitiin kokonaismaaraile kalsiu-mia, fosfaattia ja peptidia. Naista arvoista saatiin liu-kenemisnopeus (nmol kalsiumia tai fosfaattia/min) jokaista 5 0,2 ml:n fraktiota kohti.

Kaikki fosfopeptidit T1 - T5 vahensivat hydroksi-apatiittiliukoisuusnopeuden n. 32 %:lla.

Fosfopeptidien T6 - T9 havaittiin olevan huomatta-vasti tehottomampia.

10 Fluoridi ja fosfopeptidi T1 antoivat yhdistetyn pienentymisen hydroksiapatiitin liukoisuudessa (40 %:n alentuminen). Fosfopeptidi Tl aiheutti 50 % suuremman fluoriretention hydroksiapatiittipylvaassa.

Tåma tyό osoittaa, etta nama fosfopeptidit sitou-15 tuvat hydroksiapatiittiin ja vahentavat kivennåisaineiden liukenemisnopeutta ja parantavat fluoridin retentiota ki-teiseen sideaineeseen. Hydroksiapatiitin liukoisuuden pie-nentyminen oli suhteessa fosfoseriinipitoisuuteen ja etai-syyksiin peptidien vaiilia.

20 Testi 2

Suunsisainen plakkikoe

Fosfopeptidin Tl plakkiin kohdistuva vaikutus maa-ritettiin kayttaen Koulourides'in ja Ostrom'in suunsisai-sen plakkitestin (Caries Res. 10:442 - 482, 1976) muunnos-: 25 ta. Emalilevyt sijoitettiin siirrettavaan suunsisaiseen laitteeseen jaijittelemaan hampaiden vaiista tilaa. T3må tehtiin siirrettavan laitteen molemmille puolille (vasen ja oikea). Laitetta kulutettiin sallimaan plakin kasautu-minen hampaiden vaiista tilaa jaijittelevilia alueilla.

30 Kahdeksan kertaa paivassa laite poistettiin ja pantiin ;; 37 °C:n liuokseen. Liuos sisaisi 2 paino/ tilavuus-% sakka-

roosia, 2 paino/tilavuus-% glukoosia, 140 mM KC1, 20 mM NaCl pH:ssa 7,0. Kahdesti paivassa oikeanpuoleiset emalilevyt altistettiin liuokselle, joka sisaisi 1,8 paino/ti-35 lavuus-% kalsiumfosfaattia Tl 140 mM KCl:ssa, 20 mM

11 92709

NaCl:ss3 pH:ssa 7,0 samalla kun vasen puoll altistettiin alnoastaan suolaliuokselle. Kokeen paatyttya emalilevyt poistettiin. Plakkia otettiin laitteen molemmilta puolilta ja analysoitiin kalsiumfosfaatin, seriinifosfaatin ja pep-5 tidin Ti suhteen kSyttåen kilpailukykyista, kvantitatii-vista, entsyymisitoutunutta immunosorptiokoetta (ELISA) kayttaen monoklonaalista antipeptidi-Tl-vasta-ainetta.

Tama osoltti, etta plakki laitteen oikealla puo-lella, joka oli altistettu kahdesti paivassa peptidi-Tl-10 liuokselle, sisalsi peptidia vahintaan 0,4 % paino/plakin markapaino ja kalsiumfosfaatin pitoisuus oli kohonnut 2 - 4-kertaiseksi.

Tama tyO osoitti, etta peptidi TI on yhdistynyt plakkiin ja taten kohottanut plakin kalsium- ja fosfaat-15 tipitoisuutta. Tata yhdistymis- ja akkumuloitumismenetel-maa hammasplakissa voidaan kayttaa siirtamaan uudelleen kivennaisaineita ja antibakteerisia ioneja plakkiin ja kiilteeseen, esim. Ca, P04, FP03, Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe ja La.

20 Testi 3

Suun sisainen kivennaisaineiden lisaaminen

Kaytettiin suun sisaista laitetta, joka oli saman-lainen kuin edellisesså testimenetelmåssa, paitsi etta emalilevyt oli ennalta altistettu kivennaisaineita vahen- ° tavaile liuokselle, joka aiheutti kaksi pinnanalaista ki- vennaisaineen vahentymisesta aiheutunutta vauriota kussa-kin levyssa. Kivennaisaineita poistavassa liuoksessa oli 0,1 M laktaattipuskuria pH 5,0, joka sisalsi 500 mg/1 hydroksiapatiittia ja 1 % agaria. KoehenkilOt kayttivat , laitteita 10 paivaa. Kahdesti paivassa laitteet poistet- • tiin ja tippa kivennaisainetta lisaavaa liuosta pantiin emalilevyille laitteen oikealle puolelle. Emalilevyjen vasen puoli toimi kontrollina. 10 paivan kuluttua emalilevyt poistettiin, poikkileikattiin ja saatettiin mikrora-35 diografiaan. Kivennåisainemååra, joka oli kerrostunut ta- 12 92709 kaisin pinnanalaisiin vaurioikohtiin, m&åritettiin kSyt-tSen mikrodensitometria. KivennSisainetta liså&vS liuos, joka sisalsi 1,8 % paino/tilav. Tl-kalsiumfosfaattia, pH 7,0, palautti 57 % kivennaisainehaviOsta verrattuna ai-5 noastaan syljesta aiheutuneeseen 13 %:iin.

Testi 4

Plakin pH:n aleneminen

KoehenkilOt pidattaytyivat suun hygieniasta 3-5 paivaa, sen jaikeen seurasi yhden minuutin huuhtelu 10 5-%risella sakkaroosiliuoksella. Plakkinaytteet poistet- tiin ja pH mitattiin kayttaen yhden tipan menetelmaa. Noin viiden minuutin kuluttua pH putosi n. 5,0:aan. Kuitenkin, mikali koehenkilOt huuhtelivat liuoksella, joka sisalsi 1,8 % paino/tilav. Tl-kalsiumfosfaattia, pH 7,0, 15 mi-15 nuuttia ennen huuhtelua 5-%:isella sakkaroosiliuoksella, plakin pH ei pudonnut alle 6,7, mika osoittaa Tl-kalsium-fosfaatin huomattavaa pH-puskurointia.

Koska tarkkaa mekanismia, jolla fosfopeptidit osoittavat plakkia vastustavaa aktiivisuutta, ei tunneta, 20 jatkossa esitetaan seuraavat spekuloivat teoriat, mutta niita ei tulisi pitaa sitovina tai rajoittavina.

Fosfopeptidit voivat akkumuloitua plakkiin ja kiil-teeseen, puskuroida plakkihappoa, estaa kivennaisaineiden vahentymista hammaskiilteesta ja lisata kivennaisaineiden /· 25 lisaantymista. Fosfopeptidien pieni molekyylipaino saat-taa aiheuttaa lapitunkeutumista ja kasaantumista plakin ja kiilteen huokosissa. Fosfopeptidit, johtuen seriinifos-faattijaannOsten sopivasta vaiista, voivat sitoa hammas-kiilteen kivennaisaineita ja estaa kivennaisaineiden va-30 hentymista. Peptidit voivat myOs siirtaa kalsiumia ja fos-;; faattia (fluorifosfaattia modifioitaessa) plakkiin ja kiilteeseen, sopivassa muodossa mahdollisesti sallien spontaanin kivennaisaineiden lisaåntymisen. Fosfoseriini-jaanndkset voivat myOs puskuroida plakkihappoa. Fosfopep-35 tidi voi myOs siirtaa antibakteerisia metalli-ioneja, 13 92709 esim. Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe ja La plakkiin ja talla ta-valla silia on plakkla vastustava vaikutus. Metalli-ionit siirtyvat ensisijaisesti fosfopeptideissa, johtuen fosfo-seriinijaanndksista. Fosfopeptidit voivat sitoa plakkibak-5 teereita ja estaa sokerin hyvaksikaytdn.

Hakijat ovat formuloineet erilaisia koostumuksia tamån keksinndn mukaisesti seuraavassa. Yleensa koostu-mukset sisaitavat 0,01 - 10 paino-% fosfopeptidia.

Eslmerkkl 1 10 Jauho:

Laitteessa kuivien aineiden sekoittamiseksi, se-koitettiin 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia jauhon kanssa.

Esimerkki 2

Vilj avalmiste: 15 Aamiaisvilj avalmiste suihkutettiin liuoksella, j os sa oli Tl-kalsiumfosfaattia vedessa. Sitten viljahiutaleet kuivattiin antamaan lopputuote, joka sisalsi 1 % Tl-kalsiumfosfaattia .

Esimerkki 3 20 Leipa: 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia lisattiin jauhoon aineosien sekoittamisen aikana leivan valmistamiseksi.

Esimerkki 4

Kakkuj auhe: ' 25 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia lisattiin aineosiin kakkutaikinan valmistuksessa.

Esimerkki 5

Makeiset:

Makeisten valmistuksessa lisattiin 1 paino-% Tl-30 kalsiumfosfaattia lopulliseen seokseen.

Esimerkki 6

Keksi:

Valmistettaessa keksi/seos lisattiin 1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia muihin kuiviin aineosiin sekoituksen 35 aikana.

II

w 92709 14

Esimerkki 7 Virvoitusj uoma:

Valmistettiin virvoitusjuoma, johon oli liuotettu 0,1 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia.

5 Esimerkki 8

Tabletti:

Valmistettiin tabletti, joka sisSlsi 10 paino-% Tl-kalsiumfosfaattia yhdesså tåyteaineiden, jotka olivat ma-ku- ja sideaineita, kanssa.

10 Tavallisen hampaidenpuhdistusaineen valmistuksessa tåmån keksinnttn piirin mukaisesti tarvittava suola ja fos-fopeptidin valikoidut suolat yhdistetåSn hampaanpuhdistus-ainekoostumuksiin jollakin sopivalla tavalla riippuen sii-ta, onko valmistettu jauhe, tahna tai nestevalmiste. Tåtå 15 tarkoitusta vårten lisStåån tarkoituksenmukaisia valmis- teita, kuten pinta-aktiivisia aineita, sideaineita, maku-aineita ja muita tarvittavia téyteaineita hampaidenpuhdistusaineen tarvittavan muodon aikaansaamiseksi.

KeksintdS kuvataan viela seuraavien esimerkkien 20 avulla:

Esimerkki 9 Hammastahna:

Valmistettiin hammastahna, jolla oli seuraava koos- tumus: 25 Paino-%

Tl-kalsiumfosfaatti 5,0 CMC 7MF 1,0

Saccharin 450 0,2

Glyseriini (B.P.) 25,0 30 Natriumlauryylisulfaatti (Empicol 0919) 5,0

Natriumbentsoaatti 0,5

Makuaine 9/693090 0,8

Kalsiumfosfaatti 1,0 35 Deionisoitu vesi 39,5 92709 15

Thixosyl 33J 9,5

Syloid Al-1 12,0

Titanium Dioxide 3328 0,5

Esimerkki 10 5 Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkisså 9 on esitetty, toistettiin, mutta lisåttiin 0,2 % natriumfluoridia so-pivassa muodossa.

Esimerkki 11 10 Hammastahna:

Valmistaminen, kuten esimerkisså 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,4 %:n tinafluoridinlisåyksellå sopi-vassa muodossa.

Esimerkki 12 15 Hammastahna:

Valmistus, kuten esimerkisså 9 on esitetty, toistettiin, mutta 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia lisåttiin sopivassa muodossa.

Esimerkki 13 20 Hammasjauhe:

Tehtiin seuraava valmiste:

Tl-kalsiumfosfaatti 5,0 paino-% liukoinen sakkariini 0,1 paino-% våriaine pieni måårå 25 kaksiarvoinen kalsiumfosfaatti 94,1 paino-%

Esimerkki 14 Hammasjauhe:

Tehtiin valmiste, kuten esimerkisså 13 on esitetty, mutta lisåttiin 0,76 % mononatriumfluorifosfaattia sopi-30 vassa muodossa.

Esimerkki 15

Nestemåinen hampaidenpuhdistusaine:

Tehtiin valmiste, joka sisålsi: natriumalginaattia 1,4 paino-% 35 Tl-kalsiumfosfaattia 2,0 paino-%

II

16 92709 natriumlauryylisulfaattia 1,0 paino-% makuainetta pieni maara vSriainetta pieni maara vetta 95,5 paino-% 5 Esimerkki 16

Nestemainen hampaidenpuhdistusaine:

Kuten esimerkissa 15, mutta lisattiin 0,5 % natriumf luoridia .

Esimerkki 17 10 Suunpesuneste:

Tehtiin seuraava valmiste:

Tl-kalsiumfosfaatti 2,0 paino-% natriumfluoridi 0,5 paino-% makuaine pieni maara 15 variaine pieni maara vesi 97,5 paino-%

Esimerkki 18

Hiilihapotettu virvoitusjuoma: 0,1 paino-% kalsiumfosfopeptidia TI lisattiin kau-20 pallisesti saatavaan hiilihapotettuun virvoitusjuomaan. Esimerkki 19 Hedelmamehu: 0,1 paino-% Tl-kalsiumfosfopeptidia lisattiin kau-pallisesti saatavaan hedelmamehuun.

25 Esimerkki 20

Liuos kaytettavaksi paikallisesti hampaisiin: Tl-kalsiumfosfaatti 2 %

NaF 0,6 mM

Zn-asetaatti 0,1 mM

30 SrCl2 0,1 mM

(tama liuos voidaan muodostaa geeliksi lisaamaiia Tl-kal-siumfosfaatin maaraa).

17 92709

Esimerkki 21 Hampaiden tayteaine

Tl-kalsiumfosfaatti 5 % paino/palno kalsiumfosfaatti 95 % paino/palno 5 polymerointiainetta pieni maara

Tehdaan tahnaksi veden kanssa.

TSssa esimerkissa kaytetty polymerointiaine oli glutaraldehydi.

Esimerkki 22 10 Hampaiden tayteaine:

Tl-kalsiumfosfaatti 5 % paino/paino kalsiumfosfaatti 70 % akryylipolymeeri 25 % katalyytti polymeerille pieni maara 15 Esimerkki 23

Paikallinen geeli yliherkkien hampaiden hoitoon: Tl-kalsiumfosfaatti 4,0 paino-%

SrF2 1,0 paino-% maku- aine pieni maara 20 vesi 95 %

Edellisessa kaytettiin Tl-kalsiumfosfaattia kuvaamistar-koituksessa, mutta sen asemesta voidaan kayttaa mita ta-hansa tarkoituksenmukaista fosfopeptidia ja/tai suolaa.

Muunnokset ja sovellutukset voidaan tehda edelia 25 kuvattuun.

Η

Claims (20)

92709

1. Fosfopeptidi, tunnettu siita, etta sil-5 la on sekvenssi: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu- Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val- Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fosfopeptidi, tunnettu siita, etta se on hapon tai suolan muo-dossa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen fosfopeptidi, tunnettu siita, etta se on natriumsuolan muodossa.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen fos fopeptidi, tunnettu siita, etta se on oleellisesti puhtaassa muodossa.

5. Jonkin edeltåvistå patenttivaatimuksista mukainen fosfopeptidi, tunnettu siita, etta se on pe- 25 raisin kaseiinista, aB-kaseiinista, β-kaseiinista tai nii- den suolasta.

6. Menetelma jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen fosfopeptidin saamiseksi, tunnettu siita, etta fraktioidaan kaseiinin, as-kaseiinin, β-kaseiinin tai 30 niiden suolan uute.

7. Suunhuoltokoostumus, tunnettu siita, etta se sisaitaa yhden tai useamman jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen fosfopeptidin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, t u n- 35. e t t u siita, etta se sisaitaa kalsiumfosfaattia tai hydroksiapatiittia. 92709

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta se sisaitaa noin 16 moolia CaHP04 moolia kohti fosfopeptidia/fosfopeptideja.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen 5 koostumus, tunnettu siita, etta se lisaksi sisaitaa fysiologisesti hyvaksyttavan laimentimen.

10 Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser- Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; tai Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta laimennin on suun kautta otettava aine.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 7-11 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta se lisaksi sisai-taa yhta tai useampaa suolaa, joka sisaitaa kahdenarvoisia metalli-ioneja.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 7-12 mukainen 15 koostumus, tunnettu siita, etta se lisaksi sisaitaa yhta tai useampaa remineralisoivaa ja bakteerinvas-taista ionia.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta ionit on valittu seuraavista:

20 Ca, P04, FP03, Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe ja La.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 7-14 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta siina ei oleelli-sesti ole pahanmakuisia epapuhtauksia.

16. Jonkin patenttivaaimuksista 7 - 15 mukainen 25 koostumus, tunnettu siita, etta fosfopeptidia on lasna 0,01 - lO paino-%.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta fosfopeptidia on lasna 0,01 -5 paino-%.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta fosfopeptidia on lasna 0,01 -2 paino-%.

19. Jonkin patenttivaatimuksista 7-18 mukainen koostumus, tunnettu siita, etta se on hammastah-35 nan, hammasjauheen, hampaanpuhdistusaineen, suunpesunes- II 92709 teen, hampaan taytekoostumuksen tai hampaille paikallises-ti laitettavan valmisteen, liuoksen tai geelin muodossa.

20. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen yhden tai useamman fosfopeptidin k&yttO suunhuoltolisd-5 aineena elintarvikkeessa, makeisissa tai juomissa. 92709