DE3751652T2

DE3751652T2 - Phosphopeptide

Info

Publication number: DE3751652T2
Application number: DE3751652T
Authority: DE
Inventors: Eric Reynolds
Original assignee: VICTORIAN DAIRY IND; University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 1986-06-12
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2007-06-13
Also published as: FI92709B; JPH0776235B2; NO880589D0; HUT47309A; BR8707352A; EP0268663A1; DK70388D0; NO178665B; FI880629A0; NZ220673A; ATE132161T1; AU593365B2; DE3751652D1; NO178665C; CA1315480C; WO1987007615A1; JPS63503459A; DK70388A; DK173565B1; FI880629A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Phosphopeptide und eine phosphopeptidhaltige Masse.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Hemmung von Karies und Zahnfleischentzündungen.
Das U.S.-Patent 4 495 176 beschreibt die enzymatische Hydrolyse von Phosphocaseinaten, um Oligophosphopeptide herzustellen, die als Nahrungsmittel geeignet sind. West beschreibt im Journal of Dairy Research 44 (1977) auf S. 373-376 den Abbau von Casein durch Trypsin und insbesondere die Nachbehandlung mit Bromcyan. Alewood et al., Proc. of the 7th Amer. Peptide Symp.: Synthesis, Structure and Function, 1981, 5. 65-67, beschreibt ein aus Casein gewonnenes synthetisches Octaphosphopeptid. Die internationale Druckschrift Nr. WO82/03008 behandelt die Verwendung von Phosphoproteinen, z.B. Casein, Phosvitin oder Polyphosphoserin, zur Hemmung der Kariesbildung.
Die vorliegende Erfindung sieht eine Masse mit karieshemmender Wirkung vor, aufweisend ein oder mehrere Phosphopeptide von:
Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys;
Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse- Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;
Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile- Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys;
Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu- Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; und
Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys in Form einer Säure oder eines Salzes.
Das Phosphopeptid liegt vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form vor.
Die Phosphopeptide der vorliegenden Erfindung oder ihre Salze können bei der Behandlung oder Hemmung von (i) zahnerkrankungen, z.B. Karies, Zahnfleischentzündungen oder Erkrankungen der Zahnwurzelhaut, (ii) Knochenerkrankungen wie Osteoporose oder Osteomalazie und (iii) durch Mineralienmangel hervorgerufenen Krankheiten eingesetzt werden.
Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung eine Masse vor, die ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein Salz davon und ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.
Die Masse kann die Form einer pharmazeutischen Masse haben.
Die Masse kann oral einzunehmen sein.
Eine Mischung aus Phosphopeptiden und/oder ihren Salzen kann in der Masse verwendet werden.
Das Phosphopeptid oder die Phosphopeptidmischung sind vorzugsweise im wesentlichen rein, wenigstens in dem Ausmaß, daß sie frei von schlecht schmeckenden Verunreinigungen sind.
Die Symbole für die Aminosäuren sind: Pse = Phosphoserin, Ser = Serin, Pth = Phoshphothreonin, Thr = Threonin, Glu = Glutamat, Asp = Aspartat, Ala = Alanin, Asn = Asparagin, Gln = Glutamin, Gly = Glycin, Arg = Arginin, His = Histidin, Ile = Isoleucin, Leu = Leucin, Lys = Lysin, Met = Methionin, Pro = Prolin, Tyr = Tyrosin, Val = Valin.
Das Phosphopeptid kann synthetisch durch chemische Synthese oder gentechnisch hergestellt werden oder aus natürlich auftretendem Material extrahiert werden.
Aus Kostengründen ist es derzeit wirtschaftlicher, das Phosphopeptid aus Casein zu extrahieren, insbesondere aus Alpha-S-Casein oder Beta-Casein. Auch Phosvitin kann zur Gewinnung der Peptide verwendet werden. Außerdem können Phosphoproteine in Getreide, Nüssen und Gemüse, vor allem in Kleiehülsen oder -schalen verwendet werden, um das obige Peptid herzustellen. Dies gilt insbesondere für Reis-, Weizen-, Hafer-, Gersten- oder Roggenflocken. Sojabohnen und Fleisch enthalten Phosphoproteine, die für die Gewinnung des obigen Peptids verwendet werden können.
Casein und insbesondere Alpha-S-Casein oder Beta-Casein oder Salze davon, z.B. Natriumcaseinat, enthalten Polypeptide, die in einfachere Peptide aufgespalten werden können. Eine solche Aufspaltung kann durch Abbau erfolgen, der chemisch oder proteolytisch sein kann.
Casein wird derzeit vorzugsweise mit Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin, Papain, Theremolysin oder Pronase abgebaut. Von diesen wird Trypsin bevorzugt.
Das abgebaute Casein kann in die gewünschten Peptide und andere Peptide fraktioniert werden. Andere Peptide beeinträchtigen die Wirksamkeit nicht, einige dieser anderen Peptide haben jedoch einen unangenehmen Geschmack. Wenn also einige dieser anderen Peptide enthalten sein sollen, sind jene mit einem unangenehmen Geschmack vorzugsweise zu entfernen. Allgemein scheinen die anderen Peptide mit unangenehmem Geschmack hydrophob zu sein.
Folgende Peptide ergaben einen unangenehmen Geschmack:
1. Glu-Val-Leu-Asn
2. Asn-Glu-Asn-Leu-Leu
3. Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly
4. Leu-Arg-Phe
5. Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly-Lys
6. Leu-Arg-Leu
7. Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu-Phe
(Glu = Glutamat, Val = Valin, Leu = Leucin, Asn = Asparagin, Ala = Alanin, Pro = Prolin, Phe = Phenylalanin, Gln = Glutamin, Gly = Glycin, Arg = Arginin, Lys = Lysin, Tyr = Tyrosin)
Vorzugsweise verringert das Peptid die Auflösungsgeschwindigkeit von Hydroxylapatit unter den hierin definierten Testbedingungen um mindestens 15%.
Vorzugsweise verringert das Peptid die Auflösungsge schwindigkeit von Hydroxylapatit unter den hierin definierten Testbedingungen um mindestens 26%.
Vorzugsweise verringert das Peptid die Auflösungsgeschwindigkeit von Hydroxylapatit unter den hierin definierten Testbedingungen um mindestens 30%.
Vorzugsweise verringert das Peptid die Auflösungsgeschwindigkeit von Hydroxylapatit unter den hierin definierten Testbedingungen um mindestens 32%.
Vorzugsweise ist das Peptid zu ca. 0,01 bis 10 Gew.-% vorhanden.
Vorzugsweise ist das Peptid zu ca. 0,01 bis 5 Gew.-% vorhanden.
Vorzugsweise ist das Peptid zu ca. 0,01 bis 2 Gew.-% vorhanden.
Die erfindungsgemäße Masse kann in eßbarer Form sein&sub1; z.B. als Nahrungsmittel oder Konfekt, als Zahnputzmittel, Tablette oder pharmakologisch annehmbarer Träger oder als Lösung oder Suspension zur örtlichen Anwendung bei Zähnen oder Zahnfleischgewebe oder als Mundwasser. Andere Arten der Verabreichung des Peptids wären annehmbar, wenn sie physiologisch oder pharmakologisch annehmbar sind.
Von besonderem Interesse als Masse sind Kaugummi, Frühstücksnahrung, Eis und andere gefrorene Süßwaren, Konfekt, Bonbons und Kuchen, da diese bekanntermaßen Kariesprobleme verursachen. Ahnliches gilt für andere potentiell kariogene Nahrungsbestandteile.
Ebenfalls von besonderem Interesse sind Zahnputzmittel, Mundwässer und Präparate zur örtlichen Anwendung bei Zähnen und Zahnfleischgewebe sowie Darmkapseln zur Behandlung von Knochenerkrankungen und Mineralienmangel.
Ebenfalls von Interesse ist die erfindungsgemäße Masse für die Zahnbehandlung von Kavitäten. Diesbezüglich scheint es Beweise für die Remineralisierung beginnender Läsionen zu geben, die als Vorbedingung für eine Kavität angesehen werden. Es gibt auch Beweise, die darauf schließen lassen, daß das Auftragen einer erfindungsgemäßen Masse auf die Oberfläche von vorhandenen Kavitäten und von Zähnen, die durch Entfernung von Fäulnismaterial aus vorhandenen Kavitäten oder durch Fraktur erzeugt wurde, vorteilhaft ist.
Da das örtliche Auftragen einer erfindungsgemäßen Masse in Form einer wäßrigen Lösung auf die Oberfläche von vorhandenen Kavitäten oder von Zähnen, die durch Entfernung von Fäulnismaterial aus vorhandenen Kavitäten oder durch Fraktur erzeugt wurde, wahrscheinlich keine Langzeitwirkung hat, haben wir außerdem nach einer Masse gesucht, welche die gewünschte Langzeitwirkung haben könnte.
Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung auch eine erfindungsgemäße Masse vor, die über einen längeren Zeitraum mit der Zahnoberfläche in Kontakt bleibt. Die Erfindung sieht auch Verfahren und Mittel vor, um die Masse erfindungsgemäß über einen längeren Zeitraum mit der Zahnfläche in Kontakt zu halten.
Ein längerer Zeitraum sollte in diesem Zusammenhang je nach der gewünschten Wirkung und der Zeit interpretiert werden, die es dauert, um eine ausreichende Wirkung zu erzielen. In einigen Fällen kann dieser längere Zeitraum nur einen Tag dauern, vorzugsweise ist es jedoch ein Zeitraum von Wochen oder Monaten.
Bei einem Beispiel wird eine Zahnkavität mit einer erfindungsgemäßen Masse beschichtet, und die Kavität wird verschlossen, um zu verhindern, daß die Masse abgetragen wird. Ein solches Verschließen kann durch eine Abdeckung oder die Verwendung einer Zahnfüllmasse erfolgen.
Bei einem anderen Beispiel wird die Masse so zusammengesetzt, daß sie über einen längeren Zeitraum an ihrem Platz verbleibt. Bei diesem Beispiel kann die erfindungsgemäße Masse einen Teil einer Zahnfüllmasse bilden.
Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung auch eine Zahnfüllmasse vor, die ein Phosphopeptid wie oben definiert und einen Träger aufweist, durch den die Masse an einer Zahnfläche haftet.
Eine solche Zahnfüllmasse kann bekannte Zahnfüllmaterialien wie Amalgam und abbindbare Polymere enthalten.
Von besonderem Interesse ist eine Zahnfüllmasse, die Kalzium enthält. Das Kalzium liegt vorzugsweise in Form vom Kalziumphosphat oder Hydroxylapatit vor.
Die Phosphopeptide, die für die Erfindung verwendet werden, können auf verschiedenen Wegen extrahiert werden.
Der Einsatz einer Fraktionierungstechnik wird jedoch allgemein bevorzugt.
Die Phosphopeptide können durch Fraktionierung auf der Basis ihrer Molekulargröße oder ihrer Ladungseigenschaften gewonnen werden. Aufgrund der eindeutigen negativen Ladungsdichte und der Fähigkeit der Peptide, zweiwertige Metallionen abzusondern, ist das bevorzugte Fraktionierverfahren die Anionenaustauschchromatographie, die selektive Präzipitation oder eine Verbindung aus beiden.
Das folgende Verfahren veranschaulicht ein Extraktionsverfahren.

Extraktionsverfahren 1

Ein Beispiel für die Phosphopeptide sind die durch tryptischen Abbau von Kuhmilchcasein hergestellten Phosphopeptide. Der Abbau des gesamten Natriumcaseinats oder von Fraktionen (Alpha-S oder Beta), die durch selektive Präzipitation erzeugt wurden (Zittle, C.A. und Custer, J.H., J. Dairy Sci, 46L, S. 1183-1189, 1963) wird unter Verwendung von Protein und Trysin im Verhältnis 50:1 in 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0 und 2,5 mM NaCl bei 37ºC eine Stunde lang durchgeführt. Die Peptide wurden mit einem Pharmacia FPLC System mit einer Mono Q HR 5/5-Säule fraktioniert und mit einem NaCl-Gefälle eluiert; Puffer A 20 mM Tris-HCL mit einem pH-Wert von 8,0, 2,5 mM NaCl; Puffer B 20 mM Tris-HCl mit einem pH- Wert von 8,0, 500 mM NaCl, Gefälle 0-100% Puffer B/30 min; Fließgeschwindigkeit 1 ml/min. Die Fraktionen wurden gewaschen und in einer Amicon Ultrafiltrationszelle mit einem UMOS-Filter konzentriert. Die Peptide wurden auf dem Aminosäurenanalysesystem PICO-TAG von Water Associates durch Phenylisothiocyanat-Aminosäurederivatisierung identifiziert. Das Phosphat wurde nach dem Verfahren von Itaya und Ui (Olin. Chim. Acta, 14:361-366, 1960) gemessen. Die Peptide wurden (nach Entfernung des Phosphats durch Alkaliphosphatase) durch manuelle Edman- Degradation sequenziert, und die entstehenden PTH- Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Zorbax-ODS-Säule 25 x 0,46 cm (Dupont) identifiziert.
Die folgenden Phosphopeptide wurden individuell durch tryptischen Abbau von Natriumcaseinat nach dem obigen Verfahren gewonnen.
T1. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile- Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.
T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu- Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.
T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.
T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse- Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.
T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.
Zusätzlich wurden auch die folgenden Peptide gewonnen:
T6. Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met-Glu- Asp-Ile-Lys.
T7. Val-Pro-Gln-Leu-Gln-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Ala-Glu-Glu- Arg.
T8. Thr-Val-Asp-Met-Glu-Pse-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys.
T9. Leu-Pth-Glu-Glu-Lys.
Die Peptide T1, T6 und T7 wurden ebenfalls aus einem TPCK-tryptischen Abbauprodukt von AlphaS1-Caseinat (bestehend aus AlphaS1 und AlphaS0) gewonnen. Das Peptid T2 wurde ebenfalls aus einem TPCK-tryptischen Abbauprodukt von Beta-Caseinat gewonnen. Die Peptide T3, T4, T5, T8 und T9 wurden ebenfalls aus einem TPCK-tryptischen Abbauprodukt von AlphaS2-Caseinat (bestehend aus AlphaS2, AlphaS3, AlphaS4 und AlphaS6) gewonnen. Die Symbole für die Aminosäuren sind: Pse Phosphoserin, Ser Serin, Pth = Phosphothreonin, Thr = Threonin, Glu = Glutamat, Asp = Aspartat, Ala = Alanin, Asn = Asparagin, Gln = Glutamin, Gly = Glycin, Arg = Arginin, His = Histidin, Ile = Isoleucin, Leu = Leucin, Lys = Lysin, Met = Methionin, Pro = Prolin, Tyr = Tyrosin, Val Valin.

Extraktionsverfahren II

Das folgende Verfahren veranschaulicht eine Methode der selektiven Präzipitation.
Eine Natriumcaseinat-Lösung wurde mit Trypsin (Verhältnis Casein zu Trypsin 50:1) eine Stunde lang bei 37ºC abgebaut, wobei der pH-Wert durch Zugabe von NaOH bei 8,0 aufrechterhalten wurde. HCL (0,1 mM) wurde dann der Lösung bei Raumtemperatur zugegeben, bis der pH-Wert bei 4,7 lag, und das entstehende Präzipitat wurde entfernt. BaCl&sub2; wurde dem Überstand zu einem Anteil von 0,25% w/v zugegeben, gefolgt von einem gleichen Volumen reinem Ethanol, und das entstehende Präzipitat wurde entfernt und getrocknet. Das Präzipitat wurde in einem Zehntel des ursprünglichen Wasservolumens aufgelöst (um die Auflösung zu erleichtern, wurde der pH-Wert mit NAOH erhöht), und der pH-Wert der Lösung mit 1 M HCL auf 3,5 gesenkt. Ein gleiches Volumen Azeton wurde zugegeben und das Präzipitat entfernt und getrocknet. Das Präzipitat wurde dann in H&sub2;O erneut aufgelöst und der pH-Wert durch Zugabe von HCL auf 2,0 gesenkt. Das entstehende Präzipitat wurde entfernt und verworfen, der Überstand wurde mit NaOH wieder auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt, und ein gleiches Volumen Azeton wurde zugegeben. Das entstehende Präzipitat wurde gesammelt, in Wasser erneut aufgelöst, und H&sub2;SO&sub4; wurde zugegeben, um BaSO&sub4; auszufällen, das verworfen wurde. Der Überstand wurde dann dialysiert und lyophilisiert oder sprühgetrocknet. Mit diesem Verfahren wurde eine Mischung aus 5 Phosphopeptiden gewonnen.
Die folgenden Phosphopeptide wurden gewonnen:
T1. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile- Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.
T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.
T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile- Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.
T4 - Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse- Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.
T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Asn-Ser-Lys.
Das Verhältnis der Phosphopeptide (T1:T2:T3:T4:T5) im endgültigen Präparat hängt vom Ausgangsmaterial und den Hydrolysebedingungen ab. Durch Abbau von Natriumcaseinaten mit TPCK-Trypsin erhält man hauptsächlich T2 mit kleinen Mengen von Tl, T3 und T4. T2 ist jedoch labiler als die anderen Peptide, so daß ein rigoroserer Abbau als bei einigen handelsüblichen Caseinabbauprodukten zu einem Präparat führt, das hauptsächlich T1 und kleine Mengen T3 und T4 enthält.
Wird anstelle von Natriumcaseinat für dieses Verfahren Alpha-S1-Casein verwendet, wird reines T1 gewonnen. Mit Beta-Casein als Ausgangsmaterial wird reines T2 gewonnen.
Die üblichste Sequenz der aktiven Peptide ist das Pentapeptid Pse-Pse-Pse-Glu-Glu. Die Abstände der Phosphatund Carboxylgruppen in einer Beta-Anordnung dieses Pentapeptids sind in Fig. 1 dargestellt.
Die Abstände von Phosphaten und Carboxylen von 6,88 Angström ermöglichen die spezielle Anbindung an Kalziumatome entlang der C-Achse von Hydroxylapatitkristallen. Diese Pentapeptidsequenz tritt in den Peptiden T1 bis T4 auf und im Peptid T5 in abgewandelter Form - Pse-Pth- Pse-Glu-Glu, nach einer konservativen Substitution von Phosphoserin durch Phosphothreonin.
Konservative Substitutionen innerhalb der aktiven Sequenz wären Phosphothreonin und in einem geringeren Maße Phosphotryrosin oder Phosphohistidin für Phosphoserin, obwohl Phosphoserin vorzuziehen ist. Eine andere mögliche Substitution von Phosphoserin wäre Glutamat oder Aspartat, aber auch in diesem Fall ist Phosphoserin vorzuziehen. Eine mögliche Substitution von Glutamat ist Aspartat.
Die aktiven Peptide können Kalziumphosphat und andere Salze von zweiwertigen Metallionen absondern. 1 Mol T1 bindet 16 Mol CaHPO&sub4;, so daß eine Lösung von 10 mg/ml T1 mit einem pH-Wert von 7,0 60 InN CaHPO&sub4; lösen und eine metastabile übersättigte Lösung in bezug auf Kalziumphosphat herstellen kann. Mit Chlorid als Gegenion bindet 1 Mol T1 nur 5 Mol Ca&spplus;&spplus;, das sich nur an Serinphos phate bindet. 1 Mol Tl mit ca. 16 Mol gebundenem CAHPO&sub4; (M.W. 4883) wird nachfolgend als Kalziumphosphat T1 bezeichnet. Eine wichtige chemische Eigenschaft von Kalziumphosphat T1 ist, daß die Verbindung bei über 2% w/v in Wasser ein thixotropisches Gel ist. T1-T5 haben sich mit den folgenden Testverfahren als potentiell karieshemmend erwiesen:

Test 1. Geschwindigkeit der Auflösung von Hydroxylapatit

Dieser Test ist eine Abwandlung eines bereits beschriebenen Testverfahrens (Reynolds, E.C., Riley, P.F. und Storey, E., Calcif. Tiss. Int. 34: 552-556, 1982). Der Zweck dieses Tests ist die Bestimmung der Wirkung der Peptide auf die Auflösung von Hydroxylapatit. Diesbezüglich wird angenommen, daß sinnvolle Vergleiche angestellt werden können, da der Zahnschmelz weitgehend aus Hydroxylapatit besteht.
Zweifach destilliertes, entionisiertes Wasser (10 Megaohm/cm) wurde durchgehend verwendet. Von Ajax Chemicals, Australien, wurden analytische Chemikalien von Reagenziengüte bezogen. Hydroxylapatit in Kugelform wurde von BDH bezogen. Eine Chromatographiesäule mit 0,1 g Hydroxylapatitkügelchen wurde für den Entmineralisierungstest verwendet. Tris 5 mM mit einem pH-Wert von 8,3, das 50 mM NaCl enthielt, wurde als Säulenpuffer bei 20ºC verwendet und mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min durch die Säule gepumpt. Eine Peptidlösung mit 0,1 mg/ml Puffer wurde auf die Säule gegeben und Fraktionen von 0,2 ml wurden vor und nach der Peptidzugabe gesammelt und auf Kalzium-, Phosphat- und Peptidgehalt untersucht. Aus diesen Werten wurde eine Auflösungsge schwindigkeit (nmol Kalzium oder Phosphat pro Minute) für jede Fraktion von 0,2 ml berechnet.
Die Phosphopeptide T1-T5 erhöhten die Auflösungsgeschwindigkeit von Hydroxylapatit um ca. 32%.
Die Phosphopeptide T6-T9 erwiesen sich als wesentlich weniger wirksam.
Fluorid plus Phosphopeptid T1 ergab eine kombinierte Verringerung in der Auflösung von Hydroxylapatit (Verringerung um 40%). Das Phosphopeptid T1 ergab einen um 50% höhere Speicherung von Fluorid in der Hydroxylapatitsäule.
Dieser Test zeigt, daß sich diese Phosphopeptide an Hydroxylapatit binden, die Geschwindigkeit der Auflösung von Mineralien verringern und die Speicherung von Fluorid in der Kristallmatrix verbessern. Die verringerte Auflösung von Hydroxylapatit stand im Zusammenhang mit dem Gehalt an Phosphoserin und den Abständen innerhalb der Peptide.

Test 2. Intraoraler Kariestest

Die karieshemmende Wirkung von Phosphopeptid T1 wurde bestimmt, indem eine Abwandlung des intraoralen Kariestests von Koulourides und Ostrom (Caries Res. 10: 442-482, 1976) durchgeführt wurde. Zahnschmelzplatten wurden an beiden Seiten (links und rechts) in eine herausnehmbare intraorale Vorrichtung eingesetzt, um einen approximalen Bereich zu simulieren. Achtmal täglich wurde die Vorrichtung herausgenommen und in eine 37ºC warme Lösung gelegt. Die Lösung bestand aus 2% w/v Saccharose, 2% w/v Glukose, 140 mM KCL und 20 mM NaCl mit einem pH- Wert von 7,0. Zweimal täglich wurden die Zahnschmelzplatten auf der rechten Seite mit einer Lösung behandelt, die 1,8% w/v Kalziumphosphat T1 in 140 mM KCl und 20 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthielt, während die linke Seite nur mit Salzlösung behandelt wurde. Bei Beendigung des Experiments wurden die Zahnschmelzplatten herausgenommen, in Abschnitte unterteilt und einer Mikroradiographie sowie einer Mikrohärtemessung unterzogen. Die Mikroradiographie zeigte, daß die Platten, die nur mit der Zucker-Salz-Lösung behandelt worden waren (linke Seite), unter der Oberfläche kariesähnliche Läsionen aufwiesen. Die Platten, die zweimal täglich mit der Zucker-Salz-Lösung sowie der Lösung mit dem Peptid T1 behandelt worden waren, wiesen jedoch keine kariesähnlichen Veränderungen auf. Die Ergebnisse wurden durch die Mikrohärtemessung bestätigt. Auch Plaque wurde von beiden Seiten der Vorrichtung entnommen und mit einem konkurrenzfähigen, quantitativen, heterogenen Enzym Immunoassay (ELISA) auf Kalziumphosphat, Serinphosphat und das Peptid T1 analysiert, wobei monoklonale Antikörper gegen das Peptid T1 verwendet wurden.
Diese Analyse zeigte, daß die Plaque auf der rechten Seite der Vorrichtung, die zweimal täglich mit der Lösung aus dem Peptid T1 behandelt wurde, das Peptid zu einem Anteil von mindestens 0,4% w/wet wt enthielt und der Anteil an Kalziumphosphat sich um das 2- bis 4-fache erhöht hatte.
Dieser Test zeigt, daß das Peptid T1 in die Plaque eingebaut wird, dadurch den Anteil von Kalzium und Phosphat in der Plaque erhöht und so den Kariesprozeß hemmt. Dieses Verfahren von Einbau und Akkumulation in der Zahnplaque kann eingesetzt werden, um remineralisierende und antibakterielle Ionen in die Plaque und den Zahnschmelz zu transportieren, z.B. Ca, PO&sub4;, FPO&sub3;, Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe und La.

Test 3. Intraorale Remineralisierung

Eine der im vorherigen Testverfahren verwendeten ähnliche Vorrichtung wurde verwendet, mit dem Unterschied, daß die Zahnschmelzplatten zuvor mit einer entmineralisierenden Lösung behandelt wurden, wodurch in jeder Platte zwei Entmineralisierungsläsionen unter der Oberfläche erzeugt wurden. Die Entmineralisierungslösung bestand aus 0,1 M Laktatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0, der 500 mg/l Hydroxylapatit und 1% Agar enthielt. Die Vorrichtungen wurden von Versuchspersonen 10 Tage lang getragen. Zweimal täglich wurde die Vorrichtung herausgenommen und ein Tropfen Remineralisierungslösung auf die Zahnschmelzplatte auf der rechten Seite der Vorrichtung gegeben. Die Zahnschmelzplatten auf der linken Seite dienten als Kontrolle. Nach 10 Tagen wurden die Zahnschmelzplatten herausgenommen, in Abschnitte unterteilt und einer Mikroradiographie unterzogen. Die Mineralienmenge, die wieder in den Läsionen unter der Oberfläche abgelagert wurde, wurde durch Mikrodensometrie bestimmt. Die Remineralisierungslösung, die 1,8% w/v Kalziumphosphat T1 mit einem pH-Wert von 7,0 enthielt, führte zu einer Remineralisierung von 57%, im Vergleich zu 13% allein durch Speicheleinwirkung.

Test 4. Abfall des pH-Werts der Plaque

Die Testpersonen führten 3-5 Tage lang keine Zahnpflege durch und spülten dann 1 min lang mit einer 5%igen Saccharoselösung. Plaqueproben wurden entnommen, und der pH-Wert wurde mit der Ein-Tropfen-Technik gemessen. Nach ca. 5 min fiel der pH-Wert auf ca. 5,0. Wenn die Testpersonen jedoch 15 min vor dem Spülen mit der 5%igen Saccharoselösung mit einer Lösung spülten, die 1,8% w/v Kalziumphosphat T1 mit einem pH-Wert von 7,0 enthielt, fiel der pH-Wert der Plaque nicht unter 6,7, was zeigte, daß das Kalziumphosphat T1 den pH-Wert deutlich pufferte.
Obwohl der genaue Mechanismus, nach dem die Phosphopeptide karieshemmende Wirkung zeigen, nicht bekannt ist, wurden folgende spekulative Theorien aufgestellt, die jedoch nicht als bindend oder beschränkend angenommen werden sollen.
Möglicherweise akkumulieren die Phosphopeptide in der Plaque und im Zahnschmelz, puffern die Plaquesäure, verhindern die Entmineralisierung des Zahnschmelzes und verbessern die Remineralisierung. Das geringe Molekulargewicht der Phosphopeptide ermöglicht eventuell die Penetration und Akkumulation in Plaque- und Zahnschmelzporen. Die Phosphopeptide binden sich aufgrund des geeigneten Abstands von Serinphosphatrückständen möglicherweise an das Zahnschmelzmineral und verhindern die Entmineralisierung. Die Peptide transportieren eventuell auch Kalzium und Phosphat (bei Abwandlung Fluorphosphat) in geeigneter Form in die Plaque und den Zahnschmelz, wodurch möglicherweise eine spontane Remineralisierung ermöglicht wird. Die Phosphoserinrückstände puffern eventuell auch die Plaquesäure. Das Phosphopeptid transportiert möglicherweise auch antibakterielle Metallionen, z.B. Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe und La, in die Plaque und hemmt auf diesem Wege die Entwicklung von Plaque und Zahnfleischentzündungen. Die Metallionen werden hauptsächlich aufgrund von Phosphoserinrückständen von den Phosphopeptiden transportiert. Phosphopeptide binden sich möglicherweise an Plaquebakterien und hemmen die Verwertung von Zucker.
Die Fähigkeit dieser Peptide, Kalziumphosphat abzusondern, kann bei der Behandlung verschiedener Knochenerkrankungen genutzt werden. Diese Peptide können die Aufnahme von Kalzium, Phosphat und Eisen im Darm wesentlich erhöhen. Daher können pharmazeutische Träger (z.B. Darmkapseln) oder Nahrungsmittel, die Kalziumphosphat T1 und Eisenphosphat T1 enthalten, zur Behandlung von Osteoporose/Osteomalazie und Anämie verwendet werden.
Die Anmelder haben verschiedene Massen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung wie folgt zusammengesetzt. Allgemein enthalten die Massen zwischen 0,01 und 10 Gew.-% Phosphopeptid.
Beispiel 1. Mehl: In einer Vorrichtung zum Mischen trockener Substanzen wurde 1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 mit Mehl gemischt.
Beispiel 2. Getreide: Ein Frühstücksgetreide wurde mit einer Lösung aus Kalziumphosphat T1 in Wasser besprüht. Die Getreideflocken wurden dann getrocknet und ergaben ein Endprodukt mit 1% Kalziumphosphat T1.
Beispiel 3. Brot: 1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 wurde beim Mischen der Zutaten für die Herstellung von Brot dem Mehl zugegeben.
Beispiel 4. Kuchenmischung: 1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 wurde den trockenen Zutaten bei der Herstellung einer Kuchenmischung zugegeben.
Beispiel 5. Konfekt: Bei der Herstellung von Konfekt wurde der Endinischung 1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 zugegeben.
Beispiel 6. Kekse: Bei der Herstellung von Keksen wurde den anderen trockenen Zutaten beim Mischen 1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 zugegeben.
Beispiel 7. Getränke: Ein Getränk wurde hergestellt, in dem 0,1 Gew.-% Kalziumphosphat T1 aufgelöst wurde.
Beispiel 8. Tabletten: Eine Tablette wurde mit 10 Gew.- % Kalziumphosphat T1 und anderen Zutaten in Form von Aromastoffen und Bindemitteln hergestellt.
Bei der Herstellung eines üblichen Zahnputzmittels im Geltungsbereich dieser Erfindung werden das erforderliche Salz und Salze des gewählten Phosphopeptids auf beliebige geeignete Weise in eine Zahnputzmasse eingelagert, je nachdem, ob ein Pulver, eine Paste oder ein Flüssigpräparat hergestellt werden sollen. Zu diesem Zweck werden geeignete oberflächenaktive Wirkstoffe, Bindemittel, Aromastoffe und andere Zutaten zugegeben, die erforderlich sind, um die geforderte Art von Zahnputzmittel zu erzielen.
Die Erfindung wird außerdem durch folgende Beispiele veranschaulicht:
Beispiel 9. Zahnpaste: Eine Zahnpaste mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt:
Kalziumphosphat T1 5,0 Gew.-%
CMC 7MF 1,0 "
Saccharin 450 0,2 "
Glyzerin (B.P.) 25,0 "
Natriumlaurylsulfat (Empicol 0919) 5,0 "
Benzoesaures Natrium 0,5 "
Aroma 9/693090 0,8 "
Kalziumphosphat 1,0 "
Entionisiertes Wasser 39,5 "
Thixosyl 33J 9,5 "
Syloid AL-1 12,0 "
Titandioxid 3328 0,5 "
Beispiel 10. Zahnpaste: Ein Präparat gemäß Beispiel 9 wurde unter Zugabe von 0,2% Natriumfluorid in geeigneter Form wiederholt.
Beispiel 11. Zahnpaste: Ein Präparat gemäß Beispiel 9 wurde unter Zugabe von 0,4% Zinnfluorid in geeigneter Form wiederholt.
Beispiel 12. Zahnpaste: Ein Präparat gemäß Beispiel 9 wurde unter Zugabe von 0,76% Natriummonofluorphosphat in geeigneter Form wiederholt.
Beispiel 13. Zahnpulver: Folgendes Präparat wurde hergestellt:
Kalziumphosphat T1 5,0 Gew.-%
Lösliches Saccharin 0,1 "
Farbstoff Spuren
Dibasisches Kalziumphosphat 94,1 "
Beispiel 14. Zahnpulver: Ein Präparat gemäß Beispiel 13 wurde unter Zugabe von 0,76% Natriummonofluorphosphat in geeigneter Form hergestellt.
Beispiel 15. Flüssiges Zahnputzmittel: Ein Präparat wurde hergestellt aus:
Natriumalginat 1,4 Gew.-%
Kalziumphosphat T1 2,0 "
Natriumlaurylsulfat 1,
Geschmacksstoffe Spuren
Farbstoffe Spuren
Wasser 95,5 "
Beispiel 16. Flüssiges Zahnputzmittel: Wie in Beispiel 15, aber unter Zugabe von 0,5% Natriumfluorid.
Beispiel 17. Mundwasser: Folgendes Präparat wurde hergestellt:
Kalziumphosphat T1 2,0 Gew.-%
Natriumfluorid 0,5 "
Geschmackstoffe Spuren
Farbstoffe Spuren
Wasser 97,5 "
Beispiel 18. Kohlensäurehaltiges Getränk: 0,1 Gew.-% Kalziumphosphopeptid Tl wurden einem im Handel erhältlichen kohlensäurehaltigem Getränk zugesetzt.
Beispiel 19. Fruchtsaft: 0,1 Gew.-% Kalziumphosphopeptid T1 wurden einem im Handel erhältlichen Fruchtsaft zugesetzt.

Beispiel 20. Lösung zur örtlichen Anwendung bei Zähnen.

Kalziumphosphat Tl 2%
NaF 0,6 mM
Zinkazetat 0,1 mM
20 SrCl&sub2; 0,1 mM
(Diese Lösung kann in ein Gel umgewandelt werden, indem die Menge an Kalziumphosphat Tl erhöht wird.)

Beispiel 21. Zahnfüllmasse.

Kalziumphosphat T1 5% w/w
Kalziumphosphat 95% w/w
Polymerisationsstoff Spuren
Wird als Paste mit Wasser hergestellt.
Der in diesem Beispiel verwendete Polymerisationsstoff war Glutaraldehyd.

Beispiel 22. Zahnfüllmasse

Kalziumphosphat T1 5% w/w
Kalziumphosphat 70%
Acrylpolymer 25%
Katalysator für Polymer Spuren

Beispiel 23. Gel zur örtlichen Behandlung überempfindlicher Zähne.

Kalziumphosphat T1 4,0 Gew.-%
SrF&sub2; 1,0 Gew.-%
Aromastoffe Spuren
Wasser 95%
Bei diesem Präparat wurde Kalziumphosphat T1 zur Veranschaulichung verwendet, stattdessen können jedoch alle geeigneten Phosphopeptide und/oder Salze verwendet werden.

Claims

1. Eine Masse zur Verwendung bei der Hemmung von Karies, umfassend ein oder mehrere Phosphopeptide ausgewählt von:

T1: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu- Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys;

T2: Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile- Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;

T3: Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu- Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys;

T4: Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse- Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; und

T5: Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

2. Eine Masse mit karieshemmender Wirkung, umfassend ein oder mehrere Phosphopeptide ausgewählt von:

T1: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu- Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys:

T2: Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile- Val-Glu-Pse-Leu- Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg;

T5: Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys in der Form einer Säure oder eines Salzes aber nicht einschließlich einer Masse, die ein vollständiges tryptisches Abbauprodukt von Casein ist, unter der Voraussetzung, daß die Masse, falls das Phosphopeptid nur T1 umfaßt, nicht die Folge:

Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met- Glu-Asp-Ile-Lys umfaßt.

3. Eine Masse nach Anspruch 2, umfassend das Peptid:

T1: Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys sowie eines oder mehrere der Phosphopeptide:

T5: Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

4. eine Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei diese des weiteren ein zweiwertiges Metallsalz umfaßt.

5. eine Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei diese des weiteren ein Calciumphosphatsalz umfaßt.

6. Die Masse nach Anspruch 5, wobei diese etwa 16 Mol CaHPO&sub4; je Mol Phosphopeptid(e) umfaßt.

7. Die Masse nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das bzw. jedes Phosphopeptid in der Form eines Natriumsalzes vorliegt.

8. Die Masse nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei diese des weiteren Hydroxyapatit umfaßt.

9. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bzw. jedes Phosphopeptid in im wesentlichen reiner Form vorliegt.

10. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bzw. jedes Phosphopeptid von Casein, α-Casein, β- Casein oder einem Salz davon deriviert ist.

11. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei diese des weiteren ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel umfaßt.

12. Die Masse nach Anspruch 11, wobei das Verdünnungsmittel ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, ein oral einnehmbares Material oder ein verzehrbarer Stoff ist.

13. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei diese des weiteren ein oder mehrere remineralisierende und antibakterielle Ionen umfaßt.

14 Die Masse nach Anspruch 13, wobei die Ionen aus der Gruppe Ca, PO&sub4;, FPO&sub3;, Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe und La ausgewählt sind.

15. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei diese im wesentlichen von schlecht schmeckenden Verunreinigungen frei ist.

16. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Phosphopeptid (die Phosphopeptide) in einem Gewichtsanteil von 0,01 bis 10 % vorhanden ist (sind).

17. Die Masse nach Anspruch 16, wobei das Phosphopeptid (die Phosphopeptide) in einem Gewichtsanteil von 0,01 bis 5% vorhanden ist (sind).

18. Die Masse nach Anspruch 17, wobei das Phosphopeptid (die Phosphopeptide) in einem Gewichtsanteil von 0,01 bis 2 % vorhanden ist (sind).

19. Die Masse nach einem der vorstehenden Ansprüche in der Form eines Lebensmittels oder Konfekts; einer Zahnpaste, eines Zahnpulvers, eines Zahnputzmittels, eines Mundwassers, einer Zahnfüllmasse oder eines Präparats für örtliche Anwendung bei Zähnen oder Zahnfleischgewebe, einer Lösung oder eines Gels.