JPS63503459A - ホスホペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホペプチド 本発明は、ホスホペプチド（ｐｈＯｓｐｈＯｐｅｐｔ　１ｄｅｓ）および同一物 を含む組成物に関する。

本発明は、次の配列 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ ［但し、式中、Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥは、それぞれ独立にホスホセリン、ホス ホトレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸塩およびアス パラギン酸塩である。コを含む５〜３０のアミノ酸を有するホスホペプチドまた はその塩を提供する。

好ましいホスホペプチドは、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ独立にホスホセリン、ホ スホトレオニン、ホスホチロシンおよびホスホヒスチジンであり、ＤとＥがそれ ぞれ独立してホスホセリン、ホスホトレオニン、グルタミン酸塩およびアスパラ ギン酸塩である。

特に好ましいホスホペプチドは、Ａ、ＢおよびＣがホスホセリン、ＤとＥがグル タミン酸塩である。

ホスホペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態である。

本発明のホスホペプチドまたはその塩は、ｍカリエス、歯肉炎および歯周疾病等 の両性疾病、（ｉｉ）骨粗しよう症および骨軟化症等の骨箱薄化疾病および（ｉ ｉｉ）無機質吸収不良に関する疾病の処置または抑制に利用されるであろう。

従って、本発明は、本発明のペプチドまたはその塩および生理学的に許容される 希釈剤から成る組成物を提供する。

該組成物は、製薬組成物の形態であろう。

該組成物は、経口摂取できる。

ホスホペプチドおよび／またはその塩の混合物は、組成物として使用できる。こ の場合は、前記Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ配列を主に含むものが好ましい。

ホスホペプチドまたはホスホペプチド混合物は、少なくとも好ましくない不純物 を含まない程度まで、実質的に純粋であることが好ましい。

次のホスホペプチドは、本発明の組成物に有効であることが見い出された。

ＴＩ　、　Ｇｌｕ−Ｎｅｔ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｓｅ−１１ｅ− Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｕ−ｌ１ｅ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−＾ｓ ｎ−、Ｐｓｅ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ。

Ｔ２．　Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｐ ｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ｇｌ　ｕ−Ｐｓｅ−Ｌｅｕ− Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−３ｅｒ−Ｉ　ｌｅ−Ｔｈｒ− Ａｒｇ　。

Ｔ３．　Ａｓｎ−Ｔｈｒ−）１ｅｔ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｈｉ　５−Ｖａ　Ｉ　−Ｐｓ ｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−３ｅｒ−ｌ１ｅ−１１ｅ−Ｐｓｅ −Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ。

Ｔ４．＾５ｎ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−３ ｅｒ−１１ｅ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ− ＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ。

および Ｔ５．　Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｔｈ−Ｐｓｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ −Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｙｓ。

アミノ酸の記号を、次に示す。

Ｐｓｅ・・・ホスホセリン、Ｓｅｒ・・・セリン、ｐｔｈ・・・ホスホトレオニ ン、Ｔｈｒ・・・トレオニン、ＧＪｕ・・・グルタミン酸塩、　Ａｓｐ・・・ア スパラギン酸塩、Ａｌａ・・・アラニン、　Ａｓｎ・・・アスパラギン、Ｇｉｎ ・・・グルタミン、　Ｇｌｙ・・・グリシン、Ａｒｇ・・・アルギニン、　Ｈｉ ｓ・・・ヒスチジン、１１ｅ・・・イソロイシン、Ｌｅｕ・・・ロイシン、Ｌｙ ｓ・・・リシン、　Ｍｅｔ・・・メチオニン、Ｐｒｏ・・・プロリン、　Ｔｙｒ ・・・チロシン、Ｖａｌ・・・バリン。

ホスホペプチドは、化学合成法または遺伝子工学的方法により合成されまたは天 然物質から抽出される。

価格を尊重すると、ホスホペプチドをカゼイン、特にαＳ−カゼインまたはβ− カゼインから抽出することがより経済的であることが明らかである。同様に、ホ スビチンもペプチド源として使用できるであろう。さらに、穀粒、堅果そして野 菜、特にブランハスク（Ｂｒａｎ　ｈｕｓｋ）または葉鞘中のリンタンパク質は 、前記ペプチドの生産用に使用し得る。特に、米穀、小麦、カラスムギ、大麦ま たはライ麦が好ましい。大豆と肉は、前記ペプチドを得るために使用されるリン タンパク質を含む。

カゼイン、特にαＳ−カゼインまたはβ−カゼインまたはカゼイン酸ナトリウム のようなそれらの塩は、単純ペプチドに開裂し得るポリペプチドを含む。かかる 開裂は消化により行なわれ、そのような消化は、化学的またはタンパク質加水分 解性であろう。

カゼインをトリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、サーモリシン（ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）またはフロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）のいずれか１種 で消化することが好ましいことは明らかである。これらのなかでトリプシンが好 ましい。

消化カゼインは、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ配列を含むペプチドと他のペプチドに分別 し得る。しかしながら、前記他のペプチドは効能に対しては害はないが、なかに はいやな味を有するものがあり、前記他のペプチドが含まれているならば、いや な味を有するものを除去することが好ましい。

−ｍに、それらの中のいやな味を有するものは疎水性を有するものだろう。

次のペプチドは、いやな味を有することが見い出された。

１、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ ２、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ３、ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙａ、ｔｅｕ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ ５、　Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇ 　ｌ　ｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ６、　Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅ ｕ ？、　Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｇ　１　ｕ−グルタ ミンＭＩｉ塩、Ｖａｌ−バリン、Ｌｅｕ−Ｄイシン、Ａｓｎ−アスパラギン、Ａ ｌａ−アラニン、Ｐｒｏ−プロリン、Ｐｈｅ−フェニルアラニン、Ｇｌｎ−グル タミン、Ｇｌｙ−グリシン、Ａ　ｒ’ｇ−アルギニン、Ｌｙｓ−リシン、Ｔｙｒ −チロシン） 好ましくは、ペプチドは、ここで規定する条件に基づいて少なくとも１５％の水 酸化リン灰石溶解度減少性を示すものである。

好ましくは、ペプチドは、ここで規定する条件に基づいて少なくとも２６％の水 酸化リン灰石溶解度減少性を示すものである。

好ましくは、ペプチドは、ここで規定する条件に基づいて少なくとも３０％の水 酸化リン灰石溶解度減少性を示すものである。

好ましくは、ペプチドは、ここで規定する条件に基づいて少なくとも３２％の水 酸化リン灰石溶解度減少性を示すものである。

好ましくは、ペプチドは、０．０１〜１０重量％存在する。

好ましくは、ペプチドは、０゜０１〜５重量％存在する。

好ましくは、ペプチドは、０．０１〜２重量％存在する。

本発明の組成物は、栄養素またはキャンディ等の食料品、歯みがき、錠剤等の形 態であり、歯、歯肉組織に局所適用用の薬学上許容できるビヒクルまたは懸濁液 またはマウスウォッシュを含有する。ペプチドを投与する他のモードは、生理学 的または薬学上許容できるならば、許容されるであろう。

特に興味ある組成物としては、チューインガム、朝食用食料、アイスクリームお よび他の冷凍菓子があり、組成物としての菓子、甘い物およびケーキは、カリエ ス問題物質として知られている。同様な考慮は他の潜在的なう食原性食品組成物 に適用される。

同様に、特に興味があるのは、歯みがき、マウスウォッシュ、および歯と歯肉組 織に局所的に適用される製剤、および骨の病気と無機質非吸収用の処置用腸カプ セルである。

同様に、興味あるのは、窩洞の歯科処置に関する本発明の組成物の使用法である 。最後の点に関して、予め窩洞状態であると考えられる初期病変の再鉱化を立証 するであろう。しかしながら、実際の窩洞表面および実際の窩洞から朽ちた物質 を除きまたは破砕により生じた歯の表面に本発明の組成物を適用することが、有 益であることを示す証拠もある。

水溶液である本発明の組成物の実際の窩洞表面または実際の窩洞から朽ちた物質 を除きまたは破砕により生じた歯ので、さらに我々は所定の長期効果を有する組 成物を提供することを考えた。

従って、同様に、本発明は、本発明のおよび長期にわたり歯の表面に接触してと どまることに適する組成物を提供する。同様に、本発明は、本発明の組成物を長 期間にわたり歯の表面に接触させておく方法および手段を提供する。

最後の点に関して、長期間とは、所定効果および価値ある効果を充分に達成する 時間と一致すべきである。しかしながら、例えば、長期間が１日と同程度に短い であるかもしないが、１′Ａ間または一ヶ月という期間がさらに好ましい。

ある場合には、歯の窩洞は、本発明の組成物で被覆され、その窩洞は組成物の逃 散を制限するように閉塞させられる。

かかる閉塞は、キツスをすること、または歯科用窩洞充填組成物により行なわれ る。

他のある場合には、組成物は、調製できるので長期間その場所に適合してとどま る。この場合には、本発明組成物は、１！ｒ科川充填剤の一部を形成する。

従って、本発明は、前に定義されたＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ式のホスホペプチドおよ び歯の表面に該組成物を付着することに適するキャリヤーからなる歯科用充填組 成物をも提供する。

かかる歯科充填組成物は、アマルガムおよび硬化ポリマーを含むそれ自体で歯科 用充填剤として知られているものを含む。

特に、カルシウムを含む歯科用充填組成物に興味があるる。カルシウムは、リン 酸カルシウムまたは水酸化リン灰石の形態が好ましい。

本発明に使用されるホスホペプチドは、多くの方法で抽出できるが、分別技術を 使用することが一般に好ましい。

ホスホペプチドは、分子径または電荷特性に基づく分別法により抽出される。独 特の負電荷密度と活性配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅにより与えられるペプチドの二価 金属イオン分離能力のために、好適な分別法は、アニオン交換クロマトグラフィ ーまたは選択沈降法または両者の組合せである。

次の方法は、抽出の１モードを示す。

抽出法工 あるホスホペプチドは、牛乳カゼインのトリプシン消化により生じたものである 。全カゼイン酸ナトリウムまたは選択沈降法［ジットレ、シー、エイ、とクスタ ー　ジエイ。

エイチ、ジャーナル　オブ　ディリー　サイエンス　４８［１１８３−１１８９ 頁、１９６３年　（Ｚｉｔｔｌｅ、Ｃ，へ、ａｎｄ　Ｃ１，１Ｓｔｅｒ　Ｊ、ｌ （、−Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ　４８Ｌ　１１８３−１１８９．１９６３）］ により生じた分画の消化は、３７℃で１時間、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣΩ、ｐ Ｈ８，０２，５ｍＨＮａＣΩ中でタンパク質とトリプシン（比率５０：１）を使 用して行なわれる。ペプチドを、モノＱ　ＨＲｆ５１５カラムを有するファーマ シア（ｐｈｅｒｍａｃｉａ）ＦＰＬＣを用いて分別し、ＮａＣＱグラジェントで 溶出した。ここで、 バッファーＡ　：　２０ｍ）（）リスＨＣＱ　ｐＨ８，ｏ、　２．５ｍ１（Ｎａ ＣΩ。

バッファーＢ：２０ｍＨトリスＨＣＱ　ｐｔｔａ、ｏ、　５００ｍＨＮａＣΩ。

グラジェント０−１００％；バッファーＢ７３０分流　速　；　１ｍｌ／分であ る。

分画を洗浄し、ＵＭＯ５フィルターを有するアミコン　ウルトラフィルトレージ ａ７　セル（Ａｍｉｃｏｎυ＋ｔｒａｍｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｅ１ｌ）で濃縮した 。そのペプチドを、フエニリソチオシアネート　アミノ酸誘導体を用いるウォー ター　アソシエーツ　ＰＩＣＯ−ＴＡＧアミノ酸分析システムを使用して同定し た。リン酸塩をイタヤとライ（（Ｉｔａｙａ　ａｎｄ　ｔｌｉ）［クリニカ　ケ ミ力　アクタ　１４巻、３６１−３６６頁、　１９６０年（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉ ｍ、　Ａｃｔａ、　１４；　３６１−３６６、１９６０）コの方法で測定した。

ペプチド（アルカリ性フォスファターゼて′リン酸塩を除去後）を、マニュアル 　エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解を使用して配列化し、得られるＰＴＨアミノ酸を 逆相ＨＰＬＣ（シーパックスＯＤＳカラム２５×０．４６■）（デュポン社製） で同定した。

次のホスホペプチドを、上記方法によりカゼイン酸ナトリウムのトリプシン消化 により独立して得た。

Ｔ１．Ｇｌｕ−Ｎｅｔ−Ｇｌｕ−八１ａ−Ｂｔｕ−Ｐｓｅ−１１ｅ−Ｐ−ｓｅ− Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−（１１１ｕ−ＩＩｅ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｓ ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ。

Ｔ２．Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾５ｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｖａｔ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｓｅ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ −Ｐｓｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｕ−３ｅｒ−Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　。

Ｔ３．　Ａｓｎ−Ｔｈｒ−１（ｅｔ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｈｉ　５−Ｖａ　ｌ　−Ｐｓ ｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−３ｅｒ−１１ｅ−１１ｅ−Ｐｓｅ −Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ。

Ｔ４．＾５ｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ −３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｙ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐ ｓｅ−＾１ａ−ＧＩＬＩ−Ｖａｔ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ− Ｌｙｓ。

Ｔ５　、　Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｔｈ−Ｐｓｅ−Ｇ　ｌ　 ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｙｓ。

加えて、次のペプチドも同様に得た。

丁６．Ａｓｐ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ−丁ｈｒ−Ｇｌｕ− Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＧＩＵ−ＡＳＩ）−１１ｅ−Ｌｙｓ。

Ｔ７．Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ ５ｎ−Ｐｓｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＧＩＬＩ−ＡｒＣ１゜ Ｔ８．　Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ｎｅｔ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｓｅ−Ｔｈｒ−Ｇ 　１ｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ。

Ｔ９．　Ｌｅｕ−Ｐｔｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ。

ペプチドＴ１．Ｔ６およびＴ７も同様に、αＳ１−カゼイン酸塩（αｓ１とαｓ ｏを含む）のＴＰＣＫ）リブシン消化から得た。ペプチドＴ２も同様に、α−カ ゼイン酸塩のＴＰＣＫ）リブシン消化から得た。ペプチドＴ３．Ｔ４．Ｔ５゜Ｔ ８およびＴ９も同様に、αｓ２−カゼイン酸塩（αｓ２＋　αｇ３．αｓ４およ びαｓ６を含む）のＴＰＣＫ　トリプシン消化から得た。アミノ酸記号を、次に 示す。Ｐｓｅ−ホスホセリン、５ｅｒ−セリン、ｐｔｈ−ホスホトレオニン、Ｔ ｈｒ−トレオニン、Ｇｌｕ−グルタミン酸塩、Ａｓｐ−アスパラギン酸塩、Ａｌ ａ−アラニン、Ａｓｎ−アスパラギン、Ｇｌｎ−グルタミン、Ｇｌｙ−グリシン 、Ａ　ｒ　ｇ−フルギニン、Ｈｉｓ−ヒスチジン、ｌ１ｅ−イソロイシン、Ｌｅ ｕ−ロイシン、Ｌｙｓ−リシン、Ｍｅｔ−メチオニン、Ｐｒｏ−プロリン、Ｔｙ ｒ−チロシン、Ｖａｌ−バリン。

抽出法’ＩＴ 次の方法は、選択沈降法の１モードを示す。

カゼイン酸ナトリウムを、ＮａＯＨを加えてｐＨを８゜０に保持して３７℃で１ 時間トリプシン（５０：　１、カゼイン：トリプシン）で消化した。その後、Ｈ Ｃｐ（０，１Ｍ）を室温で溶液に加えてｐＨ４，７として生成する沈降物を除い た。ＢａＣρ２を０．２５％　ｗ／ｖレベルまで上澄液に加え、その後同量の無 水エタノールを加え、生ずる沈降物を除いて乾燥した。沈降物を、水の初期容量 の１／１０（溶解を促進するために、ＮａＯＨ″ｃｐＨをあげた）溶解し、その 溶液をＩＭＨＣΩでｐＨ３，５とした。同量のアセトンを加え、沈降物を除去し て乾燥した。その沈降物を、Ｈ２０に溶解し、ＨＣｐを加えてｐＨ２，０とした 。

生ずる。沈降物を除いて廃棄し、上澄液をＮａＯＨでｐＨ３゜５に戻し、同量の アセトンを加えた。生ずる沈降物を補集し、水に再溶解し、Ｈ２ｓｏ、、を加え てＢａＳＯ４を沈降させ、そのＢ　ａ　Ｓ　０４を廃棄する。上澄液をその後、 透析し、凍結乾燥またはスプレードライヤーにかけた。５のホスホペプチド混合 物をこの方法で得た。

次に得られたホスホペプチドを示す。

丁１．ＧＩｕ−Ｎｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＧＩｕ−Ｐｓｅ−Ｉ　１ｅ−Ｐｓｅ− Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｃｌｕ−Ｇｌｕ−ＩＩｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｓｅ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ。

■２．Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｖａ　Ｉ　−ＧＩｕ−Ｐｓｅ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ− Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−１１ｅ−丁ｈｒ−Ａｒｇ。

丁３．ＡＳｎ−丁ｈｒ−）１ｅｔ−Ｇｌｕ−旧５−Ｖａｌ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐ ｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−１１ｅ−１１ｅ−ＰＳｅ−Ｇｌｎ−ＧＩＵ−丁 ｈｒ−丁ｙｒ−ｔｙｓ。

Ｔ４．Ａｓｎ−八１ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−丁ｙｒ−３ｅｒ−Ｉ 　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−丁ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ。

丁５．Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｔｈ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−３ ｅｒ−Ｌｙｓ。

最終製剤中のホスホペプチド（Ｔｌ、Ｔ２．Ｔ３．Ｔ４゜Ｔ５）の比率は、出発 原料および加水分解の条件による。

カゼイン酸ナトリウムをＴＰＣＫトリプシンで消化すると、主にＴ２と少量のＴ ｌ、Ｔ３およびＴ４を生ずる。しがしながら、Ｔ２が他のペプチドよりもより不 安定であるので、ある商業的規模の消化で生ずるより過酷な消化では、主ににＴ １と少量のＴ３およびＴ４を含む生成物を生ずる。

カゼイン酸ナトリウムの代りにαｓ１　１）ゼインがこの方法で使用されると、 純粋なＴ１が得られる。β−カゼインを出発物質として用いると、純粋なＴ２が 得られる。

活性ペプチドの最も一般的な配列は、ペンタペプチドＰｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ− Ｇｌｕ−Ｇｌｕである。このペンタペプチドのβ−立体配座における、リン酸塩 とカルボキシ基との間隔を第１図に示す。

リン酸塩とカルボキシ基の６．８８人の間′隔は、水酸化リン灰石結晶のＣ軸に 沿うカルシウムに特殊な付着を認める。このペンタペプチド配列は、ペプチドＴ １〜Ｔ４において生じ、ペプチドＴ５−Ｐｓｅ−Ｐｔｈ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｕにおいて修飾されて表われ、そしてホスホセリンの代りにホスホトレオニンの 保存的置換が続く。

活性配列内保存的置換基は、ホスホトレオニンと、ホスホセリンが好ましいが、 少なくとホスホセリン代用ホスホトリロジンまたはホスホヒスチジンであろう。

ホスホセリンに代る他の可能な置換基は、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸 塩であろうが、やはりホスホセリンが好ましい。

グルタミン酸塩の好適な置換基は、アスパラギン酸塩である。

活性ペプチドは、リン酸カルシウムと他の二価金属イオンの塩類を分離する。１ モルのＴ１は、１６モルのＣａＨＰＯ４と結合するので、ｐＨ７，０においてｌ 　Ｑ　ｍｇ　／　ｍｌのＴ１溶液は、６０ｍＭ　ＣａＨＰＯｓを溶解してリン酸 カルシウム種の準安定過飽和溶液を生ずる。計数（ｃｏｕｎｔｅｒ）イオンとし て塩素を含むと、１モルのＴ１は、５モルのＣａ＋＋どのみ結合してリン酸セリ ンとのみ結合する。１モルのＴ１と約１６モルのＣａ　ＨＰ　Ｏ４結合（分子量 ４８８３）は、この後リン酸カルシウムＴ１として引用される。リン酸カルシウ ムＴ１の重要な化学的特徴は、水中で２％　Ｗ／Ｖ以上においてその組成物がチ キソトロピー性ゲルであるということである。Ｔ１〜Ｔ５は、次の試験方法を使 用して潜在的に抗う食原性であることが示された。

”Ｋ９ｊｌ　水酸化リン灰石溶解度検定法この試験は、すでに記載された試験法 を修正したものであるしレイノルズ、イー、シー、リレイ、ピー、エフ、アンド 　ストレイ、イー、　カルシフ、　ティス　インド３４巻、　５５２−３５６１ ９８２年（ＲｅｙｎＯｌｄＳ、　Ｅ、Ｃ，、Ｒ１１ｅｙ、　Ｐ、Ｆ、　ａｎｄ　 ５ｔｏｒｅｙ、　Ｅ、　Ｃａ１ｃｉｆ、　Ｔｉ５ｓ　Ｉｎｔ　３４：　５５２− ｓ５６．１９８２）］。

この試試験法は、水酸化リン灰石溶解に関してペプチドの効果を測定するための ものであり、この点に関して歯のエナメルは大部分が水酸化リン灰石から成って いるので有効な比較が成し得るものと考えられる。

二度蒸留した脱イオン水（１８メガオーム／ａｎ）を、初めから終りまで使用し た。分析試薬グレードの薬品をアジャックス　ケミカルズ（Ａｊａｘ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ、　ＡＵＳｔｒａｌｉａ）から得た。水酸化リン灰石−スフェリオダ ール（５ｐｈｅｒ　ｉ　ｏｄａ　Ｉ　）をビーディーエイチ（ＢＤＨ）か９Ｊｌ ｔ入した。０．１ｇ−の水酸化リン灰石ビーズを含有するクロマトグラフィー用 カラムを脱無機物検定法に使用した。５０ｍＭ　ＮａＣｆ１含有トリス５ｍＭ　 （ｐＨ８，３）を２０℃においてカラムバッファーとして使用し、０１１ｍ１／ 分の速度でポンプを使ってカラムに流した。バッファー１　ｍｌに０．１■のペ プチドを含む溶液をカラムに適用し、ペプチドの適用前後に０゜２ｍ１の分画を 集め、全カルシウム、リン酸塩およびペプチドを検定しな。これらの分析値から 各０．２ｍ１分画の溶解度（１分あたりのカルシウムまたはリン酸塩、単位ｎモ ル）を得た。

ホスホペプチドＴ１〜Ｔ５の全ては、水酸化リン灰石溶解度を約３２％減少させ た。

ホスホペプチドＴ６〜Ｔ９は、余り効果的でないことが見い出された。

フッ素とホスホペプチドＴ１は、結合して水酸化リン灰石の溶解度を減少した（ ４０％減少）、このホスホペプチドＴ１は、水酸化リン灰石カラムに５０％以上 のフッ素を保有させた。

この研究において、これらのホスホペプチドが水酸化リン灰石に結合し、無機質 溶解度を減少して結晶マトリックスにおけるフッ素の保有を高めることが示され る。水酸化リン灰石溶解度の減少は、ホスホセリン含量とペプチド内間隙に関連 した。

拭　＠　２　口内カリエス試験 ホスホペプチドＴ１の抗う食原性は、コーローリデスとオストロム（にｏｕｌｏ ｕｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｏｓｔｒｏｍ）　ノロ内カリエス試験［カリエス　リサ ーチ１０巻、４４２〜４８２頁、１９７６年（ＣａｒｉｅＳ　ＲｅＳ、　１０： 　４４２−４８２．１９７６］の修正法を使用して測定した。エナメル平板を移 動可能な口内器具に挿入し、密着域をシミイレートした。このことは、移動可能 な器具の両側面で行なわれたく左と右）。その器具を装着し、シミイレート化密 着域におけるプラーク（ｐｌａｑｕｅ）集積を行なった。

１日に８回、その器具を取りはずして３７℃の溶液に投入した。その溶液は、ｐ Ｈ７，０であり、２％　ｗ／ｖのショ糖、２％　ｗ／ｖのグルコース、１４０ｍ ＭのＫＣＱ。

２０ｍＭのＮａＣΩがらなっていた。１日に２回、右側エナメル平板をｐＨ７， ０で、１４０ｍＭのＫＣＱと２０ｍＭのＮａＣΩ中の１．８％　Ｗ／Ｖリン酸カ ルシウムＴ１含有溶液にさらし、一方布側は、塩溶液のみにさらした。

実＃！終了後、エナメル平板を除き、切断し、微小Ｘ線撮影および微小強度試験 を行なった。微小Ｘ線撮影では、糖基溶液（左１１）にさらされたエナメル平板 は表面下方にカリエス様傷害を有することが示さｈｆ：。しかしながら、１日に ２回糖塩溶液とペプチドＴ１溶液にさらさｈたエナメル平板は、カリエス様変化 を示さなかった。これらの結果は、微小強度分析により確認された。プラークは 、その器具の両側から同様に採られ、モノクローナル抗ペプチドＴ１抗体を利用 する競争、定量エリザ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎ。

５ｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ、　ＥＬＩＳＡ）を使用してリン酸カルシウム、リ ン酸セリンおよびペプチドＴ１の分析に使用された。

このことはペプチドを少なくとも０．４％　Ｗ／湿式プ秀重量を含むペプチドＴ １溶液に１日に２回さらさｈた器具において右側のプラークとリン酸カルシウム 量は、２〜４倍増加したことを示した。

この研究では、ペプチドＴ１がプラークに組み込まれてカルシウムとリン酸塩の プラークレベルが増加するので、カリエスの進行が抑制されることを示す。歯科 プラークに組み込みそして蓄積するこの方法は、再無機質化および抗細菌イオン 、例えばＣａ、ＰＯ４、ＦＰＯ３、Ｚｎ、Ｃｕ。

Ｓｎ、Ａｇ、ＡｆＪ、ＦｅおよびＬａをプラークとエナメルに運搬するなめに使 用し得る。

試　験　３　口内再無機質化 エナメル平板が脱無機質化溶液に予めさらされて各スラブの２つの表面下に脱無 機質化障害を生じた以外は、前述の試験法で使用された器具とＭ似する口内器具 を使用した。

脱無機質化溶液は、５００■／Ｌの水酸化リン灰石と１％のアガーを含有するｐ Ｈ５，０の０．１Ｍ＃Ｌ酸塩バッファーであった。その器具は、１ｏ日間処理で すりへらされた。

１日２＠、その器具を取りはずし、−滴の再無機質化溶液をその器具の右側のエ ナメル平板上に配しな。その左側のエナメル平板を対照とした。１ｏ日後、エナ メル平板を取りはずし、切断し、微小Ｘ線撮影にがけな。表面上傷害に沈着した 無機譬崖は、微小デンシトメーターで測定した。

１．８％　ｗ／ｖリン酸カルシウムＴ１含有再無機質化溶液（ｐＨ７，０）は、 唾液単独の１３％に比べて、無機質損失の５７％を復元した。

試　験　４　プラークｐＨ低下 被験者は、３〜５日間口腔衛生を差し控え、その後５％ショ糖溶液で１分間洗浄 した。プラークサンプルを除き、そしてｐＨを１滴法で測定した。約５分後、そ のｐＨは１約５．０になった。しかしながら、もし、５％ショ糖溶液の洗浄前に 、１．８％　ｗ／ｖリン酸カルシウムＴ１含有溶液（ｐＨ７，０）で１５分間洗 浄すると、プラークｐＨは、６．７以下にならず、リン酸カルシウムＴ１による 重要なｐＨ緩衝効果を示した。

ホスホペプチドが抗う食原性活性を示す正確な＠楕が知られていないが、次の推 測理論は、提案されたが何ら拘束または限定するものではない。

ホスホペプチドはプラークおよびエナメル、バッファープラーク酸に集積し、エ ナメルの脱無機質化を防止し、再無機質化を高める。小分子量のホスホペプチド は、プラークおよびエナメル穴への侵入および集積を許容するだろう。

リン酸セリン残基の適切な間隙のホスホペプチドは、歯のエナメル無機質に結合 し、脱無機質化を防止する。ペプチドは、カルシウムおよびリン酸塩（修飾して リン酸フッ素とする）を、適当な形感でプラークおよびエナメルに運搬し、自発 的再無機質化を許容するだろう。ホスホセリン残基も、プラーク酸を緩衝するだ ろう。ホスホペプチドも、同様に、抗細菌金属イオン、例えばＺｎ、Ｃｕ、Ｓｎ 、Ａｇ、ＡＡ、ＦｅとＬａをプラーク内に運搬し、この方法で抗プラークおよび および抗歯肉炎効果を有するだろう。金属イオンは、ホスホペプチド、主にホス ホセリン残基により運ばれる。ホスホペプチドは、プラーク細菌と結合し、糖の 利用を抑制する。

これらのペプチドのリン酸カルシウムを分離する能力は、各種の骨傷害を純化す る処置において利用し得る。これらのペプチドは、腸におけるカルシウム、リン 酸塩および鉄の吸収を極めて増加し得る。それ故に、製薬ビヒクル（例えば、腸 カプセル化剤）またはリン酸カルシウムＴ１およびリン酸第１鉄Ｔ１を含有する 食物は、骨粗しよう症／骨軟化症および貧血症の処置に使用できる。

出願人は、本発明の各種組成物を次に明確にする。一般に、組成物は、０．０１ 〜１０重量％のホスホペプチドを含む。

実施例１　穀　粉 乾燥物質を混合する装置において、１重量％のリン酸カルシウムＴ１と小麦粉を 混合した。

実施例２　穀　物 水中で朝食用穀物にリン酸カルシウムＴ１溶液を吹きかけた。穀物フレークは、 その後乾燥して１％リン酸カルシウムＴ１含有最終生成物を生じた。

実施例３　パ　ン １重量％のリン酸カルシウムＴ１をパン製造用組成物の混合中に穀粉に加えた。

実施例４　ケーキ　ミックス １重量％のリン酸カルシウムＴ１をケーキミックをつくる間の乾燥組成物に加え た。

実施例５　菓　子 菓子の製造中に、１重量％のリン酸カルシウムＴ１を最終混合物に加えた。

実施例６　ビスゲット ビスケット／混合物の製造時に、１重量％のリン酸カルシウムＴ１を混合中に他 の乾燥組成物に加えた。

実施例７　飲　物 飲物を０．１重量％のリン酸カルシウムＴ１を溶解して調製しな。

実施例８　錠　剤 １０重量％のリン酸カルシウムＴ１と香辛物質および結合物質であるエキシビエ ントをともに含む錠剤を調製した。

本発明の範囲内で代表的なはみがき剤を調製する場合に、必要な塩および選択さ れたホスホペプチドの塩は、粉、ペーストまたは液体のいずれかに従属するどの ような好適な方法でも、はみがき剤組成物に組み込まれて製剤が生産されるべき である。このなめ、表面活性の適切な製剤、バインダー、香辛剤および所定形態 のはみがき剤を得るために要求されるエキシビエントが加えられる。

本発明は、さらに次の実施例により示される。

実施例９　ねり歯みがき 次の組成を有するねり歯みがきを調製しな。

リン酸カルシウムＴｌ　５．Ｏ重量％ ＣＭＣ７ＭＦ　１．０重量％ サッカリン　４５０　０．２重量％ グリセリン（Ｂ、　Ｐ、　＞　２５．０重量％ラウリル硫酸ナトリウム　５．０ 重量％（エビコール　０９１９） 安磨、香酸ナトリウム　０．５重１％ 香辛剤　９／６９３０９０　０．８重量％リン酸力ルシウノ、　１．０重量％ 胛イオン水　３９．５重量％ チキソジル（丁ｈｉｘＤｓｙｌ）３３Ｊ　９．５重量％シロイド（Ｓｙｌｏｉｄ ）ＡＬ−１１２，０重量％二酸化チタン　３３２８　０．５重量％実施例１０　 ねり歯みがき 実施例９に示される方法が繰り返されるが、０．２％のフッ化ナトリウムを加え ることが々チましい。

実施例１１　ねり歯みがき 実施例９に示される方法が繰り返されるが、０．４％のフッ化錫を加えることが 好ましい。

実施例１２　ねり歯みがき 実施例９に示される方法が繰り返されるが、０．７６％のモノナトリウム　フル オロホスフェートを加えることが好ましい。

実施例１３　歯みがき粉 リン酸カルシウムＴｌ　５．０重量％ 可溶性サッカリン　０．１重量％ 着　色　剤　微　１ 二塩基リン酸カルシウム　９４．１重量％実施例１４　歯みがき粉 実１ｔ！、例１３に示される方法が繰り遅さｈれるが、０．７６％のモノナトリ ウム　フルオロホスフェートを加えることが好ましい。

実施例１５　液体はみがき剤 製剤は、次の組成から遣られた。

アルギン酸ナトリウム　１．４重量％ リン酸カルシウムＴｌ　２．０重量％ ラウリル硫酸ナトリウム　１．０重量％香　辛　剤　微　重 着　色　剤　微　量 水　９５．５重量％ 実施例１６　液体はみがき剤 実施例１５に従ったが０．５％フッ化ナトリウムを加えた。

実施例１７　マウスウォッシュ 次の製剤を調合した。

リン酸力シルウムＴ１　２．０重量％ フッ化ナトリウム　０．５重量％ 香　辛　剤　微　重 着　色　剤　微　量 水　９７．５重量％ 実施例１８　炭酸飲料 ０６１重量％のホスホペプチドカルシウムＴ１を商業上有効な炭酸飲料に加えた 。

実施例１９　フルーツジュース ０．１重量％のホスホペプチドカルシウムＴ１を商業上有効なフルーツジュース に加えた。

実施ＰＡ２０　歯へ局所適用する溶液 リン酸カルシウムＴＩ　２　％ ＮａＦ　０．６ｍＭ 酢酸亜鉛　０．１ｍＭ ５ｒＣ９２０，１ｍＭ （この溶液は、リン酸カルシウムＴ１の量を増加することによりゲル中で形成さ れる。） 実施例２１　歯科用充填物質 リン酸カルシウムＴｌ　５％　ｗ／ｗ リン酸カルシウム　９５％　ｗ／ｗ 重合開始剤　微　量 水でペースト状とした。

この実施例で使用した重合開始剤は、グルタルアルデヒドであった。

実施例２２　歯科充填物質 リン酸カルシウムＴｌ　５％　ｗ／ｗ リン酸カルシウム　７０％ アクリルポリマー　２５％ 重合用触媒　微　量 実施例２３　過敏症の歯の処置用局所ゲルリン酸カルシウムＴ１　４．０重量％ ＳｒＦ：ｚ　１．０重量％ 香　辛　剤　微　量 水　９５％ 上記リン酸カルシウムＴ１は、説明用に使用したものであり、代りにどんな適切 なホスホペプチドおよび／まなは塩も使用できる。

ここに開示された新規な特徴および特徴の組み合せを含む本発明の精神および範 囲から離れることな（、修正および適応が上記になされるであろう。

請求の範囲は、この開示の一部を形成する。

国際調査報告 し１１１１１１８＋１０＾■−ム、＠１．．．．．．Ａｔ、、、ＰＣＴ／Ａｌ１ ８７１００１７２

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．次の配列 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ ［但し、式中、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥは、それぞれ独立にホスホセリン、ホス ホトレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸塩およびアス パラギン酸塩である。］を含む５〜３０のアミノ酸含有ホスホペプチドまたはホ スホペプチドの塩。
2. ２．Ａ，ＢおよびＣがそれぞれ独立ににホスホセリン、ホスホトレオニン、ホス ホチロシンおよびホスホヒスチジンであり、ＤおよびＥがそれぞれ独立にホスホ セリン、ホスホトレオニン、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩である請求 の範囲第１項に記載のホスホペプチド。
3. ３．Ａ，ＢおよびＣがホスホセリン、ＤおよびＥがグルタミン酸塩である請求の 範囲第１項に記載のホスホペプチド。
4. ４．【配列があります】からなるホスホペプチド。
5. ５．【配列があります】から なるホスホペプチド。
6. ６．【配列があります】からなるホスホペプチド。
7. ７．【配列があります】からなるホスホペプチド。
8. ８．【配列があります】から なるホスホペプチド。
9. ９．実質的に純粋な形態である前記のどの請求の範囲にも記載されたホスホペプ チドまたはホスホペプチドの塩。
10. １０．請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載のホスホペプチドまたはホスホペ プチドの塩が支配的であるホスホペプチドとその塩の混合物。
11. １１．請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載のホスホペプチドまたはホスホペ プチドの塩および生理的に許容可能な希釈剤からなる組成物。
12. １２．ホスホペプチドまたはホスホペプチドの塩が組成物中に０．０１〜１０重 量％存在する請求の範囲第１１項に記載の組成物。
13. １３．ホスホペプチドまたはホスホペプチドの塩が組成物中に０．０１〜５重量 ％存在する請求の範囲第１１項に記載の組成物。
14. １４．ホスホペプチドまたはホスホペプチドの塩が組成物中に０．０１〜２重量 ％存在する請求の範囲第１１項に記載の組成物。
15. １５．希釈剤が製薬上許容可能な希釈剤である請求の範囲第１１〜１４項のいず かれ１項に記載の組成物。
16. １６．希釈剤が経口摂取物質である請求の範囲第１１〜１４項のいずれか１項に 記載の組成物。
17. １７．希釈剤が食料品である請求の範囲第１６項に記載の組成物。
18. １８．食料品または菓子の形態である請求の範囲第１７項に記載の組成物。
19. １９．ねり歯みがき、歯みがき粉、歯みがき剤、マウスウォッシュ、歯または歯 肉組織に局所的に適用する製剤の形態である請求の範囲第１１〜１４項のいずれ か１項に記載の組成物。
20. ２０．ゲルの形態である請求の範囲第１１〜１４項のいずれか１項に記載の組成 物。
21. ２１．歯科充填組成物の形態である請求の範囲第１１〜１４項のいずれか１項に 記載の組成物。
22. ２２．加えて、リン酸カルシウムまたは水酸化リン灰石を含む請求の範囲第２１ 項に記載の組成物。
23. ２３．カゼイン，αｓ−カゼイン、β−カゼインまたはそれらの塩を消化したも のを分別することからなる請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載のホスホ ペプチドを得る方法。
24. ２４．リン酸カルシウムまたは水酸化リン灰石と結合してなる請求の範囲第１〜 ９項のいずれか１項に記載のホスホペプチド。
25. ２５．１モルのホスホペプチド当り約１６モルのＣａＨＰＯ４を含む請求の範囲 第２４項に記載の組み合せ。
26. ２６．溶液またはゲルの形態である請求の範囲第２４項または第２５項に記載の 組み合せ。
27. ２７．ホスホペプチドまたはその塩、同一物を含む組成物または実施例のいずれ かに記載されているものと実質的に同一物を得る方法。
28. ２８．物品、道具、部品、エレメンと、ステップ、特徴、方法、プロセス、化合 物および個々にまたは集合的に出願の明細書および／または請求の範囲および、 いずれかおよびかかるもののいずれかの二以上の組合せを引用し、または示され る組成物。