DK173565B1 - Præparater til anvendelse ved inhibering af caries samt phosphopeptider, en fremgangsmåde til fremstilling deraf og præpara - Google Patents

Description

i DK 173565 B1

Præparater til anvendelse ved inhibering af caries samt phosphopeptider, en fremgangsmåde til fremstilling deraf og præparater indeholdende disse phosphopeptider

Denne opfindelse angår præparater til anvendelse ved in-5 hibering af caries og præparater med anticariogen aktivitet. Specielt angår opfindelsen visse phosphopeptider og salte deraf, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt præparater indeholdende disse phosphopeptider.

Opfindelsen tilvejebringer de følgende phosphopeptider: 10 TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys, T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg, T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-15 Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys, T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys, og T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Aminosyresymbolerne er som følger: 20 Pse- phosphoserin, Ser - serin, Pth - phosphothreonin,

Thr - threonin, Glu - glutamat, Asp - aspartat, Ala -alanin, Asn - asparagin, Gin - glutamin, Gly - glycin,

Arg - arginin, His - histidin, Ile - isoleucin, Leu -leucin, Lys - lysin, Met - methionin, Pro - prolin, Tyr -25 tyrosin, Val - valin.

Opfindelsen omfatter hvert af disse phosphopeptider, og fortrinsvis phosphopeptidet eller et salt deraf i hovedsageligt ren form.

DK 173565 B1 2

Opfindelsen omfatter også en blanding af phosphopeptider eller salte deraf, hvori et phosphopeptid som angivet ovenfor eller et salt deraf er overvejende.

Phosphopeptiderne ifølge opfindelsen og deres salte kan 5 have anvendelighed til behandling eller inhibering af (i) tandsygdonune, såsom caries, gingivitis og periodontal sygdom, (ii) knoglesvindssygdomme, såsom osteoporosis og osteomalacia og (iii) sygdomme forbundet med malabsorption af mineraler.

10 I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelsen et præparat til anvendelse ved inhibering af caries, som er særegent ved, at det omfatter et eller flere phosphopeptider valgt blandt de ovennævnte TI, T2, T3, T4 og T5.

Endvidere tilvejebringer opfindelsen et præparat med an-15 ticariogen aktivitet, som er særegent ved, at det omfatter et eller flere phosphopeptider valgt blandt de ovennævnte TI, T2, T3, T4 og T5 i form af en syre eller et salt, men ikke inkluderer et præparat, som er en total tryptisk nedbrydning af casein, og med den begrænsning at 20 hvor phosphopeptidet omfatter TI alene, omfatter præparatet ikke sekvensen:

Asp-Ile-Gly-Pse-Glu~Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met-Glu-Asp-Ile-Lys.

Opfindelsen omfatter et præparat, som er særegent ved, at 25 det indeholder et phosphopeptid som angivet ovenfor eller et salt deraf sammen med et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel .

Præparatet kan være i form af et farmaceutisk præparat.

Præparatet kan være oralt indtageligt.

DK 173565 B1 3

En blanding af phosphopeptider eller salte deraf som an givet ovenfor kan anvendes i præparatet.

Phosphopeptidet eller blandingen af phosphopeptider er fortrinsvis i det væsentlige ren, i det mindste i en så-5 dan grad, at det ikke indeholder urenheder med ubehagelig smag.

Phosphopeptidet kan fremstilles syntetisk ved kemisk syntese eller genteknologi eller kan extraheres fra naturligt forekommende materiale.

10 På grund af prisovervejelser er det for tiden mest økonomisk at extrahere phosphopeptidet fra casein og især fra as-casein eller β-casein. Phosvitin kan også anvendes som kilde til peptidet. Endvidere kan phosphoproteiner i kornarter, nødder og grøntsager, især i klidskaller eller 15 -skeder, anvendes til at fremstille det ovenstående peptid. Især er ris-, hvede-, havre-, byg- eller rugklid anvendelig. Sojabønne og kød indeholder phosphoproteiner, som kan være nyttige til opnåelse af det ovennævnte peptid. Casein, og især α-casein eller β-casein, eller salte 20 deraf, såsom natriumcaseinat, indeholder polypeptider, som kan spaltes til simplere peptider. Sådan spaltning kan frembringes ved nedbrydning, f.eks. kemisk eller pro-teolytisk.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelsen også 25 en fremgangsmåde til fremstilling af et phosphopeptid som angivet ovenfor, som er særegen ved, at en nedbrydning af casein, as-casein, β-casein eller et salt deraf fraktioneres .

Det foretrækkes for tiden at nedbryde casein med et af 30 enzymerne trypsin, pepsin, chymotrypsin, papain, thermo- lysin eller pronase. Af disse foretrækkes trypsin.

DK 173565 B1 4

Det nedbrudte casein kan fraktioneres i peptider som angivet ovenfor og andre peptider. Tilstedeværelsen af de nævnte andre peptider er ikke skadelig for effektiviteten, men visse af de andre peptider har ubehagelig smag.

5 Hvis nogle af de nævnte andre peptider skal inkluderes, foretrækkes det derfor at fjerne dem med ubehagelig smag.

I almindelighed synes de af de andre peptider, som har ubehagelig smag, at være hydrofobe.

De følgende peptider har vist sig at have ubehagelig 10 smag: 1. Glu-Val-Leu-Asn 2. Asn-Glu-Asn-Leu-Leu 3. Ala-Pro-Phe-Pro~Gln-Val-Phe-Gly 4. Leu-Arg-Phe 15 5. Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Gln-Val-Phe-Gly-Lys 6. Leu-Arg-Leu 7. Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu-Phe (Glu - glutamat; Val - valin; Leu - leucin; Asn - aspara-gin; Ala - alanin; Pro - prolin; Phe - phenylalanin; Gin 20 - glutamin; Gly - glycin; Arg - arginin; Lys - lysin; Tyr - tyrosin)

Fortrinsvis er peptidet et, som udviser en reduktion i hydroxyapatit-opløsningshastighed ved den i det følgende beskrevne Prøvning 1 på mindst 15 % under de i denne be-25 skrivelse definerede prøvebetingelser.

Fortrinsvis er peptidet et, som udviser en reduktion i hydroxyapatit-opløsningshastighed på mindst 26 % under de i denne beskrivelse definerede prøvebetingelser.

DK 173565 B1 5

Fortrinsvis er peptidet et, som udviser en reduktion i hydroxyapatit-opløsningshastighed på mindst 30 % under de i denne beskrivelse definerede prøvebetingelser.

Fortrinsvis er peptidet et, som udviser en reduktion i 5 hydroxyapatit-opløsningshastighed på mindst 32 % under de 1 denne beskrivelse definerede prøvebetingelser.

Fortrinsvis er peptidet tilstede i en mængde på 0,01-10 vægt-%.

Fortrinsvis er peptidet tilstede i en vægtmængde på 0,01-10 5 vægt-%.

Fortrinsvis er peptidet tilstede i en vægtmængde på 0,01- 2 vægt-%.

Præparatet ifølge opfindelen kan være i form af et spiseligt præparat, såsom næringsmiddel eller konfekt, tand-15 rensemiddel, tablet, eller det kan omfatte et farmakologisk acceptabelt medium i form af en opløsning eller suspension til topisk påføring på tænderne eller gummevævene eller til mundskyldning. Andre måder, at påføre peptidet på, vil kunne anvendes hvis de er fysiologisk eller 20 farmakologisk acceptable.

Af særlig interesse som præparater er tyggegummi, morgenmadsfødevarer, iscreme og anden frossen konfekture, konfekt, slik og kager, da disse alle er kendte som caries-problemmaterialer. Lignende overvejelser gælder andre po-25 tentielt cariogene fødevarekomponenter.

Af særlig interesse er også tandrensemidler, mundskyllemidler og præparater til topisk påføring på tænder og gummevæv og enteriske kapsler til behandling af knoglelidelser og malabsorption af mineraler.

DK 173565 B1 6

Af interesse er også anvendelsen af præparater ifølge opfindelsen med henblik på tandbehandling af hulrum. I denne sidste henseende viser der sig at være tegn på remine-ralisering af begyndende læsioner, som anses for at være 5 hulrumsforstadier. Imidlertid er der også tegn, der viser, at påføring af præparater ifølge opfindelsen på overfladerne af faktiske hulrum og på tandoverflader frembragt ved fjernelse af nedbrydningsmateriale fra faktiske hulrum eller ved fraktur er gavnlig.

10 Eftersom en topisk påføring af et præparat ifølge opfindelsen, som er en vandig opløsning, på overflader af faktiske hulrum eller tandoverflader frembragt ved fjer nelse af nedbrydningsmateriale fra faktiske hulrum eller ved fraktur sandsynligvis ikke har nogen langvarig virk-15 ning, har man yderligere søgt at tilvejebringe præparater, som kunne have den ønskede langtidsvirkning.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelen også et præparat, som er tilpasset til at forblive i kontakt med en tandoverflade over et længere tidsrum. Opfindelsen 20 tilvejebringer også fremgangsmåder og midler til at holde præparater ifølge opfindelsen i kontakt med en tandoverflade over et længere tidsrum.

I denne sidste henseende bør et længere tidsrum forstås i overensstemmelse med den ønskede virkning og den tid, det 25 tager at opnå tilstrækkeligt af den virkning til at være af værdi. Imidlertid kan det længere tidsrum i nogle tilfælde være så kort som én dag, men fortrinsvis er det et tidsrum på uger eller måneder.

I et tilfælde overtrækkes et tandhulrum med et præparat 30 ifølge opfindelsen, og hulrummet lukkes for at begrænse undslippelsen af præparatet. En sådan lukning kan frem- DK 173565 B1 7 bringes ved påsætning af en hætte eller anvendelse af tandfyldningspræparater.

I et andet tilfælde sammensættes præparatet således, at det er tilpasset til at forblive på plads i et længere 5 tidsrum. I dette tilfælde kan præparatet ifølge opfindelsen udgøre en del af et tandfyldningspræparat.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelsen også et tandfyldningspræparat indeholdende et phosphopeptid, som inkluderer sekvensen A-B-C-D-E som defineret ovenfor, 10 og en bærer for dette tilpasset til at fasthæfte præparatet til en tandoverflade.

Et sådant tandfyldningspræparat kan indeholde i sig selv kendte tandfyldningsmaterialer, herunder amalgamer og hærdelige polymere.

15 Af særlig interesse er tandfyldningspræparater, som indeholder calcium. Calciumet er ønskeligt i form af calcium-phosphat eller hydroxyapatit.

Phosphopeptiderne til anvendelse ifølge opfindelsen kan extraheres på flere måder, men i almindelighed foretræk-20 kes anvendelsen af en fraktioneringsteknik.

Phosphopeptiderne kan extraheres ved fraktionering baseret på molekyIstørrelse eller ladningsegenskaber. Pågrund af peptidernes enestående negative ladningstæthed og evne til at chelatere divalent metalion, tilført af den aktive 25 sekvens A-B-C-D-E som defineret, er den foretrukne fraktioneringsprocedure anionbytterchromatografi eller selektiv fældning eller en kombination af begge.

De følgende procedurer belyser én extraktionsmåde.

DK 173565 B1 8

Extraktionsprocedure I

Et eksempel på phosphopeptiderne er dem, der frembringes ved trypsin-nedbrydning af komælkscasein. Nedbrydningen af helt natriumcaseinat eller fraktioner (ocs eller β) 5 frembragt ved selektiv fældning (Zittle, C.A. and Custer J.H.; J. Dairy Sci. 46L: 1183-1188, 1963) udføres under anvendelse af et protein/trypsinforhold på 50:1 i 20 mM "Tris"-HCl pH 8,0, 2,5 mM NaCl ved 37 °C i 1 time. Peptiderne blev fraktioneret under anvendelse af et 10 Pharmacia FPLC-system med en Mono Q HR 5/5 kolonne og elueret med en NaCl-gradient; puffer A 20 mM "Tris"-HCl pH 8,0, 2,5 mM NaCl; puffer B 20 mM "Tris"-HCl pH 8,0 500 mM NaCl, gradient 0-100 % puffer B/30 min; strømningshastighed 1 ml/min. Fraktioner blev vasket og koncentreret 15 under anvendelse af en "Amicon" ultrafiltreringscelle med et UM05 filter. Peptiderne blev identificeret under anvendelse af et Water Associates "PICO-TAG" aminosyreana-lysesystem under anvendelse af phenylisothiocyanat-amino-syre-derivatisering. Phosphat blev målt ved fremgangsmå-20 den beskrevet af itaya and Ui (Clin. Chem. Acta. 14: 361-366. 1950). Peptiderne blev sekvensbestemt {efter fjernelsen af phosphat med alkalisk phosphatase) under anvendelse af manuel Edman-nedbrydning, og de resulterende PTH-aminosyrer blev identificeret under anvendelse af re-25 vers-fase-HPLC på en "Zorbax ODS" kolonne 25x0,45 cm (DuPont) .

De følgende phosphopeptider blev individuelt opnået ud fra en trypsin-nedbrydning af natriumcaseinat under anvendelse af den ovenstående procedure: 30 Ti. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

DK 173565 B1 9 T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-lle-Thr-Arg.

T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-lle-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

5 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala~Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Desuden blev de følgende peptider også opnået: T6. Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met-Glu-10 Asp-Ile-Lys.

T7. Val-Pro-Gln-Leu-Gln-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Ala-Glu-Glu-Arg.

T8. Thr-Val-Asp-Met-Glu-Pse-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys.

T9. Leu-Pth-Glu-Glu-Lys.

15 Peptiderne TI, T6 og T7 blev også opnået ud fra en TPCK-trypsin-nedbrydning af asi-caseinat (omfattende asi og ctso) · Peptidet T2 blev også opnået ud fra en TPCK-tryp-sin-nedbrydning af β-caseinat. Peptiderne T3, T4, T5, T8 og T9 blev også opnået ud fra en TPCK-trypsin-nedbrydning 20 af aS2-caseinat (omfattende ocS2/ aS3, ocs4 og aS6>- Aminosyre-symbolerne er som følger:

Pse - phosphoserin, Ser - serin, Pth - phosphothreonin,

Thr - threonin, Glu - glutamat, Asp - aspartat. Ala -alanin, Asn - asparagin, Gin - glutamin, Glu - glycin, 25 Arg - arginin, His - histidin, Ile - isoleucin, Leu - leucin, Lys - lysin, Met - methionin, Pro - prolin, Tyr -tyrosin, Val - valin.

DK 173565 B1 10

Extraktionsprocedure II

Den følgende procedure belyser en måde til selektiv fældning.

En opløsning af natriumcaseinat blev nedbrudt med trypsin 5 (casein/trypsin 50:1) i 1 time ved 30 °C, idet pH-værdien blev holdt på 8,0 ved tilsætning af NaOH. Derpå tilsattes HCl (0,1 M) til opløsningen ved stuetemperatur til pH 4,7 og det resulterende bundfald blev fjernet. BaCl2 blev tilsat til supernatanten til et niveau på 0,25 vægt/vol.-10 % efterfulgt af et lige så stort volumen absolut ethanol, og det resulterende bundfald blev fjernet og tørret.

Bundfaldet blev opløst i 1/10 af det oprindelige volumen vand (for at lette opløsning blev pH-værdien hævet med NaOH), og opløsningen blev gjort sur til pH 3,5 med 1 M 15 HCl. Der tilsattes et lige så stort volumen acetone, og bundfaldet blev fjernet og tørret. Bundfaldet blev derpå genopløst i vand, og opløsningen blev gjort sur til pH

2,0 ved tilsætning af HCl. Det resulterende bundfald blev fjernet og smidt væk, og supernatanten blev indstillet 20 tilbage til pH 3,5 med NaOH, og der tilsattes et lige så stort volumen acetone. Det resulterende bundfald blev opsamlet, genopløst i vand og tilsat H2SO4 for at udfælde BaS04, som blev smidt væk. Supernatanten blev derpå dialyseret og lyophiliseret eller sprøjtetørret. En blanding 25 af 5 phosphopeptider blev opnået ved denne procedure: TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-lle-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

30 T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-

Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys.

DK 173565 B1 11 T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

Mængdeforholdet mellem phosphopeptiderne (TI; T2; T3; T4; 5 T5) i det endelige præparat afhænger af udgangsmaterialet og hydrolysebetingelserne. Nedbrydning af natriumcaseinat med TPCK-trypsin giver stort set T2 med små mængder TI, T3, og T4. Imidlertid udviser T2 større labilitet end andre peptider, således at mere rigorøs nedbrydning, som 10 sker med nogle kommercielle caseinnedbrydninger, giver et præparat indeholdende stort set TI med små mængder T3 og T4.

Hvis der i stedet for natriumcaseinat anvendes asi-casein ved denne procedure, opnås rent TI. Med β-casein som ud-15 gangsmateriale opnås rent T2.

De mest almindelige sekvenser af de aktive peptider er pentapeptidet Pse-Pse-Pse-Glu-Glu. Afstandene mellem phosphat- og carboxylgrupperne i en β-konformation af dette pentapeptid er vist i figur 1.

20 Afstandene på 6,88 Å mellem phosphatgrupper og carboxyl-grupper muliggør specifik vedhæftning til calciumioner langs c-aksen af hydroxyapatitkrystaller. Denne pentapep-tidsekvens forekommer i peptiderne T1-T4 og forekommer modificeret i peptid T5 (Pse-Pth-Pse-Glu-Glu) efter en 25 konservativ udskiftning af phosphoserin med phosphothreo-nin.

Konservative udskiftninger inden for den aktive sekvens ville være phosphotreonin og i mindre grad phosphotyrosin eller phosphohistidin i stedet for phosphoserin, selv om 30 phosphoserin er foretrukket. En anden mulig udskiftning af phosphoserin ville være med glutamat eller aspartat, DK 173565 B1 12 men igen er phosphoserin foretrukket. En mulig udskiftning for glutamat er aspartat.

De aktive peptider kan chelatere calciumphosphat og andre salte af divalente metalioner. 1 mol TI binder 16 mol 5 CaHP04, således at en 10 mg/ml opløsning af TI ved pH

7,0 kan solubilisere 60 mM CaHPC>4 under dannelse af en metastabil overmættet opløsning med hensyn til calcium-phosphat-arter. Med chlorid som modionen binder 1 mol Ti kun 5 mol Ca++, der kun bindes til serinphosphater. 1 10 mol TI med omkring 16 mol CaHPC>4 bundet (molekylvægt 4883) vil i det følgende blive betegnet som calciumphos-phat-Tl. Et vigtigt kemisk træk ved calciumphosphat-Tl er, at med over 2 vægt/vol.-% vand er præparatet en thi-xotrop gel. T1-T5 er blevet vist at være potentielt anti-15 cariogene under anvendelse af de følgende prøvningsprocedurer:

Prøvning 1 - Prøvning af hydroxyapatitopløsningshastighed

Denne prøvning er en modifikation af en prøvningsprocedure, som allerede er beskrevet (Reynolds, E.C., Riley, 20 P.F. and Storey, E.; Calcif. Tiss. Int. 34: 52-56, 1982). Formålet med denne prøvning er at bestemme virkningen af peptiderne på hydroxyapatitopløsning, og eftersom tandemalje stort set er sammensat af hydroxyapatit, antages det, at der kan foretages nyttige sammenligninger.

25 Dobbeltdestilleret deioniseret vand (18 megaohm/cm) blev anvendt hele vejen. Kemikalier af analytisk reagenskvalitet blev skaffet fra Ajax Chemicals, Australien. Hydro-xyapatit-spheroidal blev købt fra BDH. En chromatografi-kolonne indeholdende 0,1 g hydroxyapatitperler blev an-30 vendt til demineraliseringsprøvningen. "Tris" 5 mM, pH

8,3 indeholdende 50 mM NaCl blev anvendt som kolonnepufferen ved 20 °C og blev pumpet igennem kolonnen med en hastighed på 0,1 ml/min. En peptidopløsning på 0,1 mg/ml DK 173565 B1 13 puffer blev påført kolonnen, og 0,2 ml fraktioner blev opsamlet før og efter peptidpåsætningen og prøvet for total calcium, phosphat og peptid. Ud fra disse værdier blev der opnået en opløsningshastighed (nmol calcium el-5 ler phosphat pr. min.) for hver 0,2 ml fraktion.

Phosphopeptiderne T1-T5 sænkede alle hydroxyapatitopløsningshastigheden med omkring 32 %. Phosphopeptiderne T6-T9 fandtes at være meget mindre effektive.

Fluorid plus phosphopeptid TI gav en kombineret reduktion 10 i hydroxyapatitopløsning (40 % reduktion), phosphopepti-det TI forårsagede en 50 % større tilbageholdelse af fluorid i hydroxyapatitkolonnen.

Dette arbejde viser, at disse phosphopeptider binder til hydroxyapatit og reducerer mineralets opløsningshastighed 15 og forhøjer tilbageholdelsen af fluorid i krystalmatrixen. Reduktionen i hydroxyapatitopløsning stod i forhold til phosphoserinindholdet og afstandene i peptiderne.

Prøvning 2 - Intraoral cariesprøvning

Anticariogeniciteten af phosphopeptidet TI blev bestemt 20 under anvendelse af en modifikation af den intraorale cariesprøvning beskrevet af Koulourides and Ostrom (Caries Res. 10: 442-482, 1976). Emaljeplader blev indsat i en udtagelig intraoral indretning, som skulle simulere et approximalt område. Dette blev gjort på begge sider af 25 den udtagelige indretning (venstre og højre). Indretningen blev båret for at tillade plakopsamling i de simulerede approximale områder. 8 gange om dagen blev indretningen udtaget og anbragt i en opløsning ved 37 °C. Opløsningen var 2 vægt/vol.-% sucrose, 2 vægt/vol.-% gluco-30 se, 140 mM KCl, 20 raM NaCl ved pH 7,0. 2 gange om dagen blev emaljepladerne i højre side udsat for en opløsning indeholdende 1,8 vægt/vol.-% calciumphosphat-Tl i 140 mM

DK 173565 B1 14 KC1, 20 mM NaCl ved pH 7,0, medens den venstre side kun modtog saltopløsningen. Ved fuldførelsen af forsøget blev emaljepladerne udtaget, skåret igennem og underkastet mi-kroradiografi- og mikrohårdheds-prøvning. Mikroradiogra-5 fien viste, at pladerne udsat for sukker-salt-opløsningen (venstre side) havde carieslignende læsioner under overfladen. Imidlertid viste pladerne udsat for sukker-saltopløsningen og peptid-Tl-opløsningen 2 gange om dagen ingen carieslignende ændringer. Resultaterne blev bekræftet 10 ved mikrohårdhedsanalyse. Plak blev også taget fra begge sider af indretningen og analyseret for calciumphosphat, serinphosphat og peptid TI under anvendelse af en kompe-titiv, kvantitativ, enzymforbundet-immunosorbent-prøvning (ELISA) under anvendelse af monoklonale anti-peptid-Tl-15 antistoffer.

Dette viste, at plakken på den højre side af indretningen, som 2 gange om dagen var udsat for peptid-Tl-opløs-ningen, indeholdt peptidet i et niveau på mindst 0,4 vægt-% beregnet på den våde plak, og at niveauet af cal-20 ciumphosphat var forøget 2-4 gange.

Dette arbejde viser, at peptidet Ti inkorporeres i plak og derved forøger plakniveauet af calcium og phosphat, hvorved cariesprocessen inhiberes. Denne fremgangsmåde til inkorporering og akkumulering i dental plak kan an-25 vendes til at bære remineraliserende og antibakterielle ioner ind i plak og emalje, f.eks. Ca, PO4, FPO3, Zn,

Cu, Sn, Ag, Al, Fe og La.

Prøvning 3 - Intraoral remineralisering

En intraoral indretning mage til den, som blev anvendt 30 ved den forudgående prøvningsprocedure, blev anvendt, undtagen at emaljepladerne i forvejen var blevet udsat for en demineraliserende opløsning for at frembringe 2 demineraliserede læsioner under overfladen i hver plade.

DK 173565 B1 15

Den demineraliserende opløsning var en 0,1 M lactatpuffer pH 5,0 indeholdende 500 mg/1 hydroxyapatit og 1 % agar. Indretningerne blev båret af individer i 10 dage. 2 gange om dagen blev indretningerne udtaget, og en dråbe remine-5 raliserende opløsning blev anbragt på hver emaljeplade i højre side af indretningen. Emaljepladerne i venstre side tjente som kontroller. Efter 10 dage blev emaljepladerne udtaget, gennemskåret og underkastet mikroradiografi.

Mængden af mineral deponeret tilbage i læsionerne under 10 overfladen blev bestemt under anvendelse af mikrodensito-metri. Den remineraliserende opløsning indeholdende 1,8 vægt/vol.-% calciumphosphat-Tl pH 7,0 tilbageførte 57 % af det tabte mineral sammenlignet med 13 % ved spyt alene.

15 Prøvning 4 - Fald i plak-pH

Individer afholdt sig fra oral hygiejne i 3-5 dage og skyllede derefter munden med en 5 % sucroseopløsning i 1 min. Plakprøver blev udtaget, og pH-værdien blev målt under anvendelse af 1-dråbe-teknikken. Efter omkring 5 mi-20 nutter faldt pH-værdien til omkring 5,0. Hvis imidlertid individerne skyllede med en opløsning indeholdende 1,8 vægt/vol.-% calciumphosphat-Tl, pH 7,0, 15 min. før skylning med den 5 % sucroseopløsning, faldt plak-pH-værdien ikke under 6,7, hvilket påviser væsentlig pH-pufferevne 25 hos calciumphosphat-Tl. Selvom den præcise mekanisme, hvorved phosphopeptiderne udøver anticariogen aktivitet, ikke er kendt, er der fremsat de følgende spekulative teorier, som ikke skal opfattes som bindende eller begrænsende.

30 Phosphopeptiderne kan akkumuleres i plak og emalje, pufre plaksyre, forhindre emaljedemineralisering og forhøje re-mineralisering. Phosphopeptidernes lille molekylvægt kan muliggøre indtrængen og opsamling i plak og emaljeporer.

DK 173565 B1 16

Phosphopeptiderne kan på grund af den passende afstand mellem serinphosphatrester bindes til tandemaljemineral og forhindre demineralisering. Peptiderne kan også bære calcium og phosphat (fluorophosphat ved modificering) ind 5 i plak og emalje i passende form, hvilket eventuelt muliggør spontan remineralisering. Phosphoserinresterne kan også pufre plaksyre. Phosphopeptidet kan også bære anti-bakterielle metalioner, f.eks. Zn, Cu, Sn, Ag, Al, Fe og La, ind i plak og på denne måde have en antiplak- og an-10 tigingivitis-virkning. Metalionerne bæres af phosphopeptiderne først og fremmest på grund af phosphoserinresterne. Phosphopeptiderne kan bindes til plakbakterier og in-hibere sukkerudnyttelse.

Disse peptiders evne til at chelatere calciumphosphat kan 15 udnyttes ved behandling af forskellige knoglesvindssyg-domme. Disse peptider kan væsentligt forøge absorbtionen af calcium, phosphat og jern i tarmen. Derfor kan farmaceutiske medier (f.eks. enteriske kapsler) eller næringsmidler indeholdende calciumphosphat-Tl og jern(II)-phos-20 phat TI anvendes til behandling af osteoporose/osteoma-laci og anæmi.

Ansøgerne har sammensat forskellige præparater i overensstemmelse med opfindelsen som følger. I almindelighed indeholder præparaterne 0,01-10 vægt-% phosphopeptid.

25 EKSEMPEL 1 - Mel I en indretning til blanding af tørre stoffer blev 1 vægt-% calciumphosphat-Tl blandet i mel.

EKSEMPEL 2 - Korn

En morgenmadskornart blev sprøjtet med en opløsning af 30 calciumphosphat-Tl i vand. Kornflagerne blev derpå tørret DK 173565 B1 17 til opnåelse af et færdigt produkt indeholdende 1 % cal-ciumphosphat-Tl.

EKSEMPEL 3 - Brød 1 vægt-% calciumphosphat-Tl blev tilsat til melet under 5 blandingen af ingredienserne til fremstillingen af brød.

EKSEMPEL 4 - Kageblanding 1 vægt-% calciumphosphat-Tl blev tilsat til de tørre ingredienser ved fremstilling af en kageblanding.

EKSEMPEL 5 - Konfekt 10 Ved fremstillingen af konfekt tilsattes 1 vægt-% calciumphosphat-Tl til den endelige blanding.

EKSEMPEL 6 - Bisquit

Ved fremstillingen af en bisquitblanding tilsattes 1 vægt-% calciumphosphat-Tl til de andre tørre ingredienser 15 under blanding.

EKSEMPEL 7 - Drik

Der fremstilledes en drik, hvori der var blevet opløst 0,1 vægt-% calciumphosphat-Tl.

EKSEMPEL 8 - Tablet 20 Der fremstilledes en tablet indeholdende 10 vægt-% calciumphosphat-Tl sammen med excipienter, som var aromati-serende materiale og bindende materiale.

Ved fremstilling af et typisk tandrensemiddel omfattet af opfindelsen inkorporeres det nødvendige salt og salte af 25 det valgte phosphopeptid i tandrensemiddelsammensætningen på enhver egnet måde afhængigt af, om der skal fremstil- DK 173565 B1 18 les et pulver, en pasta eller et flydende præparat. Til dette formål tilsættes passende præparationer af overfladeaktive midler, bindemidler, aromatiserende materialer og andre excipienter, som kræves til at opnåden nødvendi-5 ge form af tandrensemiddel. Opfindelsen belyses yderligere ved de følgende eksemplers EKSEMPEL 9 - Tandpasta

Der blev fremstillet en tandpasta med følgende sammensætning: 10 Calciumphosphat-Tl 5,0 vægt-% "CMC 7MF" 1,0 " "Saccharin 450" 0,2

Glycerol (B.P.) 25,0 "

Natriumlaurylsulfat 15 ("Empicol 0919") 5,0

Natriumbenzoat 0,5 "Flavour 9/693090" 0,8

Calciumphosphat 1,0

Deioniseret vand 39,5 20 "Thixosyl 33J" 9,5 " "Syloid AL-1" 12,0

Titandioxid 3328 0,5 EKSEMPEL 10 - Tandpasta

Der blev fremstillet et præparat som angivet i eksempel 25 9, men med tilsætning af 0,2 % natriumfluorid i en egnet form.

EKSEMPEL 11 - Tandpasta

Der blev fremstillet et præparat som angivet i eksempel 9, men med tilsætning af 0,4 % tin(II)-fluorid i en egnet 30 form.

DK 173565 B1 19 EKSEMPEL 12 - Tandpasta

Der blev fremstillet et præparat som angivet i eksempel 9, men med tilsætning af 0,76 % mononatriumfluorophosphat i en egnet form.

5 EKSEMPEL 13 - Tandpulver

Der blev fremstillet følgende præparat:

Calciumphosphat-Tl 5,0 vægt-%

Opløselig saccharin 0,1 "

Farvemiddel spor 10 Dibasisk calciumphosphat 94,1 ” EKSEMPEL 14 - Tandpulver

Der blev fremstillet et præparat som angivet i eksempel 13, men med tilsætning af 0,76 % mononatriumfluorophosphat i en egnet form.

15 EKSEMPEL 15 - Flydende tandrensemiddel

Der blev fremstillet et præparat bestående af:

Natriumalginat 1,4 vægt-%

Calciumphosphat-Tl 2,0 "

Natriumlaurylsulfat 1,0 2 0 Aroma spor

Farve spor

Vand 95,5 " EKSEMPEL 16 - Flydende tandrensemiddel

Som i eksempel 15, men tilsat 0,5 % natriumfluorid.

25 EKSEMPEL 17 - Mundskyllemiddel

Der blev fremstillet følgende præparat: DK 173565 B1 20

Calciumphosphat-Tl 2,0 vasgt-%

Natriumfluorid 0,5

Aroma spor

Farve spor 5 Vand 97,5 " EKSEMPEL 18 - Carboniseret drik 0,1 vægt-% calciumphosphat-Tl blev tilsat til en kommercielt tilgængelig carboniseret drik.

EKSEMPEL 19 - Frugtsaft 10 0,1 vægt-% calciumphosphat-Tl blev tilsat til en kommer cielt tilgængelig frugtsaft.

EKSEMPEL 20 - Opløsning til topisk påføring på tænder

Calciumphosphat-Tl 2 vægt-%

NaF 0,6 kiM

15 Zn-acetat 0,1 mM

SrCl2 0,1 mM

(Denne opløsning kan omdannes til en gel ved at man forøger mængden af calciumphosphat-Tl).

EKSEMPEL 21 - Tandfyldningsmateriale 20 Calciumphosphat-Tl 5 vægt-%

Calciumphosphat 95

Polymerisator spor fremstillet som en pasta med vand.

Den i dette eksempel anvendte polymerisator var glutar-25 aldehyd.

DK 173565 B1 21 EKSEMPEL 22 - Tandfyldningsmateriale

Calciumphosphat-Tl 5 vaegt-%

Calciumphospat 70

Acrylisk polymer 25 " 5 Katalysator for polymer spor EKSEMPEL 23 - Topisk gel til behandling af hypersensitive tænder

Calciumphosphat-Tl 4,0 vaegt-%

Sr?2 1,0 " 10 Aroma spor

Vand 95 I de ovenstående eksempler blev calciumphosphat-Tl anvendt til belysning, men i stedet kan anvendes ethvert passende phosphopeptid og/eller salt deraf.

15

Claims (26)

1. Præparat til anvendelse ved inhibering af caries, kendetegnet ved, at det omfatter et eller flere phosphopeptider valgt blandt:

2. Præparat med anticariogen aktivitet, kendeteg-15 net ved, at det omfatter et eller flere phosphopeptider valgt blandt: TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-20 Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-lle-Thr-Arg; T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; T4. Asn—Ala—Asn—Glu—Glu—Glu—Tyr—Ser—Ile—Gly—Pse—Pse—Pse— Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; og 25 T5. Glu—Gin—Leu—Pse—Pth—Pse—Glu—Glu—Asn—Ser—Lysj DK 173565 B1 i form af en syre eller et salt, men ikke inkluderer et præparat, som er en total tryptisk nedbrydning af casein, og med den begrænsning at hvor phosphopeptidet omfatter TI alene, omfatter præparatet ikke sekvensen:

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det omfatter peptidet: TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ile-10 Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; og et eller flere af phosphopeptiderne: T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg ? T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-15 Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; og T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

4. Phosphopeptidet Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile-Pse-Pse-20 Pse-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys.

5. Phosphopeptidet Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg.

5 Asp-Ile-Gly-Pse-Glu-Pse-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met-Glu-Asp-Ile-Lys.

5 TI. Glu-Met-Glu-Ala-Glu-Pse-Ile~Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-lle-Val-Pro-Asn-Pse-Val-Glu-Gln-Lys; T2. Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Pse-Leu-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-ile-Thr-Arg; T3. Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Ser-Ile-10 Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys; T4. Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-lle-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys; og T5. Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys.

6. Phosphopeptidet Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Pse-Pse-Pse-25 Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Pse-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys. DK 173565 B1

7. Phosphopeptidet Asn-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Pse-Pse-Pse-Glu-Glu-Pse-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys.

8. Phosphopeptidet Glu-Gln-Leu-Pse-Pth-Pse-Glu-Glu-Asn-5 Ser-Lys.

9. Phosphopeptid eller salt deraf ifølge et hvilket som helst af kravene 4-8 og i hovedesageligt ren form.

10. Blanding af phosphopeptider eller salte deraf, hvori et phosphopeptid eller salt deraf ifølge et hvilket som 10 helst af kravene 4-9 er overvejende.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et phosphopeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 4-9, kendetegnet ved, at en nedbrydning af casein, as-ca-sein, β-casein eller et salt deraf fraktioneres.

12. Præparat, kendetegnet ved, at det indehol der et phosphopeptid eller salt deraf ifølge et hvilket som helst af kravene 4-9 sammen med et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

13. Præparat ifølge krav 12, kendetegnet ved, 20 at phosphopeptidet eller saltet deraf er tilstede i præparatet i en mængde på 0,01-10 vægt-%.

14. Præparat ifølge krav 12, kendetegnet ved, at phosphopeptidet eller saltet deraf er tilstede i præparatet i en mængde på 0,01-5 vægt-%.

15. Præparat ifølge krav 12, kendetegnet ved, at phosphopeptidet eller saltet deraf er tilstede i præparatet i en mængde på 0,01-2 vægt-%. DK 173565 B1

16. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 12-15, kendetegnet ved, at fortyndingsmidlet er et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

17. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 12- 5 15,kendetegnet ved, at fortyndingsmidlet er et oralt indtageligt materiale.

18. Præparat ifølge krav 17, kendetegnet ved, at fortyndingsmidlet er et spiseligt materiale.

19. Præparat ifølge krav 18, kendetegnet ved, 10 at det har form af et næringsmiddel eller konfekt.

20. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 12-15, kendetegnet ved, at det har form af en tandpasta, et tandpulver, et tandrensemiddel, et mundskyllemiddel eller et præparat til topisk påføring på 15 tænder eller gummevæv.

21. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 12-15, kendetegnet ved, at det har form af en gel.

22. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 12- 20 15,kendetegnet ved, at det har form af et tandfyldningspræparat.

23. Præparat ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det desuden indeholder calciumphosphat eller hydroxya-patit.

24. Præparat, kendetegnet ved, at det indehol der et phosphopeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 4-9 samt calciumphosphat eller hydroxyapatit. DK 173565 B1

25. Præparat ifølge krav 24, kendetegnet ved, at det indeholder ca. 16 mol CaHPC>4 pr. mol phosphopep-tid.

26. Præparat ifølge krav 24 eller 25, kendeteg-5 net ved, at det har form af en opløsning eller gel.