FI87072C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara kastanosperminestrar - Google Patents

Description

1 87072

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kastanospermii-niestereiden valmistamiseksi

Kastanospermiini on alkaloidi, joka on eristetty 5 Castanospermum australen siemenistä, ja sen kaava on seu-raava: HO^

io /—N

".....yj

OH OH

15 Tämä yhdiste voidaan nimetä systemaattisesti useilla tavoilla seuraavasti: [lS-(Ια,6β,7β,8β,8ββ)]-oktahydro- 1,6,7,8-indolitsiinitetroli tai (IS,6S,7R,8R,8aR)-l,6,7,8-tetrahydroksi-indolitsiini tai 1,2,4,8-tetradeoksi-l,4,8-20 -nitrilo-L-glysero-D-galakto-oktitoli. Termiä kastanospermiini tai ensimmäistä systemaattista nimeä käytetään allaolevassa selostuksessa.

Tämän yhdisteen eristämisen ja sen rakenteen määrittämisen on kuvannut L.D. Hohenshutz ym.. Phytochemistry 25 20, 811 (1981). Osana kastanospermiinitutkimustaan Hohen shutz valmisti kastanospermiinitetra-asetaattia kastano-spermiinin reaktiolla hyvin suuren ylimäärän kanssa etik-kahappoanhydridia, mutta artikkelissa ei mainita kastano-spermiinin mitään muita estereitä.

30 Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä uu sien terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan I mukaisten kastanospermiiniestereiden ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, 35 2 87072 HO^. ..

/-N

5 R"0......^ (I)

OR' OR

10 jossa kaavassa R, R' ja R" tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä, Cx_10-alkanoyyliä, —\ 0 ryhmää \\— c_ , 15 pyridiinikarbonyyliä, tiofeenikarbonyyliä tai furaanikar-bonyyliä, Y on vety, Cx_4-alkyyli, Cx_4-alkoksi tai halogeeni ja Y' on vety, Cx_4-alkyyli, C1.4-alkoksi tai halogeeni, jolloin vähintään yksi, mutta enintään kaksi, symboleista R, R' ja R" tarkoittaa vetyä.

20 Ylläkuvatut Cx_xo-alkanoyyliryhmät voivat olla suora- tai haaraketjuisia ja niistä ovat esimerkkinä formyyli, asetyyli, propionyyli, butyryyli, isobutyryyli, heksanoyy-li, oktanoyyli ja dekanoyyli. Ylläkuvatuista halogeeneista ovat esimerkkinä fluori, kloori, bromi tai jodi. Ylläku-25 vatut C1.4-alkyyliryhmät, joko yksin tai osana alkoksiryh-mää, voivat olla suora- tai haaraketjuisia, korkeintaan neljä hiiliatomia sisältäviä alkyyliryhmiä. Esimerkkinä sellaisista ryhmistä ovat metyyli, etyyli, propyyli ja bu-tyyli, metoksi, etoksi ja butoksi. Ylläesitetyt pyridiini-30 karbonyyli-, tiofeenikarbonyyli- ja furaanikarbonyyliryh- mät käsittävät monia asemaisomeereja ja näistä ovat esimerkkinä nikotinyyli, isonikotinyyli, tiofeeni-2-karbonyy-li, tiofeeni-3-karbonyyli, furaani-2-karbonyyli, tiofeeni- 3-karbonyyli, furaani-2-karbonyyli ja furaani-3-karbonyy-35 li.

3 87072

Ylläkuvatut happoadditiosuolat farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa vastaavat amiineja tässä keksinnössä. Valaisevia esimerkkejä sellaisista suoloista ovat epäorgaanisten happojen, kuten esimerkiksi vetyklori-5 din, vetybromidin, rikkihapon, fosforihapon ja vastaavien suolat; orgaanisten karboksyylihappojen, kuten esimerkiksi etikka-, propioni-, glykoli-, maito-, pyruvaatti-, malo-ni-, meripihka-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, as-korbiini-, maleiini-, hydroksimaleiini- ja dihydroksima-10 leiini-, bentsoe-, fenyylietikka-, 4-aminobentsoe-, 4- hydroksibentsoe-, antraniili-, kaneli-, salisyyli-, 4-ami-nosalisyyli-, 2-fenoksibentsoe-, manteli- ja vastaavien happojen suolat; ja orgaanisten sulfonihappojen, kuten metaanisulfonihapon ja p-tolueenisulfonihapon suolat. Sel-15 laisia suoloja voidaan valmistaa tavanomaisilla menetel millä tämän keksinnön mukaisesta amiinista ja sopivasta haposta.

Esillä olevan keksinnön mukaiset edulliset yhdisteet ovat niitä, joissa R''' on vety. Lisäksi yhdisteiden 20 edullinen ryhmä on ne, joissa R, R' ja R'1 ovat 1- tai 2-alkanoyyli- tai bentsoyyliryhmiä, joissa bentsyyli on sub-stituoitu Y:llä ja Y':llä yllä kuvatulla tavalla.

Esillä olevan keksinnön mukaisia estereitä valmistetaan kastanospermiinin reaktiolla sopivan happoklori-25 din tai -anhydridin kanssa inertissä liuottimessa. Haloge-nidi voi olla kloori tai bromi ja anhydridi käsittää seka-anhydrideja. Käytettävän happohalogenidin tai -anhydridin suhteellinen määrä, liuottimen suhteellinen määrä, lämpötila ja reaktioaika ovat kaikki säädetyt asyloituvien hyd-30 roksiryhmien määrän minimoimiseksi. Siten hapon johdannaista käytetään vain rajoitetusti ylimäärin, joka tarkoittaa enintään noin kolminkertaista ylimäärää asyloivaa agenssia. Liuottimen käyttö suhteellisen suurina määrinä aiheuttaa reagoivien aineiden laimentumisen ja ehkäisee 35 pitemmälle asyloitujen tuotteiden muodostumisen. Käytettävä liuotin on edullisesti sellainen, että se liuottaa 4 87072 käytettävät reagoivat aineet reagoimatta itse niiden kanssa. Edelleen on edullista toteuttaa reaktio tertiaarisen amiinin läsnäollessa, joka reagoi mukana ja poistaa kaiken reaktion aikana muodostuneen hapon. Tertiääristä amiinia 5 voidaan lisätä seokseen tai sitä voidaan käyttää ylimäärin ja se toimii siten liuottimena. Pyridiini on tässä suhteessa edullisin liuotin. Kuten yllä on osoitettu, aika ja lämpötila ovat samalla tavoin säädetyt rajoittamaan tapahtuvan asylaation määrää. Reaktio toteutetaan edullisesti 10 jäähdyttäen jäähauteessa 16 tunnin ajan, jolloin saadaan monoestereitä, ja jos halutaan diestereitä, reaktioaikaa pidennetään, kuten esimerkiksi 7 päiväksi. Reaktio voidaan suorittaa korkeammassa lämpötilassa ja itse asiassa kuumentaa voidaan niin kauan kuin eri vaikuttavat tekijät on 15 oikein säädetty. Kun reaktio on suoritettu kuvatulla tavalla, lopullinen reaktioseos sisältää yhä huomattavan määrän reagoimatonta kastanospermiiniä. Tämä reagoimaton materiaali voidaan saada erilleen reaktioseoksesta ja uudelleen kierrättää seuraavissa reaktioissa, ja siten se 20 lisää esteriksi muutetun kastanospermiinin kokonaismäärää. Tämä uudelleenkierrätys on erityisen tärkeä, kun reaktio suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, jotka suosivat mono-esterien eristämistä.

Ylläkuvatut menetelmät tuottavat yleensä 6- tai 7-25 monoestereitä tai 6,7- tai 6,8-diestereitä. Muita isomeerejä voidaan aikaansaada käyttämällä sopivia suojaryhmiä. Siten kastanospermiinin voidaan antaa reagoida esimerkiksi 2-dibromimetyylibentsoyylikloridin kanssa, jolloin tuloksena on 6,7-diesteri. Tämän diesterin annetaan sitten 30 reagoida sopivan happohalogenidin tai -anhydridin kanssa, ja tuloksena on vastaava 8-esteri. Kaksi suojaryhmää poistetaan sitten heti muuttamalla kaksi dibromimetyyliryhmää formyyliksi (käyttäen hopeaperkloraattia ja 2,4,6-kolli-diinia asetonin vesiliuoksessa), jota seuraa formyyli-35 bentsoehappoesterin hydrolyysi, joka aikaansaadaan käyt- 5 87072 täen morfoliinia ja hydroksidi-ioneja. Esitettyä menetelmää voidaan käyttää samalla tavoin diesteri-isomeerien

Esilläolevat yhdisteet ovat hyödyllisiä diabeteksen hoidossa. Niitä voidaan käyttää erityisesti ehkäise-5 mään liiallisen hyperglykemian kehittymistä, jollaista voidaan havaita tietyissä diabeettisissa olosuhteissa nautittaessa glukoosin prekursoria. Niinpä kun hiilihydraattia nautitaan glukoosina tai sellaisissa muodoissa kuin ruoan tai juoman maltoosina, sakkaroosina tai tärkkelykse-10 nä, seerumin glukoosikonsentraatiotaso nousee korkeaksi. Terveillä yksilöillä tämä hyperglykeeminen tila palaa nopeasti normaaliksi organismin metaboloitua ja varastoitua ja/tai hyödynnettyä nopeasti veren glukoosin. Sokeritaudissa potilaan glukoosinsietokyky on kuitenkin alentunut 15 ja kehittynyt epätavallisen korkea seerumin glukoositaso jää korkeaksi pitemmäksi ajaksi. Samanlainen ihmisessä todettu reaktio voidaan havaita muissakin eläimissä käsittäen karjan, siipikarjan, lemmikkieläimet ja laboratorio-eläimet. Sellaista tilaa voidaan kuvata aterianjälkeiseksi 20 hyperglykemiaksi. Eräs keino sellaisen tilan hoitamiseksi olisi tiettyjen agenssien antaminen, jotka estäisivät so-kerikompleksien konversion glukoosiksi ja siten estäisivät korkean glukoositason kehittymisen. Esillä olevassa keksinnössä on havaittu, että milloin korkea glukoositaso on 25 sokerikompleksien hydrolyysin tulosta, esillä olevien kas-tanospermiinijohdannaisten anto ehkäisee alkavaa glukoosin muodostumista veressä ja tekee siten mahdolliseksi välttää pitkittyneestä seerumin korkeasta glukoositasosta aiheutuvia vaikeuksia.

30 Mekanismi, jonka avulla tämä tulos saavutetaan, on seuraava, vaikkakin ylläkuvattua höytyä ei saisi rajoittaa tämän mekanismin yksityiskohtiin. Entsyymit, jotka katalysoivat kompleksisten hiilihydraattien hydrolyysia, muuttavat absorboitumattoman hiilihydraatin absorboituvik-35 si sokereiksi. Näiden entsyymien nopea toiminta johtaa 6 B 7 C'/ 2 sokeritaudissa seerumin glukoosin akuuttiin ja ei-toivottuun kohoamiseen. Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat näiden entsyymien potentiaalisia inhibiittorei-ta ja annettuna yhdessä hiilihydraattiaterian kanssa ne 5 estävät tämän tyyppisiä vahingollisia hyperglykeemisiä poikkeamia. On kuitenkin toivottavaa, että näiden hydro-lyyttisten entsyymien inhibointi rajoitettaisiin suolistossa oleviin entsyymeihin ja näin onkin esillä olevien yhdisteiden kohdalla. Toisaalta koko elimistöön vaikutta-10 vien glykohydrolaasien inhibointi voi johtaa vaikeuteen hyödyntää solunsisäisiä hiilihydraatteja energian lähteenä ja siten aiheuttaa metabolisia ongelmia. Ensimmäinen ylläkuvattu entsyymi on suoliston sakkaraasi, kun taas toinen entsyymi on solunsisäinen lysosomaalinen α-glukosidaasi. 15 Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden aktiivisuus näitä entsyymejä vastaan testattiin seuraavilla menetelmillä.

Suoliston sakkaraasi

Sakkaraasi eristettiin rotan suolistosta raakahomo-20 genaattina Kolinskan suolauuttomenetelmän mukaan [Biochem. Biosphys. Acta, 284, 235 (1984)]. Inkubointiseokset sisälsivät 10 μΐ entsyymipreparaattia ja lisäksi testiyhdistet-tä ja niitä inkuboitiin 1 tunti, minkä jälkeen lisättiin 6,6 pmol sakkaroosia 100 ul:ssa 0,1 M natriummaleaattia, 25 pH 5,9. Seoksia inkuboitiin lisää 30 min ja sitten ne läm-pöinaktivoitiin 80 - 100 °C:ssa 3 minuuttia. Denaturoitu proteiini poistettiin sentrifugoimalla. Vapautunut glukoosi määritettiin glukoosidehydrogenaasireagensseilla (Seragen Diagnostics).

30 Lysosomaalinen a-glukosidaasi

Lysosomaalinen α-glukosidaasi eristettiin ja osittain puhdistettiin rotan maksasta Dissous'in fraktioivan ammoniumsulfaattimenetelmän mukaan [Anal. Biochem., 116, 35 (1981)]. Entsyymiä inkuboitiin testiyhdisteen 35 kanssa 1 tunti 37 °C:ssa ennen p-nitrofenyyli-a-D-glukosi- 7 87072 din lisäystä 0,6 ml:ssa 0,1 M natriumasetaattia, 25 mM kaliumkloridia, pH 4,2. Seoksia inkuboitiin lisää 30 min. 37 °C:ssa ja sitten ne lämpöaktivoitiin 90 °C:ssa. Denaturoitu proteiini poistettiin sentrifugoimalla. Supernatant-5 tifraktioon lisättiin 1 ml 0,1 M natriumkarbonaattia, ja vapautunut nitrofenoli määritettiin 410 nm:n absorptiolla.

Tulokset, jotka saatiin ylläkuvatulla tavalla testaamalla esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä, voidaan esittää tiivistelmänä seuraavassa taulukossa. Taulu-10 kossa 1 on esitetty vertailun vuoksi tulokset myös kasta-nospermiinille.

Taulukko 1 IC50 15 _

Kastanospermiini- Suoliston Lysosomaalinen johdannainen sakkaraasi a-glukosidaasi _(M)_(M) 6-bentsoaatti 8 χ 10'8 8 x 10'4 20 6-( 4-fluoribentsoaatti) 2 x 10‘7 4 χ 10'6 6-( 4-metyylibentsoaatti) 3 x 10‘7 1 χ 10'3 6- ( 4-metoksibentsoaatti) 2 χ ΙΟ'6 1 χ 10'3 7- bentsoaatti 2 χ 10'6 2 χ 10'4 7-(4-fluoribentsoaatti) 4 x 10‘7 6 χ 10'6 25 7-( 2,4-diklooribentsoaatti) 4 χ 10'7 1 χ 10'4 6.7- dibentsoaatti 2 x 10‘6 > 10'3 6.7- bis-(4-fluoribentsoaatti ) 4 χ 10'6 > 10'3 6.8- dibutyraatti 2 χ 10'7 > 10"3 30 kastanospermiini 1 χ 10'8 1 x 10'7

Ylläolevista tuloksista voidaan havaita, että esillä olevien yhdisteiden IC50-arvot ovat alhaisemmat suoliston sakkaraasin kuin lysosomaalisen α-glukosidaasin suh-35 teen, ts. keksinnön mukaisilla yhdisteillä IC,,0-arvot suo- 8 87072 liston sakkaraasin suhteen poikkeavat selvästi IC50-arvois-ta lysosomaalisen α-glukosidaasin suhteen. Esillä olevassa keksinnössä pyrittiin nimenomaan sellaisiin yhdisteisiin, joilla olisi selvä ero näissä aktiivisuuksissa. Tarkastel-5 taessa sen sijaan vertailuyhdisteen, kastanospermiinin, vastaavia arvoja, ei havaita yhtä selvää eroa näiden kahden aktiivisuuden välillä. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat tässä suhteessa selvästi kastanospermiiniä edullisempia.

10 Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet testat tiin edelleen sakkaroosirasitustestillä niiden seerumin glukoosin kohoamista inhiboivan kyvyn määrittämiseksi. Menetelmä voidaan esittää tiivistelmänä seuraavasti.

Sveitsiläisille ICR-hiirille, joita oli paastotet-15 tu 18 - 20 tuntia, annosteltiin suun kautta testiyhdis-tettä plus sakkaroosia 2,0 g/kg. 30 minuuttia sakkaroosin antamisen jälkeen eläimet tapettiin ja määritettiin niiden seerumin glukoosikonsentraatio. Se määrä testi-yhdistettä, joka tarvittiin merkittävästi inhiboimaan 20 seerumin glukoosin kohoamista, määritettiin vertaamalla sellaisten eläinten seerumin glukoosikonsentraatioon, joille oli annosteltu vain sakkarosia. Testin kuluessa hiirille annosteltiin ainetta suun kautta kahdesti. Alkuannos oli testiyhdiste tai liuotin. 1, 2 tai 3 tunnin 25 kuluttua hiirille annosteltiin sakkaroosia 2,0 g/kg. 30 lisäminuutin kuluttua sakkaroosin antamisesta eläimet tapettiin ja määritettiin niiden glukoosikonsentraatio. Testiyhdisteen aktiivisuus osoitettiin merkittävällä seerumin glukoosikonsentraation erolla verrattuna vas-30 taavaan vertailunäytteeseen. Havaittu aktiivisuus voidaan esittää tiivistelmänä seuraavasti: Q r ·~ι (" τ r» y ö / L / l

Taulukko II

Kastanospermiini- Tehokas annos Toimenpiteen johdannainen_(mg/kg )_kesto_ 5 6-bentsoaatti 1 1 tunti 6- (4-fluoribentsoaatti) 5 7- bentsoaatti 5 7-(4-fluoribentsoaatti) 5 2 tuntia 7-(2,4-diklooribentsoaatti) 20 10 6,7-dibentsoaatti 20

Imettäväiselle annetaan tarvittaessa sopivalla tavalla yhtä yhdisteistä sellainen määrä, joka on tehokas inhiboimaan aterianjälkeistä hyperglykemiaa. Tämän kek-15 sinnön mukaisiin tarkoituksiin antamista suun kautta pidetään parempana.

Yhdisteen tehokas määrä, ts. määrä, joka on riittävä inhiboimaan aterianjälkeistä hyperglykemiaa, riippuu monista tekijöistä, kuten hoidettavan eläimen koosta, la-20 jista ja iästä, käytettävästä tietystä yhdisteestä tai farmaseuttisesti hyväksyttävästä suolasta, antamisen tois-tumistiheydestä, tilan ankaruudesta ja antamisajasta. Yleisesti ottaen yhdisteet tulisi antaa suun kautta 0,1 -50 mpk:n annoksina 0,5 mpk:n annosta pidettäessä 5 mpk:n 25 annosta parempana. Erityisesti esillä olevat yhdisteet tulisi antaa ihmisille 35 - 350 mg aktiivista ainetta sisältävinä yksittäisinä osa-annoksina ja siten, että materiaali annetaan kolmasti päivässä ateria-aikana. Aktiivinen aineosa on edullisesti sisällytetty yhdisteeseen, joka 30 sisältää farmaseuttisen kantajan ja 5 - 90 paino-% keksinnön mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa. Termi farmaseuttinen kantaja viittaa tunnettuihin farmaseuttisiin täyteaineisiin, jotka ovat hyödyllisiä formuloitaessa farmaseuttisesti aktiivisia yhdis-35 teitä annettavaksi sisäisesti eläimille, ja jotka ovat 10 87072 suurin piirtein myrkyttömiä ja herkistämättömiä käyttöolosuhteissa. Yhdisteitä voidaan valmistaa yleisesti tunnetuilla tablettien, kapselien, eliksiirien, siirappien, emulsioiden, dispersioiden ja liuotettavien ja poretablet-5 tien valmistustekniikoilla, ja ne voivat sisältää sopivia täyteaineita, joiden tiedetään olevan hyödyllisiä halutun tietyn tyyppisen yhdisteen valmistamisessa. Sopivia farmaseuttisia kantajia ja formulointitekniikoita on löydettävissä vakioteksteistä kuten Remington's Pharmaceutical 10 Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Seuraavat esimerkit esitetään kuvaamaan esillä olevaa keksintöä. Niitä ei kuitenkaan pitäisi tulkita rajaamaan sitä millään tavalla.

Esimerkki 1 15 Seosta, joka sisälsi 4,0 g kastanospermiiniä 140 ml:ssa pyridiiniä, sekoitettiin huoneenlämmössä 30 minuuttia, kunnes ehdottomasti kaikki kiinteä aine oli liuennut. Liuos jäähdytettiin 0 °C:een jää/vesihauteessa, ja liuosta, joka sisälsi 5,85 ml bentsoyylikloridia 15 ml:ssa py-20 ridiiniä, lisättiin tipoittain 15 minuutin ajan typen suojaamana. Lisäyksen jälkeen reaktioseosta sekoitettiin 8 °C:ssa yön yli.

Reaktioseos jaettiin 225 ml:11a metyleenikloridia ja 300 ml:lla vettä. Orgaaninen kerros erotettiin ja vesi-25 kerros uutettiin kahdella annoksella 225 ml metyleenikloridia. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin peräkkäin 150 ml:11a 0,5 N vetykloridia, kyllästetyllä natriumkarbonaatilla, vedellä ja kyllästetyillä natriumkloridiliuok-silla ja kuivattiin sitten natriumsulfaatilla. Liuotti-30 mien haihduttaminen alipaineessa tuotti 2,9 g kullanruskeata, lasimaista jäännöstä.

Tämä materiaali sekoitettiin kloroformiin, ja muodostui valkea sakka. Tämä kiinteä aine eristettiin ja tuloksena oli 910 mg valkeaa jauhetta. Ohutkerroskromatogra-35 fia-analyysi (85:15, etyyliasetaatti:metanoli) osoitti 11 87072 materiaalin koostuvan kahdesta komponentista (Rf 0,33 ja Rf 0,26). Kiinteä seos sekoitettiin 45 ml:aan etyyliasetaatti imetanoli -seosta (4:1) ja suodatettiin. Sakka kuivattiin vakuumissa ja tuloksena oli 350 mg [1S-5 (Ια, 6β, 7a, 8β, 8a3) ]oktahydro-l, 6,7,8-indolitsiinitetroli- 6-bentsoaattia kiinteänä valkoisena jauheena, joka suli hajoamalla noin 233 - 236 °C:ssa. Tämä oli yhtäpitävä seoksen vähemmän polaarisen yhdisteen kanssa. NMR (DMSO-d6) S 1,5 - 2,2 (m, 5H), 2,9 - 3,6 (m, 4H), 4,1 (m, 1H, CtH), 10 4,3 (d, 1H, -OH), 4,7 (d, 1H, -OH), 4,8 (sekstetti, 1H, C6-H), 5,1 (d, 1H, -OH), 7,6 - 8,1 (m, 5H, aryyli.

MS (CI-CHJ 294 (MH*), 276 (MH*-H20), 172 (MH*-PhC02H) .

Ylläsaatu suodos kondensoitiin ja fraktioitiin pre-paratiivisella ohutkerroskromatografiällä (silikageeli 15 80:20, etyyliasetaatti:metanoli) ja tuloksena oli 120 mg polaarisempaa komponenttia, [lS-(lct,63,7a,83,8a3 ) ]oktahyd-ro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli-7-bentsoaattia kiinteänä valkoisena jauheena, joka suli noin 200 - 202 °C:ssa.

NMR (DMS0-d6 + D20) 1,5 - 2,2 (m, 5H), 2,9 - 3,1 20 (m, 2H), 3,6 - 3,8 (m, 2H), 4,1 (m, 1H, C^-H), 4,8 (t, 1H, C7-H), 7,4 - 8,1 (m, 5H, aryyli). MS (CI-CH4) 294 (MH*-H20), 172 (MH*-PhC02H). Tämän yhdisteen rakennekaava on seuraava: 25 /

)-N

HO....../ \

30 y-C-0 OH

Esimerkki 2

Kastanospermiiniä (1,89 g) lisättiin 10 ml:aan py-35 ridiiniä, jota sekoitettiin, ja seos jäähdytettiin 0 °C:een 12 87072 jäähauteessa. 3,0 g bentsoyylikloridia lisättiin tipoit-tain seokseen, ja tulokseksi saatua suspensiota pidettiin 0-4 °C:ssa 7 päivää. Lisättiin 10 ml vettä, ja seos haihdutettiin kuivaksi vakuumissa. Tulokseksi saatu sakka 5 liuotettiin uudelleen 100 ml:aan vesi:etyyliasetaattia (1:1) ja faasit erotettiin. Vesikerros uutettiin jälleen 100 ml:11a etyyliasetaattia. Orgaaniset uutteet yhdistettiin ja konsentroitiin siirapiksi, joka osoittautui kahden pääkomponentin seokseksi ohutkerroskromatografiällä (1:1 10 etyyliasetaatti:heksaani, silikageeli, Rf = 0,42 ja Rf = 0,11). Seos erotettiin preparatiivisella korkeapaineneste-kromatografiällä (silikageeli, 1:1 etyyliasetaatti:hek-saani) ja tulokseksi oli 1,9 g (48 %) polaarisempaa [1S-(Ια, 6β, 7a, 8β, 8a3) ]oktahydro-l, 6,7,8-indolitsiinitetroli-15 6,7-dibentsoaattia kuivana vaahtona, joka suli noin 79 - 81 °C: ssa. NMR (DMS0-d6/D20) 6 1,5 - 2,3 (m, 5H), 3,0 - 3,4 (m, 2H), 3,9 (t, 1H), 4,2 (m, 1H, 0Χ-Η), 5,15 (m, 1H, C6-H), 5,3 (t, 1H, C7-H) 7,4 - 8,0 (m, 10H, aryyli).

MS (FAB-Xe) 398 (MH*), 380 (MH*-H20), 276 (MH*-PhC02H). Vä-20 hemmän polaarinenkomponentti (Rf = 0,42) eristettiin kuivana vaahtona, joka suli noin 75 - 78 °C:ssa, ja joka oli [1S~( Ια, 6β,7a,8β,8a8)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitet-roli-6,7,8-tribentsoaatti.

Esimerkki 3 25 Kun esimerkin 1 mukainen menetelmä toistettiin käyttäen kastanospermiiniä ja sopivaa happokloridia, saatiin seuraavat yhdisteet: [lS-( Ια, 6β,7α,8β,8ββ)]-oktahydro-1,6,7,8-indolit-siinitetroli-6-(4-fluoribentsoaatti), joka suli noin 216 -30 218 °C:ssa.

[lS-( Ια, 6β,7a,8β,8aβ)]-oktahydro-1,6,7,8-indolit-siinitetroli-7-(4-fluoribentsoaatti), joka suli noin 190 -193 °C:ssa.

[ lS-(1α,6β,7α,8β,83β)]-oktahydro-1,6,7,8-indolit-35 siinitetroli-7-(2,4-diklooribentsoaatti), joka suli noin 179 - 181 °C:ssa.

13 87072 [lS-( Ια, 6β, 7α, 8β, 8ββ) ] -oktahydro-1,6,7,8-indolit-siinitetroli-6-(4-bromibentsoaatti), joka suli noin 234 -235 °C:ssa.

[lS-( Ια, 6β, 7a, 8β, 8ββ) ] -oktahydro-1,6,7,8-indolit-5 siinitetroli-7-(4-bromibentsoaatti), joka suli noin 199 -202 °C:ssa.

[lS-( Ια, 6β, 7a, 8β, 8θβ ) ] -oktahydro-1,6,7,8-indolit-siinitetroli-6-(4-metoksibentsoaatti), joka suli noin 221 - 224 °C:ssa.

10 Esimerkki 4

Kun esimerkin 2 mukainen menetelmä toistettiin käyttäen kastanospermiiniä ja 4-fluoribentsoyylikloridia, lopputuote oli [1S~(Ια,6β,7a,8β,8a8)]-oktahydro-1,6,7,8-lndolitsiinitetroli-6,7-bis(4-fluoribentsoaatti), joka 15 suli noin 82 - 84 °C:ssa.

Esimerkki 5

Suspensioon, joka sisälsi 3 g kastanospermiiniä 30 ml:ssa pyridiiniä 0 °C:ssa lisättiin tipoittain 3 g 4-me-tyylibentsoyylikloridia sisältävä liuos. Lisäyksen jälkeen 20 seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpöiseksi, ja sitten sitä kuumennettiin 55 °C:ssa 24 tuntia. Reaktioseos laimennettiin 10 ml:11a vettä ja haihdutettiin kuivaksi vakuu-missa. Jäljellejäänyt sakka sekoitettiin 150 ml:aan vesi :metyylikloridi -seosta (1:2). Liukenematon materiaali 25 erotettiin suodatuksella, jolloin saatiin amorfinen, murretun valkoinen kiinteä aine, joka liuotettiin 60 ml:aan kuumaa metanolia, käsiteltiin 0,5 g:lla aktiivipuuhiiltä ja suodatettiin. Väritön suodos jäähdytettiin, jolloin saatiin värittömiä [1S~(Ια,6β,7a,8β,8afi)]-oktahydro-30 1,6,7,8-indolitsiinitetroli-6-(4-metyylibentsoaatti) -ki teitä, jotka sulivat hajoten noin 255 - 258 °C:ssa (580 mg, saanto 12 %).

Yllä saatu kaksifaasinen vesi/metyleenikloridi -seos haihdutettiin kuivaksi ja sakka liuotettiin 50 35 ml:aan metanoli:etyyliasetaatti -seosta (1:2). Liuos frak- 14 87072 tioitiin preparatiivisella korkeapainenestekromatografiällä (silikageeli, 9:1 etyyliasetaatti:metanoli), ja fraktiot, jotka sisälsivät polaarisemman komponentin (ts. po-laarisemman kuin edellisessä kappaleessa saatu 6-esteri) 5 kerättiin talteen ja haihdutettiin vakuumissa, ja lopputuotteena oli väritön kiinteä aine, joka oli [1S-(Ια,6β,7a,8β,88β)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli-7-(4-metyyllbentsoaatti), joka suli hajoten noin 220 - 223 °C:ssa (210 mg, saanto 4 %).

10 Esimerkki 6

Kun esimerkin 5 mukainen menetelmä toistetaan käyttäen kastanospermiiniä ja sopivaa happokloridia, saadaan seuraavia estereitä: 6-(2-metyylibentsoaatti), joka sulaa noin 213 - 215 15 °C:ssa.

6-(3-metyylibentsoaatti), joka sulaa hajoten noin 212 °C:ssa.

6-(2-tiofeenikarboksylaatti), joka sulaa noin 214 -215 °C:ssa 20 6-(2-furaanikarboksylaatti), joka sulaa noin 209 - 212 °C:ssa

Esimerkki 7 350 mg:aan kastanospermiiniä lisättiin 5 ml pyri-diiniä ja sekoitettiin typen suojaamana huoneenlämmössä.

25 Lisättiin tipoittain 0,97 g voihappoanhydridia, ja seosta pidettiin huoneenlämmössä 24 tuntia. Reaktioseos haihdutettiin kuivaksi vakuumissa, jolloin jäi siirappinen jäännös. Jäännös liuotettiin eetteriin ja pentaanin lisäyksellä saostettiin väritön kiinteä sakka. Kiinteän aineen uu- 30 delleenkiteytys eetterin ja petroolieetterin seoksesta antoi värittömiä [1S~(la,6β,7a,8β,8ap)]-oktahydro- 1,6,7,8-indolitsiinitetroli-6,8-dlbutanaatti -neuloja, jotka sulivat noin 110 - 111 °C:ssa (22 mg, saanto 4 %). NMR 6 3,7 (t, 1H, C7-H), 4,1 (m, 1H, Ο^Η), 4,85 (t, 1H, 35 Cg-H), 5,0 (m, 1H, C6-H). MS (CI-CHJ 330 (MH*), 312 (MH+-H20).

is 87072

Esimerkki 8

Suspensioon, joka sisälsi 1,5 g kastanospermiiniä 15 ml:ssa pyridiiniä, ja joka oli jäähdytetty jäähautees-sa 0 °C:een, lisättiin sekoittaen tipoittain 1,0 g butyy-5 likloridia. Seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 3 päivää, ja se lisättiin vesirmetyleenikloridi-seokseen 1:1 (400 ml). Erottamisen jälkeen vesifaasi konsentroitiin vakuumissa, jolloin saatiin 68 mg [IS—(la,68,7a,8p,8a8)]~ oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli-6-butanoaattla,joka 10 oli homogeeninen ohutkerroskromatografiässä (silikageeli, 2:8 metanoli:kloroformi, Rf = 0,5). Lopputuotteen uudel-leenkiteytys 5:95 isopropanoli:heksaanista tuotti värittömän kiinteän aineen, joka suli 113 - 114 °C:ssa. NMR (CDC13) 6' 3,5 - 3,8 (2t, 2H, C7-H ja C8-H, 4,4 (m, 1H, 15 Ct-H), 4,95 (m, 1H, C6-H). MS (CI-CH4) 260 (MH*), 242 (MH*-H20), 172 (MH*-C3H7C02H).

Vastaavasti kun ylläesitetty menetelmä toistettiin käyttäen asetyylikloridia tai propionyylikloridia, saatiin seuraavat monoesterit: 20 [lS-(la,6p,7a,88, 8a3) ] -oktahydro-1,6,7,8-indoli t- silnitetroli-6-asetaatti, joka suli noin 188 - 189 °C:ssa.

[IS-(Ια, 6β, 7α, 8β, 8a8) ] -oktahydro-1,6,7,8-indolit-siinitetroli-6-propionaatti, joka suli noin 153 - 155 °C:ssa.

- - - 25 Esimerkki 9

Seokseen, joka sisälsi 1,0 g kastanospermiiniä ja 30 ml pyridiiniä 0 °C:ssa typen suojaamana, lisättiin 12,2 g isonikotinyylikloridivetykloridia. Tulokseksi saatua keltaista liuosta lämmitettiin 55 °C:ssa 41 tuntia.

30 6 mg:n määrä 4-dimetyyliaminopyridiiniä lisättiin ja pa lautus jäähdytystä jatkettiin 24 lisätuntia. Reaktioseos konsentroitiin ja pantiin tilavuudeltaan 700 ml:n Kie-selgel 60 -kolonniin ja eluoitiin 80:20:1: kloroformi:- metanoli:ammoniumhydroksidilla. Kun oli ensin kerätty 300 • 35 ml eluutioliuosta, kerättiin 100 ml:n fraktioita. Frak- 16 87072 tiot 11 - 21 konsentroitiin ja saatiin 180 mg materiaalia, joka pantiin radikaalikromatografialevylle (2 mm; Kieselgel 60 PF-254) ja eluoitiin 9:1: klorformi^etanolilla. Kun oli eluoitu kolme vyöhykettä, fraktiot, jotka 5 sisälsivät neljännen vyöhykkeen, yhdistettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin [1S~(Ια,6β,7a,8β,8ap)]-oktahyd-ro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli-7-isonikotinaattia valkoisena kiinteänä aineena. NMR (DMS0-d6) S 8,81 (d, J=5,9 Hz, 2H, pyridyylin protonit N:n suhteen orto-asemassa), 7,87 10 (d, J=5,9 Hz, 2H, pyridyylin protonit N:n suhteen meta- asemassa), 4,85 (dd, J=9,2 Hz, 1H, C7-H).

Esimerkki 10 0,38 g kastanospermiiniä lisättiin sekoittaen 5 ml:aan pyridiiniliuosta ja jäähdytettiin jäähauteessa. 15 0,96 g bentsyylikloridia lisättiin tipoittain seokseen, ja tulokseksi saatua suspensiota pidettiin 0-4 °C:ssa 18 tuntia. Lisättiin 5 ml jäävettä, ja seos laimennettiin 50 ml:11a eetteriä. Eetteriliuos erotettiin ja pestiin 1 N vetykloridilla (2 x 50 ml), kyllästetyllä natriumbikarbo-20 naatin vesiliuoksella (50 ml) ja suolavedellä (50 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuivaksi vakuumissa. Tulokseksi saatu jäännös liuotettiin uudelleen 3 ml:aan eetteriä, ja se osoittautui ohutkerroskromatografiässä kahden pääkompo-25 nentin seokseksi (6:4 eetteri:heksaani, silikageeli, Rf = 0,35; 0,20). Seos erotettiin preparatiivisella ohutkerros-kromatografialla (silikageeli, 6:4 eetteri:heksaani), jolloin saatiin 0,30 g (30 %) vähemmän polaarista (Rf = 0,35) [ 1S~( Ια, 6β, 7α, 8β, 8ap ) ]oktahydro-l, 6,7,8-indolitsiinitet-30 roli-1,6,8-tribentsoaattia kiinteänä, kuivana vaahtona, joka suli noin 85 - 87 °C:ssa. NMR (CDC13/D20) £ 1,7 - 2,6 (m, 5H), 3,0 - 4,1 (m, 3H); 5,1 - 5,7 (m, 3H), 7,1 - 8,2 (m, 15H, aryyli). MS (CI-NH3) 502 (MH*), 380 (MH* -PhC02H). Polaarisempi komponentti (Rf = 0,20) eristettiin kuivana 35 vaahtona, joka suli noin 75 - 78 °C:ssa ja oli [1S~(Ια,6β,7a,8β,8ap-oktahydro-l,6,7,8-indolitsiinitetro-li-6,7,8-tribentsoaatti.

Claims (7)

17 87072

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan I mukaisten kastanospermiiniestereiden ja nii- 5 den farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, H°V )-N / \ (i) R"0....../ \ ' ’ OR' OR 15 jossa kaavassa R, R' ja R" tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä, Cj.jQ-alkanoyyliä, Yv—\ 0 ryhmää \S— c- , 20 pyridiinikarbonyyliä, tiofeenikarbonyyliä tai furaanikar-bonyyliä, Y on vety, C1.4-alkyyli, C1.4-alkoksi tai halogeeni ja Y' on vety, C1.4-alkyyli, C1.4-alkoksi tai halogeeni, jolloin vähintään yksi, mutta enintään kaksi, symboleista R, 25 R' Ja R" tarkoittaa vetyä, tunnettu siitä, että kastanospermiini saatetaan reagoimaan sopivan happohaloge-nidin tai -anhydridin kanssa inertissä liuottimessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 30 [lS-(Ια,6β,7a,88,8aö)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitet- roli-6-butanoaatti.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä [1S-(Ια,68,7a,88,8aB)J-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli-6-bentsoaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 35 että kastanospermiini saatetaan reagoimaan bentsoyyliklo-ridin kanssa. 18 87 072

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä [1S-(Ια,6B,7a,8B,8aB) ]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli- 7-bentsoaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kastanospermiini saatetaan reagoimaan bentsoyyliklo- 5 ridin kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä [1S-(Ια,6B,7a,88,8aB)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli- 6- (4-fluoribentsoaatin) valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kastanospermiini saatetaan reagoimaan fluori- 10 bentsoyylikloridin kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä [1S-(Ια,6β,7α,8B,8aB)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli- 7- (4-fluoribentsoaatin) valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kastanospermiini saatetaan reagoimaan fluori- 15 bentsoyylikloridin kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä [1S-(Ια,6β,7a,8B,8aB)]-oktahydro-1,6,7,8-indolitsiinitetroli- 6,8-dibutanoaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kastanospermiini saatetaan reagoimaan voihappoanhyd- 20 ridin kanssa. 19 87072