FI86546C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara spergualinderivat. - Google Patents

Description

1 86546

Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten sper-gualiini3ohdannaisten valmistamiseksi

Spergualiini on antibiootti, jonka Umezawa (yksi 5 kyseessä olevan keksinnön tekijöistä) et ai. ovat keksineet (US 4 416 899). Sen keksimisestä lähtien Umezawa et ai. ovat syntetisoineet monia spergualiinille läheisiä yhdisteitä (US 4 529 549, US 4 556 735, jne.)

Kyseessä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä 10 on immunomoduloiva vaikutus sekä alhainen myrkyllisyys, ja ne on tarkoitettu lääkkeiksi.

Tavanomaisella immunomoduloivalla aineella on yleensä voimakas sivuvaikutus. Sentähden yhdiste, jolla on erinomainen immunomoduloiva vaikutus vähäisin sivuvai-15 kutuksin ja vähäiseen myrkyllisyyteen liittyneenä, on ollut toivottu.

Kyseessä olevan keksinnön kohteena on antaa käyttöön immunomoduloiva aine (immunosupressiivinen tai immu-nostimuloiva aine), jolla on vähentynyt myrkyllisyys. Im-20 munosupressiivisten aineiden uskotaan olevan tehokkaita, esimerkiksi tukahdutettaessa immuniteettia, mitä tarvitaan elinsiirrossa, tai terapeuttisena aineena autoimmuunisairauksiin. Immunostimuloivien aineiden uskotaan olevan käyttökelpoisia parannettaessa sairauksia, joita hei-25 kentynyt immuniteetti aiheuttaa.

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien, kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten spergualiini-johdannaisten ja niiden farmakologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi 30 R R.

h2nx I I1 ^,c-nh-x-(ch2)3-conhchconh-(ch2)4-n-(ch2)3-nh-r2 35 U) 2 86546 jossa kaavassa X on -(CH2)3_5- tai r on -H tai ^K2 NH2 5 -CH2OH; R1 on -H, -CO- tai(CH3)2CHCH2-CH-CO-; R2 on 1) ryhmä, jolla on kaava 10 XK NH2 J^-tCH^-LcO- X2 15 jossa n on 0 tai 1; X2 on -H tai -OH; ja X2 on -H tai -CH2OH, X* I ^ 2) ryhmä, jolla on kaava X0-(CH0) -CH-CO- J z ro 20 jossa m on kokonaisluku 0-4; x3 on -H, -C00H, -OH, -NH2 tai -C0NH2; X4 on -H tai -NH2; ja ainakin toinen X3;sta ja X4:stä on -NH2, 3) ryhmä, jolla on kaava H- (A )y- 25 CH2CH (CH3) 2 jossa y on 1 tai 2; A on -NH-CH-CO- tai 30 [J-CO-; ja, kun y on 2, kaksi As-ryhmää muodostavat

. I

peptidisidoksen, tai 4) ryhmä, jolla on kaava V 35 @-<*2-™ - CH-CO-

NH2 OH

ja kun Rx on muu ryhmä kuin -H, R2 on sama kuin Rx.

3 86546

Kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä ja niiden farmakologisesti hyväksyttävillä suoloilla on erinomainen aktiivisuus, alhainen toksisuus, ja ne ovat erittäin turvallisia.

5 Symboli R2 on aminohappo- tai peptidityyppejä. On huomattava, että näiden aminohappotähteiden stereokemial-linen konfiguraatio on L, D tai DL, paitsi glysiinin, β-alaniinin ja ^ -aminovoihapon.

(1) Aminohapot 10 Alaniini, arginiini, ornitiini, apargiinihappo, asparagiini, kysteiini, kystiini, glutamiinihappo, gluta-miini, pyroglutamiinihappo, glysiini, histidiini, lysii-ni, proliini, hydroksiproliini, isoleusiini, leusiini, metioniini, fenyylialaniini, fenyylillä substituoitu fe-15 nyylialaniini, seriini, treoniini, tryptofaani, homose- riini, tyrosiini, väliini, fenyyliglysiini, p-hydroksife-nyyliglysiini, 4-hydroksimetyyli-3-hydroksifenyyliglysii-ni, β-alaniini,^-aminovoihappo, 3-amino-2-hydroksi-4-fe-nyylivoihappo, jne.

20 (2) Peptidit

Peptideinä ovat edullisia di- ja tripeptidit, joissa kaksi tai kolme samaa tai erilaista, yllä mainittua aminohappoa on liitetty yhteen. Peptidejä valaistaan seuraavin esimerkein.

25 Alanyylialaniini, leusyylileusiini, valyylivalii- ni, fenyylialanyylifenyylialaniini, tyrosyylityrosiini, fenyyliglysyylifenyyliglysiini, glysyyliglysiini, iso-leusyyli-isoleusiini, leusyylifenyylialaniini, fenyyli-alanyylileusiini, leusyylifenyyliglysiini, fenyyliglysyy-30 lileusiini, glysyyliglysyyliglysiini, fenyyliglysyylife-nyyliglysyylifenyyliglysiini, fenyylialanyylifenyyliala-nyylifenyylialaniini, leusyylileusyylileusiini, jne.

Edullisia aminohappoja ja peptidejä ovat esimerkiksi fenyyliglysiini, fenyylialaniini, leusiini, aspara-35 giinihappo, tryptofaani ja alaniini sekä peptidit, jotka 4 86546 muodostetaan kahden tai kolmen mainitun aminohapon kon-densaation avulla. Fenyyliglysiini, fenyylialaniini, leu-syylileusiini jne. ovat edullisemmat.

Seuraavat R2:n merkityset kuuluvat keksinnön pii- 5 riin: (1) ryhmä, jolla on seuraava kaava

Xl\ nh2 ^3-(CH2)n-CH-C0- 10 X ^-( *2 jossa kaavassa n on 0 tai 1; X3 on -H tai -OH; ja X2 on -H tai -CHjOH.

(2) ryhmä, jolla on seuraava kaava 15 f« X,-(CH-) -CH-CO-j i m 20 jossa kaavassa m on kokonaisluku 0-4; X3 on -H, -C00H, -OH, -NH2 tai -C0NH2; X4 on -H tai -NH2; ja vähintään toinen X3:sta ja X4:stä on -NH2.

(3) ryhmä, jolla on seuraava kaava 25 H- (A )y- ch2ch(ch3)2 jossa kaavassa y on kokonaisluku 1 tai 2; A on -NH-CH-CO- tai Q- CO- ; kun y on 2, kaksi As-ryhmää muodostavat

30 I

peptidisidoksen.

(4) ryhmä, jolla on seuraava kaava (f - CH - CH - C0-

35 \=/ 2 I I

NH2 oh R 86546

Yleisen kaavan (I) mukaisia edullisia yhdisteitä ja niiden farmakologisesti hyväksyttäviä suoloja ovat edullisesti esimerkiksi sellaiset yhdisteet, joita saadaan, kun yleisessä kaavassa (I) X on -Ό-’ NH-, | * R on -CH2OH, R2 on -H tai (L tai D) CH-CO-, 10 NH_ I ^ (CH3)2CHCH2CH-CO-, ja R2 on (L tai CH-C0- NH, NH- NH- j 2 _ ( 2 | 2 15 (L)—CH2CH-C0-, (L)—H0--^y-CH2CH-C0-, (L) CH3CH-C0-, NH-, i 2 (L)— (CH3)2CHCH2CH-CO-, tai (L,L)—(CH3)2CHCH2CHCONHCH-CO- 1 20 NH2 CH2CH(CH3)2 tai niiden farmakologisesti hyväksyttävät suolat.

Uudet spergualiinijohdannaiset, joilla on yleinen kaava (I), voivat muodostaa suolan hapon kanssa. Sellainen happo voi olla epäorgaaninen tai orgaaninen happo, 25 sikäli kun se on myrkytön. Mitään rajoitusta ei ole epäorgaanisten happojen suhteen; kuitenkin suolahappo, rikkihappo, typpihappo, fosforihappo, jne. ovat edullisia. Myöskään orgaanisten happojen suhteen ei ole mitään rajoitusta; kuitenkin edullisia ovat etikkahappo, propioni-30 happo, meripihkahappo, fumaarihappo, maleiinihappo, ome-nahappo, viinihappo, glutaarihappo, sitruunahappo, bent-seenisulfonihappo, tolueenisulfonihappo, metaanisulfoni-happo, etaanisulfonihappo, propaanisulfonihappo, aspara-giinihappo, glutamiinihappo, jne.

35 Esimerkkejä kyseessä olevan keksinnön mukaisista, yleistä kaavaa (I) vastaavista hapoista esitetään taulu- 6 86546 kossa 1. Kyseessä olevassa hakemuksessa käytetyillä lyhennyksillä on seuraavat määritelmät.

TAD : triatsadekaani GP : guanidinofenyyli 5 GHep: guanidinoheptanoyyli

For : 4-hydroksimetyyli-3-hydroksifenyyliglysyyli

Aminohappotähteet Ala : alanyyli

Leu : leusyyli 10 Phe : fenyylialanyyli

Asp : aspartyyli

Asn : asparaginyyli

Lys : lysyyli

PhG : fenyyliglysyyli 15 Pro : prolyyli

Tyr : tyrosyyli Ser : seryyli β-Ala : β-alanyyli AHPA : 3-amino-2-hydroksi-4-fenyylibutyryyli 20 Gly : glysyyli

Glu : glutamyyli J^-ABA : -aminobutyryyli

Suojaavia ryhmiä Z : bentsoyylikarbonyyliryhmä 25 Boc : t-butyylioksikarbonyyliryhmä pMZ : p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhmä Aoc : t-amyylioksikarbonyyliryhmä

Aminohappotähteitä, jotka sisältävät suojaavia ryhmiä Asp(OBzl) : β-bentsyyliaspartyyli 30 Asp(OBu*) : β-t-butyyliaspartyyli

Ser(Bzl) : O-bentsyyliseryyli SertBu*) : O-t-butyyliseryyli Z-Lys : £-bentsyylioksikarbonyylilysyyli TyriBu*) : O-t-butyylityrosyyli 35 7 86546 έ ·3 ^ j o.

δ ^ Λί «n V-t (M 3 PS & _ _

“s S

^ 3) <1)

u - a iJ

£ I — ίο* o o - u u

(N | (N I <N

ps i a s = = ( o u—z o —z a (no i i

Z « I (N (N tN

i a s a x

n U— Z U O

'cm /<2N * X

S C°J Λ A „ w n m ro m ph i a a a a a— z o u u u i ____

(N

G

a z 0

0 PH

t- J. α a = = o , x Λ as a 5 §

3 V

S >----

CN

»*« u

X

; I

1 * u o

/ ^ N

z z a JN s o - φ

•H 3 pH CN PO

T3 jg g ____ g 86 546 ά 0

δ S ° J J J

* s (M 3 PS &>

U “ω >1 CU

SZ SZ ( E-> « CU Cu o — < ~ I ^ U ~ O I 04 | U SK o I (N CJ — Z u

(N I S X I I (N

CC O U—Z 04 SS

U ISO —z I 04 04 O 04 s x s I s y—z y u

& & Y I

M

•H

Oi s - - - s o S '(N s = s

S

" u

.... I

Φ •2 § un vo r~ β 3 ____ 9 86546 ά 0 g S j * a

,¾ JO

or 3, « "u 0 <0 .H <U Wt ·—· < tn a* < co.

0 0 0 04 u CM u <N I u

IX XX 23 X O JN

u —2 U— 2 υ = 1 I / u

n (N -/ (N

X X \ X

U U 2 X u

I / <N

S i K X = = =

X

0 X 04 = = =

X

CJ

Φ

A. B

^ c oo σι o «H

3 it__1^1" 10 86 546

•Η Ο OS

4-1 -H £ - C jj “ i-3 S (Ö J ^

*8 m J

oT & TT-n----—---

E E

— O u ^ < \ / - c o* 33 I O en S o o 0 — < I < <N cj >J ϋ I =— 0 w sri sz o U U- U 3 cu U oi SE U— 2

04 CS u—O SE.'-' I I

as i «N U ,U 1 O es

E E \/ O a X

n U—Z SCJ I oj U

1 U , SS I

oi OI 1 u—Z u

E SEI O

O u —u z (§ H ® o o

U -H

^ i -y OS s = s s g s u— z 2 (¾ t ^ 6

M

M

0 S OI 5 s s

E

y Φ * o en h ^ ^ OI n TT m jC QJ <H 1-i .H r-l 22 86 546 b .3

S 3 J J ^ J

m ra <N 3 ρί σ> 3 — — 1 VO 3

O I .J JZ V

U <N O'-' 04 I 1-3 as b u - o ^

CJ — 2 I tN CJ

(N E 2 I «Ν B U-2 = = CJ ΓΜ I CJ — 2

(N (N BO CN

tc B — CJ U E

OMI I cn O

(N >i B BE I

x j CJ u — 2 as U w / \ I u = 1 A. /\ U EE f O I - - 2 U CJ = =

<N CJ CJ

E

rH

o; B = = *

B

OS °(N B S =

- - E

V

I 4Γ . * (°) * = s" 5» 8 c vo r* oo σ> M gj 1-1 H 1-1 Μ K.---------- i2 86 546 S a

5 ί» J a J tJ

1 is Q

βΓ1 Ϊ _ U *3 -«· ΐ" •C <u o o CU I 1-3 -C El·, w o -- ^ Ι ο — o I <n u x a I (n I U — 2 2 2 (NO I I U— 2

CC U (NO I

1 (N x u /V

2 2 U I <N f /-\] U — 2 I 2 2 I Ul 1 s r2 r? Φ /V Φ) § § U U 2 —

rH

2 2 = = s 2 -. ° 2 X (N = s 2

U

=;, l φ J> 8 •H c o --1 <N m

g Qj ™ " « N

13 86 54ό

H O

4-1 -H r C -P *-* ' , , O (O ^ M JO *

s-l iJ

OJ 3 X &> T *3 0 . i—t !-t <! >i u

Ot £Q rH “ 1 < u O I —

U I >- X

, Λ o ~ o <n A — u o

P5 H n | U

I -* O I <N

_l <n u o

\ o X <N U <N

Z —U u X XX

_t I — U U—U

_I (N «N OI

_z x z z z

rH

K X s S = s « °(N Ϊ = =

X

u Φ 5 I o •H ä -«* m VO r> : . <0 oi oi oi «n g fl ____ 14 86 5 46 Η 0 0 <« * β of g.___

D

(U

►4 0 (N <_>

X X

(N 2 —o OS «Ν u "T* u

<N

m *Ψ» »**

U

«w» 1 "d ο ω <n U .J «23 *I3 z— u

(N

iH S

OS U

U

CN

m ***

U

0 OS 04 ·*·

U

m X *ΤΊ

X

u

__T

Aj 8 ^ c 03 la, is 86546

Kuten taulukosta 1 on nähtävissä, edullisia ovat yhdisteet numerot 1, 2, 4-8, 13 ja 14. Edullisempia ovat yhdisteet numerot 1, 2, 5, 13 ja 14.

Yleisen kaavan (I) mukaiset yhdisteet valmistetaan 5 keksinnön mukaisesti siten, että poistetaan suojaryhmät suojaryhmiä sisältävästä yhdisteestä, jolla on kaava (II)

R·* R

H2N\ I3 I4 3-CONHCHCONH-(CH2) 4~tJ- (CHj) 3-nh-r5 111 10 jossa X merkitsee samaa kuin edellä; R3 on -H tai -CH2-0-Y, jossa Y on -H tai hydroksisuojaryhmä; R4 on -H, fenyyliglysyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu, tai leusyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu; ja R5 on 15 tähde, joka vastaa R2-ryhmää, jossa aminoryhmä on suojattu; ja kun R4 on fenyyliglysyyli- tai leusyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu, R5 on fenyyli- tai leusyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu.

Suojaryhmät poistetaan pelkistyksen, happohajotuk-20 sen, hydrolyysin yms. avulla.

Reaktio suojaryhmien poistamiseksi suoritetaan tavallisesti jossakin inertissä liuottimessa, jonka lämpötila on -60°C:sta liuottimen kiehumispisteeseen, mieluummin noin -50°C - 100°C. Inerttinä liuottimena voidaan 25 käyttää vettä sekä hydrofiilisia orgaanisia liuottimia, kuten esimerkiksi alempia alkoholeja (esimerkiksi metano-lia, etanolia), ketoneja (esimerkiksi asetonia, metyyli-etyyliketonia), amideja (esimerkiksi dimetyyliformamidia, dimetyyliasetamidia), syklisiä eettereitä (esimerkiksi 30 tetrahydrofuraania, dioksaania), alempia rasvahappoja (esim. etikkahappoa, trifluorietikkahappoa), nestemäistä ammoniakkia, nestemäistä fluorivetyä yms.

Reaktion päätyttyä, suojaryhmän poistamiseksi reaktioseokselle suoritetaan puhdistus spergualiinijoh-35 dannaisen eristämiseksi. Esimerkiksi, kun suojaryhmä 16 8 6 O 6 poistetaan katalyyttisen pelkistyksen avulla palladium-mustaa käyttämä, reaktioseos suodatetaan katalysaattorin poistamiseksi; suodos väkevöidään tyhjössä; ja jäännös puhdistetaan tunnetun puhdistusmenetelmän avulla, käyttä-5 mällä CM-Sephadex® (Na*) :a sekä Sephadex® LH-20:a [T. Takeuchi et ai., J. Antibiotics, 34, 1619 (1981)].

Kun suojaryhmä poistetaan trifluorietikkahapon avulla, reaktioseos väkevöidään tyhjössä, ja jäännös puhdistetaan samalla puhdistusmenetelmällä kuin yllä on mainittu.

10 Yllä esitetyssä puhdistusmenetelmässä yleisen kaa van (I) mukainen, uusi spergualiinijohdannainen saadaan hydrokloridina. Tämä hydrokloridi voidaan muuttaa toiseksi suolaksi, esimerkiksi jonkin seuraavan menetelmän avulla. Hydrokloridi liuotetaan veteen; vesiliuoksen an-15 netaan läpäistä voimakkaasti emäksinen ioninvaihtajahart-si jakeen saamiseksi, joka sisältää halutun yhdisteen; jakeeseen lisätään haluttua happoa, vesiliuosta, joka sisältää happoa, tai hapon liuosta liuotettuna hydrofiili-seen orgaaniseen happoon (esimerkiksi metanoliin, etano-20 liin, asetoniin, tetrahydrofuraaniin, dioksaaniin) neutraloinnin aikaansaamiseksi; ja neutralointiseos kuivataan tyhjössä tai, kun se sisältää orgaanista liuotinta, sille suoritetaan tyhjötislaus liuottimen poistamiseksi ja sitä seuraavaa lyofilisointia varten. Vaihtoehtoisesti hydro-25 kloridi sekoitetaan hopeahydroksidin tai hopeaoksidin vesiliuoksen kanssa hydrokloridin kloorivedyn neutralointi -seksi; reaktioseos suodatetaan liukenemattoman hopeaoksidin poistamiseksi; suodos sekoitetaan halutun hapon kanssa suolan muodostamiseksi; ja reaktioseos lyofilisoidaan. 30 Yllä esitetyllä tavalla saatu muu suola kuin hyd rokloridi voi olla hydraatin muodossa, käsittelyolosuh-. . teista riippuen.

Suojattuja spergualiinijohdannaisia, läheisiä yhdisteitä, joilla on yleinen kaava [II] ja joita käytetään 35 lähtöaineina kyseessä olevassa keksinnössä, voidaan syntetisoida seuraavasti.

i7 8 6 34 6 a) Yleisen kaavan [II] mukaisten yhdisteiden synteesi, jolloin kyseessä olevassa kaavassa R4 on vetyatomi ja Rs on tähde, joka on saatu poistamalla aminohaposta, jossa on suojattuja aminoryhmiä, karboksyyliryhmän hyd- 5 roksyyliryhmä (tähteen sivutketjut saattavat olla suojatut).

Spergualiinijohdannaisille, jota esittää seuraava yleinen kaava [III]

R

10 h2n\ I

hn^C-NH-X-(CH2)3-CO-NHCHCONH-(CH2)4-NH(CH2)3-NH2 [III] (jossa kaavassa X:llä ja R:llä on kummallakin sama merkitys kuin aiemmin on esitetty), joka yhdiste saadaan mene-15 telmän mukaan, jota kuvataan JP-patenttihakemuksissa

Kokai 42356/1984 ja 185758/1985, suoritetaan kondensaa-tioreaktio N-suojattu-α- tai ti -aminohapon kanssa, jota seuraava yleinen kaava [IV]- esittää 20 R^-OH [IV] [jossa kaavassa R^ on tähde, joka saadaan poistamalla aminohaposta, jossa on suojattuja aminoryhmiä, karboksyyliryhmän hydroksyyliryhmä (tähteen sivuketjut saattavat 25 olla suojatut] tai sen reagoivan johdannaisen kanssa, jotta saadaan otsikon mukainen yhdiste.

b) Yleisen kaavan [II] mukaisten yhdisteiden synteesi, jossa kaavassa R4 on vetyatomi ja R5 on tähde, joka saadaan poistamalla peptidistä, jossa on suojattuja 30 aminoryhmiä, karboksyyliryhmän hydroksyylirynmä (tähteen sivuketjut saattavat olla suojatut).

Yleisen kaavan [III] mukainen yhdiste kondensoi-daan ensimmäisen N-suojatun aminohapon tai sen reaktio-kykyisen johdannaisen kanssa ja sitten N-suojaryhmä 35 poistetaan; syntyvä yhdiste kondensoidaan toisen N-suojatun aminohapon tai sen reaktiokykyisen johdannaisen kans- is 8 6 5 4 6 sa, ja sitten N-suojaus poistetaan; jolloin voidaan saada yleisen kaavan [II] mukainen yhdiste, jossa kaavassa R5 on tähde, joka saadaan poistamalla N-suojatusta dipep-tidistä karboksyyliryhmän hydroksyyliryhmä.

5 Kun yleisen kaavan [II] mukainen yhdiste konden- soidaan edelleen kolmannen N-suojatun aminohapon kanssa ja N-suojaus poistetaan, voidaan saada yleisen kaavan [II] mukainen yhdiste, jossa R5 on tähde, joka saadaan poistamalla N-suojatusta tripeptidistä karboksyyliryhmän 10 hydroksyyliryhmä.

c) Yleisen kaavan [II] mukaisten yhdisteiden synteesi, jossa kaavassa sekä R4 että R5 ovat N-suojattu fe-nyyliglysyyliryhmä tai N-suojattu leusyyliryhmä.

Yhdiste, jota seuraava yleinen kaava [V] esittää 15 NH2-(CH2)4-N-(CH2)3 -NH- RJ! L [V] H4 20 (jossa kaavassa sekä R4 ja R" ovat N-suojattu fenyyligly-syyliryhmä tai N-suojattu leusyyliryhmä), kondensoidaan suojatun aminohapon kanssa, jota seuraava yleinen kaava [VI] esittää R, 25 |3 P2"NHCHC00H [VI] (jossa kaavassa P2 on suojattu ryhmä ja R3:lla on sama merkitys kuin on annettu aiemmin), tai sen reaktiokykyi-30 sen johdannaisen kanssa, jotta saadaan yhdiste, jolla on seuraava yleinen kaava [VII] f3 35 P2-NHCHCONH-(Ca2)4-N-(C8,)3-NH-R5 [ν„, i9 8 C Z ‘i 6 (jossa kaavassa P2:lla, R3:lla, R4:lla ja Railia on kullakin aiemmin määritelty merkitys. Sitten poistetaan suoja-ryhmä P2 selektiivisesti, ja syntyvä yhdiste kondensoi-daan u) -guanidlnohappojohdannaisen kanssa, jota esittää 5 seuraava yleinen kaava [VIII] hI^C"NH'X’(CH2,3-C0°h [Vili] 10 (jossa kaavassa X:llä on aiemmin määritelty merkitys), tai sen reaktiokyky!sen johdannaisen kanssa, jotta saadaan otsikon mukainen yhdiste.

Yleisen kaavan [V] mukainen yhdiste voidaan valmistaa seuraavan tavallisen menetelmän mukaisesti.

15 Esimerkiksi, yksi mooli N-suojattua spermidiiniä, jota esittää seuraava yleinen kaava [IX] P1-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3NH2 [IX] 20 (jossa kaavassa P3:llä on aiemmin annettu merkitys), kon-densoidaan yhden moolin kanssa reaktiokykyistä johdannaista, joka saadaan seuraavan yleisen kaavan [IV] mukaisen N-suojatun aminohapon . 25 Rs - OH [IV] (jossa kaavassa Rs:llä on aiemmin annettu merkitys) sekä 1,3-tiatsolidiini-2-tionin välisen reaktion avulla; kon-densaatiotuotteen annetaan sitten reagoida N-suojatun 30 aminohapon kanssa, jota esittää seuraava yleinen kaava [X] rJ - OH [X] [jossa kaavassa R4 on tähde, joka saadaan poistamalla -35 OH aminohaposta, jossa on suojattuja aminoryhmiä (aminohapon sivuketjut voivat olla suojatut)]: tämän jälkeen 20 86 5 4 6 suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jolloin saadaan yleisen kaavan [V] mukainen yhdiste.

Kun Rj ja Rj merkitsevät samaa, yleisen kaavan [V] mukainen yhdiste voidaan myös valmistaa siten, että anne-5 taan yhden moolin yleisen kaavan [IX] mukaista, N-suojat- tua spermidiiniä reagoida ainakin kahden moolin kanssa yleisen kaavan [IV] tai [X] mukaista, suojattua aminohappoa tai sen reaktiokykyistä johdannaista, ja sitten selektiivisesti poistetaan suojaava ryhmä Px reaktiotuot-10 teestä.

Yleisen kaavan [IX] mukainen N-suojattu spermidii-ni voidaan valmistaa siten, että seuraavan yleisen kaavan [XI] mukaisen yhdisteen 15 PX-NH( CH2 )4NH2 [XI] (jossa kaavassa P1:llä on aiemmin annettu merkitys) annetaan reagoida akryylonitriilin kanssa, ja sitten nitrii-liryhmä pelkistetään.

20 Kondensaatio, joka on esitetty yllä olevissa koh dissa a), b) ja c), voidaan suorittaa tavanomaisella menetelmällä, jota käytetään peptidisidoksen muodostamiseen. Menetelmään sisältyy karbodi-imidimenetelmä, jossa käytetään disykloheksyylikarbodi-imidiä, l-etyyli-3-(N,N-25 dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidiä, jne? atsidimene- telmä, jossa käytetään hydratsidia, jne; seoshappoanhyd-ridimenetelmä, jossa käytetään etyylikloorikarbonaattia, isobutyylikarbonaattia, jne; aktiivinen esterimenetelmä, jossa käytetään syanometyyliesteriä, vinyyliesteriä, sub-30 stituoitua tai substituoimatonta fenyyliesteriä, tiofe- nyyliesteriä, hydroksisukkinimidiesteriä, jne; o-asyyli-hydroksyyliamiinijohdannaismenetelmä, jossa käytetään asetoksimia, sykloheksaanioksimia, jne; N-asyyliyhdiste-menetelmä, jossa käytetään karbonyylidi-imidatsolia, jne; 35 ja karboksyylihappoaktivointimenetelmä, jossa käytetään 1,3-tiatsolidiini-2-tionia.

2i 86546

Kondensaatiossa käytetty liuotin voi olla sellainen, jota käytetään peptidisidoksen muodostuksen tavallisessa reaktiossa. Liuottimina voidaan mainita esimerkiksi eettereitä, kuten dietyylieetteri, tetrahydrofuraani yms; 5 estereitä, kuten esimerkiksi etyyliasetaattia yms; keto-neja, kuten esimerkiksi asetonia, metyylietyyliketonia yms; halogenoituja hiilivetyjä, kuten esimerkiksi mety-leenikloridia, kloroformia, yms; amideja, kuten esimerkiksi dimetyyliformamidia, dimetyyliasetamidia yms; ja 10 nitriilejä, kuten esimerkiksi asetonitriiliä yms. Näitä liuottimia voidaan käyttää yksitellen tai, kun ne ovat veden kanssa sekoittuvia, veden kanssa sekoitettuna liuottimena.

Aminoryhmiä suojaaviin ryhmiin, joita käytetään 15 kyseessä olevassa keksinnössä, kuuluvat bentsyylioksikar-bonyyliryhmä, substituoitu bentsyylioksikarbonyyliryhmä (esimerkiksi p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhmä), t-butyylioksikarbonyyliryhmä, t-amyylioksikarbonyyliryhmä, formyyliryhmä, trityyliryhmä, o-nitrofenyylisulfenyyli-20 ryhmä, jne.

Suojaavat ryhmät aminohapon sivuketjuja varten voivat olla seuraavat. Karboksyyliryhmää suojaaviin ryhmiin kuuluvat alempi alkyyliryhmä, t-butyyliryhmä, bent-syyliryhmä ja substituoitu bentsyyliryhmä; hydroksyyli-25 ryhmää suojaaviin ryhmiin kuuluvat t-butyyliryhmä ja bentsyyliryhmä; merkaptoryhmää suojaaviin ryhmiin kuuluvat bentsyyliryhmä ja p-metoksibentsyyliryhmä; imidatso-liryhmää suojaaviin ryhmiin kuuluvat bentsyylioksikarbonyyliryhmä, bentsyyli-ryhmä ja tosyyliryhmä; ja guanidi-30 noryhmää suojaaviin ryhmiin kuuluvat nitroryhmä, tosyyli ryhmä ja t-butyylioksikarbonyyliryhmä. Kuitenkaan aminohapon sivuketjuja suojaavat ryhmät eivät rajoitu yllä mainittuihin ryhmiin.

Tyypillisiä esimerkkejä yleisen kaavan [II] mukai-35 sista yhdisteistä, joita käytetään lähtöaineina kyseessä olevassa keksinnössä, esitetään taulukossa 2. Aminohappotähteen stereokemiallinen konfiguraatio on L, D tai LD.

22 8 6 Ξ 4 6

Aminohappotähteitä Ala : alanyyli Leu : leusyyli Phe : fenyylialanyyli 5 Asp : aspartyyli

Asn : asparaginyyli Lys : lysyyli PhG : fenyyliglysyyli Pro : prolyyli 10 Tyr : tyrosyyli

Ser : seryyli β-Ala : β-alanyyli AHPA : 3-amino-2-hydroksi-4-fenyylibutyryyli Gly : glysyyli 15 Glu : glutamyyli ^-ABA : if·' -aminobutyryyli Suojaavia ryhmiä Z: bentsyylioksikarbonyyliryhmä Boc : t-butyylioksikarbonyyliryhmä 20 pMZ : p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhmä

Aoc : t-amyylioksikarbonyyliryhmä

Aminohappotähteitä, jotka sisältävät suojaavia ryhmiä Asp(OBzl) : β-bentsyyliaspartyyli AspiOBu4): β-t-butyyliaspartyyli 25 Ser(Bzl) : O-bentsyyliseryyli

SeriBu*) : O-t-butyyliseryyli Z-Lys : £ -bentsyylioksikarbonyylilysyyli TyriBu11) : O-t-butyylityrosyyli 23 86546

Taulukko 2

Tyypillisiä esimerkkejä yhdisteestä, jota esittää yleinen kaava /ΪΙ.7 5 R, R, I 3 I 4

Π^^ΟΝΚ-Χ-ίΟ!-) CONHCH-CONH- (CH-) -N-(CH9) -,-NH-Re HN * J 4 J

10 __ X 1*2 R4 R5 -(oy- -CH20H h Z-Leu- " " " Boc-Leu- 15 " " " pMz-Leu- " " " Z-PhG- ” " " Boc-PhG- 20 " " " pMz-PhG- 24 8 Cl-.ό x__ί*3__«4__*s_ -<2>- -CH2OH H Z-Phe- 5 «· » .. Boc-Phe- « h il pMz-Phe- n il n Z-Tyr- " " " Aoc-Tyr(But)- 10 t " " " pMz-Tyr(Bu )- '· " " Z-Asp (OBzl) - " " " Boc-Asp(OBufc) - 15 t '· " " pMz-Asp(OBu ) - " " " Z-Ala- " " " Boc-Ala- 20 *' " " pMz-Ala- " " " Z-Ser(Bzl)- " " ” Boc-Ser(But)- :· « » » pMz-Ser (Bufc) - 25

Il II II Z-Pro- » » ” Boc-Pro- - - " " " pMz-Pro- 30_____ - ». » '· Z-Asn-

Boc-Asn- " " pMZ-Asn- ft f ? / r 25 o w ^ ·.· X R3 T5 ^ - _ _ -(5)- -ch2 OH H Z-Lys- z 5 " " " Boc-Lys-

Z

"__ϋ__;__dmz-lvs- " " " Z-Leu-Leu- " " " Boc-Leu-Leu- 10 " " " pMz-Leu-Leu- " " " Z-PhG-PhG- " " " Boc-PhG-PhG- 15 " » » pMz-?hG-PhG- " " " Z-g-Ala- " " " Boc-3-Ala- " " " pMz-3-Ala- 20 " " " Z-AHPA- M " " Boc-AHPA- pMZ-AHPA- 25---- H " Z-Leu- " " " Boc-Leu- " " pMz-Leu- 30--- " " " Z-PhG-

Boc-PhG- pMz-PhG- 26 86546 X R^ R^ -<5)- H H Z-Leu-Leu- " " " Boc-Leu-Leu- 5 " ” " pMZ-Leu-Leu- " H " Z-Phe- " " " Boc-Phe- " " " pMz-Phe- 10 ---- -f-CHj+j -CH2OH " Z-Leu- " " " Boc-Leu- " " " pMz-Leu- " " " Z-PhG- 15 " " ” Boc-PhG- " " " pMz-PhG- " ” " Z-Leu-Leu- 2Q " " " Boc-Leu-Leu- " " " pMz-Leu-Leu-

" " " Z-GABA

" " " Z-Gly “V 25 " " " Boc-Asp (OB21) H ” Z-Leu-Leu- " " " Boc-Leu-Leu- ; "·· " " " pMz-Leu-Leu- 30 1 Z-Leu-

Boc-Leu- " ” " pMz-Leu- 27 86 546 X R3 R^J Rg -bCK2+2 H H Z-PhG- 5 " " " Boc-PhG- " " " pMz-PhG- -(θ>- -CH2OBzl Z-PhG- Z-PhG- " -CH_-OBut Boc-PhG- Boc-PhG- 10 " '· pMz-PhG- pMZ-PhG- " -CH2OBzl Z-Leu- Z-Leu- " -CH20But Boc-Leu- Boc-Leu- <· ·* pMz-Leu- pMz-Leu- " -CH2OBzl Z-Leu-Leu- Z-Leu-Leu- " -CH2OBut Boc-Leu-Leu- Boc-Leu-Leu- " " pMz-Leu-Leu- pMz-Leu-Leu- 20 " H Z-PhG- Z-PhG- " " Boc-PhG- Boc-PhG- pMz-PhG- pMz-PhG- ‘25___ -fCH2-*-3 " Z-PhG- Z-PhG-

Boc-PhG- Boc-PhG- " " pMz-PhG- pMz-PhG- :-‘30-- " -CH2OBzl Z-PhG- Z-PhG- " -CH20But Boc-PhG- Boc-PhG- pMz-PhG- pMz-PhG- 28 86 5 4 6 Käytettäessä kyseessä olevia yhdisteitä lääkkeinä ne valmistetaan halutun valmisteen muotoon jonkin tavanomaisen menetelmän mukaisesti, käyttämällä, jos on tarpeellista, täyteainetta, ja niitä voidaan antaa suun kautta tai 5 parenteraalisesti.

Kun valmistetaan ruiske, on suositeltavaa, että ruiske sisältää tavallisesti 0,1 - 30 paino-%, mieluummin 1-10 paino-% aktiivista ainetta. Suun kautta annosteltaessa käytetään tabletteja, kapseleita, jauhetta, rakeita, liuosta, 10 kuivaa siirappia jne. Kapselit, rakeet ja jauhe sisältävät tavallisesti 5-100 paino-%, mieluummin 25-200 paino-% aktiivista ainetta.

Annosteltava määrä määritetään potilaan iän ja painon, sairauden vaiheen, hoidon tarkoituksen, jne. mukai-15 sesti, mutta yleensä annetaan 1-100 mg/kg/vuorokausi annos teltaessa parenteraalisesti ja 5-500 mg/kg/vuorokausi, kun annostelu suoritetaan suun kautta.

Seuraavaksi esitetään kyseessä olevan yhdisteen toksisuus ja fysiologinen aktiivisuus kokeiden avulla.

20 1. Koemenetelmät a) Myrkyllisyys

Kyseessä olevan keksinnön mukainen yhdiste liuotettiin fysiologiseen keittosuolaliuokseen eri konsentraatiois-sa. Syntyvistä liuoksista kutakin annosteltiin vatsaonte-25 lonsisäisesti yhdelle naaraspuoliselle CDF^-SLC-hiirelle (yksi ryhmä: kaksi-kolme hiirtä) 0,1 ml:a 10 g:a kohti ruumiinpainoa. Kyseessä olevan yhdisteen korkein konsentraa-tio oli 400 mg/10 ml/kg, ja aloittamalla tästä korkeimman konsentraation liuoksesta valmistettiin kunakin ajankohta-30 na alempia konsentraatioita vastaavat liuokset suhteen ollessa 2. Akuutin toksisuuden määräksi otettiin annosteltu määrä kyseessä olevan yhdisteen alhaisinta konsentraa-tiota, joka aiheutti vähintään yhden hiiren kuoleman.

29 86546 b) Vasta-aineen muodostusta inhiboiva aktiivisuus

Koeryhmät ja naaraspuolisten CDF^-SLC-hiirien muodostama kontrolliryhmä (kukin ryhmä: viisi hiirtä) herkis-

O

tettiin ruiskuttamalla laskimonsisäisesti 1 x 10/0,2 ml 5 lampaanpunasoluja (SRBC). Kyseessä olevan keksinnön mukaista yhdistettä liuotettiin fysiologiseen keittosuola-liuokseen eri konsentraatioina. Kutakin syntyvistä liuoksista annettiin yhdelle koeryhmistä kerran päivässä kolmen peräkkäisen päivän ajan herkistämistä seuraavasta päi-10 västä lähtien, 0,1 ml/10 g (ruumiinpaino)/vuorokausi. Kontrolliryhmälle annosteltiin fysiologista keittosuolaliuosta.

Neljäntenä päivänä herkistämisestä kaikki hiiret tapettiin, ja anti-SRBC-plakkia muodostavien solujen (PFC) lukumäärä mitattiin kunkin hiiren pernasoluista. Tästä lu-15 kumäärästä laskettiin PFC-luku 10^ pernasolua kohti. Kyseessä olevan yhdisteen vaikutus ilmaistiin koeryhmän PFC-luvun inhibitioprosenttina (%) kontrolliryhmään verrattuna. Inhibitioprosentti (%) = /1- (koeryhmän PFC-luku)/ 20 (kontrolliryhmän PFC-luku)„7 x 100 c) Kyseessä olevan keksinnön mukaisen yhdisteen vaikutus hiiren L1210-leukemiasolujen eliniän pidentymiseen ja kyseessä olevan yhdisteen myrkyllisyys

Hiiren L1210-leukemiasoluja siirrostettiin 25 1 x 10 /0,2 ml/hiiri vatsaontelonsisäisesti koeryhmille ja naaraspuolisten CDF1-SLC-hiirien kontrolliryhmälle •j- (kukin ryhmä: neljä hiirtä) . Kyseessä olevan keksinnön mukaista yhdistettä liuotettiin fysiologiseen keittosuola-liuokseen erilaisina konsentraatioina, ja kutakin valmis-- - 30 tetuista liuoksista annettiin yhdelle koeryhmistä kerran päivässä yhdeksän peräkkäisen päivän ajan siirrostamista seuraavasta päivästä lähtien määränä, jonka suuruus oli 0,1 ml/10 g (ruumiinpainoa)/vuorokausi. Kontrolliryhmälle annettiin fysiologista keittosuolaliuosta.

30 86546

Koeryhmien ja kontrolliryhmän kaikkia hiiriä tarkkailtiin L121O-siirrostuksen suoritusta seuraavasta päivästä lähtien elinpäivien pituuden tutkimiseksi, ja laskettiin kunkin koeryhmän elinpäivien keskimääräinen määrä (T) sekä 5 kontrolliryhmän elinpäivien keskimääräinen määr (C). Kyseessä olevan yhdisteen aikaansaama eliniän prosentuaalinen piteneminen ilmaistiin lausekkeella (T/C) x 100.

Kun (T/C) x 100 on 125 tai sitä suurempi, kyseessä oleva aine on tehokas.

10 2. Kokeiden tulokset

Kyseessä olevien yhdisteiden annostelumäärät, jotka aiheuttavat akuutin kuoleman, kun niitä annetaan hiirille, esitetään taulukossa 3. Taulukossa 4 esitetään kyseessä olevan keksinnön mukaisten tyypillisten yhdisteiden vasta-15 aineiden muodostusta inhiboivat vaikutukset. Kyseessä

olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden aktiivisuudet kasvaimia vastaan esitetään taulukossa 5. Taulukoihin 4 ja 5 on sisällytetty kontrolliyhdiste. Tämä yhdiste on sellainen, että yleisessä kaavassa [l] X on _/q\_ t R on -CH20H

20 ja sekä että R2 ovat -H. '—' 3i 86546

Taulukko 3

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden an- nöstelumäärät, jotka aiheuttavat hiirien kuoleman 5

Yhdiste nro Annostelumäärä __(mg/kg)_ 1 100 3 100 10 4 100 5 100 6 100 15 7 100 9 > 100 10 100 12 100 20 13 100 14 200 32 86546

Taulukko 4

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden aikaansaama vasta-aineen muodostuksen inhibitio 5 . . Inhibitioprosentti

Yhdiste nro---—-----

Annostelumäärä Annostelumäärä 1,56 mg/kg 6,25 mg/kg 10 1 87 97 2 60 92 4 68 95 13 53 88 15 14 -50* -75*

Kontrolli 20 X “{O}- R=-CH2OH 39 86 r1=r2=h \ 25 * - (miinus) ilmaisee vasta-aineen muodostumisen lisääntymistä 33 86546

Taulukko 5

Kyseessä olevien yhdisteiden vaikutus eliniän pitenemiseen hiiren leukemiassa L1210 5

Yhdiste nro Annostelumäärä χ ^gg ^ mg/kg/vuorokausi 50 j00 327 25.00 294 10 1 12^50 273 6.25 315 3,13 269 15 V6 296 0;78 195 0 y 39 146 50.00 53 / 20 25 7 00 281 12.50 272 i

6.25 30Q

2 3 j13 331 25 1,56 244 0 7 78 152 0.39 136 i 50.00 197 ..30 25.00 247 12 7 50 243 4 67 25 237 35 3 713 228 1.56 195 34 86346 0,78 149 0,39 125 5 50,00 253 25 ,00 284 12.50 290 6.25 290 10 5 7 3.13 265 1.56 146 0.78 133 i 15 V?_123 50.00 162 25.00 270 12.50 250 20 6,25 250 6 3.13 267 1r 56 201 0.78 158 ; 25 0.39 125 50.00 284 25 r 00 284 12.50 265 30 6.25 216 7 3.13 152 1.56 99 0.78 86 3 5 1 0,39 96

; I

“ Γ~" “ „ 86546

Jo 25 , 00 362 12.50 290 5 6,25 272 3.13 312 8 ' lr56 164 0.,78 130 10 0,39 102 0;20 109 100.00 103 / 50.00 250 15 25,00 241 12.50 276 9 6.25 191 3 13 155 20 1,56 125 0,78 118 50.00 303 ) 25.00 274 25 7 12.50 257 6.25 247 13 ' 3.13 283 - i V-· 30 1,56 201 0,78 149 0,39 132 ---L----1 36 8 6 346

Kontrolli 25^0 191 12,50 261 6f2S 254 3,13 243 R=-CH20H 1,56 211 0,78 158 R =R =H 0.39 129

10 1 2 J

0,20 109

Kuten yllä esitettyjen kokeiden perusteella on selvää, kyseessä olevien yhdisteiden määrät, jotka aiheut-25 tavat akuutin kuoleman, ovat suuremmat, ja sen mukaisesti ne ovat turvallisempia. Ennen kaikkea kyseessä olevilla yhdisteillä on erinomaista fysiologista aktiivisuutta. Sen tähden kyseessä olevien yhdisteiden odotetaan olevan lääkkeitä, kuten esimerkiksi immunosupressiivisia aineita ja 20 kasvaimenvastaisia aineita. Kyseessä olevista yhdisteistä sellaiset yhdisteet, joissa yleisen kaavan [1] ryhmä R2 on neutraali aminohappo tai peptidi, joka koostuu neutraaleista aminohapoista, ovat edullisia niiden erinomaisen aktiivisuuden ja alhaisen toksisuuden vuoksi.

25 Seuraavassa selitetään kyseessä olevaa keksintöä havainnollisesti esimerkkien avulla. Esimerkeissä TLC:n (ohutkerroskromatografia) Rf-arvo saatiin käyttämällä ____: piihappogeelilevyä 60 ^254 (Paksuus: 0,25 mm), valmistaja

Merck Co., kehittämällä näyte, joka sisältää kyseessä ole- . 30 van yhdisteen, noin 8 cm:n etäisyydelle kehitysliuoksella, jonka koostumus selitetään myöhemmin, mittaamalla etäisyys lähtökohdasta aiotun yhdisteen (kyseessä oleva yhdiste) muodostaman täplän keskipisteeseen ja jakamalla etäisyys lähtökohdan ja kehiteliuoksen rintaman välisellä etäisyy--35 dellä. Havainnot tehtiin ultraviolettiabsorption avulla, ja ne tehtiin näkyviksi ninhydridiinillä ja Sakaguchi-rea-genssilla.

37 86 5 46

Esimerkki 1 10-£n-/3-(4-GP)butanoyyli7-L-Ser^-1-L-PhG-1,5,10-TAD:n trihydrokloridi (yhdiste nro 1) 0,76 g (0,98 mmoolia) 10-£n-/4-(4-GP)butanoyyli7~ 5 L-SerJ-1-(Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:n dihydrokloridin valkoisia kiteitä liuotettiin 30 ml:aan metanolia. Siihen lisättiin 0,15 g palladiummustaa. Seokselle suoritettiin katalyyttinen pelkistys, joka kesti 5 tunnin ajan, huoneenlämpö-tilassa, normaalipaineessa.

10 Reaktion päätyttyä reaktioseos suodatettiin kata lysaattorin poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 0,7 g öljymäistä ainetta. (Saanto oli kvantitatiivinen) .

Tämä öljymäinen aine liuotettiin 6 ml:aan tislattua 15 vettä, ja sille suoritettiin kromatografia pylväässä, joka oli pakattu 105 ml:lla CM-Sephadex® C-25 (Na+):a. Sitten eluutio suoritettiin gradienttieluutiomenetelmän mukaisesti, 500 ml:sta tislattua vettä 500 ml:aan 0,1 mo-laarista natriumkloridin vesiliuosta, jakeiden kokoamisek-20 si, jotka sisälsivät halutun yhdisteen. Nämä jakeet väkevöitiin kuiviksi tyhjössä. Jäännökseen lisättiin metanolia, ja syntyvä liuos suodatettiin natriumkloridin poistamiseksi. Syntyvä öljymäinen aine puhdistettiin seuraa-valla tavalla halutun yhdisteen saamiseksi.

25 Jäljelle jäävän pienen natriumkloridimäärän pois tamiseksi öljymäinen aine liuotettiin 4 ml:aan metanolia ja sille suoritettiin kromatografia pylväässä, joka oli (r) pakattu 70 ml:11a Sephadex LH-20:a. Eluoitiin metanolil-la jakeiden kokoamiseksi, jotka sisälsivät halutun yhdis-30 teen. Ne väkevöitiin tyhjössä. Pienten epäpuhtauksien poistamiseksi edelleen, syntyvä öljymäinen aine liuotettiin 4 ml:aan tislattua vettä ja se kromatografoitiin pyl-väässä, joka oli pakattu 70 ml:11a HP-20 :a (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). Eluointi suoritettiin tisla-35 tulla vedellä jakeiden kokoamiseksi, jotka sisälsivät 38 86546 halutun yhdisteen. Jakeet väkevöitiin tyhjössä. Syntyvä öljymäinen aine liuotettiin 5 ml:aan tislattua vettä, ja liuos suodatettiin liukenemattomien aineiden poistamiseksi. Suodos lyofilisoitiin, jotta saatiin 0,37 g 5 (saanto: 55,63 %) haluttua yhdistettä.

NMR (D20, ulkoinen TMS) <^= 1,6 - 4,0 (m, 21H) , 4,1 - 4,5 (d, 2H, J=5Hz) , 4,6 - 4,9 (t, H, J=5Hz), 5,63 (s, H), 7,5 - 8,1 (m, 4H); 8,05 (s, 5H) 10 IR (KBr) V(cm“1) = 3325, 2950, 1650, 1510, 1250 TLC (kloroformi:metanoli: 17 %:inen ammoniakin vesi- liuos = 6:4:1 tilav./tilav.)

Rf = 0,15 15 /«f™ +15,3° (C= 1 ,03, H20)

Esimerkeissä 2-24 valmistettiin yleisen kaavan Jlj mukaisia muita yhdisteitä muista yleisen kaavan /liJ mukaisista yhdisteistä samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

20 Esimerkeissä 2-24, jos yleisellä kaavalla /ΪΙ7 esi tetyn yhdisteen 1-aminohapon aminoa suojaava ryhmä ei ollut bentsyylioksikarbonyyliryhmä, vaan se oli t-butyylioksikar-bonyyliryhmä, p-metoksibentsyylioksikarbonyyliryhmä tai t-amyylioksikarbonyyliryhmä, ja jos karboksyyli- tai hyd-25 roksyyliryhmää suojaava ryhmä oli t-butyyliryhmä, käsitte lyä suojaavan ryhmän poistamiseksi ei suoritettu katalyyttisen pelkistyksen avulla, vaan se suoritettiin a) trifluo-rietikkahapolla tai, kun yleisen kaavan /11/ mukainen yhdiste sisälsi sekä bentsyylioksikarbonyyliryhmän sekä .30 t-butyyliryhmän, b) katalyyttistä pelkistystä seurasi tri-fluorietikkahappo; ja tätä seuraavat käsittelyt suoritettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1, jotta saatiin vastaavia haluttuja yhdisteitä.

Esimerkkejä 2-24 koskevat tulokset esitetään yhteen-35 vetona taulukossa 6.

39 86 346

X ITS

m Ή

04 « G

I x * 8 ►4 * in g I E rr § Λ -* *— J-> in · I w r*4 G ·> ~ ή σ\ § J9 QJ ^ , NS — * -5 3 5 o ^ ·*τ 'j· x o m .. +j di tn 3 i i *r m m <#* \ di I ϋ CO VO 10 04 ' —

d M 3 NN* -H M £ £ C

ς i h I—i^rE j3 oi G -H 8 - ' ‘ o in -μ ω-ΗΛ en -—. » io m -h .5 e* >ι Σ X = v σι 73 in 30¾ E* 10 rn cd m r-4 ö ., o amfi G - - m «.^4jr3< t-{ E ti ^ ®jae* omaj ^ H e -- -5 ~ ~ f" <n^b·· 11 r>, Ä .. (N 3 m m ..

<d, cu a y r- m m *—i a 0 < . . H N «v — -h n ~ C I fcn 0 M Ή N II E es |«riZ 11= S « h o S< V 0 04 <-h m Λ iS§ *. as

(§|ιΗ * V *" U ^ 0-¾ 0 N

^ττ·»ωο^**·^-~ι p^h t~~

— in -M 04 ME 0-HIII

S I * .3 a H au --J «

S 2 H ,2 - X *-* i ^ «JO

p = 01 a a) 1 3 >1 ei *o o c -h o cu 2 a iJ-H a >· «-1 M Z m E- -V —

~ (TJ

m -H

cn G

* “ ~ O g 1 -M £ 01 m 01 S "7 -1 3 ~~ m >

$ -3 0 ocn^co M

•h <u 3 o o „ s Ό tn p 1 m <h m Tr (#> .

x!lid r- m 00 100 > j ^ *s N S «H >—I f"'· <d SI S «h in r* d S,ri ό ,—. « «· « m o d - tn —· — — lOm-Hr-

SSGS = x= σ\ 04 rH

"3 O Q E-< m "3· 'T 04 ·Η U ··

g G ^ S

N &* e * " 4J

dj ti ι 3 ε ε ε o m m ..

.t? R o C — — en -o· S ^ H ~ h 04 <? m a. - 8 m o «H rn i-ι „

Je U m p *- *, *-. 3 ..... ra I * 3 .h in 00 II MW 00 > -n· m lii 00

-- 1 1—f »—1 ««G »N

I — * - N * S^° ΤΓ30Ή^Γ-_| gd

C — <D 04 ME rH w II

.¾ 1 = a il au x a» .¾ X I — « — —>ιυ

0 — J *<= — > K

Ή I I G£ CJ d

>· O N Z CC iJ -H

• - - »H 2 M £-» M

•H

lr w IM _______ 4o 86 5 46 I in

Q rH

I in

Ή iH

$ u to ω Q) -Μ -<r Λ

j W Ό vo O

^ 1 'd ·“* <n X ^ Q =

Sg« ss ; 5 S. i σν (N r-t A S f (M V.

Ί s ii * > M

« 5 h o m II

3 +* π in ,H> £ r: — m TT o *νι ~ " n m ι-t —

CU Q

S U < · II o

§ I E* O O

to - o f-ι σν

M I Ή I rH

*r * m Λ ε I

c in +5 y υ

Si *.wa«- h 2 —f ^ m σ

<1> — 1 ^ —- > (N Q

H I 3 §, ^ * o 0) * a a Ή »J* '~-r M **^

V

*H *» Λ I 1 ® 5—15 o ~

(/)1-10 «· <-* S

rj 1) ^ ·*Γ *. ΤΓ ό tn S1 I ττ I 5 γ~· j -3 - * e SI »H »—v * -q c =

.g H " CT - CJN O

5 S < en :3-co "5 o H E* VO 0) i E fi i --10 jg O - ' ^ 3 H ® E 00 r* .tf Ά - £ — 00 ..: 'vi — «« '3 - ' CU Q VO r-t —.

e o -h s - s: - - -'- 5 11 3 -h - -r 5 -vr — | | — 3 ή x - l flJ - ». n ε •^r i-4 O H (N -

— I (N

1C Q II

•H 2 I —

- 3 — U «O

•H I O Oi x o e s ή — z

H

:-- Ig" 10

M

4i 865 46

N

X I

in - \ Λ I - II - o · Q Π 1-3 — m > > 1 - X m <2 *3 oj r* . ‘ ^ * -5 -H m -μι mx Λί -μ -μ W ^ S ' * (Π -Η)μ ·<τ » Ε ο ιπ -Η τ-

'g oj ι jj — in in G

·% en m — io o H " —

I -H »»m i—O

δμ 'q m «n *s ra <n

| -H N CO - ·· X

H rs n -mi o o '· , _ ra^HH —.— ι in in in , w - J2><2 en x ιο »» σ\ 04 -h n o 3 >i p 2 m t. r- 04 m o *- ^11 H " ^ _ ..58 3 - - —- X o o m -3 11 ^ g c E — X m σι m S>h

-Q C ~ 3 — N in ti· K 3 U

C — · m C x - - m m ·· co — <opuQ d o m en tn g3

U «C · S v. Il — — H d > O

ι fH o ή ^ n Rcinin «>•1231 min — OÖ^ n

—" O Γ- - IO O <—I 4-1 C ·-. O

I ·“« - «, X <v H I O -H O 1-t m-$Omoiinco — E n<» 1 .3 — in tn <n MU Q^ll (U I - H Q N O — 2 1— m s m -d — te — r- y-ι o >· .— 1 .e S3 — ? kcnq I <U χ u · »- o x s K H a H Di 2 H ^ — -OI .

- in - - J

sm»» 00 . "7 -H <n 1 r- m 10 > > I T3 in in m ra ra 1—(‘Π - -. - 1—Ir-1 C m 1 $ ~ 2 -- 1 3 * n 4 3 » m o m -H »- ^ 0) O »r . . «. in n· e

^ n n co n tn - 1004 Q

1 §. -s—-tn mm i _ mm— 1 "* ci II m -

Oj ψ--» e «* n ro o tn ·· H j “ ^ m co ro to ‘av,Q en X - n en m iJ., 2 £ < 2 os - r- 04m o

306-1 £h 04 04 —» C W

• - eci n- - - ra o ra o . _, - »x— o o m -P 3 ö 3 Ή § E Ό m x co m rr OJ m .h .3 - 5---11-¾1 01 m o S m ‘νι ϋ m .q t-3 mmm.. 53

.CU- 0 o m - <U

.:. Sum 2 - . - e II -H > S1· 2 m m χ — Br· ^ ra n· — J 1 1 — oS ^ — ra— Q) 10 m - o m iwc *-

M I X » v . 4J v I O H O

.»ma. O m m — co — E H·· S — I 04 MU 0<#> Il n 1 o a il a— 2r- •h 2 1 — ie ί 1- m a> — u > — :> x ' ‘ d 1 o x u

^ o a x x H

m — 2 H Μ

H

le ^ tn

W

42 86 3 4 6 - —^· -----

S

ro CM v I - 00

J Λ I

I — m _,

iH -, ,H

ηι I m r- 0 S u . ^ - I ^ ä3 a λ m § ; i I y *~ — § o >i >J O ^s> m ίο ·· n> S 4 3 ' r, · » = •5 § 3 s Ϊ - 3 "

ni >t >1 2 <N x QW O

gQ^E^tNPo m§ j i; i 1 _ 11

— · in C .. ai U

_, cu Ο ·σοο— ^ > > — £ u < · 9 -. v x -g - J2 ί> I E* 0 5 'S’ in <n BS^h ® o J'S’iZdli o C -U »—i m — ο ao vo - m-H"-· — I rH 0) V «- ·, E p · o cn § r « «, Π - - I £ I „ 1

! 0) I » Ό Q II >> r~ -H

•H Z «-l Λ — W r- 4J U-l σ

14'— I >1 Ό S' CN Q

i I 11 « U — •*0X2 Ö a rl X — z ^ — - m Λ ^

I -H W TT

'G O <-t « i, H ^ ° -5 ι/i U I—j 'S· m o ^ jj ® 4s I -— 'T -H t— ^ ui H o ·» x vo £ §, I rrt *- — 'S’ iH 8 (-3¾ ^ X Ή g rr S Λ 5 » " . o « s ..

G ·Η Ό ^ - in in's··· « >L c cn X xi — cn o . '•o Ä g S g cn - cn^^m 3 Ο Ω H cn m 0 E c < ovo - - c cn

___ [rt g-, » »^ -· ooniO

Via' gjainr- σνιη^3 |H Λ ® C —i £ £ « ^

N — Ή -3 in » miH

^ Cl, - O O «-S —. ” W ·

Sum .¾ «-'τχ il _, p > 5 I υ ί· cn -d > r- (rt'T’H -» I — n c ϋ m (6-1 ή o S 4J —> M I —. - *. x cn .— I >yc\o _, 'S’ φ Ο Ή CN — C0 £ P -H · § t £ eT n I ! I - a " ί 6i 1 > 3 t s £ si 1 I OS ^ ..

o tsj Σ X y

. . —t — Z M P

Ή g c S I- m _ 43 86 546 33 *s *

<N 00 O

I H

I » w in

«H E -N <H

I -J· '— p- Q -H ·» * + W Ό o - in m ™ <D τ* I «s —. τΓ in

tm a m m n ioo O

I Jj -IS I—I Ή CM

j 2 t «e· ao 2C

J I p ·* II -- - "r ^ oo

2 ^ T? T m ’T

•r bL h1 tn s - - σι m «=

ft £ Ή Σ <N — X «NrH V

Λ o H £h (N N TJ. Ή a'"1 £ -P 32 ^ ·*

ttl -in- oo II

ν,.Χ 5 g E II O’ in rr

,l· ί Δ - g -- Ό - cn 'T U

N Δ c ID .a m m — -CUE-· O o - r- £ U I · .¾ - X - X II ° S I O O d «TCNf-.^· f* fc <*· -t z 3 I I — *- it --- - r— — m - m m yi I m - ό >s ε I ^ -tt- O'-i — p-— — ε + § — _ι ω <n u o ö5 I I tn Q H ca — H 2 U -Η — x ° „

<1) ·— >, *o —? (NQ

ί I h ΐ K _ — ·* O I >1 2 oi 3 Ή J — 2 H “ υ o o — -- < mm o m m — r- I mm -P | -> s m II mm l

Wm_ m — -n mm e -n | JL S .S'"·. - - | g > P O <n - X — om 3m

m < n — *3· X mm c^H

Sen E-> X - N IOCNQ+J

li vo ε X - ·—* —· g .ajo li — m o1 - S'- (0 i m il — ε - - ..

32 » o^b '— o m e lii m - -n co covo

— 'tr' - to X Ί· - ' ·* O cv m -H

Ns S m X m | X r- v iN^ n”

MOI E-· VO CM I ® e VO

|H C -. - <H I - " f3 (t| p .u m - «.m o o o 4J il e -5 >1 £ Λ Ό r- cr> ^ ^ <U rn sHph gj^s— r- (n ·>τ o ε w

£ £L 1 .5 — - mmm,, Q

3 C- _5 o 'r X m - - „ -H

3 O I, 32 · m -. X — Il m m mi^j Hmm^rmN p . ui § ~ ο.Λ.ΐη h *2§— ^ j i f 1 o h'-J . 'e 2 % i °

H N PO O dP 11 II

* ± t i £ " g ~ S3 r- Π w - S £ *3 - P W - «

1 V >1 es U

O I m X cc J

m O iy Z M ^

H

g 1 § VO 3 2

W

44 8 6 5 4 6 ' --------—............ -- I * ^ iJ Ό - j> > I «n S 3 3 3 !; . 3 -

.¾ O) ;d 16 S

'gwl^ rH^- S — £ I M *· i rr o

>1 1-3 O TT o (3 (N

. I rH Λ M 2

S ~ | _ ^ 7 ·· VO

•H >, § en s m ^ h n -h «5 S >i s cm ^ ~ o *v

1 8 5 SK

! | a S E — e I® iH; J3 e - e ~ N - -h u p» -H S ·· en _, CU Q O O IT) rH ,<L> S u < . -M il -d > o

> I E-1 O ^ 1-3 oo n e m <N

h *r l Z I I 0 S «N *s (0---0 tri » -*r me — o 1 1—1 ««-O··- O -H o 1—1

•V .Q) O <H <N Γ- « " I

S — tn -g (N S o* Il 2 Λ ' -¾ ° 11 2r-

— r- UH O

— I £ Ό e; 04 Q

ζ] I CU >1 Ct CJ

^ o tn 2 H a -H < — 2 ^ —

ö ' I

" 0 \

C -T

I < (N > B tl H ^ tn — a - Λί +j •h )-i i—1 o -a V e; rH -H r- •5 en tn tn e >1 1 * I-H 9 ‘* s i 7 i ·> g —· —. 00 "G -H Cu 04 -t 3 τ' en vo o .

□ ^ ^ ^ h n E o 1 o . e j - - g «

h1 3 L 0 ^ 3 R

□ -M ·<Η rj· +- H

^ 3 Τ' 04 rH I ^ ^ A £ « rH G ^ -- e a. jj1 ·· tn S v ? a " ä s r.

3 ; ί ί f f S ’ :-: cias _'ε a5?° w — 1 ^ Li m h ·· > m -hIOR ta ~ ,3 ^ -h - -- (DZird X 3 r- -H uh rj — =1 >1 — ? « • - - I I Xj

.' o m d et U

r-t ^ M p

•H

is |s, laj_1 45 86 546 * Ή ”ν X I Λ ·* X τ «. n τ in o O s ►>

I II τ ιο S

0)1 C0 1-3 ε ιηο^Π

£ Ή ν'- -H -t C -D

3 ι ή ·. Ö \ Λ H s «η ' ' 2 · _£ Μ Ό ' (Ν »n o m ·Ή > ><U'rJ — 00 «η «Λ ·· « Λ W g N'l Ο <Ν ^ 3 S I ,—| X Ό m H H |s J —.

2 J 3 γ- — ν τ- ο .3 I Ό II Γ" - « »- Μ

Β) π Η Ι"3 ΙΠ 0 1/1" X

3 Zj Ti — UItt," 3 >, ί en * τ -» (Λ-τ ,πη.

Β £ ΐΐ 2=1= CMf-0 r- iv. Q H S" σ> ^ S - - - =o · r 3 » g ή ε -i £

S .2) Ω —. •a — ''— (N m il II

JS^rtjaao —. n h ·

J a, Eh 3 cn x <j\ m U

UI · d v o « Il ‘5 9 ~ I O O - <N| tN TT n .d 00

T rH 2 I I —» O Ή .HO

SI — v ΟΊ v ID .H 4h -H V. rH

il I Kl „ * V E ·, I Rm O *>

•H T O H — VT e S Φ <X

— MU 3 > III

d i i h a il a — mg ^ z m -3 - ~ -h n-io v— >-< m *o *- ·> „ , m a n q i < >1 = U 2 — oi2 CS Pc a h x v_ z m cb o d 'in in •9 T3 l <n IM — -H τ

»H O *v rH

ϋ Λ M ° ^ Λ . .g 2 M B <n ' = m o ^ r- 2 m 3 |Λττ n h· rd

£U3>i ίο X ID O -H

">ι I "5 *v ' »H rH S

- j Ή ^ ' ε 8 g ~ c o o •H -h ·· ._. Λ o m id id 'i Q tn x σ* ►. σι <~i ·· M £ < 2 m s 00 M <H n "

SoE-· E-· m Ή | C tn c c I in « » ra o n. in o G v . ^ o m -P 3 h1 -H -I S E -v ^ τ Oi -h |Hr H ' .3 — N ^ 04 B Η Λ ^ - m o X' m -h .. 3 "7

Jr, a, ' m o r-~ Φ> f3 u ^ g V il x il 'd i> n) > I I Prri-jrr I H· T ~ I r' O S 3 Π — ITI in V ^ rH ipe\ *v I rH 'V=E I o -H . o

St < O ή n ' E M ·· > — | CN MUOO^mil 2 1 J a n a — 3 d 2— u o — ? es >3 i o es _ u

0X2 o: H

rH — 2 M

•«H

fo JS °° tn M _ « 26:': * in o rr vo I in o w V rH ^ .¾ m '-'jd - ft U 3 o O -H *“ in o £ in vo 6 H to S vo ra y hQ I »H fH »H E ^ <*—

§L ·- ·ί£ ?3 O

c —, in m ·· 3 2 m m -h S >ι θ ® ^ ή n j C Ή N H O ® 2 o H S 01 o 1 I c == 1 .§

rjHQ— cn in II

¢7. —. < cv m iH ·· « >

0* E" _, V fO U

C U I II 'rf > -j ro I ο 0 B c 'Xj ή o 5J m 0 2^*· <h mc· ^ «n 2 1 m 1 p -h > 0 -> ^ tj· * n, —. E y ·· <β σι c — h $ n 0 £ ^ 3 n 1

Si 1 m ca — Λί m .ft 2 >4 rj '-'r- mo

φ — Cj 5 W > K<NQ

h I W % U — >i 0 1 « ri 0 .h i_: -- m ^ — 1 t3 -- « >, in 0 —- n m c\ I H m *—» ft 7 ^ -5 ω Λ H - . -¾ ;d u a m m ή j—

>2 <u < m m G

(Λ £-> VO CN 9 " II Ή Ή f _« 2 I '—i -- H — * o m ·· 3 Z! *n cn vo , vo σι m 3 „ 1 g m cn ^ 'S "

«01 C OT

^ § XX o m m I §

|H' H m o m p« jg H

ft 05 M V o K 1 _, 1 m i-H iH .. CO · § S i ,, -d » s m I m u r· Zi ^ 2 ^ £ r- ο δ 3 ^ ft* m m 2 \ -- e 1 n 1 p -H · ° I — -f ^ Z u 8 i’ δ n « Z ti 8 § 3 £ 3 1«

* τ 1 :¾ ~ p « K

O » U « g -H O Ή ^ *H T _ - ^ n = in

W

__ _________________ 47 86546 JS1 Λ 3 f 3 Λ o ί _ 'd u r-J c _

•§L ® ^ 8 O

S J ·0 · r G j. >i - H j Λ , -g· I ΪΪ 3 Π 1 | ΰ § *

Im -2 ί ω 11 ^ 3 Q S £ 3 _ o JC -—· <C ^ ·· (Λ · —' 3 o* , ω > > u i · > <g e ^ -< 2 o S 2 ™ , ** — <*-i c \ k in

SI in di O -H · o (N

TT ». -M J-l ·· ί> I

W — r-t m ^0 <#> Il O) I 1 'H 3 r» h rH s o Ό = U U <4-1 o >h >— u x; es «n a i cu >, u ~

O I H O

*—4 X ·-— ^ , — “" " .....

O

O

ca i 0) F-l ω JL £ 2 ^ ω u 3 S £ o -ä - S f 3 I rr ™ ..

1¾ *r"j ·«

^ τ|ι ^ ID

S >1 Ό rH II

'Tv 5 C C o) h1 3 ·· 3 o (H -P Q -P 3 B < 8 rl •:- e " & e 3 _ 3 s* i .. w ~ > O o S > ..... <3 I Ή -H >3 «Tl 5 =« S 4. ^ ·3 ! - ° «J *— I M ·· > Il •h | O OP 3 J2 z o r—· _ ·—i u-i

g ~ u * £ ‘J K

I CU ^ O I u f—* j 0

H

g„ lö 2 en ΙΪ______ 48 86 34 6 ————-------- o r-4 ω I in +} r-i -4 •a jl h 2 » 3 m 5 >. ® a ·» <n t/j 0 vo x I f 1

•Hip ' IN

<TJ " 'y O O o X HI ^ in in ^ a s. a CS cm -.

6 ¢2 CM 1-4

N Ϊ 11 II

^ ra C a o U

-H ** —. aa m w

3 J5 S 3 ί! Z

® <i r-H Π «Η 0 ra Cu B m ra u I · n X I o O m - τ Ή Z -- r4

§ ~ * Ή I

ϊη I m m I

•η 4Γ * -p ε Φ ·“ ή 2 H u in 1 I ‘rg Q — u.

* 2 « S « O

^ >i '— > CN C

I < — o I cc a 1-4 ca —' M <— in o

ri rH VO

nj I T3 in r—♦

4-> Ή H »“4 <-4 C

3 - ö — I

V. H v in O .3 ,_ -§L a o tr in c ^ n i so cm n ·· C I P. »-4 (-4 §

S J

.¾ I ±* ' ra V ° ^

_v -H I rr VO ID

3 tJ O m η -H

E C < CM fH 7s 11 k1 cu y

^2. § CO

ι-f S 1 ~ ra o H ra o o m m -p q ‘vi -Η <-4 o in Qi -r4 r-Q' cn rr ° S =4 m m —i ,-4 „ π ^ pa.' 8 > to u >h n -π > ra rati p * 3 * ^ 3 S '-P <3.

|Q r~4 iii r4 \ *N

'3 I p -S P Q

ϋ)·τ< — E u.. >

Ή *— I Ui U 0 <#> ra II

CL) I OQ a - r-4 <—I

d2? § ί i ^

I ο Q

o a κ 3

^4 w M B

Ιο 3 0 2 0)--4 w 49 86540 η3 in it >1 m vo

, H 3 3 S

m ·—* * * to -P Jj C in in -H <— in (D ·· n· m G ___ d ui Q vo cn P '* o

_g I < I—I i-> g CN

> >-3 H 3 s I I CN - δ-— o r-ι m m · - -r-ι I—I n· n· ^ ^ cn 5 ri · 1 σιη·ιιι o S S in 0 cn γη o M - 2 S 55 ^ g I 1 5 ° 2 φ 11

,ηχΙ^-η cn in ** 3 ~ U

^ £ S % "rt · 5 >

Cu*C>i II 'd > * 0 S> I I i c ^ r- m δ ^ _p O Ö +J ^ *" “ 4. " h _ 's S 7 > ° 7 § - - 3 i; § 5 - 5 » : is s “ ίϊΐ « =

(U w- H — > K CN Q

r-l I — V O —

S* O I O CC H B

rH rH H H ^ '— cn CN » m — j m I H -H m

r-H *T3 rH C

aj Λ 7j * w n B ° “i m 3 r

H ¢) P Ji n· n· C

t3 cn ι a o o p s i t I I - S 4, S 5 ο «Ϊ .. ·· £ 3 14 Ό mm vo '3 sL p _ σν cn -j I I i ϊ ~ - i: “ j§ f S ο ΙΛ I 9 s;i3_ ^ — Ο ^ (η·Η .. cn 0- C - 0) > C O -H m II -d > _§ § 3 f 7 M ^ n.

Jg . n Λ V o S T 7 & a 3 3 # Λ 11 ·Η2ρΓ,εχ 3 Γ^.ρ ^ 5 7 11-=- u

X O CS 3 05 H

ι-l en -Q m t-1

•P

ί n 5-1 O

Ql J_i CN

| Ξ -e (Λ

Im _ so 8 6 o 6 1 1 ' . . -, vo (N *T ^

' -H “I O

M rrt - - T ΙΟ l -H EE tn o ^ O w w M ^ .5

<U ^ Tj I—t>H 'X

U u *g o un 2 ID ¢) μ 's* co inin‘3r- — tn Ή il vocnh.. o

r* I >1 E in rH rH K OI

t J ^ E 't - i Tj r-t r~ - * 10 g -7 4J O m ϊ 1 — ' m io id in ,h G cn ^ ci m -h o 3 C ·· s x x m >h -h h .v o O H «5 m Pm <-h 1 I g e - - o o 3 § « "5 I — Φ EE en ό ω -h 04 "'T S rH u ‘"s» —. >H r-( OI -H m —

Q* - S t" O

G O m . 3 ~ ~ Il -H ·> ίο o I? I * O 3 iH m Er-i^o S -s· ή Z II Λ S G ·Η ή ·-» M- J, OlrH rH «Sc\ · —t

.* I 3 0) * " -· *- I o -5 . O -H

ττ <U $ O rH rr — E I

g “ P3 M ni UU Odprö II

m I I *P Q II X ' i—t i—I

•H Z iJ 'S - iS ;P ^ Tl 'M o

D '— I «O —· ·> »--p Cä Oi Q

rH I 3 ^ K r, rr

^ O Q> Ξ £S J C

fH r4 - Z m En — ^ *

| * O O

Ti E rH m | >1 LH r—< rH rC VO rH rH —, a i 3 r- ~ .g -H P G rr Ί5 — m in ^ Ό <D I o X m o· -H r- rGC/lO f-4*^TT io f—l n· >i I *C ^ ID rH i-H g * SJ £-> i—i * E 'f II. - E - - 3

C r—, O ' ~ — O O

H j H — X in in " 2 ^ ~ X en m x en oi -h iSJin OI 4' O 04 rH ,—| 11 go*· rH % Γ* rH 0 ^ G rH wi > « S <!j

*\3l *· ^- o * oinoRS

,tf o e •'•ja o ό ^ S h

— Γ. J3 3 —oinog^H

Q) VO *% m i-H ^H -H r—«.

e t· iJ oo^^o ·· w · ---- roOl I i'- Il . 5 ...: > i J , h . i o\ s ? J2 m S^i c'-^ 1 — S e 3 U3 S'-'G h >o x - ·<τ ή οδ-u I0J 44, r rt J3 ·» I 'P G ^ o £"r,J_i&orr,v-'r'‘~G S t; o

Ti!, a - S - I

3 ~ 1 P — * ^ Γ- -H lu rH — O 0 *<3 ·— ? — T-4-4 £2 >4 I O <-1 K ..

o en ηά x cc S

rH - £ Z H P

•H

£o «Hr, Γ: i! ^

•ri r-H

m w 51 86546

N

S

1Λ H ^ - I * Il ·» S O m tn, Ή ^ t rt· ra

- ,3 —' I « H

,—I -H * CO » —. 1—I «—| C

IM «n » v E S '3 m —* O *- m—»m » «· >5 -P rt 7 rt· o o .2 _ en <u -g 1 4J » r-ι * mm e ~~

:d en ρ m n q O

y I Tj v N 00 w CN ·—I £ <N

P ^ 'TOKI § ^ = I 5 ·» rt· in VO * °..

G «* rt » in II Λ o 00..

S® r-t 4J —— 1 t"b r* m r* o ® ή >i en — m 00 o m e -h o >< C s o ^ - * n h r- h 11 *» g" E- rt· x _» - gw -h * < , e * * * x s: o o o 5 B 11 k.3E^ — 3 E -* Ό rt· m r~ m r- ω -rt

j Λ l ^ t) - n - il mmoErj CJ

^ O <H ^ K Tl - « ^ rH .. 'm ~ ~ & >h Horn® en · m ·> g o * q il - * - 11 -p > !c 0 p i m q p rt· ι-j m x e rH p- o *=· - Z I I tn -» S Si il ^ ^ nl —' ·—4 tp »m * o rH i2e\ ·>σι i2 I I ni * - X »- Ό - I o -S . orn rt'O.pOrHC'im'-'ra.—-E ρ ·· > +

S *— .£ UJ IN MO o o* <s II

äJicu-Han θ'- O'— »J -? *0 ^ a! nq rj 1 1 ·* « m — * O -rt 2 K *5 0 l-ι Ό ^ z H H “ Λ e* * * Λ m <rt

, ” P n - r-l rP

rt O —' —' m ~ 1 rrt ω % < * H e N i Ö 2 £ P -rt rt- -rt * I * & en Yl 1 ~ <9 co ~ X o -j o rt h ti o rt· ·> 1 m m g i, 2 ΐ Ό S H I rt· <H "J· rt· 7! '· £ H Pi •ξ. J5 ~ m - «>03 in y A 5 >· T m . *m —e rH e » rt Γ[

c O - m—.*— S'- i^aJ

5J I 1—I X - X im -rt

S— I » ^ σ\ o m Y * M

•M — — ' X (N frt m ^ O 7 O

S ΰ ΧΛ-» oi N -H Γ JL Ah SCx: O ·~ ' M HH II M ίζ Γ]

Sd1^ fN * en q *i £ -9

Cl «(O'- ·* » 5 8 g ^ H

n 3 j » ' o o 2 2 a 1 -m

.Hrt1 Λ rt· m o m 7 .¾ G f ~ S

3 «S3 -—- 1 ro ro m -r g ,-j 2 n <d tn 2=.1 m o mm ’M-' X 0 ή

e o* 2 m - - r* " S -> 5 e H H

p U 1 rt· m II . s rt :-.10 7 ^ I -h -rt m * 3 ? pj ra (¾ Z & .7=

Stpo-O-* 1 * ' — r·* Se -rt ηι ψ J J3 -ft 3 1* ,i—1’ *H ro 00 *—* <"* S3 Ή O 53 -P ^ T irt e

I'o1-1 - X K >-1 I nS"". O 3 ^ >1 I

Crt-m^Uofrt CNH— E 8 „ > 1 ' 7 d m“‘3q Αίυ 5^¾ ιΐ^·ιη»ω§ ,ΰι^Όυιι oa ^ r-ι ^ >γ^-ρφ

oZlrSw x £ O -M >« Λ I -rt C

Ah — — O ^ ^ ? — r-4J K 2 ' I» g *'μ£κ ^ y ^m:<5 3

ΟΟΪΙ2 X

m en xl 2 m p T- to * rt o e S t- rt· •rt e -H in « 52 86546 I o >J tn I tn Ή f—i tn wi o o

Ί2 <U -H tn VO

2 en τ3 vo o _ * J» t ^ °ot I : 5 -HO rr LH « rt >, £ σν OJ S3 •g g li ™ ^ °

1 g S

K, a H ° O

-¾ ** — O -T II

V) a c tn en ·*τ

=*·„>-< m i—t CJ

e CU fi w § o < . Il

K I E- o O

(3 Ί I Z — en X w <=> ^ *>

SI Ή <U I "T

^ » S I

— tn tn u u •S i-rio'-' tv z * >2 x e ri *- 1 ^ w ? (nq >< i e ^ o tn es a ·—i rtj ' M *— id m tn l 3 >-· vo £ ^7 l u tn i-t £ >

*“♦ O rH iH <D <TJ

ω JL £ . . ..3 tn £ S ^ ° -h \ •H rH LO 1/1 y] · ^ en S- «uO CN 0) > -P I rt rH pH t> Π3

*H i—I

e l Ό - - ·· 3

S q e <=> ° -H

q r-\ S co r* e (N

’d >i C cv m -h S S < OI -H -H ·· -¾ o e* 'd 1 S I «. -Hm .2 o o o o ^ .· V^l 3 Ή O O tn Dj ιΗ Xl m m o ^ di — n en rH -~t CU . **

s U Ή H -H VO

PII O xr 2 'T —. „ C n S3 rt c rH1 o, n 1 “2 1 σ a °

- ^ ~ ε SS

S — I DU Dj rt II

$ i co — I -S

“21 * £ H »w 0) *— u — o x es M I O rj >· o a es p *—i *—' M t-·

•H

S

J§ s tn u L.----—____._ 53 86 34 6 k ^ vj o m 3

in -H

-h ^ ° Φ 7

fl) '“'M ' * rH

4j >-i O m o -H •'i 01 <U H rr in "I ^ rjco-7^ VO cn ^ v · S h ^ > > o •g, H >3 ·· fd <n

1 ^ ' « . -J K

fi — 5 o o H H

(D ·η Γ] τ m .5

23+J οι Ί· -H N OM

s £ c N ^ 3 .. ® k g s — S.

E s O o m & 00 ^ -U < —· oo -H ^ .. Il Y^i jn g-ι vo n in

IQ « i h n m CJ

Cu O —- q a -h n n " p ι-o c vo ° 2 rj> vn 2 ~ f3 γμ r·» % ~ - -h g. «i - - 3 I rH I P „ o m

*Τ I 0) Ä E ä 8 I

q — oi ^ ^ u iS11 S i > -h a — q m ~ ~ Ό « ~ .q «h o

φ — I, 'P —' "> K N Q

>i o T c: ri a r-l H "—*9 M ,“— m o rH ΤΓ q m o

*· rH rH C

I e n s-t E-· m o -ri i- •h <U l <π· n c

ro tn O VÖ r-l Q

£l I rH *-H ^H fc >1 j - i ^ - I m - - ..

§ — - o m

q H ^ VO

•H rH I en <n * ..

<d H-, -—· CM rH Q

-¾ h oi q oi 3 2 >i - * fq o c 5 ►! o m -P d

(N -H 1 co rr SU

.H» 3 J CN TT b H

•H — I en rH .. $ ^ CL esi Q) > q cj i n -d > «j

f3 i -h zj p _, H CN

§3^3 — 3 S '3 ™ S ^ i q ^ u-iq\*v

S I ω o I O -H . O

^'TZlr-j^E q ·· > e — q υ oopmn 2 i^ ϋί Ϊ «

5> 7 5 K ? M K

3 o i jS « ^ rn ιΗ ^ M Μ Ή g

Il * S._ 54 86546 * Ο αο

^ rH

I in o ►4 rH rH Cj 5 7 ^ tj ' (N un -H V-

.2 rrt ^ ^ S

^ ^ VOCnQ·· ~ XI H ^ ^ B ^ o

>1 ^ O S (N

_, I <~j » * .. ~ ΰ 1 P in in vo ·§ ^ H II ^ (ti >, >1 <N i-> 0 c> 3 9 5 g m v 3 s d - - <3 o o ^ (H H O (N -P 3 S;?~ ^ = 17 11 li-? Λ d 00 ™ ^ _

^1 “ Ή rH .. ω . U

C* Ω (U > —

S O < Il -H > (U

§•£-0 R r 7 cn o

J 3 n 2 JT O S iJ lOrH

i <—· aj i o -h « o (n S'T'-P^E H ·· > + “ m g, μ υ Q ‘tf3 rt I( i i;s § w 3-3 -o

Φ — I 7, — P C !NQ

^ ο o es *u a -H e- m ^ «— i U o o

O rH UO

c3 in i—i <d 7 ^ ^ .g •P Λ H K 3 (Λ , Ό rrt £ ~ M S ° 7 - & S3 UO CN g ..

- o -ä G ** δ I 8 ' ' ^ ..

2 r^ ·α O O ..

•H Ή >i n κω KO

β h Λ oo n -h

| g! fvj rH -H II

s S s ; o 1 § ^ί£ s : “a- S S ό il -d ^ ^ ! - ui H- Jj § £ d s 4· -Γ - 'e 8 % > °

rt — I u O O # Λ II

2 I hh Q — .H rH

'0=0 * £ - 5 ^

rH — X — ? ^ CS

>H I CU rj oi es j

h m in EH

H

|o m ; f±JL ....____________ _________ 55 8654 6 c

Q

< in m E-1 τ in I vo cn r

O »-» I—l <H -H

'-ι σ χ <U - (N * * ifl m ^ 0 0-2- -h ' n r* g ..

rn ή Ο σι m g xi I 2 n h E ~

>i U <3 O

- J= 0) **.." ™ §J 4-* ^ ® VO “ C * uj m m -h •H tJ -r-| O rH li fO I 'Q m γη O o X Λ S Ö 1 . >1 ' - 5 R <-t e — O O m -2

iv, >i —· m g ,_| II

,M r-l in m -H

^ u m ” S > H

§ g. .h h t > * .

(rt .C -r4 —- ΟΦ-PCNio <3 u p ή mc'v^»v·^ * I ^ I 8 - > c -1 o <)c δ +

Ή .h II

tn i u a *— m r~ -h

•H Z ^ Ui — τ- -M 144 O

aj·— >i—5 k n q * ό § a ^ " r-t M ί α) 4-)

m I

•H 1 C

li | CU Ή *— S Λ i ··

'3 * E

m o £

[ S -R VO

rv, I 8 -π μ

I—jl ^ r—j O

¢11¾ § o

s 1 ^ m -R

g 5 § g a - fq ___ —1 ·· ω ισ a. Ό , g) > ·* αΓ - -g > 3 n c = - a c -h ^

Sue o 5J -p *·· •2 4- t P -S ^ ° “ 7 !ζ Ö £ & n X i o r—i i—i Z —i ^ h -H Ή — '-»--Po; I ^ n ° s rH r-ι ^

H

fg Q) Vl 00 H ^ 0) lw -L------- 56 8 6 546 o

(M

m o •nr» c

I I o . jL

•H U -Η Ο Ξ ^ <t3 JZ <0 m Q ·< -p G* Ή Γ» S .— ^ I, . S'* c

C^rQ » » ra .. CM

§ · -8 in in .. ·· X

C Ή ^ fM m 10 •H I ο Ο (Ί Ή »-» *H CN r-C ·Η H o i S I . . § 8 tn m o 4J 3

rs, | >i CN in flj ·Η II

lH *JX(N IN rr E iH

^ » D <N .. W U

S * * · » *25 > Cl) G 0 EiHOOo I ö ö 2 -Γ » | i ° ” « i g j - 's S-5>°5 S'— i m u u o # m il tn i o -h x — «—( f—t ΐ 2 -1 'P u: £ £ rj Ή o -h w > '-'^+jkcnq ^ o » es H a t—t r—t —' M p

O

m CN 00 $ 1 £ £ q tn rr ^ ^ -21

H O V

•a .g » » tn 4: o. o <n -h T-

-"' | N- rp S

c j io o y

S I Ή Ή E

5 2 . . s ..

| λ ä > S I ^ O' CN ^ n — O C\| Ή o r». u <-\ e to .h1 <u v * * N 2 H tn R m cn m -3 C J >1 CN-n-CT^.H^.

03 | jO m <H ID ·· to · g o· ^ il 3 > 3 m <u e q e 3 ^ = .· —. o S -P in CUD -h iyq\ -v I |i ί _ >g 8 » > ° “TA ϋ “ 5-5 » r-ι i σ tn »— Λ! -h >i Z Ή x 1—’ t— +J y-1 —- ' — ? Ci 1 1/1 ri o » k y

»—i M

r-|

Is E et en

r3 ____J

57 86546 I in o 1-3 -H n in I Ό mo d d ^ ^ α) I 5 p — ,¾ - ^ Ui v> mo ^ <U Ό ·<τ m —

_5 w M m rg O

>, I P i-l^ <N

* j £ x £ I d -- ^ — u o m

l-| -H P *T ID CD

tn d ^ σι n o I ?l e q < --

r-^ P t* o m II

,Ι-ί -SI— CO »

'-v/ 3 Ο 'T in *r CJ

Ä H (S Mr-) — S CU « P U m · || o m 1-0 Γ- (0 «Η 2 v M — I ^ Ό 10 0 I ^

M rr S-i P — £ I

$ — e. « p u •H I I r-- Q —^ 0 Z J £ ϋ a d — I di — => ™ a I 0 o u ca a r-4 a. — M '— - >1 O ° P1 n· id id m <-· m

Φ <H T) -H rH C <N

-¾ - c - -¾ ° Ό P ’ mod £ m Q 'T m q >1 U3 «£ ID CM Q m _, I E-1 <—I —Ip s ij ' § - •H — «-· o m ..

-H - T VO VO

-s .H m οι η Ή 1 δ ~ I "

0 I G W

:. Ö S - o «3 § : « SS S Si d q Λ cu 1-1 .. ω -“Γ --- ro cu I a3 > > O J II -H > (0 ^ *3 I t μ ή > 03 S z ο "

G I Ui I 0 ·Η · O

ϋ rr C- -* β Μ··>^

—* I U U O (d CN II

m I ^ Ή e -w r—i «—i V.

H = I 5 S * £ £ O <U

d — U d — O — r-p K

1 0 o u

o a -h ci H

^U —· M M P

•H

3 P o m u £ c o m w 58 86546

TT

— ro , - m 'T I * - nu

O (N ^ O O O -X

*"H ·. (N vo co n ' · J3 I n m o J ^ ^ O — 04 H H m ^ QJ -2 - » > P rH p*» (N * ·· ft 3 · q VXX oo . d

•Q < S -IIVOIN vor- 'ä JJ

Ä 5 .¾ I— Ui<N$< >1 rr4 ID X ** ** »—♦ »H £> · 0 sf* - " - ^ — ·· | C 1 - o o , □ H h - E on oo m co P 3 <d I w .— '— ·. — on ro h o X ^ K OI H _ IN H Tl N — 3 U rr O I I x T3 h cgj - r~ (" v «. u "

K, to ^ · 04 *« r. . OO sLro II

VH I *3 .Q l oi to ±j in 03 o a ^ »J £ — r» —' ro t o ·· u I o o * ». ro i—i no '· — 5 H in h — *j· , 5 0« -5i ^22^ II 3 .. o iä W H <—i · o’ no rr q on ifl S fl λ | λ I Cno to ·.

AnC3^.Q<o2*~cn h 3 »~. o -1^0 •'O E E -. I & » O 04 tn ^ H Q V4 u S, H, li h i ^ u il a — i s o> z e w X C rt H o Π'— .. ό — a - ^ c m a ^ I Q K — 0 < 2 es H o h E-· S M p —

^ * «J

1 ~ O e .—. * ro τ r— 2

< £ I in o H

Cn ON H H "ti

< ·. - (O Φ O

0)1 O 04 —. O· — * -

4-lH ** S *· 0» OOH

<Λ| OI » CO Ν' in VO H H

H N 1 λ I * NOOI^^ Μι m o - ro _ h h i" 7 >,2 ^ o· ε ^ 2 ^ > ' »H *w ΤΓ CN * * ·· (Π SI d * O O *"“* h[3 ‘ £ o· * ~ inra-^ Tj

il I 2 ^ ~ ~ M ON (O .S

rt - O 3= h=— oj h .Π o, X J-l H O· o· | 04 rg 3 <D Ai «v H 00 .. » H ·· «enP * oi ». « o o o g _ I H Λ I fo Ό - in id i ^ ii J — CN — in Ho-a„ IH I h S ro H ..

* -H in (M o ^ Λ rr α'Ρ ~ x: ~ — 2 il d a 0) H » rp ro o m 7n“ in £ 2 r. — i ~ i — M no vo rOUQQHE-o-^» h y rt i < O ·- οι ε v 4J tn I an o -* r- 6- γοηη — ro — — _ε o e r · Q „ i; u & 8* 11 0) I C U II O — I s

1/321-1 ’ OS CrdH

H— » Ό — O — .£ CS

01 | in CO

d o - 2 es y

H H 2 M

•H

ie ^ l-i ω e S t—4 &_2_ 59 86546 V ^ «k —* SC SC SC tri VO 03 (N VO - ν' «N * o 2 I ~ - Γ'Ο'Π ο · ε -υ ε χ ιηο^'τ s Η. S ---- ! s CO ^ 00 *· %%1-Η •Η * Q) ** ·* ·» Ρ O Q ·Η Ή 'QrH+J Η Μ Π w ω Ο Κ ^ •g, .¾ III VO η S --

>< r£j ITI fM H CO r-l r-t ^ > O

S'-"* ^ ° ^ ^ ^ ·· <t3 cm

C >1 Γ-» CN n"> m % * fH S

SI 1 ° ° ‘ä ti d '—i » » * r* o m i ^ S l — — — — - cn<N.H<N o 3— x x x m (N ι-i rr) .» p J-! »TfN«T~ -H·· r-t

(1) - „ „ H

W H ' ' ~ — O O fr ^ Il I 3 j2 ε ε = 4J o co ^ ..

— “ —· (N — «r «t .· (J

C I O m >—i Ί· —· to —« r-j in o iH - ττ -rl > C, 2 ~ tn — Il n" 0 3<u g r-t (M n — rr ^ U) in ui S = $ -. i i i i — g m — CJ^Qmcoinr-m «h ft ιι o CI-CO^^-tv l 0 o r-t

Sr-yl m ·—i (N m *T —»g SS I

.3 - H Q u o p* g II

3 * u » ca — ä {?

<-i ^ C fä x: .u-i CD

>H '— ·. O D K <N Q

I Q CS U — ' o < Ξ K Η a —< E- X m ^ — l - <$ pH * O ]v

£ cn m s tn -P

<1) I TT r-t Φ · -P | CM >

3 — CO ·- ^ - CM — * ’*rH

·- (N X ε ** X O O -rt -H

xi t~* ή ττ — m m vo vo tn -P

>1 O i - i vo o Φ ^ _, I in » fft O v r-l r-| > ‘ § N ·- x £ - - tn .. m ^ .,-1 #hcn'—’min'»—' r—j

A 1 r0 I O O -H H

(Π <”♦ -rH - - <—t f- - ττ in VO Cl -P

-¾ 'S ε ·- ·* — *- ο in N

3^0 X —· m m χ r- in h ifl ^ B S 3 ^ I I 3 ..

hv_IUo a CO - - CM - - }_| H1 W U v — 4J *- O O fr ^ |H Ιό X3<NCNX'—r' in vo 511 >J fr — I vo m TT ..

r- I X| CO - TT- O r-t TT

(3 rr t3 vn - *~ — -h > 9* _ - -h 3: ε ^ X II ·· ...; tfltUC »—i cm — i rj O oo SS··—!- m ^ S^vn UQ G m - ττ cm - r-j cLii ·- SI < O *- x jj ·- - tn i O o

Γ-&Τ n 1-1 CD — m TT — P M O

tn—iC PU CU & ιι

S i e u n e — L

Ά 2 H -r se S g ru - - » T « X *° w * u e C · Σ cc 3 r-t I—I x M -t

Is r.

^ e m tn LH___ _ ¢) gr. / 60 u u J '· \j ^ ^ ^ i i ta ?] 5 'f s * n3 o rsi o -5 r-l - - - - * 03 m - · E O’ E E E an ,ρ_.

m O ^ ^ “ — — m CU· - Z > |j H CO CM CM m O - “ £ to1 CU OO , d H 3 4J m cm m m m· coo »J Π p m (/) tilli VO 1—I 0) \

£ O j m o o m en m .-1 > O

·> I Ρ *- ί> cm >-3 m m cm m m m - ” £ — S I ^ c o m m a «H %%%.** O C3 r* 1) **

I —' O <N -H O

«3 —< E X E E X —· m r-ι P 04 -¾ l-ι m cm m CM CM E £ m i <u ,H ' - u " ui p - - · · · · σο 11 '“N I -H .3 E E -P E E an c\ Q<

H h ^ -— ----— tttt ·· U

^ 1 O n m " ^ c — 3 m o in m en *>· -h !3 a o · ·- » ·- ·- * Il r-i ·· o *> 0) ρ m cm cm m m O mm § X P I I I I I I — G vo m [u U δ1 G -r en <n cm i— m m S„ --m m 1 m q · · · * * · 1 n* cm c p- p mmmcMmm^r—*- Qn l S — +3 o p o aan « 1 u π ε*- ia •h z c — « £ £ m o £ — *0 — ? -G x cm c £ i G « n — o < z « y s m £> 2 m H 1— j 1 - — 1 “---- I m 1 en "-nj I -m ·· m o o Ai J jj · m ^ iri o λ

I — m - E an ·~< ‘H

04 I - .—v m 1—1 1—1 n) m n m <rv — x t> -PC · X - - - ·· m »O CM (M CM - E CO Ή S 1 m 1 E ~ r- o $ Tj cm--— cm S -r t p v — E an mm §> .

NO cmc—-m-, > S— m cm ·- r- - - ·· (0 1-¾ -σν'τι o o . p -d m H — - - I cm c oo cl) efl l p E-Pmm- r- m £

,V — >1 rn — I *- Γ- CM m -H CM

a ρ -G cm r- τ p k aj m vo - -»{!·· n. ° * c - — o o o £ ^ H* l G £ cm ^ X unmvogj \H iJ ·· — I - C cm m m· o ·· ''-J I Q rr--^ mmm··

SaE- -cmoE« Il 3 ..

g <D I cm m — — O 04 S = o _ 1 c vo p- föUmcm— -mcM m m · M 1 - o —-es·'- 1 a n o ,-r-m m m cm — -«τ m —.5 Ro § — - Q PO & Sv 11

Ä I ml a II C — I S

•H Z I — x c cg £ £ — — K3 — o —J3c d 1 O E , - ^ O — m £2 y *—* CJ z M |j Ή t IS s en W________ I % % 61 86546 8 - o o Λ £ * m r» >i w —» in <h

^ ^ ^ S

a λ a ;3·ΐ °- «,· »e t ° cn M g x l >3 oo min g h 0) in l io cn am 'U en Q —- n * m mm p ' —

·£ i < co ·η m x - 5 ^ O

Λ J t< (N cn r» -* .. cn

Si i «. ·. o m o X

i—·ο·λΧ<-.»» τγ io m m cmmoeneNXO —. ' o\ m o -h * O >i ~ 2 S rH CD 2 CN m m ^ 11 m P M m E* m m §cn ° "3 >ί * <.<s· ·“ *“ *· ra O ·-.

g jJ m m Ό » v. - o O in 3 3 m 3 l -P G .3 E 'J· E <r ia in jj Ή

^-3-^ c ---1- CN H· m E ^H II

'P* —» 3 d .a m m r—i i—I '3 ^ α a 2 o o n· -o — $ > o II -H > ίο —

full ^ »H m ITI E H H

& *»· |J w 3 I I - « — S 5 "

S'— I (N 00 —» CM m .° P 4" V ON

S I 2 - ~ - g I O -r\ ·<=> Λ n· 1 O m m cn -«r £ Ρ··> ^

S — -H CN MU o 0\P (ö II I

I T3 -H Q II O'- -—j ·—!

"jX'-'O'- X

'a i [1 *o — ? T-+JatNQ

m I *n 0 £ _ g - sh o « m 2 k a o ·—i Ή AJ S l-l H “ — __ " \ „ ^ - δ £

I I X in in ig fO

•—' on in cn m H ^ ^

M - * m m o 2 T» ’-P

1) m «-% m m <U en * x -H m -P l >» — τ cn ~ G *· 2>-3 ->X'- 00 S 0 r«lQ non- m o I..

j» «* < s en m vorH g >, n e* m » *— <n mm in . Q I II Λ " ' S O o hj w r* - * , ™ » I 1—» o o m ^

.3 * *· * VO ·** » ΓΠ^* Q

aj ;q in S3 ·" m ^ <T\ cn e vo g S <-t «H I *> ^ m 11 b h I σι — - ' g in H h 3 Ό m cn £ oh· .. 3

VH _3 a) — — CN rr -H

'ή — ij - mm -d ·Η e· C- I m ~ en C rn

3 U J - X ~ ·-. Il g S

>11 mm Γ- U-I > rr 5 'r m 1 r— 1 Oio co ·—" 1 q 10 - NT es m M G »— I 2 O - E ► *- I P So η'ΤΙ m o — h· ιο —, g 2-b S) — -H O MU ~ .. Il 35 1 T3 a il a — dp d 2 'x. g ^ im P — 1 <0 — ?

d I in a H

a - 2 K

i-4 Ή 2 M

Ή h E e ^

*- CN

en

W

62 86546

Viite-esimerkki 1 1 0-{N-( 4- ( 4-GP) butanoyyliJ-L-Serj -1 - (Boc-L-Leu) - 1,5,10-TAD:n dihydrokloridin synteesi 1) 3-(N-Boc-L-Leu)-1,3-tiatsolidiini-2-tioni 5 10 g (43,23 mmoolia) N-Boc-L-leusiinia liuotettiin 100 ml:aan metyleenikloridia. Tähän lisättiin 5,15 g (43,23 mmoolia) tiatsolidiini-2-tionia. Edelleen lisättiin 8,92 g (43,23 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Seoksen annettiin reagoida 10 6 tunnin ajan jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Reaktio- seos suodatettiin saostuneen N,N'-disykloheksyyliurean poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin vaaleankeltainen kide. Tämä kide lietettiin 40 ml:aan metanolia. Suspensio suodatettiin halutun yhdisteen kokoamiseksi, jota 15 saatiin 5,38 g (saanto: 41,32 %).

IR (KBr) ** (cm_1) = 3380, 2930, 1675, 1510, 1335, 1250, 1160, 1040, 845, 755 2) 1 0-{n-/4- (4-GP) butanoyyli7-L-Ser| -1" (Boc-L-Leu) - 20 1,5,10-TAD:n dihydrokloridi 300 mg (0,55 mmoolia) 1 0-{n-,{3-(4-GP) butanoyyli7-L-SerJ-1,5,10-TAD:n trihydrokloridin valkoisia kiteitä liuotettiin 5 ml:aan metanolia. Tähän lisättiin 61,2 mg (0,61 mmoolia) trietyyliamiinia jäähdyttäen samalla jäiden 25 avulla. Seoksen annettiin reagoida 10 minuutin ajan reaktio-seosta samalla jäiden avulla jäähdyttäen. Reaktioseokseen lisättiin 201 mg (0,61 mmoolia) 3-(N-Boc-L-Leu)-1,3-tiatsoli-diini-2-tionin vaaleankeltaisia kiteitä, jotka oli saatu yllä esitetyssä kohdassa 1). Syntyvän seoksen annettiin rea-30 goida 5 tunnin ajan huoneenlämmössä. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, öljymäinen jäännös lietettiin 30 ml:aan asetonia. Supernatantti poistettiin dekantoiden, ja sama menettely toistettiin kahdesti. Jäljelle jäänyt jäännös väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 390 mg (saanto: 98,2 %) haluttua 35 yhdistettä valkeana kiteenä.

63 86546 IR (KBr) V (cm-1) - 3280, 2950, 1640, 1510, 1365, 1250, 1165, 1045 TLC (kloroformi:metanoli: ammoniakin 17 %:inen vesiliuos = 6:4:1 tilav./tilav.) 5 Rf = 0,39

Viite-esimerkeissä 2-4, esimerkkien, lukuunottamatta esimerkkiä 14, yleisen kaavan /il/ mukaiset yhdisteet valmistettiin erilaisista suojatuista aminohapoista samalla tavalla kuin on esitetty viite-esimerkissä 1.

10 Viite-esimerkki 2 1 0-{n-/[4- (4-GP) butanoyyli7-L-Serj -1 - (Boc-L-Leu-L-Leu) - 1,5,10-TAD:n trihydrokloridin synteesi 0,84 g (1,28 mmoolia) 10-{N-/4-(4-GP)butanoyyli7-L-Ser]-1-L-Leu-1,5,1 0-TAD:n valkoisia kiteitä, jotka saatiin 15 esimerkissä 1, käsiteltiin viite-esimerkissä 1 2) esitetyllä tavalla, jotta saatiin esimerkin 13 yleisen kaavan /1X7 mukaista yhdistettä.

Viite-esimerkki 3 10-|ν-/3-(4-GP)butanoyyli7~0-bentsyyli-L-Ser?-1,5-20 di-(N-Boc-L-PhG)-1,5,10-TAD:n synteesi

1) 10-Boc-1,5,10-TAD

18,9 g (100 mmoolia) mono-N-boc-1,4-butaanidiamii-nia (katso Japanese Patent Application Kokai (julkaistu) nro 192347/1982) liuotettiin 150 ml:aan kloroformia. Sii-25 hen lisättiin 5,57 g (105 mmoolia) akryylinitriiliä jäähdyttäen samalla jäiden avulla, ja seoksen annettiin reagoida 3 vuorokauden ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 23,4 g öljymäistä ainetta.

30 öljymäinen aine (23,4 g) liuotettiin 260 mitään am moniakilla kyllästettyä etanolia. Tähän lisättiin 20 g Raney-nikkeliä, ja hydrattiin 5 tunnin ajan huoneenlämmössä, 60 ilmakehän paineessa (6078 kPa:n paineessa). Reaktion päätyttyä reaktioseos suodatettiin katalysaattorin 35 poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 64 8 6 5 4 6 23,7 g (saanto: 96,7 %) haluttua yhdistettä öljymäisenä aineena.

NMR (D20, ulkoinen TMS) ef = 1,6 - 2,5 (m, 6H) , 1,9 (s, 9H) , 2,7 - 3,3 (m, 6H) , 5 3,4 - 3,8 (m, 2H)

1) 1O-Boc-1,5-di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD

2,85 g (11,6 mmoolia) öljymäistä 1O-Boc-1,5,10-TAD:a, joka saatiin yllä kohdassa 1),sekä 6,63 g (23,2 mmoolia) N-Z-L-fenyyliglysiiniä liuotettiin 50 ml:aan dikloorime-10 taania. Tähän lisättiin 5,3 g (27,84 mmoolia) 1-etyyli-3-(N,N'-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidin hydrokloridia jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Seoksen annettiin reagoida yön ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos väkevöi-tiin tyhjössä, jotta saatiin öljymäistä ainetta, öljymäi-15 nen aine liuotettiin 200 ml:aan etyyliasetaattia. Liuosta pestiin natriumkarbonaatin 5 %:isella vesiliuoksella sekä natriumkloridin kyllästetyllä vesiliuoksella mainitussa järjestyksessä. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja sitten se väkevöitiin tyhjös-20 sä, jotta saatiin 10,5 g öljymäistä ainetta.

öljymäiselle aineelle suoritettiin pylväskromato-grafia käyttäen piihappogeeli 60:a, jonka valmistaja on Merck Co. Kloroformilla suoritettua kehittämistä seurasi eluointi kloroformi-metanoli-seoksella (20:1), mikä an-25 toi 4,9 g (saanto: 54,44 %) öljymäistä ainetta.

NMR (CDC13) cf = 0,9 - 1,9 (m, 6H) , 1,47 (s, 9H) , 2,7 - 3,8 (m, 8H) , 4.5 - 5,0 (b, H), 5,2 - 6,0 (m, 2H), 5,23 (s, 4H), 6,1 - 6.6 (b, 2H), 6,9 - 8,0 (b, H), 7,5 (s, 10H), 7,53 (s, 10H) 30 TLC (kloroformi:metanoli = 10:1 tilav./tilav.)

Rf = 0,49

3) 1,5-di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD

4,9 g (6,28 mmoolia) 1O-Boc-1,5-di-(N-Z-L-PhG)- 1,5,10-TAD:a, joka oli saatu yllä kohdassa 2), liuotettiin 35 20 ml:aan trifluorietikkahappoa jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Liuoksen annettiin reagoida 2 tunnin ajan. Reaktio- 65 86546 seos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin öljymäistä ainetta. öljymäinen aine liuotettiin 150 ml:aan etyyliasetaattia, ja liuos pestiin natriumkarbonaatin 5 %:isella vesi-liuoksella sekä natriumkloridin kyllästetyllä liuoksella 5 mainitussa järjestyksessä. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja sitten se väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 4,4 g (saanto: kvantitatiivinen) haluttua yhdistettä öljymäisenä aineena.

IR (KBr) 10 V= (cm-1) = 3290, 3030, 2920, 1700, 1635, 1490, 1445, 1325, 1230, 1145, 1035 TLC (kloroformi:metanoli = 1:1 tilav./tilav.)

Rf = 0,12

4) 10-(N-Boc-O-bentsyyli-L-Ser)-1,5-di-(N-Z-L-PhG)-15 1,5,10-TAD

3,2 g (4,7 mmoolia) 1,5-di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:a, joka saatiin yllä kohdassa 3), liuotettiin 40 ml:aan dikloo-rimetaania. Siihen lisättiin 0,8 g (7,9 mmoolia) trietyyli-amiinia jäiden avulla samalla jäähdyttäen. Edelleen lisät-20 tiin 2,39 g (6,09 mmoolia) N-Boc-O-bentsyyli-L-seriinin N-hydroksisukkinimidiesteriä. Seoksen annettiin reagoida yön ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, ja jäännös liuotettiin 200 ml:aan etyyliasetaattia. Liuosta pestiin 5 %:isella fosforihapolla ja natriumkarbo-25 naatin 5 %:isella vesiliuoksella sekä kyllästetyllä natrium- kloridiliuoksella mainitussa järjestyksessä. Orgaaninen kerros pestiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja sitten se suodatettiin kuivausaineen poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 4,2 g (saanto: 93,3 %) halut-30 tua yhdistettä vaaleankeltaisena, öljymäisenä aineena.

IR (KBr) V(cm-1) = 3305, 2930, 1705, 1650, 1495, 1450, 1300, 1235, 1160, 1040 TLC (kloroformi:metanoli = 20:1 tilav./tilav.) 35 Rf = 0,43 66 86 546 5) 1 O-(O-bentsyyli-L-Ser)-1,5-di-(N-Z-L-Phg)-

1,5,10-TAD

4.2 g (4,38 mmoolia) 10-(N-Boc-O-bentsyyli-L-Ser)- 1.5- di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:a, joka oli saatu yllä koh- 5 dassa 4), liuotettiin 20 ml:aan trifluorietikkahappoa jääh dyttäen samalla jäiden avulla. Liuoksen annettiin reagoida 2 tunnin ajan. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin öljymäinen aine. Tämä aine liuotettiin 150 ml:aan etyyliasetaattia, ja sitä pestiin natriumkarbonaatin 10 5 %:isella vesiliuoksella ja natriumkloridin kyllästetyl lä vesiliuoksella mainitussa järjestyksessä. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja sitten se suodatettiin kuivausaineen poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 3,7 g (saanto: kvanti-15 tatiivinen) haluttua ainetta öljymäisenä aineena.

IR (KBr) V (cm"1) = 3305, 2930, 1710, 1640, 1520, 1495, 1450, 1325, 1235, 1075, 1040 TLC (kloroformi:metanoli = 10:1 tilav./tilav.) 20 Rf = 0,13 6) 1 0—[N—/5— (4-GP) butanoyyli_/-0-bentsyyli-L-Ser^- 1.5- di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:n hydrokloridi 1.2 g (5,42 mmoolia) 4-(4-GP) voihapon ruskeita kiteitä lisättiin 7 ml:aan jäiden avulla jäähdytettyä tio- 25 nyylikloridia, 4-5 erässä. Seoksen annettiin reagoida 15 minuutin ajan. Reaktioseos väkevöitiin kuivaksi tyhjössä.

3,8 g (4,38 mmoolia) 10-(O-bentsyyli-L-Ser)-1,5-di-(N-Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:a, joka oli saatu yllä kohdassa 5), liuotettiin 30 ml:aan dimetyyliformamidia. Siihen lisättiin 30 0,65 g (8,21 mmoolia) pyridiiniä jäähdyttäen samalla jäi den avulla. Edelleen lisättiin liuos, joka oli saatu liuottamalla yllä valmitettua 4-(4-GP)-voihappokloridin hydro-kloridia 7 ml:aan dimetyyliformamidia. Seoksen annettiin reagoida 30 minuutin ajan jäähdyttäen samalla jäiden avul-35 la. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin öljymäinen jäännös. Jäännös liuotettiin seokseen, joka sisälsi 67 «6545 300 ml etyyliasetaattia ja 90 ml etanolia, ja seosta pestiin 5 %:isella fosforihapolla, natriumkarbonaatin 5 %:isella vesiliuoksella sekä natriumkloridin kyllästetyllä vesiliuoksella, mainitussa järjestyksessä. Koska pesun aikana saostui 5 pieni määrä öljymäistä ainetta, lisättiin etanolia saostuman liuottamiseksi. Orgaaninen kerros kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja sitten se suodatettiin kuivaus-aineen poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 4,8 g (saanto:kvantitatiivinen) haluttua tuotetta 10 vaaleankeltaisena, öljymäisenä aineena.

IR (KBr) (cm“1) = 3300, 2030, 1645, 1515, 1450, 1235, 1045 TLC (kloroformi:metanoli:ammoniakin 17 %:inen vesiliuos = 6:1,5:0,25 tilav./tilav.) 15 Rf = 0,28

Viite-esimerkki 4 10-{n-/4-(4-GP)butanoyy1i7“L-SerJ-1-(Z-L-PhG)-1,5,10-TAD:n dihydrokloridin synteesi 1) 3-(N-Z-L-PhG)-1,3-tiatsolidiini-2-tioni 20 5,7 g (20 mmoolia) N-Z-L-fenyyliglysiiniä liuotet tiin 50 ml:aan metyleenikloridia. Siihen lisätään 2,38 g (20 mmoolia) 1,3-tiatsolidiini-2-tionia. Edelleen lisättiin 4,13 g (20 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Seoksen annettiin reagoida 25 6 tunnin ajan reaktiosoosta jäillä jäähdyttäen. Reaktioseos suodatettiin N,N1-disykloheksyyliurean poistamiseksi. Suodos väkevöitiin tyhjössä, jotta saatiin 12,0 g vaaleankeltaista, öljymäistä ainetta. Aine kromatografoitiin pylväässä, joka oli pakattu silica gel*® 60:llä, jonka valmistaja on Merck 30 Co. Kehittäminen suoritettiin seosliuotinta n-heksaani-klo-roformi-etyyliasetaattia (6:3: 1-2 tilav./tilav.) käyttäen, jolloin saatiin 4,0 g (saanto:51,28 %) haluttua tuotetta vaaleankeltaisena, öljymäisenä aineena.

IR (KBr) 35 V (cm_1) = 3390, 1690, 1585, 1500, 1455, 1335, 1275, 1225, 1170, 1055 68 86546 TLC (n-heksaani:kloroformi:etyyliasetaatti = 6:3:2 (tilav./tilav.)

Rf = 0,28 2) 10-{N-//f-(4-GP)butanoyyli_/-L-Ser]-1-/Z-L-PhG)- 5 1,5,10-TAD:n dihydrokloridi 0,55 g (1 mmoolia) 1 0-{n-/4-(4-GP) butanoyyli/-L-Ser^- 1,5,10-TAD:n trihydrokloridia liuotettiin 6 ml:aan metanolia. Tähän lisättiin 0,106 g (1,05 mmoolia) trietyyliamiinia jäiden avulla samalla jäähdyttäen.

10 Seoksen annettiin reagoida 10 minuutin ajan reaktio- seosta samalla jäiden avulla jäähdyttäen. Reaktioseokseen lisättiin 0,41 g (1,05 mmoolia) vaaleankeltaista, öljyjäis-tä ainetta, joka oli 3-(N-Z-L-PhG)-1,3-tiatsolidiini-2-tio-nia, joka oli saatu yllä kohdassa 1). Seoksen annettiin 15 reagoida 5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos väkevöitiin tyhjössä, öljymäinen jäännös lietettiin 30ml:aan asetonia. Supernatantti poistettiin dekantoiden. Sama menettely toistettiin kahdesti. Jäännös kuivattiin tyhjössä, jotta saatiin 0,83 g (saanto kvantitatiivinen) haluttua 20 yhdistettä valkoisena kiteenä.

IR (KBr) ^(cm"1) = 3270, 1620, 1510, 1235, 1040 TLC (kloroformirmetanoli:ammoniakin 17 %:inen vesiliuos = 6:4:1 tilav./tilav.) 25 Rf = 0,51

Yleisen kaavan [llj mukaisia, erilaisia muita yhdisteitä voidaan valmistaa erilaisista suojatuista aminohapoista samalla tavalla kuin viite-esimerkissä 1.

Jos viite-esimerkissä 1 saatu tuote on vaaleankeltai-30 nen, kiteinen aine, lisäpuhdistus pylväskromatografiän avulla ei ole tarpeellista. Kide lietetään metanoliin ja se saadaan takaisin suodattamalla, jolloin haluttu yhdiste voidaan saada erittäin puhtaana.

Claims (7)

69 OOD‘r0

1. Menetelmä uusien, kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten spergualiinijohdannaisten ja 5 niiden farmakologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi R R h2n\ I fx ^C-NH-X-ICHj) 3-CONHCHCONH-(CH2l .-M-fCH,) 10 (I) jossa kaavassa X on — (CH2) 3_5- tai · R on tai nh2 m

15 A ^ I -CH20H; R1 on -H, ^y-CH-CO- tai(CH3)2CHCH2-CH-CO-; R2 on 1. ryhmä, jolla on kaava 20 Γ2 ^Ö^CH2)n-CH-C0- x2 .·. 25 jossa n on 0 tai 1; X! on -H tai -OH; ja X2 on -H tai -ch2oh, X. I4 2. ryhmä, jolla on kaava Χ,-(ΟΗ-) -CH-CO- v m lu 30 jossa m on kokonaisluku 0-4; X3 on -H, -C00H, -OH, -NH2 tai -CONH2; X4 on -H tai -NH2; ja ainakin toinen X3:sta ja X4: stä on -NH2, 3. ryhmä, jolla on kaava H- (A )y- 35 70 86 54 6 CHjCH (CH3 ) 2 jossa y on 1 tai 2; A on -NH-CH-CO- tai CD- CO-; ja, kun y on 2, kaksi A-ryhmää muodostavat peptidisidoksen, tai 4. ryhmä, jolla on kaava 10 ennä-®· - CH-CO- NH2 oh ja kun Rx on muu ryhmä kuin -H, R2 on sama kuin R2, tunnettu siitä, että poistetaan suojaryhmät suo-jaryhmiä sisältävästä yhdisteestä, jolla on kaava (II) 15 H 2 r ^c-nh-x-(ch2)3-conhchconh-(ch2)4-n-,ch2)3-n„.Rs UI) jossa X merkitsee samaa kuin edellä; R3 on -H tai 20 -CH2-0-Y, jossa Y on -H tai hydroksisuojaryhmä; R4 on -H, fenyyliglysyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu, tai leusyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu; ja R5 on tähde, joka vastaa R2-ryhmää, jossa aminoryhmä on suojattu; ja kun R4 on fenyyliglysyyli- tai leusyyliryhmä, jos-25 sa aminoryhmä on suojattu, R5 on fenyyli- tai leusyyliryhmä, jossa aminoryhmä on suojattu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, NH2 tunnettu siitä, että R2 on (L tai D)_^"""^-ch-co-

30 NH-, (L) —(CH^)2CHCH2CH-CO-, tai (L,L)—(CH^)2CHCH2CHCONHCH-CO-. nh2 ch2ch(ch3)2 35 t c r .· r 71 uC jvu

3. Menetelmä 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)buta-noyyli]-L-seryyli}-l-L- tai D-fenyyliglysyyli-1,5,10-triatsadekaanin tai sen farmakologisesti hyväksyttävän 5 suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että poistetaan suojaryhmät 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)buta-noyyli]-L-seryyli}-l-N-suojattu-L- tai D-fenyyliglysyy li-1, 5, 10-triatsadekaanista tai sen suolasta.

4. Menetelmä 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)buta- 10 noyyli]-L-seryyli}-l-L-leusyyli-l,5,10-triatsadekaanin tai sen farmakologisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että poistetaan suojaryhmät 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)butanoyyli]-L-seryyli}-1-N-suojattu-L-leusyyli-l,5,10-triatsadekaanista tai sen 15 suolasta.

5. Menetelmä 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)buta-noyyli]-seryyli}-l-L-leusyyli-L-leusyyli-l,5,10-triatsadekaanin tai sen farmakologisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että poistetaan 20 suojaryhmät 10-{N-[4-(guanidinofenyyli)butanoyyli]-L-se- ryyli}-l-N-suojattu-L-leusyyli-L-leusyyli-l,5,10-triatsadekaanista tai sen suolasta.

6. Menetelmä 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)buta-noyyli]-L-seryyli]-1,5-di-L-fenyyliglysyyli-l,5,10-triat- 25 sadekaanin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että poistetaan suojaryhmät 10-{N-[4-(4-guanidinofenyyli)butanoyyli]-0-bentsyyli-L-seryyli}-1,5-(di-N-suoj attu-L-fenyyliglysyy-li)-l,5,10-triatsadekaanista tai sen suolasta. 72 86 546