FI81360C - Stabila salter mellan s-adenosyl-l-metionin (sam) och polyanjoner. - Google Patents

Description

81360 1 S-adenosyyli-L-metionilnin (SAM) ja polyanlonien väliset stabiilit suolat Stabila salter melian S-adenosyl-L-metlonin (SAM) och pölyänjoner 5 Tämä keksintö kohdistuu uusiin, S-adenosyyli-L-metionlinin (SAM) ja vesi-10 liukoisten polyanionien välisiin stabiileihin suoloihin, menetelmiin niiden saamiseksi, sekä lääkinnällisiin valmisteisiin, jotka sisältävät aktiivisina aineosinaan mainittuja uusia suoloja.

S-adenosyyli-metioniinilla, josta yleisesti käytetään lyhennettä SAM, ja 15 jota on läsnä kaiklesa elävissä organismeissa, on lukuisia tärkeitä biologisia toimintoja: (a) se toimii metyyliryhmän luovuttajana lukuisissa transmetylointlreaktioissa; (b) se on erään spesifisen lyaasi-entsyymin substraatti, joka entsyymi muuntaa tämän molekyylin metyylitioadenosiinik-si (MTA) ja homoseriiniksi; (c) se toimii aminovoihappoketjun luovuttajana, 20 jolloin vastaanottajana on tRNA; (d) se on aminoasidiketjun luovuttajana biotiinin biosynteesissä; (e) se on adenosyyliryhmän luovuttaja; (f) se on lysiini-2,3-aminomutaasin, treoniinisyntetaasin, pyruvaatti-formaatti-lyaasin ja N^-metyylitetrahydrofolaatti-homokysteiini-metyylitransferaasin promoottori; (g) se on H-ribonukleaasin, metyleeni-tetrahydrofoolireduktaa-25 sin ja etanollamiinifosfaattl-sytidyylltransferaasin inhibiittori; (h) sitä tarvitaan bakteerelden ja leukosyyttien kemotaksis-ilmiössä (organismin, esimerkiksi leukosyytin liikkuminen kemiallisen pitoisuusgradientin seurauksena); (i) sitä tarvitaan prokarioottisissä ja eukarioottisissa soluissa DNA:n restriktio- ja muuntamisjärjestelmissä. Tämän lisäksi siitä 30 dekarboksylaatiolla saatu tuote, S-adenosyyli-(5')-3-metyylitiopropyylia-miini (deca-SAM), toimii propyyliamiiniryhmän luovuttajana polyamiinien biosynteesireaktioissa. SAM:in ja deca-SAM:in moninaisia biologisia toimintoja laajasti käsittelevää, uutta kirjallisuutta on käytettävissä (Zappia V. et ai., "Biomedical and Pharmacological roles of Adenosylmethionine 35 and the Central Nervous System", sivu 1, Zappia V. et al., toim., Pergamon Press N.Y., 1979; Paik W.K. et al., "Protein Methylation", Maister A., toim., J. Wiley & Sons N.Y., 1980; "Biochemistry of S-Adenosylmethionine 2 81360 1 and Related Compounds", Usdin E. et al., toim., Mac Millan Press L.t.D., 1982). Erityisesti transmerylointireaktioissa metyylin luovuttajana toimiva 8AM saa aikaan lukuisten erilaisten metaboliittien biosynteesissä esimerkiksi sidosten M-Cli (kreatilnit, koliini, N-metyylinikotiiniatnidi, adrena-5 liini, useat alkaloidit, proteiinit, nukleiinihapot), S-CH^ (metioniini, S-metyylimetioniini), 0-CH (metaaniefriini, ligniini, pektiini, fenolit), C-CH.^ (C28-ergosteroli, tymiini-ribosidi, tietyt antibiootit, proteiinit, nukleiinihapot, polysakkaridit) muodostumisen. Entsymaattisissa transmety-laatioissa muodostuvat erilaiset yhdisteet ja kemialliset sidokset osoitta-10 vat, että entsymaattiset transmetylaatiot ovat fysiologisesti hyvin monipuolisia; näistä toiminnoista mainittakoon toksisuuden poistaminen, joka tapahtuu esimerkiksi pyridiinin ja sen johdannaisten, kuten nikotiinihapon ja sen amidijohdannaisen, metvloitumisen seurauksena. Metylointi voi myös usein muuttaa molekyylien fysiologisia ominaisuuksia; riittää, kun maini-15 taan esimerkiksi noradrenaliinin ja adrenaliinin, tai morfiinin ja kodeiinin väliset eroavaisuudet (Borchardt R.T., "Enzymatic Basis of Detoxication". voi. Il, sivu 43, Academic Press, 1980). Erittäin merkittävää oli lukuisten, tRNA:ssa esiintyvien metyloitujen emästen toteaminen; tässä yhteydessä esitettiin lukuisia olettamuksia polynukleotidien metyloitumisen 20 mahdollisesti aiheuttamista säätelevistä toiminnoista (Kersten H., "Biochemistry of S-Adenosylmethionine and Related Compounds", sivu 357, Usdin E. et ai., toira., Mac Millan Press L.t.D., 1982). Samoin tärkeitä ovat proteiinien metyloitumisreaktiot, jotka ovat olleet kohteena W.K. Paik:in tutkijaryhmän viimevuosina toteutetuissa tutkimuksissa. Useat 25 entsyymit osallistuvat niihin reaktioihin, joissa (a) arginiinir guanidii-nijäännökset metyloituvat, jolloin muodostuu (O -N-metyyliarginiinia; (b) lysiinijäännösten aninoryhmät metyloituvat, jolloin muodostuu E-N-mono-ja dimetyyli-lysiiniä; (c) kaksi karboksyyliryhmää käsittävien aminohappo-jäännösten karboksiryhmät metyloituvat, jolloin muodostuu metyy]iestereitä.

30

Proteiineissa olevien lysiinijäännösten metyloituminen on ensistäänkin merkittävää itse proteiinien toiminnalle, jonka lisäksi se johtaa myöskin N-trimetyyli-lysiinin syntymiseen, mikä on samoin tärkeä seuraus tällaisesta metylointireaktiosta. Tämä metyloitunut aminohappo on karnitiinln 35 biosynteesin välituote. Transmetylaatioreaktioiden lisäksi SAM-yhdisteellä on olennaista vaikutusta polyamiinien biosynteesiin ohjautuvissa metabolian tapahtumissa. Tässä biogeneettisessä reitissä SAM toimii entsymaattisen

II

3 81 360 1 dekarboksylaation jälkeen propyyliamiiniryhmän luovuttajana, jolloin tämän ryhmän ottavat vastaan putresilnl ja spermxdiini, ja jolloin muodostuu spermldiinlä ja spermiiniä, vastaavasti, jotka ovat tärkeitä, eukariooteis-sa esiintyviä biologisia polyamiineja. (Zappia V. et ai., J. Biol. Chem.

5 7276, 225, 1980). Polyamiinien biosynteesin ja transmetylaatioreaktioiden välillä ei ole yhteyttä ainoastaan siitä syystä, että molemmissa reiteissä käytetään yhteistä substraattia, vaan myöskin siitä syystä, että SAM-yhdis-teen dekarboksylaatioreaktion tuote, deca-SAM, on transmetylaatioreaktioiden inhibiittori (Zappia et ai., J. Biol. Chem. 224, 4499, 1969). Nämä 10 samat tutkijat ovat julkaisseet MTA-yhdisteen aiheuttaman samanlaisen inhiboivan vaikutuksen. Niiden reaktioiden lisäksi, joissa reaktioissa SAM toimii substraattina, mainittakoon tietyt säätelevät, sulfoniumyhdis-teen aiheuttamat toiminnot. Tarkasteltakoon esimerkiksi SAM-yhdisteen säätelevää vaikutusta homokysteiinin metyloinnissa, jolloin muodostuu 15 metioniinia. Tässä reaktiossa N^-metyylitetrahydrofoolihappo toimii metyylin luovuttajana, ja B^-vitamiini on metyloitunut välituote, jolloin toisaalta SAM-yhdiste, jota tarvitaan katalyyttisinä pitoisuuksina, toimii Bj^-vitamiinin metyloinnin käynnistimenä. Muistutettakoon, että sulfonium-yhdisteen muihin sääteleviin toimintoihin kuuluu sen vaikutus etanoliamii-20 ni-sytidyylitransferaasientsyymin toimintaan. Tämän entsyymin aktiivisuutta säätävä mekanismi on ehkä saatu selvitetyksi, ja se käsittää todennäköisesti proteiinin ei-entsymaattisen metyloitumisen. Tämän saman mekanismin oletetaan myös selittävän vasikan kateenkorvarauhasesta peräisin olevan H-rlbonukleaasin palautumattoman inaktivoitumisen, jonka SAM saa aikaan 25 (Zappia V. et ai., "Biomedical and Pharmacological Roles of Adenosylmethio-nine and the Central Nervous System", sivu 1, Zappia V. et ai., toim., Pergamon Press N.Y., 1979). Tärkeitä ovat samoin transsulfurointireaktioi-den, folaattisyklin ja transmetylaatioiden aineenvaihdunnalliset riippuvuudet toisistaan.

30

Sen jälkeen, kun SAM on luovuttanut metyyliryhmän, se muuttuu yhdisteeksi S-adenosyyli-homokysteiini (SAH), joka en voimakas inhibiittori kaikissa tähän mennessä tutkituissa transmetylaatioreaktloissa. Näin ollen SAM-yh-distettä hajottavilla entsyymeillä, eräällä L-aminohappo-oksidaasilla ja 35 eräällä spesifisellä hydrolaasllla, on epäsuoraa säätelevää vaikutusta metyyliryhmän siirtoreaktiolssa. Vaikka hydrolyysireaktioissa tasapaino on siirtynytkin kondensaation suuntaan, niin kuitenkin SAH hydrolysoituu, 4 81360 1 koska reaktiotuotteet hajoavat entsymaattisesti. Todellakin, adenosiini muuttuu nopeasti inosiiniksi, hypoksantiiniksi, ksantiiniksi, ja erittyy virtsahappona, kun taas hotnokysteiini metaboloituu kahdella kilpailevalla järjestelmällä: cr«n vsulfurointijärjestelmällä, joka johtaa kysteiiniin, 5 sekä niin kutsuttuna "rikin säilyttävänä renkaana", joka liittyy jälleen folaattiin.

Monipuolisten mutkikkaiden biokvnial1isten toimintojensa ansiosta SAM-yh-disceellä on lukuis ia larmako 1 oy i s i .·> vaikutuksia, joita on lueteltu liit-10 teenä olevassa taulukoissa I.

SAM-vhdistettä voidaan tuottaa helposti teollisessa mitassa hiivoilla, ioita on kasvatettu metton:inia sisältävillä alustoilla (kantoni G.L., "Methods in Enzymology", 3, 60<·, ]cJb7) .

15

Adenosyylimecioniinin tai 5'-{[{3S)-3-araino-3-karboksi-propyyliJ-metyyli-(S)-sulfoni/-51-deoksiadenosiinin, josta käytetään lyhennettä (-)SAM, luonnollista, biologisesti aktiivista muotoa esittävässä kaavassa, jäljempänä (Zappia V. et ai., Biochem. Biophys. Acta 178, 185, 1969), on annettu 20 tässä molekyylissä olevien erilaisten ionisoituvien ryhmien pK^-arvot (Farooqui J. et ai·, "Electrophoresis" A, 261, 1983).

25 x3

OJ

30 pk, 12.3 U-lcri, l CHrCHrCRCOOH /pH HOSj CH3 +ΝΗ, pkCi.it ^Nor pk, 7.0 35

II

5 81360 μ <u Ό 3 I (0 (Ο μ d d ή to x: d

«ο -H CO

as »—l *H μ bC :as ai O :as co

μ -H

O CD S

4-» Ή O

d Ό O

& 4) )-i ^ ^ Xi :d co co a) co d co 3 C 3 ·>-)

di Ό ·*—i 'B

CO 2 2 2 Ή 0) - d) Ή 3 Ή Cd .—I 4-4 •H 3 τ4 3 3 H 4J CO 4J 3 rH 2 2 rH 2 2 d> 3 d) cd > 4J >

Ο Ή CD ·Η C

1 4-> 3 Ή 3d

4J I μ I CO

4J 2 3 3 3 2 d) :cd 3 o 3 cd « Oi 2 2 2 2 2 3

4J

3 2

•H

cd >

4J

<U I I

CO <H 4-> I

•H Cd 3 t4 00 3 ·» C d) (O c O A! » « £ d 0) d -H iH 3 C ·γ4 die 4J > o cd 44 Tl Cd ·η (0 CO d 3

M 2 >03 CU4J -H-4J4J

3 > O d <~v 3 2 <0 ·Η CO 2

0 B 3 μ O CO CO *H 3 2 3 d O

01 C d 3 μ CO τ-Ι -Hd) O -H B *c->

Oil 3 3 2 2 d) CO d) 2 2 μ d 44—t 3 cod 4J Ή Ο μ :« 2 b d 2 μ o d οι —I u )-) 33 3 4-) S3 O μ H Ji 3 I» C 1-C d 2 d 3 >> 3.3 r-tcd<ud>

H 3 ·ι—) 3 Ο 3 B O d 2 2 CO

•H 3 2 d) ^ d-H CO μ ·Η 2 •H 3 2 3 r-l -T—> r—i 2 d) d >, 3 -Hdd)3B d d 4J 4-) o > 2 2 a) :d> B-H^f^ •H CO d Ή 2 CO *r-) d 3 2 2 2 3 4J d B d 3 2 d)2d)2 2B2d)

d) 3d d >>, 3 0 3 fl Ή O O C

S 12 3 Ή 3 232 223)6^

2 2 2 d> 3 2 330 '-'COB

Ή S3 3 ;d3 Ή 3 3 4) 9 3 >. 2 d> dl 2 C0 33 2 3 2 2 3 3 2 2

>, f—C d) 2 d) 3 d) Ή CCS 2 H d) Φ (β 4J

S> 1-4 Μτ4 B4-) >2 d > 2 0 3 2 2 2

0 d dd -ho co d :d O 3 rl h 4) O

3 s μ d> dd 2 2 > Od)B3> d) dll μβ 3 μ 3 S μ H to 2 3 0 3 « •3 O I Cdd) 33 2 d 2 Cd d 2 2 2 2 d d oi oi co «J 2 22 2 co μ -d d 2 d μ

Cfl :d > d)

CO

- 2 :ro :d 2 > d 2 :d > d) 44 d i 3 d 44 d d> ·π o> t-t > o co co d) 3

2 2 to ή m «ID

3 3 3 H 3 3 μ 3 2 μ d μ 3 2 3 d 3 d 3 2 at 2 3 2 co 2 •H ι-H 2 O. 2 2 2 d 3d 2 d d d > H > Od > 2 > 6 81 360 nj ,

E CD

D w w 4-1 a C w >, C 0) · φ dc x cn to cl Da» ,χί E co

D AC C ,*! W D CO

I CO -Η tH > W *H

I D E D :D Dx» ; CD ·» D td -ι-l co w A«i 3 I > C C W *-» X X Ο» Ή « lt-,α» >^d CD cos a> cow I U C X D c0 ·—. W D C >1

i C X 1» pL C AC X CO

»HE W -H CO ero W Ai C C Ή

x D w D CL w :C 3 a! CO

Λ W X CO W Ή C CO CO O

•1» D CO >, C ¢0 X C I

CO a X X D W tie 111 | I CO CX A*C V w E cn ·, -: CO 0—1 i C —f 85 D CD — X —ίΟ i

cO ce :co ·Η ¢0 W I O O CO I

^ X '—I E W w CO C- A>! O 1

•h —ID >> X X t-ι I

co c ·η Λ c> e o x co a» i o> o» Ai x co d Ph *c I C CO C X Η A*! —I 3 X W i

I 0) Ή OX O CO C —1 CO D

I x s 1) —I COW CO —( W CO CO

I D D Me C C Ai —I CO CO L» CD

I co X o e h 2 ο» α» ή w c ή

AC ύί W 1» A*! B > x C DC

f CO — D. « fi rl H -I CL' rl j O — CO .Ό r', — C e: c 2 — <3 Ή j ’ ” " J' " " j

i I

!IC I

I 2 w I

[ Ό ΟΙ C CO

I Ή V) i

! C cQ

! ·Η ·'—» j 55 ΰ <1) a· I ÖC £ t C Ή c I e E a» I w c

I CC W X

I D co E

I :D D

I X <—I W

¢0 I— D

I w <0

i At1 Οι C — X

I 1) —I efl

! 3 >> co I

I --1 I

I :D S C I

I co <u <u ! Ή C CO i CO to -H !

I co E

C D

I D CO A*i I Λ β A^ AC Ή rl

D O X I I I

Σ co -. I I I

II

cn

D

w

I cO co D

X ί> D Αέ

CO D w X

> D W D « W 0) AC >

CD CO X X

> DSD CD

CD W X > >

w DO CD

w ac > co w

Ps X > M

10) D Ή Ή 0)

W > D O

CO W CO D

a» e D w

C D CD XI CO

Cu > C D

D O :D X C

0) CO X w c CL D O CO co 0)

Cl W > X W CO

d d a» x c <g

cn A —1 aJ C» X

j 81360 1 Sen lisäksi, että pH määrittää molekyylin varaustilan, se vaikuttaa myöskin liuoksessa olevan molekyylin kemialliseen stabiilisuuteen; riittävän happamat väliaineet ja alhaiset lämpötilat estävät SAM-yhdistettä hajoamasta nopeasti pääasiallisesti yhdisteeksi MTA. Tämä hajoamisprosessi johtuu 5 siitä, että karboksyyliryhmän hiili hyökkää nukleofilisesti ja molekyylin sisäisesti aminohapporyhmän -metyleeniin, jonka lähellä sijaitsevan sulfoniumryhmän polaarisuus on tehnyt erityisen reaktiiviseksi (Zappia V. et ai., "Transmethylation", Usdin E. et ai., toim., Elsevier N.Y., 1979; Zappia V. et ai., "Methods in Enzymology", 94, 73, 1983). Suuremmis- 10 sa pH-arvoissa molekyylin stabiilisuus liuoksessa on alhainen, ja se hajoaa nopeasti eri mekanismeilla. SAM-yhdisteen kiteisinä kiinteinä aineina olevien suolojen stabiilisuutta säätävät kriittisesti läsnäolevan anionin ominaisuudet; erityisesti ollaan todettu, että tämän anionin kasvava eteerinen estyneisyys lisää kiinteänä faasina olevan molekyylin stabiilisuutta.

15 Tässäkin tapauksessa pääasiallinen hajoamismekanismi johtaa MTA-yhdisteen muodostumiseen. Erästä tällaista suolaa, jolla on kaava SAM+.HS0^.H2S0^ .CH^CgH^SO^H (US-patenttijulkaisu no. 3 954 726, myönnetty toukokuun 4. päivänä 1976), käytetään tällä hetkellä farmakologiassa.

20 Nyt ollaan todettu, että SAM-yhdisteen ja anionityyppisten, vesiliukoisten polyelektrolyyttien välisillä suoloilla on sellaiset hyvät ominaisuudet, joiden ansiosta nämä suolat ovat erityisen käyttökelpoisia farmaseuttisissa valmisteissa sekä preparatiivisissa sovellutuksissa.

25 SAM-yhdisteen varaustila arvoltaan korkeintaan 3,5 olevissa pH-olosuhteissa on todellakin sellainen, että se mahdollistaa tämän molekyylin ja anioni-cyyppisissä, vesiliukoisissa polyelektrolyyteissä olevien, negatiivisesti varautuneiden kohtien välisen stabiilin, spesifisen yhteisvaikutuksen.

30 Tämän yhteisvaikutuksen tuloksena muodostuu liukenemattomia suoloja, joiden stökiometria riippuu lukuisista tekijöistä, kuten esimerkiksi (a) reagoivien komponenttien välisestä suhteesta; (b) reaktion väliaineen pH-arvosta ja luonteesta; (c) polyanionin kemiallisesta luonteesta. Useimmissa tutkituissa tapauksissa saostuneiden suolojen stökiometriset suhteet, jotka mää- 35 ritellään suhteena moolia SAM-yhdistettä/grammaekvivalenttia polymeeriä, ovat alueella 0,5-0,1.

8 81 360 1 Erityisen edullinen suhde saadun suolan stabiilisuutta ja valmistuksessa esiintyviä seikkoja ajatellen on 1:3 moolia SAM-yhdistettM: polyanionin ekvivalenttia. Toisaalta myöskin tästä suhteesta poikkeavat, eli edellä mainitulla alueella 0,1-0,5 olevat stökiometriset suhteet, moolia yhdis-5 tettä SAM/polymeerin ekvivalenttimäärä, ovat käyttökelpoisia saostamispro-sessissa, ja näihin suhteisiin voidaan päästä käyttämällä polyanionin liian suuria tai pieniä määriä SAK-yhdisteeseen verrattuna.

Suoloissa, joissa stökiometrinen suhde on alle 0,3, saostuman sähköinen 10 neutraalisuus saavutetaan reaktion väliaineessa olevilla kationeilla, jotka toimivat yhdessä SAMiin kanssa polyanionin vastaioneina, kun taas niiden suolojen, joissa tämä suhde on suurempi, tapauksessa väliaineessa olevat anionit neutraloivat osittain tämän sulfoniyhdisteen positiiviset varaukset .

15

Yleisesti ottaen heikkojen ja vahvojen polyhappojen anionit johtavat SAM-yhdisteen liukenemattomien suolojen muodostumiseen. Vahvasta haposta saatujen polyanionien havainnollistavina esimerkkeinä mainittakoon polymeerit tai kopolymeerit, jotka käsittävät makromolekyylinsa rungossa toistuvia 20 -SO^ -ryhmiä (polyetyleenisulfonaatti, polystyreenisulfonaatti, jne.), -0S0_, -ryhmiä (polyvinyylisulfaatti, polydestraanisulfaatti, jne.), -O-PO^H - ja -O-PO^H -ryhmiä (polyvinyylifosfaatti, jne.), /° -O-P-^ -ryhmiä (polyf osfaatit, metafosfaatit, jne.).

25 ^°'

Heikosta haposta saatujen polyanionien havainnollistavina esimerkkeinä mainittakoon polymeerit tai kopolymeerit, jotka rakenteessaan käsittävät -C00 -ryhmiä (polyakrylaatit, polymetakrylaatit, karboksimetyyliselluloosa, polygalakturonaatit, jne.).

30

Mitä tämän polyanionin molekyylipainoon tulee, tämä parametri ei vaikuta kriittisesti suolan ja SAM-yhdisteen väliseen saostumisprosessiin. Yleisesti ottaen ollaan todettu, että jokainen polyanioni kykenee muodostamaan happamassa väliaineessa liukenemattomia suoloja SAM-yhdisteen kanssa, poly-35 anionin molekyylipainon voidessa vaihdella laajalla alueella, jolloin mole-kyylipainon ylärajaa rajoittaa polyanionin vesiliukoisuus, ja sen alarajana on sellainen polymeroitumisaste, jonka perusteella tätä molekyyliä voidaan

II

9 81360 1 pitää polyelektrolyyttien luokkaan kuuluvana (Doty P. et ai., "Polymeric Electrolytes", Ann. Rev. Phys. Chem. 3, 81, 1952).

SAM-yhdisteen ja polyanionien välisten liukenemattomien suolojen muodostu-5 mismekanismi voidaan pelkistää kahdeksi prosessiksi, polyelektrolyyttien fysikokemialiisten ominaisuuksien tämänhetkisen tietämyksen perusteella. Ensimmäinen prosessi käsittää SAM-yhdisteen - siinä olevien positiivisesti varautuneiden kohtien välityksellä - ja poiyanionin yhden molekyylin välisen stabiilin vuorovaikutuksen, poiyanionin negatiivisten varausten toimi-10 essa useiden polymeeriketjujen neutraloituina osina, mikä johtaa suolan saostumiseen. Toisessa saostusprosessin mekanismissa on kyseessä yhden ja saman SAM-molekyylin sekä poiyanionin eri molekyyleissä olevien varautuneiden kohtien välinen samanaikainen vuorovaikutus, jolloin varausten neutraloituminen ja molekyylien välisten ristisidosten muodostuminen tapahtuvat 15 samanaikaisesti, mitkä kaksi tekijää johtavat suolan saostumiseen. Näiden kahden eri tyyppisen, SAM-yhdisteen ja poiyanionin keskinäisen vaikutuksen suhteellinen merkitys liukenemattoman suolan muodostumiseen riippuu saos-tusolosuhteista sekä poiyanionin luonteesta.

20 Huomattakoon, että nämä molemmat prosessit käsittävät SAM-yhdisteen eri varautuneiden kohtien, ja topologisesti makroionin pinnalle määräytyneiden negatiivisten varausten välisen samanaikaisen, stabiilin vuorovaikutuksen.

Niissä tapauksissa, joissa suhde "moolia SAM-yhdistettä/polyanionin ekviva-25 lenttimäärä” on 1:3, tämän keksinnön mukaiset suolat voidaan esittää kaavana CSAM% f X-j; R* 35 10 81 360 1 missä ryhmä | ^ i voi tarkoittaa kaavan -f·o —

R- T i-T

5 mukaista ryhmää (poly- ja metafosfaatit), tai X voi tarkoittaa kaavan mukaista ryhmää, ja R yhtä seuraavista ryhmistä: 10 'y~S°* · -s03~» -oso3-, -opo3h-, coo".

Polymeerisen yhdisteen molekyylipaino, ja näin ollen luvun n arvo, ei ole kriittinen, kuten edellä esitetään, paitsi siinä suhteessa, että polyanio-15 nin tulee olla veteen liukenevaa ja sen tulee kuulua polyelektrolyyttien luokkaan.

Alla olevassa kaavassa esitetään selvyyden vuoksi SAM-yhdisteen täydellinen kaava, jonka SAM-yhdisteen kationisten kohtien ja ryhmien 20 —X--

i i J

R- välillä on vuorovaikutusta, kuten edellä esitetään, jotka ryhmät voivat olla joko yhden ainoan polymeeriketjun osa, tai ne voivat kuulua tTiilisiin 25 moiekyyleihin, kuten edellä on esitetty.

fr4 #?_ +/»M, 30 '

J-L CHpS-CMfCMrCH

35 fj-f

II

n 81360 1 Tämän keksinnön mukaiset suolat ovat erityisen stabiileja jopa huoneenkin lämpötilaa olennaisesti suuremmissa lämpötiloissa; näiden suolojen lämpö-stabiilisuuden analysoiminen ajan suhteen on osoittanut näiden yhdisteiden ajallisesti rajoittamattoman stabiilisuuden, kun niitä säilytetään kiinte-5 änä faasina A5°C:n lämpötilassa. Kuitenkin 75°C:n lämpötilassa erilaisten valmistettujen suolojen on todettu käyttäytyvän toisistaan poikkeavilla tavoilla. Joka tapauksessa SAM-yhdisteen ja polyanionien välisten suolojen stabiilisuus 75°C:n lämpötilassa on yleisesti ottaen paljon suurempi kuin kaikkien muiden tähän mennessä tutkittujen suolojen stabiilisuus, joiden 10 suolojen puoliintumisajat ovat parhaimmillaankin alle 2A tuntia, verrattuna SAM-yhdisteen ja polyanioneiden välisten erilaisten suolojen 10/^0-ker-taa korkeampiin arvoihin.

SAM-yhdisteen ja polyanionien väliset suolat muuttuvat liukoisiksi vesifaa-15 sissa pH-arvon noustessa arvon A yläpuolelle, ja liukoiseksi muuttumisen nopeus riippuu tällöin polymeerin kemiallisesta luonteesta, kiinteän suolan stökiometriasta ja fysikaalisista ominaisuuksista, sekä väliaineen ioni-vahvuudesta. Tähän liukenemistapahtumaan ei liity pH-arvon muuttumista edes silloin, kun liukeneminen tapahtuu huonosti purkuroidussa väliaineessa, 20 mikä johtuu näiden suolojen luontaisen alhaisesta happamuudesta.

Yleisesti ottaen, SAM-yhdisteen ja polyanioneiden väliset lyofilisoidut suolat eivät ole osoittautuneet hygroskooppisiksi, ja ne ovat tällöin väriltään valkoista kiinteätä materiaalia, jolla on kiderakenne.

25

Neutraalien molekyylien suuretkaan pitoisuudet tai luonteeltaan ionisten molekyylien läsnäolo eivät vaikuta SAM-yhdisteen saostumiseen happamissa vesiliuoksissa (pH mieluiten alueella 2,0-3,5). Lisäksi tämä saostuminen on erittäin spesifistä siinä suhteessa, että MTA:n, joka on tämän sulfo-30 niumyhdisteen eräs pääasiallinen hajoamistuote, läsnäollessakin saostuu selektiivisesti SAM-yhdistettä. SAM-yhdisteen ja polyanionien väliset suolat voidaan saostaa sellaisistakin liuoksista, jotka ovat erittäin laimeita sulfoniumyhdisteen suhteen (alle 0,001 M), mutta kuitenkin tiheästi pakkaantuneita saostumia, jotka saadaan helposti otetuksi talteen pelkästään 35 laskeuttamalla, saadaan käyttämällä liuoksia, joissa pitoisuus vaihtelee alueella 0,002-0,2 M. Toivottaessa näiden liukenemattomien suolojen saantoa voidaan parantaa lisäämällä tähän vesifaasiin korkeintaan yhtä suuri 12 81 360 1 tilavuus vesiliukoista orgaanista liuotinta, kuten esimerkiksi metanolia, etanolia, n-butanolia, asetonia, metyyliketonia. SAM-yhdisteen saostuminen, ja tämän jälkeen sen stabiloituminen kiinteäksi suolaksi on yleisesti optimaalista, kun polyanionia käytetään 3 ekvivalenttia liuoksessa olevan SAM-5 yhdisteen moolia kohden. Kun käytetään erilaisia, suurempia tai pienempiä stökiometrisiä suhteita, niin saostuneen suolan tunnusomaisena piirteenä on tällöin se, että siinä on läsnä muita, väliaineesta peräisin olevia vas-taioneja. Nämä vastaionit ovat kationeja, mikäli SAM-yhdisteen ja polyanio-nin välinen stökiometrinen suhde on alle 0,33, ja nämä vastaionit ovat ani-10 oneja, mikäli tämä suhde on suurempi kuin esitetty arvo. SAM-yhdisteen ja polyanionien välisten suolojen seostaminen voidaan toteuttaa lisäämällä voimakkaasti sekoittaen polyanionin vesiliuos SAM-yhdisteen liuokseen, tai päinvastoin. Saostuma muodostuu nopeasti huoneen lämpötilassa, vaikka 4°C:n lämpötilaan jäähdyttäminen voikin joissain olosuhteissa parantaa saostuman 15 saantoa. Polyanionin kemiallisen luonteen mukaisesti saostuma muodostuu koostumukseltaan erilaisina geeleinä, jotka tarttuvat nopeasti astian seinämiin, tai saostuma muodostuu suurikokoisia partikkeleja käsittävänä, tiukkaan pakkautuneena materiaalina, joka useimmissa tapauksissa mahdollistaa nesteen poistamisen yksinkertaisesti dekantoimalla.

20

Sen jälkeen, kun saostuma on pesty vedellä tai toivottaessa orgaanisilla liuottimilla, tämä saostunut suola voidaan kuivata haihduttamalla vakuumis-sa lämmön avulla (suositeltavin lämpötila on 50°C), tai lyofilisoimalla. Tämän kiintoaineen jauhaminen tuottaa kiteisiä jauheita, joita voidaan 25 käyttää aktiivisina komponentteina farmaseuttisissa valmisteissa.

Tämän yleisen menetelmän muunnoksessa, jota käytetään niissä tapauksissa, joissa SAM-yhdiste seostetaan muunkinlaisia molekyylejä sisältävistä liuoksista, esimerkiksi hiivauutteista, joihin on rikastunut SAM-yhdLstettä, 30 saostuma tehdään liukoiseksi pH-arvossa 5 käyttämällä riittävästi vettä tai puskuriliuosta. Tällä tavoin saostuman sisään jääneet vieraat molekyylila-jit laimenevat koko nestetilavuuteen. Tämän jälkeen SAM-yhdisteen ja polyanionien välinen suola muodostetaan uudestaan alentamalla liuoksen pH-arvo alueelle 2-3.

35 Tässä keksinnössä kuvatut menetelmät ovat yksinkertaisia ja kustannuksiltaan alhaisia, joten niiden perusteella voidaan kehittää teolliseen mittaan li 13 81 360 1 soveltuvia valmistusmenetelmiä.

Jäljempänä esitettävät esimerkit havainnollistavat SAM-yhdisteen ja poly-anionien välisten erilaisten suolojen valmistamista. On selvää, että näis-5 sä esimerkeissä kuvataan ainoastaan muutama niistä lukuisista mahdollisista suoritusmuodoista, jotka tästä kuvauksesta ilmenevät, ja näiden esimerkkien tarkoituksena on havainnollistaa tämän keksinnön tavoitteita, keksintöä kuitenkaan rajoittamatta. Mäissä esimerkeissä käsitellään seostamista pitoisuuksiltaan erilaisia SAM-yhdisteen liuoksia käyttäen, vaikka tätä 10 saostamismenetelmää voidaankin myös soveltaa suoraan sellaisiin hiivauut-teisiin, joihin on rikastunyt SAM-yhdistettä.

Esimerkki 1 15 10 litraan 40 mM SAM-sulfaattiliuosta, jonka pH on asetettu arvoon 2,2 rikkihapolla H^SO^ , lisätään huoneen lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 2 litraa poly-para-styreenin sulfonihapon (molekyylipaino 7x10 ) 0,6 N liuosta, jonka pH oli asetettu arvoon 2 (polyhapon ekvivalenttlpaino on 184). Tällöin muodostuu välittömästi maitomainen emulsio, joka koaguloituu 20 muutamassa minuutissa kumimaiseksi massaksi.

Neste poistetaan yksinkertaisesti dekantoimalla, ja saostuma pestään kahdesti 10 litralla tislattua vettä, tätä seosta koko ajan voimakkaasti sekoittaen. Sen jälkeen, kun pesuun käytetty vesi on poistettu dekantoimai-25 la, saostuma kuivataan vakuumissa, jolloin saadaan 342 g valkoista, kiteistä tuotetta, joka ei ole hygroskooppista, ja joka jauhetaan hienoksi. Täten saatu tuote on veteen liukenematonta alle 4 olevissa pH-arvoissa, kun taas tuotteen liukoisuus kasvaa pH-alueella 4-7. Vesiliuoksissa, jonka pH on 4, olevan suolan UV-spektrissä on maksimi aallonpituudella 258 nm, joka on 30 myöskin SAM-yhdisteen maksimikohta. Adeniinikromoforin molaarisen ekstink-ciokertoimen korkeat arvot, sekä tämän kromoforin asettuminen spektrissä päällekkäin polyanionin bentseenikromoforin kanssa estävät sen, ettei suolan tätä rakenteellista komponenttia saada esiin UV-spektrissä.

35 Eluoimiseen käytetyssä puskurissa liuoksena olevan, SAM-yhdisteen ja poly-parastyreenisulfonaatin välisen suolan HPLC-analyysissä (Zappia V. et ai., "Methods in Enzymology", 94, 57, 1983) /kationinen, 25 cm x 4,6 mm (sisä- 14 81360 1 halkaisija) suuruinen ULTRASI!, CX-kolonni, ammoniumformiaatin muodostama eluentti, 0,5 M, pH 4, virtausnopeus 1 ml/min/, saadaan kromatografinen piikki, jonka retentioaika, 6,6 minuuttia, on sama kuin SAM-yhdisteen piikillä, ja tämän suolan tuottaman piikin integroinnilla voidaan todeta, 5 että sulfoniumvhdiste muodostaa noin 40 % saostuneen suolan kuivapainosta. SAM-vhdisteen ja polyparastyreenisulfonaatin välisen suolan ^H-KiR-spekt-roskopia (2H2O; pH 7,0) osoittaa, integrointisuhteen ollessa asianmukainen, vastaavasti SAM-yhdisteen signaalit, jotka ovat keskittyneet kohtiin «5 8,2; 6,0; 4,5; 3,9; 3,5; 2,7; ja 2,3, sekä polyaniouin suurentuneet signaa-10 lit’ jotka vastaavasti ovat keskittyneet kohtiin £7,5; 6,5; ja 1,5.

Polyanionista ja SAK-yhdisteestä saatujen, toisistaan parhaiten erottuneiden signaalien integraalien välisen suhteen arvin mahdollistaa sen, että suhteen "moolia SAM-yhdistettä/polyparastvreenisulfonaatin ekvivalenttimää-15 rä" arvoksi voidaan todeta noin 0,3.

Suola liukenee hitaasti pH-alueella 4-5, ja se muuttuu nopeasti liukoiseksi pH-arvossa 7,0.

20 Polyparastvreenisulfonaatin kanssa muodostuneen suolan muodossa olevan SAM-yhdisteen 0,1 moolin liuottaminen 1 litraan fosfaattipuskuria, pH 7, 0,01 M, ei saa aikaan merkittävää pH-arvon muuttumista, mikä osoittaa, että saostuneen suolan jäännöshappamuus on merkityksetön.

25 Tämän suolan stabiilisuus 45°C:n lämpötilassa on ajallisesti rajoittumaton-ta, kun taas 75°C:n lämpötilassa sen puoliintumisaika on yhtä kuukautta pidempi .

Esimerkki 2 30 1 litraan 20 mM SAM-sulfaattia, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 rikkihapolla ^2^4’ lisätään ympäristön lämpötilassa, liuosta voimakkaasti sekoittaen, 500 ml 0,12 N natriumpolyparastyreenisulfonaatin, molekyylipaino c 5 x 10 , liuos, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 (suolan ekvivalenttipaino 35 on 206). Saostumlsreaktio tapahtuu esimerkissä 1 esitecysti. Tuotteen pesu ja lyofilisointi johtaa 16,5 grammaan valkoista, ei-hygroskooppista kiteistä kiinteätä materiaalia, jonka spektroskooppiset, analyyttiset ja stabiili 15 81 360 1 lisuusominaisuudet ovat samankaltaisia esimerkin 1 mukaisen tuotteen vastaavien ominaisuuksien kanssa, paitsi että liukenemisaikojen yli 4 olevissa ρΗ-arvoissa todettiin kasvavan.

5 Esimerkki 3 10 litraan 0,1 N NaClO^-liuosta, joka sisältää 0,3 mol SAM-perkloraattia, ja jonka pH on asetettu arvoon 2 HCiO^-liuoksella, lisätään huoneen lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 2 litraa 0,45 N polyparastyreeni-natrium-10 sulfonaatin, mp. 6 x 10^, liuosta, jonka pH on asetettu arvoon 2 (suolan ekvivalenttipaino, 206). Saostumisreaktio etenee esimerkissä 1 kuvatun kaltaisesti. Pesulla ja lyofilisoimalla saadaan 271 grammaa valkoista, ei-hygroskooppista, kiteistä kiinteätä materiaalia, jonka spektroskooppiset ja analyyttiset ominaisuudet, sekä liukoisuusominaisuudet ovat samankaltai-15 set esimerkin 1 mukaisen tuotteen vastaavien ominaisuuksien kanssa, ainoan eroavaisuuden muodostuessa hitaammasta liukeriemisnopeudesta yli 4 olevissa pH-oloissa.

Esimerkki 4 20 1 litraan SAM-sulfaattia, 0,1 M, pH asetettu arvoon 2,0 rikkihapolla H7S0^, lisätään huoneen lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 0,5 litraa natrium- 3 polyvinyylisulfonaatin, mp. 2 x 10 , 0,6 N liuosta, jonka pH on asetettu arvoon 2 (suolan ekvivalenttipaino, 130).

25 Tällöin muodostuu maitomainen emulsio, ja tämä emulsio pyrkii koaguloitu-maan reaktioastian seinämille, jolloin muodostuu kirkasta, hyvin viskoosia geeliä. Lämpötilan alentaminen 4°C:een jouduttaa tätä prosessia, mikä mahdollistaa nesteiden poistamisen dekantoimalla.

30

Tuote pestään ja lyofilisoidaan, jolloin esimerkissä 1 esitetysti saadaan valkoista, ei-hygroskooppista, kiteistä kiinteätä materiaalia. Saanto: 61,6 g.

35 Tuote muuttuu nopeasti liukoiseksi yli 4 olevissa ρΗ-arvoissa. Vesiliuoksena, jonka pH on 6, olevan suolan UV-spektri on identtinen SAM-yhdisteen UV-spektrin kanssa, joissa spektreissä maksimi saavutetaan aallonpituudel- i6 81 360 1 la 258 nm.

Tämän suolan HPLC-analyysissa, joka toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, nähdään yksi ainoa UV-absorption piikki, jonka retentioaika on 5 sama kuin SAM-yhdisteen tuottaman piikin, joiden piikkien integroinnin avulla voidaan todeta, että sulfoniumyhdiste vastaa noin 55 prosenttia saostuneen suolan kuivapainosta.

SAM-yhdisteen suolan NMR-spektroskopia (^H^O; pH 5,4) osoittaa, integroin-10 tisuhteen ollessa asianmukainen, että kohtiin h 8,5; 8,4; 6,2; 4,6; 4,0; 3,6; 3,0; ja 2,4 keskittyneiden SAM-vhdisteiden siganaalien lähellä on suurentuneita, kohtiin £ 2,0 ja 3,5 keskittyneitä signaaleja, jotka johtuvat polyanionin alifaattisesta ketjusta. Kun näiden jälkimmäisten vetyjen integraaleja verrataan SAM-yhdisteen hyvin erottuneiden protonien integraa-15 leihin, niin voidaan todeta, että suhteen "moolia SAM-yhdistettä/polyanio-nin ekvivalenttimäärä" arvo suolassa on noin 0,3. Suolan jäännöshappamuus on esimerkissä 1 todetusti merkityksetön, kiinteän suolan stabiilisuus 45°C:n lämpötilassa on ajallisesti rajoittumaton, kun taas suolan puoliintumisaika 75°C:n lämpötilassa on yhtä kuukautta pidempi.

20

Esimerkki 5 5 litraan 30 mM SAM-sulfaattia, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 rikkihapolla H SO , lisätään huoneen lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 3 litraa 1 4 5 25 0,15 N natriumpolyvinyylifosfaatin, mp. noin 1 x 10 , liuosta, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 (suolan ekvivalenttipaino, 168). Liuoksessa tapahtuu hidasta flokkuoiritia, jota voidaan nopeuttaa jäähdyttämällä liuos 4°C:n lämpötilaan. 2 tunnin kuluessa muodostuu riittävän tiiviisti pakkautunut saostuma, joka voidaan ottaa talteen alhaisella nopeudella toteutetulla 30 sentrifugoir.nilla tai suodattamalla. Kun tuote pestään ja lyofilisoidaan esimerkissä 1 esitetysti, niin saadaan 81 g valkoista, ei-hygroskooppista, kiteistä kiinteätä materiaalia. Tämä tuote muuttuu nopeasti liukoiseksi pH-arvossa 7, ja esimerkin l mukaisesti toteutetussa HPLC-analyysissä todetaan yksi ainoa UV-absorption piikki, jonka retentioaika on sama kuin 35 SAM-yhdisteen tuottamalla piikillä, joiden piikkien integroinnin avulla voidaan todeta, että sulfoniumyhdiste muodostaa noin 60 % saostuneen suolan kuivapainosta. Vesiliuoksena, jonka pH on 6, olevan suolan IV-spektri n 17 81 360 1 on identtinen SAM-yhdisteen UV-spektrin kanssa.

NMR-spektri on esimerkissä 4 esitetyn kaltainen, lukuunottamatta polymee-rirungon metyyleenin ja metiinin kemiallisen siirtymän arvoja, jotka tässä 5 tapauksessa ovat kohtiin <5 2,0 ja 4,6 keskittyneiden, suurentuneiden signaalien muodossa. Verrattaessa sulfoniumyhdisteen ja polyanionin protonien integraaleja toisiinsa voidaan todeta, että suhteen "moolia SAM-yhdistettä/ polyanionin ekvivalenttimäärä" arvo on noin 0,5.

10 Suolan jäännöshappamuus on esimerkissä 1 esitetystä merkityksetön, kiinteän suolan stabiilisuus 45°C:n lämpötilassa on ajallisesti rajoittumatonta, kun taas suolan puoliintumisajan 75°C:n lämpötilassa voidaan todeta olevan yli 10 vuorokautta.

15 Esimerkki 6 10 litraan 0,01 M SAM-sulfaattia, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 rikkihapolla H^SO^, lisätään 4°C:n lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 2 litraa 0,15 N natriumheksaraetafosfaatin liuosta, jonka pH oli asetettu arvoon 2,5 20 (natriumheksametafosfaatin ekvivalenttipaino, 102). Valkoisen emulsion ha vaitaan muodostuvan nopeasti, ja 2^4 tunnin kuluessa emulsio koaguloituu läpikuultavaksi, hyvin viskoosiksi geeliksi, joka tarttuu reaktioastian seinämiin, jolloin nesteet voidaan poistaa dekantoimalla. Tuotteen peseminen ja lyofllisoiminen esimerkissä 1 esitetysti johtaa 53 grammaan valkois-25 ta, ei- hygroskooppista, kiinteätä materiaalia. Tämä tuote muutuu nopeasti liukoiseksi pH-arvossa 7, esimerkin 1 mukaisesti toteutetussa HPLC-analyy-sissä saadaan yksi ainoa UV-absorpion piikki, jonka retentioaika on sama kuin SAM-yhdisteellä saadun piikin, ja näiden piikkien integroimisen avulla voidaan todeta, että sulfoniumyhdiste muodostaa noin 63 % saostuneen suolan 30 kuivapainosta. Vesiliuoksena, jonka pH on 6, olevan suolan UV- ja NMR-spektrit ovat identtiset SAM-yhdisteen vastaavien spektrien kanssa.

Suolassa olevan fosfaatin määrän määrittäminen, toteutettuna kiteisen tuotteen hydrolysoidulla hapolla, vahvistaa stökiometrisen suhteen arvoksi 35 1:3, joka suhde määritellään "moolia SAM-yhdistettä/heksametafosfaatin ek- vivalenttimäärä".

J8 81 360 1 Suolan jäännöshappamuus on esimerkissä 1 esitetyn mukaisesti merkityksetöntä, kiinteän suolan stabiilisuus 45°C:n lämpötilassa on ajallisesti ra-joittumatonta, kun taas suolan puoliintumisajan voidaan todeta olevan noin 10 vuorokautta 73°0:n lämpötilassa.

5

Esimerkki 7 5 litraan 0,02 M SAM-sulfaattia, jonka pH on asetettu arvoon 2,5 rikkihapolla, lisätään 4°C:n lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 0,5 10,6 N po-jO lyfosforihapon (ekvivaleuttipaino 80; ?2θ^:η kokonaispitoisuus 89 %) liuosta, joka on valmistettu liuottamalla 100 grammaan fosforihappoa 154 g yhdistettä Pf>0 , ja lämmittämällä liuosta tämän jälkeen 100°C:n lämpötilassa 24 tuntia. Tämän jälkeen polyfosforihappo liuotetaan 4°C:n lämpötilassa veteen, pH--arvo asetetaan nopeasti arvoon 2,5 NaOH:lla.

15

Reaktio etonee esimerkissä 6 esitetyn kaltaisesti. Saanto: 54 g suolaa.

Kiinteän suolan stabiilisuus sekä spektroskooppiset ja analyyttiset ominaisuudet ovat esimerkissä 6 esitetyn mukaiset.

20

Esimerkki 8

10 litraan 0,1 M SAM-sulfaattia, pH asetettu arvoon 2,5 rikkihappoa lisäämällä, lisätään 4°C:n lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen 2 litraa 1,5 N

3 25 polvfosforihapon, mp. noin 2 x 10 (ekvivalenttipaino 80), liuosta, pH 2,5. Reaktio etenee esimerkissä 6 esitetyllä tavalla. Saanto: 518 g suolaa.

Kiinteän suolan stabiilisuus sekä sen spektroskooppiset ja analyyttiset tunnusomaiset piirteet ovat esimerkissä 6 esitetyn mukaiset.

30

Esimerkki J9

II

19 81360 1 poistaa dekantoimalla.

Peseminen ja lyofilisointi toteutetaan esimerkissä ] esitetysti, ja ne tuottavat 102 g valkoista, ei-hygroskooppista, kiteistä suolaa. Tuote muut-5 tuu nopeasti liukoiseksi pH-arvossa 6, ja esimerkissä 1 esitetyllä tavalla toteutetussa HPLC-analyysissä saadaan UV-absorption piikki, jonka retentio-aika on sama kuin SAM-yhdisteellä saadulla piikillä, ja näiden piikkien integroimisella voidaan todeta, että sulfoniumyhdiste muodostaa noin 60 % saostuneen suolan kuivapainosta. Vesiliuoksessa, jonka pH on 6, olevan suc-10 iän UV-spektri on identtinen SAM-yhdisteen UV-spektrin kanssa.

NMR-spektn on samankaltainen esimerkissä 4 esitetyn spektrin kanssa, lukuunottamatta polymeerinrungossa olevan metvleenin ja metiinin kemiallisen siirtymän arvoja, jotka tässä tapauksessa ovat kohtiin 1,8 ja 2,2 kes-15 kittyneiden, suurentuneiden signaalien muodossa. Verrattaessa sulfoniumyh-disteen ja polyanionin protonien integraaleja toisiinsa voidaan todeta, että suhteen "moolia SAM-yhdistettä/polyanionin ekvivalenttimäärä" arvo on noin 1:3. Jäännöshappamuus on esimerkin 1 mukaisesti merkityksetöntä, kiinteän suolan stabiilisuus 45°C:n lämpötilassa on ajallisesti rajoittumaton, 20 kun taas kiinteän suolan puoliintumisajan voidaan todeta olevan noin 20 tuntia 75UC:n lämpötilassa.

Esimerkki 10 25 Lämpöstabiiliteetti 75°C:n lämpötilassa kiinteässä faasissa

Suolan lämpöstabiilisuus 75°C:n lämpötilassa kiinteänä faasina Esimerkeissä 1,3,4,5,6,7 ja 9 valmistettujen suolojen lämpöstabiilisuutta kiinteänä faasina 75°C:n lämpötilassa on verrattu SAK-kloridin ja kaavan 30 SAM .HSO. ,H„S0..2CH„C,H.S0_H mukaisen kaksoissuolan lämpöstabiilisuuteen. 4243643

Liitteenä olevan piirrustuksen kuvassa esitettyjen tulosten, SAM-yhdisteen prosenttinen hajoaminen ajan funktiona, perusteella voidaan todeta, että tämän keksinnön mukaisten suolojen suurempi stabiilisuus on ilmeistä.

35 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen SAM-suolojen toksisuus on sama kuin itse sulfoniumyhdlsteellä, joka sisältää vastaioneinaan muita kuin polyelektrolvyttien tyyppisiä ioneja.

20 8 1 3 60 1 Tämän keksinnön mukaisten suolojen farmakokineettiSten ominaisuuksien ja 14 biologisen saatavuuden arvioimiseksi S-adenosyyli-L-(met- C)-mei:ioniinin ja poiyparastyreenisulfonaatin, polyfosfaatin ja sulfaatin (vertailuyhdis- 1 4 te) väliset suolat valmistettiin säestämällä S-adenosyyli-L-(Met- C)me-5 tioniinin liuos, jonka ominaisradioaktiivisuus on 2 ^iCi/mol, edellä kuvattujen polyanioneiden liuoksilla.

Urospuolisia Wisrar-rottia, jotka oli jaettu 5 eläimen ryhmiin, käsiteltiin vatsalaukkuun johtavan putken avulla tällä aktiivisella aineella määränä 10 10 mg/kg (10 jiCi 1 tä vastaava määrä), ja eläimet tapettiin lääkeaineen antamisesta lukien eripituisten aikojen jälkeen (2,8,.4 ja 48 tuntia).

Virtsa- ja ulostenäytteitä otettiin ainoastaan 24. ja 48. tuimin kuluttua, kun taas verinäytteitä otettiin myöskin 30. tunnin kuluttua häntälaskimos-15 ta. Maksa, munuaiset, ohut- ja paksusuoli, vatsan ja suolten sisältö, virtsaa, ulostetta ja plasmaa otettiin talteen ja niiden radioaktiivisuus määritettiin laskemalla, yksikössä dpm/g tai dpm/ml.

Saadut tulokset osoittavat selvästi, että tämän keksinnön mukaiset suolat 20 absorboituvat tehokkaasti siten, että yli 60 % annetussa annoksessa läsnäolevasta radioaktiivisuudesta absorboituu ja metaboloituu 24 tunnissa.

Poiyparastyreenisulfonaatin ja polyfosfaatln suolat, jotka ovat liukenemattomia happamassa väliaineessa, eivät absorboidu vatsalaukun tasolla, jossa 25 viiveaika on alle 2 tuntia, ja lyhyempi kuin SAM-sulfaatilla.

SAM-yhdisteen ja polyanionien väliset stabiilit suolat muuttuvat liukoiseksi suolistossa, ja ohutsuolessa, missä absorptioproseesi alkaa. Yleisesti ottaen poiyparastyreenisulfonaatin ja polyfosfaatin kanssa muodostuneen 30 suolan muodossa olevaan aktiiviseen aineeseen liittyvän radioaktiivisuuden absorboituminen on verrannollinen SAM-sulfaatin absorboitumiseen. Näin ollen SAM-yhdisteen ja polyanionien välisiä uusia suoloja voidaan käyttää vaivatta suun kautta annettavissa tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavissa farmaseuttisissa valmisteissa.

Johtuen SAM-yhdisteen ja polyanionien välisten suolojen huonosta liukoisuudesta happamassa väliaineessa, ne käyttäytyvät suun kautta annettavissa 35

II

2i 81360 1 valmisteissa käytettyinä sellaisten farmakologisten aineosien tavoin, jotka aineosat on suojattu vatsan vaikutuksia vastaan, ja jotka absorboituvat pääasiallisesti suolistossa. Käytettäessä biologisesti hajoamattomia makromolekyylejä, kuten polystyreenisulfonaatteja, polyvinvylxsulfonaatteja, 5 polyvinyylifosfaatteja, jne., edullisimmat polyanionit ovat tällöin mole-kyylipainoltaan niin suuria, etteivät ne absorboidu suolistossa, jolloin ne poistuvat tehokkaasti ulosteessa jätemateriaalina.

Suonen sisäisesti annettavissa valmisteissa edullisimpia SAK-yhdisteen ja 10 polyanioneiden välisiä suoloja ovat sellaisten polvanioneiden kanssa muodostuneet suolat, joissa polyanioni hajoaa nopeasti biologisesti "in vivo" myrkyttömiksi molekyyleiksi, kuten esimerkiksi tapahtuu polyfosfaattien tapauksessa, jotka polyfosfaatit hajoavat tehokkaasti epäorgaaniseksi fosfaatiksi organismissa läsnäolevien pyrofosfataasientsyymien avulla. SAM-15 yhdisteen ja heksametafosfaatin välinen suola on havainnollistava esimerkki sellaisesta yhdisteestä, jota voidaan käyttää tehokkaasti ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavissa valmisteissa sen jälkeen, kun se on tehty liukoiseksi sopivassa, molaarisuudeltaan alhaisessa puskurissa.

20 Seuraavassa luetellaan esimerkkejä sellaisista farmaseuttisista valmisteista, jotka sisältävät aktiivisina aineosinaan tämän keksinnön mukaisia suoloja: - tabletit tai kapselit, jotka sisältävät 20-200 mg aktiivista komponent-25 tia, sulfoniumyhdisteeksi laskettuna, yhdessä sopivien täyteaineiden, kuten tärkkelyksen, magnesiumstearaatin, laktoosin tai talkin kanssa.

- lyofilisoidut ampullit suonen tai lihaksen sisäisiä injektointeja varten, jotka ampullit sisältävät 20-500 mg aktiivista komponenttia, sulfonium- 30 yhdisteeksi laskettuna, jota käytetään yhdessä sopivien steriilien tai pyrogeenittomien liuottimien kanssa, jotka liuottimet voivat sisältää kipulääkkeitä, puskuroivia aineita, jne.

- peräpuikot, jotka sisältävät 50-500 mg aktiivista komponenttia, sulfo-35 niumyhdisteeksi laskettuna, käytettynä yhdessä peräsuolen kautta annettavissa valmisteissa tavallisesti käytettyjen täyteaineiden kanssa.

22 81360 1 Tämän keksinnön mukaisia valmisteita voidaan antaa kaikkien, SAM-yhdisteel-le tyypillisten oireiden tapauksessa, 1-2 kertaa vuorokaudessa ruuansulatuskanavan uikopuolisesti annettaessa, ja 2-4 kertaa vuorokaudessa suun kautta annettaessa, kulloinkin diagnoosin, potilaan kunnon ja painon mukai-5 sesti.

10 15 20 25 30 35

Claims (11)

1. 23 81360 Ί Patenttivaatimukset
2. 1. Menetelmä lääkeaineina käyttökelpoisten S-adenosyyli-L-metioniinin (SAM) ja vesiliukoisten pölyänioneiden välisten suolojen valmistamiseksi, 5 jotka sisältävät polymeerirakentoessaan vahvan ja heikon hapon tyvppisiä funktionaalisia ryhmiä, tunnettu siitä, että tämä menetelmä käsittää vaiheet, joissa: (a) SAM-yhdisteen liuos, jonka pH on hapan, sekoitetaan polyanionin liuokseen, jolla on sama pH-arvo, ja tätä seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa, (b) täten muodostunut saostinaa otetaan 10 talteen dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla, talteenotettu saostuma pestään vedellä, jonka jälkeen se kuivataan vukuumissa haihduttamalla tai 1 yof il isoimalla.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 vaihe (a) toteutetaan SAM-yhdisteellä, joka on saostettu sellaisista hiiva- soluista saadusta uutteesta, joihin hiivasoluihin on rikastunut tätä sul-foniumyhdistettä.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 20 ennen kuivaamista muodostunut saostuma liuotetaan ensin riittävään määrään vettä, jonka pH on 4-5, jonka jälkeen suola seostetaan uudestaan alentamalla tämän liuoksen pH-arvoa.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että 25 vaihe (a) suoritetaan 4°C:n lämpötilassa.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) toteutetun saostamisen lopussa vesifaasiin lisätään korkeintaan samansuuruinen tilavuus orgaanista, veteen sekoittuvaa liuotinta. 30
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (b) saostuma pestään jauhamalla sitä orgaanisissa liuottimissa.
8. 7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että vesiliukoiset polyanionit valitaan ryhmästä, joka käsittää polyfos- faatit, metafosfaatit, polystyreenisulfonaatit, polyvinyylisulfonaatit, polyvinyylisulfaatit, polyvinyylifosfaatit, ja polyakrylaatit. 24 81360
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyanionit ovat polyfosfaatteja.
10. 0. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu sLitä, että 5 polyanionit ovat metafosfaatteja.
11. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen tunnettu siitä, että poly-anionit ovat para-polystyreenisul tomaatteja , 10 15 20 25 30 II 35 25 8 1 3 6 0