DK160430B - Stabile salte af s-adenosyl-l-methionin med polyanioniske materialer, fremgangsmaade til fremstilling af disse samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents

Description

i

DK 160430 B

Opfindelsen angår hidtil ukendte stabile salte af S-adenosyl-L-methionin (SAM) med vandopløselige polyanioniske materialer, en fremgangsmåde til opnåelse heraf og farmaceutiske præparater, der indeholder disse hidtil ukendte salte som aktive be-5 standdele.

S-adenosylmethionin, der i det følgende betegnes som SAM og overalt optræder i levende organismer, udøver en række vigtige biokemiske funktioner: (a) den virker som en methylgruppedonor 10 i et stort antal transmethyleringsreaktioner, (b) den er et substrat for en specifik lyase, som omdanner molekylet til me-thylthioadenosin (MTA) og homoserin, (c) den fungerer som ami-nosmørsyredonor for tRNA, (d) den er aminosyrekædedonor i biosyntesen af biotin, (e) den er donor for adenosyldelen, (f) 15 den er promotor for lysin-2,3-aminomutase, threoninsynthetase , pyruvatformiatlyase og N5-methyltetrahydrofolathomocysteinme-thyltransferase, (g) den er inhibitor for H-ribonuclease, me- thylentetrahydrofolinsyrereduktase og ethanolaminphosphatcy-M tidyltrånsferase, (h) den er nødvendig foi^ den bakterielle og 20 leukocyte chemotaxis, (i) den er nødvendig i DNA's prokaryote og eukaryote restriktions- og modifikationssystem. Decar-boxylatproduktet deraf, S-adenosyl-(5')-3-methylthiopropylami-nen (deca-SAM) virker desuden som propylamingruppedonor ved polyamin-biosyntesereaktionerne. Der eksisterer for tiden 25 en omfattende litteratur vedrørende SAM og deca-SAM's mange biologiske roller (Zappia V. et al., "Biomedical and Pharmacological roles of Adenosylmethionine and the Central Nervous System", side 1, Zappia V. et al., Eds., Pergamon Press N.Y., 1979; Paik W.K. et al., "Protein Methylation", Maister A. Ed., 3Q J. Wiley & Sons N.Y., 1980; "Biochemistry of S-

Adenosylmethionine and Related Compounds", Usdin E. et al. Eds., Mac Milian Press L.t.D., 1982). Især fører SAM som me-thyldonor ved transmethyleringer til biosyntesen af en lang række metabolitter til dannelse af f.eks. N-CHg-(creatin, cho-35 lin, N-methylnikotinamid, adrenalin, mange alkaloider, proteiner, nucleinsyrer), S-CH3-(methionin, S-methylmethionin), 0-CH3-(methanephrin, lignin, pectin, phenoler), C-CH3~(C28-ergosterol, thyminribosid, visse antibiotika, proteiner nucleinsyrer, polysaccharider) bindinger. De forskellige forbindel- 2

DK 160430 B

ser og kemiske bindinger, der dannes ved hjælp af de enzymatiske transmethyleringer,viser, at disse sidstnævnte spiller mange fysiologiske roller. Blandt disse skal mindes om afgiftningsfunktionen, som gennemføres ved f.eks. methyleringen af 5 pyridin og derivater heraf, inklusive nikotinsyren og amidet heraf. Methylering kan hyppigt også ændre molekylers fysiologiske egenskaber: lad det være nok at overveje forskellene mellem nor-adrenalin og adrenalin, morfin og codein, etc. (Borchardt R.T., "Enzymatic Basis of Detoxication", vol. II, 10 side 43, Academic Press, 1980). Af særlig interesse var opdagelsen af en række methylerede baser, der forekommer i tRNA. I forbindelse hermed blev der fremsat mange teorier vedrørende reguleringsfunktioner, som muligvis blev udøvet ved methyleringer af polynucleotider (Kersten H. "Biochemistry of 15 S-Adenosylmethionine and Related Compounds", side 357, Usdin E. et al. Eds., Mac Millan Press L.t.D., 1982). Proteinernes methyleringsreaktioner er også af betydning, hvilket har været genstand for adskillige undersøgelser gennemført i de seneste år af W.K. Paik, og coll., Group. Det er et spørgsmål om antal 20 enzymer som methylerer: (a) arginins guanidinrester med dannelse åf e-N-methylarginin, (b) lysin-resternes aminogrupper ved dannelse af e-N-mono- og dimethyllysin, (c) carboxygrup-perne af resterne af dicarboxylaminesyrer til dannelse af methylestere.

25

Methyleringen af proteiners lysinrester vil ud over at have funktionel betydning for proteinerne selv også - som en ikke ubetydelig konsekvens af fænomenet - resultere i dannelsen af N-trimethyllysin. Denne methylerede aminosyre er et mellemop-30 rodukt ved biosyntesen af carnitin. Udover transmethylerings-reaktionerne er den anden metaboliske retning, hvori SAM spiller en grundlæggende rolle, mod biosyntesen af polyaminer. På denne biogenetiske vej, der følger efter enzymatisk decarboxy-lering,virker SAM som donor for propylamingruppen til putres-3g cin og spermidin til dannelse af henholdsvis spermidin og spermin, de primære biologiske polyaminer, der optræder i eukaryoter. (Zappia V. et al., J. Biol. Chem. 7276, 225, 1980)-. Det forholder sig ikke blot således, at biosyntesen af 3

DK 160430 B

polyaminer hænger sammen med transmethyleringsreaktionerne på grund af anvendelsen af et fælles substrat til begge vejene, men også på grund af, at deca-SAM, et decarboxyleringsprodukt af SAM, er en inhibitor for transmethyleringsreaktionerne 5 (Zappia V. et al., J. Biol. Chem. 244, 4499, 1969). De samme forfattere har rapporteret en lignende inhiberende virkning ved hjælp af MTA. Udover reaktionerne, hvor SAM virker som substrat, skal nævnes visse reguleringsfunktioner, der udøves af sulfoniumforbindelsen. Tænk f.eks. på den reguleringsrolle 10 som SAM spiller ved methyleringen af homocystein til methio-nin. Medens her N5-methyltetrahydrofolinsyre vil virke som me-thyldonor ved reaktionen, og vitamin B12 er det methylerede mellemprodukt, er SAM i virkeligheden på den anden side nødvendig i katalytiske koncentrationer, som Bj2·-methyleringsi-15 nitiator. Blandt de andre reguleringsroller som sulfoniumforbindelsen spiller, skal huskes dens indvirkning på ethanola-mincytidyltransferaseenzymet. En mekanisme, som regulerer dette enzyms aktivitet, er i virkeligheden blevet forventet og vil sandsynligvis involvere en ikke-enzymatisk methylering af 20 proteinet. Den samme mekanisme blev også forventet til forklaring af den irreversible inaktivering af H-ribonucleasen fra kalvethymuskirtlen, som udøves af SAM (Zappia V. et al. "Biomedical and Pharmacological Roles of Adenosylmethionine and the Central Nervous System", side 1, Zappia V. et al. Eds., 25 Pergamon Press N.Y., 1979). De indbyrdes stofskifteforhold for trans-sulfureringsreaktioner, folatcyklus og transmethylerin-ger er også af betydning.

Efter opgivelse af methylgruppen omdannes SAM til S-adenosyl-on homocystein (SAH), som er en kraftig inhibitor for alle trans-methyleringsreaktionerne, som hidtil er blevet undersøgt. Enzymerne, som nedbryder SAM, en L-aminosyreoxidase og en specifik hydrolase, spiller derfor indirekte en regulerende rolle ved methyloverføringsreaktionerne. Ved afbalancering af hydrolysereaktionerne forskydes disse mod kondensation og SAH udsættes

V O

for at blive hydrolyseret alligevel på grund af, at reaktionsprodukterne fjernes ad enzymatisk vej. Adenosin omdannes i virkeligheden hurtigt til inosin, hypoxanthin og xanthin, og det

DK 160430 B

4 udskilles som urinsyre, hvorimod homocystein metaboliseres ved hjælp af to konkurrerende systemer: transsulforeringssystemet, som fører til cystein, og den såkaldte "svovlkonserveringscyklus", som sammenknyttes igen på folatet.

5 På grund af dens mange og komplekse biokemiske funktioner er SAM i stand til at udøve en række farmakologiske virkninger, som er sammenfattet i den efterfølgende tabel 1.

SAM opnås let i industriel målestok ud fra gær, der dyrkes på methionin-holdige medier (Cantoni G.L., "Methods in Enzymolo-gy", 3, 600, 1967).

Den nedenfor anførte formel, som repræsenterer den naturlige biologisk aktive form af adenosylmethionin (Zappia V. et al., 15 Biochem. Biophys. Acta 178, 185, 1969) eller 5'-[[(3S)-3-ami-no-3-carboxy-propyl]methyl-(S)-sulfon]-5'-deoxyadenosin, symboliseret (-)SAM, giver pKa-værdierne for forskellige ioniser-bare grupper i molekylet (Farooqui J. et al., "Electrophoresis" 4, 261, 1983).

20 4 26 pk, 12.5 --‘'fx

X-J-—kcrf2 1 CHttCHtCH-COOH

/OHHO^ CH, *JfH3 Jtl_, pk, 7.8 30 35

5 DK 160430 B

bi 1

o I I S I

p T3 I W >> O

o ti o g bo co p .μ <u Æ X a w

G G ^ C ·~· O P G P

g Ό . CO P O Ό g G O S

0)U P O P O O W CO S

χ ,n p «bo w,cj>oceaoj

05 C O (0 n) > O > i—i O

•h o oo 4-i to g p eo a x g p G X CO C Ό OP OG G S* p w φ « φοΟΟΌΜΡΟΟΟΟ p g P P C E bi SMS η b Β χ tn m tn G oo >>bo O p p ·η·η p G ·η ΟΦ Λ Ρ W «ο g >> G C cø •Η 4J a Ρ ti g OG Φ G G ΦΦΟ τι η -η X ε tn tn -η cø p cø o co g Ό g g

OG ti O P P >—I G “ CO P P bO G P O G

J) j; (J X5 bO Ό O 05 Ό O GO Ort G ϋ blGiH

t« ρ -P G p Obo P G G G O G GOPCOOOaU

G O C 8S G >> Ρ P G C CØ P G G BH G Μ M

bt Ό G P G O 05 TJ 05 .G M G J3 >> C > C O "G O

S3 g os O PC P O G O P G PGOPPGOC

Ρ O G Λί Ο P O > »-i Λ G Ji 05ECØEG.GPG

G>PtO P S > GOPGG COØ'OCECP.C

X g 05 3 05 X Φ G Æ P CO GO O p C O O O ® P

G <C O E O < P b0 O G S O. C feCPfePSiGG

P

> I 05 Ρ Ε ·Η

φ G ! Φ CD

X Φ G G

tn bo bo p p p p G G C 05 bt ·η ή o co

o g bo C C -Q Φ i—I

pH JiOPOGbOO

O Ό ti Ρ P G O ,C

x φ G Ό Ρ P O Ci u G bo > p p bo o p tn g o co a g g w bo

tH G g Ρ O P C O S G

G SO Ρ ρ P O G N ‘H

,J Ρ ΦΌ 05 G SB .C P C G G

W ρ ΌΒ05 Ρ O Ρ Ρ O Ό G G P

n 05 o sop to a ό s ji ρ λ pffi

<| GO I Ό P G >» .03 P S g ρ E

H p O p P p P -G ,03 G G O OG I I I

G E G > G O CO OG O

O P O -C -C >> GP GpJii X > P 05 OOP S G G G G to 050 XS <U bOb££-> <w *H *H ·* ·Η Φ P H G bo G G ·—· O P M fl P Ό

O G Sj 1 GP 05 P 05 O J3 P GP

g G 05 POPOPbOOG aG

p G J3 C X CO C CO O P O Obo >i O 85 G OCOOaOCOOPX!

tn P> PS PGPGPXi GP

o PCS Gg O O G »O G O GO

s sop o o a o g a g ρ p

Φ ϋ Ci ΐ EG P S» P O G C GG

7S < X G CO G CO .C CO p JC P H X

G t co

G

G o

φ I Φ P

x Ό G bO Ό

05 G O G P

p O Φ P P S

G T5 G G G 05

GO OG S G X Ό C

OP ΌΟ bO O G G O

bt G GP G PPOP

gg OP Ό Ρ>τ-»Ό CO

PS Pt» G O —' G P co gG p x o aeo

x r-t P CO Ό O O O J3 G

G P PO S* CO CO Ό E a

pg Hi X5 P PPOO O

t> p O O <G GO>G G

I pp O bO ,03 G Ρ Ό p tiG Ό S C P G p

p o a P C g > P

g EO G O Ρ P S G

< co ss o fa s s n < 6

DK 160430 B

Udover at bestemme ladningstilstanden påvirker pH-værdien også den kemiske stabilitet af molekylet i opløsning. Tilstrækkelig sure medier og lave temperaturer hindrer SAM i hurtigt at nedbrydes til hovedsageligt MTA. Denne nedbrydningsproces skyldes 5 et nucleofilt intramolekylært angreb af det carboxyliske carbon på det aminosure γ-methylen, som er gjort særlig reaktivt på grund af den nærliggende pol af sulfonium (Zappia V. et al., "Transmethylation", Usdin E. et al. Eds., Elsevier M.Y., 1979, Zappia V. et al., "Methods in Enzymology", 94, 73, 10 1983). Ved højere pH-værdier, er stabiliteten i opløsning rin ge, og molekylet nedbrydes hurtigt ifølge forskellige mekanismer. Stabiliteten af saltene af SAM, som krystallinske faste stoffer, påvirkes afgørende af den tilstedeværende anions egenskaber. Det ses især, at forøget sterisk hindring af anio-15 nen forbedrer stabiliteten af fast-fase-molekylet. I dette tilfælde fører den overvejende nedbrydende mekanisme også til dannelse af MTA. Et af disse salte med formlen SAM+.HS04-. H2S04.CH3C6H4S03H (US patentskrift nr. 3.954.726) finder for tiden farmakologisk anvendelse.

20

Det har nu vist sig, at visse salte af SAM med vandopløselige polyelektrolytter af anionisk type har uventet gode egenskaber, som gør dem særligt egnede både til anvendelse i farmaceutiske formuleringer og til præparative anvendelser.

25

Saltene ifølge opfindelsen er salte af S-adenosyl-L-methionin af den i krav 1 karakteriserede art.

SAM's ladningstilstand ved en pH-værdi på indtil 3,5 er i vir-30 keligheden således, at der sikres en stabil og specifik reaktion mellem molekylet og de negativt ladede steder af vandopløselige polyelektrolytter af anionisk type.

Som et resultat af denne reaktion vil der dannes uopløselige 35 salte med støkiometriske forhold på 0,1-0,5 mol SAM/g-ækviva lent af polyanionisk materiale.

7

DK 160430 B

Et særligt foretrukket forhold, på grund af stabiliteten af det opnåede salt og af præparative hensyn, er på 1:3 mol SAM/ ækvivalent polyanionisk materiale (i det følgende benævnt po-lyanion). På den anden side er også støkiometrier, der er for-5 skellige fra dette forhold, nemlig indenfor det ovennævnte interval fra 0,1 til 0,5 mol SAM/ækvivalent af polyanionen, forligelige med udfældningsprocessen og opnåelige ved anvendelse af enten et overskud eller et underskud af polyanionen i forhold til SAM.

10 I salte med et lavere støkiometrisk forhold end 0,3 opnås bundfaldets elektronneutralitet på grund af kationer i mediet, der virker som modioner på polyanionen sammen med SAM, hvorimod anioner i salte med et højere forhold i mediet delvis 15 neutraliserer SAM's positive ladninger.

Repræsentative eksempler på polyanioner afledt af stærke syrer er polymerer eller copolymerer, som i det makromolekylære skelet gentagne gange indeholder grupper som -S03~(polyethylen-20 sulfonat, polystyrensul fonat, etc.), -OSO3-(polyviny1 sulfat etc.), -0-P030“_ og -O-PO3H"-(polyvinylphosphat, etc.), .0 -0-P- / (polyphosphater, methaphosphater etc.) 25 \ 0-

Repræsentative eksempler på polyanioner, der er afledt af en svag polysyre, er polymerer eller copolymerer, som i strukturen indeholder -C00_-grupper (polyacrylater, polymethacryla- ter etc.).

30

For så vidt angår polyanionens molekylvægt styres udfældningsprocessen af saltet med SAM ikke afgørende af denne parameter.

Det ses i virkeligheden,, at hver polyanion generelt er i stand til i et surt medium at give anledning til dannelse af uoplø-3 δ selige salte med SAM inden for et bredt interval af molekylvægte. En overgrænse herfor er polyanionens vandopløselighed, og en nedergrænse heraf er en polymerisationsgrad, som vil

DK 160430 B

8 tillade, at molekylet falder inden for klassen af polyelektro-lytter (Doty P. et al., "Polymeric Electrolytes", Ann. Rev. Phys. Chem. 3, 81, 1952).

5 Dannelsesmekanismen for disse uopløselige salte af SAM med po-lyanioner kan i overensstemmelse med det foreliggende kendskab til polyelektrolytters fysisk-kemiske karakter blive reduceret til to processer. Den første proces tilvejebringer en stabil reaktion mellem SAM - via positivt ladede steder heraf - med 10 et molekyle af polyanionen, hvis negative ladninger er neutraliserede segmenter af adskillige polymerkæder, hvilket resulterer i udfældning af saltet. Den anden procesmekanisme sørger for samtidig reaktion mellem et og samme molekyle af SAM med de ladede steder af forskellige molekyler af polyanionen for 15 samtidigt at fremkalde neutralisation af ladningerne og en intramolekylær tværbinding, to faktorer, som begge fører til saltudfældning. Den indbyrdes rolle, som de to typer af SAM-polyanionreaktion spiller ved dannelsen af det uopløselige salt, afhænger af udfældningsbetingelserne og af polyanionens 20 karakter.

Det skal bemærkes, at begge processerne omfatter en samtidig stabil reaktion mellem de forskellige ladede steder af SAM med negative ladninger, som er defineret topologisk på makroionens 25 overflade. 1 35 tilfælde af forhold på 1:3 mellem mol af SAM/ækvivalent af polyanion kan saltene ifølge opfindelsen angivet ved hjælp af formlen 30

DK 160430B

9 (SAM X fx-]- R- hvor gruppen-4—-X--kan repræsentere en gruppe med formlen 5 I 1

L r J

—j-o—^P°ly_ °S metaPhosPhater)-eller X kan repræsentere en gruppe med formlen —£· 10 , /=\ og R" kan betegne en af grupperne: —>-S03-, -S03"·, -0S03-, -0P03H", C00“.

Den polymere forbindelses molekylvægt og således værdien af n er som nævnt ovenfor ikke afgørende, bortset fra polyanionens 15 vandopløselighed og for at den bliver i stand til at falde indenfor polyelektrolytklassen.

Den efterfølgende formel heri angiver for tydeligheds skyld den fuldstændige formel for SAM, de kationiske steder, som 20 reagerer med grupperne r "| S0JB tidligere defineret rFt R~ ft4 R~ .Ας-.

“ UU x I , ?«> /" 35 - *^0·^ fl-3- 10

DK 160430 B

Saltene ifølge den foreliggende opfindelse er særligt stabile selv ved væsentligt højere temperaturer end stuetemperatur: en analyse af deres varmestabilitet i forhold til tiden har i virkeligheden vist en ubegrænset stabilitet hos disse forbin-5 delser, når de holdes i fast fase ved 45°C. Ved 75°C ses der imidlertid differentieret adfærd for de forskellige fremstillede salte i forhold til hinanden. I hvert tilfælde er stabiliteten ved 75°C, som udvises af saltene af SAM med polyanio-ner, generelt langt højere end for alle de hidtil undersøgte 10 salte, hvis halveringstider i bedste fald er under 24 timer i sammenligning med indtil 10-20 gange højere værdier, der udvises af de forskellige salte af SAM med polyanioner.

Saltene af SAM med polyanioner gøres opløselige i vandig fase 15 ved pH-værdier over 4 med en hastighed, som i alt. væsenti igt styres af polymerens kemiske natur, det faste salts støkiometri og fysiske egenskaber såvel som af mediets ionstyrke. Opløsningsprocessen involverer ikke nogen ændring i pH-værdi, selv når den gennemføres i dårligt pufrede medier, hvilket 20 skyldes disse saltes iboende lave surhedsgrad.

De lyofi 1iserede salte af SAM med polyanioner viser sig i almindelighed ikke at være hygroskopiske og foreligger i form af hvide, krystallinske faste stoffer.

25

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del anførte.

Udfældningen af SAM fra sure (foretrukket pH-værdi 2,0-3,5) 30 vandige opløsninger påvirkes ikke selv i nærværelse af høje koncentrationer af neutrale molekyler eller molekyler, som har anionisk karakter. Den er desuden meget specifik ved, at der f.eks. selektivt udfældes SAM i nærværelse af MTA, et af sul-foniumforbindelsens vigtigste nedbrydningsprodukter. Med po-35 lyanioner er det muligt at udfælde SAM fra eksternt fortyndede opløsninger af sulfoniumforbindelsen (>0,001 M), men tæt pakkede bundfald, der let udvindes blot ved bundfældning, opnås ved anvendelse af opløsninger med koncentrationer på 0,002-0,2

DK 160430 B

u M. Om nødvendigt, kan der opnås forbedrede udbytter af uopløselige salte, hvis der til den vandige fase sættes indtil 1 volumen af et organisk vandopløseligt opløsningsmiddel, som f.eks. methanol, ethanol, n-butanol, acetone og methylethylke-5 ton. Udfældning af SAM og den resulterende stabilisering deraf som et fast salt ligger almindeligvis på et optimum, når der anvendes 3 ækvivalenter af polyanionen pr. mol SAM i opløsning. Forskellige støkiometrier, der udnytter et højere eller lavere forhold, er karakteriseret ved, at der i det udfældede 10 salt findes andre modioner fra mediet. Disse vil bestå af kationer, hvis det støkiometriske forhold mellem SAM og polya-nion er lavere end 0,33, og af anioner.hvis forholdet er højere end denne værdi. Udfældningen af saltene af SAM med po-lyanioner kan gennemføres ved, at der under kraftig omrøring 15 tilsættes en vandig opløsning af polyanionen til opløsningen af SAM eller omvendt. Bundfaldet dannes hurtigt ved stuetemperatur, selvom afkøling til 4°C under visse omstændigheder kan forbedre bundfaldsudbyttet. I overensstemmelse med polyanio-nens kemiske natur viser bundfaldet sig at have form af en gel 20 med varierende konsistens, og som hurtigt vil klæbe til beholdervæggene, eller at have form af et storkornet tæt pakket partike1formet stof, som i de fleste tilfælde gør det muligt at fjerne væskerne ved simpel dekantering.

25 Efter vask med vand og om ønsket med organiske opløsningsmidler kan det udfældede salt tørres ved inddampning (foretrukket temperatur 50eC) under vakuum, eller ved lyofi 1 isering. Formaling af det faste stof giver krystalinske pulvere, som er velegnede til anvendelse som aktive bestanddele i farmaceutis-3Q ke formuleringer.

En variation af dette almene skema, der kan anvendes, når SAM udfældes fra opløsninger, der indeholder andre molekylære for- 35 12

DK 160430 B

j mer, som i tilfældet med SAM-berigede gærekstrakter, sørger for opløse!iggørelse af bundfaldet ved pH-værdi 5 i et passende volumen vand eller pufferopløsning. På denne måde forbliver den fremmede molekylære form indesluttet i bundfaldet og 5 bliver fortyndet i volumenet. Saltet af SAM med polyanioner dannes.så igen ved at bringe opløsningens pH-værdi ned på 2-3.

i På grund af deres simple konception og lave pris kan metoder- i ne, der er beskrevet i forbindelse med denne opfindelse, let 10 anvendes til fremstilling i industriel målestok.

De nedenfor anførte eksempler belyser fremstillingen af en række salte af SAM med polyanioner. Der er naturligvis ved hjælp af disse eksempler kun angivet nogle få af mange mulige 15 udførelsesformer. Eksemplerne refererer til bundfældninger, som foretages ud fra opløsninger af SAM med forskellige koncentrationer, selv om metoden kan finde direkte anvendelse også til ekstrakterne af gær, der er beriget med SAM.

20 Eksempel 1

Til 10 liter SAM-sulfat, 40 mM, pH 2,0 ved hjælp af H2SO4, sættes ved stuetemperatur under kraftig omrøring 2 liter 0,6 N opløsning af poly-para-styrensulfonsyre (molekylvægt 7 x 104), 25 hvis pH blev justeret til 2 (polysyrens ækvivalentvægt 184).

Det ses strakt, at en mælket emulsion dannes og koagulerer i løbet af nogle få minutter til en masse af gummiagtig konsistens .

30 Væskedelen fjernes ved simpel dekantering, og bundfaldet vaskes to gange med 10 1 destilleret H2O, idet systemet holdes under kraftig omrøring. Efter fjernelse af vaskevandet ved dekantering, tørres bundfaldet under vakuum til opnåelse af 342 g af et hvidt, ikke-hygroskopisk, krystallinsk produkt, som 35 formales fint. Det således dannede produkt er uopløseligt i vand ved pH <4, hvorimod voksende opløselighed ses ved pH fra 4 til 7. UV-spektret af saltet i vandig opløsning ved pH 4 vi- 13

DK 160430 B

ser et maksimum ved 258 nm, hvilket stemmer overens med SAM.

De høje værdier af koefficienten af molær ekstinktion af ade-nin-chromophoren og dens spektrale overstyring af polyanio-nens benzenchromophor hindrer denne strukturelle komponent i 5 saltet i at blive gjort synlig i det ultraviolette spektrum.

HPLC-analysen (Zappia V. et al., "Methods in Enzymology", 94, 57, 1983) (ULTRASIL CX 25 cm x 4,6 mm i.d. kationisk kolonne, ammoniumformiatelueringsmiddel, 0,5 M, pH 4, strømningshastig-10 hed 1 ml/min) af saltet af SAM med polyparastyrensulfonatet

opløst i elueringspufferen viser nærværelsen af en chromato-grafisk top med den samme retentionstid, som for SAM ved 6,6 min., hvis integration gør det muligt at slutte, at sulfonium-forbindelsen repræsenterer ca. 40¾ af det udfældede salts tør-15 vægt. Ih-NMR (2H2O, pH 7,0) spektroskopien af saltet af SAM

med polyparastyrensulfonatet viser, i den korrekte integrationssammenhæng, SAM-signaler centreret ved henholdsvis δ8,2, 6,0, 4,5, 3,9, 3,5, 2,7 og 2,3 og af polyanionen som forstørrede signaler centreret henholdsvis ved δ7,5, 6,5 og 1,5.

20

En vurdering af den relative sammenhæng mellem integraler af de bedst opløste signaler af polyanionen og af SAM gør det muligt at sætte forholdet mellem mol SAM og ækvivalenter af po-lyparastyrensulfonat i saltet til ca. 0,3.

25

Saltet opløses langsomt ved en pH-værdi fra 4 til 5, hvorimod det hurtigt gøres opløseligt ved en pH-værdi på 7.

Opløseliggørelsen af 0,1 mol SAM i form af salt med polypara-30 styrensulfonatet i en liter phosphatpuffer, pH 7, 0,01 M, giver ikke nogen signifikant pH-værdiændring, hvilket viser en ubetydelig restsurhed i det udfældede salt.

Saltets stabilitet ved 45°C er ubegrænset, medens halverings-35 tiden ved 75°C er over en måned.

DK 160430 B

14

Eksempel 2

Til 1 liter SAM-sulfat, 20 mM, pH 2,5 ved hjælp af H2SO4, tilsættes ved omgivelsernes temperatur og under kraftig omrøring 5 500 ml 0,12 N opløsning af natriumpolyparastyrensulfonat, mo lekylvægt 5 x 105, hvis pH-værdi er blevet indstillet til 2,5 (ækvivalentvægt af saltet 206). Udfældningsreaktionen foregår som i eksempel 1. Vask og lyofi 1 iser ing resulterer i dannelsen af 16,5 g af et hvidt ikke-hygroskopisk, krystallinsk fast 10 stof med tilsvarende spektroskop!-, analyse- og stabilitetsegenskaber, som forbindelsen fra eksempel 1 bortset fra, at der ses en forøgelse i opløselighedstider ved pH >4.

Eksempel 3 15

Til 10 liter 0,1 N NaCl04-opløsning, der indeholder 0,3 mol SAM-perchlorat, indstillet til pH-værdi 2 med HC104, sættes ved stuetemperatur og under kraftig omrøring 2 liter en af 0,45 N opløsning af polyparastyrennatriumsulfonat, molekylvægt 20 6 x 106, hvis pH-værdi er blevet indstillet på 2 (ækvivalent vægt af saltet 206). Udfældningsreaktionens forløb svarer til det i eksempel 1 beskrevne. Efter vask og lyofi lisering opnås 271 g af et hvidt ikke-hygroskopisk, krystallinsk fast stof med tilsvarende spektroskopi-, analyse- og stabi1 itetsegenska-25 ber som forbindelsen fra eksempel 1, idet den eneste forskel er den lavere opløseliggørelseshastighed ved pH >4.

Eksempel 4 30 Til 1 liter SAM-sulfat, 0,1 M, pH 2,0 ved hjælp af H2SO4, tilsættes ved stuetemperatur under kraftig omrøring, 0,5 liter 0,6 N opløsning af natriumpolyvinylsulfonat, molekylvægt 2 x 1θ3, hvis pH-værdi er blevet indstillet på 2 (ækvivalentvægt af saltet 130).

Der ses dannelse af en mælket emulsion, og emulsionen er tilbøjelig til at koagulere på reaktionsbeholderens væg under 35 15

DK 160430 B

dannelse af en klar meget viskos gel. Sænkning af temperaturen til 4°C fremmer denne proces og muliggør således, at væskerne kan fjernes ved dekantering.

5 Vask og lyofi 1isering gennemført som i eksempel 1 fører til opnåelse af et hvidt, ikke hygroskopisk, krystallinsk fast stof. Udbytte 61,1 g.

Produktet opløses hurtigt ved pH-værdi >4. UV-spektreret af 10 saltet i vandig opløsning ved pH 6 er identisk med UV-spek-tret for SAM med et maksimum på 258 nm.

Analysen via HPLC for saltet, gennemført som beskrevet i eksempel 1, viser nærværelsen af en enkelt absorptions UV-top 15 med den samme retentionstid som for SAM. Integrationen heraf gør det muligt at fastslå, at sulfoniumforbindelsen udgør ca.

55% af tørvægten af det udfældede salt.

NMR-spektroskopi (2H20, pH 5,4) af saltet af SAM viser i kor-20 rekt integrationssammenhæng, at nær SAM's signaler centreret ved 68,5, 8,4, 6,2, 4,6, 4,0, 3,6, 3,0 og 2,4 er der forstørrede signaler centreret ved σ 2,0 og 3,5, hvilket kan tilskrives polyanionens alifatiske kæde. Ved sammenligning af disse sidstnævnte hydrogeners integraler med integralerne af de bed-25 re spaltede protoner af SAM, kan det sluttes, at forholdet mellem mol af SAM og ækvivalenter af polyanion i saltet er ca. 0,3. Restsurheden er ubetydelig, hvilket stemmer overens med, hvad er ses i eksempel 1, og stabiliteten af det faste salt ved 45eC er ubegrænset, medens der ved 75°C konstateres en 30 halveringstid på over en måned.

Eksempel 5

Til 5 liter SAM-sulfat, 30 mM, pH 2,5 ved hjælp af H2SO4, ti 1 -35 sættes ved stuetemperatur og under kraftig omrøring 3 liter 0,15 N opløsning af natriumpolyvinylphosphat, molekylvægt 1 x 105, hvis pH-værdi er blevet indstillet på 2,5 (ækvivalent- 16

DK 160430 B

vægt af saltet 168). Der ses en langsom fnugdannelse, der kan fremmes ved afkøling af opløsningen til 4°C. I løbet af ca. 2 timer dannes et passende pakket bundfald, som kan centrifugeres fra ved filtrering under lav hastighed. Vask og lyofilise-5 ring af produktet på tilsvarende måde som beskrevet i eksempel 1 giver 81 g af et hvidt, ikke-hygroskopisk krystallinsk fast stof. Produktet gøres hurtigt opløseligt ved pH 7, og HPCL-analysen, gennemført som beskrevet i eksempel 1, viser nærværelsen af en enkelt absorptions-UV-top med den samme retenti-10 onstid som for SAM. Integrationen heraf gør det muligt at slutte, at sulfoniumforbindelsen udgør ca. 60% af tørvægten af det udfældede salt. UV-spektret af saltet i vandig opløsning ved pH-værdi 6 er identisk med UV-spektret for SAM.

15 NMR-spektroskopi viser et tilsvarende billede, som det i eksempel 4 anførte, bortset fra de kemiske forskydningsværdier for methylen og methin i polymerrygraden, som i dette tilfælde har form af forstørrede signaler centreret på 62,0 og 4,6. Baseret på en sammenligning mellem integrationerne af protonerne 20 fra sulfoniumforbindelsen og polyanionen kan forholdet mellem mol af SAM og ækvivalenter af polyanion angives som værende ca. 0,5.

Restsurheden, i overensstemmelse med det i eksempel 1 beskrev-25 ne, er ubetydelig, og det faste salts stabilitet ved 45eC er ubegrænset, medens der ved 75°C konstateres en halveringstid på mere end 10 dage.

Eksempel 6 30

Til 10 liter SAM-sulfat, 0,01 M, pH 2,5 ved hjælp af H2SO4, tilsættes ved 4°C og under kraftig omrøring 2 liter 0,15 N opløsning af natriumhexametaphosphat, hvis pH-værdi er blevet indstillet på 2,5 (ækvivalentvægt af natriumhexametaphosphatet 35 102). Des ses, at der hurtigt dannes en hvid emulsion, som i løbet af 2 - 4 timer koagulerer til en gennemskinnelig gel, der er meget viskos og som klæber til reaktionsbeholdervægge-

DK 160430 B

17 ne, hvorved væskerne kan fjernes ved dekantering. Vask og lyo-filisering, gennemført som beskrevet i eksempel 1, fører til dannelsen af 53 g af et hvidt, ikke-hygroskopisk, krystallinsk fast stof. Produktet bliver hurtigt opløseligt ved pH-værdi 7, 5 idet HPLC-analysen, på tilsvarende måde som beskrevet i eksempel 1, viser nærværelsen af en enkelt UV-absorptionstop med den samme retentionstid som for SAM. Integrationen heraf gør det muligt at slutte, at sulfoniumforbindel sen udgør ca. 63% af den tørre vægt af det udfældede salt. Der er tilsvarende 10 UV- og NMR-spektre for saltet i den vandige opløsning ved pH-værdi 6 som for SAM.

Bestemmelsen af phosphatmængden i saltet, gennemført på den hydrolyserede syre af det krystallinske produkt, svarer til en 15 støkiometri på 1:3, defineret som mol SAM/ækvivalent hexameta-phosphat.

Restsurheden er, i overensstemmelse med det i eksempel 1 anførte, ubetydelig, og stabiliteten ved 45°C af det faste salt 20 er ubegrænset, medens der ved 75°C konstateres en halveringstid på ca. 10 dage.

Eksempel 7 25 Til 5 liter SAM-sulfat, 0,02 M, pH 2,5 ved hjælp af H2SO4, tilsættes ved 4°C og under kraftig omrøring 0,5 liter 0,6 N opløsning af polyphosphorsyre (ækvivalentvægt 80, samlet indhold i P2O5 89%) fremstillet ved, at der i 100 g H3PO4 opløses 154 g P2O5 og opvarmes til 100°C i 24 timer. Polyphosphorsyren 30 opløses derpå ved 4°C i vand, idet pH-værdien hurtigt indstilles på pH-værdi 2,5 med NaOH.

Reaktionsforløbet svarer til reaktionsforløbet i eksempel 6. Udbytte: 54 g salt.

Spektroskopi- og analyseegenskaberne såvel som stabiliteten af det faste salt stemmer overens med det i eksempel 6 anførte.

35 18

DK 160430 B

Eksempel 8

Til 10 liter SAM-sulfat, 0,1 M, pH 2,5 ved hjælp af tilsat H2SO4, tilsættes ved 4°C og under kraftig omrøring 2 liter af 5 en 1,5 N opløsning af polyphosphorsyre, molekylvægt 2 x 103 (ækvivalentvægt 80), pH-værdi 2,5. Reaktionsforløbet svarer til det i eksempel 6 beskrevne. Saltet opnås i et udbytte på 518 g.

10 Karakteriseringen ved hjælp af spektroskopi og analyse af det faste salt såvel som stabiliteten af sidstnævnte stemmer overens med de i eksempel 6 anførte.

Eksempel 9 15

Til 5 liter SAM-sulfat, 40 mM, pH 2,0 ved hjælp af tilsat H2SO4, tilsættes under kraftig omrøring 0,5 liter af en 1,2 N opløsning af polyacry1 syre (molekylvægt 2,5 x 105), hvis pH-værdi blev indstillet på 3,0 (ækvivalentvægt af polysyren 72).

20 Det ses, at der øjeblikkeligt dannes et hvidt gummiagtigt bundfald, som hænger fast på reaktionsbeholdervæggene og således gør det muligt at fjerne moderluden ved dekantering.

Vask og lyofi 1isering gennemføres som beskrevet i eksempel 1 25 og fører til dannelsen af 102 g af et hvidt, ikke-hygrosko- pisk, krystallinsk fast stof. Produktet bliver hurtigt opløseligt ved pH-værdi 6 og HPLC-analysen, gennemført som beskrevet i eksempel 1, viser nærværelsen af en UV-absorptionstop med samme retentionstid som for SAM. Integrationen heraf gør det 30 muligt at slutte, at sulfoniumforbindelsen udgør ca. 60% af tørvægten af det udfældede salt. UV-spektret af saltet i vandig opløsning ved pH-værdi 6 er indentisk med UV-spektreret for SAM. NMR-spektroskopi viser et tilsvarende billede som det i eksempel 4 anførte bortset fra, at de kemiske forskydnings-35 værdier for methylen og methin i polymerrygraden, som i det foreliggende tilfælde ses som forstørrede signaler, er centreret ved 61,8 og 2,2. På basis af en sammenligning mellem inte- 19

DK 160430 B

grat ionerne af sulfoniuroforbindel sens protoner og polyanionen kan det sluttes at forholdet mellem mol af SAM og ækvivalenter af polyanionen er 1:3. Restsurheden er, i overensstemmelse med det i eksempel 1 anførte, ubetydelig, og stabiliteten af det 5 faste salt ved 45°C er ubegrænset, medens der ved 75eC ses en halveringstid på ca. 20 timer for det faste salt.

Eksempel 10 10 Varmestabilitet ved 75°C i fast fase

Varmestabiliteten ved 75°C i fast fase for de i eksemplerne 1, 3, 4, 5, 6, 7 og 9 fremstillede salte er blevet sammenlignet med varmestabiliteten for SAM-chlorid og for dobbeltsaltet med 15 formlen SAM+.HSO4-.H2SO4.2CH3C6H4SO3H. På basis af resultaterne, der er angivet i figuren på den vedføjede tegning, som procentuel nedbrydning af SAM som funktion af tiden, fremgår helt klart den højere stabilitet af saltene ifølge opfindelsen .

20

Saltene af SAM, der blev fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen, har i alt væsentligt samme giftighed som sulfoni-umforbindel sen, der indeholder modioner af en ikke-polyelek-trolyttype.

25

For at vurdere de farmakokinetiske og biotilgængelige egenskaber af saltene ifølge opfindelsen blev saltene af S-adenosyl-L-(met-l4C)methionin med polyparastyrensulfonat, polyphosphat og sulfat (som referenceforbindelse) fremstillet ved udfæld-30 ning af en opløsning af S-adenosyl-L-(met-l4C)methionin med specifik radioaktivitet på 2uCi/mol med opløsninger af polyan-ionerne som beskrevet ovenfor.

Han-Wistar-rotter, opdelt i grupper med 5 dyr i hver, blev ved 35 hjælp af mavesonde behandlet med 10 mg/kg (ækvivalent med 10 pCi fra 1*C) af den aktive forbindelse og aflivet på forskellige tider (2, 8, 24 og 48 timer) efter indgift.

20

DK 160430 B

Urin og fæces blev udelukkende opsamlet efter 24 og 48 timers forløb, medens der også fra halevenen blev udtaget blodprøver efter 30 min. Lever, nyrer, tynd- og tyktarm, mave- og tarm-iondhold, urin, fæces og plasma blev opsamlet og radioaktivi-5 teten talt som dpm/g eller dpm/ml.

De opnåede resultater viser helt klart, at saltene ifølge opfindelsen absorberes effektivt, idet mere end 60% af radioaktiviteten, som findes i den indgivne dosis, absorberes og me-10 taboliseres efter 24 timer.

Polyparastyrensulfonat- og polyphosphatsaltene, der er uopløselige i surt medium, absorberes ikke i maven, hvor opholdstiden er under 2 timer og kortere end SAM-sulfats.

15

De stabile salte af SAM med polyanioner gøres opløselige i tarmen allerede i tyndtarmen, hvor absorptionsprocessen starter. Absorptionen af radioaktiviteten, der er forbundet med den aktive forbindelse som salt med polyparastyrensulfonat og 20 polyphosphat, overlejrer det, der findes for SAM-sulfat. De hidtil ukendte salte af SAM med polyanioner kan derfor hensigtsmæssigt anvendes i farmaceutiske præparater, der er beregnet til oral eller parenteral indgift.

25 Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater, der er ejendommelige ved det krav 7's kendetegnende del anførte.

På grund af deres ringe opløselighed i sure medier opfører saltene af SAM med polyanioner sig, når de anvendes i orale 30 formuleringer, som farmakologiske bestanddele af den gastrobe-skyttede, overvejende intestinale absorptionstype. Når der anvendes makromoleky1 er, der ikke kan nedbrydes ad biologisk vej, såsom polystyrensulfonaterne, polyvinylsulfonaterne, polyvinyl phosphaterne etc., er de foretrukne polyanioner de an-35 ioner, som har en tilstrækkelig høj molekylvægt til ikke at blive udsat for intestinal absorption således, at de effektivt fjernes ved afføring.

DK 160430 B

21 I intravenøse formuleringer er de foretrukne salte af SAM med polyanioner de salte med polyanioner, som hurtigt kan nedbrydes ad biologisk vej "in vivo" til ugiftige molekylære former, som f.eks. polyphosphaterne, som effektivt nedbrydes til uor-5 ganisk phosphat ved hjælp af de i organismen tilstedeværende pyrophosphataser. Saltet af SAM med hexametaphosphat er et repræsentativt eksempel på en forbindelse, som effektivt kan anvendes til parenteral indgift efter opløseliggørelse i en passende puffer med lav molaritet.

10 I det følgende er angivet eksempler på farmaceutiske formuleringer, der indeholder saltene ifølge opfindelsen som aktive bestanddele: 15 - Tabletter eller kapsler, der indeholder fra 20 til 200 mg aktiv bestanddel, udtrykt som sulfoniumforbindelse, sammen med passende hjælpestoffer, såsom stivelse, magnesiumstea-rat, lactose og talkum.

- Lyofi 1iserede ampuller til intravenøs eller intramuskulær 20 injektion indeholdende fra 20 til 500 mg aktiv bestanddel, udtrykt som sulfoniumforbindel sen, til anvendelse sammen med passende sterile eller ikke-pyrogene opløsningsmidler, der kan indeholde analgetikum, puffer etc.

- Stikpiller, der indeholder fra 50 til 500 mg aktiv bestand- 25 del, udtrykt som sulfoniumforbindelsen, sammen med hjælpe stoffer, som almindeligvis anvendes til rektal brug.

Midlerne ifølge opfindelsen kan gives for alle de indikationer, der er særlige for SAM, 1-2 gange dagligt ved parenteral 30 indgift og 2-4 gange dagligt ved oral ingift, afhængig af diagnosen samt patientens vægt og tilstand.

35

Claims (7)

1. Salte af S-adenosyl-L-methionin (SAM) med vandopløselige 5 polyanioniske materialer valgt blandt polyphosphater, meta- phosphater, polystyrensulfonater, polyvinylsulfonater, poly-vinylsulfater, polyvinylphosphater og polyacry1 ater og støkiometriske forhold mellem komponenterne beliggende mellem 0,1 og 0,5 mol SAM/g-ækvivalent af polyanionisk materiale. 10

2. Salte af S-adenosy1-L-methionin ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det støkiometriske forhold mellem komponenterne er ca. 0,33 mol SAM/g-ækvivalent af polyanionisk materiale. 15

3. Fremgangsmåde til fremstilling af saltene ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at den omfatter trin til (a) blanding af en opløsning af SAM ved sur pH-værdi med en opløsning af polyanionisk materiale ved den samme pH-værdi under omrø- 20 ring ved en temperatur mellem 4°C og 30°C og i et støkiometrisk forhold på 0,1-0,5 mol SAM/g-ækvivalent polyanionisk materiale, (b) opsamling af det herved dannede bundfald ved dekantering, filtrering eller centrifugering, vask af det opsam- lede bundfald med vand eller ved formaling i organiske opløs- 25 ningsmidler, derpå tørring ved inddampning under vakuum eller ved lyofi 1isering.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at SAM-opløsningen er en gærcelleekstrakt, der er beriget med

30 SAM.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det dannede bundfald før tørring først opløses ved pH-værdi 4-5 i et passende volumen vand, og derpå udfældes igen ved 35 sænkning af opløsningens pH-værdi.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at indtil 1 volumen af et organisk, med vand blandbart opløs- DK 160430 B ningsmiddel sættes til den vandige fase ved afslutningen af udfældningen i trin (a).

7. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de 5 indeholder mindst et af saltene ifølge krav 1-2 som aktiv bestanddel sammen med ønskede forligelige, ugiftige hjælpestoffer . 10 15 20 25 30 35