FI59803C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara penicillansyraderivater - Google Patents

Description

ν£Κ*»·1 ΓβΙ KUULUTUSJULKAISU

1 J ' UTLÄGG N I NGSSKRI FT 59803 c (45) Γ" t:i r r; y 12 1? 1 ;: 1 ^ (51) Kv.lk?/Int.CI. ^ c 07 D 499/68 SUOMI — FINLAND (21) PM*nttlh*k.mu«-P.t.nttmöknlnj 75292k . (22) H»k*mlipilvi — Ansdknlnpdi| 20.10.75 V ' (23) Alkupilvl — GUtljhtudif 20.10.75 (41) Tullut lulklaeksl — Bllvlt offentllj 22.0*1. j6

Patentti- ja rekisterihallitus . .

. . . . . . . . (44) NShtivIkalpanon a kuuL|ulkalaun pvm. — "5η n< βη

Patent- och registerstyrelsen V 1 Antfkan utla(d och utl.ikrfft.n publlc.rtd JU.UO. Ö1 (32)(33)(31) Pyydetty ttuoikeui—Bejfrd prlorittt 21.10.7**

Iso-Britannia-Storbritannien(GB) U5U0O/7** (71) Gist-Brocades nv, Wateringseweg 1, Delft, Alankomaat-Nederländema(NL) (72) Cornells Adrianus Bruynes, Koudekerk a/d Rijn, Johannes Karel van der Drift, Delft, AIankomaat-Nedelländeraa(NL) (7**) Berggren Oy Ab (5**) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten penisillaanihappojohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av terapeutiskt användbara penicillan syraderi vat er Tämä keksintö koskee menetelmää uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten penisillaanihappojohdannaisten valmistamiseksi.

Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on kehitetty ja markkinoitu laajassa mittakaavassa joitakin puolisynteettisiä penisilliinejä, esim. ampisilliini,amoksisilliini, sulbenisilliini, karbenisil-liini, dikloksasilliini ja nafsilliini. Vaikka nämä puolisynteettiset penisilliinit ovat osoittautuneet tehokkaiksi taisteltaessa monia erilaisten mikro-organismien aiheuttamia tartuntatauteja vastaan, on vielä olemassa tarve kehittää uusia antibiootteja, jotka ovat tehokkaita määrättyjä mikro-organismeja vastaan, kuten Pseudomonas- ja Proteus-laj ej a vastaan. Keksinnön kohteena on menetelmä amoksisiniinin, so. 6-/ä-amino-(p-hydroksibentsyylikarbonamido)7-penisillaanihapon uusien johdannaisten, joilla on amoksisilliinin ennestään tunnetun aktiviteetin lisäksi mielenkiintoista aktviteet-

N

tia esim. sellaisia mikro-organismeja vastaan kuin Pseudomonas-ja/tai Proteus-lajit, valmistamiseksi.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetuilla uusilla penisil-laanihappojohdannaisilla on yleinen kaava: 2 59803 o s /—\ Il ^ \ /CH, HO-/' XV CH-C-NH-CH-CH (I)

I I I I^CH

NH I 1 1 0h3

I 0 = C -N -CH

[ I

COOE

jossa E on vetyatomi tai suolan muodostava kationi, ja Y on kaavan /Z2 -C -NH-(II)

Il l^z.

o o x mukainen ryhmä, jossa Z^ ja ovat samanlaisia tai erilaisia ja ovat kumpikin alempi alkoksiryhmä, alempi alkyyliryhmä,hydroksi-ryhmä tai ryhmä -OM, jossa M on suolan muodostava kationi. Tässä ilmaisu "alempi" käytettynä alkyyli- tai alkoksiryhmien yhteydessä tarkoittaa, että tällaisessa ryhmässä on korkeintaan 6 hiiliatomia.

Symboleilla E ja M määritelty suolan muodostava kationi on sellainen, joka kaavan I mukaisen yhdisteen kanssa muodostaa myrkyttömiä, farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationeja; tällaisia suoloja ovat natrium-, kalium-, ammonoium- tai kalsiumsuolat tai amiinisuolat, esim. tri(alempi)alkyyliamiini, prokaiini- tai bentsyyliamiinisuo-lat. Keksinnön piiriin kuuluvat myös yleisen kaavan I mukaisten yhdisteiden suolojen hydraattien valmistaminen.

Esimerkkejä kaavan II mukaisista ryhmistä ovat di(alempi)alkoksi-fosfinyyliaminokarbonyyli, di(alempi)alkyylifosfinyyliaminokarbo-nyyli, hydroksi(alempi)alkoksifosfinyyliaminokarbonyyli, hydroksi-(alempi)alkyylifosfinyyliaminokarbonyyli ja dihydroksifosfinyyli-aminokarbonyyli.

Tyypillisiä keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat D-6-{a-/3-(hydroksi-(etyyli)fosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penislilaani happo, D-6-{a-/3-(hydroksi(etoksi)fosfinyyli)ureido7-p-hydroksi-bentsyylikarbonamidoIpenisillaanihappo, D-6-{a-/3-(hydroksi(metoksi)- 3 59803 fosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penisillaanihap-po, D-6-{a-/3-(dihydroksifosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyyli-karbonamidolpenisillaanihappo, D-6-{a-/3-(dietoksifosfinyyli)-ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penisillaanihappo ja näiden natrium-, kalium- tai ammoniumsuolat (mono-, di- ja triva-lenssiset suolat), jolloin sellaiset kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa ja/tai Z2 on hydroksi tai ryhmä -OM, ovat edullisia, varsinkin yhdisteet, joissa on hyrdoksiryhmä tai -OM-ryhmä, ja Z2 on metoksi- tai etoksiryhmä, ovat osoittaneet mielenkiintoista antimikrobista aktiviteettia. Kuten tavallista, näiden yhdisteiden D-muodolla on paras antimikrobinen vaikutus.

Saksalaisesta hakemusjulkaisusta 2405894 (vastaa suomalaista patenttihakemusta 352/74) tunnetaan ampisilliinijohdannaisia, jotka muistuttavat keksintömme mukaisia amoksisilliinijohdannaisia. Keksinnön mukaisia yhdisteitä on verrattu myöhemmin esiintulevissa vertailukokeissa hyvänä tunnettuun antibioottiseen yhdisteeseen, karbenisilliiniin ja todettu, että keksinnön mukaiset yhdisteet ovat 1,25-10 kertaa tehokkaampia Proteus mirabilis A 1200-lajia vastaan ja 1,27-2,5 kertaa tehokkaampia Pseudomonas aeruginosa-lajia vastaan kuin karbenisilliini. Kun mainitusta saksalaisesta hakemusjulkaisusta tunnettujen yhdisteiden on puolestaan todettu olevan aktiivisuudeltaan alempia kuin karbenisilliini, ovat keksinnön mukaiset yhdisteet luonnollisesti aktiivisempia kuin DE-hakemusjulkaisun 2 405 894 yhdisteet.

Yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä valmistetaan käyttäen tunnettuja menetelmiä, joita käytetään rakenteeltaan samankaltaisten penisilliinien valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) yleisen kaavan /CK3 Q-0 \__y C|H~ jj'NH_CH - j3H |C\CH (1^) Q-NH 0 0 = C - N -CH 3 ! COOE 1 mukainen yhdiste, jossa Q on vetyatomi tai tavanomainen amino- tai K 59803 hydroksisuojaryhmä ja E' on tavanomainen karboksisuojaryhmä saatetaan reagoimaan yleisen kaavan 7 ' X' 1 0=C=N-P (V) zi, jossa Z^ ja Z^ merkitsevät samaa kuin edellä Z^ ja tai ovat ryhmiä, jotka voidaan helposti muuttaa tällaisiksi ryhmiksi hydro-genoimalla, mukaisen yhdisteen kanssa orgaanisessa liuottimessa lämpötila-alueella -30° - +30°C, edullisesti -5° - + 5°C ja edullisesti vedettömissä olosuhteissa, ja sen jälkeen näin saaduista yhdisteistä poistetaan mahdolliset suojaryhmät sinänsä tunnetuilla menetelmillä tai että b) yleisen kaavan Q-0 CH-COOH (VI)

NH

Y’ mukainen yhdiste, jossa Q merkitsee samaa kuin yllä, ja jossa Y* 7 ' ^ 2 on kaavan - C - NH - P^ mukainen ryhmä, jossa Z' ja Z' mer- II II \ 12 0 o z^ kitsevät samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 6-aminopenisil-laanihapon tai sen johdannaisen kanssa käyttäen karbodi-imidiä kondensoimisaineena, ja sen jälkeen näin saaduista yhdisteistä mahdolliset suojaryhmät poistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä ja saadut hapot muutetaan suoloiksi.

Yleisen kaavan IV mukainen lähtöaine voidaan valmistaa sinänsä tunnetuin menetelmin. Esimerkiksi yhdiste, jossa symbolit Q ovat vetyatomeja ja ET on vety, so. amoksisilliini, voidaan valmistaa menetelmällä, joka on kuvattu GB patenteissa 873 049, 959 853, 978 178, 1 339 605 ja 1 347 979, BE patenteissa 676 594, 790 466, 737 848 ja 751 106, NL patenteissa 7 215 359, ZA patenteissa 64/659, 66/1304, 67/5627 ja 72/05231 tai DE hakemusjulkaisussa 2 240 422. Kaavan IV mukaisia amoksisilliinin silyylijohdannai-sia ja estereitä voidaan valmistaa siitä sinänsä tunnetuin menetelmin .

5 59803 Käytettäviksi sopivia 6-aminopenisillaanihappojohdannaisia ovat myös yleisen kaavan ^ 3 \ /0H3 H,N-CH-CH (VIII) 2 I I I CHj

0= c - N -(JH

C00E'' mukaiset yhdisteet, joissa E,f on suolan muodostava tähde, suoja-ryhmä, joka voidaan reaktion jälkeen helposti poistaa ja jolla ei ole vaikutusta reaktioon. Esimerkkejä yllä olevassa kaavassa symbolilla E’ ja E" esitetyistä helposti poistettavista suoja-ryhmistä ovat mahdollisesti substituoitu bentsyyli (esim. p-nitrobentsyyli, p-metoksibentsyyli), bentshydryyli, fenasyyli (esim. p-halosubstituoitu fenasyyli), 2,2,2-trikloorietyyli,tri-tyyli, t-butyyli, isobornyyli tai pii- tai fosforiatomi, jossa on seuraavia substituentteja: alempi alkyyli, halosubstituoitu alempi alkyyli, aryyli, aralkyyli, alempi alkoksi, halosubstituoitu alkoksi, alempi alkyylitio, aralkoksi, di(alempi)alkyyli-amino, alempi alkoksialkyyli ja alkyleenidioksiryhmät tai halo-geeniatomit.

Kaavan VI mukaisten lähtöhappojen tai niiden aktivoitujen johdan-naisten valmistukseen tarvittava lähtöaine D(-)-2-amino-(p-hydrok-sifenyyli)etikkahappo on tunnettu esim. DE hakemusjulkaisusta 2 355 785 ja NL patentista 7 311 012.

Kaavan VI mukaiset hapot ovat uusia ja niitä on kuvattu suomalaisessa patenttihakemuksessa 803 000.

Kaavan VI mukainen happo voidaan muuttaa edullisesti in situ kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi lisäämällä saatuun reaktioseokseen sopivaa reaktanttia, kuten edellä osoitettiin.

Kaavan V mukaiset lähtöyhdisteet voidaan valmistaa sinänsä tunnetuin menetelmin, kuten on kuvattu esim., seuraavissa julkaisuissa: G.I. Derkatsch, Angew. Chem. 8l, n:o 11, 407-^36 (1969)» L.I. Samarai et ai., Zh. Obshch. Khim. 39, 1511 (1969), G.I. Derkach et ai., Zh. Obshch, Khim, _38, n:o 8, s. 1784-1788 (1968), E.S. Gubnitskaya et ai., Zh. Obshch. Khim, 40, 1205-1210 (1970), L.I.

6 59803

Samarai et ai., Zh. Obshch. Khim, 39, n:o 8, 1712-1715 (1969), A. V. Narbut et ai., Zh. Obshch, Khim, 3_8, n:o 6, s. 1321-1324 (1968) ja G.Tomaschewski et ai., Arch. Pharm. 301, s. 520 (1968).

Yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä käytetään edullisesti terapeuttisiin tarkoituksiin myrkyttöminä suoloina, kuten natrium-, kalium-, ammonium- tai kalsiumsuoloina. Muita käytettäviksi sopivia suoloja ovat myrkyttömät sopivasti kiteytyvät orgaanisten emästen, kuten amiinien, esim. trialkyyliamiinien, prokaiinin ja di-bentsyyliamiinin kanssa muodostetut suolat.

Bakteeri-infektioiden käsittelyssä tämän keksinnön antibakteeri-sia yhdisteitä voidaan antaa paikallisesti, oraalisesti ja paren-teraalisti tavanomaisin antibioottilääkinnässä käytetyin menetelmin. Niitä annetaan annosyksikköinä, jotka sisältävät tehokkaan määrän aktiivista aineosaa yhdessä sopivien fysiologisesti hyväksyttävien kantoaineiden tai laimennusaineiden kanssa. Annosyksi-köt voivat olla nestemäisiä valmisteita, kuten liuoksia, suspensioita, dispersioita tai emulsioita tai kiinteitä, kuten jauheita, tabletteja ja kapseleita.

Tässä käytetty ilmaisu "tehokas määrä" kuvattujen yhdisteiden suhteen tarkoittaa määrää, joka on riittävä tuhoamaan tai ehkäisemään haitallisten mikro-organismien kasvun, kun tällaista yhdistettä annetaan tavallisella tavalla, ts. se tarkoittaa riittävää määrää bakteerien kasvun kontrolloimiseen. Tehokkaan määrän suuruuden voi alan ammattimies helposti määrittää standardimenetelmillä, joita käytetään antibakteeristen aineiden suhteellisen aktiviteetin määrittämiseen haitallisia organismeja vastaan erilaisin lääkeantotavoin.

Sopivat kantoaineet ja laimennusaineet voivat olla mitä tahansa soveliaita fysiologisesti hyväksyttäviä aineosia, jotka helpottavat terapeuttisesti aktiivisen yhdisteen lääkeantoa. Kantoaineil-la voi olla muita lisätehtäviä, ne voivat olla esim. laimennusai-neita, makua parantavia aineita, sidonta-aineita, vaikutusta hidastavia aineita tai stabilointiaineita. Esimerkkejä kantoaineista ovat vesi, joka voi sisältää gelatiinia, akaasiakumia, alginaattia, dekstraania, polyvinyylipyrrolidonia tai natriumkarboksimetyylisel-luloosaa, vesipitoinen etanoli, siirappi, isotoninen suolaliuos, 7 59803 isotoninen glukoosi, tärkkelys, laktoosi tai mikä tahansa muu lääke- ja eläinlääketeollisuudessa tavallisesti käytetty aine.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden joidenkin tyypillisten yhdisteiden antibioottinen aktiviteetti kokeiltiin in vitro agar-sarjalaimen-nuskokeella seuraavasti:

Valmistetaan steriiliin, sopivaan liuottimeen antibioottiperus-liuos, jonka pitoisuus on 2000 ^ug/ml. Tästä valmistetaan kaksinkertaisia laimennuksia steriilillä 0,05-m fosfaattipuskurilla pH 6,5 (KHgPO^-NaOH). 1 ml kutakin laimennusta sekoitetaan 19 ml:aan aivosydäninfuusioagaria steriilissä Petri-maljassa. Pinnan kovetuttua se ympätään koeorganismilla ja inkuboidaan 24 tuntia 37°C:ssa. Minimiehkäisyväkevyys (MIC), so. alhaisin antibiootti-väkevyys, joka täysin estää koeorganismin kasvun, ilmoitetaan ^ug/ml:oina.

Joissakin tapauksissa MIC-arvot määritetään mikro-sarjalaimennus-kokeella, joka suoritetaan seuraavasti:

Steriilillä Pasteur-pipetillä viedään 2 tippaa kokeiltavan antibiootin perusliuosta tunnetun väkevyisenä yhdeksällä, numeroidulla kololla varustetun koelevyn ensimmäiseen koloon. Pipetti huuhdotaan 5 kertaa fysiologisella natriumkloridiliuoksella, sitten koeorganismin perusliuosta viedään 2 tippaa kaikkiin muihin koloihin paitsi koloon 8. Ensimmäisessä kolossa koeyhdisteen liuos on laimennettu puoleen, ensimmäisen kolon neste sekoitetaan ja tätä seosta lisätään 2 tippaa toiseen koloon, näin jatketaan aina koloon 8 asti, jolloin koeyhdisteen liuoksesta saadaan laimennuksia geometrisessa sarjassa. Kolossa 9 ei ole lainkaan antibioottia, ja sen tarkoituksena on kontrolloida koeorganismin kasvu sokeakokeena. Koelevyä inkuboidaan 18 tuntia 30°C:ssa tai 37°C:ssa.

Tässä viimeksimainitussa kokeessa saadut MIC-arvot ovat seuraavassa taulukossa suluissa. Kokeissa määritettiin myöhemmin esitettävien esimerkkien 4, 5 ja 7 mukaan valmistettujen yhdisteiden MIC-arvot.

59803 δ .

λ

I CM

I—I "

•H O

CO '

•H LO

3 i—i e— oo c\i o n CO (Tl Φ « « " « O OO [— « « " "

® ·Η O ΙΛ O O ΙΛ OH LO LO LT\ CO O O O O

% G CM /s

cd ·Η J* -H (—I

f—I

•H

CO "H

•h g lpi LO in m

iVH OO O H H -=T O

g.H " " " " « n 1Λ OOO

Cd H OOO OO O CM fO H LT\ ΙΙΛ K> ΙΌ r3 Λ m -=r

LO ^ -—N

O CM CM LPi LO LO 3 LO " « " O " •'^3'CMLOLOlo

® " O HH O CM LO CM " o-O

LO H LO LO — —' ' ΓΟ i—I LO LO i—I CMHfO OHO «LO

O

LO

✓-V ^r LO ΓΟ LO LO Λ C— LO "LO LOOLO H . CM LO O 3°

«OLO" O" «O" LO O '— « " « ipfD

Ή O LO CM i—I -H i—li—li—I CM MD LOMDIO O O O .H

I—I

:cd -P ^ ^

H CO ^ C— CM

g.H LO^^LO LO" "

\ fts! LO LO *-— CM C7\ CTL «O "rOLOLOLOH

b0 3 " CM " «« CM O LO LO O CM '— ««« 30) "CMHO OO H H LO CM CM LO H ΙΟ OHH ΚΊΛ ^ E f"- o>Hw —- — —' Λ

H

n CO «—>

O Φ IO

O "

>0) O

3 4J ___

cd CO ^ LO CM LO

• H LO CM CO O LOOLOHC—

O O -3" C— LO «n «O O — « « « «O

H ,3 < « «« ho OHroioro LOioro OOO o*-3 S>HLO O LO O O ^

LO

-=r « o co 00 o

I—I

LO CO

< CM OL LO

03- rockin oroo

CO OO LO CM O 1—I 1—I CM 1—I

3 t— 00 O

O μ] J CC ® < H O

•H H LO < < CM CO CM

-PC0D3- σ\ rog 3 oor-ocoH

>> ·Η 3 ro O 3 Φ H" 3 O CO H

H H ·Η σ\ CM LO d ci H CM O < S J <-=T

033 cm H -H ® 3 3 CM

£ O O O <H 0330 -H CM

Φ Φ £ O CM O O 3 E M CO

3 3 3 EH CO O E ·Η ·Η ·Η 3 ·Η ·Η ·Η .3 <3 φ < ·Η< Η 3 Η Ο Η 3 3 Η Ή

3 3 3 Φ Ο α Ο Φ ΦΗ C

.. ιο ft 3 COCO £ 3 3 >> O 3 fciO ® 3 § 3 Φ -H Ο, ® .ρ -Ρ 3 Μ OOCO-P co 3 3 3 co ρ 3 3

0 0 33 · 3 (0 H333 H.3 Φ·Η O

• O O O i—I hOH H H H H O 3 3 E ε

3COOOO Φ·Η3 ΦΗγΗΗΟ O

•H 00003 3 O H 3 Φ Φ φ ·Η E coco co 3O-P-P03 Q, H 3 -H 333 O 33 3 Φ · Qj Ω* O ·Η ·ΟΦ Φ CO O O Φ O ΦΦ Φ -p E: Φ Φ 1—io E E o p> jo E E O 3 -p -p h

033303 3 Φ 3 co φ i—IHO Φ OO O

3 3i -p -P H 3 333 3 H 3 3 co co 33 3

Ö Ö W O] Q O] OO® ® 3 00 CO ® ® ® ® O

g 59803

Esillä olevan keksinnön joillakin tyypillisillä edustajilla saatiin alustavissa in vivo kokeissa seuraavat tulokset:

•H

e

•H

•H tn LO m LTi LT\ H · OJ C\J C\J C\J C\J -=r mo ,—| £_l Λ Λ Λ * Λ

•HO OOOOO rH CM

to ν' v V V V V V

•rH

e Φ in in £ n · O rH rH CM CM \D <J\ CU inS ·>*>·*** ** £ Cd · MO CM O O MO 13— H W Ή H VV C— C~-

E

>5

4J D^- -3- -=r -=r CM CM

.p · tn md md tn tn md im <P_| « Λ Λ Λ

<H in O OOOOO O rH

Φ V V V v V

•Η Ή CÖ -P ·^ •t-3 03 I 34 · ar [3- O C— M3 CO 0 H H G S « « Λ " *3 " n O I—I 03 d) · m σ> m ar 0 tn m

03 CtiWS'HCMrHrH -=T MO

Cd Λ V

-P U

HO O CTi

g · in in in in in « A

3 cd ^rin «„««« £ t-3 ocmcmcmcmcm cmcm 0) ·Η VVVVV v

0 · I >~TC

03 g I Di · c— ar cm in in in m , I £_| £ #> * Λ Λ £ ·ηοοφ· ο- ο σ> cm cm mo

•H W S ·Η CM CM ν,ν MO CO

CM V

•h 34 •h tn rH &£) .mmmcMO -=r co ^ g CQ^h «%**>** •h noooooo mo 03 0 -¾ 1-1 ^

•H rH -H V

c 34 φ w 1 34 m m m m

ο Ο Ή ShS λλλ»%| CMO

£ £ 03 φ · m co o m oh

cd C W S "H CM H H HH

34 <ς cd in in in in in

• r-5 · CM CM CM CM CM m C3M

£--- #N #\Λ C 000000 min φ -H v v v ν '* Ο 34 cn •h cd 1 34 momvo^r Φ 1—1 ·η e ε λ ·> »» λ m in π> I—1 o3 φ · Hcooocno m ar 03 · Η Η ε ή co mo m mm •H Φ Ό G -G -h

>5 -H ar CM

C ^ ^ £ Cd O 1—li—I CM H" M£3 ar φ λ: fv •o o e -p cd _ i—1 cd - £·

• H 03 Cd cd 03 G

φ n 1 c cd 1 c φ o ^ £ ·η ·Ηϋ d Cd c Φ o -h S o ·η i—i o cd>3-pcd

^ > 3 ·· cd 3 03 n 03 red G

CO H 34 " -P -P -H £ ·Η Φ 03 SC P G ·Η O Xd Φ . ai cd e e 3 ·η g .e xd · <c CO P> H 34 O G > Φ >> E feS.

10 5 980 3

Alla olevissa taulukoissa mainittu ABA-testi suoritetaan kuuden noin 20 g:an painoisen naarashiiren (Swiss SPF) ryhmillä.

Veri- ja virtsanäytteitä otetaan sen jälkeen, kun testattua yhdistettä on annettu 100 mg/kg annoksena fysiologisessa suolaliuoksessa, vatsaontelon sisäisesti ja suun kautta.

Annetun mikrobinvastaisen yhdisteen pitoisuudet näissä näytteissä määritetään kvalitatiivisesti Vincent*in kehittämällä testimenetelmällä mittaamalla halkaisijaltaan 7 mm:n suuruisten paperikiekkojen ympärillä olevien estovyöhykkeiden halkaisijat, jotka kiekot on impregnoitu näytteellä ja sovitettu agarviljelyväliaineelle Petri-maljassa, jossa haluttua mikro-organismia viljellään. Kahden tai kolmen itsenäisen ajon keskiarvot merkitään.

Testatun yhdisteen pitoisuuksien kvantitatiiviseksi määrittämiseksi verinäytteissä mitataan näytteellä sekä seerumissa testattavan yhdisteen standardiliuosten sarjalla impregnoitujen paperikiekkojen ympärillä olevien estovyöhykkeiden halkaisijat ja tuntematon pitoisuus määritetään standardikäyrän avulla.

Alla olevissa taulukoissa mainitut suojauskokeet suoritetaan 10 naarashiiren (Swiss SPF) ryhmillä.

Kunkin ryhmän hiiriin tartutetaan vatsaontelon sisäisesti valikoidulla mikro-organismilla. Mikrobienvastaisen yhdisteen liuosta annetaan esitetyllä tavalla ja 5 kertaa päivässä. Käsittelyn kesto oli 1 päivä ja testieläinten tarkkailu kesti 7 päivää. ED^g-arvot ja vaikutussuhde mitä tulee annettuihin referenssiyhdisteisiin määritettiin probit-analyysillä. .

n 59803 Β· ί Η A CH3 H0-<^r-NiXi> 9S° 0 ^ONa _ MH Kemoterapeuttinen 0 = 1^ ^CH~ aktiviteetti U ^O-Ni --

Antibakteeri- Suojauskoe hiirillä__ nen aktiviteet- T , , . -,, ,, . „ Yhdis- Infektio Vertai- Tehosuhde ti virtsassa ιηα“ Ar,4 w__ . , . -τ-τττ;- /μ-·.·_,·\ tetta ABA MIC l.p. luyh- läakeanto (.niin;. annet- ν/τη. Hi-.

2 1/2 tunnin tu γ/ιη1 dlS

kuluttua otetun 100 tettä virtsan inhi- mg/kg .

biitiovyöhyke l*P* 5·°· Ρ*°· γ/ιη1 (mm:einä =ABA)

Staphylococcus i.p. Staphyl.aur. - aur._or._ A 321__

Staphylococcus i.p. 32 12,5 Staphyl.aur.

aur. A 2001 or. 26 (15) a 2001_

Staphylococcus i.p. 12 100 Staphyl.aur.

aur. A 355_or_._7 (60)_A 355 _______

Escherichia i.p. 22 12,5 Escher.coli coli U 20_or._10_____

Klebsiella i.p. 7 100 Klebs.pneum.

pneum. A 809 or._7___

Salmon. i.p. 25 6 S.typhimur.

typhimur. R 172 or._16 R 172_

Proteus mira- i.p. Proteus.mirab. Karb. 5,4 0,75 bil· A 1200_or._._A 1200_(0,45)

Proteus mira- i.p. 28 1,5 Proteus.mirab.

bil· H 3_or._14________

Proteus mira- i.p. 32 0,5 Proteus mirab.

bil. L 93_or_._17 _

Proteus rettge- i.p. 26 0,25 Proteus rettg. Karb. 4,8 ri A 821_θ£._16 _A 821_Ampi ._0,91_

Proteus morga- i.p. 7 50 Proteus morgan.

nii 2241_or_._7 _2241_

Pseudomonas i.p. 19 3 Pseud.aerug. Karb. 0,93 1,67 aerug. A 1058 or._7 (4)_A 1058_

Sareina lutea i.p, 52 ATCC 9341_or. 47__

Verentaso hiirillä (koeorga- Veren ja uriinitason määritys kaniineilla nismi Sarc.lut. ATCC 9341), (annos 10 mg/kg) annos 100 mg/kg Käyttö- lääkkeenantotapa tapa - t.m. p.o._ maks.verentaso i.p. 23 w , . . , , . 1 , Maks. searumitaso γ/ml -^^ (i.m. = 1/4 h/p.o. = 1/2 h) 25,3 0,3_ inhibiitiovyö- i.p. 27 , ......

,, 24 tunnin kuluttua laake- hyke mm:emä or. 14 „ , „ ---- annosta erottunut ".-osuus 110 20,8 havaittavat in- i.p. 1 1/2 h annoksesta hibiitiovyö- or. 1/2 h hykkeet 12 59803 °· „Η% ,S C“3 ς*0 ^ '"'ONa Kemo ter apeut t inen mu aktiviteetti oJ-ONa - υ r '-0-C2H5

Antibakteeri- Suojauskoe hiirillä_

Yhdi?." _ Infektio Vertai- Tehosuhde (hiiri) . anne?- ^ X 1·ρ· laäkeanto 21/2 tunnin tu ' dis- kuluttua otetun ^qq tettä bfitiovyöhyke . “C.

(mm: eina=ABA) _l.p. s.o. p.o. γ/mi

Staphylococcus i.p. Staph.aur.

aur._or.__A 321_

Staphylococcus i.p. 22 25 Staph.aur.

aur. A 2001 or._13_(11)_A 2001_

Staphylococcus i.p. 11 100 Staph.aur.

aurr A 355_or ._7_(30)_A 355_

Escherichia i.p. 24 3 Escher.coli coli U 20_orj;_10__

Klebsiella i.p. 7 >100 Klebs.pneum.

pneum. A 809 or._7 _

Salmon. i.p. 26. 6 S.typhimur.

typhimur. R 172 or._]JL_R 172_

Proteus mira- i.p. Proteus mirab. Karb. 2,62 0,75 bil. A 1200_or_._ A 1200_Amoks._0,16 (0,3)

Proteus mira- i.p. 26 0,5 Proteus.mirab.

bil. H 3_orj_13 ____

Proteus mira- i.p. 31 0,12 Proteus mirab.

bil. L 93_or._16 _;_

Proteus rettge- i.p. 31 0,06 Proteus rettg.

ri A 821_or_._1J5_A 821____

Proteus morga- i.p. 7 50 Proteus morgan.

nii 2241_or^_7_2241_____

Pseudomonas i.p. 19 3 Pseud.aerug. Karb. 2,7 2,5 aurig. A 1058 or._8_(6)_A 1058_____

Sareina lutea i.p. 51 0,5 A TCC 9341 or._41 ____

Verentaso hiirillä (koeorga- Veren ja uriinitason määritys kaniineilla nismi Sarc.lut. ATCC 9341) Käyttö- (annos 10 mg/kg) annos 100 mg/kg tapa_ lääkkeenantotapa maks. verentaso i.p. 37 i-m·_P·o·_ _γ/ml_or. 2 Maks. seerumitaso γ/ml ......... . (i.m.= l/4h/oraalisti 23,4 0,64 inhibiitiovyo- i.jj. · 23 - 1/9 m hyke mm:einä_or;_9 —---------- , . . . . , 24 tunnin kuluttua lää- havaittavat: mhi- ^p. 1/2 h keannosta erottunut 46-63 <1,22 biitiovyo- or. 1/2 h ,_osuus annok3esta hykkeet i3 59803 Λ=0 's“ONa Remoter apeuttinen mh aktiviteetti 0-^2¾ ONa

Antibakteeri- Suojauskoe hiirillä_ nen aktiviteet- Yhdis- Infektio Vertai- Tehosuhde ti virtsassa tetta I _ luyh- _lenosunae__ (hiiri) annet- ABA MIC ‘ * j.·.. lääkeanto 21/2 tunnin tu v/mi kuluttua otetun tetta virtsan inhi- MTr biitiovyöhyke mg/kg (mm:eina=ABA) i.p. s.o. p.o. γ/ml

Staphylococcus i.p. Staphyl.aur. ^ aur._στ._A 321_

Staphylococcus i.p. 13 50 Staphyl.aur.

aur. A 2001 or._8 (23)_A 2001___

Staphylococcus i.p. 12 50 Staphyl.aur.

aur. A 355_or._7 (30)_A 355____

Escherichia i.p. 23 6 Escher.coli coli U 20_or_._10_

Klebsiella i.p. 9 100 Klebs.pneum.

pneum. A 809_or_._7__

Salmon.; i.p. 26 25 S.typhimur.

typhimur. R 172 or._12_R 172_

Proteus mira- i.p. Proteus mirab. Karb. 1,23 1,5 bil. A 1200_or._A 1200_(0,45)

Proteus mira- i.p. 30 0,5 Proteus mirab.

bil. H 3_or. 13_

Proteus mira- i.p. 33 0,5 Proteus mirab.

bil L 93_or_._16 ______

Proteus rettge- i.p. 26 0,25 Proteus rettg.

ri A 821_or · 14_A 821 __

Proteus morga- i.p. 7 >100 Proteus morgan.

nii 2241_or._7_2241_

Pseudomonas i.p. 19 3 Pseud.aerug. Karb.

aurug. A 1058_or._7_(15)_A 1058_

Sareina lutea i.p. 53 ATCC 9341_or. 44_

Verentaso hiirillä (koeorga- Veren ja uriinitason määritys kaniineilla nismi Sarc.lut. ATCC 9341) Käyttö- (annos 10 mg/kg) annos 100 mg/kg_tapa_ lääkkeenantotapa maks. verentaso i.p. 19 i.m. p.o.

γ/ml_or._4 Maks . seerumi taso γ/ml • vu··..· ·· · i.m.= l/4h/oraalisti 27,7 < 2,5 mhibiitiovyo- i.p. 22 . /0 * ’ hyke mm: emä or. 12 - 24 tunnin kuluttua lää- havaittavat inhi- i.p. 11/2 h keannosta erottunut 80,9 >27-^30 biitiovyö- or, 1/2 h %-osuus annoksesta hykkeet 1" 59803 Ε· ΛΤν ΐ Η_/\/™3 f=0 Cr ^ONa Kemoterapeuttinen NH . . aktiviteetti ON a -:- 0-PvONa

Antibakteeri- Suojauskoe hiirillä_ nen aktiviteet- Yhdis- Infektio Vertai- Tehosuhde tettä 1,P* iUyh" -lääke anto-

Unin) annet- ABA MIC dls_ _ 21/2 tunnin tu γ/ml tettä kuluttua otetun 100 virtsan inhi- mg/kg urr biitiovyöhyke . .

(mm: einä=ABA) _i.p. s.o. p.o. γ/ml

Staphylococcus i.p. Staphyl.aur. 6 a ur.____ A. 321_

Staphylococcus i.p. 50 Staphyl.aur.

aur. A 2001_or. _(15)_A 2001_

Staphylococcus i.p. 15 100 Staphyl.aur.

aur. A 355_or._7 (60)_A 355

Escherichia i.p. 28 25 Escher.coli coli U 20_or._7 _

Klebsiella i.p. 7 >100 Klebs.pneum.

pneum. A 809_or_._7 _

Salmon. i.p. 33 25 S.typhimur.

typhimur. R 172 or._16_R 172_

Proteus mira- i.p. Proteus mirab. Karb. 10,9 3 bil. A 1200_or._A 1200_(1,2)

Proteus mira- i.p. 32 1,5 Proteus mirab.

bil. H 3_or._7_

Proteus mira- i.p. 36 1,5 Proteus mirab.

bil. L 93_crn._8 _

Proteus rettge- i.p. 24 0,25 Proteus rettg.

ri A 821_or_._8_A 821_

Proteus morga- i.p. 7 50 Proteus morgan.

nii 2241_or_._7_2241 ____

Pseudomonas i.p. 20 3 Pseud.aerug. Karb. 1 1.27 aerug. A 1058 or._7 (3,7)_A 1058_

Sareina lutea i.p. 60 ATCC 9341_or._34__

Verentaso hiirillä (koeorga- Veren ja uriinitason määritys kaniineilla nismi Sarc.lut. ATCC 9341) Käyttö- (annos 10 mg/kg) annos 100 mg/kg_tapa_ lääkkeenatotapa maks.verentaso i.p. 134 w , . , , —- . Λ _ Maks.seerumitaso γ/ml --—- i.m.= l/4h/oraalisti 813 <0,25 inhibiitiovyö- i.p. 38 = 1/2 h_ -or^-7_ 24 tunnin kuluttua lää_ havaittavat inhi- i.p. 2 1/2 h keannosta erottunut 346 6 biitiovyö- or. - h %-osuus annoksesta hykkeet 15 59803

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1 Esimerkissä 4 käytettävän lähtöaineen, natrium-D-6-{a-/_3“ (bent syylioksi (etyyli)fosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penisillanaatin,valmistus

0 S

/=\ Il H0-{v />-CH-C-NH-CH-CH C(CH3)2

X—7 NH | | I

q_0 0=C- N-CH-COONa f^C2H5

°^o-c„2-Q

Etyylifosfonihappodikloridi (C^H^POC^), kp. 78°C/30 mm Hg, valmistettiin 66,6 %:n saannolla etyylibromidista ja aluminiumkloridi/fos-foritrikloridista (AlCl^/PCl^) (Houben Weyl, 121, s. 397). Tämä di-kloridi muutettiin bentsyylietyylifosfonamidaatiksi /U2H5P(0)(0CH2C6H5)NH2_7 43,7 %:n saannolla standardimenetelmällä, jossa suoritettiin peräkkäin reaktiot bentsyylialkoholi/pyridiinin ja nestemäisen ammoniakin kanssa dietyylieetterissä. Jälleen käyttäen standardimenetelmää eristetty erittäin hygroskooppinen fosfonamidaat-ti muutettiin fosgeeni/pyridiinillä tolueenissa raa'aksi bentsyyli-etyylif osfoni-isosyanatidaat iksi /_C2H^P(0) (0CH2CgH^ )NC0/. Yksi mooli fosfonidaattia lisättiin seokseen, jossa oli 1 mooli fosgeenia ja 2 1/2 moolia pyridiiniä -60°C:ssa, minkä jälkeen lämpötila nousi hitaasti -10°C:een. Sekoitettiin vielä 90 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten reaktioseos suodatettiin kuivissa olosuhteissa ja suo-dos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Isosyanaatin määrä raakatuottees-sa määritettiin infrapunaspektroskopialla.

Vedettömissä olosuhteissa lisättiin 6,5 ml (noin 26 mmoolia) N,0-bis-trimetyylisilyyliasetamidia (BSA) huoneen lämpötilassa nopeasti suspensioon, jossa oli 4,75 g (noin 13 mmoolia) puhdasta muttei kuivaa D-(-)-(6-a-amino-p-hydroksibentsyylikarbonamido)penisillaanihappoa (amoksisilliini) (sen vesipitoisuus oli todennäköisesti 25 ml:ssa dikloorimetaania noin 1,0-1,5 moolia penisilliinin moolia kohti). Saatua reaktioseosta, joka tuli kirkkaaksi 10 minuutin kuluttua, sekoitettiin 90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kirkas liuos jäähdytettiin alle 5°C:n jäähauteella, minkä jälkeen lisättiin tipottain 0-5°C:ssa liuos, jossa oli noin ekvimolaarinen määrä yllä mainittua isosyanaat- 16 59803 tia (valmistettu raakamuodossa 30 mmoolista bentsyylietyylifosfon-amidaattia) 30 ml:ssa dikloorimetaania. Reaktioseoksen sekoitusta jatkettiin 5°C:ssa, ja amoksisilliinin muuttumista seurattiin ohut-levykromatografiällä (piihappo; 5:4:1 etyyliasetaatti-asetoni-etikka-happoseos; kaksoistäplä Rf noin 0,7). Noin 30 minuutin lisäsekoituk-sen jälkeen oli tapahtunut kohtuullinen muuttuminen halutuksi penisilliiniksi. Koska tulos ei parantunut 60 minuutin sekoituksen jälkeen, suoritettiin seokselle tavanomaiset eristystoimenpiteet. Lisättiin pieni määrä etyyliasetaattia ja reaktioseos väkevöitiin tyhjössä pieneen tilavuuteen ja kaadettiin sen jälkeen yhtä suuret määrät dietyylieetteriä ja jäävettä sisältävään seokseen, jonka pH oli 7,0. Kerrokset erotettiin, orgaaninen kerros hyljättiin ja vesikerros pestiin joitakin kertoja etyyliasetaatti-dietyylieetteriseoksella (1:1). Jäljelle jäänyt vesiliuos tehtiin happameksi pH 3,8:aan ja uutettiin 10 kertaa yhtä suurella tilavuudella etyyliasetaattia. Nämä uutokset yhdistettiin, pestiin 4 kertaa 20 ml:11a natriumkloridilla kyllästettyä jäävettä, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä noin 500 ml:n tilavuuteen. Saostunut pieni ainemäärä suodatettiin. Lisättiin natrium-a-etyyliheksanoaatin liuos etyyliasetaatissa. Muodostunut sakka koottiin suodattamalla, pestiin kuivalla etyyliasetaatilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin tyhjössä. Otsikon yhdisteen saanto oli 3,3 g (noin 40 % laskettuna amoksisilliinistä; noin 18 % laskettuna fosfonamidista); ohut-levykromatografian, IR- ja PMR-spektrien mukaan lopputuotteen puhtaus 011 yli 90 %.

Asymmetrisesti substituoitu fosforia sisältävä ryhmä muodostaa yhdisteessä kiraalikeskuksen, ja sen johdosta yhdiste voi esiintyä kahtena muotona. Tässä penisilliinissä tämä ilmiö näkyy ohutlevykromatogram-missa (kaksi vierekkäistä täplää) ja PMR-spektrissä.

IR (KBr-levy, arvot ovat cm ^einä): - 3100-3500 (leveä ja intensiivinen), olkapäitä noin 3080, 3000, 2930 ja 2900, 1765, noin 1690 (olkapää), 1665, 1600-1620, 1520, 1460 - 1400, 1325, noin 126O-H8O, ± 1020, 915, 350, 745.

PMR (dg-dimetyylisulfoksidi (DMSO), 60 Mc, 2,2-dimetyylisilapentaani- 5-sulfonaatti (DSS) vertailuna, δ-arvot ppm:nä): erittäin mutkikas 11H absorptioalue noin 0,7-2,2, joka sisältää singletit 1,45 ja 1,57; 3,98 (s, 1H), 4,95 (kahden dubletin keskikohta, 6v «s: 0,7, J^7,6 cps, 2H), noin 5,3-5,5 (multipletti, 3H), 6,65-7,25 (q) ja noin 7,3 (2 singlettiä) yhdessä 9H; 7,7 (d, J'3*7,5 cps, 0,8H), noin 8,4 (leveä, noin 0,6H) 8,85 (d, JÄ8,5 cps, 0,8H).

17 59803

Esimerkki 2 Esimerkissä 5 käytettävän lähtöaineen^ natrium-D-6-{a-_/3- (bent syy lioksi (et oksi) f osfinyy li )ureid£7~P~ hydroksibentsyylikarbonamidoipenisillanaatin, valmistus

y=\ 8 /s X

Λ—CH-C-NH-CH-CH C(CH3)2

'—' ψ I I I

' 0 = C- N - CH-COONa Lähtien etyylifosforodikloridaatista (C2H^OP(0)C12) valmistettiin bentsyylioksi(etoksi)fosfinyyliamini /TCgH^C^O)(02Η^0)Ρ(0)ΝΗ2_7 standardimenetelmällä, jossa suoritettiin peräkkäin reaktiot bentsyyli-alkoholi/pyridiinin ja ylimäärin käytetyn nestemäisen ammoniakin kanssa dietyylieetterissä. Raaka amidi (noin 30 mmoolia) muutettiin esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä raa’aksi bentsyyli(etyyli)fosforoiso-syanatidaatiksi /JCgH^CHgO)(C2H^0)P(0)NC07, joka IR-spektrin mukaan sisälsi noin 15 mmoolia isosyanattia.

Esimerkin 1 mukaisesti suspensiota, jossa oli 5,5 g (noin 15 mmoolia) amoksisilliiniä 25 ml:ssa dikloorimetaania, käsiteltiin huoneen lämpötilassa 7,5 ml:11a (noin 30 mmoolia) BSA:ta. 60 minuutin lisäsekoi-tuksen jälkeen huoneen lämpötilassa kirkas liuos jäähdytettiin 0°C:een. Tähän liuokseen lisättiin yllä mainittu fosforoisosyanatidaatti 25 ml:ssa dikloorimetaania 0° - +5°C:ssa noin 5 minuutin kuluessa. Lisäyksen päättymisestä noin parin minuutin kuluttua otettu ohutlevy-kromatogrammi osoitti amoksisilliinin muuttuneen tyydyttävästi halutuksi penisilliiniksi (Rf noin 0,65 piihappogeelillä etyyliasetaatti-asetoni-etikkahapposeoksella 5:4:1). Reaktioseosta sekoitettiin jää-veden (pH 7,0) ja pienen määrän etyyliasetaattia kanssa. Dikloorime-taani poistettiin tyhjössä ja pH 7,0:ssa oleva liuos pestiin 3 kertaa etyyliasetaatti-dietyyli-eetteriseoksella 1:1. Saman seoksen avulla penisilliini poistettiin vesiliuoksestaan pH 3,5~4,0:ssa. Yhdistetyt happamet uutokset pestiin useampaan kertaan pienillä määrillä natrium-kloridilla kyllästettyä jäävettä, kuivattiin vedettömällä magnesium-sulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin tyhjössä. Lopullista etyyli-asetaattiliuosta käsiteltiin natrium-a-etyyliheksanoaatin etyyliase-taattiliuoksella jne. Otsikon yhdisteen saanto oli 8,0 g (noin 80 % laskettuna amoksisilliinista; noin 40 % laskettuna raa'asta bentsyyli- is 59803 oksi(etoksi)fosfinyyliamidista). Ohutlevykromatogrammit ja PMR-spektri osoittivat vähintään 95 $:n puhtautta.

IR (KBr-levy, arvot cm ^reinä): noin 3200-3600 (leveä ja intensiivinen), olkapäät noin 3060 ja 2935, 2980, 1768, noin 1690 (olkapää), 1670, 1610, 1535 (olkapää), 1515, 1480, 1400, 1375 (olkapää), noin 1220-1260, 1180, 1135, 1040 ja 1020, 920, 840, 745, 700.

PMR* (dg-DMSO-DCC^D-seos noin 4:1, 60 Mc, DSS, δ-arvot ppmieinä): 1,26 (kahden läheisen tripletin keskikohta, J«fc:7,5 cps), 1,46 (s) ja 1,58 (s) kaikki yhdessä 9H; noin 3,85-4,35 (multipletti) ja 4,27 (s) yhdessä 3H; 5,35-3,6 (AB-q, J<=e-4,1 cps) ja 5,46 (s) yhdessä 3H; 6,7“ 7,3 (q-tapainen, J^8,5 cps), ja noin 7,4 (kaksinkertainen signaali) yhdessä 9H.

X . ♦

Yhdisteen spektrissä DMSO:ssa oli tavalliset 3 NH absorptiota, kaksi dublettia noin 7,7 ja 8,9 ja leveä absorptio noin 8,7.

Analogisella tavalla valmistettiin natrium-D-6-ia-_/3~(hentsyylioksi-(met oksi )f osf inyy li )ureido7-p-hydroks'ibent syy likarbonamido) penis i 11a-naatti.

IR (sama): - 3300-3500 (leveä ja intensiivinen), - 3050 (olkapää), ± 2950 (olkapää), 1765, noin 1690 (olkapää), 1660, 1590-1610, 1550 (olkapää), 1515, 1460, 1400, 1325, noin 1220-1280, 1180 (olkapää), 1135, 1045 (intensiivinen) olkapäät, 930, 850, 790, 745, 700.

PMR (EMSO/sama): 1,46 ja 1,56 (6H), 3,69 (kahden lähekkäisen dubletin keskikohta, 1,3 cps, J-»»ll,7 cps, 3H), 3,98 (s, 1H), 5,05 (kahden dubletin keskikohta, δν^0,5 cps, J<^7,5 cps, 2H), noin 5,25-5,5 (multipletti, 3H), 6,65-7,3 (q) ja noin 7,35 (2 signaalia) yhdessä 9H, 7,8 (d, <1^8 cps, 0,8H), noin 8,4 (sangen leveä, <1H), 8,9 (J 8 cps, 0,8H) .

Esimerkki 3 Esimerkissä 7 käytettävän lähtöaineen, Natrium-D-6-{a-/3'-(dibentsyy lioksifosfinyyli )ureido7-p-hydroksibent-syylikarbonamido}penisillanaatin,valmistus 19 59803 0 s /s:=\ fi _\ HO-(v Λ-CH-C-NH-CH-CH C(CH,)- I I I 32 £_0 0 = C-N-CH-COONa f>«2-0 0 = P 7= X°CH2-0 O.H. Friedman’in et ai. /T. Am. Chem. Soc., 7^.j 916 (1954_)7 kuvaamalla tavalla fosforitrikloridia (PCl-j) käsiteltiin pyridiinin läsnäollessa 3 ekvivalentilla bentsyylialkoholia kuivassa bentseenissä, jolloin tulokseksi saatiin ja eristettiin 78,6 %:n saannolla dibentsyyli-fosfonaattia 2TC^H^CH20)2P(0)H7. Tämä tuote liuotettiin kuivaan hiili-tetrakloridiin, ja liuokseen vietiin ammoniakkikaasua (maksimireak-tiolämpötila oli 38°C). Uudelleenkiteyttämällä hiilitetrakloridista saatiin 84,4 %:n saannolla dibentsyylifosforamidaattia _/TCgH^CH20)2P(0)NH2_7, sp. 104-105°C. Tämä yhdiste muutettiin tavallisella tavalla kuten esimerkissä 1 kuvattiin raa'aksi dibentsyyli-fosfori-isosyanatidaatiksi 7TCgH^CH20)2P(0)NC07.

Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla suspensiota, jossa oli 2,2 g (noin 6 mmoolia) amoksisilliinia 10 mlrssa dikloorimetaania, käsiteltiin huoneen lämpötilassa 3 ml:11a (noin 12 mmoolia) BSA:ta. Kun sekoitusta oli jatkettu 60 minuuttia, kirkas liuos jäähdytettiin 0°C:een, sitten lisättiin tipoittain liuos, jossa oli noin 6 mmoolia yllä mainittua fosfori-isosyanatidaattia 15 mlrssa dikloorimetaania. Reaktio-seoksen lämpötila pidettiin 0° - -5°C:ssa. Joidenkin minuuttien kuluttua otettu ohut levykromatogrammi osoitti tyydyttävää muuttumista halutuksi penisilliiniksi (Rf noin 0,6 piihappogeelillä etyyliasetaat-ti-asetoni-etikkahapposeoksella 5:4:1). Reaktioseos (pH 7,0) kaadettiin jääveden (100 ml) ja dietyylieetterin (100 ml) seokseen. Jotta saataisiin kirkas 2-kerrossysteemi, lisättiin 300 ml jäävettä ja jonkin verran natriumkloridia. Kerrokset erotettiin, orgaaninen kerros hyljättiin ja vesikerros pestiin joitakin kertoja dietyylieetterillä pH 7,0:ssa. Saatu vesikerros tehtiin happamaksi laimealla kloorivety-hapolla ja uutettiin pH 3>5~4,0:ssa etyyliasetaatilla. Näistä uutoksista saatiin samalla tavalla kuin esimerkeissä 1 ja 2 3,9 g (noin 90 % laskettuna amoksisilliinista ja noin 55 % laskettuna fosforami-daatista) olennaisen puhdasta otsikon yhdistettä.

20 5 9 8 0 3 IR (KBr-levy, arvot cm 1 teinä): noin 3200-5500 (leveä ja intensiivinen), olkapäät 3050 ja 2980, 1780, 1680, 1620, 1560 (olkapää), 1520, 1465, 1 1^00, 1330, 1230-1270, 1190 (olkapää), 1140 (olkapää), 1030 olkapäät kohdissa 1050 ja 1015, 935, 750, 710.

PMR (dg-DMSO, 60 Mc, DSS δ-arvot ppm:nä): 1,45 ja 1,56 (6H), 4,05 (s, 1H), 5,05 (d, J^;7,5 cps, 4H), noin 5,2-5,6 (multipletti, 3H), 6,65-7,3 (q-tapainen, Jcps) ja 7,35 yhdessä 14H; 7,7 (d, 8 cps, noin 0,8H), noin 8,9 (d ja leveä s, noin 1,4H).

Esimerkki 4 D-6-{a-/3_(hydroksi( etyyli )fosfinyyli )ureido7 -p-hydroksibent syyli-karbonamido penisillaanihapon dinatriumsuolan valmistus 0 q /=\ I / \ HO-7 // - CH C(CH5)2

'- NH I I I

_0 0 = c- N-CH-COONa

f/ c2H

0 = P^ 5 ^ 0-N a 3,06 g (4,8 mmoolia) natrium-D-6-ia-/3-(bentsyylioksi(etyyli)fosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penisillanaattia (valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla) liuotettiin jääkylmään etanolin (35 ml) ja veden (5 ml) seokseen. Magneettisekoittajalla sekoitettuun liuokseen lisättiin 1,5 g 10 %:sta palladiumhiiltä. Jatkaen jäillä jäähdytystä liuoksen pintaan johdettiin normaalipaineessa vetyä. Pelkistyksen aikana lisättiin 410 mg (4,9 mmoolia) natriumbikarbonaattia pieninä annoksina. Koska pelkistys ei ollut päättynyt 4 tunnin kuluessa, reaktioseos jätettiin seisomaan yöksi 0°C:een. Seuraavana päivänä lisättiin vielä 1 g katalysaattoria ja 10 ml etanolia ja vedyn johtamista jatkettiin, kunnes pelkistyminen oli täydellinen (joitakin tunteja). Seos suodatettiin imulla käyttäen suodatinapua. Suodos haihdutettiin tyhjössä, jäännökseen lisättiin abs. etanolia ja bentseeniä, ja seos haihdutettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin mahdollisimman pieneen vesimäärään. Liuoksen tilavuus kaksinkertaistettiin lisäämällä etanolia, sitten lisättiin asetonia, kunnes liuos sameni lievästi. Lisättiin suodatinapua samalla sekoittaen, ja seos suodatettiin. Suodokseen lisättiin kuivaa asetonia. Saatu sakka suodatettiin, pestiin asetonilla ja kuivattiin tyhjössä. Otsikon yhdisteen saanto 2i 59803 oli 2,6 g (noin 90 %). Lopputuotteen puhtaus oli 90 % tai yli. Ohut-levykromatogrammissa piihappogeelillä ja käyttäen n-butanoli-etikka-happo-vesiseosta 4:1:1 yhdisteen Rf-arvo oli noin 0,1.

IR (KBr-levy, arvot cm ^:einä: 3100-3600 (leveä ja intensiivinen) noin 3050 (olkapää), 2980, 1765, 1640-1660, 1600-1615, noin 1560 (olkapää), 1515, 1460, 1400 , 1370, - 1325, ± 1275, 1240 , 1180, 1135 (olkapää), 1060, 900, 850, noin 730.

PMR (dg-DMSO-DCC^D-seos 4:1, 60 Mc, DSS, δ-arvot ppm:nä): sangen mutkikas 11H absorptioalue noin 0,7-2,2, jossa on singletit 1,46 ja 1,59; 4,24 (s, 1H), noin 5,3~5,6 (AB-q, J^i4 cps ja singletti, 3H), 6,7-7,3 (q-tapainen, J^8,0 cps, 4H).

Esimerkki 5 D-6-{a-/_3“ (hydroksi (et oksi) fosf inyy li )ureido7-p-hydroksibentsyyli-karbonamido}penisillaanihapon dinatriumsuolan valmistus

/=\ S

HO-(v /VCH-C-NH-CH- CH C(CHx)Q

1 1 1 32 (1_0 0 = C- N-CH-COONa NH (Λ/-1 „ I OCoH,-

osP'T

^ONa

Olennaisesti samalla tavalla kuin esimerkissä 4 vetyä johdetaan 0°C: ssa magneettisesti sekoitetun seoksen pintaan, jossa·seoksessa on 3 g 10 %:sta palladiumhiiltä ja natrium-D-ö-ia-ZT-ibentsyylioksiietoksi)-fosfinyyli)ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido)penisillanaatin (6,3 g, 9,7 mmoolia) (valmistettu esimerkin 2 mukaan) liuosta etanolin (60 ml) ja veden (10 ml) seoksessa. Katalyyttisen pelkistyksen aikana seokseen lisättiin annoksittain 0,82 g (9,7 mmoolia) natrium-bikarbonaattiliuosta 3 ml:ssa vettä. Pelkistys oli päättynyt 5,5 tunnissa. Reaktioseos suodatettiin imulla käyttäen suodatinapua, ja suo-dos haihdutettiin tyhjössä. Loppuvesi poistettiin lisäämällä toluee-nia ja haihduttamalla jälleen kuiviin tyhjössä. Jäännös sekoitettiin 150 ml:aan puhdasta kuivaa asetonia. Saatu väritön kiinteä aine erotettiin suodattamalla, pestiin kuivalla asetonilla ja kuivattiin tyhjössä.

Otsikon yhdisteen saanto 5,54 g (93 %)· Lopputuote oli puhdas.

22 59803 IR (KBr-levy, arvot cm 1:einä): noin 3200-3600 (leveä ja intensiivinen), 2975, 2930 (olkapää), 1765, 1 1650-1670, - 1610, 1550 (olkapää), 1515, 1460, 1400, 1375 (olkapää), ± 1325, noin 1240 (leveä), 1180, 1135, 1085, 1050, 955, 900, 770.

PMR (dg-DMS0-DC02D-seos 5:1, DSS, δ-arvot ppm:nä): 1,25 (kahden lähekkäisen tripletin keskikohta, J^7,5 cps), 1,46 (s) ja 1,59 (s) kaikki yhdessä 9H; noin 3*75-4,1 (multipletti, 2H), 4,22 (s, 1H), 5,42 (s) ja noin 5,3-5,6 (leventynyt AB-q) yhdessä 3H; 6,65-7,35 (q-tapainen, J<^8,5 cps, 4H).

Analogisella tavalla valmistettiin D-6-{a-/3-(hydroksi(metoksi)fosfi-nyyli)ureido-p-hydroksibentsyylikarbonamido)penisillaanihapon dinat-riumsuola.

IR (sama): noin 328Ο-36ΟΟ (leveä ja intensiivinen, - 2950 (olkapää), 1760, 1680 (olkapää), noin 1645-1665, - 1600, - 1540, 1500, 1455, 1395, 1370 (olkapää), 1345 (olkapää), 1310-1330, 1215-1245, Il80 (olkapää), 1125, 1080 (intensiivinen), 1045, 895, - 770.

PMR (dg-DMS0-DC02D-seos 5:1, 60 Mc, DSS, δ-arvot ppm:nä): 1,47 ja 1,59 (6H), 3,50 (d, J«*ll,6 cps, 3H), 4,27 (s, 1H), 5,44 (s) ja noin 5,35-5,6 (leventynyt AB-q) yhdessä 3H, 6,7-7,35 (q-tapainen, 4H).

Esimerkki 6 Esimerkissä 3 valmistetun lähtöaineen monodebentsyloiminen D-6-(a-/5-(hydroksi(bentsyylioksi)fosfinyyli)ureidoZ-p-hydroksibent-syy likarbonamido } penisillaanihapon dinatriumsuolaksi

0 S

HO-/ VcH-C-NH-CE- CH

I I I 32 'C_Q 0=c- N- CH-COONa o-<ocH-0 ^ONa 345 mg (0,47 mmoolia) natrium-D-6-{a-/_3“(dibentsyylioksi(fosfinyyli)-ureido7-p-hydroksibentsyylikarbonamido}penisillanaattia (valmistettu 'esimerkissä 3 esitetyllä tavalla) ja 80 mg (0,95 mmoolia) natriumbikarbonaattia liuotettiin 10 ml:aan vettä. Lisättiin 0,1 g 10 %:sta palladiumhiiltä, sitten seokseen johdettiin vetyä 0°C:ssa. 5 tunnin 23 59803 sekoituksen jälkeen ohutlevykromatogrammi osoitti, että lähtöaine dibentsyyliesteri oli täysin hävinnyt reaktioseoksesta ja samalla hiilidioksidin kehitys oli huomattavasti hidastunut. Reaktioseoksen pH oli noin 8,0. Seos suodatettiin imulla käyttäen suodatinapua, ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Jäännöstä trituroitiin kuivan asetonin kanssa, ja saatu kiinteä aine suodatettiin. Jättämällä huomioonottamatta epäorgaaniset suolat saatiin ohutlevykromatogrammilla ja PMR-spektrillä lopputuotteen otsikon penisilliiniyhdisteen pitoisuudeksi 85-90 %. Epäpuhtauksina oli suhteellisen pieniä määriä hajoamistuotetta tai -tuotteita, kaksinkertaisesti pelkistynyttä (so. di-debentsy-loitua) penisilliiniä ja asetonia. Koska reaktiossa käytettiin kaksi ekvivalenttia natriumbikarbonaattia, lopputuotteen voitiin odottaa sisältävän jonkin verran vähemmän kuin 1 mooli natriumbikarbonaattia penisilliinimoolia kohti. Ohutlevykromatogrammilla (piihappogeeli, metanoli-etikkahappo-vesiseos 95:5:5) otsikon yhdisteellä oli Rf noin 0,9 (UV-positiivinen), kun taas di-debentsyloidun penisilliinin Rf oli noin 0,25· IR (KBr-levy, arvot cm "'"reinä): noin 3100-3600, olkapäät - 3050, 2970 ja 2935, 1765, 1690 (olkapää), 1640-1660, 1595-1615, 1 1550 (olkapää), 1515, 1^55, 1400, 1380 (olkapää), 1320-1340, 1220-1260, 1180, 1135, 1090 (intensiivinen), 1010-1035, 985, 900, 870, 845, 750, 710.

PMR (dg-DMSO-DCC^D-seos 4:1, 60 Mc, DSS, δ-arvot ppm:nä): 1,48 ja 1.60 (6H), 4,26 (s, 1H), 4,86 (d, J-^7,0 cps, 2H), 5,45 (s) ja 5,35- 5.60 (AB-q, Jä*4,0 cps) yhdessä 3H) ; 6,65-7,3 (q-tapainen, J<=«8,2 cps) ja noin 7,35'yhdessä 9H.

Yllä kuvattu koe osoittaa selvästi, että on täysin mahdollista saada monodebentsyloitua pelkistystuotetta puhtaana johtuen toisen pelkis-tysvaiheen olennaisesti hitaammasta reaktiosta. Monodebentsyloidun tuotteen saamiseksi on ilmeistä, että tulisi käyttää vain yksi ekvivalentti natriumbikarbonaattia, ja kaksinkertaisesti pelkistetyn tuotteen muodostuminen saadaan edelleen vähenemään joko käyttämällä lievästi myrkyttynyttä katalysaattoria ja/tai keskeyttämällä pelkistys juuri ennen lähtöaineen täydellistä muuttumista, jolloin lähtöaine voidaan helposti erottaa lopputuotteesta pesemällä etanolilla.

Esimerkki 7 D-6-{a-/J- (dihydroksifosf inyy li )ureid£7-p-hydroksibentsyy likarbon-amido } penisillaanihapon trinatriumsuolan valmistus 24 59803 690 mg (0,94 mmoolia) natrium-D-6-{a-/3-(dibentsyylioksifosfinyyli)-ureido7-p-hydroksibent syylikarbonamido}penisillanaattia (valmistettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla) ja 168 mg (2 mmoolia) natriumbikarbonaattia liuotettiin 15 mitään vettä, ja liuokseen lisättiin 0,1 g 10 %:sta palladiumhiiltä ja sitten liuokseen johdettiin vetyä. 5 tunnin sekoituksen jälkeen huoneen lämpötilassa lisättiin vielä 0,2 g 10 %:sta palladiumhiiltä ja pelkistystä jatkettiin. Kaikkiaan 6 tunnin sekoituksen jälkeen ohutlevykromatogrammi osoitti lähtöaineen täydellisesti muuttuneen esimerkin 6 tuotteen ja otsikon penisilliinin seokseksi. Pelkistystä jatkettiin yli yön. Seuraavana päivänä lisättiin vielä 0,5 g 10 %\sta palladiumhiiltä. Pelkistystä jatkettiin sitten 2,5 tuntia. Hiilidioksidin kehitys lakkasi, ja ohutlevykromatogrammi osoitti, että nyt esimerkin 6 tuote oli täysin hävinnyt. Lisättiin asetonia, ja seos suodatettiin imulla käyttäen suodatinapua, ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Jäännöstä trituroitiin absoluuttisen etanolin kanssa. Saatu kiinteä aine suodatettiin, pestiin etanolilla ja kuivalla asetonilla ja kuivattiin tyhjössä.

Otsikon yhdisteen saanto oli 0,5 g (noin 80 %); ohutlevykromato-grammin ja PMR-spektrin mukaan lopputuotteen puhtausaste oli noin 90 %.

IR (sama): noin 3100-3600, 2970 (olkapää), 1760, 1640-1660 (erittäin intensiivinen), 1600, 1540-1560, 1510, 1450, 1400, 1370 (olkapää), 1320, noin 1250, jossa olkapäät ll80, 1135 (olkapää), 1110 (intensiivinen), 985 (intensiivinen), 890, 840, 790.

PMR (D2O, 60 Mc, DSS, 6-arvot ppm:nä); 1,46 ja 1,53 (6H), 4,20 (s, 1H), 5,2 (leveähkö s, 1H), 5,44 (s, 2H), 6,8-7,45 (q-tapainen, 4H).

Esimerkki 8

Natrium-D-6-{a-/3~(dietoksifosfinyyli)ureido7-p- hydroksi- bentsyylikarbonamido}penisillanaatin valmistus_ 15 ml dikloorimetaania lisättiin suspensioon, jossa oli 1,0 mmoolia a-/3-(dietoksifosfinyyli)ureido7-4-hydroksifenyylieti^kahappoa ja 0,25 g (1,2 mmoolia) 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidihydrokloridia 4 ml:ssa tetrahydrofuraania. Noin 7 minuutin sekoituksen jälkeen lisättiin 0,25g(l,l mmoolia) 6-aminopenisillaani- 25 59803 happoa, joka oli etukäteen silyloitu 0,l6 ml:11a (1,1 mmoolia) trietyyliamiinia (TEA) ja 0,14 ml:11a (1,1 mmoolia) trimetyylikloorisilaania (TMCS) 2,5 ml:ssa dikloorimetaania. 2 tunnin kuluttua reaktio· oli TLC:n (Rf = 0,7 etikka-happoetyyliasetaatti-asetoniseoksessa 1:5:4) mukaan noin 50 #:nen. Reaktioseos kaadettiin öljymäisen sakan erottamisen jälkeen veteen (pH = 7) ja uutettiin etyyliasetaatilla. pH säädettiin 4,7:ään, sitten uutettiin etyyliasetaatilla. Uutos kuivattiin mGSO^rllä, suodatettiin, etyyliasetaatti haihdutettiin osittain pois, sitten lisättiin natriumheksanoaattia ja haluttu tuote, jonka rakenne varmisetttiin PMRrllä, eristettiin 46,6 %:n saannolla; tuote oli TLC:n mukaan jokseenkin puhdasta.

a“/3-(dietoksifosfinyyli)-ureido7-4-hydroksifenyylietikkahapon sulamispiste oli l66-l69°C (hajosi), infrapuna: 1040, 1220, 1640 ja 1705 cm 1 ja PMR (dg-DMS0), 60 Mc, TMS, δ-arvot ppm:na): 1,3 (m, CH3); 4,1 (m, CHg), 5,15 (d, CH), 7,0 (q, arom. H).

Claims (1)

1. 26 5 9 8 0 3 Patenttivaatimus Menetelmä yleisen kaavan _j~\ ii /-ch3 H0 \ / ^H_C_NH~CH “CH C (I) W NH I I |XCH I 0 = C-N -CH -3 Y I COOE mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten, penisillaanihappo-johdannaisten valmistamiseksi, jossa kaavassa E on vetyatomi tai suolan muodostava kationi, ja Y on kaavan /Z2 -C -NH -P (II) il l|\ o o i\ mukainen ryhmä, jossa ja Z^ ovat samanlaisia tai erilaisia ja kumpikin on alempi alkoksiryhmä, alempi alkyyliryhmä, hydroksiryh-mä tai ryhmä -OM, jossa M on suolan muodostava kationi, ja niiden suolojen hydraattien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) yleisen kaavan /—\ \ /CH3 Q—0 \VcH-C-NH-CH -CH C (IV) I ii I I I X0H, Q-NH 0 0=C- N -CH COOE' mukainen yhdiste, jossa Q on vetyatomi tai tavanomainen amino- tai hydroksisuojaryhmä ja E' on tavanomainen karboksisuojaryhmä saatetaan reagoimaan yleisen kaavan 7 1 0=C=N-P ' (V) H \z· O 2 jossa Z^ ja Z^ merkitsevät samaa kuin edellä Z^ ja Z2 tai ovat ryhmiä, jotka voidaan helposti muuttaa tällaisiksi ryhmiksi hydro-genoimalla, mukaisen yhdisteen kanssa orgaanisessa liuottimessa läm- 59803 27 pötila-alueella -30° - +30°C, edullisesti -5° - +5°C ja edullisesti vedettömissä olosuhteissa, ja sen jälkeen näin saaduista yhdisteistä poistetaan mahdolliset suojaryhmät sinänsä tunnetuilla menetelmillä tai että b) Yleisen kaavan Q-0 ~\^ ^— CH-COOH NH y· mukainen yhdiste, jossa Q merkitsee samaa kuin yllä, ja jossa Y* 7 * / 2 on kaavan - C - NH - P mukainen ryhmä, jossa Zj ja Z£ mer- 0 kitsevät samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 6-aminopenisil-laanihapon tai sen johdannaisen kanssa käyttäen karbodi-imidiä kondensoimisaineena, ja sen jälkeen näin saaduista yhdisteistä mahdolliset suojaryhmät poistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä ja saadut hapot muutetaan suoloiksi. Förfarande för framställning av terapeutiskt användbara penicillan-syraderivat med den allmänna formeln 0 s HO 7—CH-C-NH-CH - CH^ (I) \=/1 I INh NH 1 CH3 j 0 = C -N -CH ^ Y I COOE väri E betecknar väte eller en saltbildande katjon och Y beteck-nar en grupp med formeln -C -NH-P (II) li liN-z1 o o 1 väri Z^ och lika eller olika och vardera betecknar lägalkbxi, 28 5 9 8 0 3 lägalkyl, hydroxyl eller en grupp -OM, väri M betecknar en salt-bildande katjon, samt hydrater av salterna, kännetecknat av att a) en förening med den allmänna formeln /"X /S\ /CH3 Q-0-// \VCH- C-NH-CH -CH p (IV) w I J> I T I ch3 Q-NH 0 = C - N - CH COOE' väri Q. betecknar väte eller en vanlig grupp, som skyddar amino-eller hydroxigruppen, och E' betecknar en vanlig grupp som skyddar karboxylgruppen, omsättes med en förening med formeln 7' X' 1 0=C=N-P (V) II \ 0 z^ vari Z| och Z^ har samma betydelse som Z^ och Z2 ovan eller betecknar grupper som lätt kan överföras genom hydrering till dessa 'grupper, i ett organiskt lösningsmedel vid en temperatur inom omradet frän -30° till +30°C, lämpligen da mellan -5 och +5°G> och företrädesvis under vattenfria betingelser, ätföljt av ett avlägs-nande av de eventuella skyddsgrupperna frän de sälunda erhällna föreningarna med hjälp av i och för sig kända förfaranden, eller att b) en förening med den allmänna formeln Q-° —CH-COOH NH Y' väri Q har tidigare angiven betydelse och vari Y' är en grupp 7» enligt formeln - C - MH - P , vari Z^ och Z^ har samma bety- 0 0 ^ Z^ delse som tidigare, omsättes med β-aminopenicillansyra eller med ett derivat därav i närvaro av en karbodimid som kondensationsme-