FI59790B - Ny-glutamyl-p-nitroanilidderivat som aer anvaendbara som substrat vid bestaemning av ny-glutamyltranspeptidas - Google Patents

Description

E5F*1 ΓΒΐ (11)KUULUTUS|ULKAISU C970n

Ή3Γα l J i ; UTLÄGGNINGSSKRIFT oy/yQ

C ' tl v J 2 J

^ ' (SI) K*Jk?/lnt.a.^ ^07 C 103/50, 143/58 SUOMI—FINLAND 0*) PWMttlhakmnu·—PMMaraekninc 3670/73 (22) HaktmiipiM—Ameknffigarfag 2d. 11. 73 * (23) AlkupUvft—GIMfh«cadag 28.11.73

(41) Tullut JulkiMksI — Bllvlt offantllg O6.O6.7U

Patentti- ja rekisterihallitus .. _ ________ ___ . ,, „ , _ ' f____ , (44) NlhtiYikilpwoo J» kuuLfuliulwn pvm. —

Patent- och registerstyrelsen ' · AimMcm uttagd och utUkriftM publktnd 30.06.8l (32)(33)(31) Pyy4«tt)r «udkuu*—B#flH priorlt* 05.12.72 03.07.73 Saksan Liittotasavalta-Forbunds-• republiken Tyskland(DE) P 2259512.6, p 2333798.6 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Forbundsrepubliken TYskland(DE) (72) Erich Bemt, Mtinchen, Wolfgang Gruber, Garatshausen, Erich Haid, Tutzing/ Obb., Fritz Stähler, Tutzing/Obb., August Wilhelm Wahlefeld, Weilheim/Obb., Glinter Weimann, Tutzing/Obb., Saksan Liittotasavalta-Forbundsrepubliken Tyskland(DE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) γ-Glutamyyli-p-nitroanilidijohdannaiset, jotka ovat käyttökelpoisia substraatteina Y-glutamyylitranspeptidaasin määrityksessä - Ύ-Glutamyl-p-nitroanilid-derivat, som är användbara som substrat vid bestämning av γ-glutamyltrans-peptidas

Keksinnön kohteena on yhdiste, joka on käyttökelpoinen substraattina γ-glutamyylitranspeptidaasin määrityksessä.

γ-Glutamyylitranspeptidaasin (γ-GT) määritys suoritetaan kliinis-kemiallisessa laboratoriossa yhä useammin maksasairauksien tutkimuksen yhteydessä. Tunnetun menetelmän mukaisesti määritys tapahtuu seuraavan reaktion mukaan:

^Y-GT

γ-glutamyyli-p-nitroanilidi + glysyyliglysiini ^ ^ p-nitro- aniliini + glutamyyliglysyyliglysiini

Keltaisen p-nitroaniliinin vapautumisen nopeutta voidaan seurata optisesti ja se on γ-GT.-n aktiivisuuden mitta.

Tämän menetelmän rutiininomaiselle käytölle on pahana esteenä γ-glutamyyli-p-nitroanilidi-substraatin huono kestävyys ja vaikealiukoisuus. Yhdiste saadaan liukenemaan vain hyvin vaikeasti ja liuoksena se kestää vain lyhyen ajan (noin 2 tuntia). Sen vuoksi on ollut tarpeen valmistaa liuoksia kulloinkin vain suhteellisen harvoja, lyhyen ajan sisällä suoritettavia määrityksiä varten. Reagenssiliuosten säilyttäminen on ollut mahdotonta. Toinen varjopuoli on siinä, että aine on täytynyt liuottaa lämpöti- 2 59790 lassa 50-60°C, mutta tämän lämpötilan yläpuolella se hydrolysoituu itsestään. Tällainen hydrolyysi vaikuttaa liuosten optiseen ekstinktioon, mikä juuri mittauksissa on ratkaisevaa, suuressa määrin. Tämä on erikoisen suuri epäkohta, kun γ-GT-määritys suoritetaan analyysiautomaateilla, koska tällöin muodostuu absorptio korkeaksi ja korkeampia aktiivisuuksia ei voida mitata kyllin täsmällisesti. Tästä syystä on tähän asti mitattu suboptimaaleja, vain 3-4 mmoolin suuruisia, substraattikonsentraatioita, optimaalisen konsentraation ollessa noin 6 mmoolia (Olin.Chim.Acta 31 (1971), 175-179).

Edellä esitetyt haitat on voitu osittain välttää käyttämällä reagenssia, joka on kuvattu saksalaisessa kuulutusjulkaisussa n:o 2 042 829; tässä menetelmässä on liuoksessa läsnä jotakin pinta-aktiivista ainetta ja polyvinyylipyrrolidonia. Tämän reagens-sin avulla voidaan γ-glutamyyli-p-nitroanilidin liukoisuusominai-suuksia parantaa huomattavasti ja liuosten kestävyys lisääntyy myös huomattavasti. Mutta myös tässä tapauksessa on välttämätöntä lämmittää 50-60°C:een, jolloin on olemassa itsestään tapahtuvan hydrolyysin vaara ja tämän johdosta mittauksen epätarkkuus.

Tämän vuoksi on ollut tarpeellista hankkia uusia yhdisteitä, joiden liukoisuus on ensiksikin parempi kuin γ-glutamyyli-p-nitroanilidin ja jotka toiseksi ovat vähintäin yhtä hyviä entsyymi y-GT:n substraatteja.

Keksinnön kohteena ovat uudet yhdisteet, joiden yleinen kaava on / H / R - N JJ/ n02 NHp 0

I ά II

jossa R merkitsee γ-glutamyylijäännöstä HOOC-CH-CHg-CI^-C-ja X tarkoittaa COOH- tai SO^H-ryhmää tai niiden alkali-, maa-alkali-, ammonium- ja aminosuolat.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden asemat 2, 5 ja 6 ovat enimmäkseen ilman substituenttia. Mutta yhdisteissä voi olla myös yksi 59790 3 tai useampia alempia alkyyliryhmiä, joissa on 1-3 hiiliatomia.

Keksinnön mukaiset yhdisteet poistavat edellä mainitut γ-glutamyyli-p-nitroanilidin haitat ja samalla kun ne ovat erittäin hyvin liukenevia, ne muodostavat entsyymi γ-GTrn oikein hyvän substraatin. Etenkin jälkimmäinen seikka on yllättävää, koska useimpia γ-glutamyyli-p-nitroanilidin johdannaisia, joissa on liukoisuutta parantavia substituentteja, ei voida käyttää γ-GTrn substraattina.

Tämä käy ilmi jäljessä tulevaan taulukkoon kootuista koetuloksista useiden γ-glutamyyli-p-nitroanilidin johdannaisten suhteen.

Taulukko osoittaa, että ainoastaan keksinnön mukaisissa yhdisteissä yhdistyvät parempi liukoisuus ja hyvät γ-GTrn substraatin ominaisuudet.

Taulukossa merkitsevät X, A, B ja C vetyä, mikäli niille ei ole annettu muuta merkitystä.

4 öy/yu o

LH g* LO

H (\l (M CM H4 00 VO M3> VO CT\ Κ"Ί

¢3 CO CO C— C·—£3 VO CM C\l CM VO CM

d) CO «H Λ «\ #S Λ * Λ Λ *\

0 3 O O O O $ O OOOO O

I -H 3 S

0 -P > s* tn-p 3 >

-P CD X

X <L> X Φ O *H i—I O ·Η W^hH

1 O

o a p a et et S Ä o ρ- σ\ lo LO co o— σ\ 0 Ct CT\ «3 LO Ct f- VO CM rH CO C—

OxJ ·Η #t Ct * *\ Λ Λ »H Λ

Oh O O <—I 1—I Oh 1—I i—! rH CM i—I rH

> Ct et eu O >

X W

O

ft O O

O O O. O O

1 O O Ct CO o o e— ra r— c^- o 33 ή oo co

•H aoco O CM O 'O rH

e Φ i—I rH VO Ct I OO rH I

Ct-P II f- Ct t— rH CM LO

H CO LOVO rH Oi rH CO

3 *H OO CO Ct CM H

00 Oh rH rH >

en ' SS SSS SSS

3 EE EES E E E

3 W OO O O -=3· OCX3P- •H O O CM CM . VO \j O roro rHrHV v,

X Λ Λ V

3 Λ11 AI I

•H ·Η X o 3 3 ra

xt >, ra ssss's SS SSSCS

ra p >j E E E E E EE E E E et ct E

ra p >5 -Hp •H Φ > Ooo-=rcooo co -zr co ^3- ·Η et -=3"

P P CU rH v HU

ra >>x et et -h

<U Kt St Oh Oh O E

fr X > O O -H

•1-3 T-3 P 3

Osi P

Ct I E O -H

e ra o I e -HO

et Φ ra Φ 3 p > raetc*H> ^ k 3 vo ^¾ ra CO > ·Η Φ 35¾¾¾ P 3s! ·Η ^ O 3 E P 2 et OO Ή LO LO ^¾ ^¾ Φ Φ

•HP30<CLOO^rro o. -=r 3 LO

Ρ£3ΡΦ<3/Ηνθ II o OOC LO LO 3sJ CM

OsJctPWO-iprHrHOO O et e rH CM rH I

Ct Oh3 ODP IO CM rHi-H-H < LO

Φ et 3 tn J (t rHrHO rH

03 p E QhO o et Φ e

et O

CM

O

2 X o -=r -3- -=r p- -=x VV 33 33 K K K CM ro ZZZIZIZ 33 33 ' \ \L O ro o ro o ro ro s 330 03 000330 033 330Ή0 0

^ f O CO O" O O COO OOO

33 2 h n

I II II II II II II II II II II

03 X X

X X X O < < < < X X

O rH

1-HCMrO -E- LOVO 1H- CO CO rH rH

5 59790 C C'- Φ tn σ\ lh O cm ^

CG rH CM CM CM CM

I *H G " " " " " 0- P>0 o o o o

G P G

p mil ϋ Φ 0*

Φ G -H

1— I O ·Η M Cm rH

O

-P

G

£

0 rH C— LT\ OO OO

G cd LTi lt\ -=r ax —r isl ·Η " * " ·> Λ

>J<G| rH rH r—I rH rH

> CÖ Φ G 1-0 b0

O

1 G O

ω -p O

•h h td o co

E a; o -P o -H

a3 -p > o3 oo l rH en p> O co 3 ·Η ·Η ·Η CM ^ cn a u 6 <-i xd xd p> tn C 40 3 ·Η ·Η >j Cti

3 G <D xd G S

en xö iti a g SS

•H > -H ε *d S 2 S S

o en 3 φ =cd ε s rH

^ C ϋ P G G ΗΓ 03- 3 d O H G ai p· nr G a •H ε G o 3 xd ·Η 2 o > > w ε o

G

xd >3 en

tn 40 >j _ S SS

en 40 >j S S S 2 E E S

•h <d > ε ε ε ε p p O rH 3T -=r cn >>2 CM -a* -or ΗΓ

Φ xd xd G

E-· id > "H

O

I G

40

•H

cö I G

G tn G o

cd Φ en φ 303¾¾¾¾ S

en cd C ·Η > encd G

en >·Η Φ £r<OLn^ ^ ^ O G E P 2 <3 ^ 3 Φ « «MO Ό •H P 3 G < G «JPil w HIO ΚΛΡΓ ι*λ o

40 .G 40 Φ < G O Φ *H G CM CM ΡΓ LT\ CM

ϋ idp MGP H ε OH G

m aG OOP cd> ·η Φ (Ö G GJ tn W 03 o 2 40 E 20 G -H G e Φ 40 ar 2 2

ΗΓ O CM

O te O 00 CM

cm G 2 0 2 o o Ή OI 2 2 rH O CM CM I CM I_ & ° s i-τΛι g 'ίΛι /\ S lT O rH " O NVs^X ^ // A A ε o o I Y Y N-f < PO G Z OO 2 π il il il I I 2 2 2 2 2 1

1 X <0 XI X K

2

CM K"\ -ar LT\ CO f- CO

i—I i—li—li—I rH i—I i—I

59790 β

Sulamispisteet määrättiin Koflerin mukaan. Levykromatograa-finen tutkimus tapahtui piigeelissä käyttäen seosta n-butanoli/jää-etikka/H20 suhteessa 50:15:25· Ilmoitetut arvot ovat suhteessa gluta-miinihappoon = 1,0 (R^ = 0,32 - 0,33).

Elektroforeettinen liikkuvuus määrättiin trietyyliammonium-bikarbonaattipuskurissa, 0,05 M pH 7,5, ja on laskettu suhteessa glutamiinihappoon = 1,0.

Edellä olevan taulukon kaikki yhdisteet ovat uusia. Ne valmistettiin antamalla aktivoidun glutamiinihapon, jossa on tavalliseen tapaan suojattu aminoryhmä, reagoida p-nitroaniliinijohdannai-sen kanssa, jossa on taulukossa ilmoitetut substituentit, ja lohkaisemalla tämän jälkeen muodostuneen glutamiinihappo-p-nitroanilidin suojaryhmä pois. Mikäli tällöin valmistetaan keksinnön mukaisia yhdisteitä, käytetään p-nitroaniliinia, jonka asennossa 3 on hapan ryhmä, mieluimmin 3-karboksi- tai 3-sulfo-p-nitroaniliinia.

Aktivoituna glutamiinihappona käytetään tarkoituksenmukaisesti vastaavaa anhydridiä tai halogenidia, mieluimmin kloridia tai bromidia. Anhydridiä saadaan esimerkiksi siten, että annetaan glutamiinihapon, johon on tuotu suojaryhmä, reagoida etikkahappoanhydridin kanssa, jolloin muodostuu vastaavaa glutamiinihappoanhydridiä. Suo-jaryhmiksi soveltuvat esimerkiksi ftalyyli-bentsyyli, karbobentsoksi-vanilliinihappo jne.

Suojaryhmän lohkaiseminen pois suoritetaan myös tunnettujen menetelmien mukaisesti. Lohkaisu suoritetaan mieluimmin hydratsii-nin avulla, mikäli on kyseessä ftalyyliryhmä.

Glutamiinihappoanhydridin tai -halogenidin asemesta voidaan käyttää myös jotakin muuta aktivoitua glutamiinihappojohdannaista, joka pystyy helpottamaan happoamidisidoksen syntymistä glutamiinihapon karboksyyliryhmän ja aniliinin aminoryhmän välille. Tällaisia aktivoituja johdannaisia tunnetaan peptidikemiasta.

Jos parhaana pidetty reaktio suoritetaan käyttäen ftalyyli-glutamiinihappoanhydridiä tai -halogenidia, on tarkoituksenmukaista käyttää reaktiossa jotakin orgaanista liuotinta, mahdollisesti jonkin amiinin kanssa. Orgaanisista liuottimista pannaan etusijalle dioksaa-ni. Mutta myös muita liuottimia voidaan käyttää, kuten tetrahydrofu-raania, formamidia, dimetyyliformamidia yms. Amiineista annetaan «etusija tertiääriselle alifaattiselle amiinille, varsinkin sellaiselle, jossa on 1-6 hiiliatomia kutakin alkyyliryhmää kohti. Reaktio hydratsiinin kanssa tapahtuu tarkoituksenmukaisesti käyttäen jotakin alempaa alkoholia liuottimena.

59790 7

Raakatuotteiden puhdistamiseen käytetään tavanmukaisia menetelmiä kuten uudelleenkiteyttämistä ta-i kromatografiaa, esimerkiksi anionienvaihtokromatografiaa tai/ja adsorptiokromatografiaa käyttäen adsorptioaineina esimerkiksi piigeeliä, aluminiumhydroksidia yms., jotka soveltuvat varsinkin levykromatografiässä käytettäviksi, tai ammoniumsuolojen uudelleenkiteyttämistä vesi-asetoniseoksesta.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat huoneenlämmössä helposti liukenevia ja samoissa olosuhteissa niitä käyttäen saavutetaan γ-gluta-myyli-p-nitroanilidin muuttumismäärä yli 100-prosenttisesti. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat sen vuoksi erinomaisia substraatteja γ-glutamyylitranspeptidaasin määrityksessä.

Parhaitten keksinnön mukaisten yhdisteiden liukoisuus on jo ilman liukoisuutta edistäviä aineita yli 120 mmoolia, so. siis vähintäin 40 kertaa suurempi kuin γ-glutamyyli-p-nitroanilidin liukoisuus.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamista, niiden ominaisuuksia ja niiden käyttöä substraatteina Y-glutamyylitranspeptidaasin (Y-GT) määrityksessä.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat osoittautuneet paremmin liukeneviksi kuin γ-glutamyyli-p-nitroanilidi ja sitä paitsi ne eivät vaadi lämmittämistä liuotettaessa, niin että korkeammat sokko-ekstinktiot voidaan välttää. Stabiliteetti on hyvä liuoksen muodossa, ja tehtäessä testiolosuhteita optimaalisiksi Y-GT:n määrityksessä, ei synny minkäänlaisia probleemeja, mikä merkitsee erittäin paljon, kun on kyse kliinisen kemian vaatimuksista. Yhdisteiden valmistaminen on yksinkertaista ja halpaa; mittauksen herkkyys on yhtä hyvä kuin käytettäessä γ-glutamyyli-p-nitroanilidiä.

Esimerkki 1 r*glutamyyli-p-nitroanilidi-3-karbonihapon (GLUPA-3-karbonihapon) valistaminen 9,1 g 2-nitro-5-amino-bentsoehappoa (50 mmoolia) ja 14,2 g ftalyyliglutamiinihappoanhydridiä (55 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan absoluuttista dioksaania, johon on lisätty 13 ml tributyyliamiinia. Reaktioseosta keitetään 2 tuntia pystyjäähdyttäjän alla. Jäähdyttyä lisätään reaktioseokseen 100 ml 2N-ammoniakkia ja tällöin erottuva tributyyliamiini ravistellaan eetterissä. Vesiliuos haihdutetaan kuiviin, liuotetaan metanoliin ja sen pH säädetään 80-prosenttisen hydratsiinihydraatin avulla arvoon 10. Reaktioseoksen annetaan seisoa 20 tuntia huoneenlämmössä. Tällöin erottuu osittain tuotetta, joka suodatetaan ja pestään metanolilla ja heitetään pois. Metanolia sisältävä suodos konsentroidaan kuiviin ja jäljelle jäävä öljy liuo- 59790 8 tetaan noin 300 ml:aan tislattua vettä.

Vesiliuos tutkitaan kromatograafisesti pylväässä käyttäen 100 ml:n Dowex-putkea 1x2 (50-100 mesh), formiaattimuotoa, pestään 300 ml:11a tislattua vettä ja eluoidaan laimentaen 2 litralla vettä käyttäen 2 litraa 0,5 N-ammoniumkarbonaattiliuosta. Eluaatti otetaan 100 ml:n fraktioina ja tutkitaan levykromatograafisesti (piigeelile-vyt n:o 37350, Riedel de Haenin firmasta( systeemissä butanoli/jää-etikka/vesi suhteessa 50:15:15 (kromatogrammin kehitys: UV-valossa sinisiä läiskiä tai kostutettuna ninhydriinillä ja sen jälkeen kuumentamalla ruskeita läiskiä aminohappoa sisältävissä alueissa). Fraktiot, jotka sisältävät haluttua tuotetta, glutamiinihappo-p-nitroanilidi-3-karbonihappoa, (Rf-arvo 0,25), kootaan ja konsentroidaan vakuumissa kuiviksi. Jäljelle jäävä pulveri hierretään absoluuttiseen alkoholiin, suodatetaan ja kuivataan vakuumissa kalsiumkloridin avulla.

Saalis: 7 g Y-glutamyyli-p-nitroanilidi-3-karbonihappoa, monoammoniumsuolana (58 % teoriasta) UV-spektri: λ = 317 nm ulcLX λ e = 11,7 /cm'V/Umooli7 317 nm:llä

Esimerkki 2

GLUPA-3-karbonihapon käyttäminen määrättäessä γ-GT

Entsymaattisessa hajoamisessa vapautuu 2-nitro-5-amino-bentsoehappoa. Sen UV-spektri osoittaa seuraavat karasterikat:

Xmax = 380 ™ ε = 9,4 /cm / ,umooli7 405 nm:llä = 12,75 /cmv^umooliZ 380 nm:llä; c = 9,83 x 10-5 M.

A. Mittauksen suoritus Pipetoidaan kyvettiin: 0,1 M tris-puskuria, 100 mM glysyyliglysiiniä,pH =8,25 2,8 ml 130 nM GLUPA-3-karbonihappoa em. puskurissa 0,2 ml temperoidaan 25°C:een, määritys aloitetaan, kun lisätään seerumia 0,2 ml sekoitetaan, luetaan ekstinktio 405 nm:llä, pannaan samanaikaisesti sekuntikello käyntiin. Lukemat toistetaan tarkalleen 1, 2 ja 3 minuutin kuluttua.

Ekstinktioeroista minuuttia kohti (Δ E/min) lasketaan keskiarvo ja käytetään tätä arvoa laskuissa.

B. Laskeminen

Kansainvälinen yksikkö (U) on entsyymiaktiivisuus, joka aiheuttaa 25°C:ssa 1 ^umoolin substraattia muuttumisen 1 minuutissa.

9 59790 Tämä lasketaan 1 ml kohti ruumiinnestettä, esimerkiksi seerumia.

. Laskettaessa entsyymiaktiivisuutta ml:aa kohti (A), sovelletaan yleensä kaavaa V . 100 A = - . Δ E (mU/ml) min . ε . d . v 3-karboksi-4-nitroaniliinin ekstinktiovakio (ε) on testiolosuhteissa 2 405 nm:llä 9,4 cm /^umoolia.

Kyvetin kerroksen paksuus (d) on 1 cm, v on käytetyn seerumin volyymi (0,2 ml), V on volyymien summa (3,2 ml). Ekstinktion E mittaaminen tapahtuu 1 minuutin välein. Tästä saadaan A = Δ E (405 nm)/min x 1702 (mU/ml).

Esimerkki 3 Y-glutamyyli-4-nitroanilidi-3-sulfonihapon valmistus 115 g aniliini-4-nitro-3-sulfonihappoa ja 150 g ftalyyli-glutamiinihappoanhydridiä suspendoidaan 2 litraan absoluuttista dimetyyliformamidia ja kuumennetaan sen jälkeen öljyhauteessa lämpötilaan 145°C.

Kun on päästy tähän lämpötilaan, pysytellään siinä 1 tunnin ajan ja sen jälkeen jäähdytetään. Reaktioseos suodatetaan ja suodos haihdutetaan vakuumissa kuiviin, öljyinen jäännös liuotetaan metano-liin ja sen pH säädetään 80-prosenttisella hydratsiinihydroksidilla arvoon 9· 24 tunnin kuluttua imusuodatetaan muodostuneet kiteet, pestään pienellä määrällä metanolia ja heitetään pois. Suodos haihdutetaan kuiviin ja siihen lisätään varovasti jäähdyttäen syväjäähdy-tettyä asetonia. Tällöin muodostuva sakka imusuodatetaan, pestään hyvin asetonilla ja jäännös liuotetaan veteen sekoittaen. Veteen liukenematon jäännös suodatetaan pois ja suodoksen pH säädetään ammoniakilla arvoon 7,5 ja haihdutetaan kuiviin. Lisätään asetonia, jolloin Y-glutamyyli-4-nitroanilidi-3-sulfonihapon ammoniumsuola kiteytyy. Tuote kiteytyy oikein hyvin vaaleankeltaisina sikeröinä.

Sp. = 186-187°C

Spektri osoittaa absorptiomaksimin 290 nm:llä ε = 4,57 /cm /^umoolia/

Saalis noin 115-120 g, kiteyttämisen yhteydessä saadaan emävedestä vielä 15-20 g.

Kokonaissaalis noin 135 g, vastaten 70 % teoriasta.

59790 ίο

Yhdiste.on huoneenlämmössä hyvin liukeneva ja saavuttaa noin 160 % γ-glutamyyli-p-nitroanilidin muuttumismäärästä, kun olosuhteet ovat samat.

Esimerkki 4

GLUPA-3-sulfonihapon käyttäminen määrättäessä γ-GT

Kun keksinnön mukainen yhdiste hajoaa entsymaattisesti, vapautuu p-nitroaniliini-3-sulfonihappoa. Sen UV-spektri osoittaa seuraavia karakteristikoita:

Amax = 380 - ε = 5,45 /cm^/^umoolia7 405 nmrllä = 7,38 /cm^/^umoolia/ 380 nmrllä; A. Mittauksen suoritus Ryvettiin pipetoidaan: 0,1 M tris-puskuria, 150 nM glysyyliglysiiniä, pH = 8,5 2,8 ml 150 mM GLUPA-3-sulfonihappoa em. puskurissa 0,2 ml temperoidaan 25°C:een, määritys aloitetaan, kun on lisätty seerumia 0,2 ml sekoitetaan, ekstinktio lasketaan 405 nmrllä, samanaikaisesti käynnistetään sekuntikello. Lukema toistetaan tarkalleen 1, 2 ja 3 minuutin jälkeen.

Ekstinktioeroista minuuttia kohti (Δ E/min) muodostetaan keskiarvo ja tätä käytetään laskuissa.

B. Laskenta

Kansainvälinen yksikkö (U) on entsyymiaktiivisuus, joka aikaansaa 25°Crssa 1 ^umoolin substraattia muuttumisen 1 minuutissa.

Tämä lasketaan 1 ml kohti ruumiinnestettä, esimerkiksi seerumia. Laskettaessa entsyymiaktiivisuutta ml:aa kohti (A), sovelletaan yleensä kaavaa A = -—- - . Δ E (mU/ml) min . ε . d . v p-nitroaniliini-3-sulfonihapon ekstinktiovakio (e) on testiolosuhteis- o sa 405 nmrllä 5,^5 cm /^uM. Kyvetin kerroksen paksuus (d) on 1 cm, v-on käytetyn seerumin volyymi (0,2 ml), V on volyymien summa (3,2 ml). Ekstinktion E mittaaminen tapahtuu 1 minuutin välein. Tästä saadaan A = Δ E (405 nm)/min x 2936 (mU/ml).