DE2333798B2 - gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3sulfonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser, und deren Verwendung - Google Patents
gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3sulfonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser, und deren VerwendungInfo
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Description
Gegenstand der Erfindune sind die neue Verbindung y-Glutamyl-4-nitranilid-3-sulfonsäure und deren Salze.
Gegenstand der Erfinduim sind ferner ein Verfahren
zur Herstellung der vorgenannten Verbindungen sowie deren Verwendung zur Aktivitätsbestimmune der
y-Glutamyltranspeptidase gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.
Die Bestimmunu der y-Glutamyltranspeptidase
(y-GT) wird im klinisch-chemischen Labor in zunehmendem Maße zur Diagnosik von Lebererkrankungen
durchgeführt. Nach einem bekannten Verfahren erfolgt die Bestimmung entsprechend der Reaktion:
y-Glutamyl-4-nitroanilid f Glycylglycin =i=4-Nitroanilin
1 Glutamylglcylglycin. "
Die Geschwindigkeit der Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitroanilins kann optisch verfolgt werden
und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an y-GT.
Für eine routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit
des Substrates y-Glutamyl-4-nitranilid ein schwerer
Nachteil. Die Verbindung läßt sich nur schwer in Lösung bringen, und die Lösungen sind nur kurzzeitig
(etwa 2 Stunden) haltbar. Es war daher erforderlich, Abfüllungen jeweils nur für relativ wenige innerhalb
kurzer Zeit durchzuführende Bestimmungen herzustellen. Eine Aufbewahrung der Reagenslösungen war
nicht möglich. Ein weiterer Nachteil bestand darin, daß die Substanz bei 50 bis 60 C in Lösung gebracht
werden mußte, bei einem Überschreiten dieser Temperatur aber spontan hydrolysierte. Eine derartige
Hydrolyse beeinflußt die optische Extinktion der Lösungen, die für die Messung entscheidend ist, in
starkem Maße. Dies ist insbesondere von großem Nachteil bei der Durchführung der y-GT-Bestimmung
mit Analysenautomaten, da infolge der dabei gebildeten hohen Absorption höhere Aktivitäten nicht exakt
genug gemessen werden können. Infolgedessen wurde bisher bei suboptimalen Substratkonzentrationen von
nur 3 bis 4 mM gemessen im Gegensatz zur optimalen Konzentration bei etwa 6 mM (Clin. Chim. Acta, 31
[1971], 175 bis 179).
Die aufgeführten Nachteile konnten teilweise beseitigt werden durch das in der DT-AS 20 42 829
beschriebene Reagens, bei welchem in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels und von Polyvinylpyrrolidon
gearbeitet wird. Durch dieses Reagens können die Löslichkeitseigenschaften des y-Glutamyl-p-nitroani-Verbindung
beseitigt diese
Nachteile und weist einerseits ausgezeichnete Löslichkeitseieenschaftcn
auf und bildet gleichzeitig em gute, Substrat für das Enzym y-GT. Besonders ,-tzt.-res ist
überraschend, da andere Derivate des : ■jlutamylmjtlöslichkeitsverbessernden
Subsiituenten <Γοϊ'"nicht als Substrat dienen können.
ist bei Raumtemperatur gut löslich und erreich; 160"„der Umsatzrate vony-Glutamyl-4-nitranilid
bei deichen Bedingungen. Die erfindungsgemälie Verbindung ist daher ein überlegenes Substrat für die
Bestimmune der y-Glutamyhranspeptidase.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung erfolm durch Umsetzung von 4-nitranilin-3-siilfonsäure
mit einem aktivierten Glutaminsäurederivat. Phthaloylelutaminsäureanhydrid.
Die Umsetzung wird in einem polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt und das erhaltene Reaklionsprodukt mit
Hydrazin unter alkalischen Bedingungen zur Reaktion «ebracht. wobei die erfindungsgemäße Verbindung
erhalten wird. Als polares organisches Lösungsmittel wird Dimethylformamid bevorzugt. Es können aber
auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wie Tetrahydrofuran oder Formamid. Die Umsetzung mit
Hydrazin erfolgt zweckmäßig in einem niedrigen Alkohol oder Keton als Lösungsmittel.
Zur Isolierung des Rohproduktes bedient man sich üblicher Methoden, beispielsweise der Umkristallisation
der Salze, z. B. des Ammoniumsalzes aus Wasser-Aceton-Mischung.
Die Löslichkeit (in Wasser bei 20 bis 25 C bzw. m 0,2 M TRIS-Puffer pH 8,25 bei der angegebenen
Temperatur) der erfindungsgemäßen Verbindung ohne Lösungsvermittler liegt über 300 mM, d. h., daß sie
mindestens lOOmal größer als die Löslichkeit des y-Glutamyl-4-nitranilids ist.
Die foleenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, ihre Eigenschaften
und ihre Verwendung als Substrat für die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT).
Bei der enzymatischen Spaltung der erfindungsgemäßen Verbindung wird 4-Nitranilin-3-sulfonsäure
freigesetzt. Deren UV-Spektrum weist folgende Charakteristika auf:
λη,αζ =380 nm,
ε = 5,45 (cmVjwMol) bei 405 nm,
=7,38 (αη2/μΜο1) bei 380 nm,
c = 1 μΜοΙ/ml,
d = 1 cm.
d = 1 cm.
Die erfindungsgemäße Verbindung weist nicht nur eine bessere Löslichkeit als das y-Glutamil-4-nitraniüd
auf. sie erfordert auch beim Lösen kein Erwärmen, so daß höhere Blindextinktionen vermieden werden.
Die Stabilität in Lösung ist gut, bei der Optimalisierung der Testbedingungen zur Bestimmung der
y-GT treten keine Probleme auf, was für die Erfordernisse der klinischen Chemie von großer Bedeutung ist.
Die Herstellung der Verbindung ist einfach und billig, die Empfindlichkeit der Meßanordnung entspricht der
bei Verwendung von y-Glutamyl-4-nitranilid.
Herstellung von
y-Glutamyl^nitraniiid^-sulfonsäure
(GLUPA-3-sulfonsäure)
(GLUPA-3-sulfonsäure)
115 g4-nitranilin-3-sulfonsäure und 150 g Phihaloylglutaminsäureanhydrid
wenden in 2 1 absolutem Dimethylformamid suspendiert und anschließend im
ölbad auf 145CC erhitzt.
Nach Erreichen dieser Temperatur wird 1 Stunde bei 145°C gehalten und dann abgekühlt. Der Ansatz
wird filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird in Methanol
gelöst und mit 80u/oigem Hydrazinhydroxyd auf pH 9
eingestellt. Nach 24 Stunden werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, mit wenig Methanol gewaschen
und verworfen.
Das Filtrat wird zur Trockene eingeengt und mit tiefgekühltem Aceton vorsichtig unter Kühlung versetzt.
Der dabei ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton gut gewaschen und der Rückstand
in Wasser unter Rühren gelöst. Der im Wasser unlösliche Rückstand wird abfiltriert und das Filtrat
mit Ammoniak auf pH 7,5 gestellt und eingeengt. Durch Zusatz von Aceton wird das Diammoniumsalz
der y-Glutamyl-4-nilranilid-3-sulfonsäure auskristallisiert.
Das Produkt kristallisiert sehr gut in hellgelben Drusen.
Ausbeute etwa 115 bis 120 g, weitere 15 bis 20 g können noch aus der Kristallisationsmutterlauge
erhalten werden.
Gesamtausbeute etwa 135 g, entspricht 70% der Theorie.
Fp. = 186 bis 187°C.
UV-Spektrum zeigt Absorptions-Maximum bei
290 nm;
ε = 4,57 (απ2/μΜο1).
Papier-Elektrophorese-Daten:
K = const., 1120V;
etwa 35 mA;
K = const., 1120V;
etwa 35 mA;
0,05 M Triäthylammoniumcarbonat-Puffer, pH =7,5;
Laufzeit: 45 min bei Raumtemperatur;
Laufstrecke 16 cm, anodisch.
Laufstrecke 16 cm, anodisch.
optische Drehwert α a in 1%·8εΓ Lösung
(bidestilliertes Wasser bei 25°C) in einem 50 mm langen Rohr beträgt 17,5° C.
Verwendung der GLUPA-3-sulfonsäure zur Be-Stimmung der y-GT
A· Durchführung der Messung
In eine Küvette pipettieren:
In eine Küvette pipettieren:
fU M 2-Amino-2-(hydroxymethyl.)-i,J-propandiol
TRIS-Puffer, 1OO mM
Glycylglycin, pH = 8,5 2,8 ml
n 13OmM GLUPA-3-sulfonsaure in
obengenanntem Puffer 0,2 ml
Temperieren auf 25QC, Bestimmung starten durch
Zugabe von
,,. anserum 0 ">
ml
Mischen, Extinktion bei 405 nm ablesen, gleichzeitig
Stoppuhr starten. Nach genau 1,2 und 3 Minuten Ablesung wiederholen.
Aus den Extinktionsdifferenzen pro min (J £/min) Mittelwert bilden und diesen in die Berechnung einsetzen.
g Berechnung
Eine internationale Einheit [U) ist die Enzymaktivitat,
die bei 25°C 1 μΜοΙ Substrat in 1 min umsetzt.
Bezogen wird auf 1 ml Körperflüssigkeit, z. B. Serum.
Für die Berechnung der Enzymaktivitäten pro ml (A) gilt allgemein die Formel
A --= -— .·.-——-Λ £(mU/ml).
min ■ ε ■ d ■ ν
Der Extinktionskoeffizient ε von 4-nitranilin-3-sulfonsäure
beträgt unter den Testbedingungen bei 405 nm 5,45 cmV^Mol. Die Schichtdicke d der Küvette
ist lern, ν ist das Volumen des eingesetzten
Serums (0,2 ml), V ist die Summe der Volumina (3,2 ml). Die Messung der Extinktion E erfolgt in
Abständen von 1min. Daraus ergibt sich
A = Δ E (405 nm)/min · 2936 (mU/ml).
Claims (3)
1. y-GIutamyl-4-nitranilid-3-sulfonsäure und de- _
ren Salze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man jeweils in an sich bekannter Weise zunächst 4-Nitranilin-3-sulfonsäure mit Phthaloylglu.am.n-Säureanhydrid
und anschließend das Reaktion*- i» produkt mit Hydrazin umsetzt und y-Glutamy>^nitramlidO-sulfonsaure,
gegebenenfalls <n Salzform, in üblicher We.se isoliert.
3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch
1 als Substrat für die Aktiviiäisbesi.mmung -5
von y-Glutamyltranspept.dase.
lins sehr verbessert werden, und auch die Haltbarkeit
, LöcUn«en wird wesentlich verbessert. Auch m
diesem Falf ist jedoch immer noch ein Erwärmen auf sn hie MV Γ erforderlich mit der Gefahr der spontanen
50 bis ου <~ ^ dadurch hervorgerufenen IJngc-
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |