DE2333798B2 - gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3sulfonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser, und deren Verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindune sind die neue Verbindung y-Glutamyl-4-nitranilid-3-sulfonsäure und deren Salze. Gegenstand der Erfinduim sind ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Verbindungen sowie deren Verwendung zur Aktivitätsbestimmune der y-Glutamyltranspeptidase gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

Die Bestimmunu der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT) wird im klinisch-chemischen Labor in zunehmendem Maße zur Diagnosik von Lebererkrankungen durchgeführt. Nach einem bekannten Verfahren erfolgt die Bestimmung entsprechend der Reaktion: y-Glutamyl-4-nitroanilid f Glycylglycin =i=4-Nitroanilin 1 Glutamylglcylglycin. "

Die Geschwindigkeit der Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitroanilins kann optisch verfolgt werden und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an y-GT.

Für eine routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit des Substrates y-Glutamyl-4-nitranilid ein schwerer Nachteil. Die Verbindung läßt sich nur schwer in Lösung bringen, und die Lösungen sind nur kurzzeitig (etwa 2 Stunden) haltbar. Es war daher erforderlich, Abfüllungen jeweils nur für relativ wenige innerhalb kurzer Zeit durchzuführende Bestimmungen herzustellen. Eine Aufbewahrung der Reagenslösungen war nicht möglich. Ein weiterer Nachteil bestand darin, daß die Substanz bei 50 bis 60 C in Lösung gebracht werden mußte, bei einem Überschreiten dieser Temperatur aber spontan hydrolysierte. Eine derartige Hydrolyse beeinflußt die optische Extinktion der Lösungen, die für die Messung entscheidend ist, in starkem Maße. Dies ist insbesondere von großem Nachteil bei der Durchführung der y-GT-Bestimmung mit Analysenautomaten, da infolge der dabei gebildeten hohen Absorption höhere Aktivitäten nicht exakt genug gemessen werden können. Infolgedessen wurde bisher bei suboptimalen Substratkonzentrationen von nur 3 bis 4 mM gemessen im Gegensatz zur optimalen Konzentration bei etwa 6 mM (Clin. Chim. Acta, 31 [1971], 175 bis 179).

Die aufgeführten Nachteile konnten teilweise beseitigt werden durch das in der DT-AS 20 42 829 beschriebene Reagens, bei welchem in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels und von Polyvinylpyrrolidon gearbeitet wird. Durch dieses Reagens können die Löslichkeitseigenschaften des y-Glutamyl-p-nitroani-Verbindung beseitigt diese

Nachteile und weist einerseits ausgezeichnete Löslichkeitseieenschaftcn auf und bildet gleichzeitig em gute, Substrat für das Enzym y-GT. Besonders ,-tzt.-res ist überraschend, da andere Derivate des : ■jlutamyl_mjtlöslichkeitsverbessernden Subsiituenten <Γοϊ'"nicht als Substrat dienen können. ist bei Raumtemperatur gut löslich und erreich; 160"„der Umsatzrate vony-Glutamyl-4-nitranilid bei deichen Bedingungen. Die erfindungsgemälie Verbindung ist daher ein überlegenes Substrat für die Bestimmune der y-Glutamyhranspeptidase.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung erfolm durch Umsetzung von 4-nitranilin-3-siilfonsäure mit einem aktivierten Glutaminsäurederivat. Phthaloylelutaminsäureanhydrid. Die Umsetzung wird in einem polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt und das erhaltene Reaklionsprodukt mit Hydrazin unter alkalischen Bedingungen zur Reaktion «ebracht. wobei die erfindungsgemäße Verbindung erhalten wird. Als polares organisches Lösungsmittel wird Dimethylformamid bevorzugt. Es können aber auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wie Tetrahydrofuran oder Formamid. Die Umsetzung mit Hydrazin erfolgt zweckmäßig in einem niedrigen Alkohol oder Keton als Lösungsmittel.

Zur Isolierung des Rohproduktes bedient man sich üblicher Methoden, beispielsweise der Umkristallisation der Salze, z. B. des Ammoniumsalzes aus Wasser-Aceton-Mischung.

Die Löslichkeit (in Wasser bei 20 bis 25 C bzw. m 0,2 M TRIS-Puffer pH 8,25 bei der angegebenen Temperatur) der erfindungsgemäßen Verbindung ohne Lösungsvermittler liegt über 300 mM, d. h., daß sie mindestens lOOmal größer als die Löslichkeit des y-Glutamyl-4-nitranilids ist.

Die foleenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung, ihre Eigenschaften und ihre Verwendung als Substrat für die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT).

Bei der enzymatischen Spaltung der erfindungsgemäßen Verbindung wird 4-Nitranilin-3-sulfonsäure freigesetzt. Deren UV-Spektrum weist folgende Charakteristika auf:

λη,αζ =380 nm,

ε = 5,45 (cmVjwMol) bei 405 nm, =7,38 (αη²/μΜο1) bei 380 nm, c = 1 μΜοΙ/ml,
d = 1 cm.

Die erfindungsgemäße Verbindung weist nicht nur eine bessere Löslichkeit als das y-Glutamil-4-nitraniüd auf. sie erfordert auch beim Lösen kein Erwärmen, so daß höhere Blindextinktionen vermieden werden. Die Stabilität in Lösung ist gut, bei der Optimalisierung der Testbedingungen zur Bestimmung der y-GT treten keine Probleme auf, was für die Erfordernisse der klinischen Chemie von großer Bedeutung ist. Die Herstellung der Verbindung ist einfach und billig, die Empfindlichkeit der Meßanordnung entspricht der bei Verwendung von y-Glutamyl-4-nitranilid.

Beispiel 1

Herstellung von

y-Glutamyl^nitraniiid^-sulfonsäure
(GLUPA-3-sulfonsäure)

115 g4-nitranilin-3-sulfonsäure und 150 g Phihaloylglutaminsäureanhydrid wenden in 2 1 absolutem Dimethylformamid suspendiert und anschließend im ölbad auf 145^CC erhitzt.

Nach Erreichen dieser Temperatur wird 1 Stunde bei 145°C gehalten und dann abgekühlt. Der Ansatz wird filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird in Methanol gelöst und mit 80^u/oigem Hydrazinhydroxyd auf pH 9 eingestellt. Nach 24 Stunden werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, mit wenig Methanol gewaschen und verworfen.

Das Filtrat wird zur Trockene eingeengt und mit tiefgekühltem Aceton vorsichtig unter Kühlung versetzt. Der dabei ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton gut gewaschen und der Rückstand in Wasser unter Rühren gelöst. Der im Wasser unlösliche Rückstand wird abfiltriert und das Filtrat mit Ammoniak auf pH 7,5 gestellt und eingeengt. Durch Zusatz von Aceton wird das Diammoniumsalz der y-Glutamyl-4-nilranilid-3-sulfonsäure auskristallisiert.

Das Produkt kristallisiert sehr gut in hellgelben Drusen.

Ausbeute etwa 115 bis 120 g, weitere 15 bis 20 g können noch aus der Kristallisationsmutterlauge erhalten werden.

Gesamtausbeute etwa 135 g, entspricht 70% der Theorie.

Fp. = 186 bis 187°C.

UV-Spektrum zeigt Absorptions-Maximum bei

290 nm;

ε = 4,57 (απ²/μΜο1).

Papier-Elektrophorese-Daten:
K = const., 1120V;
etwa 35 mA;

0,05 M Triäthylammoniumcarbonat-Puffer, pH =7,5; Laufzeit: 45 min bei Raumtemperatur;
Laufstrecke 16 cm, anodisch.

optische Drehwert α a in 1%·8^εΓ Lösung (bidestilliertes Wasser bei 25°C) in einem 50 mm langen Rohr beträgt 17,5° C.

Beispiel 2

Verwendung der GLUPA-3-sulfonsäure zur Be-Stimmung der y-GT

^A· Durchführung der Messung
I_n eine Küvette pipettieren:

^{fU M} 2-Amino-2-(hydroxymethyl.)-i,J-propandiol TRIS-Puffer, ¹OO mM

Glycylglycin, pH = 8,5 2,8 ml

n 13OmM GLUPA-3-sulfonsaure in

obengenanntem Puffer 0,2 ml

Temperieren auf 25^QC, Bestimmung starten durch Zugabe von

,,. _anserum 0 "> ml

Mischen, Extinktion bei 405 nm ablesen, gleichzeitig Stoppuhr starten. Nach genau 1,2 und 3 Minuten Ablesung wiederholen.

Aus den Extinktionsdifferenzen pro min (J £/min) Mittelwert bilden und diesen in die Berechnung einsetzen.

g Berechnung

Eine internationale Einheit [U) ist die Enzymaktivitat, die bei 25°C 1 μΜοΙ Substrat in 1 min umsetzt.

Bezogen wird auf 1 ml Körperflüssigkeit, z. B. Serum.

Für die Berechnung der Enzymaktivitäten pro ml (A) gilt allgemein die Formel

A --= -— .·.-——-Λ £(mU/ml).

min ■ ε ■ d ■ ν

Der Extinktionskoeffizient ε von 4-nitranilin-3-sulfonsäure beträgt unter den Testbedingungen bei 405 nm 5,45 cmV^Mol. Die Schichtdicke d der Küvette ist lern, ν ist das Volumen des eingesetzten Serums (0,2 ml), V ist die Summe der Volumina (3,2 ml). Die Messung der Extinktion E erfolgt in Abständen von 1min. Daraus ergibt sich

A = Δ E (405 nm)/min · 2936 (mU/ml).

Claims (3)

Patentansprüche:

1. y-GIutamyl-4-nitranilid-3-sulfonsäure und de- _ ren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise zunächst 4-Nitranilin-3-sulfonsäure mit Phthaloylglu.am.n-Säureanhydrid und anschließend das Reaktion*- i» produkt mit Hydrazin umsetzt und y-Glutamy>^nitramlidO-sulfonsaure, gegebenenfalls <n Salzform, in üblicher We.se isoliert.

3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Substrat für die Aktiviiäisbesi.mmung -5 von y-Glutamyltranspept.dase.

lins sehr verbessert werden, und auch die Haltbarkeit , _Löc_Un«en wird wesentlich verbessert. Auch m diesem Falf ist jedoch immer noch ein Erwärmen auf sn hie MV Γ erforderlich mit der Gefahr der spontanen 50 bis ου <~ ^ _dadurch hervorgerufenen IJngc-