FI59119B - Foerfarande foer bryggning av oel med god koeldstabilitet och utmaerkt smak - Google Patents

Description

fa! m.*UULUTU*JULKAISU r Q d >| Q jgarg W (11) UTLÄGGNINGSSKMPT D ^ 1 1 * C /45v Patentti 'sySr.rrtly 10 06 1901 Patent raeddelat ^ T ^ (51) Kv.ik.3/Im.a.3 C 12 C 7/00 // C 12 H 1/00 SUOMI—FINLAND (W) Ν**»«*»ΗΛ·«Μ·-·Ρκ·«*«Μβΐιηΐι** 762931 (22) ΗιΜιΜΗΜ-ΑηΜα*!^ li.-10.76 V ' (23) Alkupllvt—GIHighetadig lU.lO.76 (41) Tulkit (utklMkai — BlIvH offantng l6. OU. 77 hMMM-l* nktaurltaHitw μλ !«*»—· »«.- ratant» och raglitmtyralMn ' AmMun utitgd och uti.skmt«i puMteand 27.02.8l (32)(33)(31) Prrlttty «uolk*ui-e**trd priority 15.10.75

Tanska-Danmark(DK) U6UO/75 (71) De Forenede Bryggerier A/S, Vesterfaelledvej 100, DK-1799 K^benhavn V, Tanska- Danmark (UK) (72) Dietrich Holger von Wettstein, Vaerl^se, Bent Ahrenst-Larsen, Virum,

Inga Barbro Jende-Strid, Aller^d, Jurgen Axel Sorensen, Virum, Tanska-Danmark(DK) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä oluen valmistamiseksi, jolla on hyvä kylmasäilyvyys ja erinomainen maku - Förfarande för bryggning av öl med god köldstabilitet och utmarkt smak

Keksinnön kohteena on menetelmä oluen valmistamiseksi, jolla on hyvä kylmasäilyvyys ja erinomainen maku, käyttäen vierteenä ohrasta tai ohra-maltaista saatua uutetta.

Olutta valmistetaan tavallisesti ohramaltaasta, jota saadaan ohran mallastuksella, so. liuottamalla ohranjyvät vedessä, ja antamalla niiden itää, Idätyksessä syntyy erilaisia entsyymejä, jotka hajottavat jyvässä olevia hiilihydraatteja ja proteiineja. Itänyt ohra, jota kutsutaan vihermaltaaksi kuivataan lämpimällä ilmalla, jolloin kasvu pysähtyy, jonka jälkeen idut ja juuret poistetaan.

Näin saatu mallas, johon mahdollisesti sekoitetaan mukaan erilaisia tärkkelyspitoisia tuotteita, mäskätään, so. sitä käsitellään lämpimällä vedellä uuteaineiden liuottamiseksi. Liukenemattomien aineosien poissuodattamisen jälkeen saadaan kirkas, oljenvärinen uute, jota nimitetään vierteeksi; siihen sekoitetaan humaloita ja mahdollisesti muita aineita, se kuumennetaan kiehuvaksi, jäähdytetään ja saatetaan käymään sopivalla oluthiivalla, kuten Saccharomyces cerevisiae- tai Saccharomyces carlsbergensis-hiivalla.

t 2 59119 Käymisen jälkeen olut normaalisti siirretään varastotankkiin, jossa se kypsyy ja jossa siihen muodostuu paineessa haluttu hiilidioksidipitoisuus .

Valmistettaessa olutta ohran tai ohramaltaiden avulla saadaan tunnetuin menetelmin enemmän tai vähemmän rajoitetusti pysyviä tai kestäviä tuotteita. Kun olut on pullotettu tai laskettu tynnyreihin sekä pastöroitu se määrätyn varastoimisajän kuluttua samenee. Oluen laadusta, varastoimisajasta ja lämpötilasta riippuen sameus vaihtelee huntumaisesta näkyvään hiutalointiin kai pohjasakkaan. Korkeat lämpötilat (4O0 - 60%) nopeuttavat näitä oluen muutoksia. Mitä kauemmin olut säilyy kirkkaana, sitä suuremman kemiallisen ja kolloidaalisen kestävyyden sillä sanotaan olevan.

Oluen pullottamisen jälkeisen sameuden lisääntymisen ohella myös sen kylmäsameus kasvaa. Tällä tarkoitetaan sameutta, joka muodostuu jäähdytettäessä lämpötilassa 10° - 60% säilytettyä olutta lämpötilaan n. 0°C 1-2 vuorokaudessa. Kylmäsameuden määrää pidetään mittana oluen kemialliselle tai kolloidaaliselle pysyvyydelle. Mitä pienempi kylmäsameus on, sitä parempi on oluen kestävyys.

Joskus panimokirjallisuudeesa tapaa toisen määritelmän kylmä-sameudelle. Tämä on oluen 0°C:ssa mitatun sameuden ja määräajan huoneenlämpötilassa säilytetyn oluen sameuden välinen ero. Myös tätä, samoin oluen punotuksesta lisääntyvää kylmäsameutta käytetään oluen kestävyyden mittana. Mitä pienempi sameus on, sitä suurempi on oluen kestävyys.

Normaalisti esiintyvällä eameudenmuodostuksella on joukko syitä, mutta tärkeämmät niistä ovat oluen sisältämä happi, proteiinit, polypeptidit ja polyfenolit.

Yleisesti ottaen proteiinit, polypeptidit ja joukko erilaisia polyfenoleja muodostavat olueeseen liukenemattomia yhdisteitä. Happi hapettaa ja polymeroi polyfenoleja ja siten proteiinien ja polypep-tidien kanssa muodostuu monomeerejä vaikeammin liukenevia yhdisteitä.

On yleisesti tunnettua, että ns. antosyanogeenit (3,4-flavandi-olit), jotka kuuluvat polyfenoleihin, vaikuttavat suuresti sameuden-muodostukseen. Kemiallisesti antosyanogeenit kuuluvat flavanoidelhin, ja nimen ovat antaneet Harris ja Ricketts (Journal of the Institute of Brewing 1958, 22-32, ja European Brewery Convention, Proceeding of the Congress, Rome, 1959» 290-302). Näiden yhdisteiden 3 59119 kaava on r^

Λ. OH

h°x o ΓοΤ 2

I ^ OH OH

1 · 2 jossa R ja R ovat H, OH tai OCH^·

Samoin flavanoideihin kuuluvat katekiinit aiheuttavat oluen sameutu-mista. Näiden yhdisteiden kaava on R1

I OH

CoX

OH

OH

1 . 2 jossa R ja R ovat H, OH tai OCH^.

Tavallisesti ohra sisältää 100-200 mg antosyanogeenejä ja 100-200 mg katekiineja/100 g kuiva-ainetta.

Monista julkaisuista, viimeksi 1960-luvulta, ilmenee, että monomeeriset antosyanogeenit tai katekiinit eivät pysty saostamaan suurimolekyylisiä proteiineja ja siten aiheuttamaan sameutta oluessa, vaan niiden täytyy ensin poly-meroitua. Tätä tapahtuu myös oluessa. Polymerointia saattaa esiintyä myös antosyanogeenin ja katekiinin välillä. Muodostuneita polymerointituotteita kutsutaan bi-, tri-, tetraflavonoideiksi jne. Pääosa vierteen antosyanogeeneistä ovat biflavonoideina, eli, dimeereinä, joista hydrolyysissä muodostuu yksi katekiini ja yksi antosyanidiinimolekyyli. (Weinges, K., Bahr, W., Ebert, W.,

Goritz, K. ja Marx, H.-D., Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe, 5911 9

Voi. 27· (1969) Springer Verlag, Wien, sivut 23U-2U5; näiden dimeerien kaava on ' l [Oi

OH

. 1.2 jossa R ja R ovat joko H, OH tai OCH^·

Harrisin ja Rickettsin ehdottama nimi "antosyanogeenit" hyväksyttiin nopeasti panimokirjallisuudessa. Tosin Freudenberg ja Weinges (Tetrahedron 8 (i960), 336-339) nimittivät samaa yhdisteryhmää "proantosyanidiineiksi", joka nimitys on jonkun verran levinnyt panimoteollisuudessa.

Ohran sisältämät antosyanogeenit ja katekiinit siirtyvät pääasiallisesti mallastus- ja vierteenkeittoprosessissa vierteeseen. Proteiini voi mahdollisesti seostaa jonkin verran katekiinia vierteen keiton aikana, jolloin se saadaan poistetuksi, jos vierre suodatetaan keiton jälkeen. Vierre sisältää tyypillisesti 30-60 mg antosyanogeeneja ja 30-60 mg katekiineja litraa kohti vierrettä. Vastavalmistettu olut sisältää vastaavia määriä antosyanogeeneja ja katekiineja, so. tyypillisesti 30-60 mg/l olutta.

On toivottavaa valmistaa olutta, jolla on mahdollisimman hyvä säilyvyys ts, yritetään välttää tai estää normaalia sameuden syntymistä. Tämän saavuttamiseksi pyritään olut suodattamaan ja pullottamaan siten, ettei se joudu ilman hapen kanssa kosketuksiin. Lisäksi pyritään erottamaan tai poistamaan sameutta aiheuttavat aineet, nimittäin antosyanogeenit ja proteiinit.

... I

5 59119

Antosyanogeenien tai niiden aiheuttaman haitan poistamiseksi on käytetty erilaisia lisäaineita. Tällaiset lisäaineet tai stabilointiaineet vaikuttavat joko adsorboimalla tai seostamalla poly-fenoleja. Vaihtoehtoisesti olut voidaan stabiloida adsorboimalla, hajottamalla tai saostamalla siinä olevat proteiinit. Esimerkkinä oluen lisäaineista ja tunnetuista oluen stabilointimenetelmistä voidaan mainita seuraavat: 1) Proteolyyttisiä entsyymejä, kuten papaiinia (kaupallista valmistetta on saatavana tavaramerkillä Collupulin®) käytetään proteiinien hajottamiseen ja siten estämään proteiinien ja poly-fenolien välisten kolloidien (sameus) muodostumisesta. Entsyymiä käytetään tavallisesti 5-30 g/m^.

2) Oluen proteiinien saoetamiseen käytetään parkkihappoa, jota lisätään olutta varastoitaessa. Poistettaessa sakka vähenee sameutta aiheuttavien komponettien määrä huomattavasti.

3) Liukenematon polyvinyylipyrrolidoni (PVP, Polyclar" AT) ja polyamidi (Nylon*'66) adsorboivat tehokkaasti polyfenoleja.

Tässä menetelmässä lisätään olueeseen ennen loppusuodatusta 73-250 g polyvinyylipyrrolidonia ja suurempi määrä Nylon 66:ta 1 m^jä kohti. Kun oluesta on osittain poistettu polyfenolit, se on vähemmän taipuvainen muodostamaan kolloidaalista sameutta.

4) Polyfenolien adsorboimisen sijasta voidaan käyttää bentso-niittiä tai aktivoitua silikageeliä proteiinien absorboimiseen. Bentsoniitilla on haitallinen vaikutus vaahdon stabiiliuteen. Silikageelia käytetään 200-5500 g/m^ .

5) Samanaikainen polyvinyylipyrrolidonin ja silikageelin yhteiskäyttö vaikuttaa parantavasti kolloidien stabiiliuteen.

Edellä olevat menetelmät ovat epäedullisia siinä suhteessa, että niissä tarvitaan erityistoimenpiteitä ja ylimääräisiä lisäaineita ja siten lisäkustannuksia. Lisäksi jotkut niistä saavat aikaan pienentyneen oluen saannon ja huonontavat oluen laatua.

Alan asiantuntijat ovat yleiseeti sitä mieltä, että poly-fenoleilla on ratkaiseva merkitys mallasohran ja siitä valmistetun oluen kannalta (B. Trolle, Brygmesteren, nr. 2 1960 s. 45-55)·

Trolle on esittänyt, että olutta, jossa ei ole tanniineja ei makunsa puolesta voida hyväksyä olueksi, mikä on osoitettu kokeissa valmistettaessa olutta kuoritusta maltaasta, josta tanniinit kuorien mukana ovat poistuneet. Testaavan mielipiteen ovat esittäneet Dadic M. ja Van Gheluve, G.E.A. (Technical Quarterly Tel. 10 (1975) 69-75» sekä Dadic, M. (Technical Quarterly Tel. 11, (1974) 140-145· 59119 Näistä kirjallisuuden kohdista ilmenee kokeissa osoitetun, että poistamalla oluesta polyvinyylipyrrolidonilla tai Nylon 66:11a 90-95 % antosyanogeeneistä ja katekiineista saadaan tuotetta, jolla on täysin hyljättävä, soodavedenka.ltai -nen aromi, ja joka on lähes väritöntä. Vaikka onkin tiedetty, että oluen pysyvyyden kannalta antosyanogeenien ja katekiinien poistaminen on toivottua, on yleisenä käsityksenä ollut, ettei niitä voida poistaa ilman, että oluen maku ja aromi siitä kärsivät. Tästä syystä oluen stabiloinnissa antosyanogeeneja ja katekiineju on poistettu ainoastaan osittain ja siksi vähäisessä määrin, ettei oluen aromissa, värissä, maussa ja muissa laatuominaisuuksissa tapahdu huomattavaa huononemista.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa olutta, jolla on hyvä kylmäsäilyvyys ja erinomainen maku, ilman saostavien tai stabiloivien aineiden käyttöä. Tämä on yllättäen osoittautunut mahdolliseksi käyttämällä vierrettä, joka on valmistettu ohralajikkeesta, joka sisältää geenin, joka täysin tai osittain estää antosyanogeenien synteesin. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että vierre valmistetaan sellaisesta ohralajikkeesta, jonka antosyanogeenipitoisuus on alle 100 mg, edullisesti alle 20 mg, 100 g kuiva-ainetta kohti, ja katekiinipitoisuus alle 100 mg, edullisesti alle 20 mg 100 g kuiva-ainetta kohti, missä lajikkeessa antosyanogeeni- ja/tai katekiini-synteesi on estetty kokonaan tai osittain geneettisen mutatoinnin avulla, edullisen ohralajikkeen ollessa Foma-lajikkeen antosyaniinivapaa, etyylimetaani-sulfonaatilla käsittelemällä muodostunut mutantti ANT-13, jonka deponointi-numero on 197^: 11U1:2283 laitoksissa Sveriges Utsädesförening, Svalöf, ja Genetiskä Institutionen, Lund.

Nyt on siis osoitettu, että on mahdollista valmistaa ohramutantteja, joiden biokemiallisessa kokonaissynteesissä estyy aikainen vaihe, joka johtaa antosyaniidien ja proantosyaniidien muodostumiseen. Tätä biosynteettistä flavo-noidien muodostusta voidaan kaavamaisesti kuvata seuraavalla kuviolla: 7 591 1 9

Sikimiinihappo l·

Fenyylialaniini 2 malonjyli, Co-A ^

Asetyyli Co-A ____ Kaneelihappo 4/ välituote

Flavoni ^-li:?--Kaikoni Iymerieaatig· Flavanoni

Flavanoli ^ -2H Flavannl i — Isoflavoni \ (Dihydrof1avono1i) j.-15? L^nt-

Antosyanidiini --------pFlavenoli] \L·

Flavan-3-oli

Katekiini

ProantoByanidiini

Ohrassa tunnetaan joitakin harvoja geenejä, jotka kontrolloivat antosyanidiinin muodostumista ja niiden antosyanidiinijohdannaisten muodostumista, joita nimitetään antosyaaneiksi (NILAN, R.A, The cytology and genetic of barley, Washington University Press,1964, sivut 1951-1962, Vaiheessa hypoteettisen flavenoli-välituotteen ja antosyaanivapaan ohramutantin analyysi vahvisti sitä käsitystä, että reaktiokaaviossa tapahtuu haarautuminen hypoteettisen välituotteen kohdalla. Näistä mutanteista, jotka eivät sisältäneet antosyaania 14 sisälsi saman määrän proahtosyanidiineja (antosyanogeenejä)kuin kantatyyppi (villi tyyppi). Yksi ainoa mutanteista , jolle annettiin nimi mutantti rub 13 (nykyisin ant-13), oli käytännöllisesti katsoen proantosyanidiinivapaa (analyysissä saatiin noin 3 mg proanto-syanidiinia 100 g:aa kohti kuiva-ainetta ). Hutantissa rub-13 (nyt ant-13) 59119 on sen proantosyanidiinien ja antosyanidiinien muodostumiseen johtavassa "biokemiallisessa kokonaissynteesissä aikainen vaihe estynyt, kun taas muissa antosyaniinivapaissa mutanteissa on vain vaikutettu siihen synteesitien haaraan, joka johtaa antosyanidiinien syntymiseen.

On osoittautunut, että mainittu ohramutantti on erittäin sopiva raaka-aine oluen valmistukseen, joka alhaisen antosyanogeenipitoisuuden vuoksi tai antosyanogeenien puuttumisen vuoksi on erittäin pysyvää. Lisäksi on yllättäen osoittautunut, että tällainen olut on korkealaatuista ja vastaa sekä maultaan että aromiltaan olutta, joka on valmistettu alkuperäisestä kantaohrasta.

Kuvattu ohramutantti ant-13 valmistettiin alunperin ohralajikkeesta Foma ja eristettiin i960. Sitä säilytetään siemenkokoelmassa Lundin Yliopiston geneettisessä instituutissa ja Ruotsin siemenlaitoksessa, Svalöv, Ruotsi. Ohramutantilie annettiin nimi antosyaniinivapaa 13 ja geenisymboli rub 13, ja sitä on säilytetty tässä kokoelmassa eristämisestä lähtien. Gustafsson, A., Hagberg, A., Lundqvist, U.,Persson, G. (Hereditas 62 (1969) U09-U1H) ovat käyttäneet ohramutantista nimitystä antosyanivapaa 13 ja geenisymbolia ex-rubrum 13· Tälle ohramutantilie annettiin vähän ennen esillä olevan hakemuksen sisäänjät-töpäivää, joka on 1975-10-15, nimi ant-13, ja mutantti on vapaasti saatavana virallisella rekisteröintinimityksellä n:o I97U: 11 Ui: 22θ3·

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa käytetään ohraa, jonka antosyanogeenipitoisuus on alle 20 mg 100 g:aa kohti kuiva-ainetta.

Antosyanogeenit ja katekiinit voidaan määrittää joko (1) Dadic'in menetelmällä American Society of Brewing Chemistry, Proceedings (1971) 159-170 tai Dadic'in ja Morrison'in menetelmällä American Society of Brewing Chemistry, Proceedings (1972) 50-56 tai (2) uudella menetelmällä, joka sopii näiden yhdisteiden määrityksiin yksittäisistä ohranjyvistä.

9 59119

Uusi menetelmä perustuu määrityksen suorittamiseen yhden jyvän neljäsosasta, jolloin käytetään ainoastaan jyvän endospermiosaa. Itu ja jäljelle jäävä endospermin osa voidaan kylvää ja siten saada lisääntymään. Koe kestää vain 2-5 min, joten on mahdollista suorittaa suuri määrä analyysejä suuresta määrästä jyviä yhtenä päivänä ilman, että jyvät vaurioituvat.

Ohranjyvästä leikataan pois noin neljäsosa (ei itua) ja pannaan tasapohjaiseen reagenssilasiin. Lisätään 1 ml 50-$:ista (tilav/tilav) etanolia, ja

Cr) jyvänpalanen hienonnetaan Polytronin avulla (PolytronVÖ/ PT 10-35, Kinematica, Sveitsi). Lisätään 1 ml vastavalmistettua 1-%:ista (paino/tilav) vanilliini-liuosta (Fluka, Sveitsi) väkevässä kloorivetyhapossa. Jos seoksessa on läsnä proantosyanidiineja ja/tai katekiineja, niin ne reagoivat heti vanilLiinin kanssa muodostaen punaisen kompleksin. Jos proantosyanidiineja ja/tai katekiineja ei ole läsnä, liuos jää värittömäksi tai vaaleankeltaiseksi kuten vanilliini-reagenssi.

Mutanttia ant-13 viljeltäessä saatua ohraa käytettiin mallastukseen ja oluen valmistukseen sinänsä tunnetulla tavalla koemittakaavassa ja täydessä mitt akaavas sa.

Ohramutanttia ant-13 on viljelty vuodesta 1960 lähtien, ja saaduista sadoista on tehty analyysejä. Näiden analyysien tulokset sekä vertailuksi kantaohralajikkeen Foman analyysit on esitetty seuraavassa taulukossa:

Taulukko 1

Linja ant-13 Foma

Korjuuvuosi 1969 1973 197** 1975 1976 1960 1973 197*» 1975

Antosyanogeenit modifioitu (Harris-Rickets-menetelmä) 2 3 3 2 - l6ä 161 150 156

Antosyanogeenit (Dadic) 1 1 120

Katekiinit (Dadic) 2 1» 117

Polyfenolien 3 5 237 kokonaismäärä (Dadic) 59119

Mutantin ominaisuudet määräytyvät yhden ainoan Mendelin resessiivisen geenin mukaan. Dialleelisissa risteytyksissä se on osoittautunut ei-alleeliseksi 13 muun geenin kanssa (ant 1-12 ja ant 14)» jotka kontrolloivat antosyaanien muodostusta. Mutantille tyypillinen geeni on paikallistettu ohran kromosomiin 7 risteyttämällä ant 13-13 kasvien kanssa, jotka kuuluvat 22 translokaatiota käsittävään koesarjaan, joka peittää kaikki 7 kromosomia, ja tutkimalla näiden risteytysten P2-sukupolvea. Liittymistä esiintyi risteytyksissä, joissa oli kromosomin 7 translokaatio.

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan lähemmin seuraavien suoritusesimerkkien avulla:

Esimerkki 1

Suoritettiin oluenvalmistuskoe ohramutentillä ant-13 ja vertailuksi läheisellä ohralajikkeella Ymer (Aufhammer et ai.,

European Brewery Convention, Barley Varieties EBC, 3» painos,

Elsevier Pubi. Comp., Amsterdam, London, New York, (1968) sivut 70-71· Kokeet suoritettiin seuraavalla tavalla: 14 kg ohraa liotettiin ja saatettiin itämään ruostumattomasta teräsverkosta valmistetussa kiertorummussa, jota ympäröi muovi-vaippa. Liotus suoritettiin kahden vuorokauden aikana, jolloin ohra oli vuorotellen vedessä ja ilmassa 14-15°C:ssa, kunnes sen vesipitoisuus oli 41—43 $>. Idätyksen aikana, joka suoritettiin 12°C:ssa 3-6 vrk kuluessa vesipitoisuutta ylläpidettiin tiputtamalla vettä. Idätystilan yläosaan johdettiin halutun lämpöistä ilmaa.

Saatua vihermallasta lämpikäsiteltiin (kuivattiin) uunissa. Ensimmäisten tuntien aikana maltaan lämpötila kohotettiin 30%:β#βη, ja tätä lämpötilaa ylläpidettiin aina 10 tuntiin asti minkä jälkeen lämpötila korotettiin 3 tunnin kuluessa 78°C:seen. Kuivatus tapahtui tässä lämpötilassa 3 tunnin aikana. Kuivattu mallas vietiin jälleen rumpuun, ajossa siitä rumpua kierrättämällä poistettiin juuri-idut.

10 kg jauhettua mallasta mäskättiin 42 l:ssa ionivapaata vettä. Käytettiin seuraavaa etandardimäskäysmenetelmää: 30 min 52°C:esa, kuumennus 52°Ctsta 63°Ciseen 20 minuutin aikana, 60 min 63°C:88a, kuumennus 63°C:sta 78°C:eeen 40 minuutin aikana, 10 min. 76°C:ssa. Vierre suodatetaan sihdillä 73°C:ssa, ja siihen lisätään vielä 4 annosta, 6+6+10+13 1 ionivapaata vettä.

Suodatusaika oli kaikkiaan 160 min, ja vierrettä saatiin 61-62 1. Lisättiin 8,7 g taimiinivapaata humaluutetta (Horst Company), ja vierrettä keitettiin 90 min, sitten se jäähdytettiin 5° Öiseen 11 59119 ja jätettiin 13 tunniksi jäävedellä jäähdytettyyn säiliöön.

Seuraavana päivänä jäähdytetty vierre siirrettiin 30 litran käymis-astiaan, ja siihen ympättiin Saccharomyces carlsbergensis -hiivaa josta oli poistettu mahdolliset polyfenolit pesemällä solut kuusi kertaa vedellä. Ymppäyshiivan määrä oli 90 g lingottua hiivaa 28 kg:a kohti vierrettä. Käymisastioiden lämpötila pidettiin vesi-termostaatin avulla 10°C:ssa. Viikon käymisen jälkeen olut siirrettiin 29 litran varastotankkiin, jota pidettiin jääkaapissa. Kuuden viikon varastoinnin aikana COp-paineessa oluen lämpötila laskettiin vähitellen 5 C:sta -1υ0:8ββη. Olut suodatettiin 20 x 20 cm Seitz K-7 levyjen lävitse, ja COg-pitoisuus säädettiin 0,3 $:ksi. Pullotus ja pullojen sulkeminen suoritettiin käsin. Pullot pastöroitiin 62°C:ssa 20 min.

Ohrasta, maltaasta, vierteestä ja oluesta suoritettiin seuraavat analyysit:

Ohran vesipitoisuus ja seula-analyysi (lajittelu) suoritettiin Analytics EBC:n Analysis Committee of European Brewery Convention T.-M. ENARI ed. Schweizerische Brauerei-Rundschau 3· painos, Zlirich (1975) mukaan. Ohran itämiskoe suoritettiin kylvämällä 100 jyvää kostealle hiekalle peitetyssä petrimaljassa (16-18°C ) ja laskemalla 3 vuorokauden kuluttua itäneet jyvät. Ohran, maltaan, vierteen ja oluen kokonaistyyppi määritettiin Kjeldahl-analyysillä, 1,000 g ohraa, 1,000 g mallasta, 3»0 ml vierrettä tai 5,0 ml olutta hajotettiin 35 min ajan seoksella, jossa oli 40 ml:11a väkevää rikkihappoa, 10 ml: 11a 35-$:ista vetyperoksidia, 0,75 g HgO ja 15 g K2S,0^. Tislaus suoritettiin käyttäen liuosta, jossa oli 400 g NaOH ja 80 g Na2S2 0j/litra Tisle kerättiin 2-$:iseen boorihappoon ja tiirattiin hapolla. Proteiini laskettiin seuraavasti: kokonais-N x 6,25.

Maltaasta määritettiin vesi, uute, uute-ero, diastaattinen voima, Kolbach-indeksi ja väri e.m. Analytica EBC:n mukaan. Alfa-amylaasi määritettiin Blom'in ja Eak'in menetelmällä (k.s. Zeitschrift fär Physiologische Chemie 256 1958 197-207· Vierteestä määritettiin uute, loppukäymisaste, kitkeryys ja väri em. Analytica-EBC:n mukaan. Vapaa alfa-aminotyyppi määritettiin spektrofotometrisesti 2,4,6-trinitro-bentseeni-1-sulfonihapon avulla. Satale'n et ai. esittämällä menetelmällä (Journal of Biochemistry (Tokyo) 47 I960 654-660. Viskositeetti määritettiin Haake-kuulaviskosimetrillä (Haake K.G., Berliini-Steglitz). Olutanalyysit suoritettiin em. Analytica-EBC:n mukaan, paitsi C02-määritys 12 591 1 9 joka tehtiin Blom'in mukaan (Brauwelt 95(1955) 645-646), vaahdon puoliintumisaika, joka määritettiin Blom'in mukaan (European Brewery Convention Proceedings Congress, Copenhagen (1957) 51-56), oluen päällä pullossa oleva ilma, jokä"määritettiin S/rensenin mukaan (European Brewery Convention Proceedings Congress, Rome (1959) 220-226) ja oluen säilyvyys, joka määritettiin muunnetun Chapon-menetelmän (1966) mukaan.

Vertailevista oluenvalmistuskokeista saadut tulokset on koottu taulukkoon 2:

Ohralaji ANT-13 Ymer

Ohra: antosyanogeenit (mg/100 g kuiva-ainetta) 0 140 katekiinit " 1 147

Mallas: uute, hienojauho kuiva-ainetta (Plato) ) 79*6 78,6 antosyanogeenit (mg/100 g kuiva-ainetta) 1 110 katekiinit 4 158

Vierre 1 kantavierre (56 Plato) 10,9 10,9 käymisen näennäi- , nen päättyminen ( 96 ) 77,0 77,5 antosyanogeenit (mg/l ) 0 73

Olut: uute (?£ Plato) 10,6 10,7 näennäinen käyminen ( 56 ) 74 74 antosyanogeenit (mg/l) 1 57 vaahdon puoliintumisaika (sekuntia) 99 90 ml ilmaa/pullo 0,8 0,6 kylmäsameuden kasvu säilytettäessä 45°C:ssa1^ 1 viikko (EBC-yfcsikköä) 0,2 4,4 4 viikkoa " " 0,6 >20 \hiborgin menetelmä: Vastalaskettua olutta säilytetään 48 tuntia 0° C:ssa. Kylmäsameus mitataan Zeiss-nefelometrillä. Kylmäsameus mitataan uudelleen 1 ja 4 viikon säilytyksen jälkeen 45°C:sea.

Edellä olevista tuloksista nähdään, että mallas, vierre ja olut, jota tässä ensimmäisessä kokeessa valmistettiin, eivät sisältäneet mitattavia määriä proantosyanidiineja ja että oluen kemiallinen säilyvyys oli olennaisesti parantunut.

Esimerkki 2

Vuonna 1975 korjatulla olutmutantilla ant-15 suoritettiin koemitta-kaavassa mallastus ja oluenvalmistus vastaavalla tavalla kuin kanta-lajikkeella Foma.

13 5 91 1 9

Tulokset nähdään seuraavissa taulukoissa 3-8.

Taulukko 3

Koemallastukseen käytetyn ohran analyysiarvot_ ant-13 Foma

Vesi, io 12,0 12,1

Proteiini, i> kuiva-aineesta 17»2 16,2

Itävyys 3 vrkin kuluttua, i 100 100

Seulonta-analyysi t yli 2,8 mm, i 19 46 " 2,5 mm, io 60 44 " 2,2 mm, i 19 9 alje 2,2 mm, $21

Taulukko 4

Neljän ant-13- .ia Foma-maltaan analyysiarvot ant-13 Foma

Vesi i> a 5 c 3 e ’ * 4,5 4,5 4,6 4,8

Uute, i Plato 78,1 78,0 78,8 78,9

Uute-ero, $ Plato 5,15,0 4,3 4,6

Proteiini, io kuiva-aineesta 15,3 14,9 14,1 13,6

Alfa-amyl aasi, mielivaltainen yksikkö 149 158 177 191

Biastaattinen voima, Windisch-

Kolbach-yksikkö jä ^15 ^69 440

Kolbach-indeksi, $ 41 59 39 3Θ

Vierteen väri, EBC-yksikköjä 5,0 5,0 4,5 4,0 \k 5911 9

Taulukko 5

Ant- 13- ja. Foma-maltaista kokeissa valmistettujen vierteiden analyysi-arvot ant-13 Poma ab c d

Uute, % Plato 9,72 10,87 10,22 10,00 Käymisen näennäinen loppu, i<> 59 59 62 61

Kitkeräaine, EBC 30 28 31 33

Kokonais-N mg/l - 1398 - 1258

Vapaa alfa-amino-N, mg/l 333 380 333 349 pH 5»6 5.8 5,7 5.7 Väri, EBC yks. 11 10 10 10

Viskositeetti, mPa 1,86 1,87 1,92 2,02

Taulukko 6

Ant-13- .1a Foma-maltaista saatujen oiutnäytteiden analyyslarvot ant-13 FSma ab cd

Alkuperäinen uute, i» Plato 9,7 9,7 10,3 10,1 Näennäinen käyminen, $ 59 58 61 61

Kitkeräaine, EBC 21 20 19 20

Kokonais-N, mg/l 1172 1153 1070 1050

Vapaa alfa-amino-N, mg/l 203 239 239 222 pH 4,7 4,6 4,7 4,7 C02, % 0,46 0,51 0,49 0,51 Väri, EBC-yks. 8,5 7,5 7,5 7,5

Vaahdon puoliintumisaika, sek. 109 114 111 108

Ilma, ml/pullo 1,7 1,6 1,3 1,3

Makuprofiili: KoevalmMuksen Koevalmistuksen makupaneeli normaaleissa normaaleissa maku- makurajoissa rajoissa 5 59119

Taulukko 7 ^ '

Polyfenole.ia ohrassa, vierteessä .ia oluessa____.

ant-15 Foma

Ohrai ' ..

Antosyanogeen.it, mg/100 g kuiva-ainetta (modif. Harris & Ricketts) ®

Katekiinit/mg/100 g kuiva-ainetta _O_10£_ (Dadic) , , v ' a b c d

Vierre

Antosyanogeenit, mg/l (modif Harris & Ricketts) O O 38 43

Katekiinit mg/l (Dadic) 38 31 97 69

Polyfenolit, mg/l (Jerumanis) 18 16 105 102

Olut

Antosyanogeenit, mg/l (modif. Harris & Ricketts) O O 31 29

Katekiinit, mg/l (Dadic) 37 40 61 61

Polyfenolit,mg/l (jerumanis) 7 7 83 86

Taulukko 8

Keskioluen kemiallinen pysyvyys ant-13 Foma 6 ^ A Id

Sameus pullotuksen jälkeen, EBC-yks. 0,9 0,8 0,9 0,9

Kylmäsameus 5 vrk jälkeen 60°C:esa Ja 1 vrk:n jälkeen 0°C:ssa, EBC-yks. 1,6 1,9 7,2 12,0

Sameus 40 min. jälkeen -ö°C:ssa, EBC-yks.

(Chapon) 3.3 3,5__>12.5_

Ilma, ml/pullo 1,7 1,6 1,3 1,3 1 Ci 5 9119

Edellä olevien tulosten saamiseen on käytetty lisäksi mm. seuraavassa esitettyjä analyysimenetelmiä.

.V.... Antosyanogeenimääritys:

Em. Harris'in ja Rioketts'in kuvaamaa analyysimenetelmää muunnettiin, jolloin se suoritettiin seuraavasti: 5>0 g vasta-jauhettua ohrajauhoa (Prometer-mylly) uutettiin tunnin ajan sekoittaen 50 mlslla 60-$:ista (tilav/tilav) etanolia, joka sisälsi 1 n (paino/tilav) askorbiinihappoa. Seos lingottiin 10 min ajan kiihtyvyydellä 4100 x g Sorval-jäähdytyssentrifugissa, ja laskeuma uutettiin samalla tavalla uudelleen. Kaikkiaan suoritettiin 4 uuttoa, jolloin ohrasta olevista antosyanogeeneistä saatiin talteen 97-99 i°· Yhdistetyt uutteet laimennettiin uutto-aineella 250 ml:ksi.

10 ml uutetta, vierrettä tai olutta pipetoitiin 25 ml:n asteikolla varustettuun sentrifugiputkeen, ja putkeen lisättiin 0,5 g polyamidijauhetta (Divergan), sitten putkea ravisteltiin 40 min 5 minuutin 1inhoamisen jälkeen kiihtyvyydellä 5000 x g polyamidijauheesta koostuva antosyanogeeneja adsorboituneena sisältävä kakku pestiin tislatulla vedellä ja lingottiin uudelleen. Antesyanegeenin lakaisemiseksi ja muuttamiseksi amtesyani-diiniksi ja katekiiniksi lisättiin kakkuun 20 ml väkevää HC1 (5:1 tilav/tilav) ja näytteitä kuumennettiin kiehuvassa vesihauteessa 30 min. Näytteet jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, ne laimennettiin 25 ml:kai, ja antesyanidiinipiteisuus määritettiin mittaamalla liuoksen ekstinktio aaltopituudella 550 nm, jeka em syanidiinim butanoli-HCl-liuoksen absorptiomaksin läheisyydessä.

Ekstinktio mitattiin Zeiss FMQ III epektrofotometrillä käyttäen sokeakokeena tislattua vettä, jota oli käsitelty samoin kuin ohrajauhouutetta. Antosyanogeenipitoisuus laskettiin kalib-rointikäyrästä, joka oli saatu käyttämällä tunnettuja määriä leukosyanidiinihydraattia (Eluka) liuotettuna butanoli-HCl:ään. Tavallisesti analysoitiin rinnakkain kaksi näytettä. Jos ekstinktio-arvojen erotus oli yli 0,010, suoritettiin kolmas analyysi. Antosyanogeenipitoisuutta laskettaessa käytettiin toisiaan lähinnä olevien ekstinktioarvojen keskiarvoa.

Polyfenolien määritys vierteestä .ia oluesta

Polyfenolien määritykseen vierteestä ja oluesta käytettiin Jerumanis'in (ks. em. Analytica-EBC, 1975) kehittämää menetelmää. Oluesta poistettiin kaasut ennen määritystä ravistelemalla.

59119

Reagenssit: CM/EDTA-reagenssi: 1$:nen (paino/tilav) alhais-viskoosisen karboksimetyyliselluloosan (British Drug Bouse) liuos» joka sisälsi 0,2 ^ (paino/tilav) dinatriummetyleenidiami$nitetra-asetaattia. Ferri-reagenssis3»5-^sinen (paino/tilav) vihreä ammoniumferrisitraatti. Ammoniakkireagenssi: väkevän/ammoniumhydreksidin vesiliuos laimennettuna kahdella tilavuueosalla tislattua vettä.

10 ml analyysinäytettä ja 8 ml CM/EDTA-reagenssia sekoitettiin, ja seokseen lisättiin sekoittaen 0,5 ml ferrireagenssia. Sitten lisättiin 0,5 ml ammoniakkireagenssia, ja liuosta sekoitettiin huolella. Se laimennettiin tislatulla vedellä 25 mltksi, ja sitä sekoitettiin perusteellisesti, ja sen sumettiin sitten seistä 10 min. Polyfenolit reagoivat ferri-ionien kanssa alkalisessa liuoksessa aiheuttaen punaisen tai punaruskean värin syntymisen. Ekstinktio mitattiin Zeiss FMift II spektrofotometrillä aaltopituudella 525 nm käyttäen sokeakokeena samaa liuosta, jota käytettiin analyysiin. Sokeakokeesta oli poistettu polyfenolit käsittelemällä pestyllä Polyclar AT:llä (General Aniline and Film Co.). Muuten sokeakoetta on käsitelty samoin kuin analyysi-kokeita.

Pölyfenolien konsentraatio miljoonasosina laskettiin lausekkeesta E 525 x 630.

Edellä kuvatuista kokeista saatiin seuraavat tulokset; y-amylaasiaktiviteetin vähenemistä lukuunottamatta molemmat ant-13:n mallasnäytteet olivat sangen samankaltaisia rehu- ja mallas-ohralajikkeesta Foma valmistettujen näytteiden kanssa (taulukko 4). Mallasanalyysitplokset ovat koemallastamoissa valmistetuille maltaille määritellyissä normaalirajoissa.

Vastaavasti saatiin verrattaessa kahden ant-1J vierteen ja Foma-vierteen analyysiarvoja tulokseksi, etteivät ne poikenneet toisistaan olennaisesti (taulukko 5)· Mahdollisesti ant-13-maltaasta valmistetun vierteen kokonais-N-pitoisuus oli jonkin verran korkeampi.

Tämä johtuu antosyanogeenien puuttumisesta, jotka muuten saostaisivat olennaisia määriä proteiinia.

Myös ant-13 ja Foma-lajikkeesta valmistettujen oluiden analyyetulokset olivat sangen samankaltaiset (taulukko 6). Antosyano-geenien puuttuminen oluesta ei vaikuttanut makuun (taulukko 7), sillä makupaneeli (De forenade Bryggeriers smagpanel) sijoitti koeolut-näytteiden maut normaaleihin makurajoihin. Taulukossa 7 esitetyt polyfeneli-määritykset suoritettiin Jerumanis-menetelmällä, jonka tuloksia ai voi verrata Dadic-menetelmän tuloksiin. Ant-I3:sta valmistetusta vierteestä ja oluesta saadut katekiiniarvot eivät johdu ohran tai maltaan 18 591 1 9 sisältämästä katekiinista, koska niissä ei Dadic-analyysin mukaan ollut kate-kiinia. Kokeet ovat osoittaneet, että valmistuksessa käytetty tanniinivapaa humaluute saattoi korottaa katekiinia 3 mg/1. On osoitettu, että vierteen-keitossa syntyvät meladoidiinit vaikuttavat katekiinimääritykseen ja aiheuttavat katekiinia osoittavia tuloksia.

Ant-13:sta ja Fomasta valmistetun oluen kemiallista pysyvyyttä verrattiin, ja tulokset nähdään taulukossa 8. Välittömästi oluen pullotuksen jälkeen ei esiintynyt minkäänlaista sameuseroa. 5 vuorokauden 60°C:ssa ja 1 vuorokauden 0°C:ssa seisotuksen jälkeen määritetty kylmäsameus oli ant-13-oluella verrattuna Foma-olueeseen olennaisesti vähäisempi.

Käyttämällä ant-13~ohraa saatiin tulokseksi olutta, jonka kemiallinen pysyvyys oli sellainen, joka voitiin Foma-ohraa käytettäessä saavuttaa vain käsittelemällä kemiallisilla stabilointiaineilla. Sellaista antosyaxiogeeriien selektiivistä poistoa maltaasta, vierteestä ja oluesta, joka saadaan mallas-tettaessa ohramutanttia ant-13 ja valmistettaessa siitä olutta, ei voida saavuttaa suurillakaan määrillä Polyclar AT:tä. Voidaan siis vetää johtopäätökseksi, että antosyanogeenien ja katekiinien selektiivisellä poistamisella ohran biokemiallisen mutaation avulla saadaan aikaan erittäin tyydyttävä oluen säilyvyys ilman, että tarvitsee poistaa sellaisia olutaineosia, jotka takaavat sille halutun värin ja aromin.