FI58700B - Foerfarande foer maetning av blodplaettars spontana aggregation i blodplaettsrik citratplasma - Google Patents

Description

I. .-"—ΤΙ ,Β, .... KU ULUTUSJULKAISU ρΟΠΛΠ B ^ UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 870 0 («) C Patentti rayönnetty 10 03 1981 (51) 53A8 SUOM I — FI N LAN D (21) P»t*nttlh»kemu* — Pttenunidknlng 750^1+6 (22) H»k*ml*ptlvi— Ansöknlngtdag 18.02.75 (Fl) (23) Alkupilvi — Giltlghetsdag 18.02.75 (41) Tullut |ulklieksl — Bllvlt offentiig 22.08.75

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nihtlvlktlpanon |» kuuLJulktltun pvm. —

Patent· och registerstyrelsen Amökan utlagd och utl.skrlften publlcerad 28.11.80 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeu»—Begird prlorltet 21.02.7^

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2^08211+.2-52 (71) B. Braun Melsungen Aktiengesellschaft, Carl-Braun-Str. 1, 3508 Melsungen, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Klaus Breddin, Walldorf, Wolfgang Schremmer, Obermelsungen,

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7^t) Oy Kolster Ab (5M Menetelmä verihiutaleiden spontaanin kasautumisen mittaamiseksi runsaasti verihiutaleita sisältävässä sitraattiplasmassa - Förfarande för mätning av blodplättars spontana aggregation i blodplättsrik citratplasma

Keksinnön kohteena on menetelmä verihiutaleiden spontaanin kasautumisen mittaamiseksi runsaasti verihiutaleita sisältävässä sitraattiplasmassa pyörittämällä tutkirausnäytettä sisältävää astiaa. Verihiutaleiden tarttuminen suonen seinämälle ja verihiutalekasaumien muodostuminen ovat kaksi tärkeää fysiologista tapahtumaa, kun asetetaan verenvuoto haavoittumisen jälkeen ja todennäköisesti myös verisuonten jatkuvan ahtautumisen yhteydessä.

Samalla on trombosyyttien tarttumista suoniseinämäen muuttuneille alueille ja siihen liittyvää verihiutaleiden kasaumaa pidettävä ensimmäisinä vaiheina valtimo- ja laskimotukosten muodostumisessa.

Trombosyyttien kasautumisen tutkimukset kiinnostavat kliinikkoa, koska nair. voidaan löytää määrätyt verenvuotosairaudet, jotka johtuvat trombosyyttien vähentyneestä toiminnasta, ja koska näin voidaan todeta verihiutaleiden kasvanut kasautuma salttius .

Kasvanut kasautumistaipumus on todettavissa potilaissa, jotka kärsivät sokeritaudista, valtimonkovetustaudista, ja sydäninfarktin jälkeisessä tilassa, mutta myös laskimotukosten yhteydessä. On todistettavissa, että verihiutaleiden 2 58700 liikakasautuminen on tärkeä vaaratekijä, joka voi johtaa veritukkotulppaumaan valtimonkovetustaudin yhteydessä, ja todennäköisesti myös tärkeä vaaratekijä itse valtimonkovetustaudin kehittymisen kannalta-

Muutaman vuoden aikana on ollut saatavissa lääkkeitä, joita voi käyttää tukosten ehkäisyyn, koska ne estävät trombosyyttien kasautumista. Laitteiden avulla voidaan tällaisten lääkkeiden vaikutusta valvoa luotettavalla tavalla.

Verihiutalekasaumien arvioimiseksi tunnetaan erilaisia menetelmiä:

Ns. pidätyskokeen avulla saadaan selville trombosyyttimäärä ennen kuin veri tai veriplasma on kulkenut esim. lasihelmistä tai polyamidikuiduista koostuvan suodattimen läpi sekä tämän jälkeen. Pidätys määritetään suodattimeen jäävien verihiutaleiden prosenttilukuna.

Tämä menetelmä on epätarkka, koska hajonta on hyvin suuri. Lisäksi on veri-hiutaleidei tarttuminen erilainen riippuen käytetystä suodatinaineesta.

Tulos on riippuvainen sekä hiutaleiden tarttumisesta että niiden kasautumisesta -

Kirjallisuutta :

Moolten, S.E., L. Vroman: The adhesiveness of blood platelets in thromboembolism and hemorrhagic disorders- I Measurement of platelet adhesiveness by glasswool filter. Amer. J. elin. Path. 19:701 (19^9)- Hellem, A.J.: The adhesiveness of human blood platelets in vitro. Scand. J. elin. Lab. Invest, Suppl. 91:1 (i960). Saizmann, E.W. : Measurement of platelet adhesiveness. J.Lab.elin.Med. 62-'J2b (1963). Morris, C.D.W. : Acetylsalicylic acid and platelet stickiness. Lancet 1967/1, 279·

Toisessa menetelmässä mitataan runsaasti verihiutaleita sisältävän veriplasman optisen tiheyden muutos, kun on lisätty ns. laukaisimet. Tässä fotometrisessä menetelmässä sekoitetaan runsaasti verihiutaleita sisältävää plasmaa voimakkaasti pystysuorassa lasiputkessa, joka on valomittarin säteen tiellä, pienen magneetin avulla. Kasautuminen laukaistaan lisäämällä adenosindifosfaattia, kollageenia tai adrenaliinia ja optisen tiheyden muuttuminen merkitään muistiin.

Kirjallisuutta:

Bom, G.V.R.: Quantitative investigations into the aggregation of blood platelets. J. Physiol. 162:67 (1962). O'Brien, J.R.: The adhesiveness of native platelets and its prevention. J. Clin. Path. 15:1^0 (1961).

Tämä menetelmä tekee mahdolliseksi kasautumisen toteamisen. Lisäksi voidaan tutkia kasautumista estävien lääkkeiden vaikutusta kollageenilla jne. aikaansaadun kasautumisen yhteydessä. Tällä menetelmällä ei kuitenkaan voi osoittaa verihiutaleiden spontaanisti kasvanutta kasautumistaipumusta. Menetelmä ei sovellu tukos-alttiuden toteamiseen. Tämän menetelmän muunnoksessa plasma kiertää kiertoj ärjβει elmässä ja trombosyyttien kasaumat poistetaan suodattimena. Mittaus tapahtuu läpivirtausaltaassa. Kasaumat lauteistaan kollageenilla- Tälläkään menetelmällä ei voida todeta spontaanisti kasvavaa kasautumista.

3 58700

Kirjallisuutta :

Heinrich, D. ja L. Roka: Methode zur Bestimmung der Thrombozyten-Aggregation. Klin.WSCR U8:235 (1969)·

Saksalaisessa hakemusjulkaisussa 2 I5U 066 on esitetty menetelmä ja laite kaikkia osasia sisältävien verinäytteiden trombolyyttien kasautumisen mittaamiseksi. Menetelmässä on seuraavat erityispiirteet: 1. Sitraattiverta sentrifugoidaan pyörimiskamniossa. Tällöin raskaat punaiset verihiukkaset kerääntyvät sentrifugointikammion reunalle.

2. Valonläpäisevyys voidaan mitata plasman keskivyöhykkeestä, joka myös sisältää trombosyytit.

3· Tärkein parametri on samasta koehenkilöstä otettujen kahden plasmanäyt-teen valonläpäisevyyden ero, joista näytteistä toista on vain sentrifugoitu kun taas toisessa kasautuminen on laukaistu lisäämällä kasautumisen laukaisinta, esim.

" adenosindifosfaattia tai muita kemiallisia laukaisuaineita tai vuorotellen kiih dyttämällä ja jarruttamalla sentrifugointikammiota.

Valonläpäisevyydessä esiintyvä ero voidaan myös todeta verinäytteessä, jolloin ensin todetaan sentrifugoidun näytteen valonläpäisevyys, tämän jälkeen laukaisimen lisäämisen jälkeen sitraattiveren kasautuminen aikaansaadaan vuorotellen kiihdyttämällä ja hidastamalla sentrifugointikammiota ja valonläpäisevyys mitataan uudelleen toisen sentrifugoinnin jälkeen. Tällöin rekisteröidään valonläpäisevyydessä esiintyvä muutos, joka on seuraus trombosyyttien kasautumisesta. Tällä tavalla ei saada selville kasautumisprosessin nopeutta eikä alkua.

Breddin on kehittänyt menetelmän, jolla voidaan osoittaa erityisesti plasman spontaani kasautumistaipumus. Runsaasti verihiutaleita sisältävää sitraatti-plasmaa pyöritetään 37°C lämpötilassa silikonisoiduissa lasikolveissa, joiden tilavuus on 20 ml. Trombosyyteillä on täten mahdollisuus koskettaa toisiinsa, lyöri-tettyä ja ohennettua plasmaa asetetaan muoviselle objektilasille. 30-^5 minuutin kosketusajan jälkeen valmiste kiinnitetään, hapetetaan, väritetään ja sitä tutkitaan mikroskoopilla. Tällä menetelmällä voidaan luotettavasti ja j §1 j ennett ävästi todeta trombosyyttien spontaanisti kasvanut ksasautuminen. Myöskin kasautumista estävien aineiden vaikutusta voidaan kokeilla koelasissa ja elimistössä, kun esiintyy kasvanutta kasautumista. Menetelmällä ei kuitenkaan voida jatkuvasti rekisteröidä kasautumisen kulkua. Tutkimus mikroskoopilla saattaa johtaa subjektiivisiin virheisiin. Kun kasautuminen on suurinmillaan, ei ole mahdollista määrittää, minkä ajan kuluessa on saavutettu kasautumistila. Näin ollen ei saada erästä tärkeää difforenlloimismahdollisuutta kliinisiä tutkimuksia varten. Lisäksi tutkimustulos on käytettävissä aikaisintaan 90 minuutin jälkeen. Tarvittu plasmamäärä on myös verraten suuri.

Kirjallisuutta:

Breddin, K.: Die Thrombozytenfunktion bei hämorrhagischen Diathesen, 1, 58700

Thrombosen und Gefässkrankheiten. Thrombos. Diathes. haemorrh. Suppl. 27 (1968). Breddin. K. , J. Bauke: Thrombozytenagglutination und Gefässkrankheiten. Blut ll:lUU

(1965).

Keksinnön tehtävänä on saada aikaan menetelmä, jolla voidaan luotettavalla tavalla mitata ja merkitä ylös jatkuvasti spontaanisti kasvanut kasautumistaipumus runsaasti verihiutaleita sisältävässä sitraattiplasmassa, jolla lisäksi voidaan mitata kasvanut kasautumistaipumus verisuonisairaissa ja jolla voidaan suorittaa sarjatutkimuksia terveissä ja verisuonisairaissa. Tarvitun verimäärän tulisi olla noin 2-5 ml sitraattiverta ja siten noin 0,5-1 ml sitraattiplasmaa tai vähemmän jokaista koetta varten.

Nämä tehtävät ratkaistaan keksinnön mukaisesti patenttivaatimuksen tunnus-merkkiosassa määritellyn menetelmän avulla.

Päinvastoin kuin saksalaisen hakemusjulkaisun 2 15^ 066 mukaisessa menetelmässä vereen ei lisätä mitään kasautumista laukaisevaa ainetta. Keksinnön mukaisessa menetelmässä kasautuminen perustuu siihen, että kasautumisen laukaisimina· ovat pla.smaproteiinit, jotka on aktivoitu potilaan organianissa.

Trombosyyttien kasautumisen edellytyksinä esillä olevassa menetelmässä ovat plasman hitaat liikkeet, jotta ensimmäiset löysät kasautumiset eivät uudelleen hajoaisi. Tämä saadaan aikaan pyörittämällä levyallasta nopeudella 10-60, edullisesti 20 r/min. Pyörittämisellä ei pyritä, kutoi saksalaisessa hakemusjulkaisussa 2 15*+ Ο66, erytrosyyttien erottamiseen ( sentrifugoimiseen ). Tarkan mitta tuloksen saavuttamiseksi levyallas on asetettu siten valomittarin valonsäteeseen nähden, että valonsäde kulkee levyaltaan alakvadrantin läpi.

Kasautumisen kulku voidaan todeta jatkuvasti, joten kasautumisen alku ja nopeus voidaan rekisteröidä.

Keksinnön valai semiseksi lähemmin viitataan piirustuksiin, joissa: kuvio 1 esittää kaaviomaista kuvantoa menetelmän suorittamiseen sopivasta mittaus- ja rekisteröintilaitteesta pitkittäisläpileikkauksenaj kuvio 2 esittää kuvantoa ylhäältä samasta aiheesta; kuvio 3 esittää kaaviomaista kuvantoa kertakäyttöaltaasta; ja kuvio 1 esittää kaaviomaista kuvantoa monikertakäyttöisestä altaasta ja sen eri osista.

Valomittarin 2 säteen 1 tiellä pyörii temperoitava levyallas 3· Tämä levy-allas täytetään runsaasti verihiutaleita sisältävällä veriplasmalla. Kun tässä plasmassa tapahtuu verihiutaleiden kasautumista, niin sen valonläpäisevyys kasvaa ja optinen tiheys pienenee. Valonläpäisevyys mitataan ja merkitään ylös käyränä kaupasta saatavalla kompensaatiopiirturilla.

Mittaus tapahtuu valomittarilla 2, valonlähteellä 2a ja käyttäen noin 500-650 nm:n, mieluiten 5^6 nm:n, valon suodatinta 5·

Valon suodattimen 5 ja levyaltaan 3 välille on asennettu reikähimmennin 6, 5 58700 jossa reiän halkaisija on noin 0,5~3 mm, mieluiten 2 mm, valonsäteen rajoittamiseksi .

Levyallas 3 asetetaan pyörivään rumpuun 7, johon se kiinnitetään pidätys-laitteella, esim· O-renkaalla 8. Pyörivä rumpu 7 on asennettu kuumennusvastuksella 9 kuumennettavaan metalliiohkoon 10, joka on esim· alumiinia. Levyaltaan 3 tempo-rointi tapahtuu siten lohkotermostaattien periaatteen mukaisesti: kuumennusvastus 9 kuumentaa alumiinilohkoa 10 ja tänä johtaa lämmön levyaltaaseen 3- Lämjjötilan vakautus esim. arvoon 37° ±0,5° tapahtuu 2-Pkt-säätöpiirin kautta, jolloin lämpötilan tuntoelimenä 11 on esim. NTC-vastus. Lämpötilavakio saavutetaan noin 15-20 minuutin kuluttua.

Levyallas 3 pyörii noin 10-60 r/min. mieluiten noin 30 r/min. kierrosluvulla. Se on asennettu valomittarin säteen tielle niin, että valonsäde kulkee sen toisen alennan kvadrantin 12 läpi. Mittauspaikka on noin 5 mm vaakasuoran levyhal-kaisijän alla ja noin U mm pystysuorasta levyhalkaisijasta. Käyttö tapahtuu moottorilla, jonka kierrosluku on vakautettu.

Tässä voidaan käyttää altaan kahta toteutusmuotoa, kerta-allasta l^t, joka on esim. lasia tai läpinäkyvää tekoainetta, kuten polymetyylimetakrylaattia tai polystyrolia, ja monikertakäyttöistä allasta 15, joka on samaa ainetta ja jota voi käyttää monta kertaa. Monikertakäyttöallas koostuu rummusta 16, joka on esim. polyvinyylikloridia, ja kahdesta peitelevystä 17, 18, jotka ovat esim. polymetyylimetakrylaattia. Altaiden ulkohalkaisija on noin 20 mm ja sisähalkaisija noin 18 mm.

Runsaasti verihiutaleita sisältävä sitraattiplasma, jolla suoritetaan verihiutaleiden spontaanin kasautumisen keksinnön mukainen, fotometrinen mittaus ja rekisteröinti, saadaan sitraattiverestä linkoamalla lyhyen ajan (noin 1-1,5 minuuttia, 100-150 G). Veren otto ja sitraattiveren valmistus suoritetaan niin, että 10 ml uuteen suonivereen sekoitetaan perusteellisesti 1 ml 3,8 %:sta. vesinatrium-sitraattiliuosta.

Jokaisessa kokeessa käytetään noin 0,5~1 ml sitraattiplasmaa, mikä vastaa 2-5 ml sitraattiverta.