DK145126B - Fremgangsmaade til maaling af den spontane aggregering af blodplader i blodpladerigt citratplasma - Google Patents

Description

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (n) 145126 B

(ftl \Ri

(19) DANMARK

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 659/75 (51) IntCI.* 6 01 N 33/48 (22) Indleveringsdag 20. feb. 1975 (24) Løbedag 20. feb. 1975 (41) Aim. tilgængelig 22. aug. 1975 (44) Fremlagt 6. s ep. 1 982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 21. feb. 1974, 2408214, DE

(71) Ansøger B. BRAUN MELSUNGEN AKTIENGESELLSCHAFT, 5508 Melstangen, DE.

(72) Opfinder Klaus Breddin, DE: Wolfgang Schremmer, DE.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til måling af den spontane aggregering af blodplader 1 blodpladerigt citratplasma.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til måling af den spontane aggregering af blodplader (thrombocyter) i blodpladerigt citratplasma ved optisk bestemmelse under rotation af en undersøgelsesprøve indeholdt i en beholder.

Thrombocyternes vedhængning til karvæggen og dannelsen af jjj pladeaggregater er to vigtige fysiologiske tildragelser ved blodstands- ^ ning efter kvæstelser, læsioner eller sår og sandsynligvis også ved ^ den kontinuerlige tilstopning af blodkar.

r~ f) Samtidig må thrombocytvedhængningen til forandrede karvægs- ^ områder og den herpå følgende pladeaggregering anses for den første tildragelse ved dannelsen af arterielle og venøse thromboser.

*

Q

2 145126

Undersøgelser over thrombocytaggregeringen interesserer klinikeren i henseende til klarlæggelse af bestemte blødningssygdomme, der beror på en nedsat thrombocytfunktion, såvel som med henblik på forståelsen af et øget aggregeringsberedskab hos blodpladerne.

En øget tilbøjelighed til aggregering kan konstateres hos patienter med diabetes-mellitus, fremadskridende arteriosclerose og i tilstanden efter hjerteinfarkt, men også ved venøse thromboser.

Det lader sig påvise, at den forøgede pladeaggregering er en vigtig risikofaktor for thromboemboliske komplikationer hos personer, der lider af arteriosclerose, og sandsynligvis også er en væsentlig risikofaktor for selve arteriosclerosens fremadskriden.

Allerede i en del år har man rådet over medikamenter, der kan anvendes til thromboseprophylakse, fordi de hæmmer thrombocytaggregeringen. Sådanne medikamenters virkning ønskes overvåget med yderligere pålidelighed ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til bedømmelsen af blodpladeaggregeringen kendes forskellige metoder:

Ved hjælp af den såkaldte retentionsprøve konstateres eller bedømmes thrombocyttallet før og efter blodets eller blodplasmas passage gennem et filter, f.eks. af glasperler eller polyamidfibre. Retentionen defineres som procentdelen af de i filteret tilbageholdte blodplader.

Denne fremgangsmåde er unøjagtig, da fordelingsbredden er meget stor. Hertil kommer, at blodpladernes vedhængning er forskellig alt efter det anvendte filtermateriale.

Resultatet afhænger både af vedhængningen og af pladernes aggregering.

Litteratur:

Moolten, S.E., L. Vroman: The adhesiveness of blood platelets in thromboembolism and hemorrhagic disorders. I. Measurement of platelet adhesiveness by glasswool filter. Amer. J. clin. Path. 19_ : 701 (1949).

Hellem, A.J.:

The adhesiveness of human blood platelets in vitro.

Scand. J. clin. Lab. Invest. Suppl. 51 : 1 (1960).

Salzmann, E.W.:

Measurement of platelet adhesiveness. J. Lab. clin. Med.

62 : 724 (1963) .

Morris, C.D.W.:

Acetylsalicylic acid and platelet stickiness. Lancet 1967/1, 279.

3 145126

Ved en anden fremgangsmåde måles ændringen i optisk tæthed for en pladerig blodplasma efter tilsætning af såkaldte udløsere. Ved denne fotometriske metode omrøres pladerig plasma i et lodret stående glasrør, der befinder sig i et fotometers strålegang, kraftigt med en lille magnet. Aggregeringen udløses ved tilsætning af adenosindiphos-phat, kollagen eller adrenalin, og ændringen i den optiske tæthed optegnes .

Litteratur:

Born, G.V.R.:

Quantitative investigations into the aggregation of blood platelets. J. Physiol. 162 : 67 (1962).

O'Brien, J.R.:

The adhesiveness of native platelets and its prevention J. clin. Path. 14 : 140 (1961)

Denne fremgangsmåde gør det muligt specifikt at finde frem til aggregeringen og konstatere dennes betydning. Endvidere kan virkningen af aggregeringshæmmende medikamenter bedømmes ved hjælp af den med kollagen osv. fremkaldte aggregering. Det er dog ikke muligt med denne metode at eftervise en spontan forøget aggregeringstilbøjelighed hos blodpladerne. Til erkendelse af en thrombosetilbøjelighed er dennø fremgangsmåde ikke egnet.

Ved en modifikation af denne fremgangsmåde cirkulerer plasma i et kredsløbssystem, og thrombocytaggregaterne fjernes med et filter. Målingen sker i en gennemstrømningscuvette. Aggregeringen udløses med kollagen. Heller ikke ved denne fremgangsmåde kan den spontant forøgede aggregering konstateres.

Litteratur;

Heinrich, D. og L. Roka:

Methode zur Bestimmung der Thrombocyten-Aggregation.

KLIN.-WSCR 48: 235 (1969).

I tysk offentliggørelsesskrift nr. 21 54 066 er beskrevet en fremgangsmåde og et apparat til måling af thrombocytters sammenklumpning i prøver, som indeholder alle blods bestanddele. Denne fremgangsmådes særegenheder karakteriseres ved følgende foranstaltninger: 1. Citratblod centrifugeres med høj omløbshastighed i et rotationskammer. Herved presses de røde blodlegemer med den højere massefylde ud i centrifugeringskammerets randzone.

2. Lysgennemtrængeligheden (transmissionen) kan måles i den centrale plasmazone, der også indeholder thrombocytterne.

: 4 145126 3. Den vigtigste parameter ved fremgangsmåden ifølge tysk offentliggørelsesskrift nr. 21 54 066 er forskellen i lysgennemtrængelighed hos to plasmaprøver fra samme forsøgsperson, hvoraf den ene • kun er centrifugeret, medens den anden har fået udløst aggregeringen (thrombocytternes sammenklumpning) ved tilsætning af en aggregeringsudløser, f.eks. med ADP (adenosindiphosphat) eller andre kemiske udløserstoffer eller ved det fra citratblodets erythrocytter stammende ADP eller også ved skiftevis at køre centrifugekammeret op og ned i hastighed.

4. Forskellen i lysgennemtrængelighed kan også findes, idet man først konstaterer den centrifugerede prøves lysgennemtrængelighed, hvorefter man tilsætter udløseren og fremkalder aggregering ved afvekslende at accellerere og decellerere centrifugekammeret og efter fornyet centrifugering igen måler lysgennemtrængeligheden.

Den ændring, som thrombocytternes aggregering fremkalder i lysgennemtrængeligheden, registreres. Ifølge denne arbejdsmåde indgår hverken aggregeringsforløbets hastighed eller begyndelse.

Af Breddin er udviklet en metode til specielt at eftervise ... plasmas spontane aggregeringstilbøjelighed. Pladerigt citratplasma . - lades rotere ved 37°C i en siliconebehandlet glaskolbe, som rummer 20 ml. Derved har thrombocy tteme lejlighed til at komme i kontakt med hinanden. Med den roterede og fortyndede plasma overtrækkes et plast-objektglas. Efter en kontakttid fra 30 til 45 minutter fikseres præparaterne, oxideres, farves og bedømmes mikroskopisk. Ved denne fremgangsmåde kan man finde frem til en spontant forøget thrombocyt-aggregering på en pålidelig og reproducerbar måde. Også virkningen af aggregeringshæmmende stoffer kan afprøves in vitro og in vivo, når en forøget aggregering foreligger. Men med denne fremgangsmåde er det ikke muligt at gennemføre kontinuerlig registrering af aggregeringsforløbet. Den mikroskopiske bedømmelse kan føre til subjektive fejl. Ved den maksimale aggregering kan man ikke afgøre, efter hvilken tid aggregeringstilstanden er opnået. Hermed mangler en vigtig sondringsmulighed for kliniske undersøgelser. Endvidere er undersøgelsesresultatet tidligst til rådighed efter 90 minutter. Desuden er den hertil nødvendige mængde plasma relativt stor.

Litteratur:

Breddin, K.:

Die Thrombozytenfunktion bei håmorrhagischen Diathesen,

Thrombosen und Gefåsskrankheiten. Thrombos. Diathes. haemorrh.

Suppl. 27 (1968) 145126 5

Breddin, K., J. Bauke:

Thrombozytenagglutination und Gefåsskrankheiten.

Blut 11: 144 (1965)

Til grund for den foreliggende opfindelse ligger nu det formål at tilvejebringe en fremgangsmåde, som tillader på pålidelig måde kontinuerligt at måle og optegne den spontant forøgede aggregeringstilbøjelighed i blodpladerigt citratplasma, og ved hvilken man endvidere kan måle den forøgede aggregeringstilbøjelighed hos personer, der lider af karsygdomme, og foretage serieundersøgelser på såvel sunde mennesker som på personer, der lider af karsygdomme. Den hertil nødvendige mængde blod bør være lav og så vidt muligt holdes på mellem ca. 2 og ca. 5 ml citratblod, hvoraf man til hver prøve kun behøver ca. 0,5 til ca. 1 ml citratplasma eller endog mindre.

Det har vist sig, at den ovenfor skitserede opgave løses tilfredsstillende ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er af den i indledningen angivne art, og som er ejendommelig ved, at målingen sker kontinuerligt, idet en tempererbar rudecuvette indeholdende den blodpladerige citratplasma drejes med ca. 10 til ca.

60 omdrejninger pr. minut, medens den er anbragt således i et fo- ! tometer, at dettes lysstråle under rotationen går gennem et af rudecuvettens underste kvadranter.

I modsætning til den fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 21 54 066 kendte fremgangsmåde tilsættes ikke stoffer til udløsning af aggregeringen , ligesom sådanne heller ikke frigøres fra erythrocytterne. Aggregeringens princip ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken der kun kan måles reproducerbart i pladerigt citratplasma, beror på, at udløser for aggregeringen er plasmaproteiner, som er blevet aktiveret i patientens organisme.

Forudsætningerne for thrombocytternes aggregering ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er plasmaets langsomme bevægelse, således at de første løse aggregater ikke slås i stykker igen.

Dette udvirkes ved rotation, som foretages ved omvæltning og forsigtig gennemblanding i en rudecuvette med et omdrejningstal fra 10 til 60, men hensigtsmæssigt på ca. 20 omdr. pr. min. ROta- ' tionen tjener ikke som ved den fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 21 54 066 kendte fremgangsmåde til fraskillelse (centrifugering) af erythrocytterne. Vigtig er også en stigning i pH-værdien 6 165126 under rotationen med undvigelse af C02 fra plasmaprøven. Til opnåelse af nøjagtige måleresultater er rudecuvetten indbygget således i fotometerets strålegang, at lysstrålen går gennem rude-cuvettens underste kvadranter.

Som følge af fraværelsen af røde blodlegemer kan der ikke tilsættes eller frigøres forskellige mængder ADP, altså udløserstoffer, fra erythrocytterne.

Aggregeringsforløbet kan optegnes kontinuerligt, hvorved aggregeringens begyndelse og aggregeringshastigheden kan registreres nøjagtigt.

Til yderligere belysning af opfindelsen tjener tegningen, på hvilken fig. 1 viser en skematisk gengivelse af en udførelsesform for et til fremgangsmådens gennemførelse egnet måle- og registreringsapparat efter et tværsnit på langs gennem dette, fig. 2 viser apparatet i fig. 1 set fra oven, . fig. 3 viser en skematisk gengivelse af en ved fremgangsmåden anvendelig engangs-cuvette, og fig. 4 viser en skematisk gengivelse af en anvendelig multicuvette, såvel samlet som adskilt i sine enkeltdele.

Under henvisning til tegningens figurer 1 og 2 ses de dele, hvoraf apparatet er opbygget, og disses samvirken til måling og registrering af den spontane aggregering af blodpladerne under fremgangsmådens udøvelse, der i øvrigt skal beskrives nærmere under gennemgang af apparatet: 1 stråleforløbet 1 for et fotometer 2 roterer en tempererbar rude-cuvette 3. I denne rudecuvette påfyldes pladerigt blodplasma. Når det i denne plasma kommer til pladeaggregering, tiltager lysgennem-trængeligheden hos den således fyldte cuvette, og dens optiske tæthed aftager. Denne transmission måles og optegnes som kurve ved hjælp af et i handelen gængs kompensationsskriveapparat.

Målingen sker med et fotometer 2 med lyskilde 2a og under anvendelse af et lysfilter 5, der filtrerer lys i området fra ca.

500 til ca. 650 nm og fortrinsvis ved 546 nm.

Mellem lysfilteret 5 og rudecuvetten 3 er en hulblænde 6 med en huldiameter fra ca. 0,5 til ca. 3 mm og fortrinsvis på ca.

2 mm indbygget til begrænsning af lysstrålen.

Rudecuvetten 3 indstikkes i en rotationstromle 7 og fastholdes i denne ved hjælp af et holderorgan, f.eks. O-ring 8. Rota 7 145126 tionstromlen 7 er indbygget i en metalblok 10, f.eks. af aluminium, der kan opvarmes med en varmemodstand 9. Tempereringen af rudecu-vetten 3 sker således efter bloktermostatprincippet: En varmemod-stand 9 opvarmer aluminiumblokken 10, og denne leder varmen over i rudecuvetten 3. Temperaturstabiliseringen til f.eks. 37°C - Q,5°C sker over en 2-punkts styrekreds, idet f.eks, en NTC-modstand tjener som termoføler 11. Der opnås konstant temperatur efter ca.

15-20 minutter.

Rudecuvetten 3 drejes med et omdrejningstal på mellem ca.

10 og ca. 60 og hensigtsmæssigt på ca. 20 omdrejninger pr. minut.

Den er således indbygget i fotometerets strålegang, at lysstrålen går gennem en af dens nedre kvadranter 12. Målestedet ligger i en af de nedre kvadranter, nemlig ca. 5 mm under det horisontale storcirkelsnit og ca. 4 mm til siden for det vertikale storcirkelsnit. Tromlen drives ved hjælp af en drejningstalstabiliseret motor.

Efter eget valg kan anvendes to udførelser af cuvetter, nemlig en engangscuvette 14, f.eks. af glas eller af et gennemsig- " tigt formstof som f.eks. polymethylmethacrylat eller polystyren, eller man kan benytte en multicuvette 15 af samme materiale, dvs. en målecelle, som kan benyttes flere gange. Multicuvetten består af en tromle 16, f.eks. af polyvinylchlorld og to daskruder 17 og 18, f.eks. af polymethylmethacrylat. Cuvetterne har en udvendig diameter på ca. 20 mm og en indvendig diameter på ca. 18 mm.

Den blodpladerige citratplasraa til gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udvindes ved kort tids centrifugering (ca. 1 til 1,5 minut ved 100 til 150 G) af citratblod. Blodudtagelsen og udvindingen af citratblod sker på den måde, at 10 ml frisktappet veneblod gennemblandes grundigt med 1 ml af en 3,8% vandig natriumcitratopløsning.

Til hver prøve anvendes ca. 0,5 til ca. 1 ml citratplasma svarende til ca. 2 til ca. 5 ml citratblod.