DE2408214C3 - Verfahren zum Messen der spontanen Aggregation der Blutplättchen in blutplättchenreichem Zitratplasma B. Braun Melsungen AG, 3508 Melsun- - Google Patents

Description

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zum Messen der spontanen Aggregation der Blutplättchen in blutplättchenreichem Zitratplasma durch Rotation eines eine Untersuchungsprobe enthaltenden Gefäßes.

Die Haftung der Thrombozyten an der Gefäßwand ^a5 und die Bildung von Plättchenaggregdten sind zwei wichtige physiologische Vorgänge bei der Blutstillung nach Verletzungen und wahrscheinlich auch bei der kontinuierlichen Abdichtung von Blutgefäßen.

Gleichzeitig sind die Thrombozytenadhäsion an veränderten Gefäßwandbezirken und die anschließende Plättchenaggregation als erste Vorgänge bei der Bildung arterieller und venöser Thrombosen anzusehen.

Untersuchungen über die Thrombozytenaggregation interessieren den Kliniker sowohl zur Aufdeckung bestimmter Blutungskrankheiten, die auf einer verminderten Thrombozytenfunktion beruhen, als auch zur Erfassung einer gesteigerten Aggregationsbereitschaft der Blutplättchen.

Eine gesteigerte Aggregationsneigung ist feststellbar bei Patienten mit Diabetes-mellitus, fortschreitender Arteriosklerose und im Zustand nach dem Herzinfarkt, aber auch bei venösen Thrombosen. Es läßt sich aufzeigen, daß die gesteigerte Plättchenaggregation ein wichtiger Risikofaktor für thromboembolische Kornplikationen bei Arteriosklerosekranken ist, wahrscheinlich auch ein wesentlicher Risikofaktor für das Fortschreiten der Arteriosklerose selbst.

Seit einigen Jahren stehen Medikamente zur Verfügung, die zur Thromboseprophylaxe angewendet werden können, weil sie die Thrornbozytenaggregation hemmen. Die Wirkung derartiger Medikamente kann mit Hilfe der neuen Vorrichtung zusätzlich zuverlässig überwacht werden.

Für die Beurteilung der Blutplättchenaggregation sind verschiedene Methoden bekannt:

Mit Hilfe der sogenannten Retentionstests wird die Thrombozytenzahl vor und nach der Passage von Blut oder Blutplasma durch ein Filter z. B. aus Glasperlen oder Polyamidfasern ermittelt. Die Retention wird definiert als Prozentsatz der im Filter zurückgehaltenen Blutplättchen.

Dieses Verfahren ist ungenau, da die Streubreite sehr groß ist. Hinzu kommt, daß die Haftung der Blutplättchen je nach dem verwendeten Filtermaterial ver- ^6s schieden ist.

Das Ergebnis hängt sowohl von der Haftung als auch von der Aggregation der Plättchen ab.

Literatur: Moolten, S. E., L. Vroman: The adhesiveness of blood platelets in thromboembolism and hemorrhagic disorders. I. Measurement of platelet adhesiveness by glasswool filter. Amcr. J. elin. Path. 19: 701 (1949). Hellem, A. J.: The adhesiveness of human blood platelets in vitro. Scand. J. elin. Lab. Invest Suppl. 51: 1 (1960). Salzmann, E. W.: Measurement of platelet adhesiveness. J. Lab. elin Med. 62: 724 (1963). Morris, C. D. W.: Acetylsalicylic acid and platelet stickiness. Lancet 1967/1, 279.

Bei einem anderen Verfahren wird die Änderung der optischen Dichte eines plättchenreichen Blutplasmas nach Zugabe von sogenannten Auslösern gemessen. Bei dieser photometrischen Methode wird plättchenreiches Plasma in einem senkrecht stehenden Glasröhrchen, welches sich im Strahlengang eines Photometers befindet, mit einem kleinen Magneten kräftig gerührt. Die Aggregation wird durch Zugabe von Adenosindiphosphat, Kollagen oder Adrenalin ausgelöst, und die Änderung der optischen Dichte wird aufgezeichnet.

Literatur: Born, G. V. R.: Quantitative investigations into the aggregation of blood platelets, J. Physiol. 162: 67 (1962). O'Brien, J. R.: The adhesiveness of native platelets and its prevention. J. elin. Path. 14: 140(1961).

Dieses Verfahren ermöglicht die spezifische Erfassung der Aggregation. Ferner kann die Wirkung von aggregationshemmenden Medikamenten an Hand der durch Kollagen usw. induzierten Aggregation beurteilt werden. Es ist mit dieser Methode jedoch nicht möglich, eine spontan gesteigerte Aggregationsneigung der Blutplättchen nachzuweisen. Zur Erkennung einer Thromboseneigung ist das Verfahren nicht geeignet.

Bei einer Modifikation dieses Verfahrens zirkuliert Plasma in einem Kreislaufsystem, und die Thrombozytenaggregate werden durch ein Filter entfernt. Die Messung erfolgt in einer Durchlaufküvette. Die Aggregation wird durch Kollagen ausgelöst. Auch mit diesem Verfahren kann die spontan gesteigerte Aggregation nicht erfaßt werden.

Literatur: Heinrich, D. und L. Roka: Methode zur Bestimmung der Thrombozyten-Aggregation. Klin.-WSCR48:235(1969).

In der deutschen Offenlegungsschrift 21 54 066 sind Verfahren und Vorrichtung zum Messen der Verklumpung von Thrombozyten in Proben alle Bestandteile enthaltenden Blutes beschrieben. Die Besonderheiten des Verfahrens sind durch folgende Maßnahmen gekennzeichnet:

1. Zitratblut wird in einer Rotationskammer hochtourig zentrifugiert. Dabei werden die spezifisch schweren roten Blutkörperchen in die Randzone der Zentrifugierkammer gepreßt.

2. Die Lichtdurchlässigkeit (Transmission) kann in der zentralen Plasmazone gemessen werden, die auch die Thrombozyten enthält.

3. Der wichtigste Parameter des Verfahrens gemäß der deutschen Offenlegungsschrift 21 54 066 ist die Differenz der Lichtdurchlässigkeit in zwei Plasmaproben derselben Versuchsperson, von denen eine nur zentrifugiert wird, während in der anderen die Aggregation (Verklumpung der Thrombozyten) durch Zugabe eines Äggregationsauslösers, z. B. durch ADP (Adenosindiphosphat) oder andere chemische Auslösesubstanzen bzw. durch das aus den Erythrozyten des Zitratblutes stammende ADP

SS!? ^EeSChkun!&^{n und} ™ in Plättchenreichem Zitratplasma reproduzierbar

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4. Die Differenzder Lichtdurchlassigke.t kann auch der Aggregation Plasmaproteine sind, die im Organis-

m einer BIu probe ermittelt werden indem zunächst mus des Patienten aktiviert worden sind.

nä wird ien ^g hι"" ^2<;^nt"^fuS'^{erten Prob}e 5 Voraussetzungen für die Aggregation der Thrombo-A^rm HZimZi^th. ?f ^be _K ^des Auslösers die zyten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die SEl¹U™^{blut durd}> abwechselndes langsame Bewegung des Plasmas, damit die ersten Beschleunigen und Abbremsen der Zentrifugen- lockeren Aggregate nicht wieder zerschlagen werden. kammer erfolgt und d,e L.chtdurchlässigkeit nach Das wird bewirkt durch Rotation zwecks Umwälzung erneuem Zentrifugieren wieder gemessen wird. i. und vorsichtiger Durchmischung in einer Scheiben-Registnert wird die Änderung der L.chtdurchläs- küvette mit einer Drehzahl von 10 bis 60, zweckmäßig sigfceit, die durch Aggregation der Thrombozyten von 20 UpM. Das Rotieren dient nicht wie bei dem hervorgerufen wird. Nach diese,- Arbeitsweise wer- bekannten Verfahren aus der deutschen Offenlegungsden weder die Geschwindigkeit noch der Beginn schrift 21 54 066 zum Abtrennen (Zentrifugieren) der des Aggregationsvorganges erfaßt. »₅ Erythrozyten. Wichtig ist auch ein Anstieg des _PH-., _D ... , . ... Wertes während der Rotation mit Entweichen von CO₂ Von Breddin wurde eine Methode entwickelt, um aus der Plasmaprobe. Zur Erzielung genauer Meßspeziell die spontane Aggregationsneigung des Plasmas ergebnisse ist die Scheibenküvette so in den Strahlennachzuweisen. Plattchenreiches Z.tratplasma wird bei gang des Photometers eingebaut, daß der Lichtstrahl 37 C in sil.konis.erten 20 ml fassenden Glaskolben *° durch einen unteren Quadranten der Scheibenküvette rotiert. Dabei haben die Thrombozyten Gelegenheit, hindurchgeht

miteinander in Kontakt zu kommen. Mit dem rotierten In Folge der Abwesenheit von roten Blutkörperchen

und verdünnten Plasma werden Plastikobjektträger können keine unterschiedlichen Mengen von ADP,

überschichtet. Nach einer Kontaktzeit von 30 bis45 min also keine Auslösesubstanzen zugesetzt bzw. aus den

werden die Präparate fixiert, oxydiert, gefärbt und *5 Erythrozyten freigesetzt werden

mikroskopisch beurteilt. Bei diesem Verfahren läßt Der Aggregationsvorgang kann kontinuierlich auf-

sich eine spontan gesteigerte Aggregation der Throm- gezeichnet werden, wobei Beginn der Aggregation und

bozyten zuverlässig und reproduzierbar erfassen. Auch Aggregationsgeschwindigkeit genau registriert werden.

die Wirkung von Aggregationshemmern läßt sich in Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die

vitro und in vivo prüfen, wenn eine gesteigerte Aggre- 3o Zeichnungen, von denen Fig. 1 eine schematische

gation vorhanden ist. Mit dem Verfahren ist aber eine Darstellung einer für die Durchführung des Verfahrens

kontinuierliche Registrierung des Aggregationsablaufs geeigneten Meß- und Registriervorrichtung im Längs-

nicht möglich. Die mikroskopische Beurteilung kann durchschnitt und Fig. 2 in der Draufsicht zeigen,

zu subjektiven Fehlern führen. Bei der maximalen Fig. 3 zeigt die schematische Darstellung einer ver-

Aggregation kann nicht entschieden werden, nach 35 wendbaren Einmalküvette, und Fig. 4 die schematische

welcher Zeit der Aggregationszustand erreicht ist. Darstellung einer Multiküvette mit deren Einzelteilen.

Damit ist eine wichtige Differenziermöglichkeit für Im Strahlengang 1 eines Photometers 2 rotiert eine

klinische Untersuchungen nicht gegeben. Ferner ist temperierbare Scheibenküvette 3. In diese Scheiben-

das Untersuchungsergebnis frühestens nach 90 min küvette wird das plättchenreiche Blutplasma einge-

verfügbar. Auch ist die benötigte Plasmamenge relativ 4° füllt. Wenn es in diesem Plasma zu einer Plättchen-

£^r°ß· . aggregation kommt, so nimmt dessen Lichtdurch-

Literatur: Breddin, K.: Die Thrombozytenfunk- lässigkeit zu, und die optische Dichte nimmt ab. Diese

tion bei hämorrhagischen Diathesen, Thrombosen und Transmission wird gemessen und als Kurve von einem

Gefäßkrankheiten. Thrombos. Diathes. haemorrh. handelsüblichen Kompensationsschreiber aufgezeich-

Suppl. 27(1968). Breddin, K., J. Bauke: Thrombo- « net.

zytenagglutination und Gefäßkrankheiten. Blut 11: Die Messung erfolgt mit einem Photometer 2 mit 144 (1965). Lichtquelle 2a und unter Verwendung eines Lichtfil-Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- ters 5 von etwa 500 bis 650 nm, vorzugsweise 546 nm. fahren zu schaffen, das es gestattet, in zuverlässiger Zwischen Lichtfilter 5 und Scheibenküvette 3 ist Weise die spontan gesteigerte Aggregationsneigung im ⁵° eine Lochblende 6 mit einem Lochdurchmesser von blutplättchenreichen Zitratplasma kontinuierlich zu etwa 0,5 bis 3 mm, vorzugsweise von 2 mm, zur Bemessen und aufzuzeichnen, mit dem ferner die gestei- grenzung des Lichtstrahls eingebaut,
gerte Aggregationsneigung bei Gefäßkranken gemes- Die Scheibenküvette 3 wird in eine Rotationssen werden kann, und mit dem Serienuntersuchungen trommel 7 gesteckt und von dieser mittels einer Haltebei Gesunden und Gefäßkranken vorgenommen wer- ⁵⁵ vorrichtung, z. B. eines O-Rings 8, festgehalten. Die den können. Die benötigte Blutmenge sollte möglichst Rotationstrommel 7 ist in einem durch Heizwiderzwischen etwa 2 bis etwa 5 ml Zitratblut und daraus stand 9 aufheizbaren Metallblock 10, z. B. aus AIuetwa 0,5 bis etwa 1 ml Zitratplasma oder weniger für minium, eingebaut. Die Temperierung der Scheibenjeden Test betragen. küvette 3 erfolgt somit nach dem Prinzip des Block-Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der ein- ^6o thermostaten: Ein Heizwiderstand 9 erhitzt den Alugangs genannten Art erfindungsgemäß durch die im miniumblock 10 und dieser leitet die Wärme in die kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs angegebe- Scheibenküvette 3 über. Die Temperaturstabilisierung nen Merkmale gelöst. auf z. B. 37' ± 0,5⁰C erfolgt über einen 2-Pkt-Regel-Im Gegensatz zu dem Verfahren der deutschen kreis, wobei als Temperaturfühler 11 z. B. ein NTC-Offenlegungsschrift 21 54 066 werden keine die Aggre- *⁵ Widerstand dient. Die Temperaturkonstanz wird nach gation auslösenden Substanzen zugesetzt bzw. aus den etwa 15 bis 20 min erreicht.

Erythrozyten freigesetzt. Das Prinzip der Aggregation Die Scheibenküvette 3 dreht sich mit einer Drehzahl mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem zwischen etwa 10 bis etwa 60, zweckmäßig von etwa

20 U/min. Sie ist in dem Photometer so angeordnet, daß der Lichtstrahl durch einen unteren Quadranten 12 der Scheiben küvette hindurchgeht. Der Meßort liegt in einem der unteren Quadranten, und zwar etwa 5 mm unterhalb des horizontalen Scheibendurchmessers und etwa 4 mm vom vertikalen Scheibendurchmesser entfernt. Der Antrieb erfolgt über einen drehzahlstabilisierten Motor.

Es können wahlweise zwei Ausführungen von Küvetten verwendet werden, eine Einmalküvette 14, z. B. aus Glas oder aus einem durchsichtigen Kunststoff, wie z. B. Polymethyl methacrylat oder Polystyrol, und eine Multiküvette 15 aus dem gleichen Material, die mehrmals verwendet werden kann. Die Multiküvette besteht aus einer Trommel 16, z. B. aus Polyvinylchlorid, und zwei Deckscheiben 17, 18, z. B. aus PoIymethylmethacrylat. Die Küvetten haben einen Außendurchmesser von etwa 20 mm und einen Innendurchmesser von etwa 18 mm.

Das blutplättchenreiche Zitratplasma für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch kurzes Zentrifugieren (etwa 1 bis 1,5 min mit 100 bis 150 G) von Zitratblut gewonnen. Die Blutentnahme und die Gewinnung des Zitratbluites erfolgen in der Weise, daß 10 ml frisch entnommenes Venenblut mit 1 ml einer 3,8%igen wäßrigen Natriumzitratlösung gründlich durchmischt wird.

Für jeden Test werden etwa 0,5 bis etwa 1 ml Zitratplasma entsprechend etwa 2 bis etwa 5 ml

!5 Zitratblut verwendet.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   24

   214

   Verfahren zum Messen der spontanen Aggregation der Blutplättchen in blutplättchenreichem Zitratplasma durch Rotation eines eine Untersuchungsprobe enthaltenden Gefäßes, dadurch gekennzeichnet, daß das Messen kontinuierlich in der Weise erfolgt, daß eine das blutplättchenreiche Zitratplasma enthaltende temperierbare Scheibenküvette mit etwa 10 bis 60 U/min gedreht wird und dabei in einem Photometer so angeordnet wird, daß dessen Lichtstrahl während des P.otierens durch einen unteren Quadranten der Scheibenküvette hindurchgeht. *5