FI107233B - Menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-infektioita vastaan - Google Patents

Description

107233

Menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-infektioita vastaan Förfarande för framställning av en farmaceutisk vaccinsammansättning mot Neisseria meningitidis-infektioner 5

Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisen rokotevalmisteen valmistamiseksi Neissena^jneningiti^ aiheuttaman aivokalvontulehduksen (meningitis) ennaltaehkäisemiseksi.

10

Yleisesti voidaan todeta, että aivokalvontulehdukset ovat joko virus- tai bakteeriperäisiä. Aivokalvontulehdusta pääasiassa aiheuttavista bakteereista voidaan mainita N. meningitidis ja Haemophilus influenzae, joita todetaan vastaavasti 40 ja 50 prosentissa bakteeriperäisen aivokalvontulehduksen tapauksista.

15

Ranskassa todetaan vuosittain noin 600-800 N. meningitidis-bakteerin aiheuttamaa aivokalvontulehdustapausta. Yhdysvalloissa tapausten lukumäärä on vuosittain noin 2500-3000.

20 N. meningitidis-laii voidaan jakaa seroryhmiin sen kapselipolysakkaridien luonteen perusteella. Vaikka näitä seroryhmiä onkin kymmenittäin, niin kuitenkin 90 % aivokal-vontulehdustapauksista johtuu 3 seroryhmästä eli A-, B- ja C-seroryhmistä.

Olemassa on tehokkaita, kapselipolysakkarideihin perustuvia rokotteita A- ja C-seroryh-25 mään kuuluvan N. meningitidis-bakteerin aiheuttaman aivokalvontulehduksen estämiseksi. Nämä polysakkaridit sellaisenaan ovat vain hyvin vähän, mikäli lainkaan immu- ------ nogeenisia alle 2-vuotiaissa lapsissa, eivätkä ne johda immunologisen muistin kehittymi- - seen. Näistä haitoista voidaan kuitenkin päästä eroon konjugoimalla nämä polysakkaridit kantavaan proteiiniin.

30

Sitävastoin seroryhmään B kuuluvan N. meningitidis-bakteerin polysakkaridi ei ole lainkaan tai se on vain hyvin vähän immunogeeninen ihmisessä, olipa se konjugoidussa « muodossa tai ei. Lisäksi erittäin toivottavaa olisi saada aikaan muuhun kuin polysakkari- 2 107233 diin perustuva rokote erityisesti seroryhmään B kuuluvan N. meningitidis-bai teerin aiheuttamia aivokalvontulehduksia vastaan.

Tätä tarkoitusta varten alalla on jo ehdotettu N. meningitidis-bakteerin ulkol aivon 5 erilaisia proteiineja. Niitä ovat erityisesti tässä kalvossa läsnäoleva ihmistransfeminin reseptori.

Yleisesti, suurin osa bakteereista tarvitsee rautaa kasvaakseen ja niihin on kehittynyt erityisiä jäijestelmiä tämän metallin hankkimiseksi. Mitä tulee erityisesti N. men ngiti-10 dis-bakteeriin. joka on patogeeninen pelkästään ihmisessä, se voi saada ihmisessä käyttöönsä rautaa vain rautaa kuljettavista proteiineista kuten transferriini: ta ja laktoferriinista, koska vapaan raudan määrä ihmisessä on mitätön (suuruusluokkia 10' 18 M), ja joka tapauksessa liian pieni bakteerikasvun ylläpitämistä ajatellen.

15 Niinpä N. meningitidis-bakteerissa on ihmisen tmnsferriinin reseptori ja ihmisen laktoferriinin reseptori, joiden reseptoreiden avulla bakteeri kykenee sitomaan näitä rautaa kelatoivia proteiineja ja sieppaamaan sitten bakteerikasvulle välttämän ömän raudan.

20 Schryvers et ai. (WO 90/12591) ovat puhdistaneet N. meningitidis B16B6-kannasta transferriinin reseptorin lähtemällä kalvouutteesta. Tämä proteiini näytti koostuvan puhdistamisensa jälkeen olennaisesti kahdesta polypeptidityypistä eli polypeptidistä, jolla on suuri, 100 kD oleva näennäinen molekyylipaino sekä polypeptidistä, jo la on pienempi, noin 70 kD oleva näennäinen molekyylipaino, määritettynä elektroftreetti-25 sesti polyakryyliamidigeelillä SDS:n läsnäollessa.

Tätä erityisesti Schryvers: in puhdistamaa tuotetta kutsutaan mielivaltaisen määrit* ;lmän mukaisesti ja oheisen patenttihakemuksen tarpeita vastaavalla tavalla transfeiriinin reseptoriksi ja sen muodostavia polypeptidejä alayksiköiksi. Seuraavassa näihin 30 alayksiköihin, joilla on suuri molekyylipaino ja pienempi molekyylipaino, viiataan vastaavasti lyhenteillä Tbpl ja Tbp2.

3 107233

Nyt ollaan todettu, että olemassa on vähintään kahta eri tyyppiä olevia kantoja, jotka eroavat toisistaan transferriinireseptoreiden vastaavan koostumuksen suhteen. Tähän tulokseen on tultu tutkittaessa useista kymmenistä alkuperältään erilaisista N. menin gi-tidis-kannoista saatuja kalvouutteita. Nämä kalvouutteet on ensin käsitelty SDS-PAGE-5 geelielektroforeettisesti, minkä jälkeen ne on siirretty sähköisesti nitroselluloosa-ar-keille. Näitä nitroselluloosa-arkkeja on inkuboitu: a) sellaisen kaniinin antiseerumin läsnäollessa, jonka vaikutus kohdistuu N, meningitidis B16B6-kannasta, josta käytetään myös lyhennettä 2394, 10 puhdistettua transferriinin reseptoria vastaan; b) sellaisen kaniinin antiseerumin läsnäollessa, jonka vaikutus kohdistuu N. meningitidis 2169-kannasta puhdistettua transferriinin reseptoria vastaan; c) peroksidaasiin konjugoidun ihmistransferriinin läsnäollessa.

15 Mitä tulee kohtiin a) ja b), transferriininreseptorin alayksiköiden tunnistaminen osoitetaan lisäämällä peroksidaasiin kytkettyjä kaniinin anti-immunoglobuliini-vasta-aineita ja sitten tämän peroksidaasientsyymin substraattia.

Seuraavissa taulukoissa I ja II esitetään tiettyjen edustavien kantojen piirteet, jotka on 20 saatu 7,5 % SDS-PAGE-polyakryyliamidigeelillä; vyöhykkeiden tunnusomaisiksi piirteiksi on esitetty niiden näennäinen molekyylipaino kilodaltoneina (kD): 4 107233

h I i l I

,¾ >ι

•P

ΙΟ

(V

« V

h :« Λ ° x ·· Cl Cl Cl ci

ie to σι vo σι vo A

cm cm w

KO

·- ·« ij u u

•H

o σ\ a in t" Oi m h >, ____>1

P

O

c s

-P *H

10 £

C^^-«^.fO(jir) σι -H

ΌΌΌσινοσι vo Λ c G G C Λ (0 ·- ·* ...

.. >( U £0 +j « w w (0

iH

M1 CO (0 ro in ^t· CM H t*

CM CM CM -H

____a ----a >1 C- >1 +>

*· cq O

S J P

H a) ••CM 01

CM

• rH ^ ΗΛ :(0 a —t ·· ro co ro co g

·- Ό (0 ci vo σ vo jC

(0 C cm >,

CM P

•Τ “ ·* O

non ρ t·" T-" ' 0) to M1 n o σι cm Is· >r

CO CM H -P

. CM CM CM -P

Q)

-----4J

-H -H (0 P P H “ OO H 0> P (0 -P (0 -H - a h a h io s 0) H 0) H I (0 υ H 10 -H (0 -H P (0 (rt _ o g <u g <u ό ω o p 3 P 3 <w -H 10· •S i p i p to ό -H 1(0 *3 *H <U ·Η 0) G ·Η 3 tn 3 +j j) pj) m m Hto

-H CtOClOP* 3<D

2 (0 -H (0 -H -PO C/ltO

(0 +J +J p ^ 3 C 3 C 3 0) to to to to to a

H I Ή I Ή "H

<d ^ <ΰ σ> (0 C ·· g σν g vo g ·η g rH ΓΟ H H r—I -H n H CM H CM H P 3

11 I I I II K

5 __^^^__ , 107233 5-U £ •Q Λ jj

<N CN -K

> n en m m X; vocqh σι σι oo oo .il » - Λ £ ----:(β -η Ό !<0 σι c w ^ ** ** in in in υ< 03 σι σι οο οο :<0 {Ν'— -Ρ •Η - & Ό & H C >Ί ιη ·· rt· rt· t" t" >> σι rt! σι σι οο οο -Ρ Η - ο ----3 ·· s σι — -η Η ΙΟ 10··· Ό ΙΟ 00 C0 <ΰ r- CQ η σι σι η οο ·ι-ι CO ^ dl •Η ----a a η η* σι ζ\ o ♦· · οο οο σι σι f? O rt! f—I σι Ui h f' h w a ,_, ----(0 ·· Λ ^ in vo (H rH Qh (N ·· · 00 CO H H Λ n U h σι σι oo co >· h - a £

----Q

M

-P <U

λ 'O tn

G -* C

CO·· oo oo n n «.

nj vo cq σ> σι co co :<o « h — g ____J3

_ P

o g O C rt)

o ·· co oo in t" S

offl σι σι oo co “ H W >1

----+J

-p . 0)

σι σι σι -P

vo ·· · VO O r~ f* ·Η <-i n h σι σι n co in (n '— a <u -----c I 0

Il II M (ö a) c o c «ui tn H Pro PrO <w-H tn· H II II ω Ό -H 1(0 •H rt1 (0 ·Η σι ¢0 G *H 3 tn o +J Ui H -P lO r-H <0tn rH tn

C CO rH CrHi—I P Ä 3(U

X r0(N-Ht0cN-H4-»O WW

2 g g P (0

H 3-H33*H33Q)rH

3 mppioppinan ro -H O 0) ·Η O <U *H -H ·Η ^ ro-PQ)to+Jfl)tocin g a in gain g -h ro g

rH <U -H rH <u -H rH -H to O

h in -P h in -P ηρό 3 l i x 6 107233

Taulukkojen kahdella ensimmäisellä rivillä esitetyt tulokset osoittavat, että olems ssa on kaksi erityyppistä kantaa:

Ensimmäinen tyyppi (Taulukko I) vastaa kantoja, joiden tapauksessa anti-reseptori 2394-S antiseerumi tunnistaa näihin kantoihin kuuluvan reseptorin kummatkin kaksi alayksikköä, kun taas anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa vain sen alayksikön, jclla on suuri molekyylipaino.

Toinen tyyppi (Taulukko II) vastaa kantoja, joiden tapauksessa anti-reseptori 2169-anti-10 seerumi tunnistaa näihin kantoihin kuuluvan reseptorin kummatkin kaksi alaykskköä, kun taas anti-reseptori 2394-antiseerumi tunnistaa vain sen alayksikön, jolla on suuri molekyylipaino.

Näin ollen molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön kohdalla todetaan antigeenistä 15 erilaisuutta. Tämä erilaisuus on kuitenkin rajoittunut siten, että kysymyksessä on kaksi suurta tyyppiä, toisin kuin on ehdotettu julkaisussa Griffiths et ai., FEMS Micobiol. Lett. (1990), 69:31.

[Huomattakoon, että olipa kannan tyyppi mikä tahansa, alayksikkö, joka kykenee 20 kytkeytymään transferriiniin, on aina molekyylipainoltaan pienempi alayksikkö. (Taulukot A ja B, kolmannella rivillä esitetyt tulokset).].

Näiden havaintojen perusteella olisi houkuttelevaa vetää sellainen johtopäätös että kaikkia N. meningitidis-infektioita vastaan riittävän tehokas rokote voitaisiin toteuttaa 25 transferriinin reseptorin tai pelkästään sen alayksikön avulla, jolla on suuri mole cyyli-paino, olipa reseptorin alkuperä mikä tahansa, koska kaksi erityyppistä antisee umia . ; tunnistaa tämän alayksikön.

Nyt ollaan kuitenkin todettu yllättävällä tavalla, ettei tämä alayksikkö, jolla on suuri 30 molekyylipaino, kykene saamaan aikaan neutraloivien vasta-aineiden muodostumista. Vain pienempi näistä kahdesta reseptorin alayksiköstä kykenee tähän. Koska tämän 7 107233 molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön tunnusomaisena piirteenä on se, että sen antigeenisyys vaihtelee merkittävällä tavalla näiden kahden erityyppisen kannan välillä, niin ei riitä, että rokote, jolla pyritään torjumaan kaikki N. menineitidis-infektiot. sisältää vain yhdentyyppistä transferriinin reseptoria.

5

Keksinnön mukaiselle menetelmälle farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksissa.

Näin ollen oheisessa keksinnössä saadaan aikaan: 10 i) farmaseuttinen rokotekoostumus, joka käsittää hoitavina aineina vähintään ensimmäisen ja toisen sellaisen molekyylin, jotka kykenevät kytkeytymään ihmistransferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä N. menineitidis-kannasta, jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä (Tbpl) sekä yhdestä, molekyylipainoltaan 15 pienemmästä alayksiköstä (Tbp2), ja jonka reseptorin tapauksessa N. meningitidis 2394-kannan (2394-reseptorin) anti-reseptori-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön (Tbp2) ja N. meningitidis 2169-kannan (reseptorin 2169) anti-reseptori-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; mainitun toisen molekyylin ollessa peräisin toisesta N. meningitidis-kannasta. jossa 20 läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä (Tbpl) sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä (Tbp2), ja jonka reseptorin tapauksessa anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön (Tbp2) ja anti-reseptori 2394-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; 25 ii) käyttövalmis rokotepakkaus, joka sisältää a) farmaseuttista koostumusta, joka käsittää hoitavana aineena vähintään ensimmäisen sellaisen molekyylin, joka kykee kytkeytymään ihmistransferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva ihmistransferriinin 30 reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayk siköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja ♦ 8 107233 jonka reseptorin tapauksessa N. meningitidis 2394-kannan (2394-resepto-rin) anti-reseptori-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaaii pienemmän alayksikön (Tbp2) ja N. meningitidis 2169-kannan (rese 3torin 2169) anti-reseptori-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaa ι pie-5 nempää alayksikköä; b) farmaseuttista koostumusta, joka käsittää hoitavana aineena väh ntään toisen sellaisen molekyylin, joka kykee kytkeytymään ihmistransferr iniin; mainitun toisen molekyylin ollessa peräisin toisesta N. mening itjdis-kannasta, jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu väh: ntään 10 yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, nole- kyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapaul sessa anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön ja anti-reseptori 2394-antiseerumi ei tunnist i tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; 15 c) ohjeet näiden koostumusten a) ja b) samanaikaiseksi tai peräkkä seksi antamiseksi; iii) hoitosovellutus, jossa käytetään yhdessä vähintään sekä ensimmäistä että öistä sellaisen molekyylin, jotka kykenevät kytkeytymään ihmistransferriiniin; mainitut en-20 simmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipjinol-taan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa N. meningitidis 2394-kannan (2394-reseptorin) anti-reseptori-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön _ a N*. 25 meningitidis 2169-kannan (reseptorin 2169) anti-reseptori-antiseerumi ei tunnisti tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; mainitun toisen molekyylin ollessa peräisin toisesta N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa anti-30 reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayks ikön 9 107233 ja anti-reseptori 2394-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; iv) menetelmä kohteen rokottamiseksi N. meningitidis-infektioita vastaan, jossa 5 menetelmässä tällaista rokotuskäsittelyä tarvitsevalle kohteelle annetaan hoidon kannalta tehokas määrä, joko samanaikaisesti tai peräkkäin, vähintään ensimmäistä ja toista sellaista molekyyliä, jotka kykenevät kytkeytymään ihmistransferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä N. meningitidis-kannasta, jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainol-10 taan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa N. meningitidis 2394-kannan (2394-reseptorin) anti-reseptori-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön ja N. meningitidis 2169-kannan (reseptorin 2169) anti-reseptori-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; mainitun toisen molekyylin ollessa 15 peräisin toisesta N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva ihmistransferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön ja anti-reseptori 2394-antiseerumi ei tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää 20 alayksikköä.

Käsitteellä "molekyyli, joka kykenee kytkeytymään ihmistransferriiniin" tarkoitetaan joko N. meningitidis-kannasta peräisin olevaa ihmistransferriinin reseptoria (eli molekyyliä, joka käsittää erityisesti kahdentyyppisiä alayksiköitä), tai pelkästään resepto-25 rin sitä alayksikköä, joka kykenee kytkeytymään ihmistransferriiniin, sekä tämän alayksikön kappaletta tai analogia.

Transferriinireseptori voidaan saada puhdistetussa muodossa lähtemällä N. meningiti-des-kannasta, jota on viljelty ensin vapaata rautaa sisältämättömällä alustalla, käyttäen 30 erityisesti menetelmää, joka on kuvattu patenttijulkaisussa Schryvers et ai., WO 90/12591, ja joka on kuvattu myös julkaisussa Schryvers et ai., Infect. Immun. (1988) 10 107233 56 (5):1144. Vaihtoehtoisesti tällaista N. meningitidis-bakteerin transferriinireseptoria voidaan tuottaa käyttämällä hyväksi yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Reseptorin ahyksi-köitä koodaava DNA-kappale (tai DNA-kappaleet) voidaan ilmentää yhdesiä tai erikseen jossakin heterologisessa ilmentämisjäijestelmässä (esimerkiksi bakteerissa, hii-5 vassa, nisäkässolussa). Tässä tapauksessa vapaat alayksiköt tai reseptoriksi liit yneet alayksiköt saadaan talteen viljelmästä ja ne puhdistetaan. Kun täten tuotetut alay esikot ovat vapaina, niin ne voidaan yhdistää jälleen reseptoriksi niitä sopivasti käsittelemällä.

10 Alayksikkö, joka kykenee kytkeytymään ihmistransferriiniin (molekyylipainoltaan pienempi alayksikkö), voidaan saada puhdistetussa muodossa (eli molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä erillään ja siitä eristettynä) lähtemällä erityisesti Schryv;rs:in et ai. mukaisesti puhdistetusta reseptorista käsittelemällä reseptoria vahvasti de naturoivalla aineella kuten 8M urealla tai 6M HCl-guanidiinilla, minkä jälkeen toisistaan ir-15 ronneet alayksiköt erotetaan perinteisillä kromatografisilla menetelmillä kuten ionin-vaihtokromatografisesti tai geelisuodatuksella. Vaihtoehtoisesti näitä alayks köitä voidaan valmistaa myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Näitä menetelmiä voidaan käyttää myös alayksiköiden kappaleiden tai analogien valmistukseen.

20 Esimerkiksi kantojen 2394 ja 2169 alayksiköt Tbpl ja Tbp2 on kuvattu aminohapposek-venssinsä avulla sekvenssien tunnistusnumeroilla 1-4 (SEQ ID No. 1-4).

Käsitteellä "alayksikön, joka kykenee kytkeytymään ihmistransferriiniin, kappale" tarkoitetaan peptidiä, jonka aminohapposekvenssi sisältyy mainitun alayksikön 25 aminohapposekvenssiin. Käsitteellä "alayksikön, joka kykenee kytkeytymään nrnis-. - transferriiniin, analogi" tarkoitetaan proteiinia, jonka aminohapposekvenssi on vähin- - * tään 80-prosenttisesti, edullisesti vähintään 90-prosenttisesti, erityisen edullisella ta valla vähintään 95-prosenttisesti homologinen mainitun alayksikön aminohapposek /ens-sin kanssa. Oheisen keksinnön tavoitteita ajatellen on itsestään selvää, että alayksikön 30 immunogeenisten ominaisuuksien täytyy säilyä tällaisessa kappaleessa tai analogissa.

11 107233 N. meningitidis 2394-kanta (B:2a:P1.2:L2.3) sekä2169-kanta (B:9:P1.9:L3.7), joita on käytetty laboratorioissamme, on talletettu julkiseen kantakokoelmaan Collection 1’Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75015 Pariisi, vastaavasti talletusnumeroilla CIP 7908 ja CIP 7917.

5

Edelleen N. meningitidis-kantojen erottamiseen tarvittavat an ti-reseptori-an ti seerumit voidaan saada seuraavalla tavalla:

Ensin reseptori puhdistetaan lähtökannasta (joko 2394 tai 2169) Schryvers:in et ai.

10 menetelmällä. Sitten valkoisille uusiseelantilaisille kaniineille annetaan ihon alaisesti ja lihaksen sisäisesti 100 reseptoria Freundin täydelliseen apuaineeseen yhdistettynä.

21 vuorokautta ja 42 vuorokautta ensimmäisen injektion jälkeen kaniineille annetaan uudestaan 100 Mg puhdistettua reseptoria, tällä kertaa kuitenkin yhdessä Freundin epätäydellisen apuaineen kanssa. Eläimistä otetaan seerumia sen jälkeen, kun viimeisestä 15 injektiosta on kulunut 15 vuorokautta, komplementit poistetaan seerumista ja se suodatetaan kalvon, jonka huokoisuus on 0,45 Mm, läpi. Tämän jälkeen suodoksen annetaan imeytyä saattamalla se kosketukseen alkuperäisen kannan kanssa, jota kantaa on viljelty tätä tarkoitusta varten edeltäkäsin vapaan raudan läsnäollessa (näissä olosuhteissa transferriinireseptorin synteesi tukahtuu). Kosketukseensaattaminen tapahtuu seuraavasti: 20 10 ml suodosta lisätään lähtökannan viljelmästä saatuun 1010 pesäkkeitä muodos tavaan yksikköön. Imeytymisen annetaan edetä yön yli 4 °C:n lämpötilassa, samalla sekoittaen. Sitten bakteerit poistetaan sentrifugoimalla. Supematantti otetaan talteen, ja sen annetaan imeytyä vielä kahdesti lähtökantaan edellä kuvatulla tavalla.

25 Kannan tyyppi (siinä läsnäolevan transferriinireseptorin luonne) voidaan tunnistaa . . vapaata rautaa sisältämättömistä viljelmistä saatujen kalvouutteiden avulla käyttämällä . : tavanomaisia tekniikoita kuten SDS-PAGE-geelielektroforeesia, jonka jälkeen käytetään edellä kuvattuun antiseerumiin perustuvaa "immunoblotting"-tekniikkaa.

30 Rokotekoostumuksen ensimmäinen molekyyli on peräisin ensimmäisestä N. meningiti-dis-kannasta. jossa läsnäoleva transferriinireseptori muodostuu olennaisesti (i) alayksi- 12 107233 köstä, jolla on suuri, edullisesti noin alueella 100-90 kD oleva molekyyli wdno, edullisemmin noin 93-95 kD, sekä (ii) alayksiköstä, jolla on pienempi, edullisest i noin alueella 75-60 kD oleva molekyylipaino, edullisemmin noin 72-65 kD, alayksiköt (i) ja alayksikön (ii) molekyylipainon ollessa erityisen edullisesti vastaavasti noin 93 kD ja 67-5 70 kD.

Rokotekoostumuksen toinen molekyyli on peräisin toisesta N. meningitidis-kan iästä, jossa läsnäoleva transferriinireseptori muodostuu olennaisesti (i) alayksiköstä, jo la on suuri, edullisesti noin alueella 100-90 kD oleva molekyylipaino, edullisemmin noir 100-10 95 kD ja erityisen edullisesti noin 98 kD, sekä (ii) alayksiköstä, jolla on pien impi, edullisesti noin alueella 90-80 kD oleva molekyylipaino, edullisemmin noin 87-85 kD ja erityisen edullisesti noin 87 kD.

Edellä mainitut molekyylipainot ovat näennäisiä molekyylipainoja, jotka on saatu 15 puhdistetulla reseptorilla elektroforeettisesti SDS-PAGE-geelillä. Tämä elektrofoi eettinen menetelmä voidaan toteuttaa Laemmlirn menetelmällä seuraavasti:

Ensin valmistetaan polyakryyliamidigeeli [16 cm x 20 cm x 1 mm (paksuus)], joka käsittää 5 % esigeelin ja 7,5 % erottavan geelin elektroforeesipuskurissa (6 g/1 Tris, 20 28,8 g/1 glysiiniä, 0,1 % SDS).

Toisaalta 50 μΐ puhdistetun reseptorin liuosta, jonka pitoisuus on 0,6 mg/ml (50 mM fosfaattipuskurissa, pH 8,0, joka sisältää 0,05 % Sarkosyyliä) lisätään 50 uliaan näytepuskuria (62 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS, 5 % B-merkaptoetanolia, 1 % 25 glyserolia, 0,001 % bromifenolisinistä). Tätä seosta inkuboidaan 5 minuuttia kiehuvassa vesihauteessa. 17 μΐ tällä tavalla saatua näytettä (eli 5 μg proteiinia) laitetan geelissä olevaan kuoppaan. Geelikuoppiin laitetaan rinnakkain molekyylipainon merkkiaineita sisältäviä ja samalla tavalla esikäsiteltyjä näytteitä. Elektroforeesi toteutetaan elektroforeesipuskurissa 50 voltin jännitteessä 15 tunnin ajan. Geeli kiinnitetään ja väljiltään 30 Coomassie-sinisellä.

13 107233

Yleisesti, oheisen keksinnön tavoitteita ajatellen käyttökelpoinen ensimmäinen tai toinen molekyyli voi olla peräisin mihin tahansa seroryhmään kuuluvasta N. meningitidis-kannasta. Tämä ensimmäinen tai toinen molekyyli on kuitenkin edullisesti peräisin seroryhmään B kuuluvasta N. meningitidis-kannasta. Edullisesti, ensimmäinen ja toinen 5 molekyyli ovat peräisin vastaavasti seroryhmään B kuuluvista ensimmäisestä ja toisesta N. meningitidis-kannasta.

Keksinnön erään edullisen piirteen mukaisesti ensimmäinen molekyyli on peräisin kannasta 2394, kun taas toinen molekyyli on peräisin kannasta 2169.

10

Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla. Erityisesti, keksinnön mukainen hoitava aine tai hoitavat aineet yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävään laimentimeen tai kantajaan. Keksinnön mukaista koostumusta voidaan antaa millä tahansa tavanomaisella, rokotteille sopivalla tavalla, 15 erityisesti ihon alaisesti, lihaksen sisäisesti tai laskimon sisäisesti, esimerkiksi injektoitavana suspensiona. Koostumusta voidaan antaa kerta-annoksena tai annoksena, joka toistetaan yhteen tai useampaan kertaan tietyn aikavälin jälkeen. Sopiva annos riippuu eri tekijöistä kuten hoidettavasta yksilöstä sekä antotavasta.

20 Keksinnön yksityiskohtia havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, sekä viittaamalla kuvioon 1, joka esittää 7,5 % SDS-PAGE-polyakryyliamidigeelillä toteutetusta elektroforeesista saatuja tuloksia, ja jossa sarakkeet A ja B kuvaavat vastaavasti R meningitidis 2169- ja 2394-kannoissa läsnäolevia reseptoreita. Vaakasuorat nuolet osoittavat vertailuproteiinien, joiden näennäinen molekyylipaino tunnetaan, sijaintia 25 fosforilaasi 94 kD; albumiini 67 kD).

«

Esimerkki 1

Transferriinireseptorin puhdistaminen 2394-kannasta ioninvaihtokromatografisesti 30 14 107233 IA - Viljely

Lyofilisoitua N. meningitidis 2394-kantaa siirretään noin 1 ml:aan Mueller-Hinton-elatusalustaa (BMH, Difco). Sitten tämä bakteerisuspensio levitetään kiinteälle Mueller-Hinton-alustalle, joka sisältää keitettyä verta (5 %).

5

Sen jälkeen, kun bakteereita on inkuboitu 24 tunnin ajan 37 °C:ssa ilmakehässä, joka sisältää 10 % hiilidioksidia C02, muodostunut bakteerikerros otetaan talteen ja se siirrostetaan 150 ml:aan BMH-alustaa, pH 7,2, joka jaetaan kolmeen 250 ml:n ;rlen-meyerpulloon. Pulloja inkuboidaan 3 tunnin ajan 37 °C:ssa samalla sekoittaen. Jolainen 10 tällä tavalla saatu viljelmä voidaan nyt siirrostaa kulloinkin 400 ml:aan BMH-alustaa, pH 7,2, johon on lisätty täydennökseksi 30 /nm etyleenidiamiini-di(o-hydroksiienyy-lietikkahappoa) (EDDA, Sigma), joka on vapaata rautaa kelatoiva aine.

Sen jälkeen, kun viljelmiä on inkuboitu 16 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa samalla 15 sekoittaen, niiden puhtaus varmistetaan niitä mikroskooppisesti tarkastelemalla (iram-väijäyksen jälkeen. Suspensio sentrifugoidaan, bakteerikasauma punnitaan ja sit i säilytetään -20 °C:n lämpötilassa.

IB - Puhdistus 20 Puhdistusmenetelmä on olennaisesti edellä mainitussa julkaisussa Schryvers iit ai. mukainen.

Kohdassa IA saatu bakteerikasauma sulatetaan ja suspendoidaan 200 ml:aan 5C mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0 (puskuri A). Tätä suspensiota sentrifugoidaan 20 mir uutin 25 ajan nopeudella 15 000 x g 4 °C:n lämpötilassa. Kasauma otetaan talteen ja se suspen-. . doidaan uudestaan puskuriin A siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi saadaan 150 g/!. 150 ml:n fraktioita käsitellään 8 minuutin ajan 800 baarin paineessa suurpainesoluhjijotti-messa (Rannie, malli 8.30H). Täten saatua soluhajotetta sentrifugoidaan 15 mir uutin ajan 4 °C:n lämpötilassa nopeudella 15 000 x g. Supematantti otetaan talteen j i sitä 30 sentrifugoidaan 75 minuutin ajan 4 °C:ssa nopeudella 200 000 x g.

15 107233

Supematantti poistetaan ja kasauma siirretään puskuriin A, ja sen jälkeen, kun proteiinipitoisuus on määritetty Lowry: n menetelmällä, suspension pitoisuus asetetaan arvoon 5 mg/ml.

5 1,4 ml:aan saatua kalvosuspensiota lisätään 1,75 mg ihmisen biotinyloitua transferriinia

Schryvers:in kuvaaman menetelmän mukaisesti. Tämän kalvofraktion lopullinen pitoisuus on 4 mg/ml. Seosta inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan nopeudella 100 000 x g 75 minuutin ajan 4 °C:ssa. Kalvokasauma siirretään puskuriin A, joka sisältää 0,1 M NaCl, ja seosta inkuboidaan 10 60 minuuttia ympäristön lämpötilassa.

Liukoistamisen jälkeen tähän suspensioon lisätään tietty tilavuus 30 % (paino/tilavuus) N-lauroyylisarkosiinia ja 500 mM EDTA siten, että Sarkosyylin ja EDTA:n lopulliseksi pitoisuudeksi saadaan vastaavasti 0,5 % ja 5 mM. Seosta inkuboidaan 15 minuutin ajan 15 37 °C:n lämpötilassa samalla sekoittaen, minkä jälkeen siihen lisätään 1 ml streptavi- diini-agaroosi-hartsia (Pierce), joka on pesty ensin puskurilla A. Suspensiota inkuboidaan 15 minuuttia ympäristön lämpötilassa, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 10 minuutin ajan nopeudella 1000 x g. Sitten hartsi vakioidaan pylväässä ja välitön eluaat-ti hylätään.

20

Hartsi pestään 3 pylvästilavuudella 50 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka sisältää IM NaCl, 10 mM EDTA ja 0,5 % Sarkosyyliä (puskuri B), sitten yhdellä pylvästilavuudella puskuria B, joka sisältää 750 mM guanidiini-HCl. Sitten transferriinireseptori eluoidaan puskurilla B, joka sisältää 0,05 % sarkosyyliä ja 2M guanidiini-HCl. 25 Eluaatista kerätään fraktioita, joiden tilavuus on 1 osaa, putkiin, jotka sisältävät 1 tilavuusosan puskuria 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, IM NaCl. Eluaatin optinen tiheys * mitataan aallonpituudella 280 nm pylvään ulostulosta UV-ilmaisimella.

Eluutiopiikkiä vastaavat fraktiot otetaan talteen, ne dialysoidaan 10 mM fosfaattipusku-30 ria, pH 8,0, joka sisältää 0,05 % Sarkosyyliä, vastaan ja lyofilisoidaan. Lyofilisaatti sekoitetaan veteen 10-kertaiseksi pitoisuudeksi. Saatu liuos dialysoidaan toiseen kertaan 16 107233 50 mM fosfaattipuskuria, pH 8,0, joka sisältää 0,05 % Sarkosyyliä (puskuii C), vastaan, minkä jälkeen liuos suodatetaan kalvon, jonka huokoskoko on 0,22 Mm, läpi.

Proteiinipitoisuus määritetään ja asetetaan arvoon 1 mg/ml lisäämällä pusku: ia C 5 aseptisissa olosuhteissa. Tätä valmistetta säilytetään -70 °C:n lämpötilassa.

Esimerkki 2

Transferriinireseptorin puhdistaminen 2169-kannasta 10 Kannan 2169 viljeleminen ja transferriinireseptorin puhdistaminen toteutetaan esimi ;rkis-sä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 3

Farmaseuttinen rokotekoostumus, jolla pyritään estämään N. meninpitidis-baki eerin 15 aiheuttamat infektiot

Esimerkeissä 1 ja 2 saadut steriilit liuokset sulatetaan. Kun halutaan valmistaa litra rokotetta, joka sisältää kumpaakin aktiivista ainetta pitoisuutena 100 Mg/ml, niin seuraavat liuokset sekoitetaan steriilisti toisiinsa: 20 liuos, joka sisältää 2394-reseptoria 100 ml pitoisuutena 1 mg/ml puskurissa C liuos, joka sisältää 2169-reseptoria 100 ml

pitoisuutena 1 mg/ml puskurissa C

25 - fysiologista vettä, joka on puskuroitu 300 ml (PBS) pH-arvoon 6,0 ♦ - alumiinihydroksidi, 10 mg Al3+/ml 50 ml 1 % (p/t) mertiolaatti PBS-liuoksessa 10 ml PBS, siten, että tilavuudeksi saadaan 1000 ml.

30 17 107233

Esimerkki 5

Molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön merkitys rokotteena

Valkoisille uusiseelantilaisille kaniineille annetaan ihon alaisesti ja lihaksen sisäisesti 100 5 Mg 2394- tai 2169-reseptoria (esimerkissä 1 tai 2 saadussa muodossa) Freundin täydelliseen apuaineeseen yhdistettynä. 21 vuorokautta ja 42 vuorokautta ensimmäisen injektion jälkeen kaniineille annetaan uudestaan 100 Mg puhdistettua reseptoria, tällä kertaa kuitenkin yhdessä Freundin epätäydellisen apuaineen kanssa. Eläimistä otetaan seerumia sen jälkeen, kun viimeisestä injektiosta on kulunut 15 vuorokautta, komple-10 mentit poistetaan seerumista ja se suodatetaan kalvon, jonka huokoisuus on 0,45 Mm, läpi. Tämän jälkeen suodoksen annetaan imeytyä saattamalla se kosketukseen alkuperäisen kannan (2394 tai 2169) kanssa, jota kantaa on viljelty tätä tarkoitusta varten edeltäkäsin vapaan raudan läsnäollessa (näissä olosuhteissa transferriinireseptorin synteesi tukahtuu). Kosketukseensaattaminen tapahtuu seuraavasti: 10 ml suodosta 15 lisätään lähtökannan viljelmästä saatuun 1010 pesäkkeitä muodostavaan yksikköön. Imeytymisen annetaan edetä yön yli 4 °C:n lämpötilassa, samalla sekoittaen. Sitten bakteerit poistetaan sentrifugoimalla. Supematantti otetaan talteen, ja sen annetaan imeytyä vielä kahdesti lähtökantaan edellä kuvatulla tavalla.

20 Kummastakin antiseerumista eli anti-reseptori 2394- ja anti-reseptori 2169-seerumista tehdään laimennussaija Ml 19-alustaan (Gibco). Kutakin laimennosta laitetaan 200 m1 [ makrotiitterilevyn (noin 20,3 cm x 30,5 cm) kuoppiin. Vertailunäytteenä käytetään 200

Ml M119-alustaa. Jokaiseen kuoppaan lisätään (i) 100 m1 eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevan N. meningitidis-kannan viljelmää Mueller-Hinton-alustassa, joka sisältää 25 30 mM EDDA, seka (ii) 100 μ1 komplementtia (laimennettua nuoren kaniinin seerumia).

Makrotiitterilevyjä inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa varovasti sekoittaen, minkä jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään 1 ml Mueller-Hinton-alustaa, joka sisältää 1 ml sulaa, jäähdytettyä agaria. Alustan jähmettymisen jälkeen sitä inku-30 boidaan 18-24 tuntia 37 °C:n lämpötilassa; tämän jälkeen arvioidaan jokaisessa kuopassa pesäkkeitä muodostavien yksiköiden lukumäärä. Antiseerumin sen viimeisen 18 107233 laimennoksen, jossa todetaan bakteereiden 50 % hajoaminen vertailuun nähden, käänteisarvo vastaa bakterisidista tiitteriä.

Saadut tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon III:

5 Taulukko III

Bakterisidinen aktiivisuus

Kaniini 1 Kaniini 2

Seerumi Antireseptori- Seerumi ennen Antireseptu- ennen im- antiseerumi immunointia riantiseeru ui munointia 2169 __2394___ 2394 < 8 2048 <8 <8 10 2228 < 8 1024 <8 <8 2154 < 8 2048 <8 <8 2234 < 8 2048 <8 <8 2448 < 8 256 <8 <4 2169 <16 <16 <8 1024 15 |_896_ < 8_<_8_ < 8_65 20 Anti-reseptori 2394-antiseerumin bakterisidinen aktiivisuus kohdistuu pelkästään oheisessa hakemuksessa esitetyn määritelmän mukaisesti ensimmäistä tyyppiä olevia kantoja vastaan (2394, 2228, 2154, 2234 ja 2448), kun taas anti-reseptori 2169-antisee- a rumin bakterisidinen aktiivisuus kohdistuu pelkästään toista tyyppiä olevia lautoja vastaan (2169 ja 876). Tämän perusteella voidaan vetää se johtopäätös, että n mtra-25 loivien vasta-aineiden tuotanto indusoituu molekyylipainoltaan pienemmän ja antij;eeni-syydeltään vaihtelevan alayksikön vaikutuksesta.

t

Kohde: m m^ninpitidis 2394-kannasta peräisin olevan alayksikön Tbp2 aminohapposek venssi SEQ Π) NO: 1 19 107233

Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Aep Ser Vai Glu Thr 15 10 IS

Vai Gin Aap Met: Hia Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu Lys Ser 20 25 30

Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Vai Ser Glu Asn Ser Gly Ala Ala 35 40 45

Tyr Gly Phe Ala Vai Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Aan 50 55 60

Pro Lys Tyr Lys Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp 65 70 75

Lys Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp 80 85 90

Glu Leu Glu Lys Lys Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys 95 100 105

Trp Glu Asp Gly Gin Ser Arg Vai Vai Gly Tyr Thr Asn Phe Thr 110 115 120

Tyr Vai Arg Ser Gly Tyr Vai Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp

125 130 13S

Ile Lys Asn Asn Ile Vai Leu Phe Gly Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr

140 145 ISO

Tyr Lys Gly Lys Glu Pro Ser Lys Glu Leu Pro Ser Glu Lys Ile 155 160 165

Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Tyr Vai Thr Asp Ala Met Glu Lys 170 175 180

Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser Ala Ala Gly Gly Asp Lys Ser 185 190 195

Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly Vai Leu Arg Asn Gin Ala 200 205 210

Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Aso Phe Gly Met Thr Ser Glu Phe 215 220 225

Glu Vai Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly Thr Leu Tyr Arg 230 235 240

Aan Asn Arg Ile Thr Gin Asn Asn Ser Glu Asn Lys Gin Ile Lys 245 250 255 20 107233

Thr Thr Arg Tyr Thr lie Gin Ala THr Leu His Gly Asn Arg Phe 260 265 270

Lye Gly Lye Ala Leu Ala Ala Asp Lye Gly Ala Thr Asn Gly Ser 275 280 285

Hie Pro Phe He ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr 290 295 300

Gly Pro Lye Gly Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp 305 310 315

Asn Lys Vai Ala Ala Val Phe Gly Ala Lys Gin Lys Asp Lys Lys 320 325 330

Asp Gly Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val He Asp 335 340 345

Ala Tyr Arg He Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gin He Asp 350 355 360

Ser Phe Gly Asp Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val Glu Leu 365 370 375

Ser Leu Leu Pro Ser Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gin His Glu 380 385 390

He Glu Gin Asn Gly Val Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu 395 400 405

Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys Leu Ser Lys Gku Asn Lys Asp Asp 410 415 420

Met Phe Leu Gin Gly Val Arg Thr Pro Val Ser Asp Val Ala Ala 425 430 435

Arg Thr Glu Ala Lys Tyr Arg Gly Thr Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr 440 .445 450

He Ala Asn Gly Thr Ser Tro Ser Gly Glu Ala Ser Asn Gin Glu 455 460 465

Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Aso Phe Ser Thr Lys Lys 470 475 480

He Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lvs Asp Arg Thr Ser Pro Ala Phe 485 ' 490 49S

Thr He Thr Ala Met He Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly Val Ala 500 505 510 e • Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gin Asn Thr Gly 515 520 525

Asn Ser His Tyr Thr His He Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe 530 535 540

Tyr Gly Lys Asn Ala He Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro 545 550 555

Gly Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gin Glu Lys Ala Ser Val Val Phe S60 565 570

Gly Ala Lys Arg Gin Gin Leu Val Gin

S7S

Kohde: N._meningitidi$ 2394-kannasta peräisin olevan alayksikön Tbpl aminohapposek venssi 21 SEQ m NO: 2 107233

Glu Aan Vai Gin Ala Glu 1 5

Gin Ala Gin Glu Lys Gin Leu Asp Thr Ile Gin Vai Lys Ala Lys 10 IS 20

Lys Gin Lys Thr Arg Arg Asp Asn Glu Vai Thr Gly Leu Gly Lys 25 30 35

Leu Vai Lys Ser Ser Asp Thr Leu Ser Lys Glu Gin Vai Leu Asn

40 45 SO

Ile Arg Asp Leu Thr Arg Tyr Asp Pro Gly Ile Ala Vai Vai Glu SS 60 65

Gin Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Ile Arg Gly Met Asp 70 75 80

Lys Asn Arg Vai Ser Leu Thr Vai Aso Gly Vai Ser Gin Ile Gin 85 90 95

Ser Tyr Thr Ala Gin Ala Ala Leu Gly Gly Thr Arg Thr Ala Gly 100 105 110

Ser Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ile Glu Tyr Glu Asn Vai Lys Ala 115 120 125

Vai Glu Ile Ser Lys Gly Ser Asn Ser Ser Glu Tyr Gly Asn Gly 130 135 140

Ala Leu Ala Gly Ser Vai Ala Phe Gin Thr Lys Thr Ala Ala Asp 145 ISO 1S5

Ile Ile Gly Glu Gly Lys Gin Trp Gly Ile Gin Ser Lys Thr Ala 160 165 170

Tyr Ser Gly Lys Asp His Ala Leu Thr Gin Ser Leu Ala Leu Ala

175 180 18S

Gly Arg Ser Gly Gly Ala Glu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Lys Arg 190 195 200

Arg Gly Arg Glu Ile His Ala His Lys Asp Ala Gly Lys Gly Vai * 205 210 215

Gin Ser Phe Asn Arg Leu Vai Leu Asp Glu Asp Lys Lys Glu Gly 220 225 230

Gly Ser Gin Tyr Arg Tyr Phe Ile vai Glu Glu Glu cys His Asn 235 240 245

Gly Tyr Ala Ala Cys Lys Asn Lys Leu Lys Glu Asp Ala Ser Vai 250 2S5 260 22 107233

Lys Asp Glu Arg Lys Thr Val Ser Thr Gin Aap Tyr Thr Gly Ser 265 270 275

Asn Arg Leu Leu Ala Asn Pro Leu Glu Tyr Gly Ser Gin Ser Trp 280 28S 290

Leu Phe Arg Pro Gly Trp His Leu Asp Asn Arg His Tyr Val Gly 295 300 305

Ala Val Leu Glu Arg Thr Gin Gin Thr Phe Asp Thr Arg Asp Met 310 315 320

Thr Val Pro Ala Tyr Phe Thr Ser Glu Asp Tyr Val Pro Gly Ser 325 330 335

Leu Lys Gly Leu Gly Lys Tyr Ser Gly Asp Asn Lys Ala Glu Arg 340 345 350

Leu Phe Val Gin Gly Glu Gly Ser Thr Leu Gin Gly He Gly Tyr 355 360 365

Gly Thr Gly Val Phe Tyr Asp Glu Arg His Thr Lys Asn Arg Tyr 370 375 380

Gly Val Glu Tyr Val Tyr His Asn Ala Asp Lys Asp Thr Trp Ala 385 390 395

Asp Tyr Ala Arg Leu Ser Tyr Asp Arg Gin Gly He Asp Leu Asp 400 405 410

Asn Arg Leu Gin Gin Thr His Cys Ser His Asp Gly Ser Asp Lys 415 420 425

Asn Cys Arg Pro Asp Gly Asn Lys Pro Tyr Ser Phe Tyr Lys Ser 430 435 440

Asp Arg Met He Tyr Glu Glu Ser Arg Asn Leu Phe Gin Ala Val 445 450 455

Phe Lys Lys Ala Phe Asp Thr Ala Lys lie Arg His Asn Leu Ser 460 465 470 ·♦ He Asn Leu Gly Tyr Asp Arg Phe Lys Ser Gin Leu Ser His Ser 475 * 480 485

Ast Tyr Tyr Leu Gin Asn Ala Val Gin Ala Tyr Asp Leu He Thr 490 495 500

Pro Lys Lys Pro Pro Phe Pro Asn Gly Ser Lys Asp Asn Pro Tyr 505 510 515 . . Arg Val Ser He Gly Lys Thr Thr Val Asn Thr Ser Pro He Cys : 520 525 530

Arg Phe Gly Asn Asn Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Pro Arg Asn He

535 540 54S

Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Ala Ala Val Gin Asp Asn Val Arg Leu 550 555 560

Gly Arg Trp Ala Asp Vai Gly Ala Gly He Arg Tyr Asp Tyr Arg 565 S70 575

Ser xhr His Ser Glu Asp Lys Ser Val Ser Thr Gly Thr His Arg 580 585 590 23 107233

Aan Leu Ser Trp Aan Ala Gly Vai Vai Lau Lye Pro Phe Thr Trp

S9S 600 60S

Met Asp Leu Thr Tyr Arg Ala Ser Thr Gly Phe Arg Leu Pro Ser 610 615 620

Phe Ala Glu Met Tyr Gly Trp Arg Ala Gly Glu Ser Leu Lye Thr 625 630 635

Leu Asp Leu Lye Pro Glu Lys Ser Phe Asn Arg Glu Ala Gly Ile 640 645 650

Vai Phe Lys Gly Asp Phe Gly Asn Leu Glu Ala Ser Tyr Phe Asn 655 660 665

Asn Ala Tyr Arg Asp Leu Ile Ala Phe Gly Tyr Glu Thr Arg Thr 670 675 680

Gin Asn Gly Gin Thr Ser Ala Ser Gly Asp Pro Gly Tyr Arg Asn 685 690 695

Ala Gin Asn Ala Arg Ile Ala Gly Ile Asn Ile Leu Gly Lys Ile 700 705 710

Asp Trp His Gly Vai Trp Gly Gly Leu Pro Asp Gly Leu Tyr Ser 715 720 725

Thr Leu Ala Tyr Asn Arg Ile Lys Vai Lys Asp Ala Asp Ile Arg 730 735 740

Ala Asp Arg Thr Phe Vai Thr Ser Tyr Leu Phe Asp Ala Vai Gin 745 750 755

Pro Ser Arg Tyr Vai Leu Gly Leu Gly Tyr Aso His Pro Asu Gly 760 765 * 770

Ile Trp Gly Ile Asn Thr Met Phe Thr Tyr Ser Lys Ala Lys Ser 775 780 785 ;· Vai Asp Glu Leu Leu Gly Ser Gin Ala Leu Leu Asn Gly Asn Ala 790 795 800

Asn Ala Lys Lys Ala Ala Ser Arg Arg Thr Arg Pro Trp Tyr Vai 805 810 815

Thr Asp Vai Ser G ly Tyr Tyr Asn Ile Lys Lys His Leu Thr Leu 820 825 830

Arg Ala Gly Vai Tyr Asn Leu Leu Asn Tyr Arg Tyr Vai Thr Trp 835 840 845 . . »

Glu Asn Vai Arg Gin Thr Ala Gly Gly Ala Vai Asn Gin His Lys 850 855 860

Asn Vai Gly Vai Tyr Asn Arg Tyr Ala Ala Pro Gly Arg Asn Tyr 865 870 875

Thr Phe Ser Leu Glu Met Lys Phe 880 <. e SEQ ID NO: 3

Kohde: N. meningitidis 2169-kannasta peräisin olevan alayksikön Tbpl aminohapj>osek- venssi 24 107233

Glu Asn vai Gin Ala Gly 1 5

Gin Ala Gin Glu Lys Gin Leu Asp Thr Ile Gin Vai Lya Ala Lys 10 IS 20

Lys Gin Lys Thr Arg Arg Asp Asn Glu Vai Thr Gly Leu Gly Lys 25 30 35

Leu Vai Lys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Lys Glu Gin Vai Leu Asp 40 45 50

Ile Arg Asp Leu Thr Arg Tyr Asp Pro Gly Ile Ala Vai Vai Glu 55 60 65

Gin Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Ile Arg Gly Met Asp 70 7S 80

Lys Asn Arg Vai Ser Leu Thr Vai Asp Gly Leu Ala Gin Ile Gin 85 90 95

Ser Tyr Thr Ala Gin Ala Ala Leu Gly Gly Thr Arg Thr Ala Gly 100 105 110

Ser Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ile Glu Tyr Glu Asn Vai Lys Ala 115 120 125

Vai Glu Ile Ser Lys Gly Ser Asn Ser Vai Glu Gin Gly Ser Gly 130 135 140

Ala Leu Ala Gly Ser Vai Ala Phe Gin Tyr Lys Thr Ala Asp Asp 145 ISO 155 • ’* Vai Ile Gly Glu Gly Arg Gin Trp Gly Ile Gin Ser Lys Thr Ala 160 165 170

Tyr Ser Gly Lys Asn Arg Gly Leu Thr Gin Ser Ile Ala Leu Ala 175 180 185

Gly Arg Ile Gly Gly Ala Glu Ala Leu Leu Ile His Thr Gly Arg 190 195 200 . Arg Ala Gly Glu Ile Arg Ala His Glu Asp Ala Gly Arg Gly Vai 205 210 215 i

Gin Ser Phe Asn Arg Leu Vai Pro Vai Glu Asp Ser Ser Glu Tyr 220 225 230

Ala Tyr Phe Ile Vai Glu Asp Glu Cys Glu Gly Lys Asn Tyr Glu 235 240 245

Thr Cys Lys Ser Lys Pro Lys Lys ASp Vai Vai Gly Lys Asp Glu 250 255 260 25 107233

Arg Gin Thr Vai S«r Thr Arg Asp Tyr Thr Gly Pro Asn Arg Phe 265 270 275

Leu Ala Asp Pro Leu Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Trp Leu Phe Arg 280 285 290

Pro Gly Phe Arg Phe Glu Asn Lys Arg His Tyr Ile Gly Gly Ile 295 300 305

Leu Glu His Thr Gin Gin Thr Phe Asp Thr Arg Asp Met Thr Vai 310 315 320

Pro Ala Phe Leu Thr Lys Ala Vai Phe Asp Ala Asn Ser Lys Gin 325 330 335

Ala Gly Ser Leu Pro Gly Asn Gly Lys Tyr Ala Gly Asn His Lys 340 345 350

Tyr Gly Gly Leu Phe Thr Asn Gly Glu Asn Gly Ala Leu Vai Gly 355 360 365

Ala Glu Tyr Gly Thr Gly Vai Phe Tyr Asp Glu Thr His Thr Lys 370 375 380

Ser Arg Tyr Gly Leu Glu Tyr Vai Tyr Thr Asn Ala Asp Lys Asp 385 390 395

Thr Trp Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Ser Tyr Asp Arg Gin Gly Ile 400 405 410

Gly Leu Asp Asn His Phe Gin Gin Thr His Cys Ser Ala Asp Gly 415 420 425

Ser Asp Lys Tyr Cys Arg Pro Ser Ala Asp Lys Pro Phe Ser Tyr 430 435 440

Tyr Lys Ser Aso Arg Vai Ile Tyr Gly Glu Ser His Arg Leu Leu 445 450 455

Gin Ala Ala Phe Lys Lys Ser Phe Asp Thr Ala Lys Ile Arg His 460 465 470

Asn Leu Ser Vai Asn Leu Gly Phe Asp Arg Phe Asp Ser Asn Leu 475 480 485

Arg His Gin Asp Tyr Tyr Tyr Gin His Ala Asn Arg Ala Tyr Ser 490 495 500

Ser Lys Thr Pro Pro Lys Thr Ala Asn Pro Asn Gly Asp Lys Ser 505 510 515 « *. Lys Pro Tyr Trp Vai Ser Ile Gly Gly Gly Asn Vai Vai Thr Gly 520 525 530

Gin Ile Cys Leu Phe Gly Asn Asn Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Pro 535 540 545

Arg Ser Ile Asn Gly Lys Ser Tyr Tyr Ala Ala Vai Arg Asp Asn 550 555 560

Vai Arg Leu Gly Arg Trp Ala Asp Vai Gly Ala Gly Leu Arg Tyr 565 570 575 26 107233

Asp Tyr Arg Ser Thr His Ser Asp Asp Gly Ser Val Ser Thr Gly 580 585 590

Thr Hie Arg Thr Leu Ser Trp Asn Ala Gly lie Val Leu Lys Pro

595 600 60S

Ala Asp Trp Leu Asp Leu Thr Tyr Arg Thr Ser Thr Gly Phe Arg 610 615 620

Leu Pro Ser Phe Ala Glu Met Tyr Gly Trp Arg Ser Gly Val Gin 625 630 635

Ser Lys Ala Val Lys He Asp Pro Glu Lys Ser Phe Asn Lys Glu 640 645 650

Ala Gly He Val Phe Lys Gly Asp Phe Gly Asn Leu Glu Ala Ser 655 660 665

Trp Phe Asn Asn Ala Tyr Arg Asp Leu He Val Arg Gly Tyr Glu 670 675 680

Ala Gin He Lys Asn Gly Lys Glu Glu Ala Lys Gly Asp Pro Ala 685 690 695

Tyr Leu Asn Ala Gin Ser Ala Arg He Thr Gly He Asn He Leu 700 705 710

Gly Lys He Asp Trp Asn Gly Val Trp Asp Lys Leu Pro Glu Gly 715 720 725

Trp Tyr Ser Thr Phe Ala Tyr Asn Arg Val His Vai Arg Asp He 730 735 740

Lys Lys Arg Ala Asp Arg Thr Asp He Gin Ser His Leu Phe Asp 745 750 755

Ala He Gin Pro Ser Arg Tyr Val Val Gly Leu Gly Tyr Asp Gin 760 765 770

Pro Glu Gly Lys Trp Gly Val Asn Gly Met Leu Thr Tyr Ser Lys 775 780 785

Ala Lys Glu He Thr Glu Leu Leu Gly Ser Arg Ala Leu Leu Asn 790 795 800

Gly Asn Ser Arg Asn Thr Lys Ala Thr Ala Arg Arg Thr Arg Pro 80S 810 815

Trp Tyr He Val Asp Val Ser Gly Tyr Tyr Thr He Lys Lys His 820 825 830 * Phe Thr Leu Arg Ala Gly Val Tyr Asn Leu Leu Asn Tyr Arg Tyr 835 840 845

Val Thr Tro Glu Asn Val Arg Gin Thr Ala Gly Gly Ala Val Asn 850 855 860

Gin His Lys Asn Val Gly Val Tyr Asn Arg Tyr Ala Ala Pro Gly 865 870 875

Arg Asn Tyr Thr Phe Ser Leu Glu Met Lys Phe 880 885 SEQ m NO: 4

Kohde: N. meningitidis 2169-kannasta peräisin olevan alayksikön Tbp2 aminohapposek venssi 27 107233

Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu IS 10

Aep Ser Vai Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gin 15 20 25

Asp Vai Ser Ser Glu Lys Pro Gin Ala Gin Lys Asp Gin Gly Gly 30 35 40

Tyr Gly Phe Ala Met Arg Leu Lys Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly 45 50 55

Ala Glu Glu Ser Glu Vai Lys Leu Asn Glu Ser Asp Trp Glu Ala 60 65 70

Thr Gly Leu Pro Thr Lys Pro Lys Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys 75 80 85

Ser Vai Ile Glu Lys Vai Glu Thr Asp Gly Asp Ser Asp Ile Tyr 90 95 100

Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Asn His Gin Asn Gly Ser Ala 105 110 115

Gly Asn Gly Vai Asn Gin Pro Lys Asn Gin Ala Thr Gly Kis Glu 120 125 130

Asn Phe Gin Tyr Vai Tyr Ser Gly Trp Phe Tyr Lys His Ala Ala 135 140 145

Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys Ser Gly Asp Asp ISO 155 160 * Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg Gin Leu Pro 165 170 175

Ala Ser Gly Lys Vai Ile Tyr Lys Gly Vai Trp His Phe Vai Thr 180 185 190

Asp Thr Lys Lys Gly Gin Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gin Pro Ser 195 200 205

Lys Lys Gin Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser : 210 215 220

Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His 225 230 235

Glu Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Asn Leu Glu Vai Asp Phe Gly Asn 240 245 250

Lys Lys Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn 255 260 265 28 107233

Aan Aan Thr Aan Aan Aap Lys Kis Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Lau 270 27S 280

Aap Ala Gin Ile Thr Gly Aan Arg Phe Aan Gly Thr Ala Thr Ala 28S 290 295

Thr Aap Lys Lya Glu Aan Glu Thr Lya Leu Hia Pro Phe Vai Ser 300 305 310

Aep Ser Ser Ser Lea Ser Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu 315 320 325

Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Aep Asp Gin Lya Vai Ala Vai 330 335 340

Vai Gly Ser Ala Lya Thr Lya Asp Lys Leu Glu Aan Gly Ala Ala 345 350 355

Ala Ser Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly 360 365 370

Thr Ser Ser Glu Aan Ser Lys Leu Thr Thr Vai Leu Asp Ala Vai 375 380 385

Glu Leu Thr Leu Asn Aap Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe 390 395 400

Ser Aan Ala Ala Gin Leu Vai Vai Asp Gly Ile Het Ile Pro Leu 405 410 415

Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Ala Asp Lys Gly 420 425 430

Lys Aan Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr Pro 435 440 445

Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ala Gin Ala Gly Thr Gin Thr Asn Gly 450 455 460

Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Ala Gly Asp Thr Asn Gly Lys Thr 465 470 475

Lya Thr Tyr Glu Vai Glu Vai Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu 480 * 485 . 490

Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys Asn Ser Lys Ser Ala Het Gin 495 500 505

Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gin Vai 510 515 520 •

Glu Gin Ser Het Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu 525 530 535

Ile Pro Thr Asp Gin Asn Vai Vai Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly 540 545 S50

His Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys 555 560 565

Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Thr Vai Asn Phe Ala Asp Lys 570 57S 580 29 107233

Lye lie Thr Gly Lye Leu Thr Ala Glu Aen Arg Gin Ala Gin Thr

S8S 590 S9S

Phe Thr lie Glu Gly Met Xle Gin Gly Asn Gly Phe Glu Gly Thr 600 605 610

Ala Lye Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Lys Asn Thr 615 620 625

Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala Lys Val Lys Gly 630 635 640

Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala 645 650 655

Tyr Pro Gly Asp Lys Gin Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr Ser Ser 660 665 670

Asp Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys 675 680 685

Arg Gin Gin Pro Val Gin 690

Claims (14)

107233

1. Menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi Neisseria men ngiti-dis-infektion ennaltaehkäisemiseksi tai vaikutusten lieventämiseksi, tunnettu siitä, että 5 terapeuttisesti vaikuttava aine/aineet yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävään lait nenti-meen tai kantajaan, ja terapeuttisesti vaikuttava aine/aineet käsittävät vähintään ensimmäisen ja toisen sellaisen molekyylin, jotka kykenevät kytkeytymään humaani trans-ferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä N. me lingi-tidis-kannasta, jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu vähintään yh-10 destä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa N. meningitidis 2394-k innan (reseptorin 2394) anti-reseptori-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainoltaai pienemmän alayksikön eikä N. meningitidis 2169-kannan (reseptorin 2169) anti-rese Dtori-antiseerumi tunnista tätä molekyylipainoltaan pienempää alayksikköä; mainitun loisen 15 molekyylin ollessa peräisin toisesta N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva hun aani-transferriinin reseptori koostuu vähintään yhdestä, molekyylipainoltaan suuresta alayksiköstä sekä yhdestä, molekyylipainoltaan pienemmästä alayksiköstä, ja jonka reseptorin tapauksessa anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa tämän molekyylipainc ltaan pienemmän alayksikön eikä anti-reseptori 2394-antiseerumi tunnista tätä molelyyli-20 painoltaan pienempää alayksikköä. • «

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että terapeuttisesti vaikuttava aine/aineet käsiitävät vähintään ensimmäisen ja toisen sellaisen molekyylin, jotka kykenevät kytkeytymään 25 humaanitransferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmä: sestä N. meningitidis-kannasta. jossa on läsnä humaanitransferriinin reseptori, johon kiulu-van molekyylipainoltaan suuren alayksikön ja molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön anti-reseptori 2394-antiseerumi tunnistaa; ja mainitun toisen molekyylin ollessa peräisin toisesta N. meningitidis-kannasta. jossa on läsnä humaanitransferriinin reseptori, 30 johon kuuluvan, molekyylipainoltaan suuren alayksikön ja molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön anti-reseptori 2169-antiseerumi tunnistaa. 107233

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että terapeuttisesti vaikuttava aine/aineet käsittävät vähintään ensimmäisen ja toisen sellaisen molekyylin, jotka kykenevät kytkeytymään humaanitransferriiniin; mainitun ensimmäisen molekyylin ollessa peräisin ensimmäisestä

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen molekyyli on peräisin 15 ensimmäisestä N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu olennaisesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 93-95 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, jolla on pienempi, noin 72-65 kD oleva molekyylipaino.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen 20 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen molekyyli on peräisin ensimmäisestä N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori ' · t koostuu olennaisesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 93 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, jolla on pienempi, noin 67-70 kD oleva molekyylipaino.

5 N. meningitidis-kannasta. jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu olennaisesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 100-90 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, jolla on pienempi, noin 75-60 kD oleva molekyylipaino; ja mainitun toisen molekyylin ollessa peräisin toisesta N. menineitidis-kannasta. jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu olennaisesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 10 100-90 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, jolla on pienempi, noin 90-80 kD oleva molekyylipaino.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu toinen molekyyli on peräisin toisesta N. • < : - meningitidis-kannasta, jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu olennai sesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 100-95 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, jolla on pienempi, noin 87-85 kD oleva molekyylipaino. 30 107233

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostun uksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu toinen molekyyli on peräisin toisesta Nj. meningitidis-kannasta, jossa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori koostuu obnnai-sesti alayksiköstä, jolla on suuri, noin 98 kD oleva molekyylipaino, sekä alayksiköstä, 5 jolla on pienempi, noin 87 kD oleva molekyylipaino.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuk-sen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen molekyyli, joka kykenee k 'tkey-tymään humaanitransferriiniin, ja joka on peräisin ensimmäisestä kannasta, on ma: nitus- 10 sa ensimmäisessä kannassa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokott koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen molekyyli, joka kykenee kytkeytymään humaanitransferriiniin, ja joka on peräisin ensimmäisestä kaimasi a, on 15 mainitussa ensimmäisessä kannassa läsnäolevaan humaanitransferriinin resef toriin kuuluva, molekyylipainoltaan pienempi alayksikkö tai tämän molekyylipain iltaan pienemmän alayksikön kappale tai analogi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumiksen 20 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen molekyyli, joka kykenee kytkeytymään humaanitransferriiniin, ja joka on peräisin ensimmäisestä kannasta, on maitiitus- • < sa ensimmäisessä kannassa läsnäolevaan humaanitransferriinin reseptoriin kuuluva, molekyylipainoltaan pienempi alayksikkö.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostu- muksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että toinen molekyyli, joka kykenee kytkeyty- • · - - mään humaanitransferriiniin, ja joka on peräisin toisesta kannasta, on mainitussa to sessa kannassa läsnäoleva humaanitransferriinin reseptori.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokote koos tumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että toinen molekyyli, joka kykenee kytkeyty- 107233 mään humaanitransferriimin, ja joka on peräisin toisesta kannasta, on mainitussa toisessa kannassa läsnäolevaan humaanitransferriinin reseptoriin kuuluva, molekyylipainoltaan pienempi alayksikkö tai tämän molekyylipainoltaan pienemmän alayksikön kappale tai analogi. 5

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että toinen molekyyli, joka kykenee kytkeytymään humaanitransferriimin, ja joka on peräisin toisesta kannasta, on mainitussa toisessa kannassa läsnäolevaan humaanitransferriinin reseptoriin kuuluva, molekyylipainoltaan 10 pienempi alayksikkö.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä farmaseuttisen rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen molekyyli ovat vastaavasti peräisin seroryhmään B kuuluvasta ensimmäisestä ja toisesta N. meningitidis- 15 kannasta. • t • · 107233