ES3039650T3 - Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis b virus rna, including hbv rna transcribed from cccdna - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la detección rápida de la presencia o ausencia de ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra biológica o no biológica. Los oligonucleótidos bloqueadores competitivos previenen la amplificación de la DMA del VHB. Los métodos pueden incluir una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección. Además, se proporcionan oligonucleótidos bloqueadores competitivos para prevenir la amplificación de la DMA del VHB, cebadores y sondas dirigidos al VHB (en particular, ARN del VHB transcrito a partir de ADNccc, como el ARNpg) y kits diseñados para la detección de ARN del VHB, en particular, ARN del VHB transcrito a partir de ADNccc, como el ARNpg. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la amplificación y detección de ARN del virus de la hepatitis B, incluyendo ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo de diagnóstico víricoin vitro.Dentro de este campo, la presente invención se refiere a la amplificación y detección de un ácido nucleico diana que puede estar presente en una muestra y, en particular, a la amplificación y detección específica de un ácido nucleico diana que comprende variaciones de secuencia y/o mutaciones individuales del virus de la hepatitis B (VHB), en particular, ARN de VHB (en particular, ARN de VHB derivado de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc) tal como ARN pregenómico de VHB (ARNpg)), usando al menos un cebador de transcripción inversa (RT) y al menos un oligonucleótido de bloqueo competitivo, para evitar la amplificación y detección de ADN de VHB genómico homólogo. La invención proporciona además procedimientos y kits que contienen oligonucleótidos (tales como un cebador de transcripción inversa (RT) y oligonucleótidos de bloqueo competitivos) para la amplificación y detección del ARN de VHB circulante.

Antecedentes de la invención

La hepatitis es una inflamación del hígado, que puede estar provocada por una familia de infecciones víricas que afectan al hígado, siendo los tipos más comunes hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C. La hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C son enfermedades provocadas por tres virus diferentes. La hepatitis B es una enfermedad infecciosa del hígado provocada por el virus de la hepatitis B (VHB). El VHB puede provocar infecciones tanto agudas como crónicas. Durante la infección inicial, muchas personas son asintomáticas, mientras que algunas desarrollan una rápida aparición de síntomas (incluyendo vómitos, piel amarillenta, cansancio, orina oscura y dolor abdominal). La hepatitis B crónica afecta preferentemente a aquellos infectados alrededor del momento del nacimiento. La mayoría de los individuos con enfermedades crónicas también son asintomáticos, pero pueden desarrollar finalmente cirrosis y cáncer de hígado. Estas complicaciones dan como resultado la muerte de un 15 a un 25 % de las personas con enfermedad crónica. El VHB, en general, se transmite por exposición a sangre o líquidos corporales infecciosos, por ejemplo, cuando la sangre, semen u otro líquido corporal de una persona infectada con el VHB entra en el cuerpo de alguien que no está infectado. Esto puede ocurrir a través del contacto sexual, compartiendo agujas, jeringuillas u otros equipos para inyectar drogas o de madre a bebé al nacer. La infección en el momento del nacimiento o por contacto con la sangre de otras personas durante la infancia es el procedimiento más frecuente por el que se adquiere la hepatitis B en áreas donde la enfermedad es común. En áreas donde la enfermedad es rara, el uso de drogas intravenosas y las relaciones sexuales son las vías de infección más frecuentes. Otros factores de riesgo incluyen trabajar en atención sanitaria, transfusiones de sangre, diálisis, vivir con una persona infectada, viajar a países donde la tasa de infección es alta y vivir en una institución. Una infección por VHB se puede diagnosticar 30-60 días después de la exposición. El diagnóstico normalmente se confirma a continuación analizando la sangre para detectar partes del virus VHB y anticuerpos contra el virus VHB.

La infección por VHB se puede prevenir por vacunación desde 1982. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la vacunación en el primer día de vida, si es posible, y necesitándose dosis posteriores para garantizar la protección a más largo plazo. Para aquellas personas con enfermedades de hepatitis B crónicas, la medicación antivírica tal como tenofovir o interferón puede ser útil, mientras que el trasplante de hígado a veces es útil para aquellas con cirrosis.

Existen tratamientos disponibles para gestionar la enfermedad, sin embargo, la tasa de curación es baja. En ausencia de tratamiento curativo, se requiere adherencia de por vida a medicamentos antivíricos. La retirada del tratamiento a menudo permite un rebote en los valores de VHB, debido a la incapacidad de los tratamientos actuales de dirigir directamente el reservorio de genomas episomales de VHB en los núcleos de células infectadas.

El ciclo de vida vírico para VHB alterna entre las formas ADN y ARN. La partícula de VHB infecciosa contiene un genoma de ADN bicatenario incompleto (ADN relajado circular o ADNrc). En una célula infectada, la replicación del ADN de VHB se completa para formar un ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc) en el núcleo de la célula huésped. La transcripción de este genoma de ADN genera una variedad de formas de ARN mensajero, que codifican las proteínas en la estructura del virus (proteínas centrales y de superficie), el antígeno e, la polimerasa vírica y el antígeno X. Una forma de ARNm, conocida como ARN pregenómico (ARNpg), también sirve como molde para la actividad de transcripción inversa de la polimerasa vírica, que produce nuevas copias del ADNrc en partículas víricas encapsidadas secretadas. Algunas pruebas muestran que alguna proporción de ARNpg encapsidado se libera sin transcribirse de forma inversa, de modo que la producción de una célula infectada incluye partículas víricas que contienen tanto ADNrc como ARNpg. Además, existen múltiples variantes de ARN empalmado, de las que algunas también se transcriben de forma inversa en formas incompletas de ADN de VHB y se secretan. La integración del genoma de VHB en un cromosoma huésped no es parte del ciclo de replicación, ya que esto no puede producir moléculas de ARNpg completas; sin embargo, es una suceso común y puede dar como resultado células huésped que produzcan ARNm más pequeños, truncados o de fusión, que contribuyen a la secreción de partículas subvíricas que contienen antígenos de superficie.

A continuación, en la tabla 1, hay una lista de las formas de ARN de VHB que se cree que se generan a partir del ADNccc de VHB:

Tabla 1: se cree que las formas de ARN de VHB se generan a partir del ADNccc de VHB

A continuación, en la tabla 2, hay una lista de las formas de ARN de VHB que no se pueden transcribir a partir de copias integradas (es decir, son exclusivamente de origen ADNccc).

Tabla 2:formas de ARN de VHB que no se pueden transcribir a partir de copias integradas (son exclusivamente de origen ADNccc)

A continuación, en la tabla 3, se muestran algunas formas de ARN de VHB que se podrían transcribir a partir de copias integradas.

Tabla 3:algunas formas de ARN de VHB que se podrían transcribir a partir de copias integradas.

Los marcadores de VHB incluyen la detección de ADN, antígeno e (del ARNm precentral), antígeno central (o combinaciones de antígenos incluyendo e y central) y antígeno s, así como la producción de anticuerpos del sujeto/paciente para estos antígenos. La supresión del antígeno s es el marcador para una curación funcional. Sin embargo, el antígeno s se puede producir por copias integradas no replicantes de VHB y por lo tanto es poco probable que la cuantificación de niveles de HBsAg refleje con exactitud el conjunto de ADNccc transcripcionalmente activo. El valor de ADN se monitoriza como una prueba sensible para detectar la infección por VHB y la disminución en VHB es un indicador de la respuesta al tratamiento. Sin embargo, los tratamientos con análogos nucleosídicos actuales para VHB (que suprimen la transcripción inversa) no afectan a la transcripción de ARNpg u otros ARNm, solo a la generación de nuevas copias de ADNrc. La disminución en los valores de ADN en la sangre del paciente (tipos de muestra de plasma o suero) no siempre se corresponde con la disminución del ARN de VHB, que se puede retrasar o incluso incrementar temporalmente a medida que el ARNpg encapsidado (y el ARN empalmado) se pueden secretar por células infectadas que conservan ADNccc transcripcionalmente activo. Debido a esto, el ARN de VHB se ha explorado como un marcador separado para monitorizar el estado de enfermedad por VHB y la eficacia del tratamiento. Los estudios han demostrado que los niveles de ARN de VHB pueden predecir resultados tales como pérdida de antígeno e, recidiva vírica o acontecimientos de "empeoramiento" después de la interrupción del tratamiento, y el biomarcador es potencialmente crítico para determinar el momento del final del tratamiento para pacientes con VHB.

La discriminación entre estructuras y variantes de ARN de VHB y la distinción del ARN des los homólogos del ADN es importante para comprender el estado de enfermedad. Los ensayos del estado de la técnica seleccionan la cola de poli-A con un procedimiento RACE de dos fases (RT y PCR) (van Bommel,et al.,Hepatology 61:66-76 (2015); Zhang,et al.,Methods Mol Med 95:29-44 (2004); Kairat,et al.,Intervirology 42:228-237 (1999), Schutzet al.,Journal of Virological Methods, 86(2): 167-171 (2000). Los ensayos adicionales seleccionan la región del genoma entre los sitios de inicio de la transcripción del ARNm precentral y el ARNpg, para distinguir estas formas (Wang,et al.,Journal of Hepatology 65:700-710 (2016). También se puede usar una selección similar de las diferencias de longitud del extremo 5' de los ARNm para discriminar entre el ARNpg y los ARNm víricos más pequeños que producen el antígeno s y el antígeno X (Butler E.K.et al.,Hepatology. 2018 68(6):2106-2117). Otros ensayos pueden seleccionar las variantes de ARN (o ADN) empalmados (Bayliss,et al.,J. Hepatol. 59:1022-1028 (2013); Preiss,et al.,Hepatology 48:741-749 (2008). Todos los ensayos, excepto algunos de los ensayos RACE dirigidos a poliA, requieren el uso de un procedimiento de retirada de ADN (tal como el tratamiento con DNasa o un procedimiento de preparación de muestra que favorece el ARN o disminuye el ADN) para la discriminación del ARN de VHB del ADN, lo que limita la sensibilidad del ensayo y el uso potencial en qPCR sin una etapa de inactivación de DNasa u otras etapas de limpieza, y que puede dejar ADN residual o tener un efecto sobre la cantidad o integridad del ARN debido a las etapas adicionales implicadas. Los ensayos RACE dirigidos a poliA y la mayoría de los otros requieren una preparación de muestra manual, lo que limita el rendimiento de las pruebas que se pueden realizar en un día.

Gaoet al.,Arch Virol. 2019 Nov;164(11):2683-2690 se refiere a un ensayo de PCR de transcripción inversa cuantitativa de una etapa novedoso para la amplificación selectiva de ARN pregenómico del virus de la hepatitis B a partir de una mezcla de ARN y ADN de VHB en suero. Por tanto, los ensayos existentes en la técnica simplemente no son suficientemente sensibles. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de obtener un procedimiento para detectar ARN de VHB en un fondo de ADN homólogo sin el requisito de preparación de muestra manual y con la capacidad de omitir el tratamiento con DNasa.

En el campo del diagnóstico molecular, la amplificación y detección de ácidos nucleicos es de considerable importancia. Dichos procedimientos se pueden emplear para detectar cualquier número de microorganismos, tales como virus y bacterias. La técnica de amplificación más destacada y ampliamente usada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otras técnicas de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa, reacción en cadena de la polimerasa ligasa, Gap-LCR, reacción en cadena de reparación, 3 SR, NASBA, amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación Qp.

Los sistemas automatizados para el análisis basado en PCR a menudo hacen uso de la detección ultrarrápida de la amplificación del producto durante el procedimiento de PCR en el mismo recipiente de reacción. La clave para dichos procedimientos es el uso de oligonucleótidos modificados que llevan grupos indicadores o marcadores.

La infección por VHB está muy extendida, aproximadamente un tercio de la población mundial está infectada en algún momento de su vida, incluyendo 343 millones que padecen infecciones crónicas. Más de 750.000 personas mueren cada año de hepatitis B, aproximadamente 300.000 de esas muertes se atribuyen a cáncer de hígado. A pesar de la amplia infecciosidad de VHB, muchos de los infectados no lo saben, ya que la infección es en gran medida asintomática. Además, los procedimientos de diagnóstico actuales se centran en la detección del antígeno de VHB, anticuerpos para antígenos de VHB o ADN de VHB. Los estudios indican que una disminución en los valores de antígeno de VHB o de ADN de VHB en sangre no siempre corresponde a una disminución en el ARN de VHB. Como tal, existe una necesidad en la técnica de obtener un procedimiento rápido, fiable y sensible para detectar ARN de VHB, para monitorizar el estado de enfermedad de VHB y la eficacia terapéutica. La presente invención descrita aquí permite la detección de ARN de VHB en un fondo de ADN homólogo sin los requisitos de preparación de muestra manual o de tratamiento con ADNasa.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Determinados modos de realización en la presente divulgación se refieren a procedimientos para la detección rápida de la presencia o ausencia de ARN de VHB en una muestra biológica o no biológica, para monitorizar el estado de enfermedad de VHB y la eficacia terapéutica, por ejemplo, la detección de VHB por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un solo tubo de ensayo. Los modos de realización incluyen procedimientos de detección de VHB que comprenden realizar al menos una etapa de ciclado, que puede incluir una etapa de amplificación y una etapa de hibridación. Además, los modos de realización incluyen oligonucleótidos (incluyendo un cebador de transcripción inversa (que también puede ser un cebador de p Cr ), oligonucleótido de bloqueo, cebadores y sondas convencionales) y kits que se diseñan para la detección de VHB en un solo tubo.

El uso del oligonucleótido de bloqueo competitivo mejora la detección y cuantificación de ARN en presencia de ADN homólogo. En pacientes con VHB, el virus que contiene ADN y el ARN circulan ambos en la circulación sanguínea y, en pacientes no tratados, el nivel de ADN es típicamente mayor que el nivel de ARN. Ambas formas también se hallarían conjuntamente en otros tipos de muestra. Las técnicas de PCR convencionales no pueden distinguir el ARN de VHB (ARNpg y otros ARNm no empalmados) del ADN porque existe una secuencia común (solo se empalma un subconjunto de formas de ARN de VHB). Las técnicas de retirada de ADN (por ejemplo, DNasas u otros procedimientos de procesamiento de muestra que pueden favorecer el ARN o disminuir el<a>D<n>) también pueden afectar al valor de ARN, pueden no ser completamente eficaces o tener una eficacia variable y presentar desventajas de estabilidad, contaminación u otras que eviten su uso en flujos de trabajo automatizados o de alto rendimiento.

Una diferencia de secuencia entre el ARN y el ADN de VHB es la cola de poliA del ARNpg y otros ARNm; sin embargo, los procedimientos que usan cebadores oligonucleotídicos d(T) pueden detectar ARN no diana u otras secuencias con tramos de poliA. Los oligonucleótidos que contienen poliT "anclados" pueden proporcionar cierta medida de especificidad contra la unión y extensión no dirigidas; sin embargo, esta es una estrategia de compensación que dará como resultado cierta unión al ADN de VHB. El procedimiento de esta divulgación incluye un oligonucleótido de bloqueo competitivo que coincide con la secuencia de ADN en un diana donde la secuencia de ARN tiene una unión de cola de poliA, como un procedimiento para mejorar el rendimiento (sensibilidad y especificidad) de un ensayo dirigido a ARN en presencia de ADN. La unión del oligonucleótido de bloqueo competitivo al ADN de VHB genómico homólogo evita la unión del cebador (por ejemplo, cebador RT) y por lo tanto reduce la amplificación no deseada del ADN de VHB genómico homólogo. Se pueden incorporar bases estabilizantes modificadas a los oligonucleótidos de ensayo u oligonucleótidos bloqueadores para mejorar además las capacidades de discriminación del procedimiento.

Se pueden proporcionar cebadores y sondas que seleccionan la cola de poliA del ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, que tiene una posición de cola de poliA estándar para transcritos, tal como ARNpg, pero que también incluye otros ARNm y ARN empalmados). Se pueden proporcionar oligonucleótidos de bloqueo competitivos que incrementen la especificidad por ARN en presencia de ADN de VHB. Se pueden proporcionar cebadores y sondas adicionales que seleccionan otros sitios de poliA, tales como el sitio de poliA secundario o truncado para transcritos de VHB que se pueden originar a partir de copias de VHB integradas. Se pueden proporcionar oligonucleótidos de bloqueo competitivos que incrementan la especificidad por ARN con estos sitios de poliA específicos en presencia del ADN homólogo.

Un modo de realización de la divulgación se refiere a un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos de unión competitiva, uno o más conjuntos de cebadores y una ácido nucleico polimerasa, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador de transcripción inversa (Rt ) que también funciona como cebador inverso, para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre. En otro modo de realización, (i) el al menos un cebador directo comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una secuencia de ácido nucleico de uno o más de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 116, 117, 151 y 152, o un complemento de la misma; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma.

Otro modo de realización de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos de unión competitiva, uno o más conjuntos de cebadores y una ácido nucleico polimerasa, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso, para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que: el uno o más conjuntos de cebadores comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso, y en el que: (i) el al menos un cebador directo comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T, y comprende una secuencia de ácido nucleico de uno o más de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 116, 117, 151 y 152, o un complemento de la misma; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre.

Otro modo de realización de la presente divulgación se refiere a un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) que pueden estar presentes en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden: (a) una ácido nucleico polimerasa; (b) nucleósidos trifosfato; (c) uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso; (d) una o más sondas, y (e) uno o más oligonucleótidos de unión competitiva. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del a Rn de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica, tal como plasma o sangre. En otro modo de realización, (i) el al menos un cebador directo comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una secuencia de ácido nucleico de uno o más de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 116, 117, 151 y 152, o un complemento de la misma; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. Otro modo de realización de la divulgación se refiere a un kit para detectar ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) una ácido nucleico polimerasa; (b) nucleósidos trifosfato; (c) uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso; (d) una o más sondas; y (e) uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos; y en el que: (i) el al menos un cebador directo comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID<n>O:387, o un complemento de la misma; (ii) el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T, y en el que el al menos un cebador de transcripción inversa que también funciona como cebador inverso comprende una secuencia de ácido nucleico de uno o más de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 116, 117, 151 y 152, o un complemento de la misma; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el al menos un cebador de transcripción inversa (RT) que también funciona como cebador inverso comprende una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre.

Un modo de realización de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos de unión competitiva y uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso, para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica, tal como plasma y/o sangre. En otro modo de realización, (i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden dos secuencias nucleicas, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:43, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonudeótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1,2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas.

Otro modo de realización de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra; (b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con uno o más oligonucleótidos de unión competitiva y uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso, para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y (d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia de uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB en la muestra, y en el que: el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso, y en el que: (i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T, y comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO: 34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden un ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento del mismo. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden dos secuencias nucleicas, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:43, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre.

Otro modo de realización de la presente divulgación se refiere a un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) que pueden estar presentes en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden: (a) una ácido nucleico polimerasa; (b) monómeros nucleotídicos; (c) uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso; y (d) una o más sondas, y (e) uno o más oligonucleótidos de unión competitiva. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica. En otro modo de realización, la muestra biológica es plasma. En otro modo de realización, la muestra biológica es sangre. En otro modo de realización, (i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden un ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento del mismo. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden dos secuencias nucleicas, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:43, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas. Otro modo de realización de la presente divulgación se refiere a un kit para detectar a Rn del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (a) una ácido nucleico polimerasa; (b) monómeros de nucleótidos; (c) uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso; (d) una o más sondas; y (e) uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos; y en el que: (i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma; (ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T, y en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO: 34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; (iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y (iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden un ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento del mismo. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden dos secuencias nucleicas, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:43, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas. En otro modo de realización, el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos se hibridan a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más conjuntos de cebadores a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra. En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc). En otro modo de realización, el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg). En otro modo de realización, el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A. En otro modo de realización, el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB. En otro modo de realización, la muestra es una muestra biológica, tal como plasma y/o sangre.

Otros modos de realización proporcionan un oligonucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-400, o complementos de la misma, oligonucleótido que tiene 100 o menos nucleótidos. En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, etc.) con una de SEQ ID. NO: 1-400, o complementos de la misma, oligonucleótido que tiene 100 o menos nucleótidos. En general, estos oligonucleótidos pueden ser ácidos nucleicos cebadores, ácidos nucleicos cebadores RT, ácidos nucleicos de bloqueo competitivos, ácidos nucleicos sondas o similares en estos modos de realización. En determinados de estos modos de realización, los oligonucleótidos tienen 40 o menos nucleótidos (por ejemplo, 35 o menos nucleótidos, 30 o menos nucleótidos, 25 o menos nucleótidos, 20 o menos nucleótidos, 15 o menos nucleótidos, etc.) En algunos modos de realización, los oligonucleótidos comprenden al menos un nucleótido modificado, por ejemplo, para alterar la estabilidad de hibridación de ácido nucleico con respecto a nucleótidos no modificados. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden al menos un marcador y opcionalmente al menos un resto extintor. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos incluyen al menos una variación modificada de forma conservadora. "Variaciones modificadas de forma conservadora" o, simplemente, "variaciones conservadoras" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas, o que contienen secuencias de ácido nucleico idénticas o esencialmente idénticas que pueden cumplir la misma función y/o pueden tener funcionalidades adicionales, tales como hibridarse a dianas ligeramente modificadas (es decir, diversidad genética diana). Un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único nucleótido o un pequeño porcentaje de nucleótidos (típicamente menos de un 5 %, más típicamente menos de un 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de forma conservadora" donde las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, adición de un aminoácido o sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

En un aspecto, la amplificación puede emplear una enzima polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3'. Por tanto, el resto fluorescente donante y el resto aceptador, por ejemplo, un extintor, pueden estar dentro de no más<de 5 a 20 nucleótidos (por ejemplo, dentro de>8<o 10 nucleótidos) entre sí a lo largo de la longitud de la sonda. En>otro aspecto, la sonda incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la formación de estructura secundaria. Dicha formación de estructura secundaria puede dar como resultado la proximidad espacial entre el primer y segundo resto fluorescente. De acuerdo con este procedimiento, el segundo resto fluorescente en la sonda puede ser un extintor.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico de VHB, en particular ARN de VHB, en una muestra biológica de un individuo. Estos procedimientos se pueden emplear para detectar la presencia o ausencia de ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en plasma, para su uso en hemocribado y pruebas de diagnóstico. Adicionalmente, la misma prueba se puede usar por alguien con experiencia en la técnica para evaluar orina y otros tipos de muestra para detectar y/o cuantificar VHB o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). Dichos tipos de muestras pueden incluir cualquier muestra donde se pueden hallar ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB, incluyendo sangre completa, suero, muestras de biopsia, cultivos celulares, hepatocitos, etc. Además, dichos procedimientos en general incluyen realizar al menos una etapa de ciclado, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de unión a tinte. Típicamente, la etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos para producir uno o más productos de amplificación si una molécula de ácido nucleico está presente en la muestra, y la etapa de unión a tinte incluye poner en contacto el producto de amplificación con un tinte de unión a ADN bicatenario. Dichos procedimientos también incluyen detectar la presencia o ausencia de unión del tinte de unión a ADN bicatenario en el producto de amplificación, en los que la presencia de unión es indicativa de la presencia de VHB o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en la muestra, y en los que la ausencia de unión es indicativa de la ausencia de VHB o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en la muestra. Un tinte de unión a ADN bicatenario representativo es bromuro de etidio. Otros tintes de unión a ácido nucleico incluyen DAPI, tintes Hoechst, PicoGreen®, RiboGreen®, OliGreen® y tintes de cianina tales como YO-YO® y SYBR® Green. Además, dichos procedimientos también pueden incluir determinar la temperatura de fusión entre el producto de amplificación y el tinte de unión a ADN bicatenario, en los que la temperatura de fusión confirma la presencia o ausencia de VHB o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). En otro modo de realización, un kit para detectar y/o cuantificar uno o más ácidos nucleicos de VHB, incluyendo ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). El kit puede incluir uno o más cebadores o conjuntos de cebadores específicos para la amplificación de la diana génica; uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos y una o más sondas oligonucleotídicas detectables específicas para la detección de los productos de amplificación. Los cebadores, sondas u oligonucleótidos de bloqueo pueden contener bases modificadas para mejorar el rendimiento, por ejemplo, pinzamientos o modificaciones estabilizantes (tales como pdU y ácido nucleico bloqueado (ANB)) o modificaciones que evitan la extensión de los extremos 3' de las sondas y oligonucleótidos de bloqueo.

En un aspecto, el kit puede incluir sondas ya marcadas con restos donantes y aceptadores correspondientes, por ejemplo, otro resto fluorescente o un extintor oscuro, o puede incluir restos fluorofóricos para marcar las sondas. El kit también puede incluir nucleósidos trifosfato, ácido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la función de la ácido nucleico polimerasa. El kit también puede incluir un prospecto del envase e instrucciones para usar los cebadores, sondas y restos fluoróforos para detectar la presencia o ausencia de VHB o ARN de VHB (en particular, ARNpg de VHB) en una muestra.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente materia objeto, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Los detalles de uno o más modos de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y la descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

LaFIG. 1muestra el diseño del ensayo de diana de poli-A de VHB, que representa el oligonucleótido RT, que también puede actuar como cebador inverso y que tiene una sección poli-T para unirse a la cola de poli-A del ARNm diana, sin un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

LaFIG. 2muestra el diseño del ensayo de diana de poli-A de VHB, que representa el oligonucleótido RT, que también puede actuar como cebador inverso y que tiene una sección poli-T para unirse a la cola de poli-A del ARNm diana, junto con un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

LaFIG. 3muestra curvas de crecimiento de PCR ultrarrápida de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB, que muestra una mayor producción de amplicón con una mayor cantidad de copias iniciales de molde de ARN que contiene la secuencia del sitio de poli-A de VHB con cola de poli-A, en presencia de un cebador RT y un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

LaFIG. 4muestra curvas de crecimiento de PCR ultrarrápida de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB sin diana de ARN pero en presencia de 250 000 UI de ADN de VHB (equivalente estimado a 1 millón UI/ml en una muestra antes de la extracción y el procesamiento), que muestra la producción de amplicón (amplificación de ADN inespecífica) en presencia de un cebador RT sin ningún bloqueador, y ninguna producción de amplicón en presencia de un cebador RT y un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

LaFIG. 5muestra valores de CT de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB, que muestra especificidad contra ADN de VHB, en condiciones de muestras de solo ADN, muestras de ADN+ARN mixtas o muestras mixtas con bloqueador competitivo.

LaFIG. 6muestra una comparación de la intensidad de fluorescencia relativa (IFR) del ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB, que muestra especificidad contra ADN de VHB, en condiciones de ADN solo (con o sin bloqueador competitivo) y muestras de ADN+ARN mixtas (con o sin bloqueador competitivo).

LaFIG. 7muestra curvas de crecimiento de PCR ultrarrápida de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con: (fila superior) 100/copias ml de diana de ARN en suero, mostrando producción de amplicón en presencia de un cebador RT sin ningún bloqueador y sin cambio en presencia de un cebador RT y un oligonucleótido de bloqueo competitivo. (fila inferior) sin diana de ARN pero en presencia de 100.000 UI/ml de ADN de VHB en suero, mostrando producción de amplicón de baja señal (amplificación de ADN inespecífica) en presencia de un cebador RT sin ningún bloqueador, y sin producción de amplicón en presencia de un cebador<r>T y un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

LaFIG. 8muestra curvas de crecimiento de PCR ultrarrápida de ensayos de diana de poli-A de ARN de VHB con un nivel de entrada de ARN estimado equivalente a 100 copias/ml de molde de ARN en una muestra antes de la extracción y el procesamiento, donde la muestra contiene 125 ng/reacción de fondo de ADN humano. Se sometieron a prueba cuatro cebadores inversos/RT diferentes, con diferentes diseños y bases modificadas, mostrando las mejoras de rendimiento que se pueden observar con el ajuste del diseño de oligonucleótidos y las modificaciones químicas.

LaFIG. 9muestra valores de CT de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo, que muestra tolerancia de entrada de ADN de VHB alta en condiciones de muestras de ADN<+ a Rn mixtas. Sin Ad N añadido, el ensayo muestra linealidad de 1 x 10>9<a 10 copias/ml de ARN de VHB. Con ADN añadido al alto nivel de 1 x 10>9<UI/ml, el ensayo de ARN no se ve afectado excepto a 100 y 10 copias/ml de ARN.>

Descripción detallada de la invención

El diagnóstico de infección por VHB por amplificación de ácido nucleico proporciona un procedimiento para detectar y/o cuantificar de forma rápida, exacta, fiable, específica y sensible la infección vírica. Se describe en el presente documento un ensayo de PCR ultrarrápida para detectar ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en presencia de ADN de VHB homólogo en muestras biológicas o no biológicas. Se proporcionan cebadores (incluyendo cebadores RT), oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas para detectar y/o cuantificar VHB, así como artículos de fabricación o kits que contienen dichos cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas. El incremento en la especificidad y sensibilidad de PCR ultrarrápida para la detección de ARN de v Hb (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en comparación con otros procedimientos, así como la mejora en los rasgos característicos de PCR ultrarrápida incluyendo la contención de muestra y detección y cuantificación ultrarrápida del producto amplificado, hacen factible la implementación de esta tecnología para el diagnóstico habitual de infecciones por VHB y la eficacia terapéutica en el laboratorio clínico. Además, este ensayo de PCR ultrarrápida para la detección de ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) puede proporcionar información importante sobre el estado del paciente (por ejemplo, curación funcional, curación esterilizante y/o curación parcial). Como ejemplo, un paciente puede tener el valor vírico de ADN disminuido por un tratamiento con análogo nucleosídico pero conservar altos niveles de ARN de VHB circulantes, lo que indica presencia continuada y actividad transcripcional de ADNccc en las células hepáticas infectadas, de modo que la retirada del tratamiento provocaría un rebote en el VHB. Otro ejemplo, un paciente en tratamiento puede tener suprimidos ambos marcadores de ADN y ARN, una indicación de que se ha disminuido el ADNccc en el hígado, sin embargo, todavía puede haber HbsAg producido a partir de células con copias integradas de VHB, que sin embargo no pueden producir ARNpg ni virus replicantes.

Adicionalmente, esta tecnología se puede emplear para hemocribado así como para pronóstico. Este ensayo de detección de ARN de VHB también se puede multiplexar con otros ensayos para la detección de otros ácidos nucleicos, por ejemplo, otros virus, incluyendo, pero sin limitarse a, VIH, VHC y otros virus de la hepatitis, tales como VHA, VHE y/o VHD, en paralelo.

La presente divulgación incluye cebadores oligonucleotídicos (incluyendo cebadores RT), oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas de hidrólisis marcadas con fluorescencia que se hibridan a los ácidos nucleicos de VHB, en particular ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg), para identificar específicamente ARN de VHB usando, por ejemplo, tecnología de amplificación y detección TaqMan®.

Los procedimientos divulgados pueden incluir realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una o más porciones de la diana génica de la molécula de ácido nucleico de una muestra usando uno o más pares de cebadores. "Cebador(es) de VHB" o "cebador(es) RT de VHB" como se usa en el presente documento se refieren a cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico halladas en el VHB o ARN de VHB (tal como ARNpg de VHB) e inician la transcripción inversa y/o la síntesis de ADN a partir de ellas en condiciones apropiadas produciendo los respectivos productos de amplificación. Un ejemplo de una secuencia de ácido nucleico hallada en el VHB que es adecuada para la selección incluye ARNpg de VHB. Cada uno de los cebadores de HBV analizados (incluyendo cebadores R<t>) se hibrida a un diana de modo que al menos una porción de cada producto de amplificación contiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la diana. El uno o más productos de amplificación se producen siempre que uno o más ácidos nucleicos estén presentes en la muestra, por tanto la presencia del uno o más productos de amplificación es indicativa de la presencia de VHB y/o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en la muestra. El producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una o más sondas detectables para VHB y/o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). La(s) "sonda(s) de VHB" como se usa en el presente documento se refieren a sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico halladas en el ácido nucleico diana de VHB (por ejemplo, ARN de VHB o ARNpg de VHB). Cada etapa de ciclado incluye una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección, en las que la muestra se pone en contacto con una o más sondas detectables de VHB o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) para detectar la presencia o ausencia de VHB y/o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en la muestra.

El término "oligonucleótido de bloqueo" (o "oligonucleótido de bloqueo competitivo" o "bloqueador") como se usa en el presente documento se refiere a oligonucleótidos no extensibles que se hibridan específicamente al ADN complementario e inhiben la transcripción inversa y la polimerización del ADN. En presencia de un oligonucleótido de bloqueo, cualquier ADN de VHB que puede estar presente en la muestra se hibridará al oligonucleótido de bloqueo, haciendo de este modo que el<a>D<n>de VHB no se pueda unir a los cebadores dirigidos al punto de unión de poliA del ARN de VHB, que pueden incluir secuencias cortas que coinciden tanto con el ADN de VHB como con el ARN de VHB. Por tanto, el oligonucleótido de bloqueo evita la unión de cebador al ADN de VHB homólogo que pueda estar en la muestra. El oligonucleótido de bloqueo competitivo de la presente divulgación se hibridará al ADN de VHB homólogo, por ejemplo, el genoma del ADN de VHB. Los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación se hibridan o se unen al ADN de VHB que se superpone a parte o la totalidad de la sección de unión de VHB del/de los cebador(es) de amplificación. Al unirse al<a>D<n>de VHB homólogo, el oligonucleótido de bloqueo competitivo bloquea el sitio de unión en el ADN de VHB, evitando de este modo que los cebadores de la presente divulgación (que se hibridan al ARN de VHB) se hibriden al ADN de VHB homólogo. El efecto de esto es que cualquier ADN de VHB homólogo no se amplificará (excepto cuando esté en una concentración en gran exceso del ARN de VHB en la muestra), porque los cebadores no se hibridarán eficazmente al ADN de VHB homólogo debido a la competencia en el sitio de unión con el oligonucleótido de bloqueo de unión más fuerte. Como tal, el procedimiento de la presente divulgación, que detecta y amplifica selectivamente el ARN de VHB, no detectará ni amplificará inadvertidamente el ADN de VHB contaminante y no deseado, excepto cuando esté en una concentración en gran exceso del ARN de VHB. El oligonucleótido de bloqueo competitivo de la presente divulgación es monocatenario y puede tener una variedad de longitudes, que varían de 15 a 100 nucleótidos, en algunos modos de realización de 20 a 80 nucleótidos, en modos de realización particulares de 20 a 70 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación pueden variar de 24 a 61 nucleótidos y pueden comprender o consistir en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15. Los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación pueden contener nucleótidos modificados para mejorar el rendimiento, tales como pinzamientos o modificaciones estabilizantes (tales como pdU y ácido nucleico bloqueado (ANB)). Por ejemplo, se pueden incluir dichos nucleótidos estabilizantes modificados para incrementar la temperatura de fusión (Tf) y/o fuerza de unión. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación contienen modificaciones tales como, por ejemplo, las ejemplificadas en las tablas 10 a 12 a continuación. Adicionalmente, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación también pueden contener modificaciones que evitan la extensión de los extremos 3'. Los extremos no extensibles se pueden facilitar por un espaciador C3, un fosfato, un nucleótido didesoxi o uniendo el extremo 3' de un segundo oligonucleótido al extremo 3 de un oligonucleótido, y similares. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación se modifican añadiendo un espaciador C3 no extensible en el extremo 3' para evitar la extensión. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación comprenden o consisten en SEQ ID NO: 1-15 o un complemento de las mismas, en particular comprenden o consisten en SEQ ID NO: 1-5, 9-11, 14 y 15 o un complemento de las mismas, y se modifican añadiendo un espaciador C3 no extensible en el extremo 3' (véase, por ejemplo, la FIG. 2). En modos de realización particulares, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación comprenden o consisten en SEQ ID NO: 1-15 o un complemento de las mismas, en particular comprenden o consisten en SEQ ID NO: 1-5, 9-11, 14 y 15 o un complemento de las mismas, comprenden al menos un nucleótido modificado y se modifican añadiendo un espaciador C3 no extensible en el extremo 3'. De esta manera, los oligonucleótidos de bloqueo competitivos de la presente divulgación no se extenderán en presencia de la ácido nucleico polimerasa y la ácido nucleico polimerasa solo extenderá cebadores oligonucleotídicos que se hibridan a su diana (por ejemplo, los cebadores específicos del ARN de VHB). Por tanto, el oligonucleótido de bloqueo de la presente divulgación en presencia de una ácido nucleico polimerasa puede bloquear eficazmente la amplificación del ADN de VHB en una muestra biológica, permitiendo mientras la amplificación del ARN de VHB diana. Además, el uso de oligonucleótidos de bloqueo competitivos permite realizar eficazmente un ensayo de ARN de VHB que puede distinguir entre ARN y ADN de VHB. Por lo tanto, el uso de oligonucleótidos de bloqueo competitivos como se divulga es una mejora sustancial con respecto a las técnicas de retirada de ADN convencionales, ya que no requiere ninguna etapa para retirar ADN, por una etapa de separación (por ejemplo, usando columnas o columnas de centrifugado) o bien una digestión enzimática del ADN.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere al proceso de sintetizar moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas hebras de una molécula de ácido nucleico molde (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico del VHB y/o ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg)). Amplificar una molécula de ácido nucleico típicamente incluye desnaturalizar el ácido nucleico molde, hibridar cebadores al ácido nucleico molde a una temperatura que está por debajo de las temperaturas de fusión de los cebadores y alargar enzimáticamente a partir de los cebadores para generar un producto de amplificación. La amplificación típicamente requiere la presencia de desoxirribonucleósidos trifosfato, una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, Platinum® Taq) y un tampón apropiado y/o cofactores para la actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo, MgCh y/o KCl).

El término "cebador" como se usa en el presente documento es conocido para los expertos en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden "cebar" la síntesis de ADN por una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3' del oligonucleótido proporciona un grupo 3'-OH libre donde se pueden unir otros "nucleótidos" por una ADN polimerasa dependiente de molde que establece un enlace fosfodiéster 3' a 5', con lo que se usan desoxinucleósidos trifosfato y con lo que se libera pirofosfato. En algunos modos de realización, el cebador también es un cebador de transcripción inversa (RT) (cebador RT). Existen varios tipos de cebadores RT conocidos en la técnica, incluyendo cebadores oligo(dT)N, cebadores oligo(dT)N anclados, cebadores hexaméricos aleatorios y cebadores específicos de secuencia. En algunos modos de realización, el cebador RT se hibridará al ARN (por ejemplo, ARN de VHB, en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg), y se extienden para generar un complemento de ADN (es decir, transcripción inversa de la diana). En algunos modos de realización, el cebador RT se dirige al ARN de VHB que contiene poli-A y por lo tanto el cebador RT es un oligonucleótido que contiene poli-T.

El término "hibridar" se refiere a la hibridación de una o más sondas a un producto de amplificación. Las "condiciones de hibridación" típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación inespecífica de las sondas.

El término "actividad nucleasa 5' a 3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebra de ácido nucleico, con lo que se retiran nucleótidos del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico.

El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, la enzima cataliza la formación de productos de extensión de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y avanza en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra molde. Se han aislado polimerasas termoestables deThermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilusyMethanothermus fervidus.No obstante, también se pueden emplear polimerasas que no son termoestables en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima, si es necesario.

El término "complemento del mismo" se refiere a un ácido nucleico que tanto tiene la misma longitud que, como es exactamente complementario a, un ácido nucleico dado.

El término "extensión" o "alargamiento" cuando se usa con respecto a ácidos nucleicos se refiere a cuando se incorporan nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico se extiende opcionalmente por un biocatalizador que incorpora nucleótido, tal como una polimerasa que típicamente añade nucleótidos en el extremo terminal 3' de un ácido nucleico.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, por ejemplo, como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias disponibles para los expertos o por inspección visual. Los algoritmos ejemplares que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los programas BLAST, que se describen en, por ejemplo, Altschulet al.(1990) "Basic local alignment search tool"J. Mol. Biol.215:403-410, Gishet al.(1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search"Nature Genet.3:266-272, Maddenet al.(1996) "Applications of network BLAST server"Meth. Enzymol.266:131-141, Altschulet al.(1997) "Gapped BLAST and PS<i>-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, y Zhanget al.(1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation"Genome Res.7:649-656.

Un "nucleótido modificado" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a una alteración en la que al menos un nucleótido de la secuencia oligonucleotídica se reemplaza por un nucleótido diferente que proporciona una propiedad deseada al oligonucleótido. Los nucleótidos modificados ejemplares que se pueden sustituir en los oligonucleótidos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, un t-butilbencilo, un C5-metil-dC, un C5-etil-dC, un C5-metil-dU, un C5-etil-dU, una 2,6-diaminopurina, un C5-propinil-dC, un C5-propinil-dU, un C7-propinil-dA, un C7-propinil-dG, un C5-propargilamino-dC, un C5-propargilamino-dU, un C7-propargilamino-dA, un C7-propargilamino-dG, un 7-desaza-2-desoxixantosina, un análogo de pirazolopirimidina, un pseudo-dU, un<nitropirrol, un nitroindol, 2'-0-metil-ribo-U, 2'-0-metil-ribo-C, un N4-etil-dC, un N>6<-metil-dA, un 5-propinil-dU, un>5-propinil-dC y similares. Otro ejemplo de un nucleótido modificado incluye ácido nucleico bloqueado (ANB). Un ANB (también conocido como ARN inaccesible) es un nucleótido de ARN modificado en el que el resto ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. Este puente bloquea la ribosa en la confirmación 3'-endo (Norte), que a menudo se halla en los dúplex de forma A. El efecto de ANB es que la conformación de ribosa bloqueada potencia el apilamiento de bases y la preorganización de la cadena principal, lo que incrementa significativamente las propiedades de hibridación (temperatura de fusión) de los oligonucleótidos. Se hace referencia a muchos otros nucleótidos modificados que se pueden sustituir en los oligonucleótidos en el presente documento o de otro modo son conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, las sustituciones de nucleótidos modificados modifican las temperaturas de fusión (Tf) de los oligonucleótidos con respecto a las temperaturas de fusión de los correspondientes oligonucleótidos no modificados. Para ilustrar además, determinadas sustituciones de nucleótidos modificados pueden reducir la amplificación de ácido nucleico inespecífica (por ejemplo, minimizar la formación de dímeros de cebador o similares), incrementar el rendimiento de un amplicón diana previsto y/o similares en algunos modos de realización. Los ejemplos de estos tipos de modificaciones de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.001.611. Otras sustituciones de nucleótidos modificados pueden alterar la estabilidad del oligonucleótido o proporcionar otros rasgos característicos deseables. Por ejemplo, algunas modificaciones pueden hacer que un oligonucleótido sea no extensible, lo que es útil para las sondas y para los oligonucleótidos de bloqueo competitivos. Los extremos no extensibles se pueden facilitar por, además de un fosfato, un espaciador C3, un nucleótido didesoxi, uniendo el extremo 3' de un segundo oligonucleótido al extremo 3 de un oligonucleótido y similares.

Detección de ácido nucleico diana de VHB

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) amplificando, por ejemplo, una porción de la secuencia de ácido nucleico de VHB que es contigua a una cola de poli-A (por ejemplo, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). Específicamente, los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas usados para amplificar y detectar dianas de moléculas de ácido nucleico de VHB se proporcionan por los modos de realización de la presente divulgación.

Para la detección de ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, por ejemplo, ARNpg), se proporcionan cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas para amplificar el ácido nucleico diana de VHB, tal como ARN de VHB (en particular, Ar N de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). También se pueden usar ácidos nucleicos de VHB distintos de los ejemplificados en el presente documento para detectar ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en una muestra. Por ejemplo, se pueden evaluar variantes funcionales para determinar la especificidad y/o sensibilidad por los expertos en la técnica usando procedimientos habituales. Las variantes funcionales representativas pueden incluir, por ejemplo, una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones en los ácidos nucleicos de VHB divulgados en el presente documento.

Más específicamente, los modos de realización de los oligonucleótidos incluyen cada uno un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1-392, una variante sustancialmente idéntica de la misma en la que la variante tiene al menos, por ejemplo, un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de SEQ ID NO:1-392, o un complemento de SEQ ID NO:1-192 y la variante. Por ejemplo, el número de T en el tramo de poliT<de los cebadores de unión a poliA puede variar (>8<, 10, 12, 15, 17, 18, etc.), la presencia y longitud del anclaje de unión a HBV u otro anclaje en la unión de la cola de poliA puede variar (siendo de 5, 7,>8<pb de largo, etc.), y la>presencia, tipo, número y localizaciones de las bases modificadas en el cebador pueden variar.

En un modo de realización, los conjuntos descritos anteriormente de cebadores de VHB, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas se usan para proporciona la detección de ARN de VHB (en particular, ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) en una muestra biológica sospechosa de contener VHB (listado de secuencias, donde N pretende referirse a cualquier nucleótido). Los conjuntos de cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas pueden comprender o consistir en los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas específicos para secuencias de ácido nucleico de VHB (por ejemplo, ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg), que comprenden o consisten en las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-392. En otro modo de realización, los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas para la diana de VHB (incluyendo ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc (por ejemplo, ARNpg de VHB) comprenden o consisten en una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas de SEQ ID NO: 1-392.

Una variante funcionalmente activa de cualquiera de los cebadores (incluyendo cebadores RT), oligonucleótidos de bloqueo competitivos y/o sondas de SEQ ID NO: 1-392 se puede identificar usando los cebadores (incluyendo cebadores RT), oligonucleótidos de bloqueo competitivos y/o sondas en los procedimientos divulgados. Una variante funcionalmente activa de un cebador, oligonucleótido de bloqueo competitivo y/o sonda de cualquiera de SEQ ID NO: 1-392 pertenece a un cebador, oligonucleótido de bloqueo competitivo y/o sonda que proporciona una especificidad y sensibilidad similares o mayores en el procedimiento o kit descrito en comparación con la secuencia respectiva de SEQ ID NO: 1-392. La variante puede variar, por ejemplo, de la secuencia de SEQ ID NO: 1-392 en una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas tal como una o más adiciones, deleciones o sustituciones nucleotídicas en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la respectiva secuencia de SEQ ID NO:1-392. Como se detalla anteriormente, un cebador (incluyendo cebador RT), un oligonucleótido de bloqueo competitivo y/o una sonda se pueden modificar químicamente, es decir, un cebador, un oligonucleótido de bloqueo competitivo y/o una sonda pueden comprender un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. Un cebador, un oligonucleótido de bloqueo competitivo y/o una sonda es entonces un oligonucleótido modificado. Los "nucleótidos modificados" (o "análogos nucleotídicos"), como se describe previamente, difieren de un "nucleótido" natural en alguna modificación, pero todavía consisten en una base o compuesto similar a base, un glúcido pentofuranosilo o un compuesto similar a glúcido pentofuranosilo, una porción fosfato o porción similar a fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un "marcador" se puede unir a la porción de base de un "nucleótido", con lo que se obtiene un "nucleótido modificado". Una base natural en un "nucleótido" también se puede reemplazar por, por ejemplo, una 7-desazapurina con lo que también se obtiene un "nucleótido modificado". Los términos "nucleótido modificado" o "análogo nucleotídico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Un "nucleósido modificado" (o "análogo nucleosídico") difiere de un nucleósido natural en alguna modificación de la manera como se explica anteriormente para un "nucleótido modificado" (o un "análogo nucleotídico").

Los oligonucleótidos que incluyen oligonucleótidos modificados y análogos oligonucleotídicos que amplifican una molécula de ácido nucleico que codifica la diana de VHB, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican porciones alternativas de VHB, se pueden diseñar usando, por ejemplo, un programa informático tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.). Los rasgos característicos importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que se van a usar como cebadores de amplificación incluyen, pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros de un par de cebadores, y la longitud de cada cebador (es decir, los cebadores necesitan ser lo suficientemente largos como para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis, pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis oligonucleotídica). Típicamente, los cebadores<oligonucleotídicos son de>8<a 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo,>8<, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,>32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 nucleótidos de longitud).

En el ensayo, se emplean un "oligonucleótido de bloqueo competitivo", "nucleótidos de bloqueo competitivos", "ácidos nucleicos de bloqueo competitivos", "oligonucleótido de bloqueo", "nucleótidos de bloqueo", "bloqueador" y/o "ácidos nucleicos de bloqueo", y son términos que se refieren a oligonucleótidos de bloqueo competitivos que se unen a una región en el ADN de VHB genómico homólogo que es idéntico a la región seleccionada por el cebador (por ejemplo, cebador RT), pero que tiene mayor afinidad por el ADN que el cebador RT, por ejemplo, al no contener la secuencia de poliA en el cebador RT sino que se extiende hasta la correspondiente secuencia genómica. Es decir, el oligonucleótido de bloqueo competitivo compite con el cebador por la unión a la región diana, pero los diseños se pueden realizar de forma que (tales como diferencias en longitud, Tf, o posición de las secuencias unidas) se permite que el cebador RT tenga mayor afinidad por el ARN mientras que el oligonucleótido de bloqueo competitivo tiene mayor afinidad por el ADN. La unión del oligonucleótido de bloqueo competitivo al ADN de VHB genómico homólogo evita la unión del cebador (por ejemplo, cebador RT) y por lo tanto reduce y/o evita la amplificación no deseada del ADN de VHB genómico homólogo.

El conjunto de cebadores directos para la detección de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB (tal como VHB derivado de ADNccc, tal como ARNpg), incluye las secuencias de SEQ ID NO:20, 23, 24, 210, 213, 214, 387 y 389. El conjunto de cebadores de transcripción inversa, que pueden funcionar como cebadores inversos (por ejemplo, cebadores inversos/RT) para la detección de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB (tal como VHB derivado de ADNccc, tal como ARNpg), incluyen las secuencias de SEQ ID NO:16, 18, 19, 25-30, 33-190, 206, 208, 209, 215-220 y 223-380. El conjunto de oligonucleótidos de bloqueo competitivos para incrementar la especificidad de la detección de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB (tal como VHB derivado de ADNccc, tal como ARNpg), incluye las secuencias de SEQ ID NO:1-15, 21, 22, 191-205, 211 y 212. El conjunto de sondas para la detección de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB (tal como VHB derivado de ADNccc, tal como ARNpg), incluye las secuencias de SEQ ID NO:17, 31, 32, 207, 221, 222, 381-386, 388 y 390-392.

Además de un conjunto de cebadores y oligonucleótidos de bloqueo competitivos, los procedimientos pueden usar una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico de VHB, tal como ARN de VHB (tal como VHB derivado de ADNccc, tal como ARNpg). El término "sonda" se refiere a ácidos nucleicos (ADN o ARN) producidos sintética o biológicamente, que por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse bajo restricciones predeterminadas definidas específicamente (es decir, preferentemente) a "ácidos nucleicos diana", en el presente caso a ácidos nucleicos de VHB (incluyendo ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg), ácido nucleico (diana). Una "sonda" se puede denominar "sonda de detección", que quiere decir que detecta el ácido nucleico diana.

En algunos modos de realización, las sondas de ácido nucleico de VHB descritas (incluyendo sondas para ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) se pueden marcar con al menos un marcador fluorescente. En un modo de realización, las sondas de ácidos nucleicos de VHB (incluyendo sondas para ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg) se pueden marcar con un resto fluorescente donante, por ejemplo, un tinte fluorescente y un correspondiente resto aceptador, por ejemplo, un extintor. En un modo de realización, la sonda comprende o consiste en un resto fluorescente y las secuencias de ácido nucleico comprenden o consisten en SEQ ID No : 17, 31, 32, 207, 221, 222, 381-386, 388 y 390-392.

Diseñar oligonucleótidos que se van a usar como sondas se puede realizar de manera similar al diseño de cebadores. Los modos de realización pueden usar una única sonda o un par de sondas para la detección del producto de amplificación. Dependiendo del modo de realización, la(s) sonda(s) usada(s) puede(n) comprender al menos un marcador y/o al menos un resto extintor. Como con los cebadores, las sondas normalmente tienen temperaturas de fusión apropiadas para los parámetros de ciclado térmico del procedimiento de amplificación, y la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que se produzca la hibridación específica de secuencia, pero no tan larga como para que se reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas oligonucleotídicas en general son de 15 a 40 (por ejemplo, 16, 18, 20, 21,22, 23, 24 o 25) nucleótidos de longitud.

Las construcciones pueden incluir vectores que contienen cada uno una o más de las secuencias de los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas de moléculas de ácido nucleico para VHB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-392). Se pueden usar construcciones, por ejemplo, como moléculas de ácido nucleico molde de control. Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente y/o se producen por procedimientos de tecnología de ácido nucleico recombinante habituales en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico de VHB se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis química, clonación directa de VHB o por amplificación de ácido nucleico.

Las construcciones adecuadas para su uso en los procedimientos típicamente incluyen, además de las moléculas de ácidos nucleicos de VHB (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una o más secuencias de SEQ ID NO: 1-392), secuencias que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) para seleccionar construcciones y/o transformantes deseados, y un origen de replicación. La elección de sistemas de vectores normalmente depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la elección de células huésped, eficacia de la replicación, selectividad, inducibilidad y la facilidad de recuperación.

Las construcciones que contienen moléculas de ácidos nucleicos de VHB se pueden propagar en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término célula huésped pretende incluir procariotas y eucariotas, tales como células de levadura, vegetales y animales. Los huéspedes procariotas pueden incluirE. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescensyBacillus subtilis.Los huéspedes eucariotas incluyen levaduras, tales como S.cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris,células de mamífero tales como células COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto y células vegetales tales comoArabidopsis thalianayNicotiana tabacum. Se puede introducir una construcción en una célula huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son procedimientos comunes para introducir ácidos nucleicos en células huésped. Además, se puede suministrar ADN no marcado directamente a las células (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.580.859 y 5.589.466).

Las construcciones (vectores plasmídicos) se pueden usar para generar moléculas de ARN, a través de una transcripciónin vitrou otro proceso, produciendo moldes de ARN que también pueden contener los sitios de unión de cebadores y sondas. Las moléculas molde de ARN también se pueden crear por síntesis. Un tipo de molde de ARN que se puede crear como material de control es un ARN blindado (una molécula de ARN que se encierra dentro de una cubierta proteica), que implica la producción de ARN y una proteína de cubierta (tal como una proteína de la cápside vírica) por una construcción (por ejemplo, en un huésped bacteriano) y el ensamblaje de la proteína de cubierta que encierra la molécula de ARN. Las moléculas de ADN también se pueden encerrar en una cubierta proteica para su uso como material de control.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 divulgan técnicas de PCR convencionales. La PCR típicamente emplea dos cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles en algunos modos de realización incluyen oligonucleótidos que pueden actuar como puntos de iniciación de síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de VHB descritas (por ejemplo, SEQ ID NO: 15, 18-20, 23-30, 33-190, 206, 208-210, 213-220 y 223-380). En algunos modos de realización, los cebadores son cebadores de transcripción inversa (RT) (cebadores RT). Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una eficacia máxima en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan en primer lugar, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de hebras se puede lograr por cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento de separación de las hebras de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % desnaturalizado). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración salina de tampón y la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero típicamente varían de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C durante un tiempo dependiendo de rasgos característicos de la reacción, tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización se realiza típicamente durante de aproximadamente 30 segundos a 4 minutos (por ejemplo, de 1 minuto a 2 minutos 30 segundos, o 1,5 minutos).

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueve la hibridación de cada cebador con su secuencia diana. La temperatura para la hibridación es normalmente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto (por ejemplo, de aproximadamente de 20 segundos a aproximadamente 50 segundos; de aproximadamente de 30 segundos a aproximadamente 40 segundos). Si es necesario, a continuación se ajusta la mezcla de reacción hasta una temperatura a la que la actividad de la polimerasa se promueve o se optimiza, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión a partir de cada cebador que se hibrida a un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía en general de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos (por ejemplo, de aproximadamente de 30 segundos a aproximadamente 4 minutos; de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 3 minutos; de aproximadamente 1 minuto 30 segundos a aproximadamente 2 minutos).

El genoma de un retrovirus o virus ARN está compuesto de un ácido ribonucleico, es decir, ARN. El VHB es un pararretrovirus, es decir, que no es un retrovirus pero que todavía usa la transcripción inversa en su proceso de replicación, requiriendo<a>R<n>producido por la enzima huésped para la replicación vírica. En dicho caso, el ácido nucleico molde, ARN, se debe transcribir primero en ADN complementario (ADNc) por medio de la acción de la enzima retrotranscriptasa. Las retrotranscriptasas usan un molde de ARN y un cebador corto complementario al extremo 3' del ARN para dirigir la síntesis de la primera hebra de ADNc, que a continuación se puede usar directamente como molde para la reacción en cadena de la polimerasa. Para la preparación general de ARN, los cebadores también pueden ser aleatorios o específicos de ensayo/diana, dependiendo del procedimiento.

Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico de VHB tal como ARN (tal como ARNpg de VHB) o ADN (ADNc). No se necesita purificar el ácido nucleico molde; puede ser una fracción minoritaria de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico de VHB contenido en células humanas. Las moléculas de ácido nucleico de VHB se pueden extraer de una muestra biológica por técnicas habituales tales como las descritas enDiagnostic Molecular Microbiology. Principies and Applications(Persinget al.(eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se pueden obtener ácidos nucleicos de una serie de fuentes, tales como plásmidos, o fuentes naturales incluyendo bacterias, levaduras, virus, orgánulos u organismos superiores tales como plantas o animales.

Los cebadores oligonucleotídicos (por ejemplo, los cebadores directos que comprenden SEQ ID NO: 20, 23, 24, 210, 213, 214, 387 y 389; y los cebadores inversos/RT que comprenden SEQ<i>D NO: 16, 18, 19, 25-30, 33-190, 206, 208, 209, 215-220 y 223-380) se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reacción que inducen la extensión del cebador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de la cadena en general incluyen KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCh 15 mM, gelatina al 0,001 % (p/v), 0,5-1,0 |jg de ADN molde desnaturalizado, 50 pmol de cada cebador oligonucleotídico, 2,5 U de polimerasa Taq y DMSO al 10 %). Las reacciones normalmente contienen de 150 a 320 jM de cada uno de dATP, dCTP, dTTP, dGTP o uno o más análogos de los mismos.

Las hebras recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que se puede usar en las etapas subsiguientes de la reacción. Las etapas de separación de hebras, hibridación y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se necesite para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondientes a las moléculas de ácido nucleico de VHB diana (incluyendo ARN de VHB, tal como ARNpg de VHB). Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de cebadores, enzima termoestable y nucleósidos trifosfato presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la secuencia diana lo suficiente para la detección. En general, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)

La tecnología de FRET (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en un concepto de que cuando un resto fluorescente donante y un correspondiente resto fluorescente aceptador se sitúan dentro de una determinada distancia entre sí, tiene lugar una transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o de otro modo detectar y/o cuantificar. El donante típicamente transfiere la energía al aceptador cuando el donante se excita por radiación de luz con una longitud de onda adecuada. El aceptador típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación de luz con una longitud de onda diferente. En determinados sistemas, se puede transferir energía no fluorescente entre restos donantes y aceptadores, por medio de biomoléculas que incluyen restos donantes sustancialmente no fluorescentes (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.74l.467).

En un ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede contener un resto fluorescente donante (por ejemplo, FAM) y un extintor correspondiente (por ejemplo, BlackHole Quenchers™ (BHQ) (tal como BHQ2)), que puede ser fluorescente o no, y que disipa la energía transferida en una forma distinta de luz. Cuando la sonda está intacta, la transferencia de energía típicamente se produce entre los restos donantes y aceptadores de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante se extingue por el resto aceptador. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de la polimerasa, una sonda unida a un producto de amplificación se escinde por la actividad nucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq de modo que la emisión fluorescente del resto fluorescente donante ya no se extingue. Las sondas ejemplares para este propósito se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.210.015, 5.994.056 y 6.171.785. Los pares donante-aceptador usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ) (tal como BHQ2), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En otro ejemplo, dos sondas oligonucleotídicas, conteniendo cada una un resto fluorescente, se pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones particulares determinadas por la complementariedad de las sondas oligonucleotídicas con la secuencia de ácido nucleico diana del ARN de VHB (incluyendo ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg). Tras la hibridación de las sondas oligonucleotídicas al ácido nucleico de producto de amplificación en las posiciones apropiadas, se genera una señal FRET. Las temperaturas de hibridación pueden variar de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C durante de<aproximadamente>10<segundos a aproximadamente>1<minuto.>

Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de recuento de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para supervisar la emisión fluorescente en el intervalo particular), un sistema fotomultiplicador de recuento de fotones o un fluorímetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía, o para permitir la detección directa de un fluoróforo, se puede llevar a cabo con un láser de iones de argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una lámpara de xenón, una fuente de luz de fibra óptica u otra fuente de luz de alta intensidad filtrada apropiadamente para la excitación en el intervalo deseado.

Como se usa en el presente documento con respecto a los restos donantes y aceptadores correspondientes, "correspondiente" se refiere a un resto fluorescente aceptador o un extintor oscuro que tiene un espectro de absorbancia que se solapa con el espectro de emisión del resto fluorescente donante. El máximo de longitud de<onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptador debe ser al menos>100<nm mayor que el máximo de>longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donante. En consecuencia, se puede producir transferencia de energía no radiativa eficaz entre los mismos.

Los restos donantes y aceptadores correspondientes fluorescentes en general se eligen para (a) transferencia de energía de Foerster de alta eficacia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) desplazamiento de la emisión lo más lejos posible en la porción roja del espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a una longitud de onda mayor que la emisión fluorescente de agua de Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación de donante. Por ejemplo, se puede elegir un resto fluorescente donante que tiene su máximo de excitación cercano a una línea láser (por ejemplo, helio-cadmio 442 nm o argón 488 nm), un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico y un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del correspondiente resto fluorescente aceptador. Se puede elegir un correspondiente resto fluorescente aceptador que tiene un alto coeficiente de extinción, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donante y emisión en la parte roja del espectro visible (>600 nm). Los restos fluorescentes donantes representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptadores en tecnología FRET incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, B-ficoeritrina, 9-acridinisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenbutirato de succinimidilo y derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico. Los restos fluorescentes aceptadores representativos, dependiendo del resto fluorescente donante usado, incluyen LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonilo de lisamina-rodamina B, tetrametilrrodamina-isotiocianato, rodamina x-isotiocianato, eritrosina-isotiocianato, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones de lantánido (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donantes y aceptadores, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).

Los restos fluorescentes donantes y aceptadores se pueden unir al oligonucleótido de sonda apropiado por medio de un brazo conector. La longitud de cada brazo conector es importante, ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre los restos fluorescentes donantes y aceptadores. La longitud de un brazo conector puede ser la distancia en Angstroms (A) desde la base nucleotídica al resto fluorescente. En general, un brazo conector es de aproximadamente 10 A a aproximadamente 25 A. El brazo conector puede ser del tipo descrito en el documento Wo 84/03285. El documento WO 84/03285 también divulga procedimientos para unir brazos conectores a una base nucleotídica particular, y también para unir restos fluorescentes a un brazo conector. Un resto fluorescente aceptador, tal como un LC Red 640, se puede combinar con un oligonucleótido que contiene un conector de amino (por ejemplo, C6-aminofosforamiditas disponibles de ABI (Foster City, Calif.) o Glen Research (Sterling, VA)) para producir, por ejemplo, un oligonucleótido marcado con LC Red 640. Los conectores usados con frecuencia para acoplar un resto fluorescente donante tal como fluoresceína a un oligonucleótido incluyen conectores de tiourea (derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG de Glen Research o ChemGene (Ashland, Mass.)), conectores de amida (derivados de fluoresceína-NHS-éster, tal como CX-fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, Calif.)) o 3'-amino-CPG que requieren el acoplamiento de fluoresceína-NHS-éster después de la síntesis oligonucleotídica.

Detección del producto amplificado (amplicón) del virus de la hepatitis B (VHB)

La presente divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de ARN de VHB (tal como ARN de VHB del ADNccc transcrito, tal como ARNpg de VHB) en una muestra biológica o no biológica. Los procedimientos proporcionados evitan problemas de contaminación de muestra, negativos falsos y positivos falsos. Los procedimientos incluyen realizar al menos una etapa de ciclado que incluye amplificar una porción de moléculas de ácido nucleico diana de VHB (tales como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) de una muestra usando uno o más pares de cebadores de VHB y una etapa de detección de FRET. Se realizan múltiples etapas de ciclado, preferentemente en un termociclador. Se pueden realizar procedimientos usando los cebadores y sondas de VHB para detectar la presencia de moléculas de ácido nucleico diana de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB), y la detección de moléculas de ácido nucleico diana de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) indica la presencia de moléculas de ácido nucleico diana de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) en la muestra.

Como se describe en el presente documento, se pueden detectar productos de amplificación usando sondas de hibridación marcadas que aprovechan la tecnología FRET. Un formato FRET utiliza tecnología TaqMan® para detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación y, por lo tanto, la presencia o ausencia del virus VHB (en particular, ácidos nucleicos de VHB, tales como ARN de VHB (por ejemplo, ARNpg de VHB)). La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada con, por ejemplo, un tinte fluorescente (por ejemplo, HEX) y un extintor (por ejemplo, BHQ), que pueden ser fluorescentes o no. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente o un extintor oscuro de acuerdo con los principios de FRET. El segundo resto fluorescente en general es una molécula extintora. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ADN diana (es decir, el producto de amplificación) y se degrada por la actividad nucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, la polimerasa Taq durante la fase de alargamiento posterior. Como resultado, el resto fluorescente y el resto extintor se separan espacialmente entre sí. Como consecuencia, tras la excitación del primer resto fluorescente en ausencia del extintor, se puede detectar la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente. A modo de ejemplo, un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) usa tecnología TaqMan® y es adecuado para realizar los procedimientos descritos en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de moléculas de ácido nucleico diana de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) en la muestra.

También se pueden usar balizas moleculares conjuntamente con FRET para detectar la presencia de un producto de amplificación usando los procedimientos de p Cr ultrarrápida. La tecnología de baliza molecular usa una sonda de hibridación marcada con un primer resto fluorescente y un segundo resto fluorescente. El segundo resto fluorescente es en general un extintor, y los marcadores fluorescentes típicamente se localizan en cada extremo de la sonda. La tecnología de baliza molecular usa un oligonucleótido de sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Después de la hibridación a los ácidos nucleicos diana (es decir, productos de amplificación), la estructura secundaria de la sonda se altera y los restos fluorescentes se separan entre sí de modo que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, se pueda detectar la emisión del primer resto fluorescente.

Otro formato común de tecnología FRET utiliza dos sondas de hibridación. Cada sonda se puede marcar con un resto fluorescente diferente y en general se diseñan para hibridarse en estrecha proximidad entre sí en una molécula de ADN diana (por ejemplo, un producto de amplificación). Un resto fluorescente donante, por ejemplo, fluoresceína, se excita a 470 nm por la fuente de luz del instrumento LightCycler®. Durante la FRET, la fluoresceína transfiere su energía a un resto fluorescente aceptador, tal como LightCycler®-Red 640 (LC Red 640) o LightCycler®-Red 705 (LC Red 705). A continuación, el resto fluorescente aceptador emite luz de una longitud de onda más larga, que se detecta por el sistema de detección óptica del instrumento LightCycler®. La FRET eficaz solo puede tener lugar cuando los restos fluorescentes están en proximidad local directa y cuando el espectro de emisión del resto fluorescente donante se solapa con el espectro de absorción del resto fluorescente aceptador. La intensidad de la señal emitida se puede correlacionar con el número de moléculas de ADN o ARN diana originales (por ejemplo, el número de ácidos nucleicos de VHB (por ejemplo, número de transcritos de ARN de VHB, tales como ARNpg de VHB). Si se produce amplificación del ácido nucleico diana de VHB (incluyendo ARN de VHB, tal como ARNpg de VHB) y se produce un producto de amplificación, la etapa de hibridación da como resultado una señal detectable basada en FRET entre los miembros del par de sondas.

En general, la presencia de FRET indica la presencia de ARN de VHB (tal como moléculas de ARN de VHB originadas a partir de ADNccc (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) en la muestra, y la ausencia de FRET indica la ausencia de moléculas de ARN de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) en la muestra. Sin embargo, la extracción de muestras inadecuada, retrasos de transporte, condiciones de transporte inapropiadas o uso de determinados hisopos de extracción (varilla de alginato de calcio o aluminio) son todas condiciones que pueden afectar al éxito y/o exactitud de un resultado de prueba.

Las muestras biológicas representativas que se pueden usar en la práctica de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, muestras respiratorias, orina, muestras fecales, muestras de sangre, plasma, suero, hisopados dérmicos, hisopados nasales, hisopados de heridas, hemocultivos, gotas de sangre seca, piel e infecciones de partes blandas. Otras muestras biológicas pueden incluir placas de separación de plasma y cultivos celulares o gotas de sangre seca. Los procedimientos de extracción y almacenamiento de muestras biológicas son conocidos para los expertos en la técnica. Las muestras biológicas se pueden procesar (por ejemplo, por procedimientos de extracción de ácido nucleico y/o kits conocidos en la técnica) para liberar ARN de VHB (ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, incluyendo ARNpg de VHB) o, en algunos casos, la muestra biológica se puede poner en contacto directamente con los componentes de reacción de PCR y los oligonucleótidos apropiados.

El análisis de la curva de fusión es una etapa adicional que se puede incluir en un perfil de ciclado. El análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que el ADN se funde a una temperatura característica llamada temperatura de fusión (Tf), que se define como la temperatura a la que la mitad de las dobles hebras de ADN se han separado en hebras únicas. La temperatura de fusión de un ADN depende principalmente de su composición nucleotídica. Por tanto, las moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen una mayor Tf que las que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Detectando la temperatura a la que se pierde la señal, se puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. De forma similar, detectando la temperatura a la que se genera la señal, se puede determinar la temperatura de hibridación de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las sondas de VHB de los productos de amplificación de VHB puede(n) confirmar la presencia o ausencia de VHB en la muestra.

Dentro de cada tanda de termociclador, también se pueden ciclar muestras de control. Las muestras de control positivo pueden amplificar el molde de control de ácido nucleico diana (distinto de los productos de amplificación descritos de genes diana) usando, por ejemplo, cebadores de control y sondas de control. Las muestras de control positivo también pueden amplificar, por ejemplo, una construcción plasmídica que contiene las moléculas de ácido nucleico diana. Dicho control plasmídico se puede amplificar internamente (por ejemplo, dentro de la muestra) o en una tanda de muestra separada paralelamente con las muestras del paciente usando los mismos cebadores y sonda como se usa para la detección de la diana prevista. Dichos controles son indicadores del éxito o fracaso de la amplificación, hibridación y/o reacción de FRET. Cada tanda de termociclador también puede incluir un control negativo que, por ejemplo, carece de ADN molde diana. El control negativo puede medir la contaminación. Esto garantiza que el sistema y los reactivos no dan lugar a una señal positiva falsa. Por lo tanto, las reacciones de control pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la capacidad de los cebadores para hibridarse con especificidad de secuencia y para iniciar el alargamiento, así como la capacidad de las sondas para hibridarse con especificidad de secuencia y para que se produzca FRET.

En un modo de realización, los procedimientos incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, un procedimiento enzimático que utiliza uracil-ADN glucosilasa se describe en las patentes de EE. UU. n.os 5.035.996, 5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre una tanda de termociclador y la siguiente.

Los procedimientos de PCR convencionales conjuntamente con tecnología FRET se pueden usar para practicar los procedimientos. En un modo de realización, se usa un instrumento LightCycler®. Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR ultrarrápida como se usa en la tecnología LightCycler®: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712.

El LightCycler® se puede operar usando una estación de trabajo de PC. Las señales de las muestras se obtienen a medida que la máquina sitúa los capilares secuencialmente sobre la unidad óptica. El programa informático puede mostrar las señales de fluorescencia de forma ultrarrápida de inmediato después de cada medición. El tiempo de adquisición fluorescente es de 10-100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclado, se puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la fluorescencia frente al número de ciclos para todas las muestras. Los datos generados se pueden almacenar para análisis adicional.

El sistema de PCR ultrarrápida LightCycler® 480 II también se puede operar usando una estación de trabajo de PC. El instrumento tiene un ciclador de bloque térmico y el calentamiento y enfriamiento se logra usando elementos Peltier. Las señales fluorescentes de las muestras se obtienen de la placa de 96 pocillos usando una lámpara de xenón de alta intensidad que emite luz en un amplio espectro. La combinación flexible de los filtros incorporados para excitación y emisión específicas permite el uso de una variedad de tintes fluorescentes y formatos de detección. El programa informático puede mostrar las señales de fluorescencia y calcular valores de CT, y los datos generados se pueden almacenar para análisis adicional.

Como alternativa a FRET, se puede detectar un producto de amplificación usando un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte de unión a ADN fluorescente (por ejemplo, SYBR® verde o SYBR® oro (Molecular Probes)). Tras la interacción con el ácido nucleico bicatenario, dichos tintes de unión a ADN fluorescentes emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un tinte de unión a ADN bicatenario tal como un tinte de intercalación de ácido nucleico. Cuando se usan tintes de unión a ADN bicatenario, normalmente se realiza un análisis de la curva de fusión para la confirmación de la presencia del producto de amplificación.

Un experto en la técnica apreciará que también se pueden emplear otros procedimientos de amplificación de señal o ácido nucleico. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen, sin limitación, amplificación de señales de ADN ramificado, amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), o procedimiento de amplificación inteligente versión 2 (SMAP 2).

Se entiende que los modos de realización de la presente divulgación no se limitan por la configuración de uno o más instrumentos disponibles comercialmente.

Artículos de fabricación/kits

Los modos de realización de la presente divulgación proporcionan además artículos de fabricación o kits para detectar ARN de VHB (tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB). Un artículo de fabricación puede incluir cebadores y sondas usados para detectar la diana de ARN de VHB (tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB), conjuntamente con materiales de envasado adecuados. Los cebadores y sondas representativos para la detección de ARN de VHB, incluyendo ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB, se pueden hibridar a moléculas de ácido nucleico diana de VHB (incluyendo ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB). Además, los kits también pueden incluir reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para la inmovilización, hibridación y detección de ADN, tales como soportes sólidos, tampones, enzimas y patrones de ADN. Los procedimientos de diseño de cebadores y sondas se divulgan en el presente documento, y se proporcionan ejemplos representativos de cebadores y sondas que amplifican e hibridan a moléculas de ácido nucleico diana de VHB (ARN de VHB, tal como ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB).

Los artículos de fabricación también pueden incluir uno o más restos fluorescentes para marcar las sondas o, de forma alternativa, se pueden marcar las sondas suministradas con el kit. Por ejemplo, un artículo de fabricación puede incluir un resto fluorescente donante y/o aceptador para marcar las sondas de VHB (que pueden incluir sondas que se dirigen al ARN de VHB, tal como ARNpg de VHB). Los ejemplos de restos fluorescentes donantes y correspondientes restos fluorescentes aceptadores de FRET adecuados se proporcionan anteriormente.

Los artículos de fabricación también pueden contener un prospecto del envase o ficha técnica que tiene instrucciones en el mismo para el uso de los cebadores y sondas para detectar VHB (incluyendo ARN de VHB, tal como ARNpg de VHB) en una muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente reactivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento (por ejemplo, tampones, enzimas polimerasa, cofactores o agentes para evitar la contaminación). Dichos reactivos pueden ser específicos para uno de los instrumentos disponibles comercialmente descritos en el presente documento.

Los modos de realización de la presente divulgación también proporcionan un conjunto de cebadores y una o más sondas detectables para la detección de ARN de VHB, incluyendo ARN de VHB transcrito a partir de ADNccc, tal como ARNpg de VHB en una muestra. Se pueden proporcionar cebadores y sondas adicionales que seleccionan otros sitios de poliA, tales como el sitio de poliA secundario o truncado para transcritos de VHB que se pueden originar a partir de copias de VHB integradas.

Los modos de realización de la presente divulgación se describirán además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la materia objeto, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La región seleccionada de VHB incluye ARN de VHB, tal como ARNpg. Se alinearon todas las secuencias de ácido nucleico y se consideraron y puntuaron todos los cebadores y sondas para determinar su inclusividad prevista para todas las cepas aisladas de VHB conocidas y otras propiedades.

Ejemplo 1: diseño de ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB

Se diseñó un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2. La diana es un ARN de VHB (tal como ARN de VHB que se origina a partir de ADNccc de VHB, que tiene la cola de poliA estándar, que incluye ARNpg de VHB), como se muestra en las figuras 1 y 2. El ensayo también puede detectar variantes de empalme y otros ARN, incluyendo ARNm, que contienen una cola de poli-A. El cebador RT, que también puede actuar como cebador inverso, tiene una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del ARNm diana (por ejemplo, ARNpg de VHB, como se representa en las FIGS. 1 y 2). La secuencia específica de VHB del cebador RT está diseñada para proporcionar especificidad para VHB y reducir la unión de cebador inverso/RT a ARN humano y otras colas de poli-A o tramos de homopolímero en el genoma; sin embargo, cuanto más larga sea la secuencia específica de VHB, más probable será que se una al ADN de VHB. De hecho, incluso una secuencia específica de VHB corta ha demostrado capacidad para amplificar ADN de VHB inespecífico (es decir, no deseado), cuando el ADN está en una alta concentración. Opcionalmente, se puede añadir una secuencia de marca al oligonucleótido RT, de modo que se pueda usar un diseño de cebador inverso de secuencia distinta a VHB diferente para una amplificación por PCR más eficaz.

Se incorporó un concepto de oligonucleótido de bloqueo competitivo para reducir la amplificación del ADN de VHB, uniéndose preferentemente al genoma de ADN de VHB en lugar del cebador RT/cebador inverso del conjunto de detección de poli-A (véase la FIG. 2). Este oligonucleótido de bloqueo competitivo se diseña para no ser extensible, por lo que no actúa como cebador. Esto se puede lograr, por ejemplo, añadiendo un espaciador C3 en el extremo 3' (también se puede usar un grupo fosfato u otro grupo unido o modificación para el mismo propósito). En este ejemplo, se ha demostrado que la adición del oligonucleótido de bloqueo competitivo incrementa la especificidad del ensayo por su diana prevista. Este concepto se aplica, en este ejemplo, a un diana de poli-A para ARN de VHB, pero puede ser aplicable a otros diseños de poli-A para otras dianas; u otras situaciones de interferencia o molde competitivo, tal como diana de ARN empalmado con un intrón corto que permitiría que el genoma de ADN también se amplifique, situaciones con genes paralógicos o pseudogenes relacionados con una diana, o una muestra con genotipos mixtos u organismos relacionados donde uno se selecciona y no otros.

En todos los ejemplos de la presente divulgación, la polimerasa empleada para detectar y amplificar ARN de VHB fue la polimerasa Z05Thermusmodificada conocida como Z05D. La polimerasa modificada Z05D tiene la secuencia de la secuencia de polimerasa Z05Thermusnatural, pero con una modificación D580G, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8.962.293. La polimerasa Z05D es una ácido nucleico polimerasa que tiene capacidades tanto de retrotranscriptasa (RT) como de polimerasa (amplificación de ADN). El término "ácido nucleico polimerasa" se refiere a cualquier enzima polimerasa que puede polimerizar ácidos nucleicos, lo que incluye ADN polimerasas, ARN polimerasas, retrotranscriptasa (RT), polimerasa dependiente de a Dn , polimerasas dependientes de ARN y polimerasas que presentan capacidades de retrotranscriptasa (RT) y polimerasa (amplificación de ADN), tales como la polimerasa Z05D, empleada en los ejemplos de la presente divulgación. Cualquier polimerasa que presenta capacidades de retrotranscriptasa (RT) y polimerasa (amplificación de ADN) se puede usar en la presente divulgación para detectar y amplificar ARN de VHB.

Ejemplo 2: sensibilidad e intervalo lineal de un ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de poli-A de extremo 3' de ARNpg de VHB, en presencia de un oligonucleótido de bloqueo competitivo. Se determinó la sensibilidad e intervalo lineal del ensayo (FIG. 3).

Las muestras usadas para un ensayo de PCR ultrarrápida fueron copias de un ARN blindado que contenía la secuencia para una construcción de extremo 3' de ARNpg de VHB que incluía una secuencia de cola de poliA. El molde se añadió al plasma humano negativo en concentraciones variables (1 x 100 copias/ml, 1 x 101 copias/ml, 1 x 102 copias/ml, y así sucesivamente hasta 1 x 109 copias/ml) y se extrajeron y eluyeron en las reacciones de PCR en cobas® 6800/8800. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®.

Los oligonucleótidos específicos para ARNpg de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron los cebadores inversos/RT HBV_PA-V_5LNA_25_351 (SEQ ID NO:152) y HBV_PA-V_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:151), junto con un cebador directo (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). En este y algunos otros experimentos se usan dos cebadores inversos porque una sustitución común en el extremo 3' de la secuencia de<a>R<n>de VHB puede afectar al rendimiento de algunos diseños de cebadores. Los cebadores emparejados con un cambio de base para cubrir la variante reducen el efecto potencial de esta sustitución en las muestras. Por tanto, emplear dos cebadores inversos, en lugar de un cebador inverso, permite la hibridación a variantes con sustituciones comúnmente observadas en el extremo 3' de secuencias de ARN de VHB. Es decir, emplear más de un (es decir, dos) cebadores inversos, en lugar de solo un cebador inverso, superan la complicación de sustituciones comunes en el extremo 3' de secuencias de ARN de VHB. En general, puede ser útil emplear múltiples cebadores para cubrir múltiples variaciones (incluyendo variaciones comunes o raras, sustituciones u otros tipos de mutaciones). Se incluyó un oligonucleótido de bloqueo competitivo "25-1" (SEQ ID NO:11) en la mezcla maestra, al igual que oligonucleótidos para un control interno (no mostrado). Estas secuencias se muestran en la tabla 4, a continuación.

Tabla 4

Los datos muestran el rendimiento de un ejemplo del diseño de ensayo de PCR de diana de poli-A en el transcrito de ARNpg de VHB que contiene la secuencia del sitio de poli-A de VHB con cola de poli-A. Los resultados, mostrados en la FIG. 3, muestran una mayor producción de amplicones con mayores cantidades de transcrito de ARNpg de VHB inicial (de manera dependiente de la dosis), lo que refleja el intervalo lineal así como la sensibilidad del ensayo.

Por tanto, estos resultados, mostrados en la FIG. 3, muestran curvas de crecimiento de PCR simple ultrarrápida, que demuestran que los cebadores, oligonucleótidos de bloqueo competitivos y sondas (SEQ ID NOs:11, 151, 152, 387 y 388) detectan la presencia de ARNpg 3 de VHB en un ensayo de PCR ultrarrápida.

Ejemplo 3: especificidad del ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó la especificidad del ensayo, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras solo de ADN de VHB. La reacción se realizó en un molde de ADN de VHB (ADN blindado) a 250.000 UI/reacción, equivalente estimado a una entrada de 1 millón de UI/ml en una muestra antes de las etapas de extracción y procesamiento.

Los oligonucleótidos específicos para ARN de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron el cebador inverso/RT HBV_PA-Z_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:96), junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Las mismas mezclas maestras se realizaron con y sin el oligonucleótido de bloqueo competitivo "25-1" (SEQ ID NO:11). Las secuencias oligonucleotídicas se muestran en la tabla 5, a continuación.

Tabla 5

La comparación de ensayo se realizó en un instrumento PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La concentración final de oligonucleótidos en la mezcla maestra varió de 150 nM a 300 nM. Los resultados muestran producción de amplicón (amplificación de ADN inespecífica) en presencia de un cebador RT sin ningún bloqueador, y sin producción de amplicón en presencia de un cebador RT y un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

Estos resultados, mostrados en la FIG. 4, demuestran la especificidad contra el ADN de VHB para el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB y la mejora posible incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo en la mezcla maestra. Por tanto, el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB es específico para ARN de VHB y específico contra ADN de VHB.

Ejemplo 4: resultados de especificidad y molde mixto del ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó la especificidad del ensayo por medio del rendimiento de PCR en muestras que fueron moldes de ARN de VHB (diana) y ADN de VHB (distinto de diana) mixtos, como se refleja por los valores de CT.

Las muestras usadas para un ensayo de PCR ultrarrápida simple fueron copias de transcrito de ARNpg de VHB a<1 x 10>3<transcrito/r y niveles variables de construcción de ADN de VHB (como se muestra en el eje x de la FIG. 5).>El ensayo de ARN se diseñó para detectar el sitio de poli-A en el transcrito y ser resistente a la captación del ADN, y se añade un oligonucleótido de bloqueo competitivo al ensayo en algunas condiciones (donde se indica en la leyenda de la FIG. 5), para incrementar la especificidad por dianas de ARN. Los oligonucleótidos específicos para a Rn de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron el cebador inverso/RT HBV_PA-Z_25_351 (Se Q ID NO:43), junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Las mismas mezclas maestras se realizaron con y sin el oligonucleótido de bloqueo competitivo HBVpA_block2 (SEQ ID NO:2). Los valores de Ct para muestras mixtas y ensayo de ARN (representados como cuadrados y marcadores<X, respectivamente, en la FIG. 5) fueron consecuentes con los resultados de solo ARN, hasta 1 x 10>6<copias de>ADN (lo que indica que la señal hasta ese umbral es solo de ARN con una contribución insignificante de la reactividad cruzada de ADN a pesar del incremento en la entrada de ADN) (véase la FIG. 5). El control usado fue un ensayo de ADN (círculos, en la FIG. 5) en muestras mixtas, y muestra CT más tempranos con mayor entrada de ADN, como se esperaba.

Estos resultados, mostrados en la FIG. 5, demuestran la especificidad por ARN de VHB (y contra el ADN de VHB) para el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB, y la mejora posible incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo en la mezcla maestra. Por tanto, el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB es específico para ARN de VHB y específico contra ADN de VHB (hasta un determinado valor de ADN de VHB).

Ejemplo 5: resultados de especificidad y fluorescencia de molde mixto del ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó la especificidad del ensayo por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron moldes de ARN de VHB (diana) y ADN de VHB (distinto de diana) mixtos, o muestras solo de ADN de VHB.

Las muestras usadas para un ensayo de PCR ultrarrápida simple fueron copias de transcrito de ARNpg de VHB a 1 x 103 transcrito/r y niveles variables de una construcción de ADN de VHB (como se muestra en el eje x de la FIG.

6). El ensayo de ARN se diseñó para detectar el sitio de poli-A en el transcrito y ser resistente a la captación del ADN, y se añade un oligonucleótido de bloqueo competitivo en algunas condiciones (donde se indica en la leyenda de la FIG. 6), para incrementar la especificidad por dianas de ARN. Los oligonucleótidos usados son los mismos que para el ejemplo 4. Es decir, los oligonucleótidos específicos para ARN de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron el cebador inverso/RT HBV_PA-Z_25_351 (SEQ ID NO:43), junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Las mismas mezclas maestras se realizaron con y sin el oligonucleótido de bloqueo competitivo HBVpA_block2 (SEQ ID NO:2). Los valores de intensidad de fluorescencia relativa (IFR) para muestras mixtas y ensayo de ARN (representados como cuadrados y marcadores X, respectivamente, en la FIG. 6) fueron consecuentes hasta 1 x 106 copias de ADN (lo que indica que la señal hasta ese umbral es solo de ARN o tiene una contribución insignificante de la reactividad cruzada de ADN) (véase la FIG.6). Las muestras solo de ADN (representadas por un marcador triangular) se descartan por debajo de 1 x 105 copias/reacción de ADN indicando que el ensayo de ARN no reacciona de forma cruzada por debajo de esa concentración de ADN (véase la FIG.6). La detección solo de ADN se descartó a o por debajo de 1 x 106 copias/reacción, cuando se usa un oligonucleótido de bloqueo competitivo con el ensayo de ARN (representado por un marcador romboide, en la FIG. 6), lo que demuestra un incremento en la especificidad con el oligonucleótido de bloqueo competitivo (véase la FIG. 6). El control usado fue un ensayo de ADN (representado como círculos, en la FIG. 6), que mostró una fluorescencia consecuente en todos los niveles de entrada de ADN (véase la FIG.6).

Estos resultados, mostrados en la FIG. 6, demuestran la especificidad por ARN de VHB (y contra el ADN de VHB (hasta una determinada entrada de valor alto) para el ensayo de diana de poli-A de a Rn de VHB, y la mejora posible incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo en la mezcla maestra. Por tanto, el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB es específico para ARN de VHB y específico contra ADN de VHB.

Ejemplo 6: especificidad del ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó la especificidad del ensayo por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras solo de ARN de VHB y muestras solo de ADN de VHB.

El ensayo de PCR ultrarrápida múltiple (con una reacción de control interno (CI)) se sometió a prueba en ARN blindado de VHB a 100 copias/ml en suero humano, se extrajo y se eluyó en las reacciones de PCR en el cobas® 6800/8800. El ensayo se sometió a prueba sin un oligonucleótido de bloqueo competitivo e incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo. Los oligonucleótidos específicos para ARN de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron los cebadores inversos/RT HbV_PA-V_5LNA_25_351 (SEQ ID NO:152) y HBV_PA-V_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:151) junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID No :388). Se incluyó un oligonucleótido de bloqueo competitivo "25-1" (SEQ ID NO:11) en la mezcla maestra, al igual que oligonucleótidos para un control interno (no mostrado). Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La concentración final de oligonucleótidos en la mezcla maestra varió de 150 nM a 1 |jM.

La presencia o ausencia del oligonucleótido de bloqueo competitivo no afectó al rendimiento del ensayo en la diana de ARN. Los niveles de concentración del oligonucleótido de bloqueo competitivo se pueden ajustar para maximizar la especificidad contra el molde no deseado o preservar la sensibilidad del ensayo en su diana prevista.

Las mismas mezclas de reacción se realizaron en ADN de VHB (ADN blindado) a 100.000 UI/ml en suero humano, se extrajeron y se eluyeron en las reacciones de PCR en cobas® 6800/8800. Este nivel de ADN tenía solo un nivel bajo de señal fluorescente, sin embargo, para demostrar una alternativa al incremento del valor de corte de intensidad de fluorescencia relativa (IFR) para no llamar a estas señales inespecíficas, se realizó la reacción incluyendo el oligonucleótido de bloqueo competitivo. Las señales se eliminaron en presencia del bloqueador, permitiendo por lo tanto mayor sensibilidad del ensayo para ARN en presencia de hasta 100.000 UI/ml de ADN.

Estos resultados, mostrados en la FIG. 7, demuestran la especificidad por ARN de VHB (y contra el ADN de VHB (hasta una determinada entrada de valor alto) para el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB, y la mejora posible incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo en la mezcla maestra. Por tanto, el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB es específico para ARN de VHB y específico contra ADN de VHB.

Ejemplo 7: efecto de las modificaciones de los cebadores en el ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador inverso/RT, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ARN de VHB.

La reacción se realizó en un molde de ARN de VHB (ARN blindado) a 25 copias/reacción, equivalente estimado a<una entrada de>100<copias/ml en una muestra antes de las etapas de extracción y procesamiento, en un fondo de>125 ng/reacción de ADN humano. Los oligonucleótidos específicos para ARN de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron los cebadores inversos/RT HBV_PA-W_8pdU_25_351_MIX (SEQ ID NO:117), HBV_PA-V_8pdU_25_351_MIX (SEQ ID NO:116), HBV_PA_8pdU_25_351s2_MIX (SEQ ID NO:112) y HBV_PA-Z_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:96), junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID<NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Las secuencias oligonucleotídicas se muestran en la tabla>6<, a>continuación.

Tabla 6

La comparación de ensayo (con una reacción de control interno (CI)) se realizó en un instrumento de PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La concentración final de oligonucleótidos en la mezcla maestra varió de 150 nM a 300 nM. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente para todos los ensayos, pero los ensayos con secuencias superpuestas de HBV más largas en el punto de unión de poliA, con bases modificadas con pdU en el tramo de poliT del cebador, tuvieron mayor señal. El ensayo con las bases modificadas de ANB-T en el tramo de poliT del cebador también tuvo mayor señal, incluso sin una secuencia superpuesta a VHB más larga en el punto de unión de poliA.

<Estos resultados, mostrados en la FIG.>8<, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del>cebador inverso/RT y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el cebador.

Ejemplo 8: efecto del ADN de VHB sobre la cuantificación de ARN de VHB con un oligonucleótido de bloqueo competitivo

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ARN de VHB.

<La reacción se realizó en un molde de ARN de VHB (ARN blindado) en una serie de diluciones de 1 x 10>9<a 10>copias/ml de ARN de VHB en plasma humano negativo. Los oligonucleótidos específicos para ARN de VHB usados para el ensayo de PCR ultrarrápida fueron los cebadores inversos/RT HBV_PA-V_5LNA_25_351 (SEQ ID NO:152) y HBV_PA-V_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:151) junto con un cebador directo específico de VHB (SEQ ID No :387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Se incluyó un oligonucleótido de bloqueo competitivo "25-1" (SEQ ID NO:11) en la mezcla maestra, al igual que oligonucleótidos para un control interno (no mostrado).

El ensayo de PCR ultrarrápida múltiple (con una reacción de control interno (CI)) se sometió a prueba en ARN blindado de VHB en plasma humano, se extrajo y se eluyó en las reacciones de PCR en el cobas® 6800/8800. El ensayo se sometió a prueba incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo. Se sometieron a prueba diez réplicas por nodo de concentración mixta. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. La concentración final de oligonucleótidos en la mezcla maestra varió de 333 nM a 1 |jM.

Los resultados, mostrados en la FIG. 9, muestran tolerancia de entrada de ADN de VHB alta en condiciones de<muestras de ADN ARN mixtas. Sin ADN añadido, el ensayo muestra linealidad de 1 x 10>9<a 10 copias/ml de ARN de VHB. Con ADN de VHB añadido al alto nivel de 1 x 10>9<UI/ml, el ensayo de ARN no se ve afectado excepto a>100 y 10 copias/ml, donde la proporción de ADN con respecto a ARN es mayor de 6,0 log (1 UI/ml de ADN de VHB equivale a >5 copias/ml del molde de ADN).

<En un experimento paralelo se demostró que 1 x 10>7<UI/ml de ADN de VHB no afecta la exactitud de la>cuantificación de ARN de VHB a 100 copias/ml y solo un pequeño efecto a 10 copias/ml, lo que confirma que el<ensayo tolera la entrada de ADN siempre que la proporción entre ADN de VHB y a Rn de VHB esté dentro de los>6 logaritmos o menos.

<Por tanto, el ejemplo>8<demuestra la alta tolerancia del ensayo de ARN de VHB a la entrada de ADN. Estos datos>demuestran que el ensayo de ARN de VHB, incluyendo el oligonucleótido de bloqueo competitivo, es muy específico para el ARN de VHB, incluso en presencia de grandes cantidades de ADN potencialmente interferente/competitivo.

Ejemplo 9: efecto de la longitud del cebador inverso y las modificaciones sobre la amplificación de ARN y ADN

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador inverso/RT, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ARN de VHB. Los cebadores inversos/RT usados fueron SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157; el cebador directo usado fue SEQ ID NO:387; la sonda usada fue SEQ ID NO:388; y el oligonucleótido de bloqueo usado fue SEQ IDNO:11.

Las reacciones se realizaron en un molde de ARN de VHB (ARN blindado) a 25 copias/reacción, en un fondo de 12,5 ng/reacción de ADN humano. La reacción también se realizó en un molde de ADN de VHB a 250.000 UI/reacción. Se realizaron ensayos incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo.

Las comparaciones de ensayo se realizaron en un instrumento de PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. También se realizó un control interno. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente para todos los ensayos en ARN, pero los ensayos con secuencias superpuestas de HBV más largas en el punto de unión de poliA, con bases modificadas con pdU en el tramo de poliT o bases modificadas con LNA-T en el tramo de poliT del cebador, tendieron a tener valores de Ct ligeramente más tempranos en el molde de ARN, pero también valores de Ct relativamente más tempranos en el molde de ADN.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del cebador inverso/RT y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el cebador. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada diseño de cebador fueron como sigue:

Tabla 7

A es Ct de 25-30 B es es sin reacción

Ejemplo 10: efecto de las modificaciones de cebador inverso sobre la amplificación de ARN

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador inverso/RT, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ARN de VHB. Los cebadores inversos/RT empleados fueron SEQ ID NO: 142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190; el cebador directo empleado fue SEQ ID NO:387; la sonda empleada fue SEQ ID NO:388; y el oligonucleótido de bloqueo empleado fue SEQ ID NO:11.

Las reacciones se realizaron en un molde de ARN de VHB (ARN blindado) a 25 copias/reacción, en un fondo de 12,5 ng/reacción de ADN humano. Se realizaron ensayos incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo. Las comparaciones de ensayo se realizaron en un instrumento de PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. También se incluyeron controles internos. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente para todos los ensayos en ARN. Sin embargo, pueden existir variaciones modestas en los valores de Ct dependiendo del número y disposición de las bases modificadas químicamente incluidas en los oligonucleótidos, pareciendo que algunas disposiciones son más eficaces en la amplificación de la diana que otras.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del cebador inverso/RT y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el cebador. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada diseño de cebador fueron como sigue:

A es Ct de 25-30

B es Ct de 30-32

C es Ct de 32-35

D es Ct >35

E es sin reacción

Tabla 8

Ejemplo 11: efecto de las modificaciones de cebador inverso sobre la amplificación de ARN, en un molde variante

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador inverso/RT, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ARN de VHB. Los cebadores inversos/RT empleados fueron SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190; el cebador directo empleado fue SEQ ID NO:387; la sonda empleada fue SEQ ID NO:388; y el oligonucleótido de bloqueo empleado fue SEQ ID NO:11.

Las reacciones se realizaron en un molde de ARN de VHB (ARN blindado) a 25 copias/reacción, en un fondo de 12,5 ng/reacción de ADN humano. Se realizaron ensayos incluyendo un oligonucleótido de bloqueo competitivo. En estos experimentos se usó un molde de VHB variante que fue diferente en secuencia que en el ejemplo 10.

Las comparaciones de ensayo se realizaron en un instrumento de PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. También se incluyó un control interno. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente para todos los ensayos en ARN. Sin embargo, pueden existir variaciones modestas en los valores de Ct dependiendo del número y disposición de las bases modificadas químicamente incluidas en los oligonucleótidos, pareciendo que algunas disposiciones son más eficaces en la amplificación de la diana que otras.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del cebador inverso/RT y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el cebador. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada diseño de cebador fueron como sigue:

A es Ct de 25-30

B es Ct de 30-32

C es Ct de 32-35

D es Ct >35

E es sin reacción

Tabla 9

Ejemplo 12: efecto de las modificaciones de oligonucleótidos de bloqueo competitivos sobre la amplificación de ADN

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. El ensayo utiliza un oligonudeótido de bloqueo competitivo para mejorar la especificidad del ensayo contra la amplificación inespecífica de ADN de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador y el diseño del bloqueador, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ADN de VHB.

<La reacción se realizó en un molde de ADN de VHB a 1 x 10>6<copias/reacción. Se realizaron ensayos incluyendo>diferentes oligonucleótidos de bloqueo competitivos. En este experimento, el cebador inverso/RT usado fue HBV_PA_25_468 (SEQ ID NO:35), junto con un cebador directo (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Aquí, los oligonucleótidos de bloqueo empleados fueron SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5.

La comparación de ensayo se realizó en un instrumento PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente en altos niveles de entrada de ADN, con retrasos en los valores de Ct debido a la inclusión del oligonucleótido de bloqueo. Existen variaciones modestas en los valores de Ct dependiendo del número y disposición de las bases modificadas químicamente incluidas en los oligonucleótidos de bloqueo, pareciendo que algunas disposiciones son más eficaces en la competencia (disminuyendo la unión de cebador a la diana de ADN) que otras.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del oligonucleótido de bloqueo competitivo y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el oligonucleótido de bloqueo. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada mezcla maestra fueron como sigue:

Tabla 10

A es Ct de 25-30 B es Ct de 30-32 C es Ct de 32-35 D es Ct >35 E es sin reacciónEjemplo 13: efecto de las modificaciones de oligonucleótidos de bloqueo competitivos sobre la amplificación de ADN

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. El ensayo utiliza un oligonudeótido de bloqueo competitivo para mejorar la especificidad del ensayo contra la amplificación inespecífica de ADN de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador y el diseño del bloqueador, por medio de una señal fluorescente de PCR en muestras que fueron muestras de ADN de VHB.

<La reacción se realizó en un molde de ADN de VHB a 1 x 10>7<copias/reacción. Se realizaron ensayos incluyendo>diferentes oligonucleótidos de bloqueo competitivos. En este experimento, el cebador inverso usado fue diferente al del ejemplo 12. Aquí, el cebador inverso/RT usado fue HBV_PA_25_351_(SEQ ID NO:34), junto con un cebador directo (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Aquí, los oligonucleótidos de bloqueo empleados fueron SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14.

La comparación de ensayo se realizó en un instrumento PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente en altos niveles de entrada de ADN, con retrasos en los valores de Ct debido a la inclusión del oligonucleótido de bloqueo. Existen variaciones modestas en los valores de Ct dependiendo del número y disposición de las bases modificadas químicamente incluidas en los oligonucleótidos de bloqueo, y pareciendo que algunas disposiciones (en general, oligonucleótidos más largos y/u oligonucleótidos con más bases modificadas) son más eficaces en la competencia (disminuyendo la unión de cebador a la diana de ADN) que otras.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran los efectos en el rendimiento del ajuste del diseño del oligonucleótido de bloqueo competitivo y la inclusión de diferentes modificaciones químicas en el oligonucleótido de bloqueo. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada mezcla maestra fueron como sigue:

Tabla 11

A es Ct de 25-30 B es Ct de 30-32 C es Ct de 32-35 D es Ct >35 E es sin reacción

Ejemplo 14: efecto de las modificaciones de oligonucleótidos de bloqueo competitivos sobre la amplificación de ADN

El ensayo de diana de poli-A de ARN de VHB se diseñó usando un cebador RT (usado como cebador inverso) como se muestra en las FIGS. 1 y 2, con una diana de ARNpg de VHB. El ensayo utiliza un oligonucleótido de bloqueo competitivo para mejorar la especificidad del ensayo contra la amplificación inespecífica de ADN de VHB. Se determinó el rendimiento del ensayo cuando se varió el diseño del cebador y el diseño del bloqueador, por medio de una señal fluorescente de<p>C<r>en muestras que fueron muestras de ADN de VHB.

<La reacción se realizó en un molde de ADN de VHB a 2 x 10>6<UI/reacción, en un fondo de 12,5 ng/reacción de ADN>humano. Se realizaron ensayos incluyendo diferentes oligonucleótidos de bloqueo competitivos. En este experimento, el cebador inverso/RT usado fue HBV_PA-V_5LNA_25_351_MIX (SEQ ID NO:151), junto con un cebador directo (SEQ ID NO:387) y una sonda (SEQ ID NO:388). Aquí, los oligonucleótidos de bloqueo fueron SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15.

La comparación de ensayo se realizó en un instrumento PCR LC480. Los reactivos usados incluyen mezcla maestra para PCR genérica cobas® 6800/8800, con el perfil y condiciones para su uso con cobas® 6800/8800 y usando tecnología de amplificación y detección TaqMan®. Los resultados muestran producción de amplicón y señal fluorescente en altos niveles de entrada de ADN, con retrasos en los valores de Ct debido a la inclusión del oligonucleótido de bloqueo. Existen variaciones modestas en los valores de Ct dependiendo del número y disposición de las bases modificadas químicamente incluidas en los oligonucleótidos de bloqueo.

Estos resultados, mostrados en la tabla a continuación, demuestran varios diseños del oligonucleótido de bloqueo competitivo que difieren en longitud y la inclusión de diferentes modificaciones químicas. En la tabla, los intervalos de valores de Ct obtenidos para cada mezcla maestra fueron como sigue:

Tabla 12

A es Ct de 25-30 B es Ct de 30-32 C es Ct de 32-35 D es Ct >35 E es sin reacción

Todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente se pueden usar en diversas combinaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) usar una muestra de ácido nucleico para

(b) realizar una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos y uno o más conjuntos de cebadores y una ácido nucleico polimerasa, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso, para producir un producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB están presentes en la muestra; (c) realizar una etapa de hibridación, que comprende poner en contacto el producto de amplificación, si el uno o más ácidos nucleicos diana de ARN de VHB están presentes en la muestra, con una o más sondas; y

(d) realizar una etapa de detección, que comprende detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación, en el que la presencia del producto de amplificación es indicativa de la presencia del uno o más ácidos nucleicos diana de ARN de VHB en la muestra, y en el que la ausencia del producto de amplificación es indicativa de la ausencia del uno o más ácidos nucleicos diana de ARN de VHB en la muestra,

en el que el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A;

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una secuencia específica de VHB y comprenden además una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del a Rn de VHB;

en el que el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos no son extensibles y se hibridan a cualquier homólogo de ADN de VHB a la secuencia específica de VHB del uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que puedan estar presentes en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc).

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg).

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra se deriva de una muestra biológica.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:

(i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma;

(ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas;

(iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y

(iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento de la misma.

6<. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que>también funcionan como cebador inverso comprenden dos secuencias nucleicas, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:43, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas.

<

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a>6<, en el que la etapa de hibridación comprende>poner en contacto el producto de amplificación con una o más sondas detectables, estando marcadas dichas una o más sondas detectables con un resto fluorescente donante y un correspondiente resto aceptador; y la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre el resto fluorescente donante y el resto aceptador de la sonda, en el que la presencia o ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o ausencia de ARN de VHB en la muestra y en el que el resto<fluorescente donante y el correspondiente resto aceptador están a no más de>8-20<nucleótidos entre sí en la sonda.>

8<. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha etapa de amplificación>emplea una ácido nucleico polimerasa termoestable que tiene actividad nucleasa 5' a 3'.

9. Un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana del ARN del virus de la hepatitis B (VHB) que pueden estar presentes en una muestra, comprendiendo el kit reactivos de amplificación que comprenden:

(a) una ácido nucleico polimerasa;

(b) nucleósidos trifosfato;

(c) uno o más conjuntos de cebadores, en el que el uno o más conjuntos de cebadores comprenden uno o más cebadores directos y uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso;

(d) una o más sondas, y

(e) uno o más oligonudeótidos de bloqueo competitivos

en el que el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB comprenden una cola de poli-A;

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una secuencia específica de VHB y comprenden además una sección de poli-T para unirse a la cola de poli-A del uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB; y

en el que el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos no son extensibles y se hibridan a cualquier homólogo de ADN de VHB a la secuencia específica de VHB del uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que puedan estar presentes en la muestra, evitando de este modo la unión del uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) a cualquier ADN de VHB homólogo que pueda estar presente en la muestra.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que el uno o más ácidos nucleicos diana del ARN de VHB se derivan de ADN bicatenario circular covalentemente cerrado (ADNccc).

11. El kit de la reivindicación 10, en el que el ADNccc es ARN pregenómico de VHB (ARNpg).

12. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que:

(i) el uno o más cebadores directos comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:387, o un complemento de la misma;

(ii) el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ IDNO: 34, 35, 43, 94, 96, 112, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas;

(iii) la una o más sondas comprenden una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:388, o un complemento de la misma; y

(iv) el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 14 y 15, o un complemento del mismo.

13. El kit de la reivindicación 12, en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden dos secuencias de ácido nucleico, en los que las dos secuencias de ácido nucleico comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:151 y 152, o complementos de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:96, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de s Eq ID NO:43, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma; o en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:96, 112, 116 y 117, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:94, 96, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 151, 153, 155 y 157, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:142, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:141, 153, 157, 161, 163, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 188 y 190, o un complemento de las mismas; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una secuencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11, o un complemento de la misma; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 y 5, o un complemento de las mismas; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 9, 10, 11 y 14, o un complemento de las mismas; o

en el que el uno o más cebadores de transcripción inversa (RT) que también funcionan como cebador inverso comprenden la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:151, o un complemento de la misma; y el uno o más oligonucleótidos de bloqueo competitivos comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de un grupo seleccionado de SEQ ID NO:2, 10, 11 y 15, o un complemento de las mismas.

14. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la una o más sondas se marcan de forma detectable comprendiendo un resto fluorescente donante y un correspondiente resto aceptador y en el que el resto<fluorescente donante y el correspondiente resto aceptador están dentro de no más de>8-20<nucleótidos entre sí en>la sonda.

15. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que la ácido nucleico polimerasa es una enzima polimerasa termoestable que tiene actividad nucleasa 5' a 3'.