ES3012974T3 - Targeted therapy for lung cancer - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento del cáncer de pulmón, en particular del cáncer de pulmón microcítico, mediante terapia dirigida. La terapia se dirige a uno o más antígenos de superficie celular, como CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165 y EpCAM, que opcionalmente incluye un agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia dirigida contra el cáncer de pulmón
ANTECEDENTES
Las terapias dirigidas, como los anticuerpos y los ligandos específicos, han demostrado ser eficaces en la lucha contra el cáncer, especialmente en los casos en los que fracasa la terapia convencional. Aún más alentador es que los anticuerpos contra el cáncer funcionan generalmente con un mecanismo distinto al de la quimioterapia o la radioterapia tradicionales, por lo que a menudo pueden combinarse con las terapias tradicionales para generar un efecto aditivo o sinérgico.
Los anticuerpos pueden lograr su efecto terapéutico a través de varios mecanismos. Pueden tener efectos directos en la producción de apoptosis o muerte celular programada. Pueden bloquear los receptores del factor de crecimiento, deteniendo eficazmente la proliferación de las células tumorales. En las células que expresan anticuerpos monoclonales, pueden provocar la formación de anticuerpos antiidiotipo. Los efectos indirectos incluyen el reclutamiento de células que tienen citotoxicidad, como monocitos y macrófagos. Este tipo de destrucción celular mediada por anticuerpos se denomina citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los anticuerpos monoclonales también se unen al complemento, lo que lleva a una toxicidad celular directa, conocida como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
CD47 es una diana valiosa para la terapia contra el cáncer debido a su función como inhibidor de la fagocitosis de los macrófagos, así como a su amplia expresión en una variedad de neoplasias humanas. Al unirse a la proteína a reguladora de señales (SIRPa), un receptor expresado en la superficie de los macrófagos, CD47 es capaz de transducir señales inhibidoras que impiden la fagocitosis. El bloqueo de la interacción entre CD47 y SIRPa con anticuerpos no sólo estimula a los macrófagos a engullir células cancerígenas in vitro, sino que también ejerce potentes efectos anticancerígenos in vivo. Otros agentes bloqueantes de CD47 incluyen los antagonistas de CD47 de "próxima generación", que se unen y bloquean CD47 humano con una afinidad extraordinariamente alta.
Al desactivar las señales inhibidoras transducidas por SIRPa, las variantes de SIRPa de alta afinidad pueden reducir el umbral de activación de los macrófagos y promover la respuesta fagocítica impulsada por anticuerpos específicos de tumores. El grado en que la actividad anticancerígena de un anticuerpo terapéutico dado se ve potenciada por el bloqueo de CD47 depende probablemente de múltiples factores, incluyendo los niveles de expresión del antígeno en la superficie de las células malignas, el isotipo de su cadena pesada y la orientación que adopta el anticuerpo tras unirse al antígeno, lo que afecta a su capacidad para acoplarse a receptores Fc en los efectores inmunitarios. Los monómeros SIRPa de alta afinidad representan, por lo tanto, una alternativa rápida, segura y eficaz a varios otros enfoques, incluyendo las estrategias de conjugación fármaco/toxina, que se han seguido en esta dirección.
Edris et al. (2012) PNAS USA 109(17):6656-661 informa de que la terapia con anticuerpos dirigida contra la proteína CD47 es eficaz en un modelo de leiomiosarcoma metastásico agresivo. Wang et al. (2013) Molecular Therapy 21 (10):1919-1929 informa de que la administración intravenosa de ARNip dirigido a CD47 inhibe eficazmente el crecimiento tumoral del melanoma. Maxhimer et al. (2009) Science Translational Medicine 1(3):3ra7 describe la radioprotección del tejido normal y el crecimiento tumoral retardado mediante el bloqueo de la señalización de CD47. El documento EP2111869 describe composiciones y métodos para potenciar el sistema inmunitario. Chao et al. (2010) Cell 142(5):699-713 informa de que un anticuerpo anti-CD47 sinergiza con rituximab para promover la fagocitosis y erradicar el linfoma no Hodgkin. Weiskopf et al. (2013) Science 341(6141):88-91 describe variantes de SIRP alfa manipuladas como adyuvantes inmunoterapéuticos para anticuerpos contra el cáncer. Alblas et al. (2005) Molecular and Cellular Biology 25(16):7181-7192 informa de que la ligadura de la proteína a reguladora de señal induce la producción de óxido nítrico por los macrófagos a través de las vías dependientes de JAK/STAT y fosfatidilinositol 3-quinasa/Rac1/NADPH oxidasa/H2O2.
La identificación de dianas y combinaciones eficaces de terapias dirigidas sigue siendo de gran interés. La presente invención aborda esta necesidad.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización o aspecto de la divulgación que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título ilustrativo.
La invención proporciona un agente dirigido que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas en un paciente, mediante la administración de: (i) el agente dirigido que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa en combinación con
(ii) un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón del paciente, en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina completa, y en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es:
(a) un anticuerpo que se une específicamente a CD47,
(b) un anticuerpo que se una específicamente a la SIRPa, o
(c) un polipéptido de SIRPa soluble,
y en donde los uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón se seleccionan entre EpCAM, CD56, CD99 y CD44.
La invención proporciona además un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de superficie celular en células de cáncer de pulmón, para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas en un paciente, mediante la administración de:
(i) el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón en combinación con
(ii) un agente dirigido que bloquea selectivamente CD47 en células de cáncer de pulmón en la unión del paciente a SIRPa,
en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es:
(a) un anticuerpo que se une específicamente a CD47,
(b) un anticuerpo que se une específicamente a la SIRPa, o
(c) un polipéptido de SIRPa soluble,
y en donde los uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón se seleccionan entre EpCAM, CD56, CD99 y CD44.
En la presente se divulgan métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer de pulmón con una terapia dirigida. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células pequeñas. Una terapia puede estar dirigida a uno o más antígenos de superficie celular, incluyendo CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165, EpCAM, etc. Una terapia dirigida puede comprender la administración a un individuo que padece cáncer de pulmón de una dosis terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente a un marcador de superficie celular seleccionado entre CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165 y EpCAM.
En algunas realizaciones, la terapia dirigida se combina con un agente bloqueante de CD47. Las células cancerígenas evaden la vigilancia de los macrófagos mediante la regulación por incremento de la expresión de CD47. La administración de agentes que enmascaran la proteína CD47, por ejemplo, anticuerpos o moléculas pequeñas que se unen a CD47 o SIRPa y evitan la interacción entre CD47 y SIRPa, se administran a un paciente, lo que aumenta la depuración de las células cancerígenas mediante fagocitosis. El agente que bloquea CD47 se combina con anticuerpos monoclonales dirigidos contra uno o más marcadores de células de cáncer de pulmón, cuyas composiciones pueden ser sinérgicas para aumentar la fagocitosis y la eliminación de células cancerígenas en comparación con el uso de agentes individuales.
Las combinaciones específicas de reactivos de interés para la terapia incluyen anti-CD47 y anti-CD56; anti-CD47 y anti-CD44, anti-CD47 y anti-CD99, anti-CD47 y anti-EpCam. En algunas de tales realizaciones, el reactivo anti-CD47 es un polipéptido de SIRPa de alta afinidad, que puede proporcionarse en forma de monómero o multímero, por ejemplo como una proteína de fusión con un polipéptido de IgG Fc.
En otras realizaciones, la terapia proporciona un anticuerpo multiespecífico que se dirige a CD47 y un segundo marcador de células cancerígenas, incluyendo anticuerpos multiespecíficos que se dirigen a CD47 y CD56; CD47 y CD44, CD47 y EpCam, etc. También se proporcionan composiciones de tales anticuerpos multiespecíficos, donde el anticuerpo multiespecífico es deseablemente humano o humanizado; y puede modificarse para prolongar la semivida en sangre, por ejemplo, mediante pegilación, etc.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Las terapias de bloqueo de CD47 estimulan la fagocitosis de macrófagos del cáncer de pulmón de células pequeñas. Se purificaron monocitos humanos de donantes de sangre anónimos mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) usando selección CD14+. Los monocitos se cultivaron en presencia de suero humano AB al 10% durante una semana, momento en el que mostraron cambios morfológicos característicos de la diferenciación a macrófagos. Los macrófagos se cocultivaron con células primarias humanas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC muestra "H29") marcadas con un colorante fluorescente verde. Las células se trataron o con un vehículo de control (solución salina tamponada con fosfato, PBS), anticuerpo anti-CD56 (clon MEM-188) o anticuerpo humanizado anti-CD47 (clon 5F9-G4). La fagocitosis se evaluó mediante citometría de flujo de alto rendimiento como el porcentaje de macrófagos que habían engullido células SCLC fluorescentes verdes. El tratamiento con anticuerpos anti-CD47 fue capaz de inducir niveles elevados de fagocitosis como un único agente.
Figura 2: El bloqueo de CD47 produce una respuesta terapéutica contra las células de cáncer de pulmón de células pequeñas in vivo usando modelos de xenotrasplante en ratones. Se injertaron células primarias de cáncer de pulmón de células pequeñas (muestra H29) en ratones NSG inmunodeficientes. Después de aproximadamente tres semanas de crecimiento, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos cohortes de tratamiento. La primera cohorte se trató con un vehículo de control (solución salina tamponada con fosfato, PBS; rojo), y la segunda cohorte se trató con inyecciones diarias de 250 pg de anticuerpo anti-CD47 (clon 5F9-G4, azul). El crecimiento tumoral se monitorizó a lo largo del tiempo. Cada punto representa el crecimiento de un tumor en un ratón individual. Las barras negras representan la mediana del volumen tumoral. Izquierda Mediciones del volumen tumoral a lo largo de todo el estudio. Derecha Mediciones del volumen tumoral en el día 89 del estudio. Obsérvese la escala logarítmica.
Figura 3: Nuevas dianas terapéuticas altamente expresadas en la superficie de células de cáncer de pulmón de células pequeñas. Se sometieron células humanas primarias de cáncer de pulmón de células pequeñas (muestra H29) a inmunofenotipado exhaustivo por citometría de flujo usando un ensayo LEGENDScreen (Biolegend). Los antígenos de superficie se clasificaron sobre la base de su intensidad de fluorescencia media geométrica (Geo. MFI). Estos antígenos son dianas terapéuticas para anticuerpos en combinación con agentes bloqueantes de CD47.
Figura 4: La capacidad de los anticuerpos dirigidos contra el SCLC para inducir la fagocitosis de macrófagos puede mejorarse mediante la combinación con terapias de bloqueo de CD47. Dos líneas celulares humanas de cáncer de pulmón de células pequeñas (H82 y H69) se marcaron con un colorante verde fluorescente y, a continuación, se cocultivaron con macrófagos primarios de ratón NSG en presencia de los anticuerpos indicados, bien en combinación con un vehículo de control (solución salina tamponada con fosfato, PBS; gris) o con un monómero CV1 variante de SIRPaIfa de alta afinidad (negro). La fagocitosis se evaluó mediante citometría de flujo de alto rendimiento como el porcentaje de macrófagos que habían engullido células SCLC fluorescentes verdes. Los reactivos anti-CD47 5F9-G4 y CV1-G4 no se probaron en combinación con el monómero de CV1 debido a la competencia directa.
Figura 5. El bloqueo de CD47 induce la fagocitosis de macrófagos de células de SCLC in vitro. A Expresión de CD47 en la superficie de un panel de líneas celulares humanas de SCLC evaluada por citometría de flujo. La línea negra discontinua representa células NCI-H82 no teñidas. B Expresión de CD47 en la superficie de la muestra primaria de SCLC humano H29. C Diagrama que representa ensayos de fagocitosis in vitro usando macrófagos humanos y células tumorales fluorescentes. D Gráficos representativos de citometría de flujo de ensayos de fagocitosis realizados con macrófagos humanos y células de SCLC marcadas con calceína AM. E Imágenes representativas de las poblaciones celulares tras la clasificación celular activada por fluorescencia. La población doblemente positiva clasificada contenía macrófagos con células tumorales engullidas. La barra de escala representa 20 pm. F Resumen de los ensayos de fagocitosis usando macrófagos humanos y células de SCLC marcadas con AM analizadas mediante citometría de flujo. Las células de SCLC se trataron con un vehículo de control (PBS) o con anticuerpos anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). El porcentaje de macrófagos calceína AM+ se normalizó con respecto a la respuesta máxima de cada donante de macrófagos. G Fagocitosis de células SCLC H29 primarias por macrófagos humanos tras el tratamiento con control de vehículo (PBS) o anticuerpos anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). F-G Los ensayos de fagocitosis se realizaron con macrófagos procedentes de cuatro donantes de sangre independientes. Los datos representan la media SD. ns, no significativo; **P < 0,01; ****P < 0,0001 para las comparaciones indicadas mediante análisis de varianza de dos vías con corrección de Sidak (F) o prueba t de dos colas (G).
Figura 6. Los anticuerpos bloqueantes de CD47 inhiben el crecimiento de tumores de SCLC humanos in vivo. A Crecimiento de células NCI-H82 en el tejido subcutáneo de ratones NSG. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos tratados con control de vehículo (PBS) o anticuerpos anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). El crecimiento se evaluó mediante mediciones del volumen tumoral. Se trataron de siete a ocho ratones por cohorte, y cada punto representa el volumen tumoral de animales independientes. B Crecimiento de tumores H29 de xenoinjerto derivados de pacientes con GFP-luciferasa+ en el tejido subcutáneo de ratones NSG evaluado mediante imagenología por bioluminiscencia. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos tratados con control de vehículo (PBS) o anticuerpos anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). C Imágenes representativas de bioluminiscencia de tumores H29 en el día 85 tras el injerto. D Crecimiento de los tumores H29 evaluado mediante mediciones del volumen tumoral. E Supervivencia de ratones portadores de tumores H29 de xenoinjerto derivados de pacientes que fueron tratados con las terapias indicadas. P = 0,0004 mediante la prueba de Mantel-Cox. A-E Las flechas negras indican el inicio del tratamiento. Los puntos indican mediciones de animales independientes, las barras indican valores medianos. Las cohortes consistieron en un mínimo de 7-8 ratones. Las mediciones en cada punto temporal están escalonadas por claridad. ns, no significativo; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 para las comparaciones indicadas mediante la prueba de Mann-Whitney.
Figura 7. La MCP-3 es un biomarcador sérico que predice la respuesta a las terapias de bloqueo de CD47. A Se inyectó a ratones NSG no tratados (sin tumor) o ratones NSG portadores de células NCI-H82 subcutáneas una dosis individual de anticuerpos anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). Se recogieron muestras de suero antes del tratamiento y 24 horas después del tratamiento. Los niveles de MCP-3 se midieron mediante una matriz multiplex Luminex. B Los niveles de MCP-3 en ratones portadores de tumores xenoinjertados H29 derivados de pacientes se evaluaron como en A. Los puntos representan mediciones de ratones individuales, las barras representan la media SD. Se evaluaron cinco ratones por condición. ns = no significativo; ****P < 0,0001 mediante análisis de varianza de dos vías con corrección de Sidak.
Figura 8. El cribado exhaustivo de anticuerpos basado en FACS identifica dianas terapéuticas nuevas y establecidas en el SCLC. Se evaluó la expresión de antígenos en la superficie de cuatro líneas celulares de SCLC y de la muestra de paciente primario H29 usando kits de cribado de células humanas LEGENDScreen (BioLegend), una colección de 332 anticuerpos dirigidos a antígenos de la superficie celular. La unión de anticuerpos se detectó mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). A Histograma que representa la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) de todos los anticuerpos cribados para determinar la unión a la superficie del SCLC. Los datos representan los valores medianos de cada anticuerpo en las cinco muestras de SCLC. Los datos se ajustaron a una distribución gaussiana (curva negra) y los antígenos negativos (gris) se definieron por una MFI mediana inferior a dos desviaciones estándar por encima de la media. Los antígenos bajos (rojo) se definieron como MFI menos de un orden de magnitud por encima del umbral negativo. Antígenos altos (azul) definidos como un orden de magnitud superior al umbral negativo. B Lista ordenada de los 39 antígenos identificados como "altos" sobre la base de la mediana de MFI en las cinco muestras de SCLC.
Figura 9. Las variantes de SIRPa de alta afinidad mejoran la fagocitosis de SCLC por macrófagos en respuesta a anticuerpos de unión tumoral. Fagocitosis de células NCI-H82 (A) y células NCI-H524 (B) en respuesta a anticuerpos de unión tumoral solos (rojo) o en combinación con el monómero CV1 de variante de SIRPa de alta afinidad (azul). Los puntos representan mediciones de donantes individuales, las barras representan valores medianos. Se probaron tres clones de anticuerpos anti-CD56 (NCAM), así como anticuerpos contra CD24, CD29, CD99 y CD47 (clon Hu5F9-G4). C Fagocitosis de células de SCLC NCI-H82 en respuesta a concentraciones variables del anticuerpo anti-CD56 lorvotuzumab solo (rojo) o en combinación con el monómero CV1 de variante de SIRPa de alta afinidad (azul). Los datos representan la media SD. A-C Los ensayos de fagocitosis se realizaron con macrófagos humanos derivados de un mínimo de cuatro donantes de sangre independientes. Las mediciones se normalizaron con respecto a la respuesta máxima de cada donante de macrófagos. ns, no significativo; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001 para las comparaciones indicadas mediante análisis de varianza de dos vías con corrección de Sidak.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
En la presente se divulgan métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer de pulmón con un agente terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo, dirigido a un marcador de cáncer de pulmón, por ejemplo, dirigido a uno o más antígenos de superficie celular, incluyendo CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165, EpCAM, etc. En la presente se divulga una combinación, por ejemplo, una combinación sinérgica de agentes, en donde un agente es un agente bloqueante anti-CD47, y el segundo agente está dirigido a un marcador de cáncer de pulmón, por ejemplo, CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165, EpCAM, etc.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor expresado o intermedio en ese intervalo expresado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos dentro de la invención, a reserva de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo expresado. Cuando el intervalo expresado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyan uno o ambos límites incluidos también están comprendidos dentro de la invención.
Los métodos enumerados en la presente pueden llevarse a cabo en cualquier orden de los eventos enumerados que sea lógicamente posible, así como en el orden de eventos enumerado.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Cabe señalar que, como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta exposición sirva como base previa para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "sólo" y similares en relación con la enumeración de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Las publicaciones analizadas en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo expuesto en la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, lo que puede requerir una confirmación independiente.
DEFINICIONES
Combinación sinérgica. Las combinaciones sinérgicas pueden proporcionar un efecto terapéutico que es comparable a la eficacia de una monoterapia, es decir, los componentes individuales de la combinación, a la vez que reducen los efectos secundarios adversos, por ejemplo, el daño a tejidos no diana, el estado inmunitario y otros indicios clínicos. Alternativamente, las combinaciones sinérgicas pueden proporcionar una eficacia mejorada en comparación con la eficacia de una monoterapia, es decir, los componentes individuales de la combinación, cuyo efecto puede medirse por el número total de células tumorales, el tiempo transcurrido hasta la recaída y otros indicadores de la salud del paciente.
Las combinaciones sinérgicas divulgadas en la presente combinan un agente dirigido a inhibir o bloquear la función de CD47; y un agente dirigido a inhibir o bloquear un segundo marcador celular del cáncer de pulmón, habitualmente un marcador de la superficie celular. La combinación puede proporcionarse con una combinación de agentes, por ejemplo, dos proteínas distintas, cada una de las cuales es específica para un marcador diferente; o puede proporcionarse como un agente multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo, que combina la especificidad por dos o más marcadores diferentes.
Terapia combinada. Como se usa en la presente, el término "terapia combinada" se refiere a aquellas situaciones en las que un sujeto está expuesto simultáneamente a dos o más regímenes terapéuticos (por ejemplo, dos o más agentes terapéuticos). En algunas realizaciones, pueden administrarse simultáneamente dos o más agentes; en algunas realizaciones, tales agentes pueden administrarse secuencialmente; en algunas realizaciones, tales agentes se administran en regímenes de dosificación superpuestos.
Forma de dosificación: Como se usa en la presente, el término "forma de dosificación" se refiere a una unidad físicamente discreta de un agente activo (por ejemplo, un agente terapéutico o de diagnóstico) para su administración a un sujeto. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de agente activo. En algunas realizaciones, dicha cantidad es una cantidad de dosificación unitaria (o una fracción entera de la misma) apropiada para la administración de acuerdo con un régimen de dosificación que se ha determinado que se correlaciona con un resultado deseado o beneficioso cuando se administra a una población relevante (es decir, con un régimen de dosificación terapéutico). Los expertos en la técnica apreciarán que la cantidad total de una composición o agente terapéutico administrada a un sujeto particular es determinada por uno o más médicos tratantes y puede implicar la administración de múltiples formas de dosificación.
Régimen de dosificación: Como se usa en la presente, el término "régimen de dosificación" se refiere a un conjunto de dosis unitarias (típicamente más de una) que se administran individualmente a un sujeto, típicamente separadas por periodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis, cada una de las cuales está separada de otra por un periodo de tiempo de la misma duración; en algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y por lo menos dos periodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales. En algunas realizaciones, todas las dosis dentro de un régimen de dosificación son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas realizaciones, diferentes dosis dentro de un régimen de dosificación son de diferentes cantidades. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida de una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguido de una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis igual a la primera cantidad de dosis En algunas realizaciones, un régimen de dosificación está correlacionado con un resultado deseado o beneficioso cuando se administra a una población relevante (es decir, es un régimen de dosificación terapéutico).
Polipéptidos CD47. Las tres variantes de transcripción del CD47 humano (variante 1, NM 001777; variante 2, NM 198793; y variante 3, NM 001025079) codifican tres isoformas del polipéptido de CD47. La isoforma 1 de CD47 (NP 001768), la más larga de las tres isoformas, tiene una longitud de 323 aminoácidos. La isoforma 2 de CD47 (NP 942088) tiene una longitud de 305 aminoácidos. La isoforma 3 de CD47 tiene una longitud de 312 aminoácidos. Las tres isoformas son idénticas en secuencia en los primeros 303 aminoácidos. Los aminoácidos 1-8 comprenden la secuencia señal, los aminoácidos 9-142 comprenden el dominio similar a la inmunoglobulina de CD47, que es el fragmento soluble, y los aminoácidos 143-300 son el dominio transmembrana.
Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. "Derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes de la misma. Los derivados y la fusión de CD47 soluble se usan como moléculas miméticas de CD47.
Los primeros 142 aminoácidos del polipéptido de CD47 comprenden la región extracelular de CD47 (SEQ ID NO: 1). Las tres isoformas tienen idéntica secuencia de aminoácidos en la región extracelular y, por tanto, puede usarse cualquier isoforma para generar CD47 soluble. "CD47 soluble" es una proteína de CD47 que carece del dominio transmembrana. La CD47 soluble se secreta fuera de la célula que la expresa en lugar de localizarse en la superficie celular.
Los ensayos in vitro de la actividad biológica de CD47 incluyen, por ejemplo, la inhibición de la fagocitosis de células porcinas por macrófagos humanos, unión al receptor de SIRPa, fosforilación de tirosina de SIRPa, etc. Un ensayo ejemplar para la actividad biológica de CD47 pone en contacto una composición de macrófagos humanos en presencia de un agente candidato. Las células se incuban con el agente candidato durante aproximadamente 30 minutos y se lisan. El lisado celular se mezcla con anticuerpos anti-SIRPa humanos para inmunoprecipitar la SIRPa. Las proteínas precipitadas se resuelven mediante SDS PAGE, luego se transfieren a nitrocelulosa y se analizan con anticuerpos específicos para fosfotirosina. Un agente candidato útil como mimético de CD47 aumenta la fosforilación de tirosina de SIRPa en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fosforilación observado en ausencia del agente candidato. Otro ensayo ejemplar de la actividad biológica de CD47 mide la fagocitosis de células hematopoyéticas por macrófagos humanos. Un agente candidato útil como mimético de CD47 da como resultado una regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos un 10%, por lo menos un 20%, por lo menos un 50%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80% o hasta un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia del agente candidato.
Por "manipulación de la fagocitosis" se entiende una regulación por incremento o regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80% o hasta un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención. Así, en el contexto de la disminución de la fagocitosis de células hematopoyéticas circulantes, en particular en un contexto de trasplante, la manipulación de la fagocitosis significa una regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% p un 80% o hasta un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención.
Agente anti-CD47. Como se usa en la presente, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que
reduce la unión de CD47 (por ejemplo, en una célula diana) a SIRPa (por ejemplo, en una célula fagocítica). Ejemplos no limitativos de reactivos anti-CD47 adecuados incluyen reactivos de SIRPa, incluyendo sin limitación polipéptidos de SIRPa de alta afinidad, anticuerpos anti-SIRPa, polipéptidos de CD47 solubles y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo de SIRPa, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de CD47 a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPa).
La eficacia de un agente anti-CD47 adecuado puede evaluarse ensayando el agente (descrito adicionalmente más adelante). En un ensayo ejemplar, las células diana se incuban en presencia o ausencia del agente candidato. Un agente para su uso en los métodos de la invención regulará por incremento la fagocitosis en por lo menos un 10% (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 120%, por lo menos un 140%, por lo menos un 160%, por lo menos un 180% o por lo menos un 200%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. De manera similar, un ensayo in vitro de los niveles de fosforilación en tirosina de SIRPa mostrará una disminución de la fosforilación de por lo menos un 5% (por ejemplo, por lo menos un 10%, por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90% o el 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.
En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras la unión. Cuando se activa CD47, puede producirse un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, 1 de febrero de 2004). Por tanto, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47 por apoptosis.
Reactivo de SIRPa. Un reactivo de SIRPa comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento de la misma que conserva la actividad de unión. Un reactivo de SIRPa adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, impide, etc.) la interacción entre las proteínas nativas de SIRPa y CD47. El reactivo de SIRPa comprenderá habitualmente por lo menos el dominio d1 de SIRPa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de tal manera que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis proporcionando una señal "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal "no me comas" proporcionada por el reactivo de SIRPa de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, proporcionando mayor tamaño, dominios de multimerización, y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig.
En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un "reactivo de SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad se describen en la publicación de patente internacional WO 2013/109752. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína de SIRPa nativa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa de alta afinidad es soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana de SIRPa y comprende por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de SIRPa de tipo salvaje, y en donde el cambio de aminoácidos aumenta la afinidad de la unión del polipéptido de SIRPa a CD47, por ejemplo disminuyendo la constante de disociación en por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces, o más.
Un reactivo de SIRPa de alta afinidad comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que conserva la actividad de unión. El reactivo de SIRPa de alta afinidad comprenderá habitualmente por lo menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad.
Un reactivo de SIRPa puede usarse como un "monómero", en el que se usa el dominio de unión de SIRPa, pero en el que el dominio de unión se proporciona como una proteína monomérica soluble. En otras realizaciones, una variante de SIRPa de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido, particularmente cuando el segundo polipéptido proporciona multimerización. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis proporcionando una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo de SIRPa de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, proporcionando mayor tamaño, dominios de multimerización, y/o unión o interacción adicional con moléculas Ig.
Los cambios de aminoácidos que proporcionan una afinidad aumentada se localizan en el dominio d1, por lo que los reactivos de SIRPa de alta afinidad comprenden un dominio d1 de SIRPa humana, con por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Dicho reactivo de SIRPa de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo secuencias Fc de anticuerpos; porciones de la proteína de SIRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d1, incluyendo sin limitación los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de la misma, habitualmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.
Anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 tras la unión, por ejemplo un anticuerpo que no induce apoptosis tras la unión. Ejemplos no limitativos de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 2011/143624). Los anticuerpos anti-CD47 adecuados incluyen versiones totalmente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados (por ejemplo, hu5F9-G4) son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados, o caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.
Anticuerpos anti-SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un anticuerpo que se une específicamente a SIRPa (es decir, un anticuerpo anti-SIRPa) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados pueden unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En su lugar, los anticuerpos anti-SIRPa adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las células normales. Las células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) con respecto a otras células (células no infectadas) serán fagocitadas preferencialmente. Por tanto, un anticuerpo anti-SIRPa adecuado se une específicamente a SIRPa (sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis) y bloquea la interacción entre SIRPa y CD47. Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados incluyen versiones totalmente humanas, humanizadas o quiméricas de dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados, o caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.
Polipéptidos CD47 solubles. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un polipéptido de CD47 soluble que se une específicamente a SIRPa y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Un polipéptido de CD47 soluble adecuado puede unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En su lugar, los polipéptidos de CD47 solubles adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las no infectadas. Las células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) con respecto a las células normales no diana (células normales) serán fagocitadas preferentemente. Por tanto, un polipéptido de CD47 soluble adecuado se une específicamente a SIRPa sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.
En algunos casos, un polipéptido de CD47 soluble adecuado puede ser una proteína de fusión (por ejemplo, como se describe estructuralmente en la Publicación de Patente de Estados Unidos US20100239579). Sin embargo, sólo las proteínas de fusión que no activan/estimulan la SIRPa son adecuadas para los métodos divulgados en la presente. Los polipéptidos de CD47 solubles adecuados también incluyen cualquier péptido o fragmento peptídico que comprenda secuencias de CD47 variantes o existentes de manera natural (por ejemplo, secuencias de dominio extracelular o variantes de dominio extracelular) que puedan unirse específicamente a SIRPa e inhibir la interacción entre CD47 y SIRPa sin estimular suficiente actividad de SIRPa para inhibir la fagocitosis.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de CD47 soluble comprende el dominio extracelular de CD47, incluyendo el péptido señal, de tal manera que la porción extracelular de CD47 tiene típicamente 142 aminoácidos de longitud, y tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3. Los polipéptidos de CD47 solubles descritos en la presente también incluyen variantes del dominio extracelular de CD47 que comprenden una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90%, o 95%- 99% (o cualquier porcentaje de identidad no enumerado específicamente entre el 65% y el 100%), cuyas variantes conservan la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del péptido señal puede sustituirse por una secuencia de aminoácidos del péptido señal derivada de otro polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina o CTLA4). Por ejemplo, a diferencia del CD47 de longitud completa, que es un polipéptido de la superficie celular que atraviesa la membrana celular externa, los polipéptidos de CD47 solubles se secretan; por consiguiente, un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD47 soluble puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que está asociado con un polipéptido que normalmente se secreta de una célula.
En otras realizaciones, el polipéptido de CD47 soluble comprende un dominio extracelular de CD47 que carece del péptido señal. En una realización ejemplar, el dominio extracelular de CD47 que carece del péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1 (124 aminoácidos). Como se describe en la presente, los péptidos señal no están expuestos en la superficie celular de una proteína secretada o transmembrana porque, o el péptido señal se escinde durante la translocación de la proteína, o el péptido señal permanece anclado en la membrana celular externa (dicho péptido también se denomina anclaje señal). Se cree que la secuencia del péptido señal de CD47 se escinde del polipéptido precursor CD47 in vivo.
En otras realizaciones, un polipéptido de CD47 soluble comprende una variante del dominio extracelular de CD47. Dicho polipéptido de CD47 soluble conserva la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa. La variante de dominio extracelular de CD47 puede tener una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90%, o 95%-99% idéntica (que incluye cualquier porcentaje de identidad entre cualquiera de los rangos descritos) a una secuencia de CD47 humana de referencia.
Se pretende que el término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica con una forma específica que se ajuste y reconozca un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. Los anticuerpos utilizados en la presente pueden ser anticuerpos policlonales, aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales porque pueden reproducirse por cultivo celular o recombinantemente, y pueden modificarse para reducir su antigenicidad.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse mediante un protocolo estándar inyectando a un animal de producción una composición antigénica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Cuando se utiliza una proteína entera, o una sección más grande de la proteína, pueden generarse anticuerpos inmunizando al animal de producción con la proteína y un adyuvante adecuado (por ejemplo, de Freund, de Freund completo, emulsiones de aceite en agua, etc.). Cuando se utiliza un péptido más pequeño, es ventajoso conjugar el péptido con una molécula más grande para hacer un conjugado inmunoestimulador. Entre las proteínas conjugadas comúnmente utilizadas que están disponibles comercialmente para tal uso se incluyen la albúmina de suero bovino (BSA) y la hemocianina de lapa californiana (KLH). Para generar anticuerpos contra epítopos particulares, pueden utilizarse péptidos derivados de la secuencia completa. Alternativamente, para generar anticuerpos contra porciones de péptidos relativamente cortas de la proteína diana, puede obtenerse una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, como la ovoalbúmina, la BSA o la KLH. Alternativamente, para los anticuerpos monoclonales, pueden formarse hibridomas aislando las células inmunitarias estimuladas, como las del bazo del animal inoculado. A continuación, estas células se fusionan con células inmortalizadas, como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una línea celular inmortal que secreta inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos pueden producirse por ingeniería genética. Para su uso en la presente invención se prefieren los anticuerpos humanizados, quiméricos o humanos xenogénicos, que producen una menor respuesta inmunitaria cuando se administran a humanos.
Además de las inmunoglobulinas enteras (o sus homólogos recombinantes), los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2 u otros fragmentos) son útiles como fracciones de anticuerpo en la presente invención. Tales fragmentos de anticuerpo pueden generarse a partir de inmunoglobulinas enteras por escisión con ricina, pepsina, papaína u otra proteasa. Los "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse enlazando una región variable de cadena ligera con una región variable de cadena pesada mediante un conector peptídico (por ejemplo, poliglicina u otra secuencia que no forme una hélice alfa o un motivo de lámina beta).
Los anticuerpos incluyen anticuerpos libres y fragmentos de unión a antígeno derivados de los mismos, y conjugados, por ejemplo, anticuerpos pegilados, conjugados de fármacos, radioisótopos o toxinas, y similares. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítopo específico, o una combinación de epítopos, permitirán el direccionamiento y/o agotamiento de poblaciones celulares que expresen el marcador. Para detectar poblaciones celulares que expresen el marcador o marcadores pueden utilizarse varias técnicas con anticuerpos monoclonales, e incluyen la separación magnética con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, el "barrido" con anticuerpos adheridos a una matriz sólida (es decir, una placa) y la citometría de flujo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.985.660; y Morrison et al. Cell, 96:737-49 (1999)). Estas técnicas permiten el cribado de poblaciones particulares de células; en inmunohistoquímica de muestras de biopsia; en la detección de la presencia de marcadores vertidos por las células cancerígenas en la sangre y otros fluidos biológicos, y similares.
También están dentro del alcance de esta invención las versiones humanizadas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad.
La frase "anticuerpo multiespecífico o biespecífico" se refiere a un anticuerpo sintético o recombinante que reconoce más de una proteína. Los anticuerpos biespecíficos dirigidos contra una combinación de epítopos, permitirán el direccionamiento y/o agotamiento de poblaciones celulares que expresan la combinación de epítopos. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los dirigidos contra una combinación de CD47 y un marcador de células cancerígenas de SCLC. La generación de anticuerpos biespecíficos se describe en la bibliografía, por ejemplo, en USPN 5989830, USPN 5798229. Las especificidades de orden superior, por ejemplo los anticuerpos triespecíficos, se describen en Holliger y Hudson (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136.
La eficacia de un inhibidor de CD47 puede evaluarse analizando la actividad de CD47. Se usan los ensayos mencionados anteriormente o versiones modificadas de los mismos. En un ensayo ejemplar, se incuban SCLC con macrófagos derivados de médula ósea, en presencia o ausencia del agente candidato. Un inhibidor de la superficie celular CD47 regulará por incremento la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente candidato. De manera similar, un ensayo in vitro de los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución de la fosforilación de por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o 50%, o 70% u 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.
En una realización de la invención, el agente, o una composición farmacéutica que comprende el agente, se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir detectablemente la unión de CD47 al receptor de SIRPa presente en la superficie de células fagocíticas. La cantidad eficaz se determina mediante pruebas empíricas habituales en la técnica. La cantidad eficaz puede variar dependiendo del número de células que se trasplantan, el sitio del trasplante y factores específicos del receptor del trasplante.
Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis. Hay cuatro categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.
El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y que pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o seguimiento. El término abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras sólidas de tejido, como un espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. El término abarca las muestras que han sido manipuladas de cualquier manera después de su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.
Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización parcial o completa o curación de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, primate, incluyendo humanos y otros simios, en particular un humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero al que todavía no se le ha diagnosticado; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.
Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular los humanos.
Una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a un microorganismo o a una célula eucariota o línea celular cultivada como entidad unicelular que puede ser, o ha sido, usada como receptora de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una única célula puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o total de ADN que el progenitor original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.
Los términos "cáncer", "neoplasia", "tumor" y "carcinoma" se usan indistintamente en la presente para referirse a células que presentan un crecimiento relativamente autónomo, de tal manera que muestran un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. En general, las células de interés para la detección o el tratamiento en la presente solicitud incluyen células precancerígenas (por ejemplo, benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y no metastásicas. La detección de células cancerígenas es de particular interés. Se entiende que el término "normal", como se usa en el contexto de "célula normal", se refiere a una célula de fenotipo no transformado o que presenta la morfología de una célula no transformada del tipo de tejido que se está examinando. "Fenotipo cancerígeno" se refiere de manera general a cualquiera de una variedad de fenómenos biológicos que son característicos de una célula cancerígena, fenómenos que pueden variar con el tipo de cáncer. El fenotipo cancerígeno se identifica generalmente por anomalías en, por ejemplo, el crecimiento o la proliferación celular (por ejemplo, crecimiento o proliferación incontrolados), la regulación del ciclo celular, la movilidad celular, la interacción célula-célula, o la metástasis, etc.
"Diana terapéutica" se refiere a un gen o producto génico que, tras la modulación de su actividad (por ejemplo, mediante la modulación de la expresión, la actividad biológica y similares), puede proporcionar la modulación del fenotipo cancerígeno. Como se usa en todo el documento, "modulación" se entiende que se refiere a un aumento o una disminución del fenómeno indicado (por ejemplo, la modulación de una actividad biológica se refiere a un aumento o una disminución de una actividad biológica).
CÁNCER DE PULMÓN
El carcinoma de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Aproximadamente el 85% de los casos están relacionados con el consumo de cigarrillos. Los síntomas pueden incluir tos, molestias o dolor torácico, pérdida de peso y, con menor frecuencia, hemoptisis; sin embargo, muchos pacientes presentan enfermedad metastásica sin ningún síntoma clínico. El diagnóstico se realiza típicamente mediante radiografía de tórax o CT y se confirma mediante biopsia. Dependiendo del estadio de la enfermedad, el tratamiento incluye cirugía, quimioterapia, radioterapia o una combinación. Durante las últimas décadas, el pronóstico del paciente con cáncer de pulmón ha sido malo, sobre todo para los pacientes con enfermedad en estadio IV (metastásica).
Las células epiteliales respiratorias requieren una exposición prolongada a agentes promotores del cáncer y la acumulación de múltiples mutaciones genéticas antes de convertirse en neoplásicas (un efecto denominado carcinogénesis de campo). En algunos pacientes con cáncer de pulmón, las mutaciones secundarias o adicionales en genes que estimulan el crecimiento celular (K-ras, MYC), provocan anomalías en la señalización del receptor del factor de crecimiento (EGFR, HER2/neu) e inhiben la apoptosis contribuyendo a la proliferación de células anormales. Además, las mutaciones que inhiben los genes supresores de tumores (p53, APC) pueden provocar cáncer. Otras mutaciones que pueden ser responsables son la translocación EML-4-ALK y mutaciones en ROS-1, BRAF y PI3KCA. Los genes como éstos, que son los principales responsables del cáncer de pulmón, se denominan mutaciones impulsoras. Aunque las mutaciones impulsoras pueden provocar o contribuir al cáncer de pulmón entre los fumadores, es especialmente probable que estas mutaciones sean la causa del cáncer de pulmón entre los no fumadores.
A menudo la prueba de imagenología inicial es una radiografía de tórax. Puede mostrar anomalías claramente definidas, como una masa única o masas multifocales o un nódulo pulmonar solitario, un hilio agrandado, mediastino ensanchado, estrechamiento traqueobronquial, atelectasia, infiltrados parenquimatosos sin resolución, lesiones cavitarias o engrosamiento o derrame pleural inexplicable. Estos descubrimientos son sugestivos pero no diagnósticos de cáncer de pulmón y requieren seguimiento con exploraciones CT o exploraciones combinadas PET-CT y confirmación citopatológica.
La CT muestra muchos patrones anatómicos característicos y apariencias que pueden sugerir fuertemente el diagnóstico. La CT también puede guiar la biopsia con aguja gruesa de lesiones accesibles y es útil para la estadificación. Si una lesión detectada en una radiografía simple tiene muchas probabilidades de ser cáncer de pulmón, puede realizarse una PET-CT. Este estudio combina las imágenes anatómicas de la CT con las imágenes funcionales de la PET. Las imágenes PET pueden ayudar a diferenciar los procesos inflamatorios de los malignos.
El SCLC tiene 2 estadios: limitado y extenso. La enfermedad de SCLC en estadio limitado es el cáncer confinado a un hemitórax (incluyendo los ganglios linfáticos ipsilaterales) que puede abarcarse dentro de un puerto de radioterapia tolerable, a menos que haya un derrame pleural o pericárdico. La enfermedad en estadio extenso es el cáncer fuera de un solo hemitórax o la presencia de células malignas detectadas en derrames pleurales o pericárdicos. Menos de un tercio de los pacientes con SCLC presentarán enfermedad en estadio limitado; el resto de los pacientes tienen a menudo metástasis extensas distantes. El pronóstico global del SCLC es malo. El tiempo mediano de supervivencia del SCLC en estadio limitado es de 20 meses, con una tasa de supervivencia a 5 años del 20%. Los pacientes con SCLC en estadio extenso tienen un pronóstico especialmente desfavorable, con una tasa de supervivencia a 5 años de < 1%.
El NSCLC tiene 4 estadios, del I al IV (usando el sistema TNM). La estadificación TNM se basa en el tamaño del tumor, la localización del tumor y los ganglios linfáticos, y la presencia o ausencia de metástasis a distancia. La tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con NSCLC varía según el estadio, del 60 al 70% para los pacientes con enfermedad en estadio I a < 1% para los pacientes con enfermedad en estadio IV.
El tratamiento convencional varía según el tipo de célula y el estadio de la enfermedad. Muchos factores del paciente no relacionados con el tumor afectan a la elección del tratamiento. La escasa reserva cardiopulmonar, la desnutrición, la fragilidad o el bajo rendimiento físico, las comorbilidades, incluyendo las citopenias, y las enfermedades psiquiátricas o cognitivas pueden llevar a una decisión de tratamiento paliativo en lugar de curativo o a la ausencia total de tratamiento, aunque técnicamente sea posible la curación con una terapia agresiva.
El SCLC en cualquier estadio típicamente responde inicialmente al tratamiento, pero las respuestas son habitualmente efímeras. La quimioterapia, con o sin radioterapia, se administra dependiendo del estadio de la enfermedad. En muchos pacientes, la quimioterapia prolonga la supervivencia y mejora la calidad de vida lo suficiente como para justificar su uso. Por lo general, la cirugía no desempeña ningún papel en el tratamiento del SCLC, aunque puede ser curativa en los raros pacientes que tienen un tumor focal pequeño sin diseminación (como un nódulo pulmonar solitario) que se sometieron a una resección quirúrgica antes de que se identificara el tumor como SCLC. Comúnmente se usan regímenes de quimioterapia con etopósido y un compuesto de platino (cisplatino o carboplatino), así como otros fármacos, como irinotecán, topotecán, alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina, vinorelbina), agentes alquilantes (ciclofosfamida, ifosfamida), doxorrubicina, taxanos (docetaxel, paclitaxel) y gemcitabina. Cuando la enfermedad está confinada al hemitórax, la radioterapia mejora aún más los resultados clínicos; dicha respuesta a la radioterapia fue la base de la definición de enfermedad en estadio limitado. En ciertos casos también se recomienda el uso de radiación craneal para prevenir las metástasis cerebrales; las micrometástasis son comunes en el SCLC y la quimioterapia tiene menos capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica.
En la enfermedad en estadio extenso, el tratamiento se basa en la quimioterapia en lugar de radioterapia, aunque la radioterapia se usa a menudo como tratamiento paliativo de las metástasis óseas o cerebrales. En pacientes con una excelente respuesta a la quimioterapia, a veces se usa irradiación profiláctica del cerebro como en el SCLC en estadio limitado para prevenir el crecimiento del SCLC en el cerebro.
El tratamiento para el NSCLCL típicamente implica la evaluación de la elegibilidad para la cirugía, seguido de la elección de la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia o una combinación de modalidades, según sea apropiado, en función del tipo de tumor y el estadio.
Tratamiento del cáncer
En la presente se divulgan métodos para reducir el crecimiento de células de cáncer de pulmón mediante la introducción de una dosis eficaz de un agente terapéutico dirigido a un marcador de superficie de células de cáncer de pulmón, incluyendo sin limitación CD24, CD166, CD56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, c D165, EpCAM, etc. En algunas realizaciones, el marcador es uno de c D56, Cd44, CD99 y EpCam. En realizaciones preferidas, el agente terapéutico dirigido se combina con un agente bloqueante de CD47, por ejemplo, un monómero o multímero soluble de SIRPa, un anticuerpo anti-CD47, una molécula pequeña, etc. En ciertas realizaciones, el cáncer es SCLC. Al bloquear la actividad de CD47, se evita la regulación por disminución de la fagocitosis que se produce en ciertas células tumorales.
"Reducir el crecimiento de células cancerígenas" incluye, pero no se limita a, reducir la proliferación de células cancerígenas, y reducir la incidencia de que una célula no cancerígena se convierta en una célula cancerígena. Puede determinarse fácilmente si se ha logrado una reducción en el crecimiento de células cancerígenas usando cualquier ensayo conocido, incluyendo, pero no limitado a, incorporación de 33H]-timidina; recuento del número de células durante un periodo de tiempo; detección y/o medición de un marcador asociado con SCLC, etc.
Puede evaluarse si una sustancia, o una cantidad específica de la sustancia, es eficaz en el tratamiento del cáncer usando cualquiera de una variedad de ensayos de diagnóstico conocidos para el cáncer, incluyendo, pero no limitados a biopsia, estudios radiográficos de contraste, exploración por CAT, y detección de un marcador tumoral asociado con el cáncer en la sangre del individuo. La sustancia puede administrarse por vía sistémica o local, habitualmente por vía sistémica.
En una realización alternativa, un agente, por ejemplo un fármaco quimioterapéutico que reduce el crecimiento de células cancerígenas, puede dirigirse a una célula cancerígena mediante conjugación con un anticuerpo específico de CD47. Por tanto, en la presente se describe un método de administración de un fármaco a una célula cancerígena, que comprende la administración de un complejo fármaco-anticuerpo a un sujeto, en donde el anticuerpo es específico para un polipéptido asociado al cáncer, y el fármaco es uno que reduce el crecimiento de células cancerígenas, una variedad de los cuales son conocidos en la técnica. El direccionamiento puede lograrse acoplando (por ejemplo, enlazando, directamente o a través de una molécula conectora, ya sea covalente o no covalentemente, para formar un complejo fármaco-anticuerpo) un fármaco para un anticuerpo específico para un polipéptido asociado al cáncer. Los métodos de acoplamiento de un fármaco a un anticuerpo son bien conocidos en la técnica y no es necesario desarrollarlos en la presente.
En ciertas realizaciones, puede usarse un anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, en la presente se divulga un anticuerpo biespecífico en el que un dominio de unión a antígeno se dirige contra CD47 y el otro dominio de unión a antígeno se dirige contra un marcador de células cancerígenas, como CD24, CD166, c D56, CD326, CD298, CD29, CD63, CD9, CD164, CD99, CD46, CD59, CD57, CD165, EpCAM, etc.
En general, como se utiliza el término en la memoria descriptiva, se pretende que "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica que tenga una forma específica que se ajusta a un epítopo y lo reconoce, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. Para los anticuerpos monoclonales, pueden formarse hibridomas aislando las células inmunitarias estimuladas, como las del bazo del animal inoculado. A continuación, estas células se fusionan con células inmortalizadas, como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una línea celular inmortal que secreta inmunoglobulinas. La línea celular inmortal utilizada se selecciona preferiblemente para que sea deficiente en enzimas necesarias para la utilización de ciertos nutrientes. Muchas de estas líneas celulares (como los mielomas) son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo: timidina quinasa (TK) o hipoxantina-guanina fosforiboxil transferasa (HGPRT). Estas deficiencias permiten seleccionar las células fusionadas de acuerdo con de su capacidad para crecer, por ejemplo, en medio de hipoxantina aminopterintimidina (HAT).
Para su uso en la invención se prefieren los anticuerpos que tienen una propensión reducida a inducir una respuesta inmunitaria violenta o perjudicial en los humanos (como el choque anafiláctico), y que también muestran una propensión reducida a cebar una respuesta inmunitaria que impediría la dosificación repetida con el agente terapéutico de anticuerpos o de imagenología (por ejemplo, la respuesta de anticuerpos anti-murina humana "HAMA"). Estos anticuerpos se prefieren para todas las vías de administración. Por tanto, para su uso en la presente invención se prefieren los anticuerpos humanizados, quiméricos o humanos xenogénicos, que producen una menor respuesta inmunitaria cuando se administran a humanos.
Los anticuerpos quiméricos pueden elaborarse por medios recombinantes combinando las regiones variables murinas de cadena ligera y pesada (VK y VH), obtenidas de un clon de hibridoma murino (o derivado de otro animal), con las regiones constantes humanas de cadena ligera y pesada, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de tales anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica, y puede lograrse por medios estándar (como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.624.659). Los anticuerpos humanizados se manipulan para que contengan incluso más dominios de inmunoglobulina similares a los humanos e incorporen sólo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo de origen animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los giros hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolos a la estructura de las cadenas del anticuerpo humano. Aunque aparentemente complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.187.287.
Alternativamente, los anticuerpos policlonales o monoclonales pueden producirse a partir de animales que han sido alterados genéticamente para producir inmunoglobulinas humanas. El animal transgénico puede producirse produciendo inicialmente un animal "knock-out" que no produzca los anticuerpos naturales del animal, y transformando de manera estable el animal con un locus de anticuerpo humano (por ejemplo, mediante el uso de un cromosoma artificial humano). Entonces, el animal sólo produce anticuerpos humanos. Las técnicas para generar tales animales, y derivar anticuerpos de los mismos, se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 6,162,963 y 6,150,584. Tales anticuerpos xenogénicos totalmente humanos son un anticuerpo preferido para su uso en las composiciones de la presente invención. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos de cadena sencilla a partir de bibliotecas de fagos que contienen regiones variables humanas. Véase la Patente de Estados Unidos N° 6.174.708.
Además de las inmunoglobulinas enteras (o sus homólogas recombinantes), en la presente invención los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2 u otros fragmentos) son útiles como fracciones de anticuerpo. Tales fragmentos de anticuerpo pueden generarse a partir de inmunoglobulinas enteras por escisión con ficina, pepsina, papaína u otra proteasa. Los "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse enlazando una región variable de cadena ligera a una región variable de cadena pesada mediante un conector peptídico (por ejemplo, poliglicina u otra secuencia que no forme una hélice alfa o un motivo de lámina beta).
Los fragmentos Fv son heterodímeros del dominio variable de cadena pesada (VH) y del dominio variable de cadena ligera (VL). Los heterodímeros de los dominios de cadena pesada y ligera que se producen en la IgG entera, por ejemplo, están conectados por un enlace disulfuro. Los Fv recombinantes en los que los V<h>y V<l>están conectados por un conector peptídico son típicamente estables, véase, por ejemplo, Huston et al., Proc. Acad, Sci. USA 85:5879 5883 (1988) y Bird et al., Science 242:423 426 (1988). Se trata de Fv de cadena sencilla que han demostrado que mantienen la especificidad y la afinidad y que han demostrado ser útiles para la imagenología de tumores y para elaborar inmunotoxinas recombinantes para la terapia de tumores. Sin embargo, los investigadores han descubierto que algunos de los Fv de cadena sencilla tienen una afinidad reducida por el antígeno y que el conector peptídico puede interferir en la unión. También se han elaborado Fv mejorados que comprenden enlaces disulfuro estabilizadores entre las regiones V<h>y V<l>, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.147.203. En la presente invención puede utilizarse cualquiera de estos anticuerpos mínimos, y para su uso en realizaciones de la invención se prefieren los que están humanizados para evitar reacciones HAMA.
En las composiciones de la presente invención pueden utilizarse polipéptidos derivatizados con conectores químicos añadidos, fracciones detectables como colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, fracciones quimioluminiscentes, fracciones de unión específica como estreptavidina, avidina o biotina, o conjugados de fármacos.
En algunas realizaciones, los reactivos polipeptídicos están acoplados o conjugados con una o más fracciones terapéuticas, citotóxicas o de imagenología. Como se usa en la presente, "fracción citotóxica" (C) significa simplemente una fracción que inhibe el crecimiento celular o promueve la muerte celular cuando se aproxima o es absorbida por la célula. Las fracciones citotóxicas adecuadas a este respecto incluyen isótopos radiactivos (radionucleidos), agentes quimiotóxicos como inductores de la diferenciación y pequeños fármacos quimiotóxicos, proteínas toxínicas y derivados de los mismos. Los agentes pueden conjugarse con un reactivo polipeptídico mediante cualquier técnica adecuada, teniendo la consideración adecuada de la necesidad de estabilidad farmoquinética y toxicidad global reducida para el paciente. Un agente terapéutico puede acoplarse a una fracción adecuada directa o indirectamente (por ejemplo, mediante un grupo conector). Una reacción directa es posible cuando cada uno posee un grupo funcional capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, como un grupo amino o sulfhidrilo, puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro). Alternativamente, puede usarse un grupo conector químico adecuado. Un grupo conector puede funcionar como espaciador para distanciar un reactivo polipeptídico de un agente con el fin de evitar interferencias con las capacidades de unión. Un grupo conector también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en una fracción o un reactivo polipeptídico, y aumentar por tanto la eficacia de acoplamiento. Un aumento de la reactividad química también puede facilitar el uso de fracciones, o grupos funcionales en fracciones, que de otro modo no sería posible.
Las químicas de enlace adecuadas incluyen conectores de maleimidilo y conectores de haluro de alquilo (que reaccionan con un sulfhidrilo en la fracción de anticuerpo) y enlaces de succinimidilo (que reaccionan con una amina primaria en la fracción de anticuerpo). En las inmunoglobulinas hay varios grupos amina primaria y sulfhidrilo, y pueden diseñarse grupos adicionales en las moléculas de inmunoglobulina recombinante. Será evidente para los expertos en la técnica que como grupo conector pueden emplearse una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo como heterofuncionales (como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, III.). El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidratos oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4,671,958. Como método de acoplamiento alternativo, las fracciones citotóxicas pueden acoplarse a un reactivo polipeptídico a través de un grupo carbohidrato oxidado en un sitio de glicosilación, como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.057.313 y 5.156.840. Otro método alternativo de acoplamiento más de un reactivo polipeptídico con una fracción citotóxica o terapéutica es el uso de un par de unión no covalente, como estreptavidina/biotina o avidina/biotina. En estas realizaciones, un miembro del par se acopla covalentemente a la fracción anti-CD47, CV1, etc. y el otro miembro del par de unión se acopla covalentemente a la fracción terapéutica, citotóxica o de imagenología.
Cuando una fracción citotóxica es más potente cuando está libre de la porción de unión de un reactivo polipeptídico, puede ser deseable usar un grupo conector que sea escindible durante o tras la internalización en una célula, o que sea escindible gradualmente con el tiempo en el entorno extracelular. Se han descrito una serie de grupos conectores escindibles. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de fracción citotóxica a partir de estos grupos conectores incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4,489,710), por irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.625.014), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizados (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.638.045), por hidrólisis mediada por complemento sérico (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4,671,958), e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.569.789).
Puede ser deseable acoplar más de una fracción a un reactivo polipeptídico. Al poliderivatizar el reactivo, pueden implementarse simultáneamente varias estrategias, por ejemplo, puede marcarse un anticuerpo terapéutico para su seguimiento mediante una técnica de visualización. Independientemente de la realización particular, los conjugados con más de una fracción pueden prepararse de varias maneras. Por ejemplo, puede acoplarse más de una fracción directamente a una molécula polipeptídica, o pueden usarse conectores que proporcionen múltiples sitios de unión (por ejemplo, dendrímeros). Alternativamente, puede usarse un portador con la capacidad de contener más de una fracción citotóxica o de imagenología.
Un portador puede portar los agentes de varias maneras, incluyendo la unión covalente, ya sea directamente o a través de un grupo conector, y las asociaciones no covalentes. Los portadores de enlace covalente adecuados incluyen proteínas como las albúminas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.507.234), péptidos y polisacáridos como el aminodextrano (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.699.784), cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de fracciones. Un portador también puede portar un agente mediante asociaciones no covalentes, como la unión no covalente o por encapsulación, como dentro de una vesícula liposomal (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.429.008 y 4.873.088). Los portadores de encapsulación son especialmente útiles para la conjugación de fracciones de imagenología con fracciones de anticuerpos para su uso en la invención, ya que una cantidad suficiente de la fracción de imagenología (colorante, reactivo de contraste de resonancia magnética, etc.) para la detección puede asociarse más fácilmente con la fracción de anticuerpo. Además, los portadores de encapsulación también son útiles en las realizaciones terapéuticas quimiotóxicas, ya que pueden permitir que las composiciones terapéuticas liberen gradualmente una fracción quimiotóxica a lo largo del tiempo mientras la concentran en las cercanías de las células tumorales.
Los radionucleidos preferidos para su uso como fracciones citotóxicas son radionucleidos adecuados para la administración farmacológica. Tales radionucleidos incluyen 123I, 125I, 131I, 90Y, 211At, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Pb, y 212Bi. Los isótopos de yodo y astato son los radionucleidos más preferidos para su uso en las composiciones terapéuticas de la presente invención, ya que se ha acumulado una gran cantidad de bibliografía sobre su uso.
Los agentes quimiotóxicos preferidos incluyen fármacos de molécula pequeña como carboplatino, cisplatino, vincristina, taxanos como paclitaxel y doceltaxel, hidroxiurea, gemcitabina, vinorelbina, irinotecán, tirapazamina, matrilisina, metotrexato, análogos de pirimidina y purina, y otras toxinas pequeñas adecuadas conocidas en la técnica. Los inductores de diferenciación de quimiotaxinas preferidos incluyen los ésteres de forbol y el ácido butírico. Las fracciones quimiotóxicas pueden conjugarse directamente con la fracción de anticuerpo mediante un conector químico, o pueden encapsularse en un portador, que a su vez se acopla al anticuerpo. Las proteínas toxínicas preferidas para su uso como moléculas citotóxicas incluyen las ricinas A y B, la abrina, la toxina diftérica, la briodina 1 y 2, la momordina, la tricoquirina, la toxina del cólera, la gelonina, la exotoxina de Pseudomonas, la toxina de Shigella, la proteína antivírica fr phytolacca americana y otras proteínas toxínicas conocidas en las técnicas de la bioquímica medicinal. Como estos agentes toxínicos pueden provocar respuestas inmunitarias indeseables en el paciente, especialmente si se inyectan por vía intravascular, se prefiere que estén encapsulados en un portador para su acoplamiento al anticuerpo.
Para la administración, pueden administrarse por separado o juntos un agente terapéutico dirigido, o una combinación de agentes terapéuticos dirigidos; y generalmente se administrarán en el plazo del mismo marco temporal general, por ejemplo, en el plazo de una semana, en el plazo de 3-4 días, en el plazo de 1 día o simultáneamente entre sí.
El agente o agentes se mezclan, antes de la administración, con una sustancia portadora no tóxica, farmacéuticamente aceptable. Habitualmente, se trata de una solución acuosa, como solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución de Ringer, solución de Iactato-Ringer o cualquier solución isotónica fisiológicamente aceptable para la administración por el medio elegido. Preferiblemente, la solución es estéril y no contiene pirógenos, y se fabrica y envasa de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) aprobadas por la FDA. El practicante clínico experto está familiarizado con los intervalos apropiados de pH, tonicidad y aditivos o conservantes a la hora de formular composiciones farmacéuticas para su administración por inyección intravascular, inyección directa en los ganglios linfáticos, intraperitoneal o por otras vías. Además de los aditivos para ajustar el pH o la tonicidad, los agentes pueden estabilizarse contra la agregación y la polimerización con aminoácidos y detergentes no iónicos, polisorbato y polietilenglicol. Opcionalmente, los estabilizadores adicionales pueden incluir varios carbohidratos y sales fisiológicamente aceptables. Además del aminoácido también puede añadirse polivinilpirrolidona. Las soluciones de inmunoglobulina terapéutica adecuadas que se estabilizan para el almacenamiento y la administración a humanos se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.945.098. A la composición terapéutica o de imagenología se le pueden añadir otros agentes, como la albúmina sérica humana (HSA), para estabilizar los conjugados de anticuerpos.
Las composiciones de la invención pueden administrarse usando cualquier procedimiento médicamente apropiado, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa, intraarterial, intracapilar), inyección en el tumor, etc. La inyección intravascular puede ser intravenosa o intraarterial. La cantidad eficaz de las composiciones terapéuticas que debe administrarse a un paciente particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales serán diferentes de un paciente a otro. Un practicante clínico competente será capaz de determinar la cantidad eficaz de una composición terapéutica a administrar a un paciente para retardar el crecimiento y promover la muerte de las células tumorales. La dosificación de los agentes dependerá del tratamiento del tumor, la vía de administración, la naturaleza de los agentes terapéuticos, la sensibilidad del tumor a los agentes terapéuticos, etc. Utilizando los datos de LD<50>en animales y otra información disponible para la fracción citotóxica o de imagenología conjugada, un practicante clínico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada localmente, dado el mayor volumen de líquido en el que se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se depuran rápidamente del organismo pueden administrarse a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando los conocimientos habituales, el practicante clínico competente será capaz de optimizar la dosificación de una composición terapéutica o de imagenología particular en el curso de ensayos clínicos rutinarios.
Típicamente, una dosificación eficaz será de 0,001 a 100 miligramos de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del sujeto. La proporción del anticuerpo anti-CD47 con respecto al segundo agente puede variar entre 1:100; 1:50; 1:10; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1; 5:1; 10:1; 50:1; 100:1. Los agentes pueden administrarse al sujeto en una serie de más de una administración. Para las composiciones terapéuticas, a veces se requerirá una administración periódica regular (por ejemplo, cada 2-3 días), o puede ser deseable para reducir la toxicidad. Para las composiciones terapéuticas que se utilizarán en regímenes de dosis repetidas, se prefieren fracciones de anticuerpos que no provoquen HAMA u otras respuestas inmunitarias.
EJEMPLO 1
Las variantes de alta afinidad de SIRPa potencian la destrucción de macrófagos del cáncer de pulmón de células pequeñas.
CD47 permite a las células cancerígenas evadir el sistema inmunitario mediante la señalización a través de SIRPa, un receptor inhibidor en los macrófagos. Recientemente hemos desarrollado una nueva generación de antagonistas de CD47 manipulando el dominio de inmunoglobulina N-terminal de SIRPa. Estas "variantes de alta afinidad de la SIRPa" tienen una afinidad por la CD47 humana (K<d>) tan baja como 11,1 pm, aproximadamente 50.000 veces mejor que la SIRPa de tipo salvaje. Cuando se combinan con anticuerpos específicos de tumores, las variantes de alta afinidad de la SIRPa actúan como adyuvantes inmunoterapéuticos para maximizar la destrucción de las células cancerígenas por los macrófagos.
Ahora hemos aplicado estos reactivos al cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), un cáncer de mal pronóstico para el que no existen anticuerpos clínicamente aprobados. Descubrimos que las líneas celulares y las muestras primarias de SCLC expresaban altos niveles de CD47 en su superficie. Usando macrófagos humanos, descubrimos que las terapias de bloqueo de CD47 eran capaces de inducir la fagocitosis de macrófagos de las células de SCLC. El tratamiento de ratones portadores de tumores primarios de SCLC humano con anticuerpos bloqueadores de CD47 fue capaz de inhibir el crecimiento tumoral y prolongar significativamente la supervivencia. Para identificar nuevos antígenos del SCLC a los que dirigirse en combinación con variantes de SIRPa de alta afinidad, se cribaron muestras de SCLC mediante citometría de flujo usando matrices completas de anticuerpos.
Validamos antígenos específicos de tumores en la superficie de células de SCLC e identificamos anticuerpos contra estos antígenos que podían estimular la fagocitosis in vitro. Cuando se combinaron con monómeros de SIRPa de alta afinidad, aumentó drásticamente la capacidad de estos anticuerpos para estimular la fagocitosis.
Ejemplo 2
Las terapias de bloqueo de CD47 estimulan la destrucción por macrófagos del cáncer de pulmón de células pequeñas.
El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es un subtipo muy agresivo de cáncer de pulmón con pronóstico desalentador. No hay anticuerpos, terapias dirigidas ni inmunoterapias clínicamente aprobadas para esta enfermedad. Descubrimos que las muestras de SCLC expresaban altos niveles de CD47, una molécula de la superficie celular que permite a las células cancerígenas evadir el sistema inmunitario. En concreto, CD47 promueve la evasión inmunitaria mediante la señalización a través de SIRPa, un receptor inhibidor de los macrófagos. Formulamos la hipótesis de que las terapias de bloqueo de CD47 podrían aplicarse al tratamiento del SCLC. Descubrimos que las terapias de bloqueo de CD47 eran capaces de inducir la fagocitosis de macrófagos en muestras de SCLC in vitro. Las terapias de bloqueo de CD47 también inhibieron el crecimiento tumoral y prolongaron significativamente la supervivencia de ratones portadores de tumores de SCLC. Además, mediante el uso de matrices completas de anticuerpos, identificamos varias dianas terapéuticas nuevas y establecidas en la superficie de las células de SCLC. Los anticuerpos contra estas dianas podían provocar la fagocitosis de los macrófagos y se potenciaban cuando se combinaban con terapias de bloqueo de CD47. Estos descubrimientos sugieren que las terapias que interrumpen el eje CD47-SIRPa podrían beneficiar a los pacientes con SCLC, especialmente cuando se combinan con anticuerpos específicos del tumor.
El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), que deriva de las células neuroendocrinas del pulmón, es uno de los subtipos de cáncer más letales en humanos. Cada año, más de 25.000 pacientes son diagnosticados de SCLC sólo en los Estados Unidos, y los pacientes viven típicamente sólo 6-12 meses después del diagnóstico. La tasa de supervivencia a los 5 años sigue siendo desalentadora, rondando alrededor del 5% desde la década de 1970. Salvo la combinación de radioterapia y quimioterapia, no se han implementado nuevos enfoques terapéuticos en los últimos 30 años. A pesar de la gran cantidad de ensayos clínicos, no se ha aprobado ninguna terapia dirigida para el SCLC. El SCLC está estrechamente relacionado con el consumo excesivo de tabaco, y el aumento de las tasas de tabaquismo en los países en desarrollo seguirá incrementando la prevalencia mundial del SCLC en el futuro. Por estos motivos, es necesario identificar nuevas dianas terapéuticas y generar nuevos tratamientos para los pacientes con SCLC.
Uno de los avances más prometedores en el campo de la oncología es la inmunoterapia, cuyo objetivo es estimular el propio sistema inmunitario del paciente para que ataque y elimine el cáncer. A medida que los tumores se desarrollan, adquieren mecanismos para evitar la destrucción por el sistema inmunitario. Si comprendemos estos mecanismos, podremos desarrollar nuevas estrategias para inducir al sistema inmunitario a reconocer el cáncer como extraño. Estudios anteriores han identificado a CD47, una molécula de la superficie celular, como un "marcador del yo" que impide que las células del sistema inmunitario innato ataquen las enfermedades malignas hematológicas y ciertos tipos de tumores sólidos. CD47 actúa enviando señales inhibidoras a través de SIRPa, un receptor expresado en la superficie de los macrófagos y otras células mieloides. En este sentido, la interacción CD47-SIRPa representa un punto de control inmunitario específico de los mieloides. Se han generado una serie de reactivos para interrumpir la señalización por el eje CD47-SIRPa, incluyendo anticuerpos anti-CD47 y variantes manipuladas de su receptor, SIRPa. Estudios recientes han demostrado que el bloqueo de CD47 disminuye el umbral de fagocitosis del cáncer por los macrófagos. Planteamos la hipótesis de que las células de SCLC también expresan CD47 y que las terapias de bloqueo de CD47 podrían usarse para estimular la fagocitosis de macrófagos de las células de SCLC e inhibir el crecimiento de los tumores de SCLC in vivo.
Además, se ha demostrado que las terapias de bloqueo de CD47 mejoran la respuesta de macrófagos a los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales, como el rituximab para el linfoma o el trastuzumab para el cáncer de mama Her2+, han tenido un enorme éxito en el tratamiento del cáncer. No existen anticuerpos monoclonales aprobados clínicamente para el tratamiento del SCLC, por lo que nuestro objetivo era identificar nuevos antígenos de superficie del SCLC a los que se pudieran dirigir anticuerpos monoclonales. Aunque el tratamiento con anticuerpos monoclonales puede producir efectos antitumorales potentes, a menudo no consiguen curar la enfermedad cuando se usan como agentes individuales, lo que pone de manifiesto la necesidad de mejorar la eficacia de estos enfoques. Por lo tanto, nuestro objetivo era combinar terapias de bloqueo de CD47 con otros anticuerpos para lograr respuestas antitumorales máximas contra el SCLC.
Como primer paso de nuestro enfoque, investigamos si CD47 se expresaba en la superficie de las muestras de SCLC. A continuación, examinamos si las terapias de bloqueo de CD47 podían estimular la fagocitosis de macrófagos del SCLC in vitro. Para evaluar la respuesta de las muestras de SCLC a las terapias de bloqueo de CD47 in vivo se usaron modelos de cáncer humano en ratones. Para identificar nuevas dianas terapéuticas en la superficie de las muestras de SCLC, realizamos citometría de flujo de alto rendimiento usando matrices completas de anticuerpos. Por último, nos propusimos demostrar que los anticuerpos contra los antígenos identificados podrían combinarse con terapias de bloqueo de CD47 para aumentar aún más la fagocitosis. Los objetivos generales de este estudio eran validar las terapias de bloqueo de CD47 para el SCLC e identificar anticuerpos adicionales que pudieran usarse para tratar el SCLC. De este modo, pretendemos identificar nuevas combinaciones inmunoterapéuticas que podrían usarse en beneficio de los pacientes con SCLC.
Resultados
CD47 se expresa en la superficie del SCLC.Para evaluar si las terapias de bloqueo de CD47 podrían aplicarse al SCLC, primero examinamos la expresión de CD47 en la superficie de las células de SCLC. Obtuvimos seis líneas celulares de SCLC y las sometimos a citometría de flujo para evaluar la expresión de CD47 en la superficie celular. Las seis líneas celulares mostraban una elevada expresión de CD47 (Figura 5A). También evaluamos la expresión de CD47 en la superficie de un xenoinjerto derivado de un paciente con SCLC obtenido a partir de una muestra primaria de paciente con SCLC. De manera similar a las líneas celulares, la muestra del paciente H29 también expresaba niveles altos de CD47 en su superficie (Figura 5B). Estos resultados sugieren que CD47 es una diana inmunoterapéutica en el SCLC.
Los anticuerpos bloqueantes de CD47 inducen la fagocitosis de SCLC por macrófagos humanos.Para validar CD47 como una genuina diana terapéutica en SCLC, realizamos ensayos de fagocitosis in vitro usando muestras de macrófagos humanos y de SCLC. Los macrófagos se cocultivaron con células de SCLC en presencia de un vehículo de control o de anticuerpos anti-CD47. Probamos el clon Hu5F9-G4 del anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo humanizado anti-CD47 que bloquea la interacción entre CD47 y SIRPa y que se está investigando en un ensayo clínico de Fase I para tumores sólidos (identificador CIinicaITriaIs.gov: NCT02216409). Se usó citometría de flujo de alto rendimiento para medir la fagocitosis, que se evaluó mediante el porcentaje de macrófagos que engullían células de SCLC marcadas con calceína AM (Figura 5C y D). Se usó clasificación celular activada por fluorescencia para confirmar que la población doblemente positiva contenía macrófagos con células tumorales engullidas (Figura 5E). Se evaluaron cuatro muestras de SCLC en ensayos de fagocitosis. Tres líneas celulares (NCI-H524, NCI-1688 y NCI-H82) mostraron aumentos significativos de la fagocitosis cuando se trataron con el anticuerpo bloqueante de CD47 (Figura 5F). Una línea celular, NCI-H196, parecía ser resistente a la fagocitosis, lo que sugiere que existen mecanismos adicionales que modifican la susceptibilidad de esta línea celular al ataque de los macrófagos. El xenoinjerto H29 derivado del paciente también se sometió a ensayos de fagocitosis con macrófagos humanos. El tratamiento de esta muestra con anticuerpos anti-CD47 también produjo un aumento significativo de la fagocitosis (Figura 5G).
Los anticuerpos bloqueantes de CD47 inhiben el crecimiento de tumores de SCLC in vivo.Para evaluar el potencial de los agentes bloqueantes de CD47 cuando se administran como terapias para el SCLC humano, establecimos modelos de xenoinjerto de SCLC humano. Injertamos células NCI-H82 en los costados inferiores izquierdos de ratones NSG, que carecen de células T, células B y células NK funcionales, pero conservan macrófagos funcionales. Aproximadamente una semana después del injerto, los ratones se asignaron aleatoriamente a un tratamiento con control de vehículo o con 250 gg del clon Hu5F9-G4 de anticuerpo anti-CD47 administrado en días alternos. Se usaron las mediciones del volumen tumoral para evaluar la respuesta de los ratones a la terapia. Después de dos semanas de tratamiento, se observó una diferencia significativa en la mediana del volumen tumoral que persistió durante el resto del experimento (Figura 6A). Después de aproximadamente un mes de tratamiento, el volumen tumoral medio de la cohorte de control con vehículo era de 837,8 mm3 frente a 160,2 mm3 para la cohorte tratada con el anticuerpo anti-CD47 (P --0,0281). Por lo tanto, el anticuerpo bloqueante de CD47 fue capaz de producir una inhibición significativa del crecimiento tumoral.
Creamos una línea celular de NCI-H82 GFP-Iuciferasa+ para monitorizar el crecimiento y la diseminación in vivo. Como modelo ortotópico de SCLC humano, injertamos células GFP-Iuciferasa+ NCI-H82 en el espacio intratorácico izquierdo. Cuatro días después de las inyecciones, se confirmó el injerto mediante imagenología por bioluminiscencia. A continuación, distribuimos aleatoriamente a los ratones en dos cohortes tratadas con un vehículo de control o con 250 gg del clon Hu5F9-G4 de anticuerpo anti-CD47 administrado en días alternos. Monitorizamos el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo mediante imagenología por bioluminiscencia. De nuevo, el anticuerpo bloqueante de CD47 produjo una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Además, observamos un beneficio significativo en la supervivencia de la cohorte tratada con el anticuerpo bloqueante de CD47. El análisis post mortem reveló que los tumores se formaron en la cavidad torácica o en la región paratorácica. Los ratones del grupo de control con vehículo también mostraron metástasis importantes en el hígado, que no se observaron en la cohorte tratada con el anticuerpo anti-CD47.
Como las líneas celulares típicamente representan poblaciones clonales de células, a continuación probamos la eficacia in vivo de los anticuerpos bloqueantes de CD47 en un xenoinjerto derivado de un paciente, que se asemeja más estrechamente al tratamiento en pacientes, ya que mantiene la heterogeneidad de las poblaciones de células cancerígenas dentro de un tumor. Se transdujo la muestra H29 de SCLC primario para que expresase GFP-Iuciferasa a fin de permitir mediciones dinámicas del crecimiento tumoral in vivo. A continuación, los tumores se injertaron en los costados inferiores izquierdos de ratones y se dejó que se estableciesen durante aproximadamente 2 semanas. A continuación, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos cohortes de tratamiento con vehículo de control o 250 pg del clon Hu5F9-G4 de anticuerpo anti-CD47 administrado en días alternos. Descubrimos que el anticuerpo anti-CD47 inhibía significativamente el crecimiento tumoral, evaluado mediante mediciones del volumen tumoral e imagenología por bioluminiscencia (Figura 6B-D). El tratamiento con la terapia de bloqueo de CD47 también produjo beneficios significativos en la supervivencia. En el día 125 después del injerto, todos los ratones del grupo de control habían muerto, mientras que la mayoría de los ratones del grupo del anticuerpo anti-CD47 sólo tenían tumores pequeños que no progresaron incluso después de 225 días después del injerto (Figura 6E). Estos modelos demuestran que las terapias de bloqueo de CD47 podrían ser eficaces para los pacientes con SCLC.
La MCP-3 sérica es un biomarcador de respuesta a las terapias de bloqueo de CD47.Para identificar biomarcadores potenciales de una respuesta a las terapias de bloqueo de CD47, volvimos a injertar ratones con células NCI-H82. Dejamos que los tumores crecieran hasta alcanzar aproximadamente 1,5 cm de diámetro y, a continuación, tratamos a los ratones con una única dosis de vehículo de control o del clon Hu5F9-G4 del anticuerpo anti-CD47. Recogimos muestras de suero inmediatamente antes del tratamiento y 24 horas después del tratamiento. Sometimos las muestras de suero a un análisis multiplex de 38 citoquinas. A partir de este análisis, descubrimos que la proteína 3 quimiotáctica de macrófagos (MCP-3) aumentaba sistémicamente después del tratamiento con el clon Hu5F9-G4 de anticuerpo anti-CD47 (Figura 7A). No se observó un aumento significativo de la MCP-3 en ratones sin tumores tratados con el clon Hu5F9-G4 de anticuerpo anti-CD47 (Figura 7A). También realizamos un experimento similar usando el xenoinjerto H29 derivado del paciente. De nuevo, los ratones portadores de tumores se sometieron a una única dosis del anticuerpo anti-CD47 clon Hu5F9- G4. El análisis de citoquinas séricas reveló de nuevo que la MCP-3 aumentaba significativamente después del tratamiento con el anticuerpo bloqueante de CD47 (Figura 7B). Por lo tanto, la MCP-3 puede servir como biomarcador de respuesta a las terapias de bloqueo de CD47 en pacientes. La secreción de MCP-3 puede ser un mecanismo de retroalimentación positiva que recluta más macrófagos hacia el tumor y podría explicar en parte los potentes efectos de las terapias de bloqueo de CD47 in vivo.
Las matrices completas de anticuerpos identifican dianas terapéuticas en el SCLC.Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser algunos de los tratamientos más eficaces contra el cáncer. Sin embargo, se conocen pocas dianas de anticuerpos en la superficie del SCLC. Por este motivo, nos dirigimos a caracterizar el perfil de antígenos de superficie de las células de SCLC usando matrices completas de anticuerpos. Se analizaron cuatro líneas celulares de SCLC y la muestra primaria de SCLC H29 usando la matriz BioLegend LEGENDScreen, una colección completa de 332 anticuerpos contra antígenos de la superficie celular humana. ***Análisis del histograma para definir antígenos negativos, bajos y altos (Figura 8A). Identificamos 39 antígenos que se expresaban en gran medida en la superficie de las muestras de SCLC, lo que los convierte en posibles dianas de anticuerpos terapéuticos. Cuando clasificamos estos antígenos por su intensidad de tinción media, descubrimos que CD47 era el antígeno de superficie que presentaba la tinción más intensa (Figura 8B). Otro antígeno que se expresaba en gran medida en todas las muestras fue CD56 (NCAM), un marcador conocido de tumores neuroendocrinos y una diana terapéutica actualmente en evaluación para el SCLC, lo que valida nuestro enfoque. También identificamos una serie de otros antígenos de superficie que se expresan en gran medida que podrían ser diana de terapias con anticuerpos monoclonales, como CD24, CD29 y CD99 (Figura 8B). Curiosamente, otros ligandos de puntos de control inmunitarios como CD80, CD86, PD-L1 o PD-L2 no se expresaron de manera apreciable en la superficie de las muestras de SCLC.
La combinación de anticuerpos con el bloqueo de CD47 mejora la fagocitosis del SCLC.Para evaluar el potencial terapéutico de los antígenos identificados por las matrices LEGENDScreen, a continuación evaluamos su capacidad de ser dirigidos por anticuerpos e inducir fagocitosis in vitro. Obtuvimos anticuerpos contra una serie de antígenos de superficie que se expresaban en gran medida, incluyendo CD56 (clones HCD56 y MEM-188), CD24, CD29 y CD99. Además, obtuvimos la secuencia de lorvotuzumab, un anticuerpo anti-CD56 que se está evaluando en ensayos clínicos como conjugado anticuerpo-fármaco, y lo produjimos recombinantemente como anticuerpo desnudo. Probamos estos anticuerpos solos y en combinación con el antagonista de alta afinidad de CD47 CV1, que bloquea CD47 pero no contribuye con un estímulo Fc adicional (Figura 9A y B). Probamos la capacidad de estos anticuerpos para inducir la fagocitosis por macrófagos humanos de dos líneas celulares de SCLC diferentes, NCI-H82 (Figura 9A) y NCI-H524 (Figura 9B). De los tres anticuerpos anti-CD56 probados, se observó que lorvotuzumab era capaz de producir el mayor aumento de la fagocitosis, y este efecto se potenciaba significativamente mediante la combinación con CV1. Los anticuerpos contra CD24 o CD99 también fueron capaces de inducir una fagocitosis comparable o superior a la del tratamiento con el clon Hu5F9-G4 anti-CD47. Como se esperaba, la fagocitosis con Hu5F9-G4 se bloqueó por completo cuando se combinó con CV1, ya que CV1 compite por la misma superficie de unión y se une con una afinidad extremadamente alta. Curiosamente, el anticuerpo anti-CD29 no fue capaz de inducir la fagocitosis ni siquiera en combinación con CV1, una importante demostración de que factores adicionales como la geometría de unión a la superficie o la capacidad de acoplar receptores Fc pueden modificar la respuesta de los macrófagos a los anticuerpos terapéuticos.
Como el lorvotuzumab está en evaluación como agente terapéutico para el SCLC, investigamos su capacidad para inducir la fagocitosis en un intervalo variable de concentraciones. El tratamiento con lorvotuzumab solo produjo una relación dosis-respuesta para inducir la fagocitosis de macrófagos. Es importante destacar que, para cada concentración de lorvotuzumab probada, la adición de CV1 produjo un mayor grado de fagocitosis (Figura 9C). Estos descubrimientos demuestran que el CV1 podría aumentar tanto la eficacia máxima como la potencia del lorvotuzumab, como se había observado anteriormente cuando se combinó el CV1 con rituximab, trastuzumab y cetuximab.
Debido a su mal pronóstico y a la escasez de opciones terapéuticas eficaces, hay una necesidad inminente de identificar tratamientos novedosos para el SCLC. Las inmunoterapias están emergiendo como algunas de las nuevas terapias más prometedoras contra el cáncer, y aquí demostramos que CD47, el punto de control inmunitario específico de los mieloides, es una diana inmunoterapéutica genuina para el SCLC. CD47 se expresó en gran medida en la superficie de todas las muestras de SCLC analizadas, y descubrimos que el bloqueo de CD47 permitía la fagocitosis de macrófagos de muestras de SCLC in vitro. Usando múltiples modelos de xenoinjerto, el anticuerpo bloqueante de CD47 Hu5F9-G4 fue capaz de inhibir el crecimiento tumoral y prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumores de SCLC. Es importante destacar que observamos la eficacia antitumoral en un modelo de xenoinjerto de SCLC derivado de paciente, que mantiene la complejidad de la población de células iniciadoras del tumor y, por tanto, sirve como modelo más preciso para el tratamiento en humanos. Además, identificamos MCP-3 como un biomarcador sérico que se correlaciona con la respuesta a las terapias de bloqueo de CD47. Como el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 está siendo investigado en un ensayo clínico de Fase I para enfermedades malignas sólidas humanas (CIinicaITriaIs.gov identificador: NCT02216409), nuestros descubrimientos proporcionan una justificación científica para una evaluación adicional de los anticuerpos anti-CD47 en subconjuntos de pacientes con SCLC.
Además, usando matrices completas de anticuerpos, identificamos varios antígenos en la superficie de muestras de SCLC que podrían ser diana de terapias con anticuerpos monoclonales. Usando la variante CV1 de alta afinidad de SIRPa, un antagonista de CD47 de próxima generación, descubrimos que el bloqueo de CD47 aumentaba la eficacia de los anticuerpos antitumorales para el SCLC, como se ha demostrado para otros cánceres. La combinación de variantes de SIRPa de alta afinidad con anticuerpos independientes de unión al tumor proporcionó una estrategia óptima para dirigirse a CD47 en el SCLC. El bloqueo de CD47 en la superficie del SCLC no fue suficiente para inducir la fagocitosis de macrófagos, sino que aumentó la fagocitosis de macrófagos cuando había anticuerpos de unión al SCLC. Los anticuerpos contra CD56, CD24 y CD99 resultaron eficaces para inducir la fagocitosis del SCLC, en particular cuando se combinaron con CV1.
Además, descubrimos que el bloqueo de CD47 podía mejorar la eficacia de lorvotuzumab, un anticuerpo que se está sometiendo a ensayos clínicos para el SCLC como un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) con el agente citotóxico mertansina. La combinación de anticuerpos terapéuticos con terapias de bloqueo de CD47 representa un método alternativo para aumentar la eficacia de los anticuerpos terapéuticos. Una de los beneficios de CV1 frente a los ADC es que puede combinarse con cualquier anticuerpo sin manipulación adicional. Los ADC dependen a menudo de la internalización para administrar su carga citotóxica, y esta dependencia puede limitar la eficacia y aumentar los efectos secundarios. Como el bloqueo de CD47 estimula a los macrófagos para que identifiquen células para su eliminación, puede haber una capa añadida de especificidad conferida por las interacciones célula-célula que la lograda por los ADC. No obstante, es probable que incluso el lorvotuzumab-mertansina pueda beneficiarse de la combinación con CV1 si se conserva la capacidad de acoplar con receptores Fc.
Nuestro enfoque para identificar nuevos antígenos de superficie del SCLC puede aplicarse a otros tipos de cáncer, y en el futuro podría usarse para ensamblar cócteles oligoclonales de anticuerpos que podrían usarse para simular la respuesta inmunitaria humoral natural contra patógenos o células extrañas. Estos cócteles podrían combinarse con terapias de bloqueo de CD47 y otras inmunoterapias para generar una respuesta inmunitaria eficaz contra las células del SCLC. Estos estudios demuestran que el SCLC responde a las terapias de bloqueo de CD47.
Materiales y métodos
Líneas celulares y cultivo: Se obtuvieron NCI-H82, NCI-524, NCI-H69 y NCI-1688 de la ATCC. Las células se cultivaron en RPM1-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone), 1x Glutamax (Invitrogen), y 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Las líneas celulares se cultivaron en suspensión (NCI-H82, NCI-524, NCI-H69) y se disociaron mediante pipeteo suave o incubación breve con 1x TrypLE (Invitrogen). Las células NCI-1688 se cultivaron en monocapas adherentes y o se eliminaron mediante incubación breve con 1x TrypLE. Las líneas celulares se cultivaron en incubadoras humidificadas a 37°C con un 5% de dióxido de carbono.
Diferenciación de macrófagos humanos: Las cámaras del sistema de reducción de leucocitos se obtuvieron de donantes de sangre anónimos en el Stanford Blood Center. Los monocitos se purificaron en un AutoMACS (Miltenyi) usando microperlas CD14+ o microperlas de sangre completa CD14+ (Miltenyi) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los monocitos CD14+ purificados se sembraron en placas de cultivo tisular de 15 cm a una densidad de 10 millones de monocitos por placa. Los monocitos se diferenciaron en macrófagos mediante cultivo en IMDM suplementado con 10% de suero AB humano (Invitrogen), 1x GlutaMax (Invitrogen), y 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina durante aproximadamente 7-10 días.
Ensayos de fagocitosis in vitro: Los ensayos de fagocitosis in vitro se realizaron como se ha descrito con anterioridad. Brevemente, las células cancerígenas de SCLC se retiraron de las placas y se lavaron con IMDM libre de suero. Como células diana se usaron células GFP-Iuciferasa+ o células marcadas con calceína AM (Invitrogen). Los macrófagos se lavaron dos veces con HBSS y luego se incubaron con 1x TrypLE durante aproximadamente 20 minutos en incubadoras humidificadas a 37°C. Los macrófagos se retiraron de las placas usando elevadores de células (Corning), luego se lavaron dos veces con IMDM libre de suero. Se llevaron a cabo reacciones de fagocitosis usando 50.000 macrófagos y 100.000 células tumorales. Las células se cocultivaron durante dos horas a 37°C en presencia de terapias con anticuerpos. Después del cocultivo, las células se lavaron con tampón de ejecución autoMACS (Miltenyi) y se prepararon para el análisis por citometría de flujo. Los macrófagos se tiñeron usando anticuerpos conjugados con fluoróforos contra CD45 (BioLegend) en presencia de 100 pg/ml de IgG de ratón (Lampire). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante tinción con DAPI (Sigma). Las muestras se analizaron por citometría de flujo usando un LSRFortessa (BD Biosciences) equipado con un muestreador de alto rendimiento. La fagocitosis se evaluó como el porcentaje de macrófagos calceína-AM+ usando FlowJo v9.4.10 (Tree Star) y se normalizó con respecto a la respuesta máxima de cada donante independiente cuando se indicó. Se determinó la significancia estadística y los datos se ajustaron a curvas sigmoidales de dosis-respuesta usando Prism 5 (Graphpad).
Los reactivos adicionales usados en la fagocitosis incluyen el monómero CV1 variante de SIRPa de alta afinidad, que se produjo como se ha descrito anteriormente y se usó a una concentración de 1 pM para el bloqueo. En los ensayos de fagocitosis usamos anticuerpos contra antígenos de SCLC identificados a una concentración de 10 pg/ml, incluyendo el clon HCD56 anti-CD56 (<n>C<a>M) (BioLegend), clon MEM-188 anti-CD56 (NCAM) (BioLegend), clon ML5 anti-CD24 (Biolegend), clon TS2/16 anti-CD29 (BioLegend), clon 12E7 anti-CD99 (Abcam). Además, el lorvotuzumab se elaboró de manera recombinante usando las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera disponibles en la base de datos KEGG (fármaco: D09927). Las regiones variables de lorvotuzumab se clonaron en pFUSE-CHIg-hG1 y pFUSE2-CLIg-hK (Invivogen) para su expresión. El lorvotuzumab se produjo recombinantemente mediante transfección transitoria de células 293F (Invitrogen) usando 293fectin (Invitrogen), seguido de purificación en una columna HiTrap Protein A (GE Healthcare). El anticuerpo purificado se eluyó con tampón citrato 100 mM (pH 3,0) y se neutralizó con 1/10° de volumen de tampón Tris (pH 8,0). El anticuerpo se desaló usando una columna PD-10 (GE Healthcare).
Clasificación de poblaciones de macrófagos después de la fagocitosis: Se combinaron 2,5 millones de macrófagos humanos con 5 millones de células NCI-H82 GFP+ y 10 pg/ml de anticuerpo anti-CD47 (clon Hu5F9-G4) en medio libre de suero y se incubaron durante dos horas. Los macrófagos se identificaron mediante tinción con anti-CD45, y las poblaciones de macrófagos se clasificaron en un clasificador celular FACSAria II (BD Biosciences). Las células de las poblaciones clasificadas se centrifugaron en portaobjetos de microscopio y luego se tiñeron con la tinción de Wright-Giemsa modificada (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se tomaron imágenes en un microscopio óptico vertical DM5500 B (Leica).
Ratones: Para todos los experimentos in vivo usamos ratones Nod.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). Los ratones se injertaron con tumores aproximadamente a las 6-10 semanas de edad, y los experimentos se realizaron con cohortes emparejadas por edad y sexo. Los ratones se mantuvieron en una instalación de barrera bajo el cuidado del Centro de Servicios Veterinarios de Stanford y se manipularon de acuerdo con protocolos aprobados por el Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford.
Modelos de tratamiento in vivo de SCLC: Injertamos por vía subcutánea 1,25x106 células NCI-H82 en los costados de ratones NSG. Los tumores se dejaron crecer durante 8 días, luego los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento con PBS o 250 pg de anticuerpo anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). El tratamiento se administró en días alternos mediante inyección intraperitoneal. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante mediciones de las dimensiones tumorales que se usaron para calcular los volúmenes tumorales de acuerdo con la fórmula del elipsoide (n/6xlongitudxanchura2). Para un modelo de xenoinjerto de SCLC derivado de paciente, se injertaron por vía subcutánea 3x106 células H29 GFP- Iuciferase+ con un 25% de Matrigel (BD Biosciences) en los costados de ratones NSG. Se dejó que los tumores crecieran durante 15 días y, a continuación, se asignó aleatoriamente a los ratones a grupos de tratamiento con PBS o con 250 pg de anticuerpo anti-CD47 (clon Hu5F9-G4). El tratamiento se administró en días alternos mediante inyección intraperitoneal. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante imagenología por bioluminiscencia y mediciones del volumen tumoral como se ha descrito anteriormente. La significancia estadística del crecimiento tumoral se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel-Cox. Se realizaron experimentos piloto in vivo con células H82 y células H29 en cohortes más pequeñas de ratones con resultados similares.
La fluorescencia GFP de los nódulos tumorales se visualizó en un microscopio de disección fluorescente M205 FA (Leica) equipado con una cámara DFC 500 (Leica).
Imagenología por bioluminiscencia: Se obtuvieron imágenes de ratones portadores de tumores GFP-Iuciferasa+ como se ha descrito anteriormente. Brevemente, a los ratones anestesiados se les inyectaron 200 pl de sal potásica de D-luciferina (luciérnaga) (Biosynth) reconstituida a 16,67 mg/ml en PBS estéril. La imagenología por bioluminiscencia se realizó usando un IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences) durante 20 minutos para registrar la irradiación máxima. Los valores máximos de flujo total se evaluaron a partir de la región anatómica de interés usando Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences) y se usaron para el análisis.
Cribado completo de anticuerpos basado en FACS: Los antígenos en la superficie de las muestras de SCLC se analizaron usando kits de cribado de células humanas LEGENDScreen (BioLegend), de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones. Brevemente, los anticuerpos liofilizados se reconstituyeron en agua de calidad de biología molecular y se añadieron a las muestras celulares a una dilución 1:8. Para el análisis se usaron aproximadamente 20-40x106 células totales por muestra de SCLC. El NCI-H82 se marcó con calceína-AM y se analizó simultáneamente con NCI-H524. El NCI-H69 se marcó con calceína-AM y se analizó simultáneamente con NCI-H1688. La muestra H69 del paciente primario se analizó de manera independiente. Se disoció en fresco de un xenoinjerto de bajo paso y las células de linaje de ratón se excluyeron del análisis mediante tinción con Pacific Blue anti-mouse H-2kd (BioLegend). Las muestras se incubaron con los anticuerpos durante 30 minutos en hielo protegidas de la luz. En todas las muestras, las células muertas se excluyeron del análisis mediante tinción con DAPI.
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un agente dirigido que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa, para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas en un paciente, mediante la administración de:
(i) el agente dirigido que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa en combinación con
(ii) un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón del paciente, en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina completa,
y en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es:
(a) un anticuerpo que se une específicamente a CD47,
(b) un anticuerpo que se una específicamente a la SIRPa, o
(c) un polipéptido de SIRPa soluble,
y en donde los uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón se seleccionan entre EpCAM, CD56, CD99 y CD44.
2. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón, para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas en un paciente, mediante la administración de:
(i) el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón en combinación con
(ii) un agente dirigido que bloquea selectivamente CD47 en las células de cáncer de pulmón del paciente uniéndose a SIRPa,
en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es:
(a) un anticuerpo que se une específicamente a CD47,
(b) un anticuerpo que se une específicamente a la SIRPa, o
(c) un polipéptido de SIRPa soluble,
y en donde los uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón se seleccionan entre EpCAM, CD56, CD99 y CD44.
3. El agente dirigido para el uso de la reivindicación 1 o el anticuerpo para el uso de la reivindicación 2, en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es un anticuerpo que se une específicamente a:
(i) CD47, o
(ii) SIRPa.
4. El agente dirigido para el uso de la reivindicación 1 o el anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2, en donde el agente que bloquea selectivamente la unión de CD47 a SIRPa es un polipéptido soluble de SIRPa.
5. El agente dirigido para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, o el anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el tratamiento comprende administrar la combinación de agentes simultáneamente.
6. El agente dirigido para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, o el anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el tratamiento comprende administrar la combinación de agentes secuencialmente.
7. El agente dirigido para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, o el anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el tratamiento comprende administrar la combinación de agentes en regímenes de dosificación superpuestos.
8. El agente dirigido para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7, o el anticuerpo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde el paciente es un humano.
9. El agente dirigido para el uso o el anticuerpo para el uso de la reivindicación 8, en donde los uno o más antígenos de la superficie celular de las células de cáncer de pulmón se seleccionan entre EpCam y CD44.
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