BRPI0901452A2 - métodos para o tratamento de leucemia mielóide aguda - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA O TRATAMENTO DE LEUCEMIA MIELóIDE AGUDA. Esta invenção relaciona-se à classificação de estágio, diagnóstico e tratamento de doenças cancerosas (ambos de tumores primários e metástases de tumor), particularmente a mediação de citotoxidade de células tumorosas; e mais particularmente ao uso de anticorpos monoclonais isolados, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, e/ou anticorpos modificadores de doença cancerosa (CDMAB), opcionalmente em combinação com um ou mais CDMAB, agentes quimoterapêuticos e conjugados dos mesmos, como um meio para iniciar uma resposta citotóxica às malignidades hematológicas humanas. A invenção ainda relaciona-se aos ensaios de ligação, que utilizam os anticorpos monoclonais isolados, fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, e/ou CDMAB da presente invenção, Os anticorpos modificadores de doença cancerosa podem ser conjugados às toxinas, enzimas, compostos radioativos, citocinas, interferons, porções repórter ou alvo e células hematogêneas.

Description

MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se ao diagnóstico e tratamentode malignidades hematológicas, tal como leucemia mielóideaguda. Mais particularmente, é relacionada ao uso deanticorpos de modificação de doença cancerosa (CDMAB),opcionalmente em combinação com um ou mais CDMAB/agentesquimioterapêuticos, como um meio para o tratamento de taisdoenças.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

A membrana celular contém muitas proteínas desuperfície celular diferentes, algumas em movimento ealgumas ancoradas ao citoesqueleto. Este grande repertóriode proteínas de superfície celular é capaz de executardiferentes funções, tais como sinalização e adesão. Étambém conhecido que certos tipos de proteínas de membranasão responsáveis pela organização dessas proteínas desuperfície celular em complexos capazes de funções unidasque não poderiam realizar como moléculas sozinhas. Estafamília emergente de proteínas, as tetraspaninas ou famíliatransmembrana 4 (TM4) de proteínas de membrana integrais,serve como um facilitador ou organizador molecular decomplexos multimoleculares.

As tetraspaninas tem sido implicadas em uma amplavariedade de processo fisiológicos, tais como ativaçãocelular imune, migração celular, fusão célula-célula(incluindo fertilização) e vários aspectos de diferenciaçãocelular. Essas moléculas tem sido também mostradas porterem um papel em doenças infecciosas (por exemplo,malária, hepatite C e vírus da imunodeficiência humana) evárias doenças genéticas são ligadas às mutações nessasmoléculas (por exemplo, retardo mental ligado a X,degeneração da retina e montagem incorreta de membranasbasais humanas no rim e pele) (Boucheix e Rubinstein. Cell.Mol. Life Sei. 58(9) :1189-1205 2001). A capacidade detetraspaninas de interagir com muitas outras moléculas desinalização e participar na ativação, adesão ediferenciação celular todas relacionadas a seu papel como"facilitadores moleculares" que unem grandes complexosmoleculares e permitem, através de estabilização, parafuncionar mais eficientemente. A interação de tetraspaninascom outras moléculas de sinalização é algumas vezesreferida como rede de tetraspanina.

Esta super família (TM4SF) foi primeiro reconhecido em1990, quando comparada das seqüências dos genesrecentemente clonados CD37, CD81 (TAPA-I) e sm23 como ogene associado a tumor CD63 (ME491) (Hotta e col. CâncerRes. 48 (11) :2955-2962 1988) revelou a homologia deseqüência e uma estrutura prevista conservada (Wright ecol. J. Immunol 144 (8) : 3195-3200 1990; Oren e col. Mol.Cell. Biol. 10(8) :4007-4015 1990). A família cresceu paraaproximadamente 32 membros em humanos (Lê Naour e col.Proteomics. 6 (24) :6447-54 2006).

CD9 é um membro de 24 kD desta família que é expressaem ambas as células hematopoiéticas e não hematopoiéticas.Especialmente altas concentrações de CD9 são expressas nasuperfície de plaquetas e células endoteliais (Forsyth KD.Immunology 72 (2) :292-296 1991; Jennings e col. Blood88 (10) :624a 1996). CD9 foi também recentemente descobertocomo sendo um membro da família de complexos moleculares desuperfície celular que inclui as integrinas, outrosreceptores de superfície celular e outras tetraspaninas.Vários membros da família TM4, incluindo CD9, foramdescobertos por estarem associados com βΐ integrinas, bemcomo com β2, £3, e β7 integrinas (Rubinstein e col. Eur. J.Immunol. 24 (12) : 3005-3013 1994; Nakamura e col. J. CellBiol. 129 (6) :1691-1705 1995; Berditchevski e col. Mol.Biol. Cell. 7(2):193-207 1996; Radford e col. Biochem.Biophys. Res. Commun. 222(1):13-28 1996; Hadjiargyrou ecol. J. Neurochem 67 (6) :2505-2513 1996; Slupsky e col. EurJ Biochem 244 (1) :168-175 1997).

Com base na análise de seqüência de cDNA, os membrosTM4SF são previstos de serem cadeias simples depolipeptídeo com quatro regiões transmembrana (TM)putativas hidrofóbicas e duas alças extracelulares (EC) comambos terminais carbóxi e amino localizadosintracelularmente. 0 alinhamento de todas as seqüências deaminoácido de tetraspanina revelou que grande parte dahomologia entre tetraspaninas é confinada aos domíniostransmembrana, que contém poucos aminoácidos polaresaltamente conservados (uma asparagina em TMl e um glutamatoou glutamina em TM3 e TM4) . Esses resíduos carregadosdentro da membrana podem interagir um com o outro e podemser importantes para a estabilidade da montagem daproteína, e tem sido demonstrado para o receptor de célulaT (Cosson e col. Nature 351(6325):414-416 1991).

Há também vários resíduos hidrofóbicos conservados nosquatro domínios transmembrana; alguns em TM2 sãodescobertos em seqüências tetraspaninas 17/18. A regiãocurta entre TM2 e TM3 contém dois a três resíduoscarregados, incluindo um ácido glutâmico conservado. Estashomologias não são divididas com outras fampilias deproteínas que também tem quatro domínios transmembrana,tais como os canais de íon ligante dependente, conexinas,ou CD20/FcERII3.

A conservação entre resíduos observada em domíniostransmembrana putativos e certos resíduos nas alças EC,sugere que essas proteínas realizam funções proximamenterelacionadas (Maecker e col. FASEB J 11 (6) : 428-442 1997).Há grande divergência de seqüência nas alças extracelularesde tetraspaninas, embora três cisteínas em EC2 estejamlocalizadas em distâncias definidas das regiões TM emmembros de família 16/18. Duas dessas cisteínas ocorrem emuma porção CCG conservada localizada aproximadamente 5 0aminoácidos após TM#. A terceira cisteína é freqüentementeseguida por uma glicina e é fixada em 11 aminoácidos amontante de TM4. A quarta cisteína conservada,freqüentemente encontrada em uma porção PXSC, évariavelmente colocada em EC2. Para alguns membros dessafamília o uso de agentes redutores afeta seu reconhecimentopelos anticorpos indicando que ligações de dissulfitoocorrem. Quais cisteínas estão envolvidas é desconhecido,mas pelo menos dois dos resíduos conservados no EC2 sãoimplicados na ligação dissulfito (Tomlinson e col. Eur JImmunol 23 (1) :136-140 1993).

A maioria das tetraspaninas são modificadas por N-glicosilação, algumas são varialvelmente glicosiladas ouaciladas, tal como CD9 (Seehafer e col. Biochim BiophysActa 957 (3) :399-410 1998). Os padrões de glicosilação entrediferentes teraspaninas variam amplamente. CD9 contém umsítio de glicosilação em ECl (Boucheix e col. J Biol Chem266 (1) :117-122 1991), enquanto a maioria das outrastetraspaninas glicosiladas contém sítios em EC2 (Classon ecol. J Exp Méd 169 (4) : 1497-1502) . Dentre os membrosindividuais, entretanto, a maioria dos sítios deglicosilação é conservada entre as espécies. Por exemplo,os CD9 de camundongo, rato, primatas e vaca todos temsítios de glicosilação únicos idênticos, enquanto amolécula de felinos perdeu esse sítio.

0 padrão de expressão de algumas dessas proteínas temdistribuição de tecido proximamente ubíqua (CD9, CD63,CD81, CD8 2) enquanto outras são altamente restritas, porexemplo, para células linfõides e mielóides (CD53) oucélulas B maduras (CD3 7). Alguns membros parecem seraltamente expressos no sistema imune; mais recentemente,sua expressão no sistema nervoso também tem sido apreciada.CD9 é expresso transitoriamente motoneurônios espinhais emdesenvolvimento e outros sítios do sistema nervosoperiférico e central fetal (Tole e Patterson, Dev Dyn197 (2) :94-107 1993). Está presente em tecidoshematopoiéticos fetal e embriônico (Abe e col. NipponKetsueki Gakkai Zasshi. 1989 52(4):712-20 1989; Abe J. ClinImmunol Immunopathol. 1989 51(1):13-21 1989) e é tambémexpresso durante o desenvolvimento de célula B (Boucheix ecol. J Biol Chem 266(1) :117-122 1991).

A interação de CD9 com {31 integrinas, bem como com J32,β3, e £7 integrinas em particular, sugere que a expressãode CD9 pode influenciar muitas das mesmas funções celularesque tem sido atribuídas ãs integrinas. CD9 e outrastetraspaninas tem sido relatadas por participarem naativação, adesão, e motilidade de células, bem como nocrescimento de células tumorosas e normais (Maecker e col.FASEB J 11 (6) :428-442 1997). Enquanto foi sugerido que osmembros da família TM4 servem como facilitadoresmoleculares (Maecker e col. FASEB J 11 (6):428-442 1997),seu modo de influência pode variar entre células. Atransfecção de CD9 em células pré-B negativas CD9 poucomóveis (Raji) sub-regulou a motilidade dessas célulasatravés da fibronectina e laminina (Shaw e col.270(41):24092-24099 1995), enquanto a transfecção de CD9 emlinhagens celulares móveis, não linfóides sub-regulou suamotilidade a esses componentes de matriz extracelular(Ikeyama e col. J. Exp. Med. 177, 1231-1237 1993).

A fibronectina foi identificada como um ligantepotencial para CD 9 ao demonstrar ligação direta defibronectina para imobilizar CD9 de plaquetas e para CD9recombinante (Wilkinson e col. FASEB J. 9:A1500. 23 1995).Usando células CHO transfectadas com CD9 e falso, Cook ecol. compararam a adesão e dispersão dessas célulastransfectadas para imobilizar componentes de matrizextracelular, particularmente fibronectina. Eles mostraramque: (i) a expressão de superfície de CD9 modifica a adesãocelular de CHO e a morfologia dispersa na finronectina,(ii) a interação de fibronectina-célula CHO CD9 envolveprimariamente o segmento de fibronectina composto dodomínio de ligação HEP2/IIICS e (iii) A expressão de CD9subregula a produção de uma matriz de fibronectinapericelular. Estes dados claramente sugerem que a expressãode CD9 ectópico pode regular as interações de fibronectina-célula através da ligação de CD9 à regiões específicas nafibronectina e através da modulação de outras moléculas deligação de fibronectina, tal como a5bl (Cook e col. ExpCell Res. 251 (2) :356-371) .

Enquanto várias associações de tetraspaninas são agorarazoavelmente caracterizadas em termos de associação físicae funcional, outras permanecem controversas,particularmente as associação de tetrasponinas e receptoresde Fc (FcR) . Após a demonstração que anticorpos anti-CD9acionam a agregação plaquetária, foi reportado que osanticorpos induzem a associação de CD9 com a integrinaaIIb/βΙΙΙ (GPIIb/IIIa; CD4I/CD61) em plaquetas e que oacionamento de agregação de plaquetas é mediada porGPIIb/IIIa (Slupsky e col. J Biol Chem. 264 (21) :12289-122931989) . De fato, a injeção de anti-CD9 em macacos causatrombocitopenia letal dentro de 5 minutos de injeção, que éprevenida por pré-tratamento dos macacos anticorpos comanti-allb/p (Kawakatsu e col. Thromb Res. 70 (3) :245-2541993) . A ativação de plaqueta mediada por CD9, como aativação induzida por anticorpos anti-aIIb/βΙΙΙ, pode serbloqueada por anticorpos para FcyRII sugerindo que aativação é mediada por FcyRII. De fato, anticorpos paravárias proteínas plaquetárias, incluindo a tetraspaninaPETA-3, induz a agregação plaquetária que é inibida porbloqueio de receptor de Fc.

Entretanto, a grande maioria destes dados descreve umarelação indireta, pois os eventos de ativação celularresultam da coligação de tetraspaninas com FcR através daregião Fc de anticorpos antitetraspanina intactos. Esseevento é difícil de ter qualquer significância nafisiologia normal. 0 fato que tetraspaninas tem sidofreqüentemente identificadas como os alvos de anticorposque coligam FcR é sugestivo de uma relação espacial entreessas moléculas. A pletora de relatos de coligaçãotetraspanina-FcR tenha talvez trazido atenção para maisrelatos fisiologicamente relevantes que suportam essarelação, especificamente mostrando co-localização próximade tetraspaninas com FcR por imunof luorescência e co-imunoprecipitação (Higginbottom e col. 99 (4) :546-552 2000;Kaji e col. J Immunol 166 (5):3256-3265 2001). Tal interaçãofacilitaria o cruzamento de informações entre FcR emoléculas de adesão/sinalização na rede tetraspanina queteria clara significância fisiológica para plaqueta ebiologia celular imune. Essa associação de FcR comtetraspaninas tem efeitos funcionais importante estáimplícita pela demonstração de modulação dependente detetraspanina de sinalização FcR, ambas em complexos decoligação e independentemente de eventos de coligação.

Em câncer, estudos clínicos relataram uma ligaçãoentre níveis de expressão de tetraspanina e prognósticoe/ou metástase. CD9 foi inicialmente descrito na superfíciede células de leucemia Iinfoblástica aguda de linhagem-B(Kersey e col. J Exp Med. 153 (3):726-31 1981). É expressoem 90% de leucemias agudas de linhagem-B, e em 50% deleucemias mielóides agudas e leucemias linfóides crônicasde linhagem-B (Boucheix e col. Leuk Res. 9(5):597-6041985) . Em particular, CD9 é um marcador constante depromielocite aguda. A presença de superfície de CD9 poeservir como um prognóstico indicador do potencialmetastático de alguns cânceres (Ikeyama e col. J Exp Méd.77(5):1231-1237 1993; Miyake e col. Câncer Res.55 (18) :4127-4131 1995). De fato, um alto nível dos CD9 detetraspaninas e CD82/KAI-1 em células tumorosas estáassociado com o prognóstico favorável em cânceres de mama,pulmão, cólon, próstata e pancreático. Adicionalmente, umnível de expressão diminuído dessas moléculas estácorrelacionado com a metástase nesses cânceres (Boucheix eRubinstein. Cell Mol Life Sei. 58 (9) : 1189-1205 2001). Osníveis de CD9 estavam freqüentemente baixos em célulasobtidas das metãstases de linfonodo que em células de tumorde câncer de mama primário (Miyake e col. Câncer Res.55 (18) :4127-4131 1995). Adicionalmente, usando modelosexperimentais in vitro e in vivo, CD9 e CD82 mostraram agircomo "supressores de metástase" enquanto CD151 mostrouaumentar o potencial metastático (Boucheix e Rubinstein.Cell Mol Life Sei. 58 (9) :1189-1205 2001).

Dois estudos proteômicos recentes de composição derede de tetraspanina em tumor e metástase foram relatados(André e col. Proteomics 6 (5) : 1437-1449 2006; LE Naour ecol. Mol Cell Proteomics 5(5):845-857 2006). Esses doisrelatos foram ambos focados em câncer de cólon usando doismodelos celulares diferentes. Os modelos eram constituídosde linhagens de células derivadas tumores de cólonprimários e metástases dos mesmos pacientes. 0 primeiromodelo foi constituído pelas linhagens celulares SW480(tumor primário) e SW62 0 (metástase de linfonodo)(Leibovitz e col. Câncer Res 36(12):4562-4569 1976),disponível da American Type Culture Collection (ATCC). Oscomplexos de tetraspanina foram isolados após purificaçãopor imunoafinidade e as proteínas foram identificadas porEM usando LC-ESI-MA/MS e MALDI-FTICR.O segundo modelo foi constituído pelas três linhagenscelulares Isrecol (IS1, tumor primário), Isreco2 (IS2,metástase de fígado), e Isreco3 (IS3, metástase peritoneal)(Cajot e col. J Biol Chem. 274 (45) :31903-31908 1997). Nesteestudo, as células foram lisadas com o detergente brandoBrij97 seguido por experimentos de imunoprecipitação doscomplexos contendo CD9. As proteínas associadas foram aindaeluidas usando o detergente mais rigoroso Triton X-100, quedissocia as associação de tetraspanina-tetraspanina. A fimde excluir ligações não específicas, experimentos deimunoprecipitação foram também realizados usando uma IgGlnão relacionada que foi tratada identicamente ao CD9 mAbs.

A identificação de proteína foi realizada porespectrometria de massa.

Uma análise comparativa de células de tumor primário emetástase nos dois modelos celulares mostrou que algumasproteínas foram diferencialmente detectadas. Para a maioriadessas proteínas, a expressão diferencial foi confirmadapor métodos quantitativos, tal como citometria de fluxo.

Variações importantes nos níveis de expressão de váriasmoléculas de adesão foram observadas, em particular,receptores da matriz extracelular, tal como receptores delaminina. De forma interessante, a integrina a6b4 foidetectada por EM somente em complexos contendo CD9 dasmetástases. Experimentos de imunoprecipitação e Westernblotting confirmaram que uma quantidade mais alta deintegrina a6b4 foi coimunoprecipitada com CD9 em metástasesde ambos modelos, apesar de um nível de expressão menor ousimilar na superfície celular. Portanto, isto sugere umrecrutamento específico da integrina a6b4 nos microdomíniosenriquecidos de tetraspanina durante a progressão do tumor.Em contraste, uma diminuição significante em outrosreceptores de laminina, tais como integrina a3bl e aproteína Ig Lu/B-CAM (luterana/molécula de adesão de célulaΒ) , foi observado em linhagens de células metastáticas dosmodelos celulares usados, bem como em várias outraslinhagens celulares metastáticas (André e col. Proteomica6(5):1437-1449 2006).

Outra molécula de adesão identificada por EM foi amolécula de adesão celular epitelial (EpCAM). Essa proteínaé expressa em muitos tecidos epiteliais humanos esuperexpressa na maioria de carcinomas epiteliais(Armstrong e Eck. Câncer Biol Ther. 2(4):320 -326 2003). Deforma interessante, foi demonstrado que EpCAM pode associardiretamente com o CD 9 de tetraspanina. Assim, umacolocalização substancial dessas duas moléculas no cólonnormal foi observada, enquanto o nível de colocalização foimenor em tumores primários e metástases (Le Naour e col.Mol Cell Proteomics 5(5):845-857 2006). Proteômicos tambémrevelaram a presença de proteases de membrana diferentes(isto é, CD26/dipeptidil peptidase 4 (DPPIV) expressasomente em algumas células metastáticas), bem como váriasmoléculas de sinalização em microdomínios enriquecidos detetraspanina. Essas descobertas podem iluminar a função detetraspaninas sugerindo que os microdomínios podem ter umpapel como uma plataforma para atividades enzimáticas etransdução de sinal.

Em outro estudo proteômico Gronborg e col. ,demonstraram o uso de marcação de isótopo estável comaminoácidos em método de cultura de célula (SILAC) paracomparar as proteínas secretadas (secretoma) das célulasderivadas de câncer pancreático cora aquelas células de dutopancreático não neoplásicas. Eles identificaram váriasproteínas que não foram correlacionadas previamente comcâncer pancreático, incluindo perlecan (HSPG2), antígenoCD9, receptor de fibronectina (integrina βΐ) , e uma novacitocina designada como previsto proteína de osteoblasto(FAM3C). Particularmente CD9 foi identificada por estarelevada no câncer versus normal por uma razão de 8. DevidoCD9 não ter sido previamente descrito sendo elevado emcâncer pancreático, eles realizaram estudos de validaçãopor imunohistoquímica (IHC) usando microarranjo de tecidode câncer pancreático (TMAs) . CD 9 foi expresso emdistribuição membranosa robusta em 7 de 18 (39%) decânceres pancreáticos no TMA com nenhuma expressão vista emparênquima pancreático normal adjacente (Gronborg e col.Mol Cell Proteomics. 5(1):157-171). A marcação de CD9demonstrou um padrão de acentuação luminal apical similarao padrão relatado previamente para outras proteínassecretadas em cânceres pancreáticos, tais como antígeno decélula tronco de próstata e mesotelina (Argani e col. ClinCâncer Res 7 (12) :3862-3868 2001; Argani e col. Câncer Res.61(11):4320-4324 2001). Além disso, a marcação de conteúdosintraluminais foi freqüentemente vista dentro de estruturasglandulares neoplásicas, consistente com a secreção de CD9.

Os dados de quantificação de nível de proteína obtidospelo método de SILAC foram comparados com os dados de mRNAobtidos por um experimento de microarranjo de DNA. 0antígeno CD9, que SILAC demonstrou ser diferencialmentesuperexpresso no secretoma de câncer pancreático e foiconfirmado como sendo superexpresso em nível de proteína,foi subregulado 2 vezes em células Pancl versus HPDEbaseado nos dados de microarranjo de DNA. Esses dadosreforçam a importância de avaliar ambos transcriptoma eproteoma de cânceres humanos (Gronborg e col. Mol CellProteomics. 5(1):157-171).

Em outro estudo, a expressão de CD9 foi examinada emtecidos de carcinoma gástrico metastático e primário. Nototal, espécimes de 78 pacientes foram usados paratingimento imuno-histológico e espécimes de 57 pacientesforam submetidos a Nothern blotting. A expressão de CD9 foiobservada em ambos nível de mensagem e nível de proteína emtecidos de carcinoma gástrico primário, tecidosmetastáticos de linfonodo, e tecidos de disseminaçãoperitoneal. A expressão de CD9 foi intensificada em áreascancerosas de cânceres gástricos em comparação com áreasnão cancerosas no mesmo paciente. Quando analisada pelostatus de malignidade com base no diagnóstico clínico-patológico, houve uma tendência que a expressão de CD9fosse observada em severa invasão de vasos, metástase delinfonodo ativa, e estágio avançado. Esses autoresconcluíram que a expressão de CD9 foi intensificada emtecido de câncer gástrico em comparação com tecidosnormais. A expressão de CD9 foi mais proeminente em câncergástrico avançado (Haruko e col. J Surg Res. 117(2):208-2152004).

0 papel de CD9 na progressão de carcinoma de próstatafoi também estudada (Wang e col. Clin Câncer Res.13 (8) :2354-2361 2007). A expressão de CD9 reduzida ouperdida dentro de células neoplásicas de próstata foiobservada em 24% de 107 adenocarcinomas primárioslocalizados clinicamente, 85% de 60 adenocarcinomasprimários avaçados clinicamente, 85% de 65 metástases delinfonodo e 65% de 23 metástases de osso. Essa redução naexpressão de CD9 foi associada a alterações de CD9 cDNA nãoobservadas em tecidos normais. Eles descobriram que todasas linhagens celulares derivadas de PC-3, uma PIN e quatrodeleções protegidas de adenocarcinomas prostáticos em seusCD9 cDNAs. Essas deleções removeram os nucleotídeos 115 a487, 190 a 585, 120 a 619 da seqüência de codificação de684 bp. Assim, da proteína CD9 de 228 aminoácidos, osaminoácidos 39 a 163, 64 a 195 ou 40 a 207 foram eliminadospor essas deleções. Essas deleções afetaram os grandesdomínios intracelular e extracelular da proteína. Apresença da deleção PC-3M-LN4 (deleção 65-195) foiconfirmada em sequenciamento direto do produto deamplificação de mRNA (sem clonagem). Essas deleções nãoforam detectadas em DNA genômico derivado de algumas dessasamostras, debatendo a existência de modificações de mRNA deCD9 transcricional. Outra deleção foi detectada na linhagemcelular DU145, enquanto uma inserção em quadro estavapresente no mRNA derivado de PC-3M-Pro4.

Por último, as mutações de ponto missense comum foramobservadas em uma linhagem celular de carcinoma prostático(PC-3M-LN4) , um espécime de PIN, e sete espécimes deadenocarcinoma prostático. Alguns espécimes estavamprotegendo mais de uma mutação missense. De formainteressante, a expressão de proteína CD9 não foi detectadana maioria dos casos (exceto em um espécime deadenocarcinoma prostático). Uma substituição de par de baseresultando em um novo códon de parada, localizado nosegundo domínio citoplasmático (aminoácido 83), estavatambém presente em um PIN e em dois pacientes de câncer depróstata onde eles não detectaram a proteína CD9. Embora aexpressão reduzida de proteína CD9 tenha sido associada coma progressão de câncer em diferentes tipos de tumor, esse éo primeiro trabalho implicando alterações de mRNA de CD9 nainativação da proteína CD9.

0 papel de CD9 em várias linhagens celulares tambémfoi investigado usando anticorpos monoclonais anti-CD9.Esses experimentos demonstraram efeitos na adesão eproliferação dependendo do tipo de célula e anticorpousado. Anticorpos anti-CD9 estimularam a retração decoágulo de fibrina por fibroblastos (Azzarone e col. J CellPhysiol. 125 (3) : 420-426 1985), a adesão homotípica induzidaem pré-B linfócitos (Masellis-Smith e col. J Immunol.144 (5) :1607-1613 1990), inibiu a motilidade de células deadenocarcinoma de pulmão (Miyake e col. Exp Méd.174 (6) :1347-1354 1991), aumentou a aderência de neutrófilosàs células endoteliais (Forsyth KD. Immunology 72(2):292-296 1991) e provocou fosfatidilinositol turnover,biossíntese de fosfatidilinositol e fosforilação proteína-tirosina em plaquetas humanas (Yatomi e col. FEBS Lett.322(3):285290 1993). Um anticorpo monoclonal anti-CD9,B2C11, promoveu a adesão de várias linhagens de célula deSchwann, células PC12 e células de Schwann de ratoprimárias (Hadjiargyrou e Patterson J Neurosci. 15(1 Pt2):574-583 1995). Além disso, esse anticorpo tambémestimulou a proliferação de uma das linhagens de célula deSchwann. Em outro artigo o mesmo grupo ainda demonstrou queoutro anticorpo monoclonal anti-CD9, SMRAI, melhorou amotilidade e migração em células de Schwann primárias queestá correlacionado com um aumento em cálcio efosfoproteínas citosólicos (Anton e col. J Neurosci. 15(1Pt 2):584-95 1994). Entretanto, nenhum desses anticorposforam relatados por terem sido testados em um modelo invivo de câncer humano.

Finalmente, um recente trabalho mostrou que aexpressão ectópica de CD9 em células de carcinoma de cólonresultou em adesão e inibição dependente de integrinamelhorada de crescimento celular. Consistente com estesefeitos, o tratamento dessas células com anticorposespecíficos anti-CD9 resultou em (i) adesão celular mediadapor integrina {31 aumentada através de um mecanismoenvolvendo o agrupamento de moléculas de integrina ao invésafinidade alterada; (ii) indução de mudanças morfológicascaracterizadas pela aquisição de um fenótipo celularalongado; (iii) inibição de proliferação celular com nenhumefeito significante na sobrevivência celular; (iv)expressão aumentada de TNF-a de membrana e finalmente (v)inibição da capacidade tumorigênica in vivo em camundongosnus. Além disso, através do uso de bloqueadores seletivosde TNF-a, demonstrou-se que essa citocina mediaparcialmente os efeitos anti-proliferativos de CD9 (OvalIee col. Int J Câncer. [Epub ahead of print] 2007) . Os doisanticorpos anti-CD9 testados in vivo, VJl/20 e PAINS-13,foram testados em um modelo xenoenxertado do tipoprofilático enquanto os anticorpos anti-CD9 divulgados aquitem demonstrado eficácia em ambos modelos xenoenxertadosestabelecidos, mais clinicamente relevantes, e profiláticosde câncer humano. Além disso, diferente de VJ1/20 ou PAINS-13, os anticorpos anti-CD9 divulgados aqui demonstrarameficácia in vivo em mais de um modelo xenoenxertado decâncer.

A leucemia mielóide aguda (AML) e um distúrbio clonalheterogêneo marcado pelo acúmulo de mieloblastos nãodiferenciados. A hierarquia leucêmica é continuamentepreenchida por raras células tronco Leucêmicasfuncionalmente distintas (LSCs) caracterizadas pela suacapacidade de se auto renovar, bem como sua habilidade degerar progenitores leucêmicos clonogênicos que ultimamenteproduzem grandes números de blastos leucêmicos. Muitosestudos relataram que LSCs de AML são quiescentes ou sedividem lentamente, enquanto progenitores clonogênicos sãorapidamente proliferados. LSCs em AML foram descobertos porserem as únicas células que iniciam e mantém a hierarquiade clones leucêmicos e portanto contribuem para aprogressão e reincidência de leucemia. Essa descobertasugere que uma cura permanente para AML requer a eliminaçãode LSCs. LSCs de AML são homólogas às HSCs normais emmuitas maneiras, incluindo um fenótipo CD34+CD38-, masmostram autorenovação melhorada e alguma expressãodiscordante de marcadores de superfície celular.

Uma estratégia para o desenvolvimento de terapiasdirecionadas à LSC é encontrar antígenos de superfíciecelular com atividades requeridas para a função de LSC.Regimes quimioterapêuticos antiproliferativos atuaistipicamente atingem esses progenitores de rápidaciclização, induzindo a remissão da doença. A reincidênciaé freqüente, entretanto, e <30% de adultos com AMLsobrevivem por um tempo, sugerindo que LSCs de AMLquiescente não são efetivamente erradicadas por terapiasatuais. Assim, há uma grande necessidade para novasterapias que eliminam LSCs de AML atingindo suaspropriedades específicas enquanto deixam células troncohematopoiéticas normais (HSCs) virtualmente não afetadas.

Anticorpos Monoclonais como Terapia de Câncer: Cadaindivíduo que apresenta câncer é único e tem um câncer queé diferente dos outros cânceres como a identidade dessapessoa. Apesar disso, a terapia atual trata todos ospacientes com o mesmo tipo de câncer, no mesmo estágio, namesma maneira. Pelo menos 3 0% desses pacientes irá falharna primeira linha de terapia, assim levando às rodadasadicionais de tratamento e probabilidade aumentada de falhano tratamento, metástase, e por último, morte. Umaabordagem superior ao tratamento seria a customização deterapia para o indivíduo particular. A única terapia atualque se permite a customização é a cirurgia. A quimioterapiae tratamento por radiação não podem ser ajustados aopaciente, e a cirurgia por si própria, na maioria dos casosé inadequada para produção de curas.

Com o advento de anticorpos monoclonais, apossibilidade de desenvolver métodos para terapiacustomizada se torna mais real, já que cada anticorpo podeser direcionado a um único epítopo. Adicionalmente, épossível produzir uma combinação de anticorpos que sãodirecionados à constelação de epítopos que definemunicamente um tumor do indivíduo particular.

Tendo reconhecido que uma diferença significante entrecélulas normais e cancerosas é que as células cancerosascontém antígenos que são específicos às célulastransformadas, a comunidade científica há muito tempomontem que anticorpos monoclonais podem ser projetados paraatingir especificamente células transformadas se ligandoespecificamente a esses antígenos de câncer; assim,surgindo a crença que anticorpos monoclonais podem servircomo "Balas Mágicas" para eliminar células cancerosas.Entretanto, é agora amplamente reconhecido que nenhumanticorpo monoclonal sozinho pode servir em todos os casosde câncer, e que anticorpos monoclonais podem serdispostos, como uma classe, como tratamentos de câncerdirecionados. Anticorpos monoclonais isolados de acordo comos ensinamentos da presente invenção divulgada mostrarammodificar o processo de doença cancerosa em uma maneira queé benéfica ao paciente, por exemplo, reduzindo a carga dotumor, e será variavelmente referido aqui como anticorposmodificadores de doença cancerosa (CDMAB) ou anticorpos"anticâncer".

No momento, o paciente de câncer normalmente tempoucas opções de tratamento. A abordagem regimentada àterapia de câncer produziu melhoras na sobrevivência globale taxas de morbidade. Entretanto, ao indivíduo particular,essas estatísticas melhoradas não necessariamente secorrelacionam com uma melhora em sua situação pessoal.

Assim, se uma metodologia fosse estabelecida quepermitiria o profissional tratar cada tumorindependentemente de outros paciente no mesmo coorte, issopermitiria a única abordagem de terapia ajustada parasomente essa pessoa. Tal curso de terapia, idealmente,aumentaria a taxa de curas, e produzir melhores resultados,desse modo satisfazendo uma necessidade antiga.

Historicamente, o uso de anticorpos policlonais temsido feito com sucesso limitado no tratamento de câncereshumanos. Linfomas e leucemias tem sido tratadas com plasmahumano, mas houve poucas respostas e remissões prolongadas.

Adicionalmente, houve uma falta de reprodutibilidade e nãohouve nenhum benefício comparado a quimioterapia. Tumoressólidos, tais como cânceres de mama, melanomas e carcinomasde célula renal também foram tratados com sangue humano,soro de chimpanzé, plasma humano e soro de cavalo comcorrespondentes resultados ineficazes e não previsíveis.

Houve muitos ensaios clínicos de anticorposmonoclonais para tumores sólidos. Nos anos 1980 houve pelomenos quatro ensaios clínicos para câncer de mama humanoque produziu apenas uma resposta de pelo menos 47 pacientesusando anticorpos contra antígenos específicos ou com baseem seletividade de tecido. Não foi até 1998 que houve umensaio clínico com sucesso usando um anticorpo anti-Her2/neu humanizado (Herceptina®) em combinação comCISPLATINA. Nesse ensaio 37 pacientes foram avaliados pararespostas das quais aproximadamente um quarto teve uma taxade resposta parcial e uma quarto adicional teve progressãode doença estável ou mínima. 0 tempo médio para progressãodentre as respostas foi 8,4 meses com a duração de respostamédia de 5,3 meses.

Herceptina® foi aprovada em 1998 para primeira linhade uso em combinação com Taxol®. Os resultados de estudoclínico mostraram um aumento no tempo médio para progressãode doença para aqueles que receberam a terapia de anticorpomais Taxol® (6,9 meses) em comparação ao grupo que recebeuTaxol® sozinho (3,0 meses). Também houve um leve aumento nasobrevivência média; 22 versus 18 meses para o ramo detratamento Herceptina® mais Taxol® versus o ramo detratamento de Taxol® sozinho. Além disso, houve um aumentono número e respostas completas (8 versus 2%) e parciais(34 versus 15%) no anticorpo mais grupo de combinação deTaxol® em comparação ao Taxol® sozinho. Entretanto, otratamento com Herceptina® e Taxol® levou a uma incidênciaelevada de cardiotoxicidade em comparação ao tratamento comTaxol® sozinho (13 versus 1% respectivamente. Também, aterapia com Herceptina® foi apenas eficaz para paciente quesuperexpressam (como determinado através de análiseimunohistoquímica (IHC)) o receptor 2 de fator decrescimento epidérmico humano (Her2/neu), um receptor queatualmente não tem função ou ligante biologicamenteimportante conhecidos; aproximadamente 25% de pacientes quetem câncer de mama metástatico. Portanto, há ainda umagrande necessidade não resolvida para pacientes com câncerde mama. Mesmo aqueles que podem se beneficiar dotratamento com Herceptina® ainda teriam que lidar com, pelomenos em algum grau, os efeitos colaterais desse tipo detratamento.

Os ensaios clínicos investigando câncer coloretalenvolvem anticorpos contra alvos de glicoproteína eglicolipídio. Anticorpos tal como 17-IA, que tem algumaespecificidade para adenocarcinomas, foram submetidos aosensaios clínicos de Fase 2 em mais de 60 pacientes comapenas 1 paciente tendo uma resposta parcial. Em outrosensaios, o uso de 17-IA produziu apenas 1 resposta completae 2 respostas menores dentre 52 pacientes em protocolosusando ciclofosfamida adicional. Até hoje, ensaios clínicosde Fase III de 17-IA não demonstraram eficácia melhoradacomo terapia adjuvante para câncer de cólon de estágio III.O uso de um anticorpo monoclonal de murino humanizadoinicialmente aprovado para mapeamento de imagem nãoproduziu a regressão de tumor.

Apenas recentemente houveram alguns resultadospositivos dos estudos clínicos de câncer coloretal com ouso de anticorpos monoclonais. Em 2004, ERBITUX® foiaprovado para a segunda linha de tratamento de pacientescom câncer coloretal metastático expressando EGFR que sãorefratários à quimioterapia com base em irinotecano.Resultados de um estudo clínico de Fase II de dois ramos eum estudo de único ramo mostraram que ERBITUX® emcombinação com irinotecano teve uma taxa de resposta de 23e 15% respectivamente com um tempo médio para progressão dedoença de 4,1 e 6,5 meses respectivamente. Os resultados domesmo estudo clínico de Fase II de dois ramos e outroestudo de único ramo mostrou que o tratamento com ERBITUX®sozinho resultou em uma taxa de resposta de 11 e 9%respectivamente com um tempo médio para progressão dedoença de 1,5 e 4,2 meses respectivamente.

Consequentemente em ambas Suíça e Estados Unidos, otratamento com ERBITUX® em combinação com irinotecano, enos Estados Unidos, o tratamento com ERBITUX® sozinho, foiaprovado como uma segunda linha de tratamento de pacientescom câncer de cólon que falharam a primeira linha deterapia com irinotecano. Portanto, como Herceptina®, otratamento na Suíça é apenas aprovado como uma combinaçãode anticorpo monoclonal e quimioterapia. Além disso, otratamento em ambos Suíça e Estados Unidos é apenasaprovado para pacientes como uma segunda linha de terapia.Também, em 2004, AVAS T IN® foi aprovado para o uso emcombinação com a quimioterapia baseada em 5-fluourouracilintravenosa como primeira linha de tratamento de câncercoloretal mestastático. Os resultados de estudo clínico deFase III demonstraram um prolongamento na sobrevivênciamédia de pacientes tratados com AVASTIN® mais 5-fluourouracil comparado aos pacientes tratados com 5-fluourouracil sozinho (20 meses versus 16 mesesrespectivamente). Entretanto, novamente como Herceptina® eERBITUX®, o tratamento é somente aprovado como umacombinação de anticorpo monoclonal e quimioterapia.

Também continuam a serem fracos os resultados paracâncer de pulmão, cérebro, ovário, pancreático, próstata eestômago. Os resultados mais promissores para câncer depulmão de célula não pequena vieram de um ensaio clínico deFase III onde o tratamento envolveu um anticorpo monoclonal(SGN-15; dox-BR96, anti-Sialyl-LeX) conjugado ao fármacoexterminador de célula doxorubicina em combinação com oagente quimioterapêutico TAXOTERE®. 0 TAXOTERE® é a únicaquimioterapia aprovada pelo FDA para a segunda linha detratamento de câncer de pulmão. Os dados iniciais indicamuma sobrevivência geral melhorada comparado ao TAXOTERE®sozinho. Dos 62 pacientes que foram recrutados para oestudo, dois terços receberam SGN-15 em combinação comTAXOTERE® enquanto o um terço restante recebeu TAXOTERE®sozinho. Para os pacientes recebendo SGN-15 em combinaçãocom TAXOTERE®, a sobrevivência geral média foi 7,3 meses emcomparação aos 5,9 meses para pacientes recebendo TAXOTERE®sozinho. A sobrevivência geral em 1 ano e 18 meses foi 2 9 e18% respectivamente para pacientes recebendo SNG-15 maisTAXOTERE® comparada a 24 e 8% respectivamente parapacientes recebendo TAXOTERE® sozinho. Ensaios clínicosadicionais são planejados.

Pré-clinicamente, houve sucesso limitado no uso deanticorpos monoclonais para melanoma. Muito poucos dessesanticorpos alcançaram os ensaios clínicos e até hoje nenhumfoi aprovado ou demonstrou resultados favoráveis em ensaiosclínicos de Fase III.

A descoberta de novas drogas para tratar a doença éimpedida pela falta de identificação de alvos relevantesdentre os produtos de 30.000 genes conhecidos que poderiamcontribuir para a patogênese da doença. Na pesquisaoncológica, alvos de fármacos potenciais são freqüentementeselecionados simplesmente devido ao fato que eles sãosuperexpressos em células tumorosas. Alvos assimidentificados são então avaliados para interação com umamultitude de compostos. No caso de terapias de anticorpopotenciais, esses compostos candidatos são geralmentederivados dos métodos tradicionais de geração de anticorpomonoclonal de acordo com os princípios fundamentaisestabelecidos por Kohler e Milstein (1975, Nature, 256,495-497, Kohler e Milstein). Células de baço são coletadasde camundongos imunizados com antígeno (por exemplo,células inteiras, frações de células e antígenospurificados) e fundidas com parceiros de hibridomaimortalizados. Os hibridomas resultantes são avaliados eselecionados para a secreção de anticorpos que se liga maisavidamente ao alvo. Muitos anticorpos de diagnóstico eterapêutico direcionados contra células cancerosas,incluindo Herceptina® e TITUXIMAB, tem sido produzidosusando esses métodos e selecionados com base em suaafinidade. As falhas nessa estratégia são duas.

Primeiramente, a escolha de alvos apropriados para aligação de anticorpo de diagnóstico e terapêutico élimitada pela paucidade de conhecimento envolvendo osprocessos carcinogênicos específicos de tecido e os métodossimplistas resultantes, tal como seleção porsuperexpressão, pelo qual esses alvos são identificados. Emsegundo lugar, a hipótese que a molécula de fármaco que seliga ao receptor com maior afinidade geralmente tem a maiorprobabilidade de iniciar ou inibir um sinal, pode semsempre ser o caso.

Apesar de avanços no tratamento contra leucemiamielóide aguda (AML), a sobrevivência a longo prazo depacientes com AML é ainda pouca devido à doença reincidir ea resistência a quimioterapia. As células tronco leucêmicas(LSCs) em AML foram descobertas por serem as únicas célulasque iniciam e mantém a hierarquia de clones leucêmicos eportanto, contribuem para a progressão e reincidência deleucemia. Essa descoberta sugere que uma cura permanentepara AML requer a eliminação de LSCs. Uma estratégia para odesenvolvimento de terapias direcionadas à LSC é encontrarantígenos de superfície celular com atividades requeridaspara a função de LSC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esse pedido utiliza a metodologia para produção deanticorpos anticâncer específicos para paciente ensinada napatente U.S. 6.180.357 para isolamento de linhagenscelulares de hibridoraa que codificam anticorpos monoclonaismodificadores de doença. Esses anticorpos podem ser feitosespecificamente para um tumor e assim torna possível acustomização de terapia de câncer. Dentro do contexto dessepedido, os anticorpos anticâncer tendo propriedades deextermínio celular (citotoxicidade) ou inibição decrescimento celular serão aqui em diante referidos comocitotóxicos. Esses anticorpos podem ser usados na ajuda dediagnóstico e classificação de um câncer, e podem serusados para tratar metástases de tumor. Esses anticorpospodem também ser úteis para a prevenção de câncer por meiode tratamento profilático. Diferentes anticorpos gerados deacordo com os paradigmas de descoberta de fármacotradicionais, anticorpos gerados dessa forma podemencontrar moléculas e vias não previamente mostradas comosendo integrais ao crescimento e/ou sobrevivência de tecidomaligno. Adicionalmente, as afinidades de ligação dessesanticorpos são adequadas às exigências para início doseventos citotóxicos que podem não ser conduzidos parainterações de afinidade mais forte. Também, está dentro doâmbito dessa invenção conjugar modalidadesquimioterapêuticas padrões, por exemplo radionuclídeos, como CDMAB da presente invenção, desse modo focando o uso dosreferidos quimioterapêuticos. O CDMAB pode também serconjugado à toxinas, porções citotóxicas, enzimas, porexemplo, enzimas conjugadas a biotina, citocinas,interferons, porções repórter ou alvo ou célulashematogêneas, desse modo formando um conjugado deanticorpo. O CDMAB pode ser usado sozinho ou em combinaçãocom um ou mais CDMAB/agentes quimioterapêuticos.O prospecto de tratamento anticâncer individualizadotrará aproximadamente uma mudança no modo que um paciente étratado. Um provável cenário clínico é que a amostra detumor é obtida no momento de apresentação e armazenada.Dessa amostra, o tumor pode ser classificado de um painelde anticorpos modificadores de doença cancerosa existentes.O paciente será convencionalmente classificado em umestágio, mas os anticorpos disponíveis podem ser de uso emclassificação adicional do paciente. 0 paciente pode sertratado imediatamente com os anticorpos existentes, e umpainel de anticorpos específicos ao tumor pode serproduzido usando os métodos destacados aqui ou através douso de bibliotecas de exibição de fago em conjunto com osmétodos de rastreamento aqui divulgados. Todos osanticorpos gerados serão adicionados à biblioteca deanticorpos anticâncer, já que há uma possibilidade queoutros tumores possam carregar alguns dos mesmos epítoposcomo aquele que está sendo tratado. Os anticorposproduzidos de acordo com esse método podem ser úteis paratratar doença cancerosa em qualquer número de pacientes quetem cânceres que ligam a esses anticorpos.

Adicionalmente a esses anticorpos anticâncer, opaciente pode escolher receber as terapias recomendadasatualmente como parte de um regime multimodal detratamento. 0 fato que os anticorpos isolados através dapresente metodologia são células não cancerosas arelativamente não tóxicas permitindo combinações deanticorpos em doses altas para serem usadas, sozinhas, ouem conjunto com a terapia convencional. 0 índiceterapêutico alto também permitirá o re-tratamento em umaescala de tempo curta que deve diminuir a probabilidade deemergência de células resistentes ao tratamento.

Se o paciente é refratário ao curso inicial de terapiaou desenvolver metástases, o processo de geração deanticorpos específicos ao tumor pode ser repetido para re-tratamento. Adicionalmente, os anticorpos anticâncer podemser conjugados às células sangüíneas vermelhas obtidasdesse paciente e reinfundidas para o tratamento demetástases. Tem havido poucos tratamentos eficazes paracâncer metastático e metástases geralmente indicando umresultado fraco resultando em morte. Entretanto, cânceresmetastáticos são geralmente vascularizados e a liberação deanticorpos anticâncer por células sangüíneas vermelhas podeter o efeito de concentração de anticorpos no local dotumor. Mesmo antes das metástases, a maioria das célulascancerosas são dependentes do fornecimento de sangue dohospedeiro para sua sobrevivência e um anticorpo anticâncerconjugado às células sangüíneas pode ser efetivo contratumores in si tu também. Alternativamente, os anticorpospodem ser conjugados a outras células hematogêneas, porexemplo, linfõcitos, macrófagos, monócitos, células naturalkiller, etc.

Há cinco classes de anticorpos e cada uma estáassociada com uma função que é conferida pela sua cadeiapesada. Acredita-se geralmente que o extermínio de célulascancerosas por anticorpos nus é mediado através dacitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC). Porexemplo, anticorpos IgM e IgG2a de murino podem ativar ocomplemento humano pela ligação do componente C-I dosistema complemento, desse modo ativando a via clássica deativação de complemento que pode levar a Iise do tumor.Para anticorpos humanos os anticorpos ativantes decomplemento mais efetivos são geralmente IgM e IgGl.

Anticorpos murinos do isotipo IgG2a e IgG3 são eficazes emrecrutar células citotóxicas que tem receptores de Fc quelevarão à morte celular por monócitos, macrófagos,granulócitos e determinados linfócitos. Anticorpos humanosde ambos os isotipos IgGl e IgG3 mediam ADCC.

A citotoxicidade mediada através da região Fc requer apresença de células efetoras, seus receptorescorrespondentes, ou proteínas, por exemplo, células NK,células T e complemento. Na ausência desses mecanismosefetores, a porção Fc de um anticorpo é inerte. A porção Fcde um anticorpo pode conferir propriedades que afetam afarmacocinética de um anticorpo in vivo, mas in vitro não éoperacional.

Os ensaios citotóxicos sob os quais testamos osanticorpos não tem nenhum dos mecanismos efetores presente,e são realizados in vitro. Esses ensaios não tem célulasefetoras (NK, macrófagos, ou células T) ou complementopresente. Já que esses ensaios são completamente definidospelo que é adicionado junto, cada componente pode sercaracterizado. Os ensaios usados aqui contém apenas célulasalvo, meio e soros. As células alvo não tem funçõesefetoras, já que são células cancerosas ou fibroblastos.

Sem as células exógenas que tem propriedades de funçãoefetora não há elementos celulares que tem essa função. 0meio não contém complemento ou quaisquer células. Os sorosusados para suportar o crescimento das células alvo não tematividade de complemento como divulgado pelos vendedores.

Adicionalmente, em nossos laboratórios verificou-se apresença de atividade de complemento nos soros usados.Portanto, nosso trabalho evidencia o fato que os efeitosdos anticorpos são inteiramente devidos aos efeitos daligação de antígeno que é mediada através de Fab.

Efetivamente, as células alvo são vistas e interagidas comsomente Fab, já que não tem receptores para Fc. Embora, ohibridoma esteja secretando imunoglobulina completa que foitestada com as células alvo, a única parte daimunoglobulina que interage com as células é o Fab, que agecomo fragmentos de ligação de antígeno.

Com relação aos fragmentos de ligação de antígeno eanticorpos presentemente reivindicados, o pedido, comodepositado demonstrou citotoxicidade celular comoevidenciado pelos dados na Figura 1. Como indicado acima, ecomo aqui confirmado através de evidência objetiva, esseefeito foi inteiramente devido à ligação pelo Fab àscélulas tumorais.

Existe evidência ampla na técnica de anticorposmediando citotoxicidade devida à ligação direta doanticorpo ao antígeno alvo independente de mecanismosefetores recrutados pelo Fe. A melhor evidência para issosão experimentos in vitro que não tem célulassuplementares, ou complemento (para formalmente excluiresses mecanismos). Estes tipos de experimentos tem sidorealizados com imunoglobulina completa, ou com fragmentosde ligação de antígeno, tal como fragmentos F(ab')2· Nestestipos de experimentos, anticorpos ou fragmentos de ligaçãode antígeno podem diretamente induzir apoptose de célulasalvo, tal como no caso de anticorpos anti-Her2 e anti-EGFR,ambos os quais tem anticorpos que são aprovados pelo FDAdos EUA para comércio na terapia de câncer.

Outro mecanismo possível de morte de câncer mediadapor anticorpo pode ser através do uso de anticorpos quefuncionam para catalisar a hidrólise de várias ligaçõesquímicas na membrana celular e suas glicoproteínas eglicolipídios associados, chamados de anticorposcatalíticos.

Há três mecanismos adicionais de morte de célulacancerosa mediada por anticorpo. 0 primeiro é o uso deanticorpos como uma vacina para induzir o corpo a produziruma resposta imune contra o antígeno putativo que reside nacélula cancerosa. 0 segundo é o uso de anticorpos parareceptores de crescimento alvo e interferir com sua funçõesou subregular esse receptor, de modo que sua função sejaefetivamente perdida. 0 terceiro é o efeito de taisanticorpos na ligação direta de porções de superfíciecelular que podem levar a morte celular direta, tal comoligação de receptores de morte, tal como TRAIL Rl ou TRAILR2, ou moléculas de integrina, tal como alfa V beta 3 esimilares.

A utilidade clínica de um fármaco para câncer ébaseada no benefício do fármaco sob perfil de riscoaceitável para o paciente. Na terapia de câncer asobrevivência tem sido a mais procurada após o benefício,entretanto há vários outros benefícios bem reconhecidosalém do prolongamento de vida. Esses outros benefícios,onde o tratamento não afeta adversamente a sobrevivência,incluem alívio dos sintomas, proteção contra eventosadversos, prolongamento no tempo de recorrência ousobrevivência livre de doença, e prolongamento no tempo deprogressão. Estes critérios são geralmente aceitos e corposregulatórios, tal como o U.S. Food and Drug Administration(F.D.A.) aprovam fãrmacos que produzem esses benefícios(Hirschfeld e col. Criticai Reviews in Oncology/Hematology42:137-143 2002). Além desses critérios, é bem reconhecidoque há outros pontos que podem prever esses tipos debenefícios. Em parte, o processo de aprovação aceleradoconcedido pelo U.S. F.D.A. reconhece que há substitutos queprovavelmente irão predizer o benefício do paciente. Com ofinal do ano de 2003, houveram dezesseis fármacos aprovadossob esse processo, e desses, quatro foram totalmenteaprovados, isto é, estudos seguintes demonstraram benefíciodireto ao paciente como previsto pelos pontos substitutos.Um ponto importante para determinação dos efeitos dofármaco em tumores sólidos é a avaliação de carga de tumormedindo a resposta ao tratamento (Therasse e col. Journalof the National Câncer Institute 92 (3) :205-216 2000). Oscritérios clínicos (critérios RECIST) para tal avaliaçãoforam promulgados por Response Evaluation Criteria in SolidTumors Working Group, um grupo de experts internacionais emcâncer. Os fármacos com um efeito demonstrado na carga dotumor, como mostrado por respostas objetivas de acordo comos critérios RECIST, em comparação ao grupo controleapropriado tendem a, eventualmente, produzir benefíciodireto ao paciente. No pré-clínico estabelecer a carga detumor é geralmente mais direto para avaliar e documentar.Nesses estudos pré-clínicos podem ser traduzidos aosajustes clínicos, os fármacos que produzem sobrevivênciaprolongada em modelos pré-clínicos tem a maior utilidadeclínica antecipada. Análogos para produzirem respostaspositivas ao tratamento clínico, fármacos que reduzem acarga de tumor no ajuste pré-clínico podem também temimpacto direto significativo na doença. Embora, oprolongamento da sobrevivência é o mais procurado após oresultado clínico do tratamento com fármaco de câncer, háoutros benefícios que tem utilidade clínica e é claro que aredução da carga de tumor, que pode correlacionar ao atrasona progressão da doença, sobrevivência estendida ou ambos,podem também levar aos benefícios diretos e terem impactosclínicos (Eckhardt e col. Developmental Therapeutics:Successes and Failures of Clinicai Trial Designs ofTargeted Compounds, ASCO Educational Book, 3 9th AnnualMeeting, 2003, páginas 209-219).

Os presentes inventores descobriram previamente que oanticorpo monoclonal anti-CD9 AR40A746.2.3, é útil em umensaio de citotoxicidade e em um modelo animal de câncereshumanos sólidos. Adicionalmente, o antígeno AR40A746.2.3 éum alvo para um agente terapêutico, que quando administradopode reduzir a carga de tumor de um câncer humano sólidoexpressando o antígeno em um mamífero. 0 uso de CDMABAR40A746.2.3 e seus derivados, e fragmentos de ligação deantígeno do mesmo, e ligantes indutores de citotoxicidadedo mesmo, para encontrar seu antígeno para reduzir a cargade tumor de um câncer expressando CD9 em um mamífero foidemonstrado anteriormente, como o uso de AR40A746.2.3 paradetecção de CD9 em células cancerosas que podem ser úteispara o diagnóstico, previsão de terapia, e prognóstico demamíferos portando tumores que expressam esse antígeno.Foi descoberto agora que CD 9 é diferencialmentesuperexpresso em células tronco leucêmicas CD34+CD3 8-versus células tronco normais CD34+CD38- em um modelo invivo de AML inibe o crescimento leucêmico em animais deteste, e que esse efeito occorreu através da inibição dacélula tronco de câncer de AML humana que levou aocrescimento.

É um objetivo da invenção ensinar um método detratamento de malignidades hematológicas, tal como AMLusando CDMAB AR4 0A746.2.3.

É outro objetivo da invenção ensinar o diagnóstico demalignidades hematológicas, tal como AML usando CDMABAR4 0A74 6.2.3.

É um objetivo adicional da invenção ensinar o uso deCDMAB AR40A746.2.3 para o prognóstico ou classificação deestágio de malignidades hematológicas em mamíferos.

É um objetivo adicional da invenção ensinar o uso deCDMAB AR40A746.2.3 para a seleção de um paciente para otratamento de malignidades hematológicas.

Outros objetivos e vantagens dessa invenção setornarão aparentes da seguinte descrição em que sãoestabelecidos, por meio de ilustração e exemplo, certasmodalidades dessa invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 inclui histogramas FACS representativos deanticorpos AR40A746.2.3 direcionados contra células normaise leucêmicas CD34+CD3 8- humanas.

A Figura 2 compara a porcentagem de CD9 expressandoAML CD34+CD38- humano, ALL e sangue de cordão normal eleucêmica CML e amostras de medula adulta.A Figura 3 demonstra o efeito de AR40A746.2.3 nocrescimento de AML humano em um modelo murino. As linhashorizontais indicam a porcentagem média de células de AMLhumana nas medulas NOD/SCID. Os pontos de dados representammedidas de um camundongo.

A Figura 4 demonstra o efeito de AR4 0A74 6.2.3 nocrescimento de AML humana em receptores secundários. Aslinhas horizontais indicam a porcentagem média de célulasde AML humana na medula NOD/SCID. Os pontos de dadosrepresentam medidas de um camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em geral, as seguintes palavras,ou frases tem adefinição indicada quando usadas no resumo, relatóriodescritivo, exemplos e reivindicações.

0 termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo eespecificamente cobre, por exemplo, anticorpos monoclonaissozinhos (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas, eneutralizantes, anticorpos desimunizados, murinos,quiméricos ou hamanizados), composições de anticorpos comespecificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia simples,diacorpos, triacorpos, imunoconjugados e fragmentos deanticorpo (veja abaixo).

0 termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpossubstancialmente homogêneos, isto é, anticorpos individuaiscompreendendo a população são idênticos exceto porpossíveis mutações de ocorrência natural que podem estarpresentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonaissão altamente específicos, sendo direcionados contra umsítio antigênico único. Adicionalmente, em contraste aoanticorpo policlonal preparações que incluem diferentesanticorpos direcionados contra determinantes diferentes(epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contraum único determinante no antígeno. Além de suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosospelo fato que podem ser sintetizados descontaminados poroutros anticorpos. 0 modificador "monoclonal" indica ocaráter do anticorpo como sendo obtido de uma populaçãosubstancialmente homogênea de anticorpos, e não deve serconstruído como produção requerida do anticorpo porqualquer método particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem usados de acordo com a presenteinvenção podem ser feitos pelo método de hibridoma (murinoou humano) primeiramente descrito por Kohler e col. Nature256:495 (1975), ou feito por métodos de DNA recombinante(ver, por exemplo, US Pat. n° 4.816.567). Os "anticorposmonoclonais" podem também ser isolados das bibliotecas deanticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clacksone col., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks e col. J. Mol.Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção deum anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo aregião variável ou ligação de antígeno do mesmo. Exemplosde fragmentos de anticorpo incluem menos do que anticorposde comprimento total, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv;diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo decadeia simples; anticorpos de cadeia simples, moléculas deanticorpo de domínio simples, proteínas de fusão, proteínasrecombinantes e anticorpos multiespecíficos formados do(s)fragmento(s) de anticorpo.Um anticorpo "intacto"é um que compreende uma regiãovariável de ligação de antígeno, bem como um domínioconstante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes decadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes poderser domínios constantes de seqüência nativa (por exemplo,dompinios constantes de seqüência nativa humana) ouseqüência de aminoácidos variante dos mesmos.

Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma ou maisfunções efetoras.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínioconstante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactospodem ser atribuídos a diferentes "classes" . Há cincoclasses principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE,IgG, e IgM, e vários desses podem ser ainda divididos em"subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesadaque correspondem às diferentes classes de anticorpos sãochamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturasde subunidade e configurações tridimensionais de classesdiferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

As "funções efetoras" de anticorpo referem-se àquelasatividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma regiãoFc de seqüência nativa ou região Fc variante de seqüênciade aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funçõesefetoras de anticorpo incluem ligação de Clq,·citotoxicidade dependente de complemento; ligação dereceptor de Fe; citotoxicidade mediada por céluladependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; subregulação dereceptores de superfície celular (por exemplo, receptor decélula B, BCR), etc.A "citotoxicidade mediada por célula dependente deanticorpo" e "ADCC" refere-se a uma reação mediada porcélula em que células citotóxicas não especificas queexpressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, célulasNatural Killer (NK), neutrõfilos, e macrófagos) reconhecemanticorpos ligados em uma célula alvo e subseqüentementecausam a Iise da célula alvo. As células primárias paramediar ADCC, células NK, expressam FcyRIII somente,enquanto monõcitos expressão FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Aexpressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida naTabela 3 na página 4 64 de Ravetch e Kinet, Annu Ver.Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCCde uma molécula de interesse, um ensaio in vitro ADCC, talcomo descrito na Pat. US n° 5.500.362 ou 5.821.337 pode serrealizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluemcélulas mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) ecélulas Natural Killer (NK). Alternativamente, ouadicionalmente, a atividade de ADCC da molécula deinteresse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em ummodelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes e col.PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

As "células efetoras"são leucócitos que expressam umou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferivelmente,as células expressam em pelo menos FcyRIII e realizam afunção efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos quemediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneasperiféricas (PBMC) , células Natural Killer (NK) , monõcitos,células T citotóxicas e neutrófilos; com células PBMCs e NKsendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas deuma fonte nativa da mesma, por exemplo, do sangue ou PBMCscomo descrito aqui.

Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são usados paradescrever um receptor que se liga à região Fc de umanticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de seqüêncianativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a umanticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantesalélicas e alternativamente formas unidas dessesreceptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um"receptor ativante") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"),que tem seqüências de aminoácidos similares que diferemprimariamente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. 0receptor ativante FcyRIIA contém uma porção de ativaçãobaseada em tirosina de imunoreceptor (ITAM) em seu domíniocitoplasmãtico. O receptor de inibição FcyRIIB contém umaporção de inibição baseada em tirosina de imunoreceptor(ITIM) em seu domínio citoplasmãtico (ver revisão de M. inDaêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs sãorevistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Iwmunol. 9:457-92(1991); Capei e col. Immunomethods 4:25-34 (1994); e deHaas e col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). OutrosFcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro,são englobados pelo termo "FcR" aqui. 0 termo também incluio receptor neonatal, FcRn, que é responsável pelatransferência de IgGs maternas ao feto (Guyer e col. J.Immunol. 117:587 (1976) e Kim e col., Eur. J. Immunol.24:2429 (1994) ) .

A "citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC"refere-se à habilidade de uma molécula lisar um alvo napresença de complemento. A via de ativação de complemento éiniciada pela ligação do primeiro componente do sistemacomplemento (Clq) a uma molécula (por exemplo, umanticorpo) complexado com um antígeno cognato. Para avaliara ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo,côo descrito em Gazzano-Santoro e col., J. Immuno1. Methods202:163 (1996), pode ser realizado.

O termo "variável" refere-se ao fato que certasporções dos domínios variáveis diferem extensivamente naseqüência entre anticorpos e são usados na ligação eespecificidade de cada anticorpo particular para seuantígeno particular. Entretanto, a variabilidade não éigualmente distribuída através dos domínios variáveis deanticorpos. É concentrado em três segmentos chamadosregiões hipervariáveis ambos nos domínios variáveis decadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas de domínios variáveis são chamadas de regiõesde estrutura (FRs).Os domínios variáveis de cadeias leve epesada nativas cada compreende quatro FRs, amplamenteadotando uma configuração β-folha, conectados por trêsregiões hipervariáveis, que formam alças conectando, e emalguns casos formando parte da estrutura β-folha. Asregiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntasem proximidade por FRs e, com as regiões hipervariáveis dasoutras cadeias, contribuem para a formação do sítio deligação de antígeno de anticorpos (ver Kabat e col.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5° Ed.Public Health Service, National Institutes of HealthBethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estãodiretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a umantígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como aparticipação do anticorpo em citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC).

0 termo "região hipervariável" quando usado aquirefere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo quesão responsáveis pela ligação de antígeno. A regiãohipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidosde uma "região determinante de complementariedade" ou "CDR"(por exemplo, resíduos 24-34 (LI), 50-56(L2) e 89-97 (L3) odomínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat ecol. , Sequences of Proteins of Immunological Interestl 5aed. Public Health Service, National Institutes of HealthBethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alçahipervariável" (por exemplo, resíduos 2632(Ll), 50-52(L2) e91-96(L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32(Hl),53-55(H2) e 96-101(H3) no domínio variável de cadeiapesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Os resíduos de "Região de Estrutura" ou "FR" são aquelesresíduos de domínio variável além dos resíduos de regiãohipervariável como definido aqui. A digestão de papaína deanticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígenoidênticos, chamados fragmentos "Fab", cada com um únicosítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual,cujo nome reflete sua habilidade de cristalizarprontamente. 0 tratamento com pepsina rende um fragmentoF(ab')2 que tem dois sítios de ligação de antígeno e éainda capaz de reticular o antígeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umsítio de ligação de antígeno e reconhecimento de antígenocompleto. Essa região consiste de um dímero de um domíniovariável de cadeia pesada e cadeia leve em associação nãocovalente próxima. É nesta configuração que as três regiõeshipervariáveis de cada domínio variável interagem paradefinir um sítio de ligação de antígeno na superfície dodímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveisconferem especificidade de ligação de antígeno aoanticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (oumetade de um Fv compreendendo apenas três regiõeshipervariáveis específicas para um antígeno) tem acapacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em umaafinidade menor que o sítio de ligação inteiro. Osfragmentos Fab também contem o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada.

Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adiçãode poucos resíduos no terminal carbóxi do domínio CHl decadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região dearticulação de anticorpo. Fabi-SH é a designação aqui paraFab' em que o(s) resíduo (s) de cisteína dos domíniosconstantes carregam pelo menos um grupo tiol livre. Osfragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foramproduzidos como pares de fragmentos de Fab' que temarticulação de cisteína entre eles. Outros acoplamentosquímicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espéciede vertebrado pode ser atribuído a um dos dois tiposclaramente distintos, chamados kappa (κ) e lambda (Λ), combase nas seqüências de aminoácido de seus domíniosconstantes.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou"scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em queesses domínios estão presentes em uma única cadeia depolipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv aindacompreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vhe Vl que permitem o scFv formar a estrutura desejada para aligação de antígeno. Para uma revisão de scFv vejaPlückthun em Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se aos fragmentos deanticorpos pequenos com dois sítios de ligação de antígeno,que os fragmentos compreendem um domínio pesado variável(Vh) conectado ao domínio leve variável (Vl) na mesmacadeia de polipeptídeo (Vh-Vl) . Usando um ligante que émuito curto para permitir o pareamento entre os doisdomínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parearcom os domínios complementares de outra cadeia e criar doissítios de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritosmais inteiramente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161;e Hollinger e col. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448(1993).

O termo "triacorpos" ou "trímeros trivalentes" refere-se à combinação de três anticorpos de cadeia simples. Ostriacorpos são construídos com o terminal de aminoácido deum domínio Vl ou Vh, isto é, sem qualquer seqüêncialigante. Um triacorpo tem três cabeças Fv com ospolipeptídeos arranjados em uma forma cabeça-cauda cíclica.Uma conformação possível do triacorpo é planar com os trêssítios de ligação localizados em um plano em um ângulo de120 graus do outro. Triacorpos podem ser monoespecíficos,biespecíficos ou triespecíficos.Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado eseparado e/ou recuperado de um componente de seu ambientenatural. Os componentes contaminantes de seu ambientenatural são materiais que interfeririam com os usos dediagnóstico e terapêutico para o anticorpo, e pode incluirenzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo incluio anticorpo in si tu dentro de células recombinantes, já quepelo menos um componente do ambiente natural do anticorponão estará presente. Comumente, entretanto, o anticorpoisolado será preparado por pelo menos uma etapa depurificação.

Um anticorpo "que liga" um antígeno de interesse, porexemplo, antígeno CD9, é um capaz de ligar esse antígenocom afinidade suficiente, de modo que o anticorpo é útilcomo um agente de diagnóstico ou terapêutico para encontraruma célula expressando o antígeno. Onde o anticorpo está umque liga CD9, geralmente ligará preferencialmente CD9 comoo oposto de outros receptores, e não inclui ligaçãoacidental, tal como contato Fc não específico, ou ligaçãoàs modificações pós-traducionais comuns aos outrosantígenos e pode ser um que não faz significamente ligaçãocruzada com outras proteínas. Os métodos, para detecção deum anticorpo que liga um antígeno de interesse, são bemconhecidos na técnica e podem incluir, mas não sãolimitados aos ensaios, tais como FACS, ELISA celular eWetern blot.

Como usado aqui, a expressão "célula", "linhagemcelular", e "cultura de célula" são usadas permutavelmente,e tais designações podem incluir descendência. É tambémentendido que toda descendência pode não ser precisamenteidêntica em conteúdo de DNA, devido à mutações inadvertidase deliberadas. A descendência mutante que tem a mesmaatividade ou função biológica como previstas na célulaoriginalmente transformada são pretendidas.

"Tratamento ou tratar" refere-se a ambos tratamentoterapêutico e medidas preventivas ou profiláticas, em que oobjetivo é prevenir ou retardar (diminuir) o distúrbio oucondição patológica pretendida. Aqueles em necessidade detratamento incluem aqueles com o distúrbio, bem comoaqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles cujodistúrbio deve ser prevenido. Portanto, o mamífero a sertratado aqui pode ser diagnosticado como tendo o distúrbioou pode estar predisposto ou suscetível ao distúrbio.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se oudescrevem a condição fisiológica em mamíferos que étipicamente caracterizada pelo crescimento celulardesregulado ou morte. Exemplos de câncer incluem, mas nãosão limitados a, carcinoma, Iinfoma, blastoma, sarcoma eleucemia ou malignidades linfóides. Exemplos maisparticulares de tais cânceres incluem câncer de célulaescamosa (por exemplo, câncer de célula escamosaepitelial), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão decélula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena,adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão,câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer deestômago ou gástrico, incluindo câncer gastrointestinal,câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncerde ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma,câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncercoloretal, carcinoraa uterino ou endometrial, carcinoma deglândula salivar, câncer renal ou de rira, câncer depróstata, câncer vulval, câncer de tireóide, carcinomahepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, bem comocâncer de cabeça e pescoço.

As "malignidades heraatológicas" incluem, mas não sãolimitadas a, doenças, tais como Leucemia Mielóide Aguda(AML), Leucemia Linfocitária Crônica (CLL), LeucemiaMielóide Crônica (CML) e Mieloma Múltiplo.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químicoútil no tratamento de câncer. Exemplos de agentesquimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, tais comotiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™) , alquil sulfonatos,tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinastais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa;etileniminas e metilanelaminas incluindo altretamina,trietilenomelamina, trietilenofosforamida,trietilenotiofosforamida e trimetiloloraelamina; mostardasnitrogenadas, tais como clorambucil,clornafazinacolofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto de oxido de mecloretamina,melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina,trofosfamida, mostarda de uracila, nitrosureias, tais comocarmustina, clorozotocina, fotemustina, lomistina,nimustina, ranimustina; antibióticos, tais comoaclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina,carnomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina,daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina,marcellomicina, raitomicinas, ácido micofenólico,nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina,puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina,estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina,zorubicina; antimetabólicos, tais como metotrexato efluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais comodenopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato;análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina,doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrõgenos,tais como calusterona, dromostanolona, propionato,epitiostanol, mepitistano, testolactona; anti-adrenais,tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;complementos de ácido fólico, tal como ácido frolínico;aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácidoaminolevulxnico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno;edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona;elformitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitratodegálio; hidroxiureia; lentinano; Ionidamina; mitoguazona;mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet;pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida;procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; spirogermânio;ácido tenuazônico; tiaziquona; 2,2',2''~triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano;gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida;tiotepa; taxanos, por exemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) e docetaxel(TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulene Rorer, Antony, França);clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina;metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina ecarboplatina; vinblastina; platinio; etoposídeo (VP-6);ifosfamida; mitomicina C; raitoxantrona; vincristina;vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo;daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11;inibidor de topoisoraerase RFS 2000; difluorometilornitina(DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; esais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dequaisquer dos acima. Também incluído nesta definição sãoagentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir aação do hormônio nos tumores, tal como antiestrógenosincluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, aromataseinibindo 4(5)-imidazóis, 4-hidróxitamoxifeno, trioxifeno,ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston);e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida,bicalutamida, leuprolida, e goserelina; e sais, ácidos ouderivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dosacima.

"Mamífero" para finalidades de tratamento refere-se aqualquer animal classificado como mamífero, incluindohumanos, camundongos, camundongos SCID ou nus ou raças decamundongos, animais domésticos e de fazenda, e animais dêzoológico, de esporte ou de estimação, tais como ovelha,cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, omamífero aqui é humano.

"Oligonucleotídeos" são polideoxinucleotídeos de fitadupla ou simples, de curto comprimento que são quimicamentesintetizados por métodos conhecidos (tais como química defosfotriéster, fosfito, ou fosforamidita, usando técnicasde fase sólida, tal como descrito na EP 266.032, publicadaem 4 de maio de 1988, ou através de intermediários de H-fosfonato desoxinucleosídeo como descrito por Froehler ecol. Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986. São entãopurificados em géis de poliacrilamida.

De acordo com a presente invenção, formas"humanizadas" e/ou "quiméricas" de imunoglobulinas nãohumanas (por exemplo, murino) referem-se aos anticorpos quecontem imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias deimunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab,Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação deantígeno de anticorpos) que resultam na diminuição de umaresposta de anticorpo anticamundongo humano (HAMA),aticorpo antiquimérico humano (HACA) ou um anticorpo anti-humano humano (HAHA), comparado ao anticorpo original, econtém as porções requisito (por exemplo, CDR(s), região(s)de ligação de antígeno, domínio(s) variável(s) e em diante)derivadas da referida imunoglobulina não humana, necessáriapara reproduzir o efeito desejado, enquanto simultaneamenteretém as características de ligação que são comparáveis areferida imunoglobulina não humana. Para maior parte,anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas(anticorpo receptor) em que resíduos das regiõesdeterminantes complementares (CDRs) do anticorpo receptorsão substituídos por resíduos das CDRs de uma espécie nãohumana (anticorpo doador) tal como um camundongo, rato oucoelho tendo a especificidade, afinidade e capacidadedesejadas. Em alguns casos, os resíduos de região deestrutura (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídospor resíduos FR não humanos correspondentes.

Adicionalmente, o anticorpo humanizado pode compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nemnas seqüências de FR ou CDR importadas. Essas modificaçõessão feitas para adicionalmente refinar e otimizar odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizadocompreenderá substancialmente todas as regiões CDR quecorrespondem àquelas de uma imunoglobulina não humana etodos ou substancialmente todos os resíduos de FR sãoaqueles de uma seqüência consenso de imunoglobulina humana.

O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelomenos uma porção de uma região constante de imunoglobulina(Fc) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

Anticorpos "desimunizados" são imunoglobulinas que sãonão imunogênicas, ou menos imunogênicas, a uma dadaespécie. A desimunização pode ser conseguida através dealterações estruturais a um anticorpo. Qualquer técnica dedesimunização conhecida àqueles de habilidade na técnicapode ser empregada. Uma técnica apropriada para anticorposdesimunizantes é descrita, por exemplo, no WO 00/34317publicado em 15 de junho de 2000.

Um anticorpo que induz a "apoptose" é um que induz amorte programada de célula por quaisquer meios, ilustradospor, mas não limitados a ligação de anexina V, atividade decaspase, fragmentação de DNA, encolhimento celular,dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celulare/ou formação de vesícuias de membrana (chamadas corposapoptóticos).

Como usado aqui "citotoxicidade induzida poranticorpo" é entendida como o efeito citotóxico derivado dosobrenadante de hibridoma ou anticorpo produzido pelohibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso141204-01, um anticorpo humanizado do anticorpo monoclonalisolado produzido pelo hibridoma depositado com o IDAC como número de acesso 141204-01, um anticorpo quimérico doanticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridomadepositado com o IDAC com o número de acesso 141204-01,fragmentos de ligação de antígeno, ou ligantes deanticorpos dos mesmos, o qual o efeito não estánecessariamente relacionado ao grau de ligação.

A linhagem celular de hibridoma AR40746.2.3 foidepositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, com oInternational Depository Authority of Canadá (IDAC), Bureauof Microbiology, Health Canadá, 1015 Arlington Street,Winnipeg, Manitoba, Canadá, R3E 3R2, em 14 de dezembro de2004, sob o Número de Acesso 141204-01. De acordo com a 37CFR 1.808, os depositantes garantem que todas as restriçõesimpostas aqui na disponibilidade ao público dos materiaisdepositados serão irrevogavelmente removidas na concessãode uma patente. 0 depósito será substituído se odepositante não puder dispensar amostras viáveis.

Pelo presente relatório descritivo, as linhagenscelulares de hibridoma, bem como os anticorpos monoclonaisisolados que são produzidos dos mesmos, sãoalternativamente referidos pela sua designação interna,AR40A746.2.3 ou Designação Depositante, IDAC 141204-01.

Como usado aqui "ligante de anticorpo" inclui umaporção que exibe especificidade de ligação por pelo menosum epítopo do antígeno alvo, e que pode ser uma molécula deanticorpo intacta, fragmentos de anticorpo, e qualquermolécula tendo pelo menos uma região de ligação de antigenoou porção da mesma (isto é, a porção variável de umamolécula de anticorpo), por exemplo, uma molécula Fv,molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab').sub.2, umanticorpo biespecifico, uma proteína de fusão, ou qualquermolécula geneticamente projetada que especificamentereconhece e liga pelo menos um epítopo do antigeno ligadopelo anticorpo monoclonal isolado produzido pela linhagemcelular de hibridoma designada como IDAC 141204-01 (oantigeno IDAC 141204-01), um anticorpo humanizado doanticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridomadepositado com o IDAC com o número de acesso 141204-01, umanticorpo quimérico do anticorpo monoclonal isoladoproduzido pelo hibridoma depositado com o IDAC com o númerode acesso 141204-01 e os fragmentos de ligação de antigeno.

Como usado aqui "anticorpos modificadores de doençacancerosa" (CDMAB) refere-se aos anticorpos monoclonais quemodificam o processo de doença cancerosa em uma maneira queé benéfica ao paciente, por exemplo, pela redução de cargade tumor ou prolongamento de sobrevivência de indivíduosportando tumor, e ligantes de anticorpo dos mesmos.

Um "agente de ligação relacionado ao CDMAB", nosentido mais amplo, é entendido por incluir, mas nãolimitado a, qualquer forma de anticorpos humanos ou nãohumanos, fragmentos de anticorpos, ligantes de anticorpos,ou similares, que competitivamente se ligam à pelo menos umepítopo alvo de CDMAB.

Um "ligante competitivo" é entendido por incluirqualquer forma de anticorpos humanos ou não humanos,fragmentos de anticorpos, ligantes de anticorpos, ousimilares, que tenham afinidade de ligação por pelo menosum epítopo alvo de CDMAB.

Como usado aqui "região de ligação de antígeno"significa uma porção da molécula que reconhece o antigenoalvo.

Como usado aqui "inibe competitivãmente" significasendo capaz de reconhecer e ligar um sítio determinante aoqual o anticorpo monoclonal produzido pela linhagem celularde hibridoma designada como IDAC 141204-01 (o anticorpoIDAC 141204-01), um anticorpo humanizado do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 1412 04-01, um anticorpoquimérico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelohibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso141204-01, fragmentos de ligação de antígeno, ou ligantesde anticorpo do mesmo, é direcionado usando ensaios decompetição de anticorpo recíprocos convencionais. (BelangerL., Sylvestre C. e Dufour D. (1973), Enzyme linkedimmunoassay for alpha fetoprotein by competitive andsandwich procedures. Clinica Chimica Acta 4 8,15).

Como usado aqui "antígeno alvo" é o antígeno IDAC141204-01 ou porções do mesmo.

Como usado aqui, um "imunoconjugado" significaqualquer molécula ou CDMAB, tal como um anticorpoquimicamente ou biologicamente ligado as citotoxinas,agentes radioativos, citocinas, interferons, porçõesrepórter ou alvo, enzimas, toxinas, fármacos antitumor ouagentes terapêuticos. 0 anticorpo ou CDMAB pode ser ligadoa citotoxina, agente radioativo, citocina, interferon,porção repórter ou alvo, enzima, toxina, fármaco antitumorou agente terapêutico em qualquer localização ao longo damolécula como é capaz de se ligar a seu alvo. Exemplos deimunoconjugados incluem conjugados químicos de toxina deanticorpo e proteínas de fusão de toxina anticorpo.

Agentes radioativos apropriados para uso como agentesantitumor são conhecidos àqueles hábeis na técnica. Porexemplo, 1311 ou 211At é usado. Esses isótopos são ligadosaos anticorpos usando técnicas convencionais (por xemplo,Pedley e col., Br. J. Câncer 68, 69-73 (1993)).

Alternativamente, o agente antitumor que é ligado aoanticorpo é uma enzima que ativa um pró-fármaco. Um pró-fármaco pode ser administrado o qual permanecerá em suaforma inativa até que alcance o sítio de tumor onde éconvertido e sua forma de citotoxina uma vez que o complexode anticorpo é administrado. Na prática, o conjugadoanticorpo-enzima é administrado ao paciente e permitido serlocalizado na região do tecido a ser tratada. O pró-fármacoé então administrado ao paciente de modo que a conversão aofármaco citotóxico ocorra na região do tecido a sertratada. Alternativamente, o agente antitumor conjugado aoanticorpo é uma citocina, tais como interleucina-2 (IL-2),interleucina-4(IL-4) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). O anticorpo direciona a citocina ao tumor de modo que acitocina media o dano ou destruição do tumor sem afetaroutros tecidos. A citocina é fundida ao anticorpo ao níveldo DNA usando técnicas de DNA recombinante convencionais.Interferons podem também ser usados.

Como usado aqui, uma "proteína de fusão" significaqualquer proteína quimérica em que uma região de ligação deantígeno é conectada a uma molécula biologicamente ativa,por exemplo, toxina, enzima, proteínas fluorescentes,marcadores luminescentes, marcador de polipeptídeo,citocina, interferon, porção alvo ou repórter ou fãrmaco deproteína.

A invenção ainda contempla CDMAB da presente invençãoao qual porções alvo ou repórter são ligadas. As porçõesalvo são os primeiros membros de pares de ligação. Agentesantitumor, por exemplo, são conjugados aos segundos membrosde tais pares e são desse modo direcionados ao sítio onde aproteína de ligação de antígeno é ligada. Um exemplo comumde tal par de ligação é avidina e biotina. Em umamodalidade preferida, biotina é conjugada ao antígeno alvodo CDMAB da presente invenção, e desse modo fornece um alvopara um agente antitumor ou outra porção que é conjugada àavidina ou estreptavidina. Alternativamente, a biotina ououtra porção é ligada ao antígeno alvo do CDMAB da presenteinvenção e usada como um repórter, por exemplo, em umsistema de diagnóstico onde um agente de produção de sinaldetectável é conjugado â avidina ou estreptavidina.

Agentes de produção de sinal detectável são úteis invivo e in vitro para finalidades de diagnóstico. A agentede produção de sinal produz um sinal mensurável que édetectável por meios externos, geralmente a medida deradiação eletromagnética. Para a maior parte, o agente deprodução de sinal é uma enzima ou cromóforo, ou emite luzpor fluorescência, fosforescência ou quimiluminescência. Oscromóforos incluem corantes que absorvem luz na regiãovisível ou ultravioleta, e podem ser substratos ou produtosde degradação de reações catalisadas por enzima.

Além disso, incluído dentro do escopo da presenteinvenção está o uso do presente CDMAB in vivo e in vitropara métodos investigativos e de diagnóstico, que são bemconhecidos na técnica. A fim de realizar os métodos dediagnóstico como contemplado aqui, a presente invenção podeainda incluir kits, que contém CDMAB da presente invenção.

Tais kits serão úteis para a identificação de indivíduos emrisco de certo tipo de cânceres pela detecção desuperexpressão do antígeno alvo do CDMAB nas células detais indivíduos.

A fim de que a invenção aqui descrita possa ser maiscompletamente entendida, a seguinte descrição éestabelecida.

A presente invenção fornece CDMAB (isto é, IDAC1412 04-01 CDMAB, um anticorpo humanizado do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01, um anticorpoquimérico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelohibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso141204-01, fragmentos de ligação de antígeno, ou ligantesde anticorpo do mesmo) que especificamente reconhecem eligam o antígeno IDAC 141204-01.

O CDMAB do anticorpo monoclonal isolado produzido pelohibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso141204-01 pode ser qualquer forma contanto que tenha umaregião de ligação de antígeno que inibe competitivamente aligação imunoespecífica do anticorpo monoclonal isoladoproduzido pelo hibridoma IDAC 1412 04-01 a seu antígenoalvo. Assim, quaisquer proteínas recombinantes (porexemplo, proteínas de fusão em que o anticorpo é combinadocom uma segunda proteína, tal como um linfócito ou um fatorde crescimento inibitório de tumor) tendo a mesmaespecificidade de ligação que o anticorpo IDAC 141204-01dentro do escopo dessa invenção.

Em uma modalidade da invenção, o CDMAB é o IDACanticorpo 141204-01.

Em outras modalidades, o CDMAB pe um fragmento deligação de antígeno que pode ser uma molécula Fv (tal comouma molécula Fv de cadeia simples), uma molécula Fab, umamolécula Fab', uma molécula F(ab')2, uma proteína de fusão,um anticorpo biespecifico, um heteroanticorpo ou qualquermolécula recombinante tendo a região de ligação de antígenodo anticorpo IDAC 1412 04-01. 0 CDMAB da invenção édirecionado ao epítopo ao qual o anticorpo monoclonal IDAC141204-01 é direcionado.

O CDMAB da invenção pode ser modificado, isto é, pormodificações de aminoácido dentro da molécula, paraproduzir moléculas derivadas. A modificação química podetambém ser possível. Modificação por mutação direta,métodos de maturação de afinidade, exibição de fago mudançade cadeia pode também ser possível.

Afinidade e especificidade pode ser modificada oumelhorada por CDR mutante e/ou resíduos de triptofano defenilalanina (FW) e avaliação para sítios de ligação deantígeno tendo as características desejadas (por exemplo,Yang e col. J. Mol. Biol., (1995) 254:392-403). Uma forma éaleatorizar resíduos individuais ou combinações de resíduosde modo que em uma população de sítios de ligação deantígeno idênticos, subconjuntos de dois a vinteaminoãcidos são encontrados em posições particulares.Alternativamente, as mutações podem ser induzidas sobre umafaixa de resíduos por métodos PCR de sonda de erro (porexemplo, Hawkins e col. J. Mol. Biol., (1992) 226:889-96).Em outro exemplo, os vetores de exibição de fago contendogenes de região variável de cadeia leve ou pesada podem serpropagados em cepas mutantes de E.coli (por exemplo, Low ecol. J. Mol. Biol., (1996) 250:359-68). Esses métodos demutagênese são ilustrativos dos muitos métodos conhecidosao de habilidade na técnica.

Outra maneira para aumentar a afinidade dos anticorposda presente invenção é realizar a inversão de cadeia, ondea cadeia leve ou pesada é emparelhada aleatoriamente comoutras cadeias leves ou pesadas para preparar um anticorpocom maior afinidade. As várias CDRs dos anticorpos podemser também invertidas com as CDRs correspondentes em outrosanticorpos.

Moléculas derivadas reteriam a propriedade funcionaldo polipeptídeo, especialmente, a molécula tendo taissubstituições ainda permitirá a ligação do polipeptídeo aoantígeno IDAC 1412 04-01 ou porções do mesmo.

Estas substituições de aminoácido incluem, mas não sãonecessariamente limitadas a, substituições de aminoácidoconhecidas na técnica como "conservativas".

Por exemplo, é um princípio bem estabelecido dequímica de proteína que as substituições de aminoácido,intituladas "substituições de aminoácido conservativas",podem freqüentemente ser feitas em uma proteína sem alterara conformação ou a função da proteína.

Tais mudanças incluem substituir qualquer deisoleucina (!) , valina (V) , e leucina (L) por qualquerdesses aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) porácido glutâmico (E) e vice versa, glutamina (Q) porasparagina (N) e vice versa; e serina (S) por treonina (T)e vice versa. Outras substituições podem também serconsideradas conservativas, dependendo do ambiente doaminoácido particular e seu papel na estruturatridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) ealanina (A) podem freqüentemente ser permutáveis, comopodem alanina e valina (V). A metionina (M), que érelativamente hidrofóbica, pode freqüentemente serpermutãvel com leucina e isoleucina, e às vezes com valina.A lisina (K) e arginina (R) são freqüentemente permutáveisnas posições em que a característica significante doresíduo de aminoácido é sua carga e o pK diferentes dessesdois resíduos de aminoácido não são significantes. Aindaoutras mudanças podem ser consideradas "conservativas" emambientes particulares.

EXEMPLO 1

Ligação in vitro nas Células Tronco de AML

O anticorpo monoclonal AR40A746.2.3 foi produzido pelocultivo do hibridoma em frascos CL-1000 (BD Biosciences,Oakville, 0N) com coleções e replantio ocorrendo duasvezes/semana. Os procedimentos de purificação de anticorpopadrões com Fluxo Rápido de Sefarose 4 de Proteína G(Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) foram seguidos.Está dentro do escopo dessa invenção utilizar anticorposmonoclonais que são desimunizados, humanizados, quiméricosou de murino.

A ligação de AR40A746.2.3 às células CD34+CD38- de AMLleucêmicas e células CD34+CD38+ normais foi avaliada porcitometria de fluxo (FACS) . Uma amostra de paciente de AMLe 3 amostras de células normais foram testadas. As célulasCD34+CD3 8- foram obtidas de 2 amostras de sangue de cordãoou 1 amostra de medula adulta. Células sangüíneasperiféricas foram coletadas dos pacientes com AMLrecentemente diagnosticada após obter consentimentoinformado de acordo com os procedimentos aprovados peloResearch Ethics Board of the University Health Network(Toronto, ON) . Indivíduos foram diagnosticados com AML deacordo com os padrões das classificações Francesa-Americana-Britânica. Ambas células sangüíneas de cordãohumano obtidas de liberações completas e células de medulaadulta humana foram obtidas com o consentimento de doadoressadios de acordo com os procedimento aprovados peloResearch Ethics Board of the University Health Network(Toronto, ON) . Células sangüíneas mononucleares dospacientes e doadores normais foram isoladas porcentrifugação de gradiente de densidade Ficoll Hypaque eentão foram usadas logo ou criopreservadas em soro devitelo fetal contendo 10% de sulfoxido de dimetila. Se ascélulas estiverem congeladas, procedimentos dedescongelamento padrão foram seguidos antes do uso.

Para marcação de células leucêmicas CD34+CD38-,células de AML foram tingidas com anti-CD34-PE-cianina 5(Beckmaan-Coulter, Mississauga, ON) e anti-CD38-PE (Becton-Dickinson, Oakville, ON) . Quantidades de CD9 na superfíciecelular foram avaliadas com anticorpos Arius conjugados combiotina AR4 0A746.2 . 3 . As células marcadas por AR4 0A74 6.2.3foram detectadas por adição de anticorpos de estreptavidinaconjugados com aloficcocianina.

A Figura 1 apresenta perfis representativos deanticorpos AR40A746.2.3 se ligando a células de AML enormais. AR40A746.2.3 demonstraram ligação a 85,8% dascélulas CD34+CD3 8- da amostra de paciente com AML. Sas duasamostras sangüíneas de cordão normal e uma amostra demedula normal, a expressão de CD9 foi detectada em 9,9%,1,2% e 0% respectivamente. Esses dados demonstram que aexpressão de AR40A746.2.3 é diferencialmente expressada emcélulas CD34+CD3 8- normais versus leucêmicas, que por suavez demonstram que a expressão de CD9 é sobreregulada emcélulas tronco de câncer.

EXEMPLO 2

Ligação in vitro em Células Tronco AML, AML e CML

O Exemplo 1 demonstra que a expressão de CD 9 ésobreregulada em células tronco CD34+/CD38- de uma amostrade AML de paciente em comparação a várias amostras normais.Para determinar se a expressão de CD9 é sobreregulada emoutros tipos de leucemia além de AML, AR40A746.2.3 foitestado por FACS contra várias amostras de AML, ALL e CML ecomparadas às amostras sangüíneas de cordão e de medula. Asamostras foram obtidas como destacado no Exemplo 1. 0procedimento FACS foi o mesmo como o destacado acima. FACSfoi realizado em 7 AML, 3 ALL e 1 CML pacientes e foicomparado a 2 amostras de medula normais e 2 sangüíneas decordão normais.

A Figura 2 apresenta a porcentagem média de célulasCD34+CD38- que demonstraram a expressão de CD9 através devárias amostras de doador (normal) e paciente. Asporcentagens de amostra de paciente médias foram 57%, 55% e19% para AML, ALL e CML respectivamente. Para amostras demedula normais e sangüíneas de cordão normais, asporcentagens médias foram 0 e 5% respectivamente. Quatrodas 7 amostras de AML de paciente tiveram mais de 80% dascélulas tronco CD34+CD38- que também exibiram expressão deCD9. Esse dados ainda confirmaram que a expressão de CD9 éaumentada em células tronco de AML de paciente.s Alémdisso, demonstra que a expressão de CD9 é sobreregulada emoutras células tronco leucêmicas, incluindo ALL e CML.Juntos, esses dados demonstram que células troncoleucêmicas são CD34+CD38-CD9+.

EXEMPLO 3

Experimentos in vivo com células de AML humanaOs Exemplos 1 e 2 demonstram que CD9 pe superexpressoem células tronco de câncer CD34+CD38-. Para determinar autilidade do anticorpo AR40A746.2.3 anti-CD9 para otratamento de leucemia, AR40A746.2.3 foi testado em ummodelo de camundongo AML humano. Com referência a Figura 3,camundongos NOD/SCID fêmeas de 8-12 semanas foramirradiados subletalmente com 3,6 Gy antes de sereminjetados com 1 milhão de células cancerosas de AML humanaem 200-500 microlitros de solução de PBS injetadaintravenosamente na veia da cauda. Os camundongos foramaleatorizados divididos em 2 grupos de tratamento. Algunscamundongos foram perdidos antes do tratamento devido adose subletal de radiação. No 10° dia após a injeção, 20mg/kg de anticorpo teste AR40A746.2.3 ou controle tampãofoi administrado intraperitoneamente a cada coorte em umvolume de 3 00 microlitros após diluição da concentração dearmazenamento com um diluente que continha 2,7 mM de KCl, 1mM de KH2P04, 137 mM de NaCl e 20 mM de Na2HP04 . 0anticorpo foi injetado no 10° dia após a injeção e célulasde AML a fim de permitir o enxerto das células na medula docamundongo. As amostras de anticorpo e controle foram estãoadministradas duas vezes pó semana por quatro semanas. 0camundongos foram sacrificados no 40° dia após implantaçãocelular e a medula foi lavada para cultivar as células. Ascélulas de AML humana foram detectadas por FACS com o usode anticorpo CD45 anti-humano,anti-CD45-ficoeritina(Becton-Dickinson, Oakville, ON). Já que CD45 é um marcadorpan de células hematopoiéticas humanas, níveis de CD4 5foram medidos como um indicador do número de células AMLhumanas na medula de murino. IgG-ficoeritrina de camundongo(Becton-Dickinson, Oakville, 0N) foi usada como um controleisotípico. Um FACScalibur (Becton-Dickinson, Oakville, 0N)foi usado para a análise de citometria de fluxo.

Experimentos animais foram realizados de acordo com asorientações institucionais pela University HealthNetwork/Princess Margaret Hospital Animal Care Committee(Toronto, ON).

0 tratamento com AR40A746.2.3 reduziu a porcentagem decélulas AML humanas no modelo murino in vivo de AML humana.0 tratamento com anticorpo Arius AR40A746.2.3 reduziu aporcentagem média de células AML humanas de 20,2% nocamundongo não tratado para 3,3% no grupo tratado comAR40A746.2.3 (p=0,07, t-teste) (Figura 3).

Não houve sinais clínicos de toxicidade durante oestudo. A medida do peso corporal em intervalos regularesfoi substituída por bem estar e falha em prosperar. Nãohouve diferenças significantes no peso corporal entre osgrupos no final do período de tratamento. Em resumo,AR4 0A74 6.2.3 foi bem tolerado e diminui o crescimentoleucêmico nesse modelo murino de AML humana.

Experimento in vivo com células AML humanas

O Exemplo 3 demonstra que o tratamento com anticorpoanti-CD9 AR40A746.2.3 reduz o número de células AML namedula em comparação aos camundongos não tratados. Paradeterminar se AR4 0A74 6.2.3 está inibindo células troncocancerosas de AML humana que levam ao crescimento,transplante secundário em camundongos NOD/SCID foi feito. 0transplantes secundário pode ser usado como um teste deauto-renovação e pluripotência de células tronco de câncere normais (Hope e col. Nat. Immunol. 5:738-743 2004). Comreferência a Figura 4, medula dos camundongos receptoresprimários (o camundongo usado no Exemplo 3) foi colhida etransplantada em receptores secundários (na mesma maneiracomo destacado no Exemplo 3). Após 8 semanas, o percentualde células AML humanas na medula de NOD/SCID foideterminado (como destacado no Exemplo 3).

AR4 0A74 6.2.3 reduziu a porcentagem de células AMLhumanas nos receptores secundários. 0 tratamento com oanticorpo Arius AR40A746.2.3 significativamente reduziu aporcentagem média de células AML humanas de 14,5% noscamundongos não tratados para 3,3% no grupo tratado comAR4 0A74 6.2.3 (p<0,05, t-teste) (Figura4).

Em resumo, AR40A746.2.3 diminui o crescimentoleucêmico em ambos receptores primários e secundários dessemodelo murino de AML humana. Esses dados demonstraram que otratamento com o anticorpo anti-CD AR40A746.2.3 inibe ascélulas tronco cancerosas de AML, já que o crescimento deAML foi abolidos em receptores secundários. Observadosjuntos, esses dados demonstram que células troncoleucêmicas são CD34+/CD38-/CD9+ e que o tratamento com oanticorpo CD9 AR40A746.2.3 substancialmente reduz o númerode células tronco cancerosas sugerindo benefíciosfarmacológicos e farmacêuticos desse anticorpo para terapiaem outros mamíferos incluindo o homem. No total, essesdados demonstram que o antígeno AR40A746.2.3 é uma célulatronco cancerosa associada a antígenos e é expressa emcélulas tronco cancerosas humanas, e é um alvo de câncerpatologicamente relevantes.

O método de tratamento descrito aqui, particularmentepara cânceres, pode também ser realizado com administraçãode outros anticorpos ou agentes quimioterapêuticos. Porexemplo, um anticorpo contra EGFR, tal como ERBITUX®(cetuximab), pode também ser administrado, particularmentequando tratar câncer de cólon. Outros anticorpos para usocombinado incluem Herceptina® (trastuzumab) particularmentequando tratar câncer de mama, AVASTIN® particularmentequando tratar câncer de cólon e SGN-15 particularmentequando tratar câncer pulmão de célula não pequena. Aadministração do anticorpo da presente invenção com outrosanticorpos/agentes quimioterapêuticos pode ocorrersimultaneamente, ou separadamente, através da mesma rota oudiferente.

Os regimes de agente quimiterapêutico/outro anticorpoutilizados incluem qualquer regime acreditado serotimamente apropriado para o tratamento da condição dopaciente. Malignidades diferentes podem requere o uso deanticorpos antitumor específicos e agentesquimioterapêuticos específicos, que serão determinados emum paciente para base de paciente. Em uma modalidadepreferida da invenção, a quimioterapia é administradasimultaneamente com ou, mais preferivelmente, subseqüente aterapia de anticorpo. Deve ser enfatizado, entretanto, quea presente invenção não é limitada para qualquer métodoparticular ou rota de administração.

A preponderância de evidência mostra que AR40A746.2.3media efeitos anticâncer e prolonga a sobrevivência atravésda ligação de epítopos presentes em CD9. Foi mostrado (comodivulgado no Exemplo 13) que anticorpos AR40A746.2.3 podemser usados para imunoprecipitar o antígeno cognato dascélulas expressantes, tal como células BxPC-3. Além disso,poderia ser mostrado que AR40A746.2.3, AR4 0A74 6.2.3quimérica ou variantes humanizadas podem ser usadas nadetecção de células e/ou tecidos que expressam uma porçãoantigênica de CD9 que se liga especificamente aos mesmos,utilizando técnicas ilustradas por, mas não limitadas aFACS, ELISA celular ou IHC.

Como com o anticorpo AR40A746.2.3, outros anticorpoanti-CD9 poderiam ser usados para imunoprecipitar e isolaroutras formas do antígeno de CD9, e o antígeno pode tambémser usado para inibir a ligação desses anticorpos àscélulas ou tecidos que expressam o antígeno usando osmesmos tipos de ensaios.

Todas as patentes e publicações mencionadas nesserelatório descritivo são indicativas dos níveis daqueleshábeis na técnica a que a invenção pertence. Todas aspatentes e publicações são incorporadas aqui por referênciacom a mesma extensão como se cada publicação individualfosse indicada especificamente e individualmente para serincorporada por referência.Deve ser compreendido que quando uma determinada formada invenção for ilustrada, não deve ser limitada à formaespecifica ou arranjo de partes aqui descritas e mostradas.Será aparente àqueles hábeis na técnica que as váriasmudanças podem ser feitas sem partir do escopo da invençãoe a invenção não deve ser considerada limitada ao que émostrado e descrito no relatório descritivo.

Um hábil na técnica apreciará prontamente que apresente invenção está bem adaptada para realizar osobjetos e para obter as finalidades e vantagensmencionadas, bem como aqueles inerentes a esse. Quaisqueroligonucleotideos, peptídeos, polipeptideos, compostosbiologicamente relacionados, métodos, procedimentos etécnicas descritas aqui são presentemente representativasdas modalidades preferidas, são pretendidas serem deexemplo e não pretendidas como limitações no escopo. Asmudanças aqui e outros usos ocorrerão àquelas hábeis natécnica que são englobadas dentro do conceito inventivo dainvenção e definidas pelo escopo das reivindicaçõesapensas. Embora a invenção seja descrita em relação àsmodalidades preferidas especificas, deve-se compreender quea invenção como reivindicada não deve impropriamente serlimitada a tais modalidades específicas. Certamente, váriasmodificações das modalidades descritas para realizar ainvenção que são óbvias àqueles hábeis na técnica sãopretendidas estar dentro do escopo das seguintesreivindicações.

Claims (20)

1. Método para o tratamento de uma malignidadehematológica humana em um mamífero, em que a referidamalignidade hematológica humana expressa pelo menos umepítopo de um antígeno que liga especificamente aoanticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridomadepositado com o IDAC com o número de acesso 141204-01 ouum CDMAB do mesmo, que é caracterizado pelo fato de CDMABter uma habilidade de inibir competitivamente a ligação doreferido anticorpo monoclonal isolado a seu antigeno alvo,compreendendo a administração ao referido mamífero doreferido anticorpo monoclonal ou CDMAB do mesmo em umaquantidade eficaz para resultar em uma redução da carga doreferido tumor de mamífero.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a malignidade hematológica éselecionada do grupo consistindo de Leucemia Mielóide Aguda(AML) , Leucemia Linfocitária Crônica (CLL) , LeucemiaMielóide Crônica (CML) e Mieloma Múltiplo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é conjugado a uma porção citotóxica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxicaé um isótopo radioativo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é um anticorpo humanizado do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01 ou um fragmento deligação de antígeno produzido do referido anticorpohumanizado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é um anticorpo quimérico do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01 ou um fragmento deligação de antígeno produzido do referido anticorpohumanizado.

7. Uso de anticorpos monoclonais para o tratamento deuma malignidade hematológica humana em um mamífero,caracterizado pelo fato de que a referida malignidadehematológica expressa pelo menos um epítopo de um antígenoque liga especificamente ao anticorpo monoclonal isoladoproduzido pelo hibridoma depositado com o IDAC com o númerode acesso 141204-01 ou um CDMAB do mesmo, que o CDMAB écaracterizado por ter uma habilidade de inibircompetitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonalisolado a seu antígeno alvo, compreendendo a administraçãoao referido mamífero do referido anticorpo monoclonal ouCDMAB do mesmo em uma quantidade eficaz para resultar emuma redução da carga do referido tumor de mamífero.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo monoclonal isolado éconjugado a uma porção citotóxica.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a referida porção citotóxica é um isótoporadioativo.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é um anticorpo humanizado do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é um anticorpo quimérico do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01.

12. Método para o tratamento de uma malignidadehematológica humana em um mamífero, caracterizado pelo fatode que a referida malignidade hematológica humana expressapelo menos um epítopo de um antígeno que ligaespecificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzidopelo hibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso 141204-01 ou um CDMAB do mesmo, que o CDMAB é caracterizadopor ter uma habilidade de inibir competitivamente a ligaçãodo referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígenoalvo, compreendendo a administração ao referido mamífero doreferido anticorpo monoclonal ou CDMAB do mesmo; emconjunção com pelo menos um agente quimioterapêutico em umaquantidade eficaz para resultar em uma redução da carga doreferido tumor de mamífero.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado ou CDMAB é conjugado ao referido agentequimioterapêutico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o referido agentequimioterapêutico é uma porção citotóxica.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida porção citotóxicaé um isótopo radioativo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado ê um anticorpo humanizado do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01.

17. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal isolado é um anticorpo quimérico do anticorpomonoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado como IDAC com o número de acesso 141204-01.

18. Composição eficaz para o tratamento de umamalignidade hematológica humana caracterizada pelo fato decompreender em conjunção:um anticorpo monoclonal isolado produzido pelohibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso-141204-01; euma quantidade necessária de um veículofarmacologicamente aceitável;em que a referida composição ê eficaz para tratar areferida malignidade hematológica humana.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que ainda inclui um conjugado soreferido anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento deligação de antígeno do mesmo com um membro selecionado dogrupo consistindo de porções citotóxicas, enzimas,compostos radioativos, citocinas, interferons, porçõesrepórter ou alvo e células hematogêneas.

20. Kit de ensaio para detecção da presença de umamalignidade hematológica humana caracterizado pelo fato deque a referida malignidade hematológica humana expressapelo menos um epitopo de um antígeno que ligaespecificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzidopelo hibridoma depositado com o IDAC com o número de acesso141204-01 ou um CDMAB do mesmo, que o CDMAB é caracterizadopor ter uma habilidade de inibir competitivamente a ligaçãodo referido anticorpo monoclonal isolado a seu antígenoalvo, o kit compreendendo o anticorpo monoclonal isoladoproduzido pelo hibridoma depositado com o IDAC com o númerode acesso 141204-01 ou um CDMAB do mesmo, e meios paradetecção se o anticorpo monoclonal, ou um CDMAB do mesmo,está ligado a um polipeptídeo cuja presença, em particularnível limite, é diagnosticada da referida presença dareferida malignidade hematológica humana.