BRPI0807446A2 - Anticorpos modificantes de doenças cancerosa - Google Patents

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BRPI0807446A2
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David S F Young
Helen P Findlay
Susan E Hahn
Lisa A Popp
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Hoffmann La Roche
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS MODIFICANTES DE DOENÇAS CANCEROSA".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao isolamento e à produção de anticorpos modificantes do câncer (CDMAB) e ao uso desses CDMAB sozinhos ou em combinação com um ou mais CDMAB/agentes quimioterápicos nos processos terapêuticos e diagnósticos. A invenção refere-se ainda aos ensaios de ligação que utilizam o CDMAB da invenção imediata. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Anticorpos monoclonais como terapia do câncer: cada indivíduo que apresenta câncer é único e tem um câncer que é tão diferente de outros cânceres quanto à identidade daquela pessoa. Apesar disso, a terapia atual trata todos os pacientes com o mesmo tipo de câncer, no mesmo estágio, da mesma maneira. Pelo menos 30% destes pacientes não responderão ao tratamento inicial, levando assim a novas etapas de tratamento e ao aumento da probabilidade do seu insucesso, às metástases e, finalmente, à morte. Uma abordagem de alto nível do tratamento seria a personalização da terapia para o indivíduo em particular. A única terapia atual que se presta à personalização é a cirurgia. O tratamento de quimioterapia e de radioterapia não pode ser adaptado ao paciente e, a cirurgia por si só, na maioria dos casos, é inadequada para curá-lo.
Com o advento dos anticorpos monoclonais, a possibilidade de desenvolver métodos para a terapia personalizada se tornou mais realista, visto que cada anticorpo pode ser ligado a um único epítopo. Além disso, é possível produzir uma combinação de anticorpos que são ligados à constelação de epítopos que define especificamente o tumor de determinado indivíduo.
Reconhece-se que uma diferença significativa entre as células cancerosas e as células normais é que as células cancerosas contêm antígenos que são específicos para as células modificadas, a comunidade científica há muito tempo considerou que os anticorpos monoclonais podem ser desenhados para células-alvo especificamente modificadas pela ligação específica a estes antígenos cancerígenos; dando assim lugar à crença de que os anticorpos monoclonais podem servir como "Projéteis Mágicos" para eliminar as células cancerosas. Entretanto, hoje é reconhecido amplamente que nenhum anticorpo monoclonal único pode servir em todos os casos de 5 câncer e que os anticorpos monoclonais podem ser acionados, como uma classe, como tratamentos-alvo contra o câncer. Os anticorpos monoclonais isolados, de acordo com os ensinamentos revelados da imediata invenção, têm demonstrado modificar o processo canceroso de um modo que seja benéfico para o paciente, como por exemplo, reduzindo a carga tumoral, e que 10 serão referidos aqui de maneira variada como anticorpos modificantes do câncer (CDMAB) ou anticorpos "anticâncer".
Até o presente momento, o paciente com câncer tem geralmente poucas opções de tratamento. A abordagem dominante para o tratamento contra o câncer tem produzido melhorias na sobrevida global e nas taxas de 15 morbidade. Entretanto, para o indivíduo em particular, essas melhores estatísticas não se correlacionam necessariamente com uma melhoria na situação pessoal dos pacientes.
Assim, se uma metodologia que foi desenvolvida permitiu ao médico tratar cada tumor independentemente de outros pacientes, na mes20 ma coorte, isto permitiria uma abordagem exclusiva da terapia adequada apenas para uma pessoa. Este tipo da terapia aumentaria, idealmente, a taxa de cura e produziria melhores resultados, com isso satisfazendo uma necessidade sentida há muito tempo.
Historicamente, o uso de anticorpos policlonais tem sido utilizado 25 com sucesso limitado no tratamento de cânceres humanos. Linfomas e Ieucemias têm sido tratados com plasma humano, mas houve poucas remissões ou respostas prolongadas. Além disso, não houve reprodutibilidade ou qualquer benefício adicional comparado à quimioterapia. Tumores sólidos como cânceres de mama, melanomas e carcinomas de células renais tam30 bém têm sido tratados com sangue humano, soro de chimpanzé, plasma humano e soro de cavalo com resultados correspondentemente imprevisíveis e ineficazes. Têm sido realizados muitos ensaios clínicos de anticorpos monoclonais para tumores sólidos. Na década de 1980, houve pelo menos quatro ensaios clínicos de câncer de mama humano que produziu apenas uma resposta de pelo menos 47 pacientes usando anticorpos contra antígenos 5 específicos ou baseados na seletividade tecidual. Foi só em 1998 que houve um ensaio clínico de sucesso utilizando um anticorpo humanizado antiHer2/neu (Herceptin®) em combinação com a CISPLATINA. Neste ensaio, 37 pacientes foram avaliados para respostas das quais cerca de um quarto teve uma taxa de resposta parcial e um quarto adicional teve uma progres10 são menor ou estável da doença. O tempo médio de progressão entre aqueles que responderam foi de 8,4 meses, com uma duração média de resposta de 5,3 meses.
O Herceptin® foi aprovado em 1998 para o uso de primeira linha em combinação com Taxol®. Os resultados do estudo clínico mostraram um aumento no tempo médio de progressão da doença para aqueles que receberam a terapia com o anticorpo mais Taxol® (6,9 meses), em comparação ao grupo que recebeu só Taxol® (3,0 meses). Houve também um ligeiro aumento na sobrevida média; 22 versus 18 meses para a frente do tratamento Herceptin® mais Taxol®, versus a frente do tratamento só com Taxol®. Além disso, houve um aumento no número daqueles que responderam, completo (8 versus 2%) e parcial (34 versus 15%), no grupo de combinação anticorpo mais Taxol® em comparação apenas ao Taxol®. Entretanto, o tratamento com Herceptin® e Taxol® levou a uma maior incidência de cardiotoxicidade em comparação ao tratamento apenas com Taxol® (13 versus 1%, respectivãmente). Além disso, a terapia com Herceptin® foi eficaz apenas para os pacientes que superexpressam (como determinado através da ensaio de imuno-histoquímica (IHQ)) o fator de crescimento epidérmico humano receptor-2 (Her2/neu), um receptor que atualmente não tem função definida ou um Iigante biologicamente importante; aproximadamente 25% dos pacientes que têm câncer de mama metastático. Portanto, ainda há uma grande necessidade não atendida para os pacientes com câncer de mama. Mesmo aqueles que podem se beneficiar do tratamento com Herceptin® ainda precisariam da quimioterapia e, conseqüentemente, ainda teriam que lidar, pelo menos até certo ponto, com os efeitos colaterais deste tipo de tratamento.
Os ensaios clínicos que investigam o câncer colorretal envolvem anticorpos contra ambos os alvos da glicoproteína e do glicolipídio. Anticor5 pos, como o 17-1 A, que têm alguma especificidade para adenocarcinomas, foram submetidos a ensaios clínicos de Fase 2 em mais de 60 pacientes com apenas 1 paciente tendo uma resposta parcial. Em outros ensaios, o uso do 17-1A produziu apenas 1 resposta completa e 2 respostas menores entre os 52 pacientes em protocolos usando adição de ciclofosfamida. Até 10 agora, os ensaios clínicos de Fase Ill do 17-1A não demonstraram um aumento de eficácia como terapia adjuvante para o estágio Ill do câncer de cólon. A utilização de um anticorpo monoclonal murino humanizado, inicialmente aprovado para imagem, também não produziu a regressão do tumor.
Apenas recentemente houve algum resultado positivo de estudos clínicos de câncer colorretal com o uso de anticorpos monoclonais. Em 2004, o ERBITUX® foi aprovado para o segundo tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático que expressam o EGFR, que são refratários à quimioterapia à base de irinotecano. Os resultados de ambos os estudos clínicos de Fase Il com duas frentes e o estudo com uma única frente mostraram que o ERBITUX® em combinação com o irinotecano teve uma taxa de resposta de 23 e 15%, respectivamente, com um tempo médio de progressão da doença de 4,1 e 6,5 meses respectivamente. Resultados a partir do mesmo estudo clínico de Fase Il com duas frentes e outro estudo único com uma frente mostraram que o tratamento com apenas o ERBITUX® resultou em uma taxa de resposta de 11 e 9%, respectivamente, com um tempo médio de progressão da doença de 1,5 e 4,2 meses respectivamente.
Conseqüentemente, na Suíça e nos Estados Unidos, o tratamento com o ERBITUX® em combinação com o irinotecano, e nos Estados Unidos, o tratamento apenas com ERBITUX®, foram aprovados como um trata30 mento de segunda linha para pacientes de câncer de cólon que tiveram insucesso na tratamento inicial com o irinotecano. Portanto, como o Herceptin®, o tratamento na Suíça só é aprovado como uma combinação de anticorpo monoclonal e quimioterapia. Além disso, o tratamento tanto nos EUA quanto na Suíça só é aprovado para os pacientes como terapia de segunda linha. Também em 2004, o AVASTIN® foi aprovado para o uso em combinação com quimioterapia à base de 5-fluorouracilaintravenosa, como tratamen5 to de primeira linha do câncer colorretal metastático. Os resultados do estudo clínico de Fase Ill demonstraram um prolongamento na sobrevida média dos pacientes tratados com AVASTIN® mais 5-fluorouracilaem comparação com pacientes tratados apenas com 5-fluourouracil (20 meses versus 16 meses, respectivamente). Entretanto, novamente como o Herceptin® e o 10 ERBITUX®, o tratamento só é aprovado como uma combinação de anticorpo monoclonal e quimioterapia.
Também continua tendo resultados insatisfatórios para câncer de pulmão, cérebro, ovário, pâncreas, próstata e estômago. Os resultados recentes mais promissores para o câncer de pulmão de células nãopequenas vieram de um ensaio clínico de Fase Il onde o tratamento envolveu um anticorpo monoclonal (SGN-15; dox-BR96, anti-Sialyl-Lex), conjugado com o fármaco eliminador de célula doxorrubicina em combinação com o agente quimioterápico TAXOTERE®. O TAXOTERE® é a única quimioterapia aprovada pelo U.S. F.D.A. para o segundo tratamento do câncer de pulmão. Dados iniciais indicam uma melhoria da sobrevida global em comparação apenas com o TAXOTERE®. Dos 62 pacientes que foram recrutados para o estudo, dois terços receberam SGN-15 em combinação com o TAXOTERE®, enquanto o um terço restante recebeu apenas TAXOTERE®. Para os pacientes que receberam SGN-15 em combinação com o TAXOTERE®, a sobrevida média global foi de 7,3 meses em comparação com 5,9 meses para os pacientes que receberam apenas TAXOTERE®. A sobrevida global em 1 ano e 18 meses foi de 29 e 18%, respectivamente, para os pacientes que receberam SNG-15 mais TAXOTERE® em comparação com 24 e 8%, respectivamente, para os pacientes que receberam apenas TAXOTERE®. São planejados mais ensaios clínicos.
Pré-clinicamente, tem havido algum sucesso limitado no uso de anticorpos monoclonais para melanoma. Muito pouco destes anticorpos alcançaram ensaios clínicos e até hoje nenhum foi aprovado ou demonstraram resultados favoráveis nos ensaios clínicos de Fase III.
A falta da identificação de alvos relevantes entre os produtos de 30 mil genes conhecidos, que poderiam contribuir para a patogênese da do5 ença, atrasa a descoberta de novos fármacos para tratar a doença. Na pesquisa oncológica, os alvos potenciais dos fármacos são, com freqüência, selecionados simplesmente devido ao fato de eles estarem em grande expressão em células tumorais. Os alvos, assim identificados, são então separados para a interação com uma grande quantidade de compostos. No caso 10 de terapias potenciais com anticorpos, estes compostos candidatos são geralmente derivados de métodos tradicionais de geração de anticorpos monoclonais, de acordo com os princípios fundamentais estabelecidos por Kohler e Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler e Milstein). Células esplênicas são coletadas de camundongos imunizados com antígeno (por exemplo, cé15 lulas inteiras, frações celulares, antígeno purificado) e fundidas com as parceiras do hibridoma imortalizado. Os hibridomas resultantes passam por uma triagem e são selecionados para a secreção de anticorpos que se ligam mais avidamente ao alvo. Muitos anticorpos terapêuticos e diagnósticos direcionados contra as células cancerosas, incluindo o Herceptin® e o RITU--20 XIMAB, foram produzidos usando estes métodos e selecionados com base em suas afinidades. As falhas nesta estratégia são de duas formas. Primeiramente, a escolha dos alvos apropriados para a ligação de anticorpo terapêutico ou diagnóstico é limitada pela escassez de conhecimento em torno dos tecidos específicos dos processos carcinogênicos e dos métodos sim25 plistas resultantes, como a seleção por grande expressão, pelo qual esses alvos são identificados. Segundamente, a suposição de que a molécula do fármaco que se liga ao receptor com maior afinidade tem geralmente uma probabilidade maior para iniciar ou inibir um sinal, talvez isso nem sempre seja o caso.
30 Apesar de alguns progressos com o tratamento do câncer de
mama e de cólon, a identificação e o desenvolvimento de terapias de anticorpos eficazes, como agente único ou de cotratamentos, tem sido inadequados para todos os tipos de câncer.
Patentes Anteriores:
U.S. Patente N0 5.750.102 revela um processo em que células do tumor de um paciente são transfectadas com genes MHC que podem ser 5 clonados a partir de células ou tecidos do paciente. Estas células transfectadas são, então, usadas para vacinar o paciente.
U.S. Patente N0 4.861.581 revela um processo compreendendo as etapas de obtenção de anticorpos monoclonais que são específicos para um componente celular interno de células neoplásicas e normais dos mamí10 feros, mas não para componentes externos, marcando o anticorpo monoclonal, contatando o anticorpo marcado com tecido de um mamífero que recebeu terapia para eliminar as células neoplásicas e determinando a eficácia da terapia medindo a ligação do anticorpo marcado com o componente celular interno das células neoplásicas degeneradas. Na preparação de anticor15 pos ligados aos antígenos intracelulares humano, o titular da patente reconhece que células malignas representam uma fonte conveniente de tais antígenos.
U.S. Patente N0 5.171.665 fornece um novo anticorpo e o método para a sua produção. Especificamente, a patente mostra a formação de um anticorpo monoclonal que tem a propriedade de se ligar fortemente a um antígeno proteico associado a tumores humanos, como os do cólon e do pulmão, enquanto se ligam às células normais em um grau muito menor.
U.S. Patente N0 5.484.596 fornece um método de terapia contra o câncer que compreende remover cirurgicamente o tecido tumoral de um 25 paciente com câncer humano, tratar o tecido tumoral para obter células tumorais, irradiar as células tumorais para serem viáveis, mas não oncogênicas, e usar essas células para preparar uma vacina para o paciente capaz de inibir a reincidência do tumor primário enquanto simultaneamente inibe as metástases. A patente mostra o desenvolvimento de anticorpos monoclonais 30 que são reativos com antígenos de superfície de células tumorais. Conforme exposto na coluna 4, linhas 45 e seqüência, os titulares da patente usaram células tumorais autóctones no desenvolvimento de anticorpos monoclonais expressando uma imunoterapia ativa específica em neoplasia humana.
U.S. Patente N0 5.693.763 mostra um antígeno glicoproteico característico de carcinomas humanos e não-dependente de tecido epitelial de origem.
5 U.S. Patente N0 5.783.186 descreve os anticorpos Antí-Her2 que
induzem a apoptose nas células que expressam Her2, linhagens celulares de hibridoma produzindo os anticorpos, métodos de tratamento do câncer usando os anticorpos e composições farmacêuticas incluindo tais anticorpos.
U.S. Patente N0 5.849.876 descreve novas linhagens celulares de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais para antígenos purificados de mucinas de fontes de tecido tumorais e não-tumorais.
U.S. Patente N0 5.869.268 descreve um método de geração de linfócitos humanos produzindo um anticorpo específico para um antígeno desejado, um método para produzir um anticorpo monoclonal, assim como 15 os anticorpos monoclonais produzidos pelo método. A patente é particularmente desenhada para a produção de um anticorpo monoclonal humano anti-HD útil para o diagnóstico e tratamento de cânceres.
U.S. Patente N0 5.869.045 refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpo, anticorpos conjugados e imunotoxinas de cadeia única que rea20 gem com células de carcinoma humano. O mecanismo pelo qual esses anticorpos funcionam é de duas maneiras, em que as moléculas são reativas com os antígenos da membrana celular presente na superfície dos carcinomas humanos e também em que os anticorpos têm a capacidade de incorporar dentro de células do carcinoma, subseqüente a ligação, tornando-as 25 especialmente úteis para a formação dos conjugados anticorpo-fármaco e anticorpo-toxina. Nas suas formas inalteradas, os anticorpos também manifestam propriedades citotóxicas em concentrações específicas.
U.S. Patente N0 5.780.033 revela o uso de autoanticorpos para terapia e profilaxia tumoral. Entretanto, este anticorpo é um autoanticorpo antinuclear de um mamífero idoso. Neste caso, o autoanticorpo é dito ser um tipo de anticorpo natural encontrado no sistema imunológico. Devido ao autoanticorpo vir de "um mamífero idoso", não é exigido que o autoanticorpo realmente venha do paciente que está sendo tratado. Além disso, a patente revela o autoanticorpo antinuclear natural e monoclonal de um mamífero idoso e uma linhagem celular de hibridoma produzindo um autoanticorpo antinuclear monoclonal.
5 SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Este pedido utiliza uma metodologia para produzir anticorpos anticancerígenos específicos para o paciente, mostrado na patente U.S. 6.180.357, para isolar linhagens celulares de hibridoma que se codificam em anticorpos monoclonais modificantes do câncer. Estes anticorpos podem ser 10 criados especificamente para um tumor e, assim, tornam possível a personalização da terapia contra o câncer. No âmbito deste pedido, os anticorpos anticâncer tendo tanto propriedades de célula "killer"a (citotóxica) quanto de célula inibidora de crescimento (citostática) serão referidos aqui como citotóxicos. Estes anticorpos podem ser usados no auxílio do estágio e diagnósti15 co de um câncer e podem ser usados para tratar metástases tumorais. Estes anticorpos também podem ser usados para a prevenção do câncer através de tratamento profilático. Diferente dos anticorpos produzidos de acordo com os paradigmas de descoberta tradicional de fármacos, os anticorpos produzidos desta forma podem atingir moléculas e vias que não demonstraram 20 anteriormente serem essenciais ao crescimento e/ou sobrevivência do tecido maligno. Além disso, as afinidades de ligação destes anticorpos são adaptadas às exigências para a iniciação dos eventos citotóxicos que não podem ser tratados com interações que tenham afinidade mais forte. Além disso, é do escopo desta invenção conjugar as modalidades-padrão quimioterapêuti25 cas, como os radionuclídeos, com o CDMAB da invenção imediata, concentrando assim o uso de tais quimioterapêuticos. O CDMAB também pode ser conjugado às toxinas, às porções citotóxicas, às enzimas como, por exemplo, as enzimas conjugada com biotina, às citocinas, aos interferons, às porções-alvo ou reveladoras ou às células hematogênicas, formando, assim, um 30 anticorpo conjugado. O CDMAB pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais CDMAB/agentes quimioterápicos.
A perspectiva de tratamento anticâncer individualizado trará uma mudança na maneira como um paciente é tratado. Um cenário clínico provável é que uma amostra tumoral seja obtida no momento da apresentação e armazenada. Com essa amostra, o tumor pode ser classificado a partir de um painel de anticorpos modificantes do câncer pré-existentes. O paciente 5 será convencionalmente estadiado, mas os anticorpos disponíveis podem ser usados adiante no estágio do paciente. O paciente pode ser tratado imediatamente com os anticorpos já existentes e um painel de anticorpos específicos para o tumor pode ser produzido usando os métodos descritos aqui ou através do uso de bibliotecas que exibem os fagos em conjunto com os 10 métodos de triagem revelados aqui. Todos os anticorpos criados serão adicionados à biblioteca de anticorpos anticâncer, uma vez que existe a possibilidade de que outros tumores possam produzir alguns dos mesmos epítopos como aquele que está sendo tratado. Os anticorpos produzidos de acordo com esse método podem ser úteis no tratamento do câncer em qualquer um 15 dos pacientes que tenham cânceres que se ligam a estes anticorpos.
Além dos anticorpos anticâncer, o paciente pode optar por receber as terapias atualmente recomendadas como parte de um regime multimodal de tratamento. O fato de os anticorpos isolados através da presente metodologia não serem relativamente tóxicos para as células não-20 cancerosas, permite combinações de anticorpos em altas doses a serem usados isoladamente ou em conjunto com a terapia convencional. O alto índice terapêutico também permitirá o retratamento em um curto período de tempo que deveria diminuir a probabilidade do aparecimento de células resistentes ao tratamento.
25 Se o paciente for refratário ao curso inicial da terapia ou ao de
senvolvimento de metástases, o processo de geração de anticorpos específicos para o tumor pode ser repetido para o retratamento. Além disso, os anticorpos anticâncer podem ser conjugados às hemácias obtidas a partir do paciente e reinfundidas para o tratamento de metástases. Tem havido pou30 cos tratamentos eficazes para o câncer metastático e metástases, geralmente anunciando um mau resultado, levando à morte. Entretanto, cânceres metastáticos são geralmente bem vascularizados e o transporte de anticorpos anticâncer por hemácias pode ter efeito de concentrar os anticorpos no local do tumor. Mesmo antes das metástases, a maioria das células cancerosas é dependente do suprimento sangüíneo do hospedeiro para sobreviver, e um anticorpo anticâncer conjugado às hemácias também pode ser eficaz contra 5 os tumores in situ. Alternativamente, os anticorpos podem ser conjugados a outras células hematogênicas, como os linfócitos, os macrófagos, os monócitos, as células "natural killer", etc.
Há cinco classes de anticorpos e cada uma está associada a uma função que é conferida pela sua cadeia pesada. É um pensamento geral que as células cancerígenas mortas pelos anticorpos puros são mediadas tanto por anticorpo quanto por complemento-dependente de toxicidade celular. Por exemplo, os anticorpos de murinos IgM e lgG2a podem ativar o complemento humano ligando-se ao componente C-1 do sistema de complemento, ativando assim o caminho clássico de ativação do complemento que pode levar à Iise tumoral. Para os anticorpos humanos, os anticorpos ativados por complemento mais eficazes são geralmente o IgGI e o IgM. Os anticorpos de murinos dos isotipos lgG2a e lgG3 são eficazes no recrutamento de células citotóxicas as quais têm receptores Fc que levarão à morte da célula pelos monócitos, macrófagos, granulócitos e certos linfócitos. Anticorpos humanos de ambos os isotipos IgGI e lgG3 mediam a ADCC.
A citotoxicidade mediada pela região Fc requer a presença de células efetoras e seus receptores correspondentes, ou proteínas como as células NK1 complemento e células-T, respectivamente. Na ausência desses mecanismos efetores, a região Fc de um anticorpo é inerte. A região Fc de 25 um anticorpo pode conferir propriedades que afetam a farmacocinética de um anticorpo in vivo, mas in vitro este não é operativo.
As ensaios de citotoxidade sob as quais foram testados os anticorpos não têm qualquer um dos mecanismos efetores presentes e foram realizadas in vitro. Essas ensaios não possuem células efetoras (NK, macró30 fagos, ou células-T) ou complemento presente. Uma vez que essas ensaios são definidas completamente por aquilo que é adicionado em conjunto, cada componente pode ser caracterizado. As ensaios usadas aqui contêm apenas células-alvo, meios e soros. As células-alvo não têm funções efetoras, uma vez que elas são células cancerosas ou fibroblastos. Sem as células exógenas, que possuem propriedades de função efetora, não existem elementos celulares que tenham esta função. Os meios não contêm complemento ou células. Os soros usados para dar apoio ao crescimento das células-alvo não têm atividade do complemento como divulgado pelos vendedores. Além disso, nos laboratórios, tem-se verificado a ausência de atividade do complemento nos soros usados. Então o trabalho evidencia o fato de que os efeitos dos anticorpos são devidos inteiramente aos efeitos da ligação do antígeno que é mediada através do Fab. Efetivamente, as células-alvo são vistas e interagem apenas com o Fab, uma vez que não possuem receptores para o Fe. Contudo, o hibridoma está secretando a imunoglobulina completa que foi testada com as células-alvo, a única parte da imunoglobulina que interage com as células é o Fab, que age como um fragmento de ligação do antígeno.
Em relação à reivindicação imediata dos fragmentos de ligação dos anticorpos e do antígeno, o pedido, tal como foi depositado, mostrou a citotoxicidade celular como evidenciado pelos dados da Tabela 1. Como assinalado acima, e confirmado aqui através de evidências objetivas, este efeito deveu-se inteiramente à ligação do Fab às células tumorais.
Existe uma ampla evidência na técnica dos anticorpos que mediam a citotoxicidade devido à ligação direta do anticorpo ao antígeno-alvo independente dos mecanismos efetores recrutados pelo Fe. A melhor evidência para isso são experimentos in vitro que não possuem células de suplemento, ou de complemento (para excluir formalmente aqueles mecanismos). Esses tipos de experimentos foram realizados com imunoglobulina completa, ou com fragmentos de ligação do antígeno, tais como os fragmentos F(ab')2. Nestes tipos de experimentos, os fragmentos de ligação dos anticorpos ou do antígeno podem induzir diretamente a apoptose das célulasalvo, como no caso dos anticorpos anti-Her2 e anti-EGFR, ambos têm anticorpos que são aprovados pelo U.S. F.D.A. para a comercialização na terapia contra o câncer. Outro possível mecanismo de eliminar o câncer mediado pelo anticorpo pode ser através do uso de anticorpos que funcionam para catalisar a hidrólise de várias ligações químicas na membrana celular e em seus glicolipídeos e glicoproteínas associados, chamados de anticorpos catalíti5 cos.
Existem três mecanismos adicionais de morte da célula cancerosa mediada pelo anticorpo. O primeiro é o uso de anticorpos como uma vacina para induzir o organismo a produzir uma resposta imune contra o antígeno putativo que reside na célula cancerosa. O segundo é o uso de anti10 corpos para atingir os receptores de crescimento e interferir com sua função ou diminuir a regulação do receptor de tal maneira que sua função seja efetivamente perdida. O terceiro é o efeito de tais anticorpos na ligação direta das porções da superfície celular que podem levar à morte celular direta, tais como a ligação dos receptores letais, como TRAIL R1 ou TRAIL R2, ou as 15 moléculas de integrina como a alfa V beta 3 e similares.
A utilidade clínica de um fármaco contra o câncer é baseada no benefício do fármaco sob um perfil de risco aceitável para o paciente. Na terapia contra o câncer, a sobrevida tem sido geralmente mais procurada após o benefício, porém há uma série de outros benefícios bem20 reconhecidos, além do prolongamento da vida. Estes outros benefícios, em que o tratamento não afeta adversamente a sobrevida, incluem sintoma paliativo, proteção contra os eventos adversos, prolongamento no tempo de recorrência ou sobrevida livre de doença e prolongamento no tempo de progressão. Estes critérios são geralmente aceitos e os órgãos reguladores co25 mo o U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.) aprova os fármacos que produzem esses benefícios (Hirschfeld et ai. Criticai Reviews in Oncology /Hematolgy 42:137-143 2002). Além desses critérios, é bem-reconhecido que existam outros parâmetros que possam prever estes tipos de benefícios. Em parte, o processo de aprovação acelerado concedido pelo U.S. F.D.A. 30 reconhece que existem substitutos que irão provavelmente prever o benefício do paciente. Como no final de 2003, dezesseis fármacos foram aprovados sob este processo, e destes, quatro continuam para aprovação plena, ou seja, estudos de acompanhamento têm demonstrado o benefício direto ao paciente como previsto por parâmetros substitutos. Um parâmetro importante para determinar os efeitos do fármaco em tumores sólidos é a avaliação da carga tumoral medindo a resposta ao tratamento (Therasse et al. Journal 5 of the National Cancer Institute 92 (3): 205-216 2000). Os critérios clínicos (critérios RECIST) para tal avaliação foram promulgados pelo Response Evaluation Criteria in Soiid Tumors Working Group (RECIST), um grupo de especialistas internacionais em câncer. Fármacos com um efeito demonstrado sobre a carga tumoral, como os mostrados pelas respostas objetivas de 10 acordo com os critérios do RECIST, em comparação ao grupo de controle adequado tendem a, em última ensaio, produzir benefício direto ao paciente. No cenário pré-clínico, a carga tumoral é geralmente mais fácil de avaliar e documentar. Nesses estudos pré-clínicos, que podem ser traduzidos para o cenário clínico, os fármacos que produzem sobrevida prolongada em mode15 Ios pré-clínicos têm uma maior utilidade clínica esperada. Análogo ao produzir respostas positivas ao tratamento clínico, os fármacos que reduzem a carga tumoral no cenário pré-clínico também podem ter impacto direto significativo sobre a doença. Embora o prolongamento da sobrevida seja o mais procurado depois do resultado clínico do tratamento com fármacos contra o 20 câncer, há outros benefícios que têm utilidade clínica e está claro que a redução da carga tumoral, que pode estar correlacionada a um atraso na progressão da doença, estendendo a sobrevida, ou ambos, também pode levar a benefícios diretos e tem impacto clínico (Eckhardt et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinicai Trial Designs of Targeted 25 Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, p. 209- 219).
A presente invenção descreve o desenvolvimento e o uso do AR90A56.11 identificado pelo seu efeito em uma ensaio citotóxica e em um modelo animal de câncer humano. Esta invenção descreve os reagentes que 30 se ligam especificamente a um epítopo ou a epítopos presentes na molécula-alvo, e que também possuem propriedades citotóxicas in vitro, como um anticorpo puro, contra células tumorais malignas, mas não nas células normais, e que também mediam diretamente, como um anticorpo puro, inibindo o crescimento tumoral. Outro "forward" é o uso de anticorpos anticâncer, como este para atingir tumores que expressam marcadores de antígeno cognato para obter a inibição do crescimento tumoral e outros parâmetros 5 positivos de tratamento contra o câncer.
Em suma, esta invenção mostra o uso do antígeno AR90A56.11 como um alvo para um agente terapêutico, que quando administrado pode reduzir a carga tumoral de um câncer expressando o antígeno em um mamífero. Esta invenção também mostra o uso do CDMAB (AR90A56.11) e seus 10 derivativos e fragmentos de ligação deste antígeno, e Iigantes induzidos pela citotoxicidade deste, para atingir seus antígenos na redução da carga tumoral de um câncer expressando o antígeno em um mamífero. Além disso, esta invenção também mostra o uso de detecção do antígeno AR90A56.11 em células cancerosas que podem ser úteis para o diagnóstico, para a previsão 15 da terapia e para o prognóstico de mamíferos com tumores que expressam este antígeno.
Assim sendo, um objetivo da invenção é utilizar um método para produzir anticorpos modificantes do câncer (CDMAB) criados contra as células cancerosas provenientes de um determinado indivíduo, ou uma ou mais 20 linhagens de células cancerosas em particular, cujo CDMAB é citotóxico em relação às células cancerosas enquanto, simultaneamente, são células relativamente não-tóxicas a não-cancerosas, a fim de isolar as linhagens celulares de hibridoma e os correspondentes fragmentos de ligação dos anticorpos e antígeno monoclonal e isolado para os quais as ditas linhagens celulares 25 de hibridoma são codificadas.
Um objetivo adicional da invenção é mostrar os anticorpos modificantes do câncer, os Iigantes e os fragmentos de ligação do antígeno.
Mais um objetivo da invenção imediata é produzir anticorpos modificantes do câncer cuja citotoxicidade é mediada através da toxicidade celular dependente de anticorpo.
É ainda um objetivo da invenção imediata, produzir anticorpos modificantes do câncer, cuja citotoxicidade é mediada através da toxicidade celular do dependente de complemento.
Outro objetivo da invenção imediata é produzir anticorpos modificantes do câncer, cuja citotoxidade é uma função da sua capacidade para catalisar a hidrólise de ligações químicas celulares.
5 É ainda mais um objetivo da invenção imediata produzir anticor
pos modificantes do câncer que são úteis em uma ensaio de ligação para diagnóstico, prognóstico e monitoramento do câncer.
Outros objetos e vantagens desta invenção se tornarão aparentes das descrições a seguir, que estão estabelecidas aqui por meio de ilus10 tração e de exemplo, por certas incorporações desta invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 compara o percentual de citotoxidade e níveis de ligação dos hibridomas sobrenadantes contra linhagens celulares A549, NCIH23, NCI-H460, MDA-MB-231 e Hs888.Lu.
15 A figura 2 representa a ligação do AR90A56.11 para o câncer e
linhagens celulares normais. Os dados estão tabulados para apresentar a intensidade média de fluorescência enquanto aumenta acima do controle isotípico.
A figura 3 inclui histogramas FACS representativos de -20 AR90A56.11 e anticorpos anti-EGFR direcionados contra várias linhagens celulares cancerosas e não-cancerosas.
A figura 4 mostra o efeito do AR90A56.11 no crescimento tumoral em um modelo de BxPC-3 profilático de câncer pancreático. As linhas verticais tracejadas indicam o período durante o qual o anticorpo foi adminis25 trado. Os pontos dos dados representam a média ± SEM.
A figura 5 mostra o efeito do AR90A56.11 sobre o peso corporal em um modelo de BxPC-3 profilático de câncer pancreático. Os pontos dos dados representam a média +/- SEM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 30 Em geral, as seguintes palavras ou frases têm definição indicada
quando usadas no sumário, na descrição, nos exemplos, e nas reivindicações. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e abrange, por exemplo, os anticorpos monoclonais únicos (incluindo agonista, antagonista, e anticorpos neutralizantes, di-imunizado, de murino, quimérico ou anticorpos humanizados), composições de anticorpo com especificidade polie5 pitópica, anticorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, imunoconjugados e fragmentos de anticorpo (ver abaixo).
O termo "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos do indivíduo englobando a popula10 ção são idênticos, exceto por possíveis mutações ocorridas naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único local antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes deter15 minantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um determinante único no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" que indica o caráter do anticorpo é obtido a partir de uma população de anticor20 pos substancialmente homogênea, e não deve ser interpretado como uma produção exigida de um anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma (murino ou humano), inicialmente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou 25 podem ser produzidos por métodos recombinantes de DNA (ver, por exemplo, Patente U.S. N0 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpos que exibem fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e em Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os "fragmentos de anticorpos" englobam uma região de um an
ticorpo intacto, preferencialmente compreendendo o antígeno de ligação ou a região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem menos do que o comprimento total de anticorpos, fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; anticorpos de cadeia única, moléculas de anticorpo de domínio único, proteínas de fusão, proteínas recombinantes e anticorpos multiespecí5 ficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpo.
Um anticorpo "intacto" é um que engloba uma região variável de ligação do antígeno, assim como um domínio constante de cadeia leve (Cl) e domínios constantes de cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de seqüência nativa (por exem10 pio, domínios constante de seqüência nativa humana) ou seqüência variante de aminoácido do mesmo. Preferencialmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.
Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a 15 diferentes "classes". Há cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários deles podem ser subdivididos em "subclasses" (Isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. São bem co20 nhecidas as estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas.
O anticorpo "funções efetoras" refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma seqüência nativa da região Fc ou seqüência variante de amínoácidos da região Fe) de um anticorpo. Exemplos 25 de funções efetoras de anticorpo incluem ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fe; citotoxicidade mediada por célula anticorpo dependente (ADCC); fagocitose; baixa regulação dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.
"Citotoxicidade mediada por célula anticorpo dependente" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por célula na qual as células citotóxica não-específicas, que expressam receptores Fe (FcRs) (por exemplo, células "natural killer" (NK), neutrófilos e macrófagos), reconhecem a ligação de anticorpo em uma célula-alvo e, subseqüentemente, causa Iise da célulaalvo. As células principais para mediar a ADCC, as células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR nas células hematopoéticas está resumida na Ta5 bela 3, na página 464 do Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade da ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizada uma ensaio da ADCC in vitro, tal como descrito na Patente U.S. N0 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células "na10 tural killer" (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade da ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, como revelado na Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Células efetoras" são leucócitos que expressam uma ou mais 15 FcRs e executam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e executam a função efetora da ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam a ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células "natural killer" (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; as PBMC e células NK são as preferidas. As célu20 Ias efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, como do sangue ou das PBMC descritas aqui.
Os termos "receptor Fe" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é uma seqüência nativa humana FcR. Além disso, o FcR preferido é o que se liga a 25 um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo os variantes alélicos e alternativamente formas entrelaçadas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem o FcyRIIA (um "receptor ativador") e o FcyRIIB (um "receptor inibidor"), os quais têm seqüências similares de aminoácidos que diferem principalmente 30 nos domínios citoplasmáticos destes. O receptor ativador FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado no imunoreceptor de tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor inibidor FcyRIIB contém motivo de inibição baseado no imunoreceptor de tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver ensaio em M. Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revistos em Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-92
(1991); Capel et al. Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab.
5 CHn. Med. 126:330-41 (1995). Outros FeRs1 incluindo aqueles que devem ser identificados no futuro, são compreedidos aqui pelo termo "FcR". O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al. Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).
"Citotoxicidade complemento-dependente" ou "CDC" refere-se à
capacidade de uma molécula fazer a Iise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo), composto com um antígeno cognato. Para avaliar a 15 ativação do complemento, pode ser feita uma ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202:163 (1996).
O termo "variável" refere-se ao fato de que certas regiões do domínio variável diferem amplamente na seqüência entre os anticorpos e são usadas na ligação e na especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno em particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída em todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis nos domínios variáveis de cadeia leve e pesada. As regiões mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias nativas pesadas e leves englobam quatro Frs1 adotando amplamente uma configuração folha-β, conectados por três regiões hipervariáveis, que formam Ioops (Ioops) conectadas e, em alguns casos, fazem parte da estrutura folha-β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são unidas em proximidade pelos FRS e, junto com as regiões hipervaríáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação antígeno-antícorpo (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente em ligar um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de 5 anticorpo (ADCC).
O termo "região hipervariável" quando usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antígeno. A região hipervariável geralmente compreende os resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de um "loop hipervariável" (por exemplo, resíduos 2632 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3), à Iuz da cadeia variável domínio e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos da "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável como aqui definido. A digestão com papaína de anticorpos produz dois idênticos fragmentos de antígenos de ligação, chamados de fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação do antígeno, e um fragmento residual "Fe", cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação do antígeno e ainda é capaz do antígeno de fazer reticulação.
"Fv" é o fragmento mínimo do anticorpo que contém um local completo de reconhecimento e da ligação do antígeno. Esta região consiste em um dímero de domínio variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve, em uma associação estreita, não-covalente. É nesta configuração que 30 as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local do antígeno de ligação na superfície do dímero Vh-Vl- Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação do antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou porção de um Fv englobando apenas três regiões específicas hipervariáveis para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora com uma afinidade menor do que todo o local de ligação. O fragmento 5 Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH I) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio da cadeia pesada CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região articulação de (hinge) do anticorpo. Fab1-SH é a designação aqui para os Fab’ 10 nos quais o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes produz, pelo menos, um grupo de tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares dos fragmentos Fab1 os quais têm articulações de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
15 As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie vertebrada
podem ser atribuídas a um dos dois tipos claramente distintos, chamados Kappa (k) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
Fragmentos de anticorpo de "cadeia única Fv" ou "scFv" englo
► 20 bam os domínios Vh e Vl de anticorpo, onde estes domínios estão presentes em uma cadeia única polipeptídica. Preferencialmente, o polipeptídio Fv ainda inclui um polipeptídio de ligação entre os domínios Vh e Vl que permite o scFv formar a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma ensaio do scFv, ver Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodi25 es, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
O termo "diacorpos” refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação do antígeno, cujos fragmentos englobam um domínio variável pesado (Vh) conectado a um domínio variável leve (Vl) 30 na mesma cadeia polipeptídicas (Vh-Vl). Ao usar um conector que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação do antígeno. Bivalentes são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sc/. USA, 90:6444-6448 (1993).
5 O termo "triacorpos" ou "trímeros triacorpo" refere-se à combina
ção de três anticorpos de cadeia única. Trivalentes são construídos com a terminação aminoácida de domínio Vl ou Vh, ou seja, sem qualquer seqüência de ligação. Um triacorpo tem três Fv encabeçados com os polipeptídios arranjados de uma maneira cíclica, de cima a baixo. Uma possível configu10 ração do triacorpo é plana com os três locais de ligação localizados em um plano, a um ângulo de 120 graus um do outro. Os triacorpos podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou triespecíficos.
Um anticorpo "isolado" é um que tem sido identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. 15 Componentes contaminantes do ambiente natural dele são materiais que podem interferir com os usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ com células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do 20 anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por, pelo menos, uma etapa de purificação.
Um anticorpo "que liga" um antígeno de interesse é um capaz de ligar aquele antígeno com afinidade suficiente tal que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico ou diagnóstico para atingir a célula que expres25 sa o antígeno. Onde o anticorpo é um que liga a porção antigênica, ele irá, em geral, se ligar preferencialmente à porção antigênica em oposição a outros receptores, e não inclui ligações acidentais, tais como o contato Fc nãoespecífico, ou se liga a modificações pós-translacionais comuns a outros antígenos e pode ser um que não tenha uma reação cruzada significativa 30 com outras proteínas. Os métodos para a detecção de um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse são bem conhecidos na técnica e podem incluir, mas sem se limitar, aos testes tais como FACS, ELISA e Western blot.
Como usado neste pedido, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas alternadamente, e todas essas denominações incluem a progênie. Também é entendido que todas as progênies 5 podem não ser precisamente idênticas no conteúdo do DNA, devido às mutações deliberadas ou inadvertidas. Está incluída a progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como triadas na célula originalmente transformada. Quando forem pretendidas designações distintas, ficará claro pelo contexto.
10 "O tratamento ou tratar" refere-se tanto ao tratamento terapêuti
co quanto às medidas profiláticas ou preventivas, onde o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) a condição ou doença patológica alvo. Os que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão com a doença, bem como aqueles propensos a terem a doença, ou aqueles que precisam prevenir a doen15 ça. Assim, o mamífero a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticado como tendo a doença ou pode ser predisposto ou suscetível à doença.
Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se à ou descrevem a condição fisiológica nos mamíferos que são tipicamente caracterizados pelo crescimento celular desregulado ou pela morte. Os exemplos de câncer in
- 20 cluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou doenças linfoides. Mais exemplos específicos de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de célula escamosa epitelial), câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de não-células pequenas, adenocarcinoma de 25 pulmão e carcinomas de células escamosas do pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de abdômen incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma de endométrio ou 30 uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou de bexiga, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, bem como câncer de cabeça e de pescoço. Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento contra o câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridi5 nas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilmelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilonomelamina; mostardas nitrogenadas, como clorambucil, clornafazina, clofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalano, novembichin, 10 fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carnomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6- 15 diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como metotrexato e 5-fluorouracila(5-FU); análogos de ácido 20 fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como a fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epiti25 ostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; fontes de ácido fólico tais como ácido folínico; aceglatona; aldofosfamida glicosil; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatrexato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformithine; acetato de eliptinio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinano; Ioni30 damina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazônico; triaziquone; 2,2\2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosídeo (Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo, paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology1 Princeton, NJ) e docetaxel (TAXOTERE®, Aventis, Rhone5 Poulenc Rorer, Antony1 França); clorambucila; gemcitabina; 6-thioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida, mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novatrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoi10 somerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina e sais, ácidos ou derivativos farmaceuticamente aceitáveis, de qualquer um dos elementos mencionados acima. Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, como os anti-estrogênios, incluin15 do, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, inibidor da aromatase 4(5)-imidazol, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, e goserelina e sais, ácidos ou derivativos farmaceuticamente aceitáveis, de qualquer um dos elementos mencionados acima.
‘ 20 "Mamíferos" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal
classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, camundongos, camundongos SCID ou puros ou linhagens de camundongos, animais domesticados e de fazenda, animais de zoológico, de esportes, ou animais domésticos, tais como ovelhas, cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De prefe25 rência, aqui, os mamíferos são humanos.
"Oligonucleotídeos" são polidesoxinucleotídeos de comprimento curto e fita única ou dupla que são quimicamente sintetizados por métodos conhecidos, como fosfotriéster, fosfito, ou fosforamidita, usando técnicas de fase sólida, como a descrita em EP 266.032, publicado no dia 4 de maio de 30 1988, ou através de intermediação do H-fosfonato de desoxinucleosídeo (deoxynucleoside H-phosphonate) como descrito por Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986. Eles são então purificados em gel de poliacrilamida.
De acordo com a presente invenção, formas "humanizadas" e/ou "quiméricas" de imunoglobulinas não-humanas (por exemplo, de murino) referem-se aos anticorpos que contêm imunoglobulinas quiméricas específi5 cas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos deles (tais como Fv1 Fab, Fab', F(ab')2 ou outros subseqüentes anticorpos de ligação do antígeno), o que resulta em uma diminuição de resposta do anticorpo humano anticamundongo (HAMA), anticorpo humano antiquimérico (HACA) ou anticorpo humano anti-humano (HAHA), comparado ao anticorpo original, e contém 10 regiões necessárias (por exemplo, CDR(s), região(ões) de ligação do antígeno, domínio(s) variável(is) e assim por diante) derivadas da referida imunoglobulina não-humana necessária para reproduzir o efeito desejado, enquanto simultaneamente retém as características de ligação que são comparáveis a tal imunoglobulina não-humana. Na maioria das vezes, os anticor15 pos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nos quais os resíduos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos provenientes das CDRs de uma espécie não-humana (anticorpo doador), como o camundongo, o rato ou o coelho tendo especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em 20 alguns casos, os resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos FR não-humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode incluir resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüências importadas de CDR ou FR. Estas modificações são feitas para, mais adiante, aperfeiçoar e otimizar 25 o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá abranger consideravelmente todos, de pelo menos um, e tipicamente dois, dos domínios variáveis, em que todas ou consideravelmente todas as regiões do CDR correspondem àquelas da imunoglobulina não-humana e todos ou consideravelmente todos os resíduos FR são os da seqüência consensual da imu30 noglobulina humana. O anticorpo humanizado otimizado também incluirá pelo menos uma região de uma região constante da imunoglobulina (Fe), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Anticorpos "di-imunizados" são imunoglobulinas que não são imunogênicas, ou que são menos imunogênicas, para uma dada espécie. A di-imunização pode ser alcançada através de alterações estruturais do anticorpo. Pode ser empregada qualquer técnica de di-imunização conhecida 5 por aqueles versados na técnica. Uma técnica adequada para di-imunizar os anticorpos é descrita, por exemplo, na WO 00/34317 publicada no dia 15 de junho de 2000.
Um anticorpo que induz "apoptose" é aquele que induz a morte celular programada por qualquer meio, ilustrada pela, mas não se limitando a, ligação da annexina V, atividade de caspase, fragmentação de DNA, retração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas membranosas (chamados corpos apoptóticos).
Conforme usado aqui, "citotoxicidade induzida por anticorpo" é entendido como sendo o efeito citotóxico derivado do hibridoma sobrenadante ou o anticorpo produzido pelo hibridoma, depositado junto ao IDAC com o número de acesso 051206-03, cujo efeito não está necessariamente relacionado ao grau de ligação.
Durante toda a especificação da invenção imediata, as linhagens celulares do hibridoma, bem como os anticorpos monoclonais isolados que são produzidos a partir destas, são referidos alternativamente pela designação interna, AR90A56.11, ou pela designação depositária, IDAC 051206-03.
Conforme usado aqui, "anticorpo ligante" inclui uma porção que exibe especificidade de ligação para pelo menos um epítopo do antígenoalvo, e que pode ser uma molécula intacta de anticorpo, fragmentos de anti25 corpo e qualquer molécula que tenha pelo menos uma região de ligação do antígeno ou região deste (ou seja, a região variável de uma molécula de anticorpo), por exemplo, uma molécula Fv, molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab').sub.2, um anticorpo biespecífico, uma proteína de fusão, ou qualquer molécula geneticamente modificada que reconhece especificamen30 te e liga pelo menos um epítopo do antígeno ligado pelo anticorpo monoclonal isolado produzido pela linhagem celular de hibridoma, designado como IDAC 051206-03 (o antígeno IDAC 051206-03). Conforme usado aqui, "anticorpos modificantes do câncer" (CDMAB) refere-se aos anticorpos monoclonais que modificam o processo da doença cancerosa de uma forma que seja benéfica para o paciente, por exemplo, reduzindo a carga tumoral ou prolongando a sobrevida dos indiví5 duos portadores do tumor e os anticorpos Iigantes destes.
Um "agente de ligação relacionado ao CDMAB", no seu sentido mais amplo, inclui, mas sem se limitar, qualquer forma de anticorpo humano ou não-humano, fragmentos de anticorpo, anticorpos ligantes, ou similares, que se ligam competitivamente a pelo menos um epítopo-alvo CDMAB.
Um "ligante competitivo" é entendido como incluindo qualquer
forma de anticorpo humano ou não-humano, fragmentos de anticorpo, anticorpos ligantes, ou similares que possuem afinidade de ligação para pelo menos um epítopo-alvo CDMAB.
Tumores a serem tratados incluem tumores primários e tumores 15 metastáticos, bem como tumores refratários. Tumores refratários incluem tumores que não respondem ou que são resistentes ao tratamento apenas com agentes quimioterápicos, só com anticorpos, só radioterapia ou combinações dos mesmos. Tumores refratários englobam também tumores que parecem ser inibidos pelo tratamento com estes agentes, mas que possuem 20 recorrência até cinco anos, às vezes até dez anos ou mais, após a interrupção do tratamento.
Tumores que podem ser tratados incluem os tumores que não são vascularizados, ou que ainda não foram consideravelmente vascularizados, assim como os tumores vascularizados. Exemplos de tumores sólidos, 25 que podem ser tratados em conformidade, incluem: carcinoma de mama, carcinoma pulmonar, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, glioma e linfoma. Alguns exemplos de tais tumores incluem: tumor epidermoide, tumores escamosos, como os tumores de cabeça e pescoço, tumores colorretal, tumores da próstata, tumores da mama, tumores do pulmão, incluindo de 30 células pequenas e de não-células pequenas, tumores pulmonares, tumores pancreáticos, tumores da tiroide, tumores do ovário e tumores do fígado. Outros exemplos incluem o sarcoma de Kaposi, neoplasmas CNS, neuroblastomas, hemangioblastomas capilar, meningiomas e metástases cerebrais, melanoma, carcinomas e sarcomas gastrointestinal e renal, rabdomiossarcoma, glioblastoma, preferencialmente a glioblastoma multiforme, e leiomiossarcoma.
5 Conforme usado aqui, "região de ligação do antígeno" significa
uma região da molécula que reconhece o antígeno-alvo.
Conforme usado aqui, "inibir competitivamente" significa ser capaz de reconhecer e ligar um local determinante para o qual o anticorpo monoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma é direcionado, desig10 nado como IDAC 051206-03, (o anticorpo IDAC 051206-03), usando ensaios convencionais de competição de anticorpo recípro. (Belanger L., Silvestre C. e Dufour D. (1973), Enzyme Iinked immunoassay for alpha fetoproten and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
Conforme usado aqui, "antígeno-alvo" é o antígeno IDAC 051206-03 ou regiões do mesmo.
Conforme usado aqui, um "imunoconjugado" significa qualquer molécula ou CDMAB, como um anticorpo química ou biologicamente ligado às citotoxinas, agentes radioativos, citocinas, interferons, porções atingidas ou reveladas, enzimas, toxinas, fármacos antitumorais ou agentes terapêuti20 cos. O anticorpo ou o CDMAB pode se ligar à citotoxina, ao agente radioativo, às citocinas, ao interferon, às porções atingidas ou reveladas, à enzima, à toxina, ao fármaco antitumoral ou ao agente terapêutico em qualquer local ao longo da molécula, contanto que seja capaz de se ligar ao seu alvo. Exemplos de imunoconjugados incluem conjugados químicos anticorpo-toxina 25 e proteínas de fusão anticorpo-toxina.
Agentes radioativos adequados para uso como agentes antitumorais são conhecidos por versados na técnica. Por exemplo, é usado o 1311 ou o 211At. Esses isótopos são anexados ao anticorpo usando técnicas convencionais (por exemplo, Pedley et al., Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993)). 30 Alternativamente, o agente antitumoral que é anexado ao anticorpo é uma enzima que ativa um profármaco. Um profármaco é administrado, o qual permanece em sua forma inativa até que chegue ao local do tumor onde é convertido para sua forma de citotoxina quando o complexo anticorpo é administrado. Na prática, o conjugado anticorpo-enzima é administrado ao paciente e permitiu localizar na região do tecido a ser tratado. O profármaco é, então, administrado ao paciente para que a conversão para o fármaco cito5 tóxico ocorra na região do tecido a ser tratado. Alternativamente, o agente antitumoral conjugado ao anticorpo é uma citocina, tal como a interleucina-2 (IL-2), a interleucina-4 (IL-4) ou o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). O anticorpo atinge a citocina ao tumor de modo que a citocina media o dano ou a destruição do tumor sem afetar outros tecidos. A citocina é fundida ao anti10 corpo no nível do DNA usando as técnicas convencionais de DNA recombinante. Os interferons também podem ser usados.
Conforme usado aqui, uma "proteína de fusão" significa qualquer proteína quimérica em que uma região de ligação do antígeno está conectada a uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, toxinas, enzimas, proteínas fluorescentes, marcador luminescente, ligação polipeptídica, citocinas, interferon, porção atingida ou revelada ou fármaco proteico.
A invenção ainda contempla o CDMAB da presente invenção para a qual estão ligadas as porções atingidas ou reveladas. As porçõesalvo são os primeiros membros do pares de ligação. Agentes antitumorais, 20 por exemplo, são conjugados aos segundos membros desses pares, assim como direcionados ao local onde está ligada a proteína do antígeno de ligação. Um exemplo comum de tal par de ligações é a avidina e a biotina. Em uma incorporação preferida, a biotina é conjugada ao antígeno-alvo do CDMAB da presente invenção e, assim, fornece um alvo para um agente anti25 tumoral ou para outra porção que é conjugada à avidina ou à estreptavidina. Alternativamente, a biotina ou a outra porção está ligada ao antígeno-alvo do CDMAB da presente invenção e é usada como um revelador, por exemplo, em um sistema de diagnóstico, onde um agente produtor de sinal detectável é conjugado à avidina ou à estreptavidina.
Os agentes produtores de sinal detectáveis são úteis in vivo e in
vitro para fins de diagnóstico. O agente produtor de sinal produz um sinal mensurável que é detectável por meios externos, geralmente a medida da radiação eletromagnética. Na maior parte dos casos, o agente produtor de sinal é uma enzima ou um cromóforo, ou emite Iuz por fluorescência, fosforescência e quimiluminescência. Os cromóforos incluem corantes que absorvem a Iuz na região ultravioleta ou visível, e podem ser substratos ou 5 produtos de degradação de reações catalisadas por enzimas.
Além disso, incluído no escopo da presente invenção está o uso do presente CDMAB in vivo e in vitro para métodos investigativos ou diagnósticos, que são bem conhecidos na técnica. A fim de realizar os métodos de diagnóstico como contemplados neste documento, a invenção imediata 10 pode ainda incluir kits que contêm o CDMAB da presente invenção. Esses kits serão úteis para a identificação de indivíduos em risco para certos tipos de câncer através da detecção em grande expressão do antígeno-alvo do CDMAB nas células desses indivíduos.
Kits de Ensaio de Diagnóstico 15 O CDMAB da presente invenção está contemplado para ser utili
zado na forma de um kit de ensaio de diagnóstico para determinar a presença de um tumor. O tumor vai ser geralmente detectado em um paciente baseado na presença de um ou mais antígenos específicos tumorais, por exemplo, proteínas e/ou polinucleotídeos que codificam essas proteínas em
- 20 uma amostra biológica, tais como o sangue, o soro, a urina e/ou as biópsias tumorais, cujas amostras terão sido obtidas do paciente.
As proteínas funcionam como marcadores que indicam a presença ou ausência de um determinado tumor, por exemplo, um tumor de cólon, de mama, de pulmão ou de próstata. É ainda contemplado para que o 25 antígeno tenha utilidade na detecção de outros tumores cancerosos. Incluído nos kits de ensaio de diagnóstico dos agentes de ligação englobados na presente invenção dos CDMABs, ou agentes de ligação relacionados ao CDMAB, permite a detecção do nível de antígeno que se liga ao agente na amostra biológica. Primeres e sondas de polinucleotídeos podem ser usados 30 para detectar o nível de mRNA codificando uma proteína do tumor, que também é indicativa da presença ou ausência de um câncer. Para que a ensaio de ligação seja diagnosticada, os dados terão que ter sidos gerados com níveis de correlação estatisticamente significativos do antígeno, em relação àqueles presentes no tecido normal, de forma a submeter o reconhecimento da ligação definitivamente diagnosticável para a presença de um tumor canceroso. É contemplado que uma pluralidade de formatos será útil para a en5 saio de diagnóstico da presente invenção, como são conhecidos pelos versados na técnica, no uso de um agente de ligação para detectar os marcadores polipeptídicos em uma amostra. Por exemplo, como ilustrado em HarIow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulos 9-14, 1988. Ainda também contemplados estão todas e quais10 quer combinações, permutações ou modificações dos formatos de ensaio de diagnóstico descritos acima.
A presença ou ausência de um câncer em um paciente será tipicamente determinada por: (a) contatar uma amostra biológica obtida de um paciente com um agente de ligação, (b) detectar na amostra um nível de polipeptídios que se liga ao agente; e (c) comparar o nível de polipeptídios com um determinado valor de corte.
Em uma incorporação ilustrada, está contemplado que a ensaio envolverá o uso de um agente de ligação baseado no CDMAB, imobilizado em um suporte sólido para se ligar ao polipeptídio e eliminá-lo do restante da 20 amostra. O polipeptídio ligado poderá, então, ser detectado usando um reagente detector que contém um grupo revelador e se liga especificamente ao complexo de ligação agente/polipeptídios. Os reagentes de detecção ilustrativos podem incluir um agente de ligação baseado no CDMAB que se liga especificamente ao polipeptídio ou ao anticorpo ou a outro agente que se 25 liga especificamente ao agente de ligação, tais como uma antiimunoglobulina, uma proteína G, uma proteína A ou uma lectina. Em uma incorporação alternativa, está contemplado que uma ensaio competitiva pode ser utilizada, na qual um polipeptídio é marcado com um grupo revelador e permitido ligar-se ao agente de ligação imobilizado após a incubação do 30 agente de ligação com a amostra. Indicativo da reatividade da amostra com o agente de ligação imobilizado é a extensão pela qual os componentes da amostra inibem a ligação do polipeptídio marcado para o agente de ligação. Polipeptrdios adequados para o uso em tais ensaios incluem proteínas específicas de tumor completo e/ou das mesmas, para as quais o agente de ligação tem ligações de afinidade.
O kit de diagnóstico será fornecido com um suporte sólido que 5 pode ser sob a forma de qualquer material conhecido pelos versados na técnica, ao qual a proteína pode ser anexada. Exemplos adequados podem incluir um teste de poço na placa de titulação, ou uma nitrocelulose, ou outra membrana adequada. Alternativamente, o suporte pode ser um globo ("beed") ou um disco, como vidro, fibra de vidro, látex ou material plástico, tais 10 como o poliestireno ou o cloreto de polivinila. O suporte também pode ser uma partícula magnética ou um sensor de fibra óptica, como aqueles revelados, por exemplo, na Patente U.S. N0 5.359.681.
É contemplado que o agente de ligação será imobilizado sobre o suporte sólido usando uma variedade de técnicas conhecidas pelos versados na técnica, que são amplamente descritas na patente e na literatura científica. O termo "modalidade" refere-se tanto à associação não-covalente, tal como a adsorção, quanto à ligação covalente, que no contexto da presente invenção, pode ser uma ligação direta entre o agente e os grupos funcionais no suporte, ou pode ser uma ligação por meio de um agente de reticulação. Em uma incorporação preferida, mas não limitada, é preferível a modalidade por adsorção em uma poço de uma placa de titulação ou em uma membrana. A adsorção poderá ser obtida pelo contato com o agente de ligação, em um tampão adequado, com o suporte sólido para uma quantidade adequada de tempo. O tempo de contato pode variar com a temperatura e será, em geral, dentro de um intervalo entre cerca de 1 hora e cerca de 1 dia.
A ligação covalente do agente de ligação a um suporte sólido seria normalmente realizada, inicialmente, reagindo o suporte com um reagente bifuncional que reagiria com os grupos de apoio e funcional, tais como 30 os grupos hidroxila ou amino, sobre o agente de ligação. Por exemplo, o agente de ligação pode ser covalentemente ligado a suportes que tenham um revestimento de polímero adequado usando benzoquinona ou condensando um grupo aldeído no suporte com uma amina e um hidrogênio ativo sobre o parceiro de ligação.
É contemplado ainda que o kit de ensaio de diagnóstico assumirá a forma de um ensaio sanduíche com dois anticorpos. Esta ensaio poderá 5 ser realizada, inicialmente, contatando um anticorpo, como por exemplo, o CDMAB revelado aqui que tem sido imobilizado em um suporte sólido, geralmente no poço de uma placa de titulação, com a amostra, tal que o polipeptídio dentro da amostra permite se ligar ao anticorpo imobilizado. Uma amostra não-ligada é, então, retirada do complexo de anticorpo imobilizado 10 por polipeptídio e um reagente detector (de preferência o segundo anticorpo capaz de se ligar a um local diferente no polipeptídio) contendo um grupo revelador é adicionado. A quantidade de reagente detector que permanece ligada ao suporte sólido é, então, determinada usando um método adequado para o grupo revelador específico.
Em uma incorporação específica, é contemplado que, uma vez
que o anticorpo é imobilizado no suporte, como descrito acima, os locais restantes de ligação da proteína no suporte serão bloqueados, através do uso de qualquer agente bloqueador adequado conhecido pelos versados na técnica, tais como a albumina sérica bovina ou o Tween 20® (Sigma Chemical 20 Co., St. Louis, Mo.). O anticorpo imobilizado seria, então, incubado com a amostra, e o polipeptídio teria permissão de se ligar ao anticorpo. A amostra poderia ser diluída com um diluente adequado, tal como a salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. Em geral, um tempo adequado de contato (ou seja, tempo de incubação) seria selecionado para corresponder 25 a um período de tempo suficiente para detectar a presença do polipeptídio dentro de uma amostra obtida de um indivíduo com o tumor selecionado especificamente. De preferência, o tempo de contato é suficiente para alcançar um nível de ligação que é pelo menos aproximadamente 95% daquele atingido no equilíbrio entre polipeptídios com ligação e não-ligada. Os versados 30 na técnica vão reconhecer que o tempo necessário para alcançar o equilíbrio pode ser facilmente determinado analisando o nível de ligação que ocorre ao longo de um período de tempo. Contempla-se ainda que a amostra não-ligada seria, então, removida lavando o suporte sólido com um tampão adequado. O segundo anticorpo, que contém um grupo revelador, seria então adicionado ao suporte sólido. A incubação do reagente detector com o complexo de anticorpo imo5 bilizado por polipeptídio seria, então, realizada por um período de tempo suficiente para detectar a ligação polipeptídica. Subseqüentemente, o reagente detector não-ligada seria, então, removido e o reagente detector seria detectado usando o grupo revelador. O método utilizado para detectar o grupo revelador é necessariamente específico para o tipo de grupo revelador sele10 cionado, por exemplo, é geralmente adequado para os grupos radioativos, o contador de cintilações ou os métodos autorradiográficos. Os métodos espectroscópicos podem ser usados para detectar corantes e grupos Iuminescentes e fluorescentes. A biotina pode ser detectada usando a avidina acoplada a grupos reveladores diferentes (geralmente um grupo radioativo ou 15 fluorescente ou uma enzima). Grupos reveladores de enzima podem, com freqüência, ser detectados por meio da adição de substrato (geralmente para um período específico de tempo), seguidos por ensaios espectroscópicas ou outras ensaios de produtos de reação.
A fim de utilizar o kit de ensaio de diagnóstico da presente in
> 20 venção para determinar a presença ou ausência de um câncer, como o câncer de próstata, o sinal detectado do grupo revelador que continua ligado ao suporte sólido, seria geralmente comparado a um sinal que corresponde a um valor de corte predeterminado. Por exemplo, um valor de corte ilustrativo para a detecção de um câncer pode ser a média do sinal médio obtido 25 quando o anticorpo imobilizado é incubado com amostras de pacientes sem câncer. Em geral, uma amostra gerando um sinal de cerca de três desviospadrão acima do determinado valor de corte seria considerada positiva para o câncer. Em uma incorporação alternada, o valor de corte pode ser determinado usando "Receiver Operator Curve", de acordo com o método de 30 Sackett et al., Clinicai Epidemiology. A Basic Science for Clinicai Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. Em tal incorporação, o valor de corte pode ser determinado através de um gráfico de pares de índice verdadeiro positivo (isto é, sensibilidade) e índice falso positivo (100% especificidade), que correspondem a cada valor de corte possível para o resultado do teste de diagnóstico. O valor de corte no gráfico, que é o mais próximo do canto superior esquerdo (isto é, o valor que inclui a maior área), é o valor de corte 5 mais preciso, e uma amostra gerando um sinal que é superior ao valor de corte determinado por este método pode ser considerada positiva. Alternativamente, o valor de corte pode ser deslocado para a esquerda ao longo do gráfico, para minimizar o índice falso positivo, ou para a direita, para minimizar o índice falso negativo. Em geral, uma amostra gerando um sinal que é 10 superior ao valor de corte determinado por este método é considerada positiva para um câncer.
É contemplado que a ensaio de diagnóstico possibilitada pelo kit será realizada em testes de formato de fluxo ou teste rápido, onde o agente de ligação é imobilizado em uma membrana, como a nitrocelulose. No teste 15 rápido, os polipeptídios dentro da amostra se ligam ao agente de ligação imobilizado enquanto a amostra passa através da membrana. Um segundo agente de ligação marcado, se liga então ao complexo de ligação agentepolipeptídio enquanto uma solução contendo o segundo agente de ligação flui através da membrana. A detecção de ligação do segundo agente de Iiga20 ção pode então ser realizada como descrito acima. No teste de fita, uma ponta da membrana à qual o agente de ligação está ligado será imersa em uma solução contendo a amostra. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região que contém o segundo agente de ligação e para a área do agente de ligação imobilizado. A concentração do segundo agente 25 de ligação na área dos anticorpos imobilizados indica a presença de um câncer. A geração de um padrão, como uma linha, no local de ligação, que pode ser lida visualmente, será indicativa de um teste positivo. A ausência de tal padrão indica um resultado negativo. Em geral, a quantidade de agente de ligação imobilizado na membrana é selecionada para gerar um padrão 30 visualmente perceptível quando a amostra biológica contém um nível de polipeptídio que seria suficiente para gerar um sinal positivo no ensaio sanduíche com dois anticorpos, no formato discutido acima. Os agentes de ligação preferidos para o uso na ensaio de diagnóstico imediata são os anticorpos revelados instantaneamente, os fragmentos do antígeno de ligação do mesmo, e quaisquer agentes de ligação relacionados ao CDMAB como descrito aqui. A quantidade de anticorpo imobilizado na membrana será qualquer 5 quantidade eficaz para produzir uma ensaio de diagnóstico, e pode variar entre cerca de 25 nanogramas a aproximadamente 1 micrograma. Tipicamente tais testes podem ser realizados com uma quantidade bem pequena de amostra biológica.
Além disso, o CDMAB da presente invenção pode ser usado para pesquisa no laboratório devido à sua capacidade para identificar o seu antígeno-alvo.
A fim de que a invenção descrita aqui possa ser entendida mais detalhadamente, a seguinte descrição foi estabelecida.
A presente invenção fornece o CDMAB (ou seja, o CDMAB IDAC 051206-03) que reconhece especificamente e vincula o antígeno IDAC 051206-03.
O CDMAB do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03 pode ser em qualquer forma, desde que tenha uma região de ligação do antígeno que 20 inibe competitivamente a ligação do imunoespecífico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma IDAC 051206-03 ao seu antígeno-alvo. Assim, quaisquer proteínas recombinantes (por exemplo, a proteína de fusão em que o anticorpo é combinado com uma segunda proteína, tal como uma Iinfocina ou um inibidor do fator de crescimento tumoral), com a especificida25 de de ligação que o anticorpo IDAC 051206-03 revela no escopo da presente invenção.
Em uma incorporação da invenção, o CDMAB é o anticorpo IDAC 051206-03.
Em outras incorporações, o CDMAB é um fragmento do antígeno de ligação, que pode ser uma molécula Fv (como uma molécula Fv de cadeia única), uma molécula Fab, uma molécula Fab', uma molécula F(ab')2, uma proteína de fusão, um anticorpo bispecifico, um heteroanticorpo ou qualquer molécula recombinante que tenha a região de ligação do antígeno do anticorpo IDAC 051206-03. O CDMAB da invenção é direcionado ao epítopo para o qual o anticorpo monoclonal IDAC 051206-03 é direcionado.
O CDMAB da invenção pode ser modificado, isto é, através de 5 modificações do aminoácido dentro da molécula de modo a produzir moléculas derivativas. Também pode ser possível a modificação química, assim como a modificação por mutação direta, métodos de maturação de afinidade, exibição de fagos ou mistura da cadeia.
Afinidade e especificidade podem ser modificadas ou aperfeiço10 adas fazendo a mutação dos resíduos de CDR e/ou de fenilalanina triptofano (FW) e fazendo a triagem das regiões do antígeno de ligação tendo as características desejadas (por exemplo, Yang et al., J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403). Uma maneira é randomizar os resíduos individuais ou as combinações de resíduos de modo que em uma população de regiões idênticas do 15 antígeno de ligação, os subsistemas de dois a vinte aminoácidos sejam encontrados em posições específicas. Alternativamente, as mutações podem ser induzidas por uma gama de resíduos por métodos de com tendência ao erro (error prone PCR methods) (por exemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol.,
(1992) 226: 889-96). Em outro exemplo, os vetores de exibição do fago contendo genes de região variável de cadeias pesada e leve podem ser propagados em descendências mutadoras de E. coli (por exemplo, Low et al., J. Mol. Biol., (1996) 250: 359-68). Estes métodos de mutagênese são ilustrativos dos muitos métodos conhecidos pelos versados na técnica.
Outra forma de aumentar a afinidade dos anticorpos da presente 25 invenção é realizar uma mistura das cadeias, onde a cadeia leve ou pesada é aleatoriamente pareada com outras cadeias leves ou pesadas para preparar um anticorpo com maior afinidade. Os vários CDRs dos anticorpos também podem ser misturados com os correspondentes CDRs em outros anticorpos.
As moléculas derivativas reteriam a propriedade funcional dos
polipeptídios, ou seja, a molécula tendo tais substituições ainda permitiria a ligação do polipeptídio ao antígeno IDAC 051206-03 ou regiões destes. Estas substituições do aminoácido incluem, mas não são necessariamente limitadas a, as substituições de aminoácido conhecidas na técnica como "conservadoras".
Por exemplo, é um princípio bem-estabelecido da química da 5 proteína que certas substituições de aminoácido, intituladas "substituições conservadoras do aminoácido", podem ser feitas com freqüência em uma proteína sem alterar tanto a conformação quanto a função da proteína.
Essas mudanças incluem a substituição de qualquer isoleucina (I), valina (V) e Ieucina (L) por qualquer outros desses aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) pelo ácido glutâmico (E) e vice-versa; glutamina (Q) pela asparagina (N) e vice-versa; e serina (S) pela treonina (T) e viceversa. Outras substituições também podem ser consideradas conservadoras, dependendo do ambiente de um determinado aminoácido e seu papel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, a glicina (G) e a alanina (A) podem ser trocáveis com freqüência, assim como a alanina e a valina (V). A metionina (M), que é relativamente hidrofóbica, pode ser freqüentemente trocável com a Ieucina e a isoleucina, e às vezes com a valina. A Iisina (K) e arginina (R) são com freqüência trocadas em locais em que a característica significativa do resíduo do aminoácido é a sua carga e os diferentes ‘ 20 pKs destes dois resíduos de aminoácidos não são significativos. Outras alterações ainda podem ser consideradas "conservadoras" em ambientes especiais.
EXEMPLO 1
Produção de Hibridoma - Linhagem celular de hibridoma 25 AR90A56.11
A linhagem celular de hibridoma AR90A56.11 foi depositada segundo o Tratado de Budapeste, junto ao Autoridade Depositária Internacional do Canadá (IDAC), Bureau of Microbiology, Health Canadá, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá, R3E 3R2, no dia 5 dezembro de 30 2006, sob número de acesso 051206-03. De acordo com o 37 CFR 1.808, os depositantes garantem que todas as restrições impostas, sobre a disponibilização ao público, dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão de uma patente. O depósito será substituído se o depositário não puder distribuir amostras viáveis.
Para produzir o hibridoma que produz o anticorpo contra o câncer AR90A56.11, a suspensão de uma única célula congelada de tecido tumoral do adenocarcinoma de pulmão (Collaborative Genomics, Cambridge, MA) foi preparada em PBS. O IMMUNEASY® adjuvante (Qiagen, Venlo, Países Baixos) foi preparado para o uso com uma mistura suave. Camundongos BALB/c de cinco a sete semanas de idade foram imunizados através de injeção subcutânea de 2 milhões de células em 50 microlitros do antígenoadjuvante. O antígeno-adjuvante recentemente preparado foi usado para estimular os camundongos imunizados intraperitonealmente, 2 e 5 semanas após a imunização inicial, com 2 milhões de células em 50 microlitros. O baço foi usado para a fusão três dias após a última imunização. Os hibridomas foram preparados pela fusão do esplenócito isolado com os parceiros do míeloma NSO-1. Os sobrenadantes a partir da fusão foram testados pelos subclones dos hibridomas.
Foi usado o teste ELISA para determinar se os anticorpos secretados pelas células do hibridoma são do isotipo IgG ou IgM. Foram adicionados às placas ELISA 100 microlitros/poço de cabra anticamundongo IgG + 20 IgM (H+L) em uma concentração de 2,4 microgramas/mL em revestimento tampão (tampão de carbonato/bicarbonato a 0,1 M, pH 9,2-9,6) a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas três vezes no tampão de lavagem (PBS + 0,05 por cento Tween). Foi adicionado à placa um tampão de bloqueio de 100 microlitros/poço (5 por cento do leite em tampão de lavagem) durante 1 25 hora, à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas três vezes no tampão de lavagem. Foram adicionados 100 microlitros/poço de hibridomas sobrenadante e a placa foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com o tampão de lavagem e diluição 1/100.000 de cabra anticamundongo IgG ou peroxidase de rábano silvestre 30 IgM conjugado (diluído em PBS contendo 1 por cento de leite), foi adicionado 100 microlitros/poço. Após a incubação da placa durante 1 hora à temperatura ambiente, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem. Foram incubados 100 microlitros/poço de solução OST por 1-3 minutos à temperatura ambiente. A cor da reação foi terminada pela adição de 50 microlitros/poço H2SO4 a 2M e a placa foi lida a 450 nm com uma leitora de placa Perkin Elmer-HTS7000. Conforme indicado na figura 1, o hibridoma 5 AR90A56.11 secretou principalmente anticorpos do isotipo IgG.
Para determinar a subclasse do anticorpo secretado pelas células do hibridoma, foi realizado um experimento de isotipo usando um kit de isotipo de anticorpo monoclonal de camundongo (HyCuIt Biotecnology, Frontstraat, Países Baixos). Foram adicionados 500 microlitros da solução 10 tampão ao teste de fita contendo anticorpos específicos de subclasse rato anticamundongo. Foram adicionados 500 microlitros do hibridoma sobrenadante ao tubo de ensaio e submersos por agitação suave. Imunoglobulinas de camundongo capturadas foram detectadas diretamente por um anticorpo monoclonal secundário de camundongo que é acoplado a partículas coloi15 dais. A combinação dessas duas proteínas cria um sinal visual usado para analisar o isotipo. O anticorpo anticâncer AR90A56.11 é do isotipo lgG2a kappa.
Após uma etapa de diluição limitante, os hibridomas sobrenadantes foram testados para anticorpos que se ligam às células-alvo em uma
- 20 célula do teste ELISA. Foram testadas três linhagens celulares humanas de câncer de pulmão, uma linhagem celular humana de câncer de mama e uma linhagem celular não-cancerosa de pulmão humano: A549, NCI-H23, NCIH460, MDA-MB-231 e Hs888.Lu respectivamente. Todas as linhagens celulares foram obtidas do American Type Tissue Collection (ATCC, Manassas, 25 VA). As células plaqueadas foram fixadas antes do uso. As placas foram lavadas três vezes com PBS contendo MgCI2 e CaCI2, à temperatura ambiente. 100 microlitros de 2 por cento de paraformaIdeído diluído em PBS foi adicionado a cada poço por 10 minutos em temperatura ambiente e depois descartado. As placas foram novamente lavadas três vezes com PBS con30 tendo MgCI2 e CaCl2 à temperatura ambiente. O bloqueio foi realizado com 100 microlitros/poço de 5 por cento do leite em tampão de lavagem (PBS + 0,05 por cento Tween) por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e o hibridoma sobrenadante foi adicionado a 100 microlitros/poço por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e foi adicionado 100 microlitros/poço de 1/25.000 diluição de anticorpo IgG anticamundongo de 5 cabra conjugado à peroxidase de rábano silvestre (diluído em PBS contendo
1 por cento de leite). Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e foi incubado 100 microlitro/poço de substrato ®B por 1-3 minutos em temperatura ambiente. A reação foi encerrada com 50 microlitros/poço H2SO4 a 2M e a leitura da placa 10 foi feita em 450 nm com uma leitora de placa Perkin-Elmer HTS7000. Os resultados conforme tabulados na figura 1 foram expressos como o número de vezes acima do fundo comparado com um controle interno de isotipo IgG1 que foi mostrado previamente não se ligar às linhagens celulares testadas. Os anticorpos do hibridoma AR90A56.11 demonstraram forte ligação com a 15 linhagem celular de câncer do pulmão NCI-H23 e com a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231 não-ligada detectada às outras linhagens celulares de câncer ou linhagem celular não-cancerosa do pulmão.
Em conjunto com o teste para ligação do anticorpo, o efeito citotóxico dos hibridomas sobrenadantes (citotoxicidade induzida por anticorpos) foi testado em linhagens celulares: A549, NCI-H23, NCI-H460, MDA-MB-231 e Hs888.Lu. A calceína AM foi obtida a partir de sondas moleculares (Eugene, OR) e o teste foi realizado conforme descrito abaixo. As células foram plaqueadas antes do teste, na densidade adequada predeterminada. Após de 2 dias, 100 microlitros do sobrenadante das placas de microtitulação do hibridoma foram transferidos para as placas de célula e incubadas em uma incubadora de 5 por cento de CO2 por 5 dias. Os poços que serviram como controles positivos foram aspirados até esvaziar e foram adicionados 100 microlitros de azida de sódio (NaN3, 0,01 por cento, Sigma, Oakville, ON) ou ciclo-heximida (CHX, 0,5 micromolar, Sigma, Oakville, ON) dissolvidos em meio de cultura. Após 5 dias de tratamento, as placas foram então esvaziadas por inversão e absorção a seco ("blotting dry"). Uma DPBS (solução salina tamponada com fosfato Dulbecco) à temperatura ambiente contendo MgCI2 e CaCI2 foi dispensada em cada poço proveniente de um frasco espremedor multicanal, espremida 3 vezes, esvaziada por inversão e, em seguida, absorvida a seco ("blotted dried"). 50 microlitros do corante fluorescente calceína diluído em DPBS contendo MgCI2 e CaCI2 foram adicionados 5 em cada poço e incubados a 37°C, em uma incubadora de 5 por cento de CO2 por 30 minutos. As placas foram lidas em uma leitora de placa de fluorescência Perkin Elmer-HTS7000 e os dados foram analisados no Microsoft Excel. Os resultados estão tabulados na figura 1. O sobrenadante do hibridoma AR90A56.11 produziu citotoxidade específica de 23 por cento nas cé10 lulas de câncer de pulmão NCI-H23. Foram 26 e 74 por cento da citotoxicidade obtida com os controles positivos azida de sódio e ciclo-heximida, respectivamente.
Os resultados da figura 1 demonstram que os efeitos citotóxicos do AR90A56.11 não estavam diretamente relacionados aos níveis de ligação 15 nos tipos celulares de câncer. Embora houvesse ligação semelhante às células NCI-H23 e MDA-MB-231, a citotoxidade foi apenas detectável nas células NCI-H23. Como tabulado na figura 1, o AR90A56.11 não produziu citotoxidade na linhagem celular pulmonar não-cancerosa humana Hs888.Lu. Os agentes citotóxicos não-específicos conhecidos cicloheximide e NaN3 geral>■ 20 mente produziram citotoxicidade como esperado.
EXEMPLO 2 Ligações in vitro
O anticorpo monoclonal AR90A56.11 foi produzido pela cultura do hibridoma em tubos CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON), com cole25 tas e replantios ocorrendo duas vezes por semana. Foram seguidos os processos-padrões de purificação de anticorpo com coluna de afinidade de Proteína G ("Protein G Sepharose 4 Fast Flow") (Amersham Biosciences, Baie d’Urfé, QC). Está no escopo da presente invenção utilizar anticorpos monoclonais que são di-imunízados, humanizados, murinos ou quiméricos.
30 Ligações do AR90A56.11 ao câncer de pulmão (A549, NCI-H23,
NCI-H322M, NCI-H460, e NCI-H520), de cólon (Lovo), de mama (MDA-MB231), de pâncreas (BxPC-3), de próstata (PC-3) e de ovário (OVCAR-3), e linhagens celulares não-cancerosas de pele (CCD-27sk) e de pulmão (Hs888.Lu) foram avaliados por citometria de fluxo (FACS). Todas as linhagens celulares, com exceção da linhagem celular de câncer de pulmão NCIH322M, foram obtidas da American Type Tissue Collection (ATCC, Manas5 sas, VA). A NCI-H322M foi obtida a partir do NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository (Frederick, MD).
As células foram preparadas pela FACS inicialmente lavando a monocamada celular com DPBS (sem Ca++ e Mg++). O tampão para dissociação celular (Invitrogen, Burlington, ON) foi, então, usado para desalojar as 10 células a partir das suas placas de cultura celular a 37°C. Após a centrifugação e a coleta, as células foram ressuspensas em DPBS contendo MgCI2, CaCI2 e 2 por cento de soro bovino fetal a 4°C (meio de coloração) e contadas, separadas para a densidade celular adequada, viradas para baixo para sedimentar as células e ressuspensas no meio de coloração à 4°C, na pre15 sença do teste de anticorpo (AR90A56.11) ou controle de anticorpos(controle isotípico, anti-EGFR). O controle isotípico e o teste de anticorpo foram avaliados em 20 microgramas/mL enquanto o anti-EGFR foi avaliado em 5 microgramas/mL no gelo por 30 minutos. Antes da adição do anticorpo secundário conjugado ao Alexa Fluor 546, as células foram lavadas uma vez 20 com o meio de coloração. O anticorpo conjugado ao Alexa Fluor 546 no meio de coloração foi então colocado a 4°C por 30 minutos. As células foram então lavadas pela última vez e ressuspensas no meio de fixação (meio de coloração contendo 1,5 porcento de paraformaldeído). Aquisição citométrica de fluxo das células foi avaliada por realizar amostras em um FACSarray® 25 usando o software FACSarray® (BD Biosciences, Oakville, ON). "Forward" (FSC) e ("side scatter") (SSC) das células foram definidos pelo ajuste dos ganhos de voltagem e de amplitude nos detectores FSC e SSC. Os detectores para o canal de fluorescência (Alexa-546) foram ajustados para utilizar as células não-tingidas de tal modo que as células tivessem um pico unifor30 me com uma intensidade fluorescente media de aproximadamente 1-5 unidades. Para cada amostra, cerca de 10.000 eventos "gatted" (células tingidas fixadas) foram conseguidos para a ensaio e os resultados estão apresentados na figura 2.
A figura 2 apresenta o aumento da intensidade de fluorescência média acima do controle isotípico. Histogramas representativos dos anticorpos AR90A56.11 foram compilados na figura 3. O AR90A56.11 demonstrou 5 ligação detectável às linhagens celulares de câncer de pulmão NCI-H23 (9,5-vezes), de mama MDA-MB-231 (3,5-vezes), de pâncreas BxPC-3 (3,9- vezes), de próstata PC-3 (1,5-vezes) e de ovário OVCAR-3 (2,0-vezes). Não houve ligação detectável para outras linhagens celulares testadas, incluindo pele não-cancerosa CCD-27sk e linhagens de células de pulmão Hs888.Lu.
10 Os dados da ligação do FACS são consistentes com a ligação da célula ELISA descrita no Exemplo 1. Estes dados também demonstram que o AR90A56.11 se liga a várias linhagens celulares cancerosas diferentes com níveis variados de expressão de antígeno e mostraram ligação diferencial ao câncer versus linhagens de células normais.
15 EXEMPLO 3
Experimentos tumorais in vivo com células BxPC-3
Os exemplos 1 e 2 demonstraram que o AR90A56.11 tinha propriedades anticâncer contra as linhagens celulares de câncer humano com ligação detectável nas várias indicações diferentes do câncer. Com referên
- 20 cia às figuras 4 e 5, camundongos SCID do sexo feminino de 8 a 10 semanas de idade foram implantados com 5 milhões de células pancreáticas humanas (BxPC-3) em 100 microlitros de solução PBS injetado subcutaneamente na nuca do pescoço. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de 8 de tratamento. No dia após o implante, 10 mg/kg do an25 ticorpo AR90A56.11 teste ou do controle tampão foram administrados intraperitonealmente para cada coorte em um volume de 300 microlitros após a diluição da concentração armazenada com um diluente que continha 2,7 mM KCI, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCI e 20 mM Na2HPO4. O anticorpo e as amostras controle foram, então, administrados três vezes por semana, pela 30 duração do estudo, da mesma forma. O crescimento tumoral foi medido em aproximadamente cada sétimo dia com calibradores. O estudo foi concluído após 24 doses de anticorpos. O peso corporal dos animais foi registrado uma vez por semana, pela duração do estudo. Ao final do estudo, todos os animais foram sacrificados de acordo com as orientações do CCAC.
O AR90A56.11 reduziu o crescimento tumoral no BxPC-3 in vivo do modelo profilático de câncer pancreático humano. O tratamento ARIUS 5 com o anticorpo AR90A56.11 reduziu o crescimento dos tumores BxPC-3 por 57 por cento (p=0,0076, teste T) em comparação ao grupo tratado com tampão, como determinado no dia 56, 1 dia após a última dose de anticorpo (figura 4).
Não houve sinais clínicos de toxicidade durante o estudo. O pe10 so corporal medido em intervalos semanais foi um substituto para o bemestar e o fracasso prosperarem. A média de peso corporal aumentou ligeiramente em todos os grupos ao longo da duração do estudo (figura 5). A média de ganho de peso entre o dia 1 e o dia 56 foi de 0,75 g (3,37 por cento) no grupo de controle e de 0,88 g (3,96 por cento) no grupo tratado com 15 AR90A56.11. Não houve diferenças significativas entre os grupos ao final do período de tratamento.
Em resumo, o AR90A56.11 foi bem tolerado e diminuiu a carga tumoral neste modelo de xeno-tumor pancreático humano.
EXEMPLO 4 Isolamento de Ligações Competitivas
Dado um anticorpo, o versado na técnica pode gerar um CDMAB competitivamente inibidor, por exemplo, um anticorpo competidor que é um que reconhece o mesmo epítopo (Belanger L et al. Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). Um método obriga imunizar com um imunogénio que ex25 pressa o antígeno reconhecido pelo anticorpo. A amostra pode incluir, mas não se limitara, tecidos, proteína(s) isolada(s) ou linhagem(s) celular(es). Os hibridomas resultantes podem ser triados através de uma ensaio competitiva, a qual identifica anticorpos que inibem a ligação do anticorpo de teste, como ELISA, FACS ou Western blotting. Outro método pode fazer uso de 30 bibliotecas de anticorpo que exibem fago e "panning" (panning) os anticorpos que reconhecem, pelo menos, um epítopo do referido antígeno (Rubinstein JL et al. Anal Biochem 314:294-300 (2003)). Em ambos os casos, os anticorpos são selecionados com base na capacidade de desalojar a ligação do anticorpo original marcado para, pelo menos, um epítopo do seu antígeno-aivo. Tais anticorpos, portanto, possuiriam a característica de reconhecer, pelo menos, um epítopo do antígeno como o anticorpo original.
5 EXEMPLO 5
Clonagem de Regiões Variáveis do Anticorpo Monoclonal AR90A56.11
Podem ser determinadas as seqüências das regiões variáveis das cadeias pesadas (Vh) e leves (Vl) de anticorpo monoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma AR90A56.11. O RNA que codifica as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina pode ser extraído a partir do hibridoma revelado usando métodos padrão envolvendo solubilização celulares com isotiocianato de guanidina (Chirgwin et al. Biochem. 18:5294-5299 (1979)). O mRNA pode ser usado para preparar DNAc para posterior isolamento dos genes Vh e Vl através da metodologia PCR conhecida na técnica (Sambrook et al., eds., Molecular Cloning, capítulo 14, Cold Spring Harbor Iaboratories Press, NY (1989)). A seqüência N-terminal de aminoácido de cadeias pesadas e leves pode ser determinada independentemente pelo seqüenciamento automatizado Edman. Mais trechos do CDRs e seções de FRS também podem ser determinados pela seqüência de aminoácido dos *■ 20 fragmentos Vh e VL. Os iniciadores sintéticos podem então ser desenhados para o isolamento dos genes Vh e Vl do anticorpo monoclonal AR90A56.11, e os genes isolados podem se ligar a um vetor adequado para a seqüenciação. Para gerar IgG quimérico e humanizado, a Iuz variável e domínios variáveis pesados podem ser subclonados em um vetor adequado para expressão.
Em outra incorporação, o AR90A56.11 ou sua versão diimunizada, quimérica ou humanizada é produzida expressando um ácido nucleico codificando o anticorpo em um animal transgênico, de tal forma que o anticorpo é expresso e pode ser recuperado. Por exemplo, o anticorpo po30 de ser expresso em uma forma de tecido específica que facilite a recuperação e purificação. Em tal incorporação, um anticorpo da invenção é expresso na glândula mamária para secreção durante a lactação. Animais transgênicos incluem, mas não são limitados a, camundongos, cabras e coelhos. OAnticorpo Monoclonal
O DNA que codifica o anticorpo monoclonal (conforme descrito no Exemplo 1) é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias leves e pesadas dos anticorpos monoclonais). A célula de hibridoma serve como uma fonte preferencial de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são, então, transfectados em células hospedeiras como as células de E. coli, células simianas COS, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outra forma proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência de código para os domínios constantes de cadeia humana pesada e leve no lugar das seqüências de homólogas murinos. Os anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos na química de proteína sintética, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca do bissulfureto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem o iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato.
(ii) Anticorpo Humanizado
Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoá25 cido introduzido a partir de uma fonte não-humana. Estes resíduos de aminoácido não-humanos são muitas vezes referidos como resíduos de "importação", que são geralmente tomados a partir de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser realizada com o método de Winter e colaboradores substituindo as seqüências dos roedores CDRs ou CDR pelas 30 seqüências correspondentes de um anticorpo humano (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988), revistas em Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000)).
Um anticorpo humanizado pode ser preparado por um processo de ensaio das seqüências mães e vários produtos humanizados conceituais, usando modelos tridimensionais das seqüências mães e humanizada. Mode5 Ios tridimensionais de imunoglobulina estão geralmente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis das seqüências de imunoglobulina do candidato selecionado. A inspeção dessas exibições permite a ensaio do provável papel dos 10 resíduos no funcionamento das seqüências de imunoglobulina do candidato, ou seja, a ensaio de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina do candidato vincular-se ao seu antígeno. Desta forma, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir da seqüência consensual e de importação de modo em que a característica desejada do anticorpo, tais co15 mo o aumento da afinidade para o(s) antígeno(s)-alvo(s), seja alcançada. Em geral, os resíduos CDR são diretamente e mais fortemente envolvidos na influência de ligação do antígeno.
(iii) Fragmentos de Anticorpo
Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de - 20 fragmentos de anticorpos. Esses fragmentos podem ser produzidos por células hospedeiras recombinante (revistas em Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999), Little et al. Immunol. Today 21:364-370 (2000)). Por exemplo, fragmentos Fab1-SH podem ser recuperados diretamente do E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio25 technology 10:163-167 (1992)). Em outra incorporação, o F(ab')2 é formado usando o zíper da Ieucina GCN4 para promover a montagem da molécula F(ab')2- De acordo com outra abordagem, os fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula hospedeira recombinante.
30 EXEMPLO 6
Uma composição que inclui o anticorpo da presente invenção
O anticorpo da presente invenção pode ser usado como uma composição para a prevenção/tratamento do câncer. A composição para a prevenção/tratamento do câncer, que compreende o anticorpo da presente invenção, é de baixa toxicidade e pode ser administrada como ela é, na forma de preparações líquidas, ou como composições farmacêuticas de prepa5 rações apropriadas para o homem ou mamíferos (por exemplo, ratos, coelhos, carneiros, suínos, bovinos, felinos, caninos, símios etc.), por via oral ou parenteral (por exemplo, intravascularmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, etc.). O anticorpo da presente invenção pode ser administrado sozinho ou pode ser administrado como uma composição adequada. A com10 posição usada para a administração pode conter um veículo farmacologicamente aceitável com o anticorpo da presente invenção ou seu sal, um diluente ou excipiente. Tal composição é fornecida na forma de preparações farmacêuticas adequadas para administração oral ou parenteral.
Os exemplos de composição para a administração parenteral são preparações injetáveis, supositórios, etc. As preparações injetáveis podem incluir formas de administração, como injeções intravenosas, subcutâneas, intramusculares e intracutâneas, infusões de gotejamento, injeções intra-articulares etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas pela dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo da presente invenção ou seu sal em meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente utilizado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, o soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizador adequado, como um álcool (por exemplo, o etanol), um poliálcool (por exemplo, o propilenoglicol e o polietilenoglicol), um tensoativo não-iônico (por exemplo, o polissorbato 80, o HCO-50 (polioxietileno (50 mois) aduto de óleo de rícino hidrogenado)) etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, o óleo de gergelim, o óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizador, como o benzoato de benzila, o álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é normalmente preenchida em uma ampola adequada. O supositório usado para administração retal pode ser preparado misturando o anticorpo da presente invenção ou o seu sal com bases convencionais para supositórios. A composição para a administração ora! inclui preparados sólidos ou líquidos, mais especificamente, comprimidos (incluindo drágeas e 5 comprimidos revestidos com filme), pílulas, grânulos, preparações em pó, cápsulas (incluindo cápsulas moles), xaropes, emulsões, suspensões, etc. Tal composição é produzida por métodos conhecidos publicamente e pode conter um veículo, um diluente ou excipiente convencionalmente usado no campo de preparações farmacêuticas. Exemplos de veículo ou excipiente 10 para os comprimidos é a lactose, o amido, a sacarose, o estearato de magnésio, etc.
Vantajosamente, as composições para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em preparações farmacêuticas com uma dose unitária adaptada para caber uma dose dos ingredientes ativos. Tais 15 preparações de dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade contida do referido composto é geralmente de 5 a 500 mg por dose unitária; é preferível que o anticorpo descrito acima esteja contido especialmente na forma de injeção em aproximadamente 5 a 100 mg, e de 10 a 250 mg em outras for
1 20 mas.
A dose do referido agente ou regulador profilático/terapêutico que compreende o anticorpo da presente invenção pode variar dependendo do indivíduo a ser administrado, da doença-alvo, das condições, das vias de administração, etc. Por exemplo, quando usados para fins de tratamen25 to/prevenção, como câncer de mama em um adulto, é vantajoso administrar o anticorpo da presente invenção intravenosamente em uma dose de cerca de 0,01 para 20 mg/kg de peso corporal, de preferência cerca de 0,1 para 10 mg/kg de peso corporal e mais preferencialmente cerca de 0,1 para 5 mg/kg de peso corporal, de 1 a 5 vezes/dia, de preferência de 1 a 3 vezes/dia. Em 30 outra administração parenteral e oral, o agente pode ser administrado em uma dose correspondente à dose dada acima. Quando a condição é especialmente grave, a dose pode ser aumentada de acordo com a condição. O anticorpo da presente invenção pode ser administrado como se encontra, ou sob a forma de uma composição adequada. A composição usada para a administração pode conter um veículo farmacologicamente aceitável com o anticorpo supracitado ou seus sais, um diluente ou um exci5 piente. Tal composição é fornecida na forma de preparações farmacêuticas adequadas para administração oral ou parenteral (por exemplo, injeção intravascular, injeção subcutânea, etc.). Cada composição descrita acima pode ainda conter outros ingredientes ativos. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser usado em combinação com outros fármacos, como 10 por exemplo, os agentes alquilantes (como a ciclofosfamida, a ifosfamida, etc.), os antagonistas metabólicos (como o metotrexato, o 5- fluorouracilaetc.), os antibióticos antitumorais (como a mitomicina, a adriamicina, etc.), os agentes antitumorais vegetais (como a vincristina, a vindesina, o Taxol, etc.), a cisplatina, a carboplatina, o etoposide, o irinotecano, etc. O 15 anticorpo da presente invenção e os fármacos descritos acima podem ser administrados simultaneamente ou em vezes balanceadas para o paciente.
O método de tratamento descrito aqui, especialmente para o câncer, também pode ser realizado com a administração de anticorpos ou outros agentes quimioterápicos. Por exemplo, um anticorpo contra o EGFR1 20 como o Erbitux® (cetuximab), também pode ser administrado, especialmente ao tratar o câncer de cólon. O Erbitux® também tem se mostrado eficaz para o tratamento de psoríase. Outros anticorpos para a combinação de uso incluem o Herceptin® (trastuzumab), sobretudo no tratamento do câncer de mama, o Avastin® especialmente ao tratar o câncer de cólon e o SGN-15 25 quando tratar o câncer de pulmão de não-células pequenas. A administração do anticorpo da presente invenção com outros anticorpos/agentes quimioterápicos pode ocorrer simultaneamente, ou separadamente, através da mesma via ou de outra.
O agente quimioterápico ou outros sistemas de anticorpos utilizados inclui qualquer sistema que se acredita ser mais eficiente para o tratamento da condição do paciente. Malignidades diferentes podem exigir o uso de anticorpos antitumorais específicos e agentes quimioterápicos específicos, que será determinado paciente a paciente. Em uma incorporação preferida da invenção, a quimioterapia é administrada simultaneamente, ou mais preferencialmente, posteriormente à terapia com anticorpo. Deve-se ressaltar, entretanto, que a presente invenção não se limita a qualquer método em particular ou via de administração.
A preponderância da evidência mostra que o AR90A56.11 media os efeitos anticâncer através da ligação de um epítopo presente em linhagens celulares de câncer. Além disso, poderia ser mostrado que o anticorpo AR90A56.11 poderia ser usado na detecção de células que expressam o 10 epítopo que se liga especificamente a ele; utilizando técnicas ilustradas por, mas não limitando a, FACS, ELISA celular ou IHQ.
Todas as patentes e publicações mencionadas nesta especificação são indicativas dos níveis dos versados na técnica a qual a invenção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por referência na mesma medida, como se cada publicação individual fosse indicada especificamente e individualmente para ser incorporada por referência.
É para ser entendido que, enquanto certa forma da invenção é ilustrativa, não é para ser limitada à forma específica ou às disposições das partes aqui descritas e ilustradas. Será visível para os versados na técnica 20 que várias alterações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção, e a invenção não é para ser considerada limitada ao que é apresentado e descrito na especificação.
O versado na técnica irá facilmente reconhecer que a presente invenção está bem-adaptada para por em prática os objetivos e obter as fi25 nalidades e as vantagens mencionadas, bem como aquelas nele inerentes. Quaisquer oligonucleotídeos, peptídeos, polipeptídios, compostos biologicamente relacionados, métodos, procedimentos e técnicas descritos neste documento são atualmente representativos das incorporações preferenciais, pretendem ser exemplares e não pretendem ser Iimitante do escopo. As mu30 danças nele e outras utilizações irão ocorrer para os versados na técnica, que são englobadas no espírito da invenção e que são definidas pelo escopo das reivindicações anexadas. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as incorporações preferenciais, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais incorporações específicas. Realmente, várias modificações dos modos descriios para a realização da invenção, que são óbvias para os versados na técnica, se destinam a ser dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (48)

1. Anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03.
2. Anticorpo-Iigante do anticorpo monoclonal isolado de reivindicação 1.
3. Versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206- 03 ou um fragmento do antígeno de ligação produzido a partir do referido anticorpo humanizado.
4. Anticorpo-Iigante do anticorpo humanizado como definido na reivindicação 3.
5. Versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03 ou um fragmento de antígeno de ligação produzido a partir do referido anticorpo quimérico.
6. Anticorpo-Iigante do anticorpo quimérico como definido na reivindicação 5.
7. Anticorpo isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, conjugados com um membro selecionado do grupo consistindo em porções citotóxicas, enzimas, compostos radioativos, citocinas, interferons, porções atingidas ou reveladas, células hematogênicas.
8. Linhagem celular isolada de hibridoma depositada junto ao IDAC com número de acesso 051206-03.
9. Método para iniciar a citotoxicidade induzida por anticorpo de células cancerosas em uma amostra de tecido selecionado de um tumor humano que compreende: fornecer uma amostra de tecido humano do referido tumor; fornecer o anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, o anticorpo humanizado do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, o anticorpo quimérico do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, ou um anticorpoIigante do mesmo, o qual o anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, e contatar o referido anticorpo monoclonal isolado, o referido anticorpo humanizado, o referido anticorpo quimérico ou o referido anticorpoligante do mesmo com a referida amostra do tecido; em que a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado, do referido anticorpo humanizado, do referido anticorpo quimérico ou do referido anticorpo-ligante do mesmo, com a referida amostra do tecido induz a citotoxicidade.
10. Método para tratar um tumor humano susceptível a citotoxicidade induzida pelo anticorpo em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma, depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, ou a um anticorpo-ligante do mesmo, o qual o anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, compreendendo a administração ao referido mamífero, do referido anticorpo monoclonal ou do referido anticorpoligante do mesmo, em uma quantidade eficaz que resulte em uma redução da referida carga tumoral do mamífero.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado com uma porção citotóxica.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a referida porção citotóxica é um isotipo radioativo.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo ativa o complemento.
14. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo media a citotoxicidade celular anticorpo dependente.
15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado.
16. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado.
17. Anticorpo monoclonal capaz de se ligar especificamente ao mesmo epítopo ou epítopos como o anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03.
18. Método de tratamento de um tumor humano em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma, depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, ou um anticorpo-ligante do mesmo, o qual o anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir a ligação da competitivamente do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, compreendendo a administração ao referido mamífero, do referido anticorpo monoclonal isolado ou do referido anticorpo-ligante do mesmo, em uma quantidade eficaz que resulte em uma redução da referida carga tumoral do mamífero.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado à porção citotóxica.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante ativa o complemento.
22. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo media a citotoxicidade celular anticorpo dependente.
23. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado.
24. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado.
25. Método de tratamento de um tumor humano em um mamífero, em que o referido tumor humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso051206-03 ou um anticorpo-ligante do mesmo, o qual o anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, compreendendo a administração ao referido mamífero, do referido anticorpo monoclonal ou anticorpo-ligante do mesmo, junto com, pelo menos, um agente quimioterápico em uma quantidade eficaz que resulte em uma redução da referida carga tumoral do mamífero.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado à porção citotóxica.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
28. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante ativa o complemento.
29. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo media a citotoxicidade celular anticorpo dependente.
30. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado.
31. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado.
32. Ensaio de ligação para determinar a presença de células cancerígenas em uma amostra de tecido selecionada de um tumor humano, que está especificamente ligado pelo anticorpo monoclonal isolado produzido pela linhagem celular de hibridoma AR90A56.11, tendo o número de acesso do IDAC 051206-03, o anticorpo humanizado do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC, com número de acesso 051206-03, ou os anticorpos quiméricos do anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, que compreende: fornecer uma amostra de tecido do referido tumor humano; fornecer pelo menos um do referido anticorpo monoclonal isolado, do referido anticorpo humanizado, do referido anticorpo quimérico ou de um anticorpo-ligante do mesmo, que reconhece o mesmo epítopo ou epítopos como aqueles reconhecidos pelo anticorpo monoclonal isolado produzido por uma linhagem celular de hibridoma AR90A56.11 tendo o número de acesso do IDAC 051206-03; contatar pelo menos um dos referidos anticorpos ou anticorpoligante fornecidos do mesmo, com a referida amostra do tecido; e determinar a ligação de pelo menos um dos referidos anticorpos ou anticorpo-ligante fornecidos do mesmo, com a referida amostra de tecido; a qual é indicada a presença das referidas células cancerosas na referida amostra do tecido.
33. Uso de anticorpos monoclonais para reduzir a carga tumoral humana, em que o referido tumor humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma, depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, ou um anticorpo-ligante do mesmo, cujo anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, compreendendo a administração ao referido mamífero, do referido anticorpo monoclonal ou do anticorpo-ligante do mesmo, em uma quantidade eficaz que resulte em uma redução da referida carga tumoral humana do mamífero.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma porção citotóxica.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
36. Método de acordo com a reivindicação 33, onde o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo ativa o complemento.
37. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo media a citotoxicidade celular anticorpo dependente.
38. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado.
39. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado.
40. Uso de anticorpos monoclonais para redução da carga tumoral humana, em que o referido tumor humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma, depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03, ou um anticorpo-ligante do mesmo, o qual o anticorpoligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a Iigação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, compreendendo a administração ao referido mamífero, do referido anticorpo monoclonal ou do anticorpo-ligante do mesmo; junto com pelo menos um agente quimioterápico em uma quantidade eficaz que resulte em uma redução da referida carga tumoral humanado mamífero.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é conjugado a uma porção citotóxica.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a referida porção citotóxica é um isótopo radioativo.
43. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo ativa o complemento.
44. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referido anticorpo monoclonal isolado ou o anticorpo-ligante do mesmo media a citotoxicidade celular anticorpo dependente.
45. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão humanizada do anticorpo monoclonal isolado.
46. O método de reivindicação 40, em que o referido anticorpo monoclonal isolado é uma versão quimérica do anticorpo monoclonal isolado.
47. Composição eficaz para tratar um tumor canceroso humano compreendendo em combinação: um anticorpo ou anticorpo-ligante como definido em qualquer uma das reivindicações 1,2,3,6,7,8, ou 17; uma conjugação do referido anticorpo ou um fragmento do antígeno de ligação do mesmo, com um membro selecionado do grupo constitu15 ido por porções citotóxicas, enzimas, compostos radioativos, citocinas, interferons, porções atingidas ou reveladas e células hematogênicas; e uma quantidade necessária de um veículo farmacologicamente aceitável; em que a referida composição é eficaz para tratar o referido tumor canceroso humano.
48. Kit de ensaio para detectar a presença de um tumor canceroso humano, em que o referido tumor canceroso humano expressa, pelo menos, um epítopo de um antígeno que se liga especificamente ao anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03 ou um anticorpo-ligante do mesmo, cujo anticorpo-ligante é caracterizado por uma capacidade de inibir competitivamente a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado ao seu antígeno-alvo, o kit compreendendo o anticorpo monoclonal isolado produzido pelo hibridoma depositado junto ao IDAC com número de acesso 051206-03 ou um anticorpo-ligante do mesmo, e meios para detectar se o anticorpo monoclonal isolado, ou um anticorpo-ligante do mesmo, está ligado a um polipeptídio cuja presença, em um nível determinado de valor de corte, é diagnóstico da referida presença do referido tumor canceroso humano.
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