ES2927646T3 - Terapia anti-CD47 sinérgica para cánceres hematológicos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de cánceres hematológicos, particularmente linfomas y leucemias, incluyendo, sin limitación, leucemias mielógenas y linfocíticas. Una combinación de anticuerpos específicos para CD47; y específicos para un marcador de superficie celular asociado con el cáncer se administran al paciente y proporcionan una disminución sinérgica en la carga de células cancerosas. La combinación de anticuerpos puede comprender una pluralidad de anticuerpos monoespecíficos o un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. Los marcadores de interés incluyen, sin limitación, CD20, CD22, CD52, CD33; CD96; CD44; CD123; CD97; CD99; PTHR2; y HAVCR2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia anti-CD47 sinérgica para cánceres hematológicos

ANTECEDENTES

La idea de una "bala mágica" fue propuesta por primera vez por Paul Ehrlich, quien a principios del siglo 20 postuló que si se podía hacer un compuesto que se dirigiera selectivamente a un organismo o célula causante de enfermedades, entonces podría administrarse una toxina para ese organismo o célula junto con el agente de selectividad. El descubrimiento de anticuerpos como agentes de direccionamiento específicos ha permitido el funcionamiento real de este concepto, aunque la implementación en la terapia clínica ha requerido modificaciones significativas.

Los anticuerpos terapéuticos han demostrado su eficacia en la lucha contra el cáncer, especialmente en los casos en los que falla la terapia convencional: De los 21 anticuerpos terapéuticos comercializados, 9 son para el tratamiento del cáncer. Aún más alentador es que los anticuerpos contra el cáncer generalmente operan en un mecanismo distinto de la quimioterapia o la radioterapia tradicionales, por lo que a menudo pueden combinarse con terapias tradicionales para generar un efecto sinérgico. Sin embargo, todavía hay mucho margen de mejora, ya que incluso los anticuerpos contra el cáncer más eficaces rara vez curan la enfermedad, especialmente en sus etapas más avanzadas.

El primer paciente tratado en los Estados Unidos con terapia de anticuerpos monoclonales fue un paciente con linfoma no Hodgkin, usando un anticuerpo monoclonal murino designado AB 89. Aunque el tratamiento no logró inducir una respuesta clínica significativa, representó la primera prueba de principio en humanos de que un anticuerpo monoclonal podría inducir disminuciones transitorias en el número de células tumorales circulantes, inducir células muertas circulantes y formar complejos con el antígeno circulante, todo ello con una toxicidad mínima para el paciente. Aunque hubo mucho entusiasmo por esta nueva modalidad de tratamiento, también hubo problemas y limitaciones, incluyendo la modulación de antígenos fuera de la superficie celular y hacia la circulación o la internalización.

Los anticuerpos monoclonales logran su efecto terapéutico a través de varios mecanismos. Pueden tener efectos directos en la producción de apoptosis o muerte celular programada. Pueden bloquear los receptores del factor de crecimiento, deteniendo de manera efectiva la proliferación de células tumorales. En las células que expresan anticuerpos monoclonales, pueden provocar la formación de anticuerpos anti-idiotipo. Los efectos indirectos incluyen el reclutamiento de células que tienen citotoxicidad, como monocitos y macrófagos. Este tipo de muerte celular mediada por anticuerpos se denomina citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los anticuerpos monoclonales también se unen al complemento, lo que provoca toxicidad celular directa, conocida como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

El rituximab se convirtió en el primer anticuerpo monoclonal aprobado específicamente para la terapia contra el cáncer, y le siguieron varios otros anticuerpos desnudos o inmunoconjugados, incluyendo un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD33 conjugado con caliqueamicina y anticuerpos radiomarcados específicos para CD20 (itrio-90 ibritumomab tiuxetan y yodo-131 tositumomab).

El rituximab se ha convertido en el fármaco biológico de mayor venta en oncología clínica y es activo en una variedad de linfomas humanos y leucemia linfocítica crónica. Este es un anticuerpo monoclonal quimérico dirigido al antígeno CD20 que se encuentra tanto en células B normales como en la mayoría de los linfomas de células B de grado bajo y algunos de grado alto. Puede ser eficaz como agente único en la terapia de inducción y mantenimiento. Sin embargo, se usa principalmente en combinación con quimioterapias estándar en el tratamiento de pacientes con linfomas de células B no Hodgkin y leucemia linfocítica crónica.

El Alemtuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige al antígeno CD52 que se encuentra en los linfocitos B y se usa principalmente para la leucemia linfocítica crónica y es eficaz como terapia de inducción y mantenimiento. El Alemtuzumab también es reactivo con los linfocitos T y típicamente no se combina con quimioterapia debido al mayor riesgo de infección. El antígeno CD22 también es el objetivo de una serie de anticuerpos y recientemente ha demostrado su eficacia en combinación con toxinas en la leucemia de células pilosas resistente a la quimioterapia.

Chao et al. (2009) Experimental Hematology 37(9): S8-S9 informa que CD47 es un factor de pronóstico adverso en el linfoma no Hodgkin y un objetivo de anticuerpo terapéutico que sinergiza con el rituximab. La WO 2009/091547 describe marcadores de células madre de leucemia mieloide aguda. La WO 2009/091601 describe métodos para manipular la fagocitosis mediada por CD47. Chao et al. (2009) Blood 114(22):1063-1064 informa que el anticuerpo terapéutico dirigido de CD47 sinergiza con el rituximab para erradicar completamente los xenoinjertos de linfoma de células B humano. La US 2009/191202 describe métodos para manipular la fagocitosis mediada por CD47. La US 2007/041981 describe composiciones y métodos para alterar la función inmunitaria. La WO 2008/121821 describe el tratamiento del linfoma no Hodgkin. La US 2008/107654 describe anticuerpos anti-CD47 humanizados. Bauerle y Reinhardt (2009) Cancer Research 69(12):4941-3 describe anticuerpos de acoplamiento a células T biespecíficos para la terapia contra el cáncer. El capítulo 2 del Handbook of Therapeutic Antibodies (2007), Dubel, ed., analiza anticuerpos biespecíficos. Chames y Baty (2009) mAbs 1(6):539-547 describe anticuerpos biespecíficos para la terapia contra el cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una combinación sinérgica de agentes para su uso en el tratamiento de un cáncer hematológico en un paciente, en donde el cáncer hematológico es linfoma no Hodgkin (NHL) y en donde el NHL es un linfoma de células B grandes difuso, en donde la combinación de agentes comprende un primer agente que bloquea selectivamente CD47 y un segundo agente que se une a CD20, en donde el primer y el segundo agentes están comprendidos en un anticuerpo de acoplamiento a FcR biespecífico para CD47 y para CD20.

Uno de los agentes se dirige a las células tumorales para la fagocitosis al bloquear el CD47 en la superficie celular. Se muestra que las células de leucemia o linfoma evaden la vigilancia de los macrófagos mediante la regulación por incremento de la expresión de CD47. La administración de agentes que enmascaran la proteína CD47 a un paciente aumenta la depuración de células cancerosas mediante fagocitosis. También se proporcionan composiciones de tales anticuerpos biespecíficos, donde el anticuerpo biespecífico es deseablemente humano o humanizado; y puede modificarse para prolongar la vida media en sangre, por ejemplo, mediante pegilación, etc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Análisis FACS de la expresión de HSC humana y de CD47 progenitora del síndrome mielodisplásico (MDS, azul), leucemia mielógena crónica, fase acelerada (CMLAP, verde) y médula ósea normal (rojo).

Figura 2. ET frente a PV. Análisis FACS de la expresión de CD47 por trastornos mieloproliferativos humanos como la trombocitemia esencial (ET, azul) y la policitemia vera (PV, verde) HSC, células progenitoras y de linaje positivo en comparación con la médula ósea humana normal (rojo).

Figura 3A. Perfiles de progenitores de médula ósea normal (izquierda), mielofibrosis pospolicitémica con metaplasia mieloide (PPMM) y crisis blástica de LMC. Figura 3B. Análisis FACS de médula ósea humana normal (rojo) frente a UMPD (verde) frente a PV (azul = ML) frente a CML atípica (naranja), expresión de CD47 de HSC, células progenitoras y de linaje positivo.

Figura 4. Expresión de CD47 aumentada por progenitores de CMML (azul) en comparación con la médula ósea normal (rojo) con progresión de la enfermedad.

Figuras 5A-5B. (A) Perfiles de progenitores de médula ósea normal (izquierda) frente a AML (derecha). (B) Análisis FACS de médula ósea humana normal (rojo) frente a AML (azul) expresión de CD47 de HSC, células progenitoras y de linaje positivo (blastos).

Figura 6. El anticuerpo anti-CD47 estimula la fagocitosis de macrófagos in vitro de LSC de AML humana primaria. Las LSC de AML se purificaron mediante FACS a partir de cuatro muestras primarias de AML humana, marcadas con el colorante fluorescente CFSE e incubadas con macrófagos de sangre periférica humana o en presencia de un control de isotipo, un anticuerpo anti-CD45 o anti-CD47 de isotipo coincidente. (A) Estas células se evaluaron mediante microscopía de inmunofluorescencia para determinar la presencia de LSC marcadas con fluorescencia dentro de los macrófagos. Se determinó el índice fagocítico para cada condición calculando el número de células ingeridas por 100 macrófagos. (B) Se recogieron los macrófagos, se tiñeron con un anticuerpo de macrófago antihumano marcado con fluorescencia y se analizaron mediante citometría de flujo. Los eventos positivos dobles de hMac+CFSE+ identifican macrófagos que han fagocitado LSC marcadas con CFSE. Cada muestra está representada por un color diferente.

Figura 7A-B: Un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 humano inhibe el injerto de LSC de AML in vivo. Se incubaron tres muestras primarias de AML humana con control de isotipo IgG1, IgG1 anti-CD45 o IgG1 anti-CD47 (B6H12.2) antes del trasplante en ratones NOG recién nacidos. Se analizó el recubrimiento de una parte de las células mediante tinción con un anticuerpo anti-IgG de ratón secundario y se analizó mediante citometría de flujo (A). 13 semanas más tarde, se sacrificaron los ratones y se analizó la médula ósea para determinar el porcentaje de células de leucemia mieloide CD45+CD33+ humana mediante citometría de flujo (B). La diferencia en el injerto medio entre las células recubiertas con anti-CD47 y las células recubiertas tanto con isotipo (p<0,001) como anti-CD45 (p=0,003) fue estadísticamente significativa.

Figura 8A-F. CD47 está regulación por incremento en la leucemia mieloide aguda murina. Se muestran gráficos de progenitoras y madre típicos para células leucémicas hMRP8bcrab/ x hMRP8bc/2 en comparación con animales de control no leucémicos. Las células seleccionadas por Lin-c-Kit+Sca-1+ de médula ósea de control (a) y bazo leucémico (b) y células seleccionadas por Lin-c-Kit+Sca-1- de médula ósea de control (c) y bazo leucémico (d) demuestran perturbaciones en la hematopoyesis normal en ratones leucémicos. La frecuencia se muestra como un porcentaje de la fracción mononuclear total de médula o bazo completos. (e) La RT-PCR cuantitativa muestra que CD47 está regulación por incremento en las células BM leucémicas. Se muestran los datos de 3 grupos de ratones trasplantados con células BM leucémicas o de control hRMP8bcrab/ x hMRP8bc/2 y sacrificados después 2-6 semanas más tarde. Los resultados se normalizaron a la expresión de beta-actina y ARNr 18S. Se determinó el cambio de veces con respecto a las células de BM Bcl-2+ completas trasplantadas de control. Las barras de error representan 1 s.d. (f) Los histogramas muestran la expresión de CD47 en poblaciones seleccionadas para ratones leucémicos (grises) y de control (negros).

Figura 9A-C. Expansión de GMP y regulación por incremento de CD47 en la leucemia mieloide humana. a) Gráficos FACS representativas de progenitoras mieloides (CD34+CD38+Lin-) que incluyen progenitoras mieloides comunes (CMP), progenitoras megacariocitos-eritroides (MEP) y progenitoras de granulocitosmacrófagos (GMP) en médula ósea normal (BM) frente a aCML, B^{c l}M^c y AML. b) Histogramas FACS comparativos de la expresión de CD47 por células madre hematopoyéticas (HSC; CD34+CD38-CD90+Lin-) normales (rojo; n=6) y mielógenas agudas (AML, azul; n=6) y progenitoras (CD34+ CD38+Lin-). c) Histogramas FACS comparativos de la expresión de CD47 por células madre hematopoyéticas (HSC; CD34+CD38-CD90+Lin) normales (rojo) y de leucemia mielógena crónica y progenitoras comprometidos (CD34+CD38+Lin-). Panel superior: HSC normal (n=7) frente a CML en fase crónica (n=4), células progenitoras y positivas de linaje. Panel medio: HSC, células progenitoras y positivas de linaje de CML normales (n=7) frente a fase acelerada (n=7). Panel inferior: HSC, células progenitoras y positivas de linaje normales (n=7) frente a CML en crisis blástica (n=4).

Figura 10A-D: Identificación y separación de progenitoras normales y leucémicas del mismo paciente en base a la expresión diferencial de CD47. A. La expresión de CD47 en la fracción enriquecida con Lin-CD34+CD38-LSC del espécimen SU008 se determinó mediante citometría de flujo. Las células que expresan CD47hi y CD47lo se identificaron y purificaron usando FACS. Los paneles de la izquierda están seleccionados en células negativas de linaje, mientras que los paneles de la derecha están seleccionados en células Lin-CD34+CD38-. B. Las células Lin-CD34+cD38-CD47lo y Lin-CD34+CD38-CD47hi se sembraron en placas en metilcelulosa completa, capaz de soportar el crecimiento de todas las colonias mieloides. 14 días después, se determinó la formación de colonias mieloides mediante evaluación morfológica. Se presentan CFU-G/M (izquierda) y BFU-E (derecha) representativos. C. Se trasplantaron células Lin-CD34+CD38-CD47lo en 2 ratones NOG recién nacidos. 12 semanas después, los ratones se sacrificaron y se analizó la médula ósea para determinar la presencia de células mieloides CD45+CD33+ humanas y células linfoides CD45+CD19+ humanas mediante citometría de flujo. D. Se evaluaron HSC de médula ósea normal, células de leucemia SU008 a granel, células LincD34+CD38-CD47hi, células Lin-CD34+CD38-CD47lo o células CD45+ humanas purificadas a partir de la médula ósea de ratones injertados con Lin-CD34+CD38-CD47lo para determinar la presencia de la mutación FLT3-ITD mediante PCR. Se indican los productos FLT3 de tipo salvaje y FLT3-ITD.

Figura 11A-E: Un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CD47 humano elimina la AML in vivo. Se trasplantaron ratones NOG recién nacidos con LSC de AML, y 8-12 semanas más tarde, se analizó la sangre periférica (A,B) y la médula ósea (C-E) para determinar el injerto de referencia antes del tratamiento con anti-CD47 (B6H12.2) o anticuerpo IgG de control. (Día 0). Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales diarias de 100 microgramos durante 14 días, al final de los cuales se sacrificaron y se analizaron la sangre periférica y la médula ósea para determinar el porcentaje de leucemia humana CD45+CD33+. A. Quimerismo leucémico humano antes y después del tratamiento en la sangre periférica de ratones tratados con un anticuerpo anti-CD47 representativo y IgG de control según lo determinado por citometría de flujo. B. El resumen del quimerismo leucémico humano en la sangre periférica evaluado en varios días durante el curso del tratamiento demostró la eliminación de la leucemia en ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 en comparación con el tratamiento con IgG de control (p=0,007). C. Quimerismo leucémico humano antes y después del tratamiento en la médula ósea de ratones tratados con un anticuerpo anti-CD47 o con IgG de control representativos según lo determinado por citometría de flujo. D. El resumen del quimerismo leucémico humano en la médula ósea el día 14 con respecto al día 0 demostró una reducción espectacular de la carga leucémica en ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 en comparación con el tratamiento con IgG de control (p<0,001). E. Secciones H&E de cavidades de médula ósea de ratón representativas de ratones injertados con SU004 después del tratamiento con IgG de control (paneles 1, 2) o anticuerpo anti-CD47 (paneles 4, 5). Las médulas tratadas con IgG estaban repletas de blastos leucémicos monomórficos, mientras que las médulas tratadas con anti-CD47 eran hipocelulares, lo que demuestra la eliminación de la leucemia humana. En algunos ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 que contenían leucemia residual, se detectaron macrófagos que contenían células picnóticas fagocitadas, capturando la eliminación de la leucemia humana (paneles 3, 6 flechas).

Figura 12. La expresión de CD47 está aumentada en las células de NHL en comparación con las células B normales, confiere un peor pronóstico clínico y se correlaciona con características moleculares adversas en múltiples subtipos de NHL (A) Se determinó la expresión de CD47 en células B de sangre periférica (PB) normales (CD19+), células B del centro germinal normales (GC) (CD3-CD5-CD20+CD10+CD38+), y células B de NHL (CD19+) mediante citometría de flujo y la intensidad media de fluorescencia se normalizó para el tamaño de las células. Cada punto representa una muestra de paciente diferente: DLBCL=2, CLL=15, MCL=4, FL=6, MZL=2 y pre-B ALL=1 (****p<0,0001). La expresión media normalizada (y el intervalo) para cada población fueron: células B PB normales 420,9 (267,3-654,0), células B GC normales 482,5 (441,1-519,9) y NHL 888,5 (270,1­ 1553). (B) La expresión de CD47 en los subtipos de NHL, incluyendo DLBCL (DL, n = 15), MCL (n = 34), FL (n = 28) y B-CLL (n = 14) se determinó como en (A). La expresión media normalizada (y el intervalo) para cada población fueron: DL 725,7 (261,2-1344), MCL 1055 (444,2-2196), FL 825,1 (283,6-1546), CLL 713,6 (432,8­ 1086) (*p<0,05). (C-E) Se muestra la influencia de pronóstico de la expresión del ARNm de CD47 sobre la supervivencia general (C y E) y libre de eventos (D) de pacientes con DLBCL, B-CLL y MCL. Para DLBCL y CLL, la estratificación en grupos de expresión baja y alta de CD47 se basó en un umbral óptimo determinado por análisis de micromatrices; este punto de corte se validó internamente tanto para DLBCL como para CLL y también se validó externamente en una cohorte independiente de DLBCL. Para MCL, se empleó la estratificación con respecto a la mediana ya que no se pudo definir un punto de corte óptimo. Las medidas de significancia se basan en estimaciones de probabilidad logarítmica del valor p, cuando se trata la expresión de CD47 como una variable continua (F-H) La expresión de ARNm de CD47 se muestra con respecto a la clasificación de la célula de origen para DLBCL (F), estado de mutación de cadena pesada de inmunoglobulina (IgVH) para CLL (G) e índice de proliferación para MCL (H). Las barras de error representan los cuartiles superior e inferior (F y G). Los análisis para (C)-(H) emplearon conjuntos de datos disponibles públicamente para pacientes con NHL. NGC = centro germinal normal, ABC = similar a células B activadas, GCB = similar a células B germinales.

Figura 13. Los anticuerpos de bloqueo contra CD47 permiten la fagocitosis de células de NHL por macrófagos y sinergizan con rituximab in vitro (A) Se incubaron células de NHL marcadas con CFSE con macrófagos humanos y los anticuerpos indicados y se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia para detectar fagocitosis (flechas). Se muestran fotomicrografías de una muestra representativa de NHL. (B) Los índices fagocíticos de células de NHL humanas primarias (azul), células de sangre periférica normales (NPB) (rojas) y líneas celulares de NHL (púrpura, naranja y verde) se determinaron usando macrófagos humanos (izquierda) y de ratón (centro). La apoptosis inducida por anticuerpos (panel derecho) se probó incubando células de NHL con los anticuerpos indicados o estaurosporina sin macrófagos y evaluando el porcentaje de células apoptóticas y muertas (% de anexina V y/o PI positiva). (C) La fagocitosis sinérgica por anticuerpo anti-CD47 (B6H12.2) y mAb anti-CD20 se examinó mediante análisis de isobolograma y determinación de índices de combinación (IC). CIobs indica los resultados observados y la línea discontinua indica los resultados esperados si los anticuerpos fueran aditivos. (D y E) La sinergia entre el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab en la fagocitosis de las células de NHL y NPB se evaluó determinando el índice fagocítico cuando se incubaron con una combinación de ambos anticuerpos en comparación con cualquiera de los anticuerpos solos al doble de la dosis, con cualquiera de los macrófagos de ratón (D) o humanos (E). NHL17*: línea celular derivada de la muestra primaria NHL17. ***p<0,001, ****p<0,0001, *****p<0,00001. Figura 2B los valores de p representan la comparación con el anticuerpo de control de isotipo de IgG1.

Figura 14. El recubrimiento ex vivo de células de NHL con un anticuerpo anti-CD47 inhibe el injerto tumoral (A-F) Se evaluó el recubrimiento de anticuerpos ex vivo en células Raji (A) y SUDHL4 (C) que expresan luciferasa mediante citometría de flujo. Los ratones SCID trasplantados con Raji (B) y SUDHL4 (D) se sometieron a imagenología bioluminiscente (1-control de isotipo de IgG1, 2-anti-CD45, 3 y 4-anti-CD47, 5-control negativo de luciferasa). Se cuantificó la bioluminiscencia para ratones injertados con Raji (E) y SUDHL4 (F) (n = 3 por condición de anticuerpo). No se observó injerto tumoral en ratones trasplantados con células recubiertas con anti-CD47 en comparación con células recubiertas con IgG (p<0,05) tanto para Raji como para SUDHL4, según lo evaluado mediante imagenología bioluminiscente. Los datos se representan como media ± desviación estándar (SD). (G) Se evaluó el recubrimiento de anticuerpos ex vivo en células de linfoma a granel de un paciente con NHL humano mediante citometría de flujo. (H) En comparación con el control de isotipo de IgG 1, el pretratamiento con anticuerpos anti-CD47 inhibió el injerto de células de NHL (p<0,0001), mientras que las células recubiertas con anti-CD45 se injertaron de manera similar a los controles (p=0,54). Todos los valores de p se determinaron usando la prueba exacta de Fisher. Las barras de error representan la SD (E y F).

Figura 15. La terapia de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab elimina el linfoma en modelos de ratón con xenotrasplante de NHL humano tanto diseminado como localizado (A) Los ratones NSG trasplantados por vía intravenosa con células Raji que expresan luciferasa se trataron con los anticuerpos indicados (n = 8 por grupo de tratamiento). Se muestra la imagenología de luciferasa de ratones representativos antes y 10 días después del tratamiento (A) y se promedian para todos los ratones en cada grupo de tratamiento (B). (C) Se realizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Los valores de p comparan el control de IgG con el tratamiento de combinación de anticuerpos o el anticuerpo anti-CD47/anticuerpo único de rituximab con la combinación. Las flechas indican el inicio (día 14) y la finalización (día 35) del tratamiento. (D) Las células Raji que expresan luciferasa se trasplantaron por vía subcutánea en el costado de ratones NSG. Cuando se formaron tumores palpables (-0,1 cm3), se inició el tratamiento con los anticuerpos indicados. Se muestra la imagenología de luciferasa de ratones representativos de cada grupo de tratamiento antes (día 0) y durante (día 14) del tratamiento. (E) Se determinó y promedió la bioluminiscencia cuantificada para todos los ratones en cada grupo de tratamiento (n = 7). (F) Se midió el volumen del tumor y se muestra el volumen medio. Los valores de p se derivaron de un ANOVA de dos vías y se compararon con el tratamiento con IgG. *p<0,05, ***p<0,001, ****p<0,0001. La remisión completa se definió como el número de ratones sin evidencia de tumor en la fecha indicada. La recaída se definió como el número de ratones que lograron una remisión completa que desarrollaron después una recurrencia del crecimiento tumoral. Para (E), un ratón que logró una remisión completa murió por causas no relacionadas con el tumor. Los datos presentados en (B), (E) y (F) son valores medios ± SD.

Figura 16. La terapia de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab elimina el linfoma en modelos de ratón con xenotrasplante de NHL humano primario (A y B) Se trasplantaron por vía intravenosa células de un paciente con DLBCL primario (NHL7) a ratones NSG irradiados de manera subletal y se trataron con los anticuerpos indicados. Se muestra la citometría de flujo del injerto de linfoma humano en la médula ósea de dos ratones representativos antes y 14 días después del tratamiento con anticuerpos en (A). Los datos de todos los ratones se incluyen en (B). **p<0,01, comparando los valores previos y posteriores al tratamiento para cada tratamiento de anticuerpos respectivo. (C) Se muestra el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones injertados con DLBCL de cada cohorte de tratamiento con anticuerpos (n>10 por grupo de anticuerpos), con valores de p calculados comparando el control de IgG con el tratamiento de combinación de anticuerpos o el anticuerpo anti-CD47/rituximab con un solo anticuerpo con el tratamiento de combinación. Las flechas indican el inicio (día 14) y la finalización (día 28) del tratamiento. (D y E) Los ratones a los que se les injertó por vía intravenosa una muestra primaria de un paciente con FL (NHL31) se trataron con una dosis única de los anticuerpos indicados. En comparación con el control de IgG y rituximab, el anticuerpo anti-CD47 solo o en combinación con rituximab eliminó la carga tumoral en la sangre periférica (p=0,04, ANOVA de dos vías) y la médula ósea (p<0,001, prueba t). (E) El injerto de linfoma en la médula ósea se determinó 14 días después del tratamiento. Cada grupo de tratamiento con anticuerpos consistía de tres ratones. Para los ratones informados en (D) y (E), el quimerismo del linfoma humano estaba entre el 5 % y el 25 % en la sangre periférica y la médula ósea.

Figura 17. La sinergia entre el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab no se produce a través de las células NK o el complemento (A) Se incubaron células de NHL con los anticuerpos solubles indicados durante 2 horas y se calculó el porcentaje de células muertas (% de anexina V+ y/o 7-AAD+). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el % de células muertas con la combinación de anticuerpo anti-CD47 y rituximab en comparación con el anticuerpo anti-CD47 solo (p=0,24) o con rituximab solo (p=0,95). (B) Se muestra la expresión de SIRPa para células NK humanas y de ratón según lo determinado por citometría de flujo. (C y D) Se realizaron por triplicado ensayos de liberación de cromo que miden la ADCC con humanos (C) y ratones (D) en una relación efector:objetivo de 17,5:1, y se informa el porcentaje de lisis específica. Los anticuerpos se incubaron a 10 pg/ml excepto anti-CD47 de longitud completa o anticuerpo F(ab^')2 +rituximab (5 pg/ml). (E) El ensayo de CDC con complemento humano se realizó por duplicado. En comparación con el control de isotipo de IgG1, el anticuerpo anti-CD47 no permitió la CDC (p>0,2), mientras que rituximab sí lo hizo (p<0,001) mediante ANOVA de dos vías tanro para SUDHL4 como para NHL17*. El tratamiento de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab no permitió niveles mayores de CDC en comparación con rituximab (p = 0,78). (F) El ensayo de CDC con complemento de ratón se realizó por duplicado. En comparación con el control de isotipo de IgG1, el anticuerpo anti-CD47 no permitió la CDC (p>0,25) mientras que el rituximab sí lo hizo (p=0,03, p=0,08, respectivamente) tanto para SUDHL4 como para NHL17*. No se observaron diferencias en CDC entre el anticuerpo CD47+rituximab y rituximab solo (p>0,13) tanto para SUDHL4 como para NHL17*. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Las barras de error representan SD (C-F). NHL17* = células de NHL17 primarias expandidas en cultivo.

Figura 18. El anticuerpo anti-CD47 sinergiza con rituximab a través de mecanismos independientes de FcR y dependientes de FcR (A) Se muestra un análisis de isobolograma de la fagocitosis inducida por el anticuerpo anti-SIRPa y rituximab para células Raji y macrófagos de ratón. (B y C) Las células de NHL se incubaron in vitro con los anticuerpos indicados en presencia de macrófagos de ratón de tipo salvaje (B) o FcYr -/-(C), y se determinó el índice fagocítico. (D) Se muestra el análisis de isobolograma de la fagocitosis inducida por el anticuerpo F(ab^')2 anti-CD47 y rituximab para células Raji y macrófagos de ratón. (E) Las células de NHL se incubaron con macrófagos de ratón de tipo salvaje en presencia de los anticuerpos de longitud completa o F(ab^')2 indicados (anticuerpos individuales a 10 pg/ml, anticuerpos de combinación a 5 pg/ml cada uno) y se determinó el índice fagocítico. (F) Se determinó el nivel de fagocitosis in vivo medido como el porcentaje de macrófagos de ratón que contienen células GFP+ Raji fagocitadas (hCD45-GFP+F4/80+) mediante citometría de flujo de hígados de ratones injertados con células GFP+ Raji y luego tratados con los anticuerpos indicados (consultar Procedimientos experimentales), con cada grupo de tratamiento realizado por duplicado. En comparación con el control de IgG, el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab permitieron niveles aumentados de fagocitosis. En comparación con el anticuerpo anti-CD47 solo, la combinación de anticuerpo anti-CD47 y rituximab permitió niveles más altos de fagocitosis. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Las barras de error representan la SD (E y F).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES

Antes de que se describa adicionalmente la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor expuesto o intermedio en ese intervalo indicado, está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están incluidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo expuesto. Cuando el intervalo expuesto incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos.

Los métodos enumerados en la presente pueden llevarse a cabo en cualquier orden de los eventos enumerados que sea lógicamente posible, así como en el orden de los eventos enumerados. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta memoria descriptiva deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque también puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente en la puesta en práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Debe tenerse en cuenta que tal como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Debe tenerse en cuenta además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta afirmación sirva como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "solamente", "solo" y similares con respecto a la recitación de los elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".

Las publicaciones analizadas en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales que puede ser necesario que sean confirmadas independientemente.

DEFINICIONES

Combinación sinérgica. Las combinaciones sinérgicas pueden proporcionar un efecto terapéutico que es comparable a la eficacia de una monoterapia, a la vez que reducen los efectos secundarios adversos, por ejemplo, daño a tejidos no objetivo, estado inmunitario y otros indicios clínicos. Alternativamente, las combinaciones sinérgicas pueden proporcionar una eficacia mejorada, cuyo efecto puede medirse por el número total de células tumorales; tiempo hasta la recaída; y otros indicios de la salud del paciente.

Polipéptidos de CD47. Las tres variantes de transcripción de CD 47 humano (variante 1, NM 001777; variante 2, NM 198793; y variante 3, NM 001025079) codifican tres isoformas del polipéptido de CD47. La isoforma 1 de CD47 (NP 001768), la más larga de las tres isoformas, tiene una longitud de 323 aminoácidos. La isoforma 2 de CD47 (NP 942088) tiene una longitud de 305 aminoácidos. La isoforma 3 de CD47 tiene una longitud de 312 aminoácidos. Las tres isoformas son idénticas en secuencia en los primeros 303 aminoácidos. Los aminoácidos 1-8 comprenden la secuencia señal, los aminoácidos 9-142 comprenden el dominio similar a inmunoglobulina de CD47, que es el fragmento soluble, y los aminoácidos 143-300 son el dominio transmembrana.

Un polipéptido de "fusión" es un polipéptido que comprende un polipéptido o una parte (por ejemplo, uno o más dominios) del mismo fusionado o unido a un polipéptido heterólogo. Una proteína de CD47 soluble de fusión, por ejemplo, compartirá por lo menos una propiedad biológica en común con un polipéptido de CD47 soluble de la secuencia nativa. Los ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen inmunoadhesinas, como se ha descrito anteriormente, que combinan una parte del polipéptido de CD47 con una secuencia de inmunoglobulina, y polipéptidos etiquetados con epítopos, que comprenden un polipéptido de CD47 soluble o una parte del mismo fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede producirse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad biológica del polipéptido de CD47. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 6-60 residuos de aminoácidos.

Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de secuencias de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes de los mismos. Los derivados y la fusión de CD47 soluble encuentran uso como moléculas miméticas de CD47.

Los primeros 142 aminoácidos del polipéptido de CD47 comprenden la región extracelular de CD47 (SEQ ID NO: 1). Las tres isoformas tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en la región extracelular y, por tanto, puede usarse cualquiera de las isoformas para generar CD47 soluble. “CD47 soluble” es una proteína de CD47 que carece del dominio transmembrana. El CD47 soluble se secreta fuera de la célula expresándolo en lugar de estar localizado en la superficie celular.

Los ensayos in vitro para determinar la actividad biológica de CD47 incluyen, por ejemplo, inhibición de la fagocitosis de células porcinas por macrófagos humanos, unión al receptor SIRPa, fosforilación de tirosina de SIRPa, etc. Un ensayo ejemplar para determinar la actividad biológica de CD47 pone en contacto una composición de macrófagos humanos en presencia de un agente candidato. Las células se incuban con el agente candidato durante aproximadamente 30 minutos y se lisan. El lisado celular se mezcla con anticuerpos anti-SIRP a humanos para inmunoprecipitar SIRP a. Las proteínas precipitadas se resuelven mediante SDS PAGE, luego se transfieren a nitrocelulosa y se sondean con anticuerpos específicos para fosfotirosina. Un agente candidato útil como mimético de CD47 aumenta la fosforilación de tirosina SIRP a en por lo menos un 10%, o hasta un 20% o un 50%, o un 70% u 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fosforilación observado en ausencia del agente candidato. Otro ensayo ejemplar para la actividad biológica de CD47 mide la fagocitosis de células hematopoyéticas por macrófagos humanos. Un agente candidato útil como mimético de CD47 da como resultado la regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia del agente candidato.

Por "manipulación de la fagocitosis" se entiende una regulación por incremento o por disminución en la fagocitosis en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80% o hasta un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención. Por tanto, en el contexto de la disminución de la fagocitosis de las células hematopoyéticas circulantes, particularmente en un contexto de trasplante, manipular la fagocitosis significa una regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80%, o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención.

Inhibidores de CD47. Los agentes de interés como inhibidores de CD47 incluyen miembros de unión específica que evitan la unión de CD47 con el receptor de SIRPa. El término "miembro de unión específica" o "miembro de unión" como se usa en la presente se refiere a un miembro de una pareja de unión específica, es decir, dos moléculas, habitualmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas (es decir, el primer miembro de unión específica) a través de un medio químico o físico se une específicamente a la otra molécula (es decir, segundo miembro de unión específica). Los inhibidores de CD47 incluyen análogos, derivados y fragmentos del miembro de unión específica original.

Un miembro de unión específica puede ser un anticuerpo. Se pretende que el término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica con una forma específica que se ajuste y reconozca un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. Los anticuerpos utilizados en la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales porque pueden reproducirse mediante cultivo celular o recombinantemente y pueden modificarse para reducir su antigenicidad.

Los anticuerpos policlonales pueden generarse mediante un protocolo estándar inyectando una composición antigénica en un animal de producción. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Cuando se utiliza una proteína completa o una sección más grande de la proteína, los anticuerpos pueden generarse inmunizando al animal de producción con la proteína y un adyuvante adecuado (por ejemplo, Freund, completo de Freund, emulsiones de aceite en agua, etc.) Cuando se utiliza un péptido más pequeño, es ventajoso conjugar el péptido con una molécula más grande para hacer un conjugado inmunoestimulador. Las proteínas conjugadas comúnmente utilizadas que están disponibles comercialmente para tal uso incluyen albúmina de suero bovino (BSA) y hemocianina de lapa californiana (KLH). Para generar anticuerpos contra epítopos particulares, pueden utilizarse péptidos derivados de la secuencia completa. Alternativamente, para generar anticuerpos contra porciones peptídicas relativamente cortas de la proteína objetivo, puede provocarse una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, como ovoalbúmina, BSA o KLH. Alternativamente, para los anticuerpos monoclonales, pueden formarse hibridomas aislando las células inmunitarias estimuladas, como las del bazo del animal inoculado. Estas células luego se fusionan con células inmortalizadas, como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una línea celular secretora de inmunoglobulina inmortal. Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante ingeniería genética. Para su uso en la presente invención se prefieren anticuerpos humanos humanizados, quiméricos o xenogénicos, que producen menos de una respuesta inmunitaria cuando se administran a humanos.

En la presente invención, además de las inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes), son útiles como fracciones de anticuerpos los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión del epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab^')2 u otros fragmentos). Tales fragmentos de anticuerpos pueden generarse a partir de inmunoglobulinas completas por escisión con ricina, pepsina, papaína u otra proteasa. Las inmunoglobulinas "fragmentarias" o mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse enlazando una región de cadena ligera variable a una región de cadena pesada variable a través de un conector peptídico (por ejemplo, poliglicina u otra secuencia que no forme una hélice alfa o motivo de lámina beta).

Los anticuerpos incluyen anticuerpos libres y fragmentos de unión a antígeno derivados de los mismos, y conjugados, por ejemplo, conjugados de anticuerpos pegilados, fármacos, radioisótopos o toxinas, y similares. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítopo específico, o una combinación de epítopos, permitirán el direccionamiento y/o el agotamiento de las poblaciones celulares que expresan el marcador. Pueden utilizarse varias técnicas que usan anticuerpos monoclonales para detectar poblaciones celulares que expresen el o los marcadores, e incluyen la separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, “inmunoadsorción” con anticuerpos adheridos a una matriz sólida (es decir, una placa) y citometría de flujo. (Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.985.660; y Morrison et al. Cell, 96:737-49 (1999)). Estas técnicas permiten la selección de poblaciones particulares de células; en inmunohistoquímica de muestras de biopsia; en la detección de la presencia de marcadores vertidos por células cancerosas en la sangre y otros fluidos biológicos, y similares.

Las versiones humanizadas de tales anticuerpos también están dentro del alcance de esta invención. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad.

La frase "anticuerpo multiespecífico o biespecífico" se refiere a un anticuerpo sintético o recombinante que reconoce más de una proteína. Los ejemplos incluyen los anticuerpos biespecíficos 2B1, 520C9xH22, mDX-H210 y MDX447. Los anticuerpos biespecíficos dirigidos contra una combinación de epítopos permitirán el direccionamiento y/o el agotamiento de las poblaciones celulares que expresen la combinación de epítopos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares incluyen aquellos dirigidos a una combinación de CD47 y un marcador de células cancerosas, como CD20, CD22, ^c D96, CD97, CD99, PTHR2, HAVCR2, etc. La generación de anticuerpos biespecíficos se describe en la bibliografía, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5989830, Patente de Estados Unidos N° 5798229. Especificidades de orden superior, por ejemplo, anticuerpos triespecíficos, se describen en Holliger y Hudson (2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136.

La eficacia de un inhibidor de CD47 se evalúa analizando la actividad de CD47. Se usan los ensayos mencionados anteriormente o versiones modificadas de los mismos. En un ensayo ejemplar, las SC de AML se incuban con macrófagos derivados de la médula ósea, en presencia o ausencia del agente candidato. Un inhibidor de CD47 de la superficie celular regulará por incremento la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70%, o un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con la fagocitosis en ausencia del candidato. agente. De manera similar, un ensayo in vitro para los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución en la fosforilación de por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o un 50%, o un 70% o un 80% o hasta un 90% en comparación con fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

El agente, o una composición farmacéutica que comprende el agente, puede proporcionarse en una cantidad eficaz para inhibir de manera detectable la unión de CD47 al receptor de SIRPa presente en la superficie de las células fagocíticas. La cantidad eficaz se determina mediante la rutina de pruebas empíricas en la técnica. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la cantidad de células que se trasplantan, el sitio del trasplante y los factores específicos del receptor del trasplante.

Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis. Hay cuatro categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.

El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de monitorización. El término abarca sangre y otras muestras de líquidos de origen biológico, muestras de tejido sólido, como un espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. El término abarca muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.

Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse de manera general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, primate, incluyendo humanos y otros simios, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad o el síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero aún no se le ha diagnosticado que los tenga; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", usados indistintamente en la presente se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos.

Una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a un microorganismo o una célula o línea celular eucariótica cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una célula individual puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total al progenitor original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

Los términos "cáncer", "neoplasia", "tumor" y "carcinoma" se usan indistintamente en la presente para referirse a células que muestran un crecimiento relativamente autónomo, de tal manera que muestran un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. En general, las células de interés para la detección o el tratamiento en la presente solicitud incluyen células precancerosas (por ejemplo, benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y no metastásicas. La detección de células cancerosas es de particular interés. Se entiende que el término "normal", como se usa en el contexto de "célula normal", se refiere a una célula de un fenotipo no transformado o que muestra una morfología de una célula no transformada del tipo de tejido que se está examinando. "Fenotipo canceroso" generalmente se refiere a cualquiera de una variedad de fenómenos biológicos que son característicos de una célula cancerosa, cuyos fenómenos pueden variar con el tipo de cáncer. El fenotipo canceroso generalmente se identifica por anomalías, por ejemplo, en el crecimiento o proliferación celular (por ejemplo, crecimiento o proliferación descontrolados), regulación del ciclo celular, movilidad celular, interacción célula-célula o metástasis, etc.

"Objetivo terapéutico" se refiere a un gen o producto génico que, tras la modulación de su actividad (por ejemplo, mediante la modulación de la expresión, la actividad biológica y similares), puede proporcionar la modulación del fenotipo canceroso. Como se usa en todo el documento, se entiende que "modulación" se refiere a un aumento o una disminución en el fenómeno indicado (por ejemplo, la modulación de una actividad biológica se refiere a un aumento en una actividad biológica o una disminución en una actividad biológica).

CÁNCERES HEMATOLÓGICOS

Las leucemias agudas son leucemias que progresan rápidamente y se caracterizan por el reemplazo de la médula ósea normal por células blásticas de un clon que surge de la transformación maligna de una célula hematopoyética. Las leucemias agudas incluyen la leucemia linfoblástica aguda (ALL) y la leucemia mielógena aguda (AML). La ALL a menudo afecta al SNC, mientras que la leucemia monoblástica aguda afecta a las encías y la AML incluye colecciones localizadas en cualquier sitio (sarcomas granulocíticos o cloromas).

Los síntomas de presentación suelen ser inespecíficos (por ejemplo, fatiga, fiebre, malestar general, pérdida de peso) y reflejan el fallo de la hematopoyesis normal. La anemia y la trombocitopenia son muy comunes (del 75 al 90%). El recuento de glóbulos blancos puede estar disminuido, normal o aumentado. Por lo general, se encuentran células blásticas en el frotis de sangre, a menos que el recuento de glóbulos blancos esté notablemente disminuido. Los blastos de la LLA se pueden distinguir de los de la AML mediante estudios histoquímicos, citogenéticos, inmunofenotípicos y de biología molecular. Además de frotis con las tinciones habituales, transferasa terminal, mieloperoxidasa, negro de Sudán B y esterasa específica e inespecífica.

La ALL es la enfermedad maligna más común en los niños, con una incidencia máxima entre los 3 y los 5 años de edad. También se produce en adolescentes y tiene un segundo máximo más bajo en adultos. El tratamiento típico enfatiza la introducción temprana de un régimen intensivo de múltiples fármacos, que puede incluir prednisona, vincristina, antraciclina o asparaginasa. Otros fármacos y combinaciones son citarabina y etopósido y ciclofosfamida. La recaída generalmente se produce en la médula ósea, pero también puede producirse en el SNC o los testículos, solos o concurrentes con la médula ósea. Aunque pueden inducirse segundas remisiones en muchos niños, las remisiones posteriores tienden a ser breves.

La incidencia de la AML aumenta con la edad; es la leucemia aguda más común en adultos. La AML puede estar asociada con la quimioterapia o la irradiación (AML secundaria). Las tasas de inducción de la remisión son más bajas que con la ALL y, según se informa, la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo se produce solo en el 20 al 40% de los pacientes. El tratamiento difiere más de la ALL en que la AML responde a menos fármacos. El régimen básico de inducción incluye citarabina; junto con daunorrubicina o idarrubicina. Algunos regímenes incluyen 6-tioguanina, etopósido, vincristina y prednisona.

La policitemia vera (PV) es un trastorno mieloproliferativo crónico idiopático caracterizado por un aumento en la concentración de Hb y la masa de glóbulos rojos (eritrocitosis). La PV se produce en aproximadamente 2,3/100.000 personas al año; más a menudo en los hombres (aproximadamente 1,4:1). La edad media en el momento del diagnóstico es de 60 años (intervalo, 15 a 90 años; rara vez en la infancia); el 5% de los pacientes tienen <40 años al inicio. La médula ósea a veces parece normal pero por lo general es hipercelular; la hiperplasia implica a todos los elementos de la médula y reemplaza la grasa de la médula. Hay una producción y recambio aumentados de glóbulos rojos, neutrófilos y plaquetas. Los megacariocitos aumentados pueden estar presentes en grupos. El hierro en la médula ósea está ausente en >90% de los pacientes, incluso cuando no se ha realizado una flebotomía.

El síndrome mielodisplásico (MDS) es un grupo de síndromes (preleucemia, anemias refractarias, leucemia mielocítica crónica Ph negativa, leucemia mielomonocítica crónica, metaplasia mieloide) que se observan comúnmente en pacientes de edad avanzada. Puede estar implicada la exposición a carcinógenos. El MDS se caracteriza por la proliferación clonal de células hematopoyéticas, incluyendo las formas eritroide, mieloide y megacariocítica. La médula ósea es normal o hipercelular y la hematopoyesis ineficaz provoca citopenias variables, siendo la anemia la más frecuente. La producción celular desordenada también se asocia con anomalías celulares morfológicas en la médula y la sangre. Puede producirse hematopoyesis extramedular, lo que lleva a hepatomegalia y esplenomegalia. La mielofibrosis ocasionalmente está presente en el momento del diagnóstico o puede desarrollarse durante el curso de MDS. El clon del MDS es inestable y tiende a progresar a una AML.

Los linfomas no Hodgkin son un grupo heterogéneo de trastornos que implican la proliferación monoclonal maligna de células linfoides en sitios linforeticulares, incluyendo los ganglios linfáticos, la médula ósea, el bazo, el hígado y el tracto GI. Es el sexto cáncer más común en los Estados Unidos; anualmente se diagnostican unos 65.000 nuevos casos en todos los grupos de edad. Los síntomas de presentación suelen incluir linfadenopatía periférica. Sin embargo, algunos pacientes se presentan sin adenopatía pero con linfocitos anormales en circulación. En comparación con el linfoma de Hodgkin, hay una mayor probabilidad de enfermedad diseminada en el momento del diagnóstico. El diagnóstico habitualmente se basa en una biopsia de los ganglios linfáticos o de la médula ósea, o ambos. El tratamiento consiste de radioterapia, quimioterapia o ambas. El trasplante de células madre habitualmente se reserva para la terapia de rescate después de una remisión incompleta o una recaída.

La mayoría (del 80 al 85%) de los NHL surgen de las células B; el resto surge de las células T o células asesinas naturales. Pueden estar implicadas células precursoras o células maduras. Existe una superposición entre la leucemia y el NHL porque ambos implican la proliferación de linfocitos o sus precursores. Un cuadro similar al de la leucemia con linfocitosis periférica y afectación de la médula ósea puede presentarse hasta en el 50% de los niños y en aproximadamente el 20% de los adultos con algunos tipos de NHL.

Entre los linfomas dentro de este grupo se encuentran: leucemia/linfoma linfoblástico B precursor; leucemia linfocítica crónica de células B/linfoma linfocítico pequeño; leucemia prolinfocítica de células B; linfoma linfoplasmacítico; linfoma de células B de la zona marginal esplénica (±linfocitos vellosos); leucemia de células pilosas; mieloma de células plasmáticas/plasmacitoma; Linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar del tipo MALT; linfoma de células B de la zona marginal ganglionar (± células B monocitoides); linfoma folicular; linfoma de células del manto; linfomas difusos de células B grandes; linfoma de Burkitt; linfoma/leucemia linfoblástica de células T precursoras; leucemia prolinfocítica de células T; leucemia linfocítica granular de células T; leucemia de células NK agresiva; linfoma/leucemia de células T del adulto (positivo para HTLV 1); linfoma extraganglionar de células T/NK, tipo nasal; linfoma de células T tipo enteropatía; linfoma hepatoesplénico de células T Y-S;lLinfoma subcutáneo de células T similar a paniculitis; micosis fungoide/síndrome de Sézary; linfoma anaplásico de células grandes, células T/nulas, tipo cutáneo primario; linfoma anaplásico de células grandes, células T/células nulas, tipo sistémico primario; linfoma periférico de células T, no caracterizado de otra manera; linfoma angioinmunoblástico de células T.

Los cánceres hematológicos de células B dentro del grupo NHL incluyen, sin limitación, linfoma difuso de células B grandes, leucemia linfocítica crónica, linfoma de células del manto, leucemia/linfoma linfoblástico B y linfoma de Burkitt. Los linfomas difusos de células B grandes son de particular interés en este grupo.

Los linfomas comúnmente también se clasifican como indolentes o agresivos. Los linfomas indolentes progresan lentamente y responden al tratamiento, pero a menudo no son curables con enfoques convencionales. Los linfomas agresivos progresan rápidamente pero responden al tratamiento y, a menudo, son curables.

En los niños, el NHL casi siempre es agresivo. El tratamiento de estos linfomas agresivos (Burkitt, difuso de células B grandes y linfoma linfoblástico) presenta preocupaciones especiales, que incluyen la implicación del tracto GI (particularmente en el íleon terminal); diseminación meníngea (que requiere profilaxis o tratamiento del líquido cefalorraquídeo); y otros sitios santuario de participación (como los testículos o el cerebro). Además, con estos linfomas potencialmente curables, deben considerarse los efectos adversos del tratamiento, así como el resultado, incluyendo los riesgos tardíos de cáncer secundario.

El rituximab está incluido en el régimen quimioterapéutico estándar. Los pacientes en los grupos de mayor riesgo (pacientes con 4 o 5 factores de riesgo) ahora tienen una supervivencia de 5 años del 50%. En pacientes con linfomas de células B agresivos (por ejemplo, células B grandes difusas), la combinación estándar de fármacos es rituximab más ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, vincristina, prednisona (R-CHOP). Se espera una regresión completa de la enfermedad en >70% de los pacientes, según la categoría del IPI.

La leucemia crónica habitualmente se manifiesta como leucocitosis anormal con o sin citopenia en una persona por lo demás asintomática. Los descubrimientos y el manejo difieren significativamente entre la leucemia linfocítica crónica (CLL) y la leucemia mielocítica crónica (CML).

El tipo más común de leucemia en el mundo occidental, la CLL implica linfocitos neoplásicos defectuosos de apariencia madura (casi siempre células B) con una esperanza de vida anormalmente larga. La sangre periférica, la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos experimentan infiltración leucémica. Los síntomas pueden estar ausentes o pueden incluir linfadenopatía, esplenomegalia, hepatomegalia y síntomas inespecíficos atribuibles a la anemia (fatiga, malestar general). El diagnóstico se realiza mediante el examen de frotis periférico y aspirado de médula ósea. El tratamiento, retrasado hasta que se desarrollan los síntomas, tiene como objetivo prolongar la vida y disminuir los síntomas y puede incluir clorambucilo o fludarabina, prednisona y ciclofosfamida o doxorrubicina o ambos. Cada vez se usan más los anticuerpos monoclonales, como alemtuzumab y rituximab. La terapia de irradiación paliativa se reserva para pacientes cuya linfadenopatía o esplenomegalia interfiere con otros órganos.

En aproximadamente el 98% de los casos, las células B CD5+ experimentan una transformación maligna, con linfocitos que se acumulan inicialmente en la médula ósea y luego se diseminan a los ganglios linfáticos y otros tejidos linfoides, lo que eventualmente induce la esplenomegalia y la hepatomegalia. A medida que progresa la CLL, la hematopoyesis anormal produce anemia, neutropenia, trombocitopenia y disminución de la producción de inmunoglobulinas. Muchos pacientes desarrollan hipogammaglobulinemia y respuesta de anticuerpos alterada, tal vez relacionada con el aumento de la actividad de las células T supresoras. Los pacientes tienen una susceptibilidad aumentada a la enfermedad autoinmune caracterizada por anemias inmunohemolíticas (habitualmente con prueba de Coombs positiva) o trombocitopenia y un aumento modesto en el riesgo de desarrollar otros cánceres.

Terapia con anticuerpos monoclonales: El rituximab es el primer anticuerpo monoclonal usado en el tratamiento con éxito de cánceres linfoides. La tasa de respuesta parcial con dosis convencionales en CLL es del 10 al 15%. En pacientes no tratados con anterioridad, la tasa de respuesta es del 75% y el 20% de los pacientes logran una remisión completa. El Alemtuzumab tiene una tasa de respuesta del 33% en pacientes tratados previamente refractarios a la fludarabina y una tasa de respuesta del 75 al 80% en pacientes no tratados previamente.

El mieloma múltiple es un cáncer de las células plasmáticas que producen inmunoglobulina monoclonal e invaden y destruyen el tejido óseo adyacente. Las manifestaciones comunes incluyen dolor óseo, insuficiencia renal, hipercalcemia, anemia e infecciones recurrentes. El diagnóstico requiere la demostración de proteína M (a veces presente en la orina y no en el suero) y lesiones óseas líticas, proteinuria de cadena ligera o exceso de células plasmáticas en la médula. Habitualmente es necesaria una biopsia de médula ósea. El tratamiento específico incluye quimioterapia convencional con la adición de bortezomib, lenalidomida, talidomida, corticosteroides y dosis altas de melfalán seguido de trasplante autólogo de células madre de sangre periférica.

La proteína M producida por las células plasmáticas malignas es IgG en aproximadamente el 55% de los pacientes con mieloma e IgA en aproximadamente el 20%; de los pacientes que producen IgG o IgA, el 40% también tiene proteinuria de Bence Jones, que son cadenas ligeras ^k o A monoclonales libres en la orina. En del 15 al 20% de los pacientes, las células plasmáticas secretan solo proteína de Bence Jones. El mieloma IgD representa aproximadamente el 1% de los casos.

TRATAMIENTO PARA EL CÁNCER

La invención proporciona una combinación sinérgica de agentes para su uso en métodos para reducir el crecimiento de células de linfoma de células B grandes difuso mediante la introducción de un agente de bloqueo de CD47, en combinación con un segundo agente que se une a CD20, en donde el agente de bloqueo de CD47 y el segundo agente están comprendidos en un anticuerpo de acoplamiento a FcR biespecífico selectivo para CD47 y para CD20. Al bloquear la actividad de CD47, se previene la regulación por disminución de la fagocitosis que se encuentra con ciertas células tumorales.

“Reducir el crecimiento de células cancerosas” incluye, pero no se limita a, reducir la proliferación de células cancerosas y reducir la incidencia de que una célula no cancerosa se convierta en una célula cancerosa. Puede determinarse fácilmente si se ha logrado una reducción en el crecimiento de células cancerosas usando cualquier ensayo conocido incluyendo, pero no limitados a, incorporación de [3H]-timidina; contar el número de celular durante un período de tiempo; detectar y/o medir un marcador asociado con la AML, etc.

Puede evaluarse si una sustancia, o una cantidad específica de la sustancia, es eficaz para tratar el cáncer usando cualquiera de una variedad de ensayos de diagnóstico conocidos para el cáncer incluyendo, pero no limitados a, biopsia, estudios radiográficos con contraste, tomografía computarizada y detección de un marcador tumoral asociado con el cáncer en la sangre del individuo. La sustancia puede administrarse por vía sistémica o local, habitualmente por vía sistémica.

Un agente, por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico que reduce el crecimiento de células cancerosas, puede dirigirse a una célula cancerosa por conjugación con un anticuerpo específico de CD47. Por tanto, un método para administrar un fármaco a una célula cancerosa, puede comprender administrar un complejo fármaco-anticuerpo a un sujeto, en donde el anticuerpo es específico para un polipéptido asociado al cáncer y el fármaco es uno que reduce el crecimiento de células cancerosas, una variedad de los cuales se conocen en la técnica. El direccionamiento puede lograrse acoplando (por ejemplo, enlazando, directamente o a través de una molécula conectora, covalente o no covalentemente, para formar un complejo fármaco-anticuerpo) un fármaco a un anticuerpo específico para un polipéptido asociado al cáncer. Los métodos para acoplar un fármaco a un anticuerpo son bien conocidos en la técnica y no es necesario elaborarlos en la presente.

En general, tal como se utiliza el término en la memoria descriptiva, se pretende que "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga cadenas polipeptídicas que tenga una forma específica que se ajuste a un epítopo y lo reconozca, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. Para los anticuerpos monoclonales, las hibridomas pueden formarse aislando las células inmunitarias estimuladas, como las del bazo del animal inoculado. Estas células luego se fusionan con células inmortalizadas, como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una línea celular inmortal secretora de inmunoglobulina. La línea celular inmortal utilizada se selecciona preferiblemente para que sea deficiente en las enzimas necesarias para la utilización de ciertos nutrientes. Muchas de estas líneas celulares (como mielomas) son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo: timidina quinasa (TK) o hipoxantina-guanina fosforboxil transferasa (HGPRT). Estas deficiencias permiten la selección de células fusionadas de acuerdo con su capacidad para crecer, por ejemplo, en medio de hipoxantina aminopterintimidina (HAT).

Para su uso en la invención se prefieren los anticuerpos que tienen una propensión reducida a inducir una respuesta inmunitaria violenta o perjudicial en humanos (como un shock anafiláctico) y que también muestran una propensión reducida a cebar una respuesta inmunitaria que evitaría la dosificación repetida con el agente terapéutico de anticuerpos o el agente de imagenología (por ejemplo, la respuesta "HAMA" de anticuerpo anti-murino humano). Estos anticuerpos son los preferidos para todas las vías de administración. Por tanto, para su uso en la presente invención se prefieren los anticuerpos humanos humanizados, quiméricos o xenogénicos, que producen menos respuesta inmunitaria cuando se administran a seres humanos.

Los anticuerpos quiméricos pueden elaborarse mediante medios recombinantes combinando las regiones variables de cadena ligera y pesada murinas (VK y VH), obtenidas de un clon de hibridoma murino (u otro derivado de un animal), con las regiones constantes de cadena ligera y pesada humana, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de tales anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica, y puede lograrse por medios estándar (como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.624.659). Los anticuerpos humanizados están manipulados para contener incluso más dominios de inmunoglobulina similares a los humanos e incorporar solo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de animales. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los giros hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y ajustándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque a primera vista complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.187.287.

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de animales que han sido alterados genéticamente para producir inmunoglobulinas humanas. El animal transgénico puede producirse produciendo inicialmente un animal "knock-out" que no produce los anticuerpos naturales del animal y transformando de manera estable el animal con un locus de anticuerpo humano (por ejemplo, mediante el uso de un cromosoma artificial humano). Sólo los anticuerpos humanos son producidos por el animal. Las técnicas para generar dichos animales y derivar anticuerpos a partir de ellos se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 6.162.963 y 6.150.584. Tales anticuerpos xenogénicos totalmente humanos son un anticuerpo preferido para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos de cadena sencilla a partir de bibliotecas de fagos que contienen regiones variables humanas. Ver la Patente de Estados Unidos N26.174.708.

Además de las inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes), en la presente invención son útiles como fracciones de anticuerpo los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión del epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab^')2 u otros fragmentos). Tales fragmentos de anticuerpos pueden generarse a partir de inmunoglobulinas completas mediante la escisión con ficina, pepsina, papaína u otra proteasa. Las inmunoglobulinas "fragmentarias" o mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinantes. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse enlazando una región de cadena ligera variable a una región de cadena pesada variable a través de un conector peptídico (por ejemplo, poliglicina u otra secuencia que no forme una hélice alfa o motivo de lámina beta).

Los fragmentos Fv son heterodímeros del dominio variable de la cadena pesada (V^h) y el dominio variable de la cadena ligera (V^l). Los heterodímeros de los dominios de cadena ligera y pesada que se encuentran en la IgG completa, por ejemplo, están conectados por un enlace disulfuro. Los Fv recombinantes en los que V^h y V^l están conectadas por un conector peptídico son típicamente estables, ver, por ejemplo, Huston et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85:5879 5883 (1988) y Bird et al., Science 242:423 426 (1988). Estos son Fv de cadena sencilla que se ha descubierto que retienen la especificidad y la afinidad y se ha demostrado que son útiles para imagenología de tumores y elaborar inmunotoxinas recombinantes para terapia tumoral. Sin embargo, los investigadores han descubierto que algunos de los Fv de cadena sencilla tienen una afinidad reducida por el antígeno y el conector peptídico puede interferir con la unión. También se han elaborado Fv mejorados que comprenden la estabilización de enlaces disulfuro entre las regiones V^h y V^l como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.147.203. En la presente invención puede utilizarse cualquiera de estos anticuerpos mínimos, y aquellos que están humanizados para evitar las reacciones HAMA son los preferidos para su uso en las realizaciones de la invención.

Además, en los métodos y composiciones de la presente invención pueden utilizarse inmunoglobulinas derivatizadas con conectores químicos, fracciones detectables como colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, fracciones quimioluminiscentes, fracciones de unión específicas como estreptavidina, avidina o biotina, o conjugados de fármacos añadidos.

En algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos se acoplan o conjugan con una o más fracciones terapéuticas citotóxicas o de imagenología. Como se usa en la presente, "fracción citotóxica" (C) significa simplemente una fracción que inhibe el crecimiento celular o promueve la muerte celular cuando está cerca de la célula o es absorbida por ella. Las fracciones citotóxicas adecuadas a este respecto incluyen isótopos radiactivos (radionúclidos), agentes quimiotóxicos como inductores de diferenciación y pequeños fármacos quimiotóxicos, proteínas de toxinas y derivados de los mismos. Los agentes pueden conjugarse con el anticuerpo mediante cualquier técnica adecuada, teniendo debidamente en cuenta la necesidad de estabilidad farmacocinética y toxicidad general reducida para el paciente. Un agente terapéutico puede acoplarse a una fracción de anticuerpo adecuada ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un grupo conector). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un grupo funcional capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, como un grupo amino o sulfhidrilo, puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro). Alternativamente, puede usarse un grupo conector químico adecuado. Un grupo conector puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un grupo conector también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en una fracción o un anticuerpo y, por tanto, aumentar la eficacia del acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de fracciones o grupos funcionales en fracciones, que no serían posibles de otro modo.

Las químicas de enlace adecuadas incluyen conectores de maleimidilo y conectores de haluro de alquilo (que reaccionan con un sulfhidrilo en la fracción del anticuerpo) y conectores de succinimidilo (que reaccionan con una amina primaria en la fracción del anticuerpo). Varios grupos de amina primaria y sulfhidrilo están presentes en las inmunoglobulinas, y pueden diseñarse grupos adicionales en moléculas de inmunoglobulina recombinantes. Será evidente para los expertos en la técnica que puede emplearse una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como heterofuncionales (como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, III). como grupo conector. El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidratos oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.671.958. Como método de acoplamiento alternativo, las fracciones citotóxicas pueden acoplarse al anticuerpo a través de un grupo carbohidrato oxidado en un sitio de glicosilación, como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.057.313 y 5.156.840. Otro método alternativo más para acoplar la fracción de anticuerpo a la fracción citotóxica es mediante el uso de una pareja de unión no covalente, como estreptavidina/biotina o avidina/biotina. En estas realizaciones, un miembro de la pareja se acopla covalentemente a la fracción citotóxica o de imagenología.

Cuando una fracción citotóxica es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo conector que pueda escindirse durante o tras la internalización en una célula, o que pueda escindirse gradualmente con el tiempo en el entorno extracelular. Se han descrito una serie de grupos conectores escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de fracción citotóxica de estos grupos conectores incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.489.710), por irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, patente de Estados Unidos N° 4.625.014), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizados (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.638.045), por hidrólisis mediada por complemento sérico (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.671.958) e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.569.789).

Puede ser deseable acoplar más de una fracción citotóxica o de imagenología a un anticuerpo. Mediante la poliderivatización del anticuerpo, pueden implementarse simultáneamente varias estrategias citotóxicas, o puede marcarse un anticuerpo terapéutico para hacer un seguimiento mediante una técnica de visualización. Independientemente de la realización particular, los inmunoconjugados con más de una fracción pueden prepararse de varias maneras. Por ejemplo, puede acoplarse más de una fracción directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden usarse conectores que proporcionen múltiples sitios para la unión (por ejemplo, dendrímeros). Alternativamente, puede usarse un portador con la capacidad de contener más de una fracción citotóxico o de imagenología.

Un portador puede portar los agentes de varias maneras, incluyendo los enlaces covalentes, ya sea directamente o a través de un grupo conector, y asociaciones no covalentes. Los portadores de enlaces covalentes adecuados incluyen proteínas como albúminas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.507.234), péptidos y polisacáridos como aminodextrano (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.699.784), cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de fracciones. Un portador también puede portar un agente mediante asociaciones no covalentes, como uniones no covalentes o mediante encapsulación, como dentro de una vesícula de liposoma (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.429.008 y 4.873.088). Los portadores de encapsulación son especialmente útiles para conjugación de fracciones de imagenología con fracciones de anticuerpos para su uso en la invención, de tal manera que una cantidad suficiente de la fracción de imagenología (colorante, reactivo de contraste de resonancia magnética, etc.) para la detección puede asociarse más fácilmente con la fracción de anticuerpo. Además, los portadores de encapsulación también son útiles en realizaciones terapéuticas quimiotóxicas, ya que pueden permitir que las composiciones terapéuticas liberen gradualmente una fracción quimiotóxica a lo largo del tiempo mientras la concentran en las inmediaciones de las células tumorales.

Los radionucleidos preferidos para su uso como fracciones citotóxicas son radionucleidos que son adecuados para administración farmacológica. Tales radionúclidos incluyen 123I, 125I, 131I, 90Y, 211At, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Pb y 212Bi. Los isótopos de yodo y astato son los radionúclidos más preferidos para su uso en las composiciones terapéuticas de la presente invención, ya que se ha acumulado una gran cantidad de bibliografía con respecto a su uso.

Los agentes quimiotóxicos preferidos incluyen fármacos de molécula pequeña como carboplatino, cisplatino, vincristina, taxanos como paclitaxel y doceltaxel, hidroxiurea, gemcitabina, vinorelbina, irinotecán, tirapazamina, matrilisina, metotrexato, pirimidina y análogos de purina, y otras toxinas pequeñas adecuadas conocidas en la técnica. Los inductores de diferenciación de quimiotoxinas preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las fracciones quimiotóxicas pueden conjugarse directamente con la fracción del anticuerpo a través de un conector químico, o pueden encapsularse en un portador, que a su vez se acopla al anticuerpo. Las proteínas de toxina preferidas para su uso como fracciones citotóxicas incluyen ricinas A y B, abrina, toxina diftérica, briodina 1 y 2, momordin, tricokirina, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella, proteína antiviral de hierba carmín y otras proteínas de toxina conocidas en las técnicas de bioquímica medicinal. Como estos agentes tóxicos pueden provocar respuestas inmunitarias indeseables en el paciente, especialmente si se inyectan por vía intravascular, se prefiere que se encapsulen en un portador para el acoplamiento con el anticuerpo.

El agente o agentes se mezclan, antes de la administración, con una sustancia portadora no tóxica farmacéuticamente aceptable. Habitualmente, será una solución acuosa, como solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución de Ringer, solución de lactato-Ringer o cualquier solución isotónica fisiológicamente aceptable para la administración por el medio elegido. Preferiblemente, la solución es estéril y está libre de pirógenos, y se fabrica y envasa según los buenos procesos de fabricación (GMP) actuales, según lo aprobado por la FDA. El practicante clínico experto en la técnica está familiarizado con los intervalos apropiados de pH, tonicidad y aditivos o conservantes cuando formula composiciones farmacéuticas para administración por inyección intravascular, inyección directa en los ganglios linfáticos, intraperitoneal o por otras vías. Además de los aditivos para ajustar el pH o la tonicidad, los agentes pueden estabilizarse contra la agregación y la polimerización con aminoácidos y detergentes no iónicos, polisorbato y polietilenglicol. Opcionalmente, los estabilizadores adicionales pueden incluir varios carbohidratos y sales fisiológicamente aceptables. Además, puede añadirse polivinilpirrolidona además del aminoácido. Las soluciones de inmunoglobulina terapéuticas adecuadas que se estabilizan para su almacenamiento y administración a humanos se describen en la Patentes de Estados Unidos N° 5.945.098. A la composición terapéutica o de imagenología pueden añadirse otros agentes, como la albúmina de suero humano (HSA), para estabilizar los conjugados de anticuerpos.

Las composiciones de la invención pueden administrarse usando cualquier procedimiento médicamente apropiado, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa, intraarterial, intracapilar), inyección en los ganglios linfáticos, etc. La inyección intravascular puede ser por inyección intravenosa o intraarterial. La cantidad eficaz de las composiciones terapéuticas a administrar a un paciente particular dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales serán diferentes de un paciente a otro. Un practicante clínico competente será capaz de determinar una cantidad eficaz de una composición terapéutica para administrar a un paciente para retardar el crecimiento y promover la muerte de las células tumorales. La dosificación de los agentes dependerá del tratamiento del tumor, la vía de administración, la naturaleza de los agentes terapéuticos, la sensibilidad del tumor a los agentes terapéuticos, etc. Utilizando datos de animales de LD⁵⁰ y otra información disponible para la fracción citotóxica o de imagenología conjugada, un practicante clínico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada localmente, dada la mayor cantidad de fluido en el que se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se depuran rápidamente del cuerpo pueden administrarse en dosis más altas o en dosis repetidas para mantener una concentración terapéutica. Utilizando la capacidad ordinaria, el practicante clínico competente podrá optimizar la dosificación de una composición terapéutica o de imagenología particular en el curso de ensayos clínicos rutinarios.

Típicamente, la dosificación será de 0,001 a 100 miligramos de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del sujeto. La proporción de anti-CD47 al segundo agente puede variar de 1:100; 1:50; 1:10; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1; 5:1; 10:1; 50:1; 100:1. Los agentes pueden administrarse al sujeto en una serie de más de una administración. Para las composiciones terapéuticas, a veces será necesaria la administración periódica regular (por ejemplo, cada 2-3 días), o puede ser deseable para reducir la toxicidad. Para composiciones terapéuticas que se utilizarán en regímenes de dosis repetidas, se prefieren fracciones de anticuerpos que no provoquen HAMA u otras respuestas inmunitarias.

Además de estos métodos terapéuticos, el agotamiento de las células madre cancerosas es útil en el tratamiento del cáncer. El agotamiento puede lograrse mediante varios métodos. El agotamiento se define como una reducción en la población objetivo de hasta aproximadamente un 30%, o hasta aproximadamente un 40%, o hasta aproximadamente un 50%, o hasta aproximadamente un 75% o más. Un agotamiento efectivo habitualmente está determinado por la sensibilidad de la condición de enfermedad particular a los niveles de la población objetivo. Por tanto, en el tratamiento de ciertas afecciones, podría ser beneficioso un agotamiento de incluso aproximadamente el 20%.

Se usa un agente específico de CD47 que agota específicamente las células madre cancerosas objetivo para contactar con la sangre del paciente in vitro o in vivo, en donde después del paso de contacto, hay una reducción en el número de células madre cancerosas viables en la población objetivo. Una dosis eficaz de anticuerpos para dicho propósito es suficiente para reducir la población objetivo al nivel deseado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos para tales propósitos pueden tener baja antigenicidad en humanos o pueden ser anticuerpos humanizados.

EJEMPLO 1

CD47 ES UN MARCADOR DE LEUCEMIAS MIELOIDES

Materiales y métodos

Inmunohistoquímica. Se realizaron citospinas de poblaciones progenitoras mieloides clasificadas doblemente (CMP, GMP), células CD45 RA+ altas en IL-3Ra y células CD14+c-kit+lin- usando un aparato de citospina Shandon. Los citospines se tiñeron con Giemsa diluido 1/5 con H20 durante 10 minutos y luego se tiñeron con May-Grunwald durante 20 minutos. Los citospines se analizaron con la ayuda de un microscopio Zeiss.

Muestras de médula ósea humana y sangre periférica. Se obtuvieron muestras de médula ósea normales con consentimiento informado de donantes remunerados de 20 a 25 años que eran negativos para hepatitis A, B, C y VIH por serología (All Cells). Las muestras de médula ósea de CMML se obtuvieron con consentimiento informado, de pacientes no tratados previamente, en el Centro Médico de la Universidad de Stanford.

HSC de médula ósea humana y análisis de citometría de flujo de progenitores mieloides y clasificación celular. Las fracciones mononucleares se extrajeron siguiendo la centrifugación por densidad de Ficoll de acuerdo con métodos estándar y se analizaron frescas o después de una descongelación rápida de muestras previamente congeladas en FCS al 90% y DMSO al 10% en nitrógeno líquido. En algunos casos, las células CD34+ se enriquecieron a partir de fracciones mononucleares con la ayuda de perlas inmunomagnéticas (CD34+ Progenitor Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Antes del análisis FACS y la clasificación, los progenitores mieloides se tiñeron con anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE)-Cy5 específicos del marcador de linaje, incluyendo CD2 RPA-2.10; CD11b, ICRF44; CD20, 2H7; CD56, B159; GPA, GA-R2 (Becton Dickinson-PharMingen, San Diego), CD3,S4.1; CD4,S3.5; CD7, CD7-6B7; CD8, 3B5; CD10, 5-1B4, CD14, TUK4; CD19, SJ25-C1 (Caltag, South San Francisco, CA) y anti-CD34 conjugado con APC, HPCA-2 (Becton Dickinson-PharMingen), anti-CD38 biotinilado, HIT2 (Caltag) además de anti-IL-3Ra conjugado con PE, 9F5 (Becton Dickinson-ParMingen) y anti-CD45RA conjugado con FITC, MEM56 (Caltag) seguido de tinción con estreptavidina-rojo Texas para visualizar las células teñidas con CD38-BIO y resuspensión en yoduro de propidio para excluir las células muertas. Se incluyeron muestras no teñidas y controles de isotipo para evaluar la fluorescencia de fondo.

Después de la tinción, las células se analizaron y clasificaron usando un FACS Vantage modificado (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) equipado con un láser de colorante de 599 nm y un láser de argón de 488 nm. Las células progenitoras doblemente clasificadas (HSC) se identificaron como CD34+ CD38+ y linaje negativo. Los progenitores mieloides comunes (CMP) se identificaron en base a la tinción de CD34+ CD38+ IL-3Ra+ CD45RA-lin- y su progenie, incluyendo los progenitores de granulocitos/macrófagos (GMP), fueron CD34+CD38+IL-3Ra+CD45RA+ mientras que los progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) se identificaron en base a la tinción de CD34+CD38+IL-3Ra - CD45RA-lin-.

Expresión de CD47 por progenitores normales frente a mieloproliferativos y de AML. Se obtuvieron muestras de sangre periférica y médula ósea con consentimiento informado de pacientes con trastornos mieloproliferativos y leucemia mielógena aguda en el Centro Médico de la Universidad de Stanford de acuerdo con las regulaciones de Stanford IRB y HIPAA. Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica o de médula ósea (1 -5x106 células) con un cóctel de linaje como anteriormente pero excluyendo CD7, CD11b y CD14. Posteriormente, las muestras se tiñeron con CD14 PE (1/25), CD47 FITC (1/25), CD38 Bio (Bio) y c-kit APC (1/25) o CD34 APC o FITC (1/50) durante 45 min. seguido de lavado y tinción con estreptavidina rojo Texas (1/25) durante 45 min y finalmente resuspensión en yoduro de propidio.

Análisis

Aquí mostramos que la sobreexpresión de CD47 es característica de la progresión de los trastornos mieloproliferativos humanos a AML (ver las Figuras 1-5B). CD47 controla la función de la integrina pero también la capacidad de los macrófagos para fagocitar células, dependiendo del nivel de expresión de CD47. Por tanto, la expresión aberrante de CD47 puede permitir que las LSC evadan tanto la inmunidad innata como la adaptativa del huésped.

El análisis de la expresión de CD47 humana se realizó a través de FACS en el trastorno mieloproliferativo preleucémico (MPD) o AML HSC humanos normales, progenitores y células positivas de linaje derivadas de la médula o sangre periférica. Las muestras de MPD (n=63) incluyeron policitemia vera (PV; n=15), metaplasia mieloide/mielofibrosis pospolicitemica (PPMM/MF; n=5), trombocitemia esencial (ET; n=8), leucemia mielógena crónica atípica (aCML; n=2), CML (n=7), leucemia eosinofílica crónica (CEL; n=1), leucemia mielomonocítica crónica (CMML; n=13) y leucemia mielógena aguda (AML; n=12). Como hemos observado con los modelos de ratones leucémicos transgénicos, la progresión de los trastornos mieloproliferativos humanos a AML (n=12) estaba asociada con una expansión del grupo de GMP (70,6%+/-SD 2,15) en comparación con la médula ósea normal (14,7%+ /-SD 2.3). Además, el análisis FACS reveló que la expresión de CD47 primero aumentó 1,7 veces en AML en comparación con HSC normal y luego aumentó a 2,2 veces más de lo normal con la implicación de los progenitores de AML con el linaje mieloide. CD47 fue sobreexpresado por progenitores primitivos de AML y su progenie, pero no por la mayoría de MPD (MFI 2.3+/-SD 0.43) en comparación con la médula ósea normal (MFI 1.9+/-SD 0.07). Por tanto, la expresión de CD47 aumentada es un marcador de diagnóstico útil para la progresión a AML y, además, representa un nuevo objetivo terapéutico.

Ejemplo 2

Las leucemias humanas y de ratón regulan por incremento CD47 para evadir la destrucción de macrófagos CD47 facilita el injerto, inhibe la fagocitosis y se expresa más en LSC de AML. Determinamos la expresión de CD47 en LSC de AML humana y HSC normal mediante citometría de flujo. Se analizaron HSC (Lin-CD34+CD38-CD90+) de tres muestras de sangre periférica movilizada humana normal y LSC de AML (Lin-CD34+CD38-CD90-) de siete muestras de AML humana para determinar la expresión superficial de CD47. CD47 se expresó en niveles bajos en la superficie de HSC normal; sin embargo, de media, se expresó aproximadamente 5 veces más en LSC de AML, así como en blastos leucémicos masivos.

El anticuerpo monoclonal anti-CD47 humano estimula la fagocitosis e inhibe el injerto de LSC de AML. Para probar el modelo de que la sobreexpresión de CD47 en LSC de AML previene la fagocitosis de estas células a través de su interacción con SIRPa en células efectoras, hemos utilizado un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 conocido por alterar la interacción de CD47-SIRPa. La hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal CD47 antihumano de ratón, denominado B6H12, se obtuvo de la ATCC y se usó para producir el anticuerpo purificado. Primero, realizamos ensayos de fagocitosis in vitro. Las LSC de AML humana primaria se purificaron mediante FACS a partir de dos muestras de AML humana y luego se cargaron con el colorante fluorescente CFSE. Estas células se incubaron con macrófagos derivados de médula ósea de ratón y se monitorizaron usando microscopía de inmunofluorescencia y citometría de flujo para identificar las células fagocitadas. En ambos casos, no se observó fagocitosis en presencia de un anticuerpo de control de isotipo; sin embargo, se detectó una fagocitosis significativa con la adición de anticuerpo anti-CD47 (Figura 6). Por tanto, el bloqueo de CD47 humano con un anticuerpo monoclonal es capaz de estimular la fagocitosis de estas células por macrófagos de ratón.

Luego investigamos la capacidad del anticuerpo anti-CD47 para inhibir el injerto de LSC de AML in vivo. Dos muestras primarias de AML humana no se trataron o se recubrieron con el anticuerpo anti-CD47 antes del trasplante en ratones recién nacidos NOG. 13 semanas más tarde, se sacrificaron los ratones y se analizaron por citometría de flujo para detectar injertos de médula ósea de leucemia humana (Figura 7). Los ratones de control demostraron un injerto leucémico, mientras que los ratones trasplantados con células recubiertas con anti-CD47 mostraron poco o ningún injerto. Estos datos indican que el bloqueo de CD47 humano con un anticuerpo monoclonal es capaz de inhibir el injerto de LSC de AML.

La progresión tumoral se caracteriza por varias marcas características, incluyendo la independencia de la señal de crecimiento, la inhibición de la apoptosis y la evasión del sistema inmunitario, entre otras. Mostramos aquí que la expresión de CD47, un ligando para el receptor alfa de la proteína reguladora de la señal inhibidora de macrófagos (SIRPa), está aumentada en la leucemia mieloide humana y de ratón y permite que las células evadan la fagocitosis y aumenten su potencial tumorigénico. CD47, también conocida como proteína asociada a integrina (IAP), es una pentaspanina transmembrana similar a la inmunoglobulina que se expresa ampliamente en tejidos de mamíferos. Proporcionamos evidencia de que CD47 está regulado por incremento en células madre y progenitoras de leucemia mieloide humana y de ratón, así como en blastos leucémicos. De acuerdo con un papel biológico de CD47 en el desarrollo y mantenimiento de la leucemia mieloide, demostramos que la sobreexpresión ectópica de CD47 permite que una línea celular de leucemia mieloide crezca en ratones deficientes en células T, B y NK, mientras que, por lo demás, se depura rápidamente cuando se trasplanta a estos receptores. También se muestra que el potencial leucemogénico de CD47 depende de la dosis, ya que los clones con expresión más alta tienen un mayor potencial de formación de tumores que los clones con expresión más baja. También mostramos que CD47 funciona en la promoción de la leucemogénesis mediante la inhibición de la fagocitosis de las células leucémicas por parte de los macrófagos.

CD47 está significativamente regulado por incremento en la médula ósea transgénica Faslpr/lpr x hMRP8bcl2 leucémica y en ratones hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 leucémicos. Las transcripciones de CD47 están aumentadas en la médula ósea leucémica hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 de 3 a 4 veces mediante RT-PCR cuantitativa y de 6 a 7 veces en la médula leucémica enriquecida con c-Kit con respecto a la médula ósea sana hMRP8bcl2+ (Figura 8e). El bazo leucémico tuvo una expansión de la población de progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP), así como de subconjuntos de progenitores y madre de c-Kit+Sca-1+Lin- con respecto a los ratones de control, que tenían el mismo genotipo que los ratones leucémicos pero no desarrollaron la enfermedad. (Figura 8a-d). Se descubrió que los niveles de expresión de la proteína CD47 comenzaron a aumentar en ratones leucémicos con respecto a los ratones de control en la etapa decélulas madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC) de Flk2-CD34-c-Kit+Sca-1+Lin-(Figura 8f). Este nivel de expresión aumentado se mantuvo en los blastos GMP y Mac-1+, pero no en los progenitores restringidos de megacariocitos/eritroides (MEP) (Figura 8f). El aumento de CD47 entre las células leucémicas y normales fue de 3 a 20 veces. Todos los ratones que desarrollaron leucemia que hemos examinado de ratones trasplantados primarios (n=3) y secundarios (n=3) hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2, ratones primarios (n=14) y secundarios (n=19) Faslpr/lpr x hMRP8bcl2 y ratones primarios (n = 3) y secundarios (n = 12) hMRP8bcl2 x hMRP8bcl2 tenían una expresión de CD47 aumentada. También hemos descubierto una expresión de CD47 aumentada en ratones que recibieron células de médula ósea de ratón transducidas retroviralmente con p210bcr/abl que desarrollaron leucemia.

El análisis mediado por FACS de poblaciones de progenitores hematopoyéticos humanos se realizó en sangre y médula derivadas de sangre de cordón umbilical normal y sangre periférica movilizada (n=16) y trastornos mieloproliferativos (MPD) que incluyen policitemia vera (PV; n=16), mielofibrosis (MF; n=5), trombocitemia esencial (ET; n=7), leucemia mielomonocítica crónica (CMML; n=11) y leucemia mieloide crónica atípica (aCML; n=1), así como leucemia mieloide crónica en fase de crisis blástica (CML; n =19), CML en fase crónica (n=7) y leucemia mielógena aguda (AML; n=13). Este análisis demostró que los progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP) se expandieron en MPD con potencial de diferenciación sesgada mieloide, incluyendo CML atípica, CMML en fase proliferativa y leucemia aguda incluyendo CML y AML en crisis blástica (Figura 9a). Las HSC de AML y los progenitores mostraron uniformemente niveles más altos de expresión de CD47 en comparación con los controles normales (Figura 9b); cada muestra de BC-CML y AML tenía niveles elevados de CD47. Además, la progresión de la CML en fase crónica a la crisis blástica se asoció con un aumento significativo en la expresión de CD47 (Figura 9c).

Usando los métodos descritos en este estudio, hemos descubierto que la expresión de la proteína CD47 humana en CML-BC aumentó 2,2 veces en células CD90+CD34+CD38-Lin- con respecto a las células normales (p=6,3 x 10-5), 2,3 veces en las células CD90-CD34+CD38-Lin- con respecto a las normales (p=4,3 x 10-5), y 2,4 veces en células CD 34+CD38+Lin-(p=7,6x 10-6) (Figuras 9b-9c); sin embargo, usando un protocolo de tinción optimizado más reciente, hemos observado que CD47 aumenta aproximadamente 10 veces en AML y BC-CML en comparación con las HSC y los progenitores humanos normales.

Luego se preguntó si la expresión forzada de CD47 de ratón en células leucémicas humanas conferiría una ventaja competitiva en la formación de tumores en ratones. Las células MOLM-13, que se derivan de un paciente con AML 5a, se transdujeron con Tet-MCS-IRES-GFP (Tet) o Tet-CD47-MCS-IRES-GFP (Tet-CD47), y se propagaron integrantes estables en la base de la expresión de GFP. Luego, las células se trasplantaron por vía intravenosa en un entorno competitivo con células MOLM-13 no transducidas en ratones T, B y NK deficientes en el gen 2 activador de la recombinación, deficientes en la cadena gamma común (RAG2-/-, Gc-/-). Solo las células transducidas con Tet-CD47 pudieron dar lugar a tumores en estos ratones, injertando de manera eficiente la médula ósea, el bazo y la sangre periférica. Los tumores también se caracterizaron por una gran carga tumoral en el hígado, lo cual es particularmente significativo porque se cree que el hígado tiene la mayor cantidad de macrófagos de cualquier órgano, con estimaciones de que las células de Kupffer pueden comprender el 80% de la población total de macrófagos tisulares. Estas células también constituyen el 30% del revestimiento sinusoidal, por lo que se colocan estratégicamente en los sitios de entrada al hígado. Por lo tanto, un injerto significativo tendría que inhabilitar una respuesta citotóxica de macrófagos. Además de desarrollar nódulos tumorales, las células Tet-CD47 MOLM-13 mostraron patrones de implicación hepática vistos típicamente con AML humana, con células leucémicas infiltrándose en el hígado con un patrón sinusoidal y perivenoso. En general, los ratones trasplantados con Tet-CD47 MOLM-13 murieron más rápidamente que los ratones trasplantados con Tet MOLM-13, que prácticamente no tenían injerto de células leucémicas en los tejidos hematopoyéticos. Los ratones con Tet-MOLM-13 todavía tenían una mortalidad significativa, lo más probable debido al crecimiento localizado en el sitio de inyección (seno retro orbital) con extensión hacia el cerebro.

Se ha demostrado que la falta total de CD47 da como resultado la fagocitosis de los eritrocitos y leucocitos murinos trasplantados, a través de la falta de interacción con SIRPa en los macrófagos. Por tanto, probamos si la sobreexpresión de CD47 podría prevenir la fagocitosis de células MOLM-13 vivas sin opsonizar. Incubamos células Tet o Tet-CD47 MOLM-13 con macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) durante 2-24 horas y evaluamos la fagocitosis contando el número de células GFP+ ingeridas bajo un microscopio o evaluando la frecuencia de macrófagos GFP+ usando un citómetro de flujo. La expresión de CD47 redujo drásticamente la depuración de macrófagos de estas células en todos los puntos temporales probados, mientras que Tet-MOLM-13 se fagocitaron rápidamente de una manera que aumentó a lo largo del tiempo. También inyectamos células MOLM-13 en ratones y analizamos los órganos hematopoyéticos 2 horas después en busca de evidencia de fagocitosis de macrófagos. Los macrófagos en la médula ósea, el bazo y el hígado tenían una mayor fracción de GFP+ cuando se les inyectaban células Tet MOLM-13 en comparación con las células que expresan CD47. Esto indica que la sobreexpresión de CD47 puede compensar las señales profagocíticas ya presentes en las células leucémicas, lo que les permite sobrevivir cuando, de lo contrario, los macrófagos las depurarían.

Para modelar el efecto tumorigénico de tener una expresión de CD47 alta frente a baja, clasificamos clones de células MOLM-13 que expresan CD47 murino en expresadores altos y bajos. Cuando se ajustó al tamaño celular, la densidad de CD47 en las células CD47loMOLM-13 fue aproximadamente igual a la de las células de la médula ósea de ratón, mientras que las células CD47hiMOLM-13 tuvieron una expresión aproximadamente 9 veces mayor, un aumento acorde con el cambio observado en la expresión de CD47 en células leucémicas primarias en comparación con sus contrapartidas normales. Cuando se trasplantaron células de alta o baja expresión a los receptores, solo los ratones trasplantados con células de alta expresión sucumbieron a la enfermedad a los 75 días de edad. Además, la organomegalia fue más pronunciada en ratones trasplantados con células de alta expresión. Los ratones que recibieron células CD47loMOLM-13 todavía tenían masas hepáticas notables. Sin embargo, las masas eran invariablemente 1-2 nódulos grandes que estaban bien encapsulados y segregados físicamente del parénquima hepático, en marcado contraste con las masas tumorales de las células CD47hi MOLM-13 que consistían de cientos de masas pequeñas dispersadas por todo el parénquima. Por tanto, estas grandes masas tumorales consisten de células que han encontrado nichos libres de macrófagos para crecer separadas del cuerpo del órgano principal. Como era de esperar, la infiltración de células MOLM-13 en la médula ósea y el bazo de los ratones receptores también fue mucho mayor para los ratones trasplantados con células CD47hiMOLM-13. También examinamos el nivel de expresión de CD47 en dos ratones que recibieron células CD47loMOLM-13 pero tenían un injerto de médula significativo. En ambos casos, las células persistentes después de 75 días tenían niveles mucho más altos de CD47 que la línea original, lo que indica que hay una fuerte presión de selección in vivo para niveles altos de expresión de CD47 en células leucémicas. En total, estos datos indican que el nivel de expresión de CD47 es un factor significativo en el potencial tumorigénico, y que en una población heterogénea de células leucémicas, hay una fuerte selección para aquellos clones con alta expresión de CD47.

Luego preguntamos si un nivel de expresión de CD47 más alto proporcionaría una protección adicional contra la fagocitosis de macrófagos. Realizamos un ensayo de fagocitosis in vitro con células que expresan proteína fluorescente roja (RFP) de CD47hi y CD47loMOLM-13. Después de la incubación con macrófagos, se fagocitaron cantidades mucho mayores de células CD47lC) en comparación con las células CD47hi. Si se comparan los índices fagocíticos para las células MOLM-13 de control, las células CD47 MOLM-13 a granel (no clasificadas), las células CD47to y CD47hiMOLM-13, entonces puede verse una correlación directa entre el nivel de expresión de CD47 y la capacidad para evadir la fagocitosis. Además, cuando las células CD47to RFP MOLM-13 y las células CD47hi GFP MOLM-13 se coincubaron con macrófagos en los mismos pocillos, las células de baja expresión tenían muchas más probabilidades de ser fagocitadas. Por tanto, en una población mixta de células con niveles variables de expresión de CD47, es más probable que las células de baja expresión se depuren por depuración fagocítica a lo largo del tiempo.

También titulamos la expresión de CD47 usando otro método. Como CD47 se expresa en células MOLM-13 usando un sistema Tet-OFF, utilizamos el elemento promotor inducible por Tet para controlar la expresión de CD47 en células MOLM-13. Comenzando dos semanas después del trasplante con células CD47hi MOLM-13, se administró doxiciclina a una cohorte de ratones y se les hizo un seguimiento hasta 75 días después del trasplante. Durante este curso temporal, ninguno de los ratones que recibieron doxiciclina sucumbió a la enfermedad o tuvo una gran infiltración de células MOLM-13 en los órganos hematopoyéticos. A las dosis de doxiciclina usadas en este experimento, la expresión de muCD47 en células MOLM-13 se redujo a niveles inferiores a los de la médula ósea de ratón normal, pero notablemente no estaba completamente ausente. Por tanto, se requiere un nivel alto sostenido de expresión de CD47 para una supervivencia robusta de MOLM-13 en órganos hematopoyéticos.

En la bibliografía se han descrito muchos ejemplos de depuración de tumores por células T, B y NK, lo que indica que un sistema inmunitario saludable es esencial para regular el crecimiento de tumores incipientes. Sin embargo, hasta la fecha, se han producido pocos ejemplos que indiquen que la fagocitosis mediada por macrófagos puede controlar el desarrollo tumoral. Colectivamente, nuestros estudios revelan que la expresión ectópica de CD47 puede permitir que las células tumorales inmunogénicas crezcan rápidamente en un huésped con deficiencia de células T, B y n K. Además, es probable que esto refleje un mecanismo usado por las leucemias mieloides humanas para evadir el sistema inmunitario del huésped, ya que CD47 se regula por incremento constantemente en las leucemias mieloides murinas y humanas, incluyendo todas las formas de leucemia mieloide aguda y crónica analizadas hasta el momento. Por tanto, parece probable que las células tumorales sean capaces de ser reconocidas como objetivo por macrófagos activados y depuradas mediante fagocitosis. Al regular por incremento CD47, los cánceres pueden escapar de esta forma de vigilancia tumoral inmunitaria innata.

Esta forma de evasión inmune es particularmente importante ya que estos cánceres a menudo ocupan sitios de alta infiltración de macrófagos. CD47 se clonó por primera vez como un marcador de células tumorales de ovario, lo que indica que también puede desempeñar un papel en la prevención de la fagocitosis de otros cánceres de tejido. Además, los tumores sólidos a menudo metastatizan en tejidos ricos en macrófagos como el hígado, los pulmones, la médula ósea y los ganglios linfáticos, lo que indica que deben ser capaces de escapar de la muerte mediada por macrófagos en esos tejidos. Encontrar métodos para interrumpir la interacción de CD47-SIRPa puede resultar ampliamente útil en el desarrollo de nuevas terapias para el cáncer. La prevención de la interacción de CD47-SIRPa es doblemente eficaz, ya que los macrófagos pueden presentar los antígenos de las células tumorales fagocitadas para activar una respuesta inmunitaria adaptativa, lo que lleva a una mayor destrucción del tumor.

Métodos

Ratones. Se crearon ratones transgénicos hMRP8bcrabl, hMRP8bcl2 y Faslpr/lpr como se ha descrito anteriormente y se cruzaron para obtener transgénicos dobles. Se obtuvieron homocigotos de hMRP8bcl2 cruzando ratones heterocigotos entre sí. Se usaron ratones C57Bl/6 Ka de nuestra colonia como fuente de células de tipo salvaje. Para los experimentos de trasplante, las células se trasplantaron en ratones C57Bl/6 RAG2-/- de cadena gamma común (Gc)-/- a los que se les administró una dosis de radiación de 4 Gy usando rayos gamma de un irradiador de cesio (Phillips). Se trasplantaron leucemias primarias de ratón en ratones CD45.2 C57Bl6/Ka a los que se les administró una dosis de radiación de 9,5 Gy. Los ratones fueron sacrificados cuando estaban moribundos.

Tejidos de ratón. Los huesos largos se enjuagaron con PBS suplementado con medio de tinción de suero de ternera fetal (SM) al 2%. Los bazos e hígados se disociaron usando portaobjetos de vidrio esmerilados en SM, luego se pasaron a través de una malla de nylon. Todas las muestras se trataron con tampón de lisis ACK para lisar los eritrocitos antes del análisis adicional.

Análisis cuantitativo de RT-PCR. La médula ósea se obtuvo de ratones leucémicos hMRP8bcr/abl x hMRP8bcl2 o ratones de control hMRP8bcl2. Las células se enriquecieron con c-Kit usando microperlas c-Kit y una columna autoMACS (Miltenyi), se extrajo el ARN con el reactivo Trizol (Invitrogen) y se realizó la transcripción inversa con la polimerasa inversa SuperScriptII (Invitrogen). Se usó ADNc correspondiente a aproximadamente 1000 células por reacción de PCR. La PCR cuantitativa se realizó con un kit verde SYBR en una máquina ABI Prism 7000 PCR (Applied Biosystems) a 50° C durante 2 minutos, seguido de 95° C durante 10 minutos y luego 40 ciclos de 95° C durante 15 minutos. seguido de 60° C durante 1 minuto. Se usaron beta-actina y ARN 18S como controles para la cantidad de ADNc y se normalizaron los resultados de la expresión de CD47. Las secuencias para los cebadores directo e inverso de ARN 18S fueron TTGACGGAAGGGCACCACCAG y GCACCACCACCCACGGAATCG, respectivamente, para beta-actina fueron TTCCTTCTTGGGTATGGAAT y ^gA^g CAATGATCTTGATCCTC, y para CD47 fueron AGGCCAAGTCCAGAAGCATTC y AATCATTCTGCTGCTCGTTGC.

Muestras de médula ósea y sangre periférica humanas. Se obtuvieron muestras de médula ósea normales con consentimiento informado de donantes remunerados de 20-25 años que eran negativos para hepatitis A, B, C y VIH por serología (All Cells). Las células de sangre y médula fueron donadas por pacientes con leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mieloide crónica (CML) y leucemia mielógena aguda (AML) y se obtuvieron con consentimiento informado de pacientes no tratados con anterioridad.

Líneas celulares. Se obtuvieron células MOLM-13 de DSMZ. Las células HL-60 y Jurkat se obtuvieron de la ATCC. Las células se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) más suero bovino fetal al 10% (FBS) (Hyclone). Para fraccionar las células MOLM-13 en aquellas con expresión alta y baja de CD47, las células Tet-CD47 MOLM-13 se tiñeron con el anticuerpo Alexa-680 anti-CD47 de ratón (mIAP301). El 5% más alto y el más bajo de las células que expresan CD47 de ratón se clasificaron en un BD FACSAria y se volvieron a cultivar en IMDM FCS al 10% durante 2 semanas. Las células se clasificaron para tres rondas más de selección siguiendo el mismo protocolo para obtener las células de alta y baja expresión usadas en este estudio. Para obtener constructos de proteína roja fluorescente (RFP), el ADN de mCherry RFP se clonó en el vector vacío Lentilox 3.7 (pLL3.7). Luego se usó el lentivirus obtenido a partir de este constructo para infectar líneas celulares.

Tinción celular y citometría de flujo. La tinción de células madre y progenitoras de ratón se realizó con los siguientes anticuerpos monoclonales: se usaron Mac-1, Gr-1, CD3, CD4, CD8, B220 y Ter119 conjugados con Cy5PE (eBioscience) en el cóctel de linaje, se usaron c- Kit PE-Cy7 (eBioscience), Sca-1 Alexa680 (el 3-161-7, producido en nuestro laboratorio), CD34 FITC (eBioscience), CD16/32 (FcGRII/III) APC (Pharmingen) y CD135 (Flk-2) PE (eBioscience) como se ha descrito anteriormente para teñir los subconjuntos de progenitores y madre de ratón. El anticuerpo CD47 de ratón (clon mIAP301) se evaluó usando el anticuerpo biotinilado producido en nuestro laboratorio. Luego, las células se tiñeron con Quantum Dot 605 conjugado con estreptavidina (Chemicon). Las muestras se analizaron usando un FACSAria (Beckton Dickinson).

Para las muestras humanas, se extrajeron fracciones mononucleares siguiendo la centrifugación de densidad de Ficoll de acuerdo con métodos estándar y se analizaron frescas o después de una descongelación rápida de las muestras previamente congeladas en FCS al 90% y DMSO al 10% en nitrógeno líquido. En algunos casos, las células CD34+ se enriquecieron a partir de fracciones mononucleares con la ayuda de perlas inmunomagnéticas (CD34+ Progenitor Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Antes del análisis FACS y la clasificación, los progenitores mieloides se tiñeron con anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE)-Cy5 específicos del marcador de linaje, que incluían CD2 RPA-2.10; CD11b, ICRF44; CD20, 2H7; CD56, B159; GPA, ^g A-R2 (Becton Dickinson - PharMingen, San Diego), CD3,S4.1;CD4, S3.5; CD7, CD7-6B7; CD8, 3B5; CD10, 5-1B4, CD14, T^u K4; CD19, SJ25- C1 (Caltag, South San Francisco, CA) y anti-CD34 conjugado con APC, HPCA-2 (Becton Dickinson-PharMingen), anti-CD38 biotinilado HIT2 (Caltag) además de anti-IL-3Ra conjugado con PE, 9F5 (Becton Dickinson- ParMingen) y anti-CD45RA conjugado con FITC MEM56 (Caltag) seguido de tincición con estreptavidina -rojo Texas para visualizar células teñidas CD38-BIO.

Después de la tinción, las células se analizaron usando un FACS Vantage modificado (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) equipado con un láser de colorante de 599 nm y un láser de argón de 488 nm o un FACSAria. Las células madre hematopoyéticas (HSC) se identificaron como CD34+CD38+CD90+ y linaje negativo. Se usó FITC anti-CD47 humano (clon B6H12, Pharmingen) para evaluar la expresión de CD47 en todas las muestras humanas. El cambio de veces para la expresión de CD47 se determinó dividiendo la intensidad de fluorescencia media promedio de CD47 para todas las muestras de CML-BC, CML-CP o AML por la intensidad de fluorescencia media promedio de las células normales para una población celular dada. Los progenitores mieloides comunes (CMP) se identificaron en base a la tinción de CD34+ CD38+ IL-3Ra+ CD45RA- lin- y suprogenie incluyendo sus progenitores de granulocitos/macrófagos (GMP) que eran CD34+CD38+IL-3Ra+ CD45RA+ Linmientras que los progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP) se identificaron en base a tinción CD34+ CD38+ IL-3Ra - CD45RA- Lin-.

Para determinar la densidad de CD47 humano o de ratón, las células se tiñeron con cantidades saturadas de anticuerpo anti-CD47 y se analizaron en un FACSAria. como la dispersión directa es directamente proporcional al diámetro de la célula, y la densidad es igual al nivel de expresión por unidad de superficie, usamos el software FloJo para calcular la intensidad fluorescente media geométrica del canal de CD47 y la dividimos por la media geométrica del valor de dispersión directo al cuadrado (FSC2) para obtener una aproximación de la densidad de expresión de CD47 en la membrana.

El injerto de células MOLM-13 se evaluó usando PE-Cy7 anti-CD45 humano (Pharmingen), APC anti-CD45.2 de ratón (clon AL1-4A2) y Alexa-680 anti-CD47 de ratón (mIAP301). Todas las muestras se resuspendieron en tampón que contenía yoduro de propidio antes del análisis para excluir las células muertas. Los datos de FACS se analizaron usando el software FloJo (Treestar).

Preparación lentiviral y transducción. Los plásmidos pRRL.sin-18.PPT.Tet07.IRES.GFP.pre, CMV, VSV y tet trans-activador (tTA) se obtuvieron de Luigi Naldini. Eric Brown (UCSF) proporcionó el ADNc murino de longitud completa para la forma 2 de CD47. El constructo de ADNc de CD47 se ligó en el sitio BamHI/NheI de Tet-MCS-IRES-GFP. El ADN del plásmido se transfectó en células 293T usando protocolos estándar. El sobrenadante se recogió y se concentró usando una centrífuga Beckman LM-8 (Beckman). Las células se transdujeron con Tet o Tet-CD47-MCS-IRES-GFP y lentivirus tTA durante 48 horas. Las células GFP+ se clasificaron hasta la pureza y se cultivaron durante varias generaciones para garantizar la estabilidad de los transgenes.

Inyecciones. Las células se inyectaron por vía intravenosa en los senos retroorbitales de los ratones receptores o a través de la vena de la cola, como se indicó. Para las inyecciones intrafemorales, se inyectaron células en la cavidad femoral de ratones anestesiados en un volumen de 20 pl usando una aguja de calibre 27. Se usó una cámara de gas de isofluorano para anestesiar a los ratones cuando era necesario.

Injerto de células MOLM-13. Los animales se sacrificaron cuando estaban moribundos y se recogieron la médula ósea, el bazo y el hígado. Se obtuvo sangre periférica por sangrado de la cola de los animales 1 hora antes de la eutanasia. El injerto de células MOLM-13 en la médula, el bazo y la sangre periférica se determinó como se ha descrito anteriormente. La carga tumoral en el hígado se determinó calculando el área de cada nódulo tumoral visible usando la fórmula ((longitud en mm anchura en mm)/2)*n. Luego se sumó el área de cada nódulo por hígado.

Administración de doxiciclina. Se añadió clorhidrato de doxiciclina (Sigma) al agua potable a una concentración final de 1 mg/ml. El agua potable se reponía cada 4 días y se protegía de la luz. Además, los ratones recibieron un bolo de 10 pg de doxiciclina por inyección i.p. una vez a la semana.

Macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM). Se recogieron fémures y tibias de ratones C57Bl/6 Ka y se enjuagó la médula y se colocó en una suspensión estéril de PBS. La suspensión de médula ósea se cultivó en IMDM más FBS al 10% con 10 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos murino recombinante (MCSF, Peprotech) durante 7-10 días.

Ensayos de fagocitosis in vitro. Se recogieron BMDM mediante incubación en tripsina/EDTA (Gibco) durante 5 minutos y raspado suave. Los macrófagos se colocaron en placas a 5 x 104 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Falcon). Después de 24 horas, el medio se reemplazó con IMDM sin suero. Después de 2 horas adicionales, se añadieron 2,5 x 105 células Tet o Tet-CD47 MOLM-13 a los pocillos que contenían macrófagos y se incubaron a 37° C durante los tiempos indicados. Después de la incubación conjunta, los pocillos se lavaron minuciosamente con IMDM 3 veces y se examinaron en un Eclipse T5100 (Nikon) usando una proteína fluorescente verde mejorada (GFP) o un juego de filtros Rojo Texas (Nikon). Se contó el número de células GFP+ o RFP+ dentro de los macrófagos y se calculó el índice fagocítico usando la fórmula: índice fagocítico = número de células ingeridas/(número de macrófagos/100). Se contaron por lo menos 200 macrófagos por pocillo. Para el análisis por citometría de flujo de la fagocitosis, los macrófagos se recogieron después de la incubación con células MOLM-13 usando tripsina/EDTA y raspado suave. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Mac-1 PE y se analizaron en un BD FACSAria. Las imágenes fluorescentes y de campo claro se tomaron por separado usando una Eclipse T5100 (Nikon), una lámpara de mercurio de súper alta presión (Nikon), un filtro de paso de banda de proteína fluorescente verde dotada (eGFP) (Nikon), un filtro de paso de banda Rojo Texas (Nikon) y una cámara RT Slider (Spot Diagnostics). Las imágenes se fusionaron con el software Photoshop (Adobe).

Para ensayos in vivo, se recogió médula de huesos largos de pierna, bazo e hígado 2 horas después de inyectar células objetivo en ratones RAG2-/-, Gc-/-. Se prepararon en suspensiones de células individuales en PBS más FCS al 2%. Las células se marcaron con Cy7-PE anti-CD45 humano y biotina anti-F4/80 de ratón (eBiosciences). La tinción secundaria se realizó con estreptavidina-APC (eBiosciences). Las células que eran CD45-humanas, F4/80+ se consideraron macrófagos y se evaluaron las células GFP+ en esta fracción.

Ejemplo 3

CD47 es un factor de pronóstico independiente y un objetivo de anticuerpo terapéutico en células de leucemia mieloide aguda humana

La leucemia mielógena aguda (AML) se organiza como una jerarquía celular iniciada y mantenida por un subconjunto de células madre de leucemia (LSC) autorrenovables. Planteamos la hipótesis que la expresión de CD47 aumentada en LSC de AML contribuye a la patogénesis inhibiendo su fagocitosis a través de la interacción de CD47 con un receptor inhibidor en los fagocitos. Descubrimos que CD47 se expresaba más en LSC de AML que sus contrapartidas normales, y que la expresión de CD47 aumentada predijo una peor supervivencia general en 3 cohortes independientes de pacientes adultos con AML. Además, el bloqueo de anticuerpos monoclonales contra CD47 permitió preferentemente la fagocitosis de LSC de AML por macrófagos in vitro e inhibió su injerto in vivo. Finalmente, el tratamiento de ratones injertados con AML humana con anticuerpo anti-CD47 eliminó la AML in vivo. En resumen, la expresión de CD47 aumentada es un factor de pronóstico pobre independiente que puede dirigirse a células madre de AML humana con anticuerpos monoclonales capaces de estimular la fagocitosis de LSC.

RESULTADOS CD47 se expresa más en LSC de AML que sus contrapartidas normales y está asociado con la mutación FLT3-ITD. En nuestra investigación de varios modelos de ratón de leucemia mieloide, identificamos una expresión aumentada de CD47 en células de leucemia de ratón en comparación con la médula ósea normal. Esto impulsó la investigación de la expresión de CD47 en LSC de AML humana y sus contrapartidas normales. Usando citometría de flujo, CD47 se expresó más altamente en múltiples especímenes de LSC de AML que HSC y MPP de médula ósea normal (Figura 5). Esta expresión aumentada se extendió a las células de leucemia a granel, que expresaron CD47 de manera similar a la fracción enriquecida con LSC.

El examen de un subconjunto de estas muestras indicó que la expresión superficial de CD47 se correlacionaba con la expresión de ARNm de CD47. Para investigar la expresión de CD47 en los subgrupos morfológicos, citogenéticos y moleculares de AML, se analizaron los datos de la expresión génica de una cohorte descrita previamente de 285 pacientes adultos (Valk et al., 2004 N Engl J Med 350, 1617-1628). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de CD47 entre los subtipos FAB (francés-estadounidense-británico). En la mayoría de los subgrupos citogenéticos, CD47 se expresó a niveles similares, excepto en los casos que albergaban t(8;21)(q22;q22), un grupo de riesgo favorable que tenía una expresión de CD47 más baja estadísticamente significativa. En los subgrupos de AML caracterizados molecularmente, no se encontró una asociación significativa entre la expresión de CD47 y las mutaciones en el dominio de tirosina quinasa de FLT3 (FLT3-TKD), sobreexpresión de EVI1, o mutaciones en CEBPA, NRAS o KRAS. Sin embargo, se correlacionó fuertemente una expresión de CD47 más alta con la presencia de FLT3-ITD (p<0,001), que se observa en casi un tercio de los pacientes con AML con cariotipos normales y se asocia con una peor supervivencia global. Este descubrimiento se confirmó por separado en dos conjuntos de datos independientes de 214 y 137 pacientes con AML (Tabla 1).

Tabla 1: Características clínicas y moleculares de muestras de AML de la cohorte de validación y comparación nr l r x r i n D47 D47 l

_______ (continuación)_____________________________________ ares tabuladas al diagnóstico. WBC indica recuento de glóbulos e-británico; FLT3-ITD, duplicación interna en tándem del gen FLT3 l estado de FLT3-ITD, el estado de FLT3-ITD predicho basado en la el método de Bullinger et al, 2008); FLT3-TKD, mutación del dominio mutación del gen NPM1; MLL-PTD, duplicación parcial en tándem del n CEBPA. CR, remisión completa. La CR se evaluó tanto después del inducción, que comprendían ICE (idarrubicina, etopósido, citarabina) s y dosis altas de citarabina más mitoxantrona). HSCT autólogo; trasplante alogénico.

ias en las características moleculares y clínicas al momento del res bajos y altos de expresión de ARNm de CD47. La expresión de nto de corte óptimo para la estratificación de la supervivencia general e datos de micromatrices independiente publicado (Valk et al, 2004)

plementarios._____________________________________________

Identificación y separación de progenitores normales y leucémicos del mismo paciente en base a la expresión diferencial de CD47. En la fracción Lin-CD34+CD38- enriquecida con LSC de la muestra SU008, se detectó una población rara de células que expresan CD47lo, además de la mayoría de las células que expresan CD47hi (Figura 10 A). Estas poblaciones se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) a una pureza >98% y se trasplantaron a ratones NOG recién nacidos o se sembraron en metilcelulosa completa. Las células CD47hi no se injertaron in vivo ni formaron colonias in vitro, como puede observarse con algunas muestras de AML.

Sin embargo, las células CD47lC) injertadas con hematopoyesis mielo-linfoide normal in vivo formaron numerosas colonias mieloides morfológicamente normales in vitro (Figura 10B,C). Este espécimen albergaba la mutación FLT3-ITD, que se detectó en las células de leucemia a granel (Figura 10D). Las células CD47hi purificadas contenían la mutación FLT3-ITD y, por lo tanto, formaban parte del clon leucémico, mientras que las células CD47lC) no. Las células humanas aisladas de ratones injertados con células CD47lo contenían sólo FLT3 de tipo salvaje, lo que indica que las células CD47to contenían progenitores hematopoyéticos normales.

La expresión de CD47 aumentada en AML humana se asocia con malos resultados clínicos. Planteamos la hipótesis que la expresión de CD47 aumentada en la AML humana contribuye a la patogénesis. A partir de esta hipótesis, predijimos que la AML con mayor expresión de CD47 se asociaría con peores resultados clínicos. De acuerdo con esta hipótesis, el análisis de un grupo previamente descrito de 285 pacientes adultos con AML con diversas anomalías citogenéticas y moleculares (Valk et al., 2004) reveló que una estratificación dicotómica de pacientes en grupos de expresión baja de CD47 y alta de CD47 se asoció con un riesgo significativamente aumentado de muerte en el grupo de expresión alta (p = 0,03). La asociación de la supervivencia global con esta estratificación dicotómica de la expresión de CD47 se validó en una segunda cohorte de prueba de 242 pacientes adultos (Metzeler et al., 2008 Blood) con cariotipos normales (NK-AML) (p=0,01).

Aplicando esta estratificación a una cohorte de validación distinta de 137 pacientes adultos con cariotipos normales (Bullinger et al., 2008 Blood 111,4490-4495), confirmamos el valor del pronóstico de la expresión de CD47 para la supervivencia general y libre de eventos. El análisis de las características clínicas de los grupos de expresión de CD47 baja y alta en esta cohorte de validación cruzada también identificó diferencias estadísticamente significativas en el recuento de glóbulos blancos (WBC) y el estado de FLT3-ITD, y ninguna diferencia en las tasas de remisión completa y el tipo de terapia de consolidación que incluía el trasplante alogénico (tabla 1). El análisis de Kaplan-Meier demostró que la expresión de CD47 alta en el momento del diagnóstico estaba significativamente asociada con una peor supervivencia global y libre de eventos. Los pacientes en el grupo de baja expresión de CD47 tuvieron una mediana de supervivencia libre de eventos de 17,1 meses en comparación con 6,8 meses en el grupo de expresión de CD47 alta, correspondiente a un cociente de riesgos de 1,94 (intervalo de confianza del 95%: 1,30 a 3,77, p=0,004). Para la supervivencia general, los pacientes en el grupo de expresión de CD47 baja tuvieron una mediana de 22,1 meses en comparación con 9,1 meses en el grupo de expresión de CD47 alta, lo que corresponde a un cociente de riesgos de 2,02 (intervalo de confianza del 95%: 1,37 a 4,03, p = 0,002). Cuando la expresión de CD47 se consideró como una variable continua, la expresión aumentada también se asoció con una peor supervivencia libre de eventos (p=0,02) y global (p=0,02).

A pesar de la asociación con FLT3-ITD, la expresión de CD47 aumentada en el momento del diagnóstico se asoció significativamente con una peor supervivencia global y libre eventos en el subgrupo de 74 pacientes sin FLT3-ITD, cuando se consideró como una clasificación binaria o como una variable continua (p= 0,02 tanto para la supervivencia libre de eventos como para la supervivencia global). En un análisis multivariable que consideró la edad, el estado de FLT3-ITD y la expresión de CD47 como una variable continua, la expresión de CD47 aumentada permaneció asociada con una peor supervivencia libre de eventos con un cociente de riesgos de 1,33 (intervalo de confianza del 95%: 1,03 a 1,73, p = 0,03) y supervivencia global con un cociente de riesgos de 1,31 (intervalo de confianza del 95%: 1,00 a 1,71, p=0,05) (Tabla 2).

Tabla 2

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humano permiten preferentemente la fagocitosis de LSC de AML por macrófagos humanos. Planteamos la hipótesis que la expresión de CD47 aumentada en la AML humana contribuye a la patogénesis al inhibir la fagocitosis de las células leucémicas, lo que nos lleva a predecir que la alteración de la interacción de CD47-SIRPa con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 permitirá preferentemente la fagocitosis de LSC de AML. Se han generado varios anticuerpos monoclonales anti-CD47 humanos, incluyendo algunos capaces de bloquear la interacción CD47-SIRPa (B6H12.2 y BRIC126) y otros incapaces de hacerlo (2D3) (Subramanian et al., 2006 Blood 107, 2548-2556). Se probó la capacidad de estos anticuerpos para permitir la fagocitosis de LSC de AML, o células CD34+ de médula ósea humana normal, por macrófagos humanos in vitro. La incubación de LSC de AML con macrófagos humanos en presencia de anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o anticuerpo monoclonal de IgG1 anti-CD45 humano de ratón no dio como resultado una fagocitosis significativa según lo determinado o por microscopía de inmunofluorescencia o por citometría de flujo. Sin embargo, la adición de los anticuerpos anti-CD47 bloqueantes B6H12.2 y BRIC126, pero no el 2D3 no bloqueante, permitió la fagocitosis de LSC de AML. No se observó fagocitosis de células CD34+ normales con ninguno de los anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humano permiten la fagocitosis de LSC de AML por macrófagos de ratón. Para evaluar directamente el efecto de inhibir la interacción de CD47 humano con SIRPa de ratón, se realizaron los ensayos de fagocitosis in vitro descritos anteriormente con macrófagos de ratón. La incubación de LSC de AML con macrófagos de ratón en presencia de anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o anticuerpo monoclonal de IgG1 anti-CD45 humano de ratón no dio como resultado una fagocitosis significativa según se determinó por microscopía de inmunofluorescencia o citometría de flujo. Sin embargo, la adición de los anticuerpos anti-CD47 bloqueantes B6H12.2 y BRIC126, pero no el 2D3 no bloqueante, permitió la fagocitosis de LSC de AML.

Un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 humano inhibe el injerto de LSC de AML y elimina la AML in vivo. Se probó la capacidad del anticuerpo anti-CD47 bloqueante B6H12.2 para dirigirse a LSC de AML in vivo. En primer lugar, se utilizó una estrategia de recubrimiento previo en la que las LSC de AML se purificaron mediante FACS y se incubaron con control de isotipo de IgG1, anticuerpo anti-CD45 humano o anti-CD47 humano. Se analizó el recubrimiento de una alícuota de las células mediante tinción con un anticuerpo secundario que demostró que tanto el anticuerpo anti-CD45 como el anti-CD47 se unían a las células. Las células restantes se trasplantaron a ratones NOG recién nacidos que se analizaron para determinar el injerto leucémico 13 semanas después. En todos los ratones menos uno, el control de isotipo y las células recubiertas de anticuerpo anti-CD45 mostraron un injerto leucémico a largo plazo. Sin embargo, la mayoría de los ratones trasplantados con células recubiertas con anticuerpo anti-CD47 no tenían injerto de leucemia detectable.

A continuación, se utilizó una estrategia de tratamiento en la que los ratones se injertaron primero con LSC de AML humano y luego se les administraron inyecciones intraperitoneales diarias de 100 microgramos de IgG de ratón o anticuerpo anti-CD47 durante 14 días, con injerto leucémico determinado antes y después del tratamiento. El análisis de la sangre periférica mostró una eliminación casi completa de la leucemia circulante en ratones tratados con anticuerpo anti-CD47, a menudo después de una única dosis, sin respuesta en ratones de control (Figura 11A, B). De manera similar, hubo una reducción significativa en el injerto leucémico en la médula ósea de los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47, mientras que la implicación leucémica aumentó en los ratones tratados con IgG de control (Figura 11C,D). El análisis histológico de la médula ósea identificó blastos leucémicos monomórficos en ratones tratados con IgG de control (Figura 11E, paneles 1,2) y áreas hipocelulares depuradas en ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 (Figura 11E, paneles 4,5). En la médula ósea de algunos ratones tratados con anticuerpos anti-CD47 que contenían leucemia residual, se detectaron macrófagos que contenían células picnóticas fagocitadas, capturando la eliminación de la leucemia humana (Figura 11E, paneles 3,6).

Informamos aquí de la identificación de una expresión de CD47 más alta en LSC de AML en comparación con sus contrapartidas normales y planteamos la hipótesis de que una expresión de CD47 aumentada en AML humana contribuye a la patogénesis inhibiendo la fagocitosis de estas células a través de la interacción de CD47 con SIRPa. De acuerdo con esta hipótesis, demostramos que la expresión de CD47 aumentada en la AML humana se asocia con una disminución de la supervivencia general. También demostramos que la alteración de la interacción de CD47-SIRPa con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 permite preferentemente la fagocitosis de LSC de AML por macrófagos in vitro, inhibe el injerto de LSC de AML y elimina la AML in vivo. Juntos, estos resultados establecen el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD47 como terapia para la leucemia humana.

Como se demuestra aquí, CD47 contribuye a la patogénesis a través de un mecanismo distinto, lo que confiere una ventaja de supervivencia a las LSC y los blastos de la progenie a través de la evasión de la fagocitosis por parte del sistema inmunitario innato. Creemos que la expresión de CD47 aumentada representa el primer mecanismo de evasión inmunitaria descrito con implicaciones pronósticas y terapéuticas para la AML humana.

Una expresión más alta de CD47 es un marcador de las células madre de la leucemia y un pronóstico de la supervivencia general en la AML. Las LSC de AML están enriquecidas en la fracción Lin-CD34+CD38-, que en la médula ósea normal contiene HSC y MPP. La identificación de moléculas de superficie celular que puedan distinguir entre células madre leucémicas y normales es esencial para la evaluación basada en citometría de flujo de la enfermedad residual mínima (MRD) y para el desarrollo de estrategias de separación prospectivas para su uso en terapias celulares. Recientemente se han identificado varias moléculas candidatas, incluyendo CD123, CD96, CLL-1 y ahora CD47.

La expresión de CD47 aumentada predice independientemente un peor resultado clínico en pacientes con AML con un cariotipo normal, incluyendo el subconjunto sin la mutación FLT3-ITD, que es el subgrupo más grande de pacientes con AML. Como este análisis dependía de la expresión relativa del ARNm de CD47, un ensayo de PCR cuantitativo para el pronóstico de AML puede basarse en el nivel de expresión de CD47. Tal ensayo podría utilizarse en la toma de decisiones terapéuticas adaptadas al riesgo, particularmente en el gran subgrupo de pacientes con AML con cariotipos normales que carecen de la mutación FLT3-ITD.

Direccionamiento de CD47 en LSC de AML con anticuerpos monoclonales terapéuticos. Las moléculas de la superficie celular expresadas preferentemente en LSC en comparación con sus contrapartidas normales son adecuadas para el direccionamiento con anticuerpos monoclonales terapéuticos. Hasta ahora, se han dirigido varias moléculas a AML, incluyendo CD33, CD44, CD123 y ahora CD47. CD33 es el objetivo del conjugado de anticuerpo monoclonal gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg), que está aprobado para el tratamiento de la AML recidivante en pacientes de edad avanzada. Se demostró que el direccionamiento de CD44 con un anticuerpo monoclonal reduce notablemente el injerto de AML en ratones, con evidencia de que actúa específicamente sobre LSC para inducir la diferenciación. Recientemente se ha informado que un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD123 tiene eficacia para reducir la función de LSC de AML in vivo. Aquí informamos que un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD47 es capaz de estimular la fagocitosis de LSC de ^a M^l in vitro e inhibir el injerto in vivo. Una combinación de CD47 con CD33; con CD44 o con CD123 puede proporcionar resultados sinérgicos.

Varias líneas de evidencia sugieren que el direccionamiento de CD47 con un anticuerpo monoclonal probablemente actúa alterando la interacción de CD47-SIRPa, evitando de este modo una señal inhibidora fagocítica. En primer lugar, dos anticuerpos anti-CD47 bloqueantes permitieron la fagocitosis de LSC de AML. En segundo lugar, el anticuerpo anti-CD45 de isotipo coincidente, que también se une a LSC, no logró producir los mismos efectos.

Para terapias clínicas humanas, el bloqueo de CD47 en LSC de AML con anticuerpos monoclonales humanizados promueve la fagocitosis de LSC a través de un mecanismo similar, como lo indica la fagocitosis in vitro mediada por macrófagos humanos (Figura 8A,C). Identificamos un efecto preferencial de los anticuerpos anti-CD47 para permitir la fagocitosis de LSC de AML en comparación con las células CD34+ normales de la médula ósea por macrófagos humanos in vitro. De hecho, no se detectó un aumento de la fagocitosis de las células CD34+ normales en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra que el bloqueo de CD47 con anticuerpos monoclonales es una estrategia terapéutica viable para la leucemia humana.

La evidencia experimental presentada aquí proporciona anticuerpos monoclonales anti-CD47 como monoterapia o una estrategia de combinación para el tratamiento de la leucemia. La combinación de un anticuerpo anti-CD47, capaz de bloquear una fuerte señal inhibidora de la fagocitosis, con un segundo anticuerpo capaz de unirse a una molécula específica de LSC (por ejemplo, CD96, CD33, CD123, etc.) y acoplarse a los receptores de Fc en los fagocitos, proporcionando de este modo una fuerte señal positiva para la fagocitosis, puede dar como resultado un estímulo sinérgico para la fagocitosis y la eliminación específica de LSC. Además, las combinaciones de anticuerpos monoclonales con LSD que incluyen anticuerpos anti-CD47 bloqueantes y de IgG1 humana dirigidos contra otros dos antígenos de superficie celular tendrán más probabilidad de eliminar las células de leucemia con las variantes de epítopos preexistentes o la pérdida de antígeno que es probable que se repita en pacientes tratados con un único anticuerpo.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Muestras humanas. Se adquirieron células mononucleares de médula ósea humana normal de AllCells Inc. (Emeryville, CA). Se obtuvieron muestras de leucemia mieloide aguda humana (Figura 1A) de pacientes en el Centro Médico de la Universidad de Stanford con consentimiento informado, de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB (Stanford IRB N° 76935 y 6453). Se enriquecieron células humanas positivas para CD34 con perlas magnéticas (Miltenyi Biotech).

Análisis de citometría de flujo y clasificación celular. Se usó un panel de anticuerpos para el análisis y clasificación de LSC de AML (Lin-CD34+CD38-CD90-, donde el linaje incluía CD3, CD19 y CD20), HSC (Lin-CD34+CD38-CD90+) y MPP (Lin- CD34+CD38-CD90-CD45RA-) como se ha descrito anteriormente (Majeti et al., 2007). El análisis de la expresión de CD47 se realizó con un anticuerpo PE anti-CD47 humano (clon B6H12, BD Biosciences, San Jose CA).

Preparación de ADN genómico y análisis de FLT3-ITD por PCR. El ADN genómico se aisló de sedimentos celulares usando el kit Gentra Puregene de acuerdo con el protocolo del fabricante (Gentra Systems, Minneapolis, MN). El estado de FLT3-ITD se examinó mediante PCR usando cebadores que generaron un producto de tipo salvaje de 329 pb y productos de ITD de tamaños variables más grandes.

Anticuerpos anti-CD47 humanos. Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD47 humanos incluyeron: BRIC126, IgG2b (Abcam, Cambridge, MA), 2D3, IgG 1 (Ebiosciences, San Diego, CA) y B6H12.2, IgG1. La hibridoma B6H12.2 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). El anticuerpo se purificó o a partir de sobrenadante de hibridoma usando cromatografía de afinidad con proteína G de acuerdo con los procedimientos estándar o se obtuvo de BioXCell (Líbano, NH).

Ensayo de colonias de metilcelulosa. Se ensayó la formación de colonias de metilcelulosa colocando células clasificadas en placa en una placa de 6 pocillos, cada uno de los cuales contenía 1 ml de metilcelulosa completa (Methocult GF+ H4435, Stem Cell Technologies). Las placas se incubaron durante 14 días a 37° C y luego se puntuaron en base a la morfología.

Ensayos de fagocitosis in vitro. Las LSC de AML humana o células CD34+ de médula ósea normal se marcaron con CFSE y se incubaron con macrófagos de ratón o humanos en presencia de 7 |jg/ml de anticuerpo de control de isotipo de IgG1, IgG1 anti-CD45 o anti-CD47 (clones B6H12.2, BRIC126, o 2D3) durante 2 horas. Luego, las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia para determinar el índice fagocítico (número de células ingeridas por 100 macrófagos). En algunos casos, las células se recogieron y se tiñeron con un marcador de macrófago humano o de ratón y las células fagocitadas se identificaron mediante citometría de flujo como macrófago+CFSE+. El análisis estadístico usando la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism (San Diego, CAa).

Ensayo de injerto de prerrecubrimiento in vivo. Las LSC aisladas de especímenes de AML se incubaron con 28 jg/ml de anticuerpo de control de isotipo IgG1, IgG 1 anti-CD45 o IgG 1 anti-CD47 (B6H12.2) a 4° C durante 30 minutos. Luego, se tiñó una pequeña alícuota de células con anticuerpo secundario PE anti-ratón de burro (Ebioscience) y se analizó mediante citometría de flujo para evaluar el recubrimiento. Luego se trasplantaron aproximadamente 105 LSC recubiertas en cada ratón NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Wjl/SzJ (NOG) recién nacido irradiado. Los ratones se sacrificaron 13 semanas después del trasplante y se analizó la médula ósea para determinar el injerto de leucemia humana (hCD45+hCD33+) mediante citometría de flujo (Majeti et al., 2007 Cell Stem Cell 1,635-645). La presencia de leucemia humana se confirmó mediante tinción de Wright-Giemsa de células hCD45+ y FLT3-ITD PCR. El análisis estadístico usando la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism (San Diego, cA).

Tratamiento con anticuerpos in vivo de ratones injertados con AML. Se trasplantaron 1-25 x 105 LSC purificadas con FACS en crías de NOG. De ocho a doce semanas más tarde, se evaluó el injerto de AML humana (células hCD45+CD33+) en la sangre periférica y la médula ósea mediante sangrado de la cola y aspiración del fémur, respectivamente. Luego, los ratones injertados se trataron con inyecciones intraperitoneales diarias de 100 microgramos de anticuerpo anti-CD47 o control IgG durante 14 días. El día 15 se sacrificaron los ratones y se analizó la sangre periférica y la médula ósea para detectar AML.

Pacientes con AML, datos de expresión génica de micromatrices y análisis estadístico. Se analizaron la expresión génica y los datos clínicos de tres cohortes de pacientes adultos con AML descritas anteriormente: (1) un conjunto de datos de entrenamiento de 285 pacientes con diversas anomalías citogenéticas y moleculares descrito por Valk et al., (2) un conjunto de datos de prueba de 242 pacientes con cariotipos normales descrito por Metzeler et al., y (3) un conjunto de datos de validación de 137 pacientes con cariotipos normales descrito por Bullinger et al. Los criterios de valoración clínicos analizados incluyeron la supervivencia general y libre de eventos, con eventos definidos como el intervalo entre la inscripción en el estudio y la eliminación del estudio debido a la falta de remisión completa, recaída o muerte por cualquier causa, con datos censurados para pacientes que no tuvieron un evento en la última visita de seguimiento.

FLT3-ITD PCR. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de 50 pl que contenía 5 pl de tampón PCR 10x (KCL 50 mM/Tris 10 nM/MgCl22 mM/gelatina al 0,01%), 1 de dNTP 10 mM, 2 unidades de Tag polimerasa (invitrogen), 1 ul de cebador directo 11F 10 pM (5'-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3') y cebador inverso 12R (5'-CTTTCAg Ca TTTTGACGGCAACC-3'), y 10-50 ng de ADN genómico. Las condiciones de la PCR para la amplificación del gen FLT3 fueron 40 ciclos de desnaturalización (30 segundos a 95° C), apareamiento (30 segundos a 62° C) y extensión (30 segundos a 72° C).

Preparación de macrófagos humanos y de ratón. Se recogieron células mononucleares de médula ósea de ratón BALB/c y se cultivaron en IMDM que contenía FBS al 10% suplementado con 10 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinantes (M-CSF, Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 7-10 días para permitir la diferenciación terminal de monocitos a macrófagos. Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana a partir de sangre normal descartada del Centro Médico de la Universidad de Stanford. Los monocitos se aislaron adhiriendo células mononucleares a placas de cultivo durante una hora a 37° C, después de lo cual las células no adherentes se eliminaron mediante lavado. Las células restantes eran >95% positivas para CD14 y CD11b. A continuación, las células adherentes se incubaron en IMDM más suero humano al 10% (Valley Biomedical, Winchester, VA) durante 7-10 días para permitir la diferenciación terminal de monocitos a macrófagos.

Ensayo de fagocitosis in vitro. Se recogieron BMDM o macrófagos de sangre periférica mediante incubación en tripsina/EDTA (Gibco/Invitrogen) durante 5 minutos seguido de raspado suave. Se sembraron 5x104 macrófagos en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos en IMDM al 10% que contenía FBS al 10%. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con IMDM libre de suero y las células se cultivaron 2 horas adicionales. Las LSC se marcaron con fluorescencia con CFSE de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se añadieron 2x104 LSC marcadas con CFSE a los pocillos que contenían macrófagos junto con 7 pg/ml de anticuerpo de isotipo de IgG1 (Ebiosciences), anti-CD45 (clon H130, Ebiosciences) o anti-CD47, y se incubaron durante 2 horas. Luego, los pocillos se lavaron 3 veces con IMDM y se examinaron con un microscopio inmunofluorescente Eclipse T5100 (Nikon) usando un filtro de proteína fluorescente verde mejorado capaz de detectar fluorescencia CFSE. Se contó el número de células positivas para CFSE dentro de los macrófagos y se determinó el índice fagocítico como el número de células ingeridas por 100 macrófagos. Se contaron por lo menos 200 macrófagos por pocillo. Las imágenes fluorescentes y de campo claro se tomaron por separado y se fusionaron con Image Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Para el análisis de fagocitosis por citometría de flujo, las células se recogieron luego de cada pocillo usando tripsina/EDTA. Luego, las suspensiones celulares se tiñeron con un anticuerpo de macrófago de ratón anti-F4/80-PECy7 de ratón (Ebiosciences) o anti-CD14-PECy7 humano (Ebiosciences) y se analizaron en un FACSAria. Las LSC fagocitadas se definieron como células CFSE+F4/80+ o CFSE+CD14+ cuando se incubaron con macrófagos murinos o humanos, respectivamente.

Datos de expresión génica de micromatrices. Conjunto de entrenamiento: Los datos de expresión génica, datos citogenéticos y datos moleculares para los 285 y 465 pacientes con AML perfilados con micromatrices Affymetrix HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0 de Valk et al. y Jongen-Lavrencic et al. respectivamente, se obtuvieron de Gene Expression Omnibus usando los números de acceso correspondientes (GSE1159 y GSE6891). Los datos de resultado solo estaban disponibles para el conjunto de datos anterior, y los autores proporcionaron amablemente la información clínica correspondiente. Esta cohorte se presenta como el conjunto de datos de "entrenamiento". El último conjunto de datos se usó para confirmar las asociaciones univariadas con el cariotipo y las mutaciones moleculares descritas en el primero. Sin embargo, estos dos conjuntos de datos se superpusieron en el sentido de que 247 de los 285 pacientes del primer estudio estaban incluidos en el segundo y, por consiguiente, se excluyeron en la validación de la asociación de FLT3-ITD con la expresión de CD47 en el segundo conjunto de datos. Usando NetAffx4, RefSeq5 y UCSC Genome Browser6, identificamos 211075_s_at y 213857_s_at como conjuntos de sondas Affymetrix en el mapeo de micromatrices U133 Plus 2.0 exclusivamente para exones transcritos constitutivamente de CD47. Se empleó la media geométrica de los logaritmos en base 2 de estos dos conjuntos de sondas para estimar el nivel de expresión de ARNm para CD47 y las medidas estadísticas correspondientes para asociaciones con clasificación FAB, cariotipo y mutaciones moleculares. Como los datos proporcionados por Valk et al. como GSE1159 eran mediciones de intensidad de Affymetrix, convertimos estas intensidades en logaritmos de base 2 normalizados de proporciones para permitir la comparación con las mediciones correspondientes de micromatrices de ADNc usando un esquema convencional. Específicamente, primero (1) normalizamos los datos sin procesar usando archivos CEL de las 291 micromatrices dentro de este conjunto de datos usando gcRMA8, luego (2) generamos proporciones dividiendo la medición de intensidad para cada gen en una matriz dada por la intensidad media del gen en todas las matrices, (3) transformamos logarítmicamente (base 2) las proporciones resultantes, y (4) centramos la mediana en los datos de expresión entre matrices y luego entre genes. Para la evaluación del valor pronóstico de CD47, empleamos el conjunto de sondas 213857_s_at de las micromatrices HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0 de Affymetrix, dada su distribución de expresión similar (Figura 3B suplementaria), y considerando su posición dentro de la transcripción de ARNm en comparación con los clones de ADNc en las micromatrices de ADNc de Stanford como se indica en el recurso de NetAffx.

Equipo de prueba: Se obtuvieron la expresión génica y los datos clínicos de los 242 pacientes adultos con NKAML perfilados con micromatrices de Affymetrix HG-U133A y HG-U133 Plus 2.0 por Metzeler et al. de Gene Expression Omnibus usando los números de acceso correspondientes (GSE12417). Como los datos sin procesar no estaban disponibles para este conjunto de datos, con el propósito de evaluar el valor pronóstico de CD47, empleamos los conjuntos de datos normalizados proporcionados por los autores (logaritmos de base 2) y evaluamos la expresión de CD47 usando el conjunto de sondas 213857_s_at en las micromatrices correspondientes.

Conjunto de validación: Se obtuvieron los datos de expresión génica de los 137 pacientes con AML de cariotipo normal perfilados con micromatrices de ADNc por Bullinger et al. de la Stanford Microarray Database10. Los autores proporcionaron amablemente la información clínica correspondiente que incluía los datos de resultados y el estado de mutación de FLT3. Usando las anotaciones originales de las características de las micromatrices, así como SOURCE11, RefSeq5 y UCSC Genome Browser6, identificamos IMAGE:811819 como un mapeo de clones de ADNc verificado por secuencia para el exón terminal 3' transcrito constitutivamente de CD47 en las micromatrices de ADNc correspondientes.

Detalles del tratamiento: Los pacientes con AML descritos por Valk et al. (conjunto de entrenamiento), fueron tratados de acuerdo con varios protocolos del grupo cooperativo holandés-belga de hematología y oncología. La mayoría (90%) de los pacientes con NK-AML descritos por Metzeler et al. (conjunto de prueba) fueron tratados según el protocolo AMLCG-1999 del grupo cooperativo alemán de AML, y todos los pacientes recibieron quimioterapia intensiva de doble inducción y consolidación. Los 137 pacientes con NK-AML descritos por Bullinger et al. (conjunto de validación) recibieron regímenes de tratamiento intensificados de estándar de atención (protocolo AML HD98A), que incluyeron 2 ciclos de terapia de inducción con idarrubicina, citarabina y etopósido, un ciclo de consolidación de dosis altas de citarabina y mitoxantrona (HAM), seguido de asignación aleatoria a un ciclo de consolidación tardía de HAM frente a trasplante autólogo de células hematopoyéticas en caso de que no hubiera un donante familiar de HLA idéntico disponible para el trasplante alogénico de células hematopoyéticas.

Análisis estadístico. Usamos pruebas t de dos colas y análisis de varianza para la estimación de diferencias significativas en el nivel de expresión de CD47 en subgrupos de AML en base a categorizaciones morfológicas, citogenéticas y moleculares. Las asociaciones entre los grupos de CD47 alto y bajo y las características clínicas, demográficas y moleculares de referencia se analizaron usando las pruebas exacta de Fisher y de suma de rangos de Mann-Whitney para variables categóricas y continuas, respectivamente. Se consideró que los valores de p bilaterales inferiores a 0,05 indicaban significancia estadística.

El valor pronóstico de la expresión de CD47 se midió mediante la comparación de la supervivencia global y libre de eventos de los pacientes con la estimación de las curvas de supervivencia mediante el método de límite de producto de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico. Dentro de este análisis, primero derivamos una clasificación binaria de pacientes con AML en grupos de expresión de CD47 alto y CD47 bajo comparando la expresión de CD47 (medida por 213857_s_at dentro de GSE1159) con respecto a un umbral óptimo. Este umbral se determinó usando X-Tile16, un método que empleamos para maximizar la estadística de chi-cuadrado entre los dos grupos para el número de muertes esperado frente al observado. Esta estratificación segrega a los 261 pacientes con AML con datos de resultados disponibles en dos grupos de tamaño desigual, con el 72% de los pacientes con la expresión más baja considerados CD47 bajo, y el 28% con la expresión más alta considerados CD47 alto. Estos dos grupos tienen una supervivencia general diferente con un cociente de riesgos de 1,42 para el grupo de CD47 alto y un valor de p no corregido correspondiente de 0,033, que requiere una validación cruzada para evitar el riesgo de sobreajuste.

Por consiguiente, evaluamos la validez y solidez de la estratificación del riesgo mediante la expresión de CD47 aplicando este umbral óptimo a una cohorte de prueba independiente de 242 pacientes con NK-AML descrita por Metzeler et al. En particular, a pesar de la presencia de otras variables que podrían confundir las asociaciones con la supervivencia (incluyendo la edad más avanzada y las diferentes terapias), la derivación de un punto de corte óptimo usando los 242 pacientes con NK-AML dentro del conjunto de datos de prueba arrojó una estratificación similar, con el 74% de los pacientes con la expresión más baja considerados CD47 bajo, y el 26% con la expresión más alta considerados CD47 alto.

Luego, evaluamos la validez de esta estratificación en una cohorte de validación cruzada de 137 pacientes con NK-AML tratados uniformemente descritos por Bullinger et al. Dentro de este conjunto de datos de validación, pudimos definir de manera similar dos grupos de tamaño similar (es decir, 72% y 28% con niveles de CD47 más bajos y más altos, respectivamente), y estos dos grupos tuvieron resultados significativamente diferentes cuando se evaluó la supervivencia general (Figura 22B, p = 0,002, cociente de riesgos 2,02, IC del 95%: 1,37 a 4,03), y supervivencia libre de eventos (Figura 223A, p=0,004, cociente de riesgos 1,94, IC del 95%: 1,30 a 3,77). De los 137 pacientes, 5 no tenían mediciones fiables de CD47 al usar los criterios de selección y normalización de datos descritos por los autores.

Para determinar la solidez de esta asociación, también examinamos el valor predictivo de la expresión de CD47 cuando la cohorte de validación se dividió en grupos de expresión baja y alta de CD47 en base a la expresión relativa a la mediana o como una variable continua. Como antes, una expresión de CD47 más alta se asoció con una peor supervivencia general y libre de eventos. De los 137 pacientes estudiados, un subconjunto de 123 pacientes tenía datos de supervivencia disponibles, datos de expresión de CD47 y estado de FLT3-ITD informado. Dentro de esta cohorte, evaluamos la relación del nivel de expresión de CD47 como una variable continua con el resultado usando un análisis univariante de riesgos proporcionales de Cox, con la supervivencia libre de eventos o la supervivencia general como variable dependiente. Usamos un análisis de riesgos proporcionales de Cox multivariable con supervivencia libre de eventos o supervivencia general como variable dependiente y estado de FLT3-ITD, edad y nivel de expresión continua de CD47 como variables independientes evaluadas directamente.

Las asociaciones de CD47 con otras covariables (por ejemplo, NPM1, CEBPA) estaban limitadas por el tamaño de la muestra y la falta de datos para las covariables. Se usó la prueba de Wald para evaluar la significancia de cada covariable en los análisis multivariantes. Se realizaron análisis de riesgos proporcionales univariados y multivariados usando la función coxph en el paquete estadístico R.

Ejemplo 4

La expresión de CD47 aumenta en las células de NHL en comparación con las células B normales. Examinamos la expresión de la proteína CD47 en muestras primarias de NHL humano y células B normales mediante citometría de flujo. En comparación tanto con la sangre periférica normal como con las células B del centro germinal, CD47 se expresó más en un gran subconjunto de muestras primarias de pacientes de múltiples subtipos de NHL de células B (Figura 12A), incluyendo el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), la leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), el linfoma de células del manto (MCL), el linfoma folicular (FL), el linfoma de la zona marginal (MZL) y la leucemia linfoblástica aguda pre-B (pre-B ALL). En los subtipos de NHL, encontramos diferentes niveles de expresión de CD47 que también variaron dentro de cada subtipo de NHL (Figura 12B).

La expresión de CD47 aumentada se correlaciona con un peor pronóstico clínico y características moleculares adversas en múltiples subtipos de NHL. Habiendo demostrado anteriormente una correlación entre el ARNm de CD47 y la expresión de proteínas, evaluamos la expresión de ARNm de CD47 en los subtipos de NHL para asociaciones con subgrupos morfológicos y moleculares usando datos de expresión génica de cohortes de pacientes descritas anteriormente e investigamos las implicaciones del pronóstico de una expresión de CD47 aumentada en el resultado de la enfermedad. Una expresión más alta de CD47 se asoció con un pronóstico adverso en DLBCL, B-CLL y MCL (Figuras 12C-12E). En pacientes con LDCBG, tratados con o sin quimioterapia de combinación basada en rituximab (Figura 12C), una expresión de CD47 más alta se asoció significativamente con el riesgo de muerte. Este mayor riesgo se debió en gran medida a la progresión de la enfermedad, un descubrimiento validado en una cohorte independiente de pacientes usando RT-PCR cuantitativa en especímenes de archivo fijos.

A continuación, investigamos si la expresión de CD47 aumentada estaba asociada con características moleculares adversas conocidas en el NHL. En DLBCL, estudios previos habían identificado dos subgrupos distintos en base a la supuesta célula de origen de los tumores: células B normales del centro germinal (similares a GCB), que están asociadas con un resultado clínico favorable, o células B de memoria sanguínea activadas (similares a ABC), que se asocian con un mal resultado clínico. La expresión de CD47 fue significativamente más alta en DLBCL tipo ABC (Figura 12F). No se descubrió que la expresión de CD47 tuviera un valor pronóstico independiente dentro de los subtipos GCB y ABC, lo que sugiere una fuerte asociación con la clasificación de la célula de origen de DLBCL. La expresión de CD47 más alta también se asoció con regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina (IgVH) no mutadas en CLL (Figura 12G) y se correlacionó significativamente con el índice proliferativo en la MCL (Figura 12H), ambos factores pronósticos adversos conocidos. En análisis multivariados, la expresión de CD47 siguió siendo un pronóstico de progresión de la enfermedad independiente del índice pronóstico internacional en DLBCL y dos factores pronósticos principales en CLL: estado de mutación de IgVH y estado de ZAP-70. Dentro de la pequeña cohorte de MCL, un modelo multivariante no encontró un valor pronóstico independiente para CD47 al considerar el índice de proliferación.

El bloqueo de anticuerpos anti-CD47 permite la fagocitosis de células de NHL por macrófagos y sinergiza con rituximab in vitro. En primer lugar, probamos la capacidad de los anticuerpos anti-CD47 humanos para permitir la fagocitosis de líneas celulares humanas de NHL, células primarias de NHL y células de sangre periférica normales (NPB) por macrófagos humanos in vitro. La incubación de células de NHL en presencia de anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o IgG1 anti-CD45 no resultó en una fagocitosis significativa; sin embargo, dos anticuerpos bloqueantes anti-CD47 diferentes (B6H12.2 y BRIC126) permitieron la fagocitosis de las células de NHL pero no de las células NPB (Figuras 13A y 13B).

Luego, repetimos los ensayos de fagocitosis in vitro con macrófagos de ratón. La incubación de células de NHL en presencia de anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o de IgG1 anti-CD45 no resultó en una fagocitosis significativa; sin embargo, se observó fagocitosis de células de NHL con anticuerpos bloqueantes de CD47 (B6H12.2 y BRIC126), mientras que no se observó fagocitosis con un anticuerpo no bloqueante (2D3) (Figura 13B). La interrupción de la interacción de CD47-SIRPa con un anticuerpo anti-SIRPa de ratón también resultó en una fagocitosis significativa (Figura 13B).

Dada la expresión variable de CD47 en el NHL primario, investigamos mediante dos métodos independientes si los niveles de expresión de CD47 se correlacionaban con el grado de fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47. En primer lugar, se usaron vectores de ARNhc lentivirales para silenciar la expresión de CD47 en células Raji. Se generaron varios clones con un intervalo de silenciamiento de CD47. Aquellos clones con una reducción superior al 50% en la expresión de CD47 (shCD47-1 y shCD47-2) demostraron una reducción significativa en la fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47. En el segundo enfoque, un análisis estadístico demostró una correlación positiva entre la expresión de CD47 y el grado de fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47 con células efectoras de macrófagos humanos y de ratón.

Se ha informado que los anticuerpos inmovilizados o reticulados contra CD47 inducen la apoptosis de células B-CLL humanas primarias, así como varias líneas de células linfoides malignas. Por lo tanto, se podría predecir que los anticuerpos anti-CD47 inducirían directamente la apoptosis de las células del NHL que luego son reconocidas por los macrófagos y fagocitadas. Contrariamente a esta predicción, cuando se incubaron las células de NHL con anticuerpos anti-CD47 en ausencia de macrófagos, no se observó inducción de apoptosis cuando las células se incubaron en suspensión durante 2 horas (Figura 13B, derecha) o 8 h. La incubación de células de NHL con anticuerpo anti-CD47 inmovilizado dio como resultado un aumento de la apoptosis en comparación con los controles, consistente con los informes anteriores. Como la fagocitosis de las células del NHL se produce en presencia de mAbs anti-CD47 solubles, es poco probable que estos mAbs induzcan la apoptosis de las células de NHL que luego se fagocitan de manera secundaria.

A continuación, probamos la capacidad de un mAb anti-CD47 bloqueante para sinergizar con rituximab en la fagocitosis de las células de NHL. Examinamos la expresión de CD20 en células de NHL y no encontramos diferencias entre las células B normales y las células de NHL. La incubación de células de NHL con rituximab en presencia de macrófagos humanos o de ratón dio como resultado en una fagocitosis significativa (Figura 13D). Luego probamos la hipótesis de la sinergia mediante un análisis de isobolograma. Usando células Raji, SUDHL4 y NHL17, que expresan niveles variables tanto de CD47 como de CD20, el anticuerpo anti-CD47 sinergizó con rituximab o el anticuerpo anti-CD20 humano (IgG2a de ratón), como lo indican los índices de combinación inferiores a 1 (Figura 13C). En un segundo enfoque, los ensayos de fagocitosis in vitro se realizaron con células de NHL primarias incubadas con anticuerpo anti-CD47 o rituximab solo, o ambos en combinación a la mitad de la dosis del agente único. Las células de NHL mostraron un aumento significativo en la fagocitosis cuando se incubaron con la combinación en comparación con cualquiera de los anticuerpos solos cuando se usaron efectores de macrófagos de ratón (Figura 13D) o humanos (Figura 13E). No se observó fagocitosis de células NPB con anticuerpos solos o en combinación con macrófagos humanos (Figura 13E).

El recubrimiento ex vivo de células de NHL con un anticuerpo anti-CD47 inhibe el injerto tumoral. Luego, se exploró la capacidad de bloquear el anticuerpo anti-CD47 para eliminar el NHL in vivo o solo o en combinación con rituximab mediante dos estrategias de tratamiento separadas. En primer lugar, se probó el efecto del recubrimiento de anticuerpo anti-CD47 ex vivo sobre el injerto de células de NHL humanas. Las líneas celulares Raji y SUDHL4 que expresan luciferasa se prerrecubrieron ex vivo con anti-CD47, anticuerpo de control de isotipo de IgG1 o anti-CD45 y se trasplantaron por vía intravenosa a ratones SCID. El recubrimiento con anticuerpo anti-CD47 impidió el injerto de ambas líneas celulares (Figuras 14A-14F). El recubrimiento de células Raji con rituximab también inhibió el injerto cuando se trasplantaron a ratones SCID. Además de estas líneas celulares, identificamos un espécimen primario de un paciente con NHL que se injertó en ratones NSG en la médula ósea tras un trasplante intravenoso. Al igual que con las líneas celulares, el recubrimiento ex vivo de estas células primarias con anticuerpos anti-CD47, pero no los controles (Figura 14G), dio como resultado la inhibición completa del injerto de médula ósea (Figura 14H).

La terapia de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab elimina el linfoma en modelos de xenotrasplante de NHL humano tanto diseminado como localizado. En la segunda estrategia de tratamiento, los ratones se injertaron primero con NHL y luego se les administró una terapia de anticuerpos única o combinada. Para modelar mejor el NHL, establecimos modelos de xenotrasplante diseminados y localizados en ratones NSG que eran deficientes en células T, B y NK pero retenían células efectoras de fagocitos. En el modelo diseminado, las células Raji que expresan luciferasa se trasplantaron por vía intravenosa en ratones NSG adultos. Dos semanas después, a estos ratones se les administraron inyecciones diarias de IgG de ratón de control, anticuerpo anti-CD47, rituximab o anticuerpo anti-CD47 y rituximab. El tratamiento con anticuerpos anti-CD47 disminuyó la carga de linfoma en estos ratones (Figuras 15A y 15B) y una supervivencia significativamente prolongada en comparación con el control de IgG, aunque todos los ratones finalmente murieron (Figura 15C). Se observaron resultados similares con rituximab y no fueron estadísticamente diferentes en comparación con el anticuerpo anti-CD47 (Figuras 15A-15C). Por el contrario, la terapia de combinación con anticuerpos anti-CD47 y rituximab eliminó el linfoma en el 60% de los ratones, según lo indicado por la supervivencia a largo plazo (Figura 15C) y la ausencia de linfoma positivo para luciferasa más de 4 meses después de finalizar el tratamiento. En humanos, se cree que la eficacia de rituximab está mediada principalmente por macrófagos y células NK. Como los ratones NSG carecen de células NK, realizamos un experimento similar en ratones SCID que contenían células NK y observamos respuestas terapéuticas similares a las de los ratones NSG.

En el modelo de NHL localizado, se trasplantaron subcutáneamente células Raji que expresan luciferasa en el costado derecho de ratones NSG. Una vez que los tumores eran palpables (aproximadamente 2 semanas), los ratones se trataron con terapia de anticuerpos. Los ratones tratados con anticuerpo anti-CD47 o rituximab demostraron una tasa de crecimiento del linfoma disminuida en comparación con los ratones tratados con IgG de control, medido tanto por la señal de luciferasa como por el volumen tumoral (Figuras 15D-15F) pero, al igual que los controles, finalmente tuvieron que ser sacrificados debido al crecimiento tumoral agrandado. Por el contrario, los ratones tratados con la combinación de anticuerpo anti-CD47 y rituximab demostraron la eliminación completa del linfoma, y el 86% de los ratones tratados no tenían una masa medible o linfoma positivo para luciferasa 4 semanas después del final de la terapia (Figuras 15D-15F). Además, ninguno mostró evidencia de crecimiento tumoral, permanecieron libres de recaídas y estaban vivos más de 197 días después del injerto tumoral. De los seis ratones que lograron una remisión completa, cinco permanecieron libres de recaídas, mientras que un ratón murió por causas no relacionadas con el tumor (Figura 15E). Tanto para los modelos de xenoinjerto diseminados como para los localizados, la expresión de CD47 y CD20 en células Raji trasplantadas no difirió de las células Raji en cultivo.

La terapia de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab elimina el linfoma en modelos de ratón con xenotrasplante de NHL humano primario. Las líneas celulares de NHL han sido valiosas para la evaluación de agentes terapéuticos, pero es posible que no recapitulen con precisión la heterogeneidad de la enfermedad primaria. Presentamos aquí dos nuevos modelos de xenoinjerto de ratón para NHL en los que el trasplante intravenoso de células de un paciente con DLBCL (NHL7/SUNHL7) y un paciente con FL (NHL31/SUNHL31) dan lugar a un injerto de linfoma robusto en la médula ósea y/o la sangre periférica. Las células de DLBCL primarias se trasplantaron a ratones, que 2 semanas después se trataron con inyecciones diarias de anticuerpos durante 14 días. El tratamiento con anticuerpos anti-CD47 solos o en combinación con rituximab eliminó el linfoma humano en la médula ósea, mientras que el tratamiento con rituximab dio como resultado una reducción de la enfermedad en el 60% de los ratones (Figuras 16A y 16B). Las células hematopoyéticas de ratón no se vieron afectadas por la terapia con anticuerpos. A continuación, se interrumpió el tratamiento y se monitorizó la supervivencia de todos los ratones. Los ratones tratados o con anticuerpos anti-CD47 o con rituximab solo tuvieron una supervivencia significativamente mayor en comparación con los ratones tratados con IgG de control, pero finalmente todos murieron como consecuencia de la enfermedad debido a la diseminación generalizada de órganos en la autopsia (Figura 15C). Más significativamente, 8 de 9 ratones (el 89%) a los que se les administró un tratamiento de combinación de anticuerpos se curaron del linfoma, como lo indica la supervivencia libre de enfermedad a largo plazo más de 4 meses después del final del tratamiento (Figura 16C) sin linfoma detectable en la médula ósea. En un segundo modelo primario, las células FL se trasplantaron por vía intravenosa de manera similar. Se detectó injerto de linfoma CD20+CD10+ en sangre periférica y médula ósea después de 8 semanas. En ese momento, los ratones se trataron con una única inyección intraperitoneal de IgG de control, anticuerpo anti-CD47, rituximab o la combinación y luego se les hizo un seguimiento de la progresión de la enfermedad. Una dosis única de anticuerpo anti-CD47 solo o en combinación con rituximab eliminó el linfoma tanto en la sangre periférica (Figura 16D) como en la médula ósea (Figura 16E). Por el contrario, una dosis única de rituximab permitió una reducción parcial de la carga tumoral que se recuperó a los niveles de referencia en la sangre periférica sin que se observara una reducción tumoral en la médula ósea. La diferencia en la depuración de anticuerpos anti-CD47 del linfoma como una dosis única en ratones injertados con FL (Figuras 16D y 16E) en comparación con la terapia de múltiples dosis en ratones injertados con DLBCL (Figura 16B) o Raji (Figura 15) puede deberse a diferencias intrínsecas de las células en la sensibilidad a los anticuerpos entre diferentes subtipos de NHL o debido a diferentes potencias de los anticuerpos anti-CD47 en distintos compartimentos tisulares (sangre periférica frente a médula ósea (BM) frente a compartimientos de tejidos blandos). Para evaluar la capacidad de estos dos modelos de xenotrasplante de NHL primario para modelar la enfermedad, comparamos secciones histológicas del espécimen de NHL primario y el tumor trasplantado. Se observó una morfología similar de DLBCL y FL para NHL7 y NHL31, respectivamente. Luego, determinamos si los porcentajes de macrófagos que se infiltran en el tumor diferían entre el paciente primario y el tumor xenoinjertado. Para NHL31, el porcentaje de macrófagos humanos infiltrantes (CD68+) en el ganglio linfático primario fue similar al porcentaje de macrófagos de ratón infiltrantes (F4/80+) en la médula ósea de ratones trasplantados. Al analizar la frecuencia de macrófagos infiltrantes mediante citometría de flujo, no se observaron diferencias entre el espécimen primario y el xenoinjerto para NHL7 o NHL31.

La sinergia entre el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab no se produce a través de las células NK o del complemento. EL rituximab puede eliminar las células malignas mediante apoptosis, ADCC mediada por células NK y CDC. Sin embargo, no se sabe si el anticuerpo anti-CD47 también permite la ADCC o la CDC además de la fagocitosis. Por lo tanto, investigamos si el anticuerpo anti-CD47 por sí solo podría inducir efectos antitumorales mediante mecanismos independientes de los macrófagos y si pudiera producirse una sinergia con rituximab a través de estas modalidades. En primer lugar, para investigar la posible sinergia en la apoptosis directa, se incubaron células de NHL con anticuerpo anti-CD47/rituximab solo o en combinación sin macrófagos, y se midió la muerte celular. No se observó apoptosis sinérgica cuando las células de NHL se incubaron con anticuerpos solubles (Figura 17A) o inmovilizados. Además, la reticulación del anticuerpo anti-CD47 soluble solo o en combinación con rituximab por los macrófagos no indujo un aumento de la apoptosis de las células de NHL no fagocitadas en comparación con el control de isotipo de IgG1, mientras que el rituximab indujo un ligero aumento de la apoptosis. No se observó apoptosis sinérgica en este contexto. El pequeño aumento de la apoptosis tras el tratamiento con anticuerpos no dependía de FcR dado que los resultados fueron similares con los macrófagos que carecían de la subunidad Fcg.

En segundo lugar, investigamos si las células NK podrían mediar en la eliminación del tumor mediante el anticuerpo anti-CD47 solo o en sinergia con rituximab. Primero determinamos si las células NK humanas o de ratón expresaban SIRPa y descubrimos que tanto las células NK humanas, CD3-CD56+CD7+, como las células NK de ratón, CD3-DX5+, expresaban una cantidad mínima o nula de SIRPa (Figura 17B). Luego, se investigó la capacidad del anticuerpo anti-CD47 para inducir ADCC mediada por células NK a través de FcR o mediante el bloqueo de CD47-SIRPa. Utilizando células NK humanas como efectores, el anticuerpo anti-CD47 no indujo un aumento de ADCC de células Raji o SUDHL4 en comparación con el control de isotipo de IgG1 (Figura 17C). Aunque el rituximab permitió la ADCC de estas dos líneas celulares de NHL, no se observó ningún efecto sinérgico entre el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab (p = 0,77, Figura 17C). Como el anticuerpo anti-CD47 (B6H12.2) es un isotipo de IgG1 de ratón, repetimos estos ensayos con células NK de ratón. El anticuerpo anti-CD47 provocó un aumento de la ADCC de estas dos líneas celulares de NHL en comparación con el control de isotipo, mientras que el rituximab indujo la ADCC en menor medida (Figura 17D). Para probar si la ADCC mediada por anticuerpos anti-CD47 era dependiente de Fc, generamos un fragmento F(ab^')2 del anticuerpo anti-CD47. El fragmento F(ab^')2 no permitió la ADCC, lo que indica que el aumento de la ADCC probablemente estuvo mediado por los FcR (Figura 17D). La combinación de anticuerpo anti-CD47 o fragmento F(ab^')2 con rituximab no indujo un aumento estadísticamente significativo en la ADCC en comparación con la terapia con un único agente, lo que indica que no hubo efecto sinérgico.

En tercer lugar, investigamos el papel del complemento en la citotoxicidad mediada por anticuerpos anti-CD47. Usando cualquier complemento humano (Figura 17E) o de ratón (Figura 17F), el anticuerpo anti-CD47 no indujo CDC de una línea celular de NHL ni de una muestra primaria de NHL, mientras que el rituximab indujo una CDC significativa contra ambas muestras. Además, la combinación de anticuerpos anti-CD47 y rituximab no indujo un aumento de CDC en comparación con rituximab solo.

En cuarto lugar, investigamos la contribución relativa de los componentes principales de los macrófagos, las células NK y el complemento en la mediación de los efectos terapéuticos del anticuerpo anti-CD47 y el rituximab in vivo. Se injertaron células Raji marcadas con luciferasa por vía intravenosa en ratones SCID, que tienen macrófagos funcionales, células NK y complemento. Luego, los ratones se separaron en cohortes que recibieron depleción selectiva de macrófagos por clodronato, células NK por anticuerpo anti-asialoGM1, complemento por factor de veneno de cobra o un vehículo de control. Luego, estas cohortes se trataron con una combinación de anticuerpo anti-CD47 y rituximab durante 3 días, y se midió la carga tumoral mediante imagenología bioluminiscente antes y después del tratamiento. En comparación con el control del vehículo, el agotamiento de las células NK y del complemento no tuvo ningún efecto sobre la eliminación del tumor mediante la terapia de combinación de anticuerpos. Por el contrario, el agotamiento de los macrófagos anuló significativamente el efecto terapéutico, lo que indica que los macrófagos, y no las células NK o el complemento, son necesarios para la eliminación del LNH mediada por la combinación del anticuerpo anti-CD47 y de rituximab in vivo.

El anticuerpo anti-CD47 sinergiza con rituximab a través de mecanismos independientes y dependientes de FcR. Planteamos la hipótesis de que la sinergia observada entre un anticuerpo anti-CD47 y el rituximab se produce a través de la combinación de dos mecanismos separados para estimular la fagocitosis: (1) independiente de FcR a través del bloqueo de una señal fagocítica inhibidora por el anticuerpo anti-CD47, y (2) dependiente de FcR a través del envío de una señal fagocítica positiva por el rituximab. Utilizamos cuatro métodos independientes para investigar esta hipótesis. En primer lugar, se observó fagocitosis sinérgica con la combinación de anticuerpos anti-SIRPa y rituximab mediante análisis de isobolograma (Figura 18A), y con un gran panel de muestras primarias de NHL (Figura 18B). En segundo lugar, se utilizaron los macrófagos de ratón que carecen del receptor Fcy, por lo tanto incapaces de permitir la fagocitosis dependiente de FcR, pero que aún expresan SIRPa, como células efectoras para la fagocitosis de células de NHL incubadas con anticuerpos anti-CD47, anticuerpos anti-SIRPa, rituximab o anticuerpo anti-CD47/anti-SIRPa en combinación con rituximab. Como se predijo, el anticuerpo anti-CD47 y el anticuerpo anti-SIRPa, pero no el rituximab, permitieron la fagocitosis de las células del NHL, sin evidencia de fagocitosis sinérgica (Figura 18C).

En tercer lugar, se generaron y utilizaron fragmentos F(ab^')2 tanto del anticuerpo anti-CD47 como del rituximab en ensayos de fagocitosis con células de NHL y macrófagos de tipo salvaje. El anticuerpo F(ab^')2 anti-CD47 sinergizó con rel ituximab como lo demuestra el análisis de isobolograma (Figura 18D). Además, el F(ab^')2 anti-CD47, pero no el F(ab^')2 de rituximab, permitió la fagocitosis de células de NHL (Figura 18E). De acuerdo con el mecanismo propuesto, se observó fagocitosis sinérgica con la combinación de anti-CD47 de longitud completa o F(ab^')2 anti-CD47 con rituximab completo, pero no con ninguna combinación que implique F(ab^')2 rituximab (Figura 18E).

En cuarto lugar, se investigó la fagocitosis sinérgica in vivo usando células Raji GFP+ injertadas en ratones NSG. Como agentes individuales, el anticuerpo anti-CD47 y el rituximab permitieron la fagocitosis de las células Raji injertadas en el hígado, como lo demuestra un mayor porcentaje de macrófagos de ratón que contienen células GFP+ Raji fagocitadas (Figura 18F). Lo más significativo es que el tratamiento de combinación con anticuerpo anti-CD47 y rituximab permitió una fagocitosis significativamente aumentada en comparación con cualquier agente individual, lo que demuestra que se produjo fagocitosis sinérgica in vivo (Figura 18F).

En este informe, identificamos un mecanismo distinto de sinergia entre mAbs en la terapia contra el cáncer que lleva a curas en ausencia de quimioterapia. Específicamente, utilizamos un anticuerpo anti-CD47 bloqueante en combinación con el anticuerpo anti-CD20 rituximab para erradicar el NHL humano a través de un mecanismo de sinergia que implica la habilitación de la fagocitosis independiente de FcR por el anticuerpo anti-CD47 y la estimulación de la fagocitosis dependiente de FcR por el rituximab. Además, la identificación de la expresión de CD47 como factor de pronóstico puede incorporarse a las consideraciones de pronóstico clínico estándar en múltiples subtipos de NHL y es útil en la toma de decisiones de terapia adaptada al riesgo. Aunque se piensa que muchos mAbs terapéuticos para enfermedades malignas humanas, incluyendo el rituximab, funcionan principalmente a través de ADCC mediada por células NK, varias líneas de evidencia indican que el efecto terapéutico del anticuerpo anti-CD47 solo o en combinación con rituximab está mediado principalmente a través de la fagocitosis de macrófagos. En primer lugar, se observó fagocitosis de macrófagos sinérgica con la combinación de anticuerpos anti-CD47 y rituximab in vitro, mientras que no se observó sinergia para la apoptosis directa, ADCC o CDC. En segundo lugar, se observó fagocitosis de células de NHL in vivo o con el anticuerpo anti-CD47 o con el rituximab solos y, lo que es más importante, aumentó significativamente con la terapia de combinación. En tercer lugar, el efecto terapéutico del tratamiento de combinación con anticuerpos fue similar en un modelo de xenotrasplante de NHL usando ratones NSG deficientes en complemento y células NK como en ratones SCID competentes en complemento y células NK, lo que sugiere que los macrófagos solos son suficientes para mediar el efecto terapéutico. En cuarto lugar, el agotamiento de los macrófagos, pero no del complemento o de las células NK, anuló el efecto sinérgico del anticuerpo anti-CD47 en combinación con rituximab. Estos estudios destacan la importancia de los macrófagos como efectores de la terapia con anticuerpos anti-CD47 en el NHL humano.

Este estudio describe un mecanismo de sinergia de anticuerpos en la eliminación de NHL en ausencia de quimioterapia. Las terapias de combinación de anticuerpos para el NHL se han investigado con anterioridad, principalmente en combinación con rituximab, y algunas progresaron a ensayos clínicos. Estos incluyen un anticuerpo humanizado dirigido al antígeno de células B CD22 (epratuzumab) y galiximab, un anticuerpo quimérico dirigido al ligando coestimulador CD80. Los estudios de fase I/II con epratuzumab o galiximab en combinación con rituximab demuestran una seguridad relativa y respuestas clínicas iguales o mayores que la terapia con un único agente solamente. En base a estos resultados, están en progreso ensayos de fase III. También se están explorando de manera preclínica las combinaciones de anticuerpos que implican anticuerpos anti-CD20 y anticuerpos contra receptores proapoptóticos. Estos estudios destacan el potencial clínico de los enfoques de combinación de anticuerpos en pacientes con NHL. La terapia de combinación con dos o más mAbs posee varias ventajas en comparación con las monoterapias en NHL u otras enfermedades malignas. En primer lugar, la terapia únicamente con anticuerpos monoclonales dirigidos a antígenos específicos del cáncer podría dar como resultado una toxicidad fuera del objetivo disminuida en comparación con los regímenes terapéuticos actuales que utilizan quimioterapia. En segundo lugar, la sinergia entre dos mecanismos efectores de anticuerpos distintos, independiente de FcR y dependiente de FcR, como se muestra aquí, daría como resultado una mayor eficacia terapéutica. En tercer lugar, es más probable que los anticuerpos dirigidos a dos antígenos de la superficie celular distintos eliminen las células cancerosas con variantes de epítopos preexistentes o pérdida de epítopos, como los informados en pacientes con NHL refractario/resistente a rituximab. En cuarto lugar, un anticuerpo biespecífico que se acopla a FcR con un brazo que se une y bloquea el CD47 y el otro se une a un objetivo de anticuerpo contra el cáncer validado (CD20) podría reducir la potencial toxicidad del anticuerpo, a la vez que conserva el efecto sinérgico, especialmente porque el CD47 se expresa en múltiples tipos de tejido normal.

Además de su aplicación en NHL, el mecanismo informado de sinergia de anticuerpos proporciona una prueba de principio de que un mAb bloqueante dirigido contra CD47 puede crear sinergia con un anticuerpo de activación de FcR para proporcionar una eficacia terapéutica superior. Este descubrimiento plantea la posibilidad de sinergia entre un anticuerpo anti-CD47 y otros anticuerpos terapéuticos clínicamente aprobados que activan FcR en células efectoras inmunitarias para el tratamiento de diversas enfermedades malignas humanas, incluyendo trastuzumab (Herceptin) para carcinomas de mama HER2 positivos, cetuximab (Erbitux) para carcinomas colorrectales y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, alemtuzumab (Campath) para CLL y linfoma de células T, y otros en desarrollo.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Líneas celulares. Se obtuvieron una línea celular de linfoma de Burkitt (Raji) y una línea celular de DLBCL (SUDHL4) de la American Type Culture Collection o se generaron en el laboratorio. La línea celular de NHL17* se generó a partir de un paciente con LDCBG cultivando células a granel in vitro con IMDM suplementado con suero AB humano al 10% durante 1,5 meses.

Muestras humanas. Se obtuvieron muestras de sangre periférica humana normal y de NHL humano del Centro Médico de la Universidad de Stanford (Stanford, California, USA) con consentimiento informado, de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB o con consentimiento informado del ^Norwegian Radium Hospital (Oslo, Noruega) de acuerdo con a un protocolo aprobado por el Comité Regional de Ética (REK). Las amígdalas normales para el análisis de células B del centro germinal se obtuvieron de especímenes de amigdalectomía desechadas de pacientes pediátricos autorizados en el Centro Médico de la Universidad de Stanford de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB.

Análisis de citometría de flujo. Para el análisis de células sanguíneas periféricas normales, células B del centro germinal y células de NHL primarias, se usaron los siguientes anticuerpos: CD19, CD20, CD3, CD10, CD45, CD5, CD38 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA y BD Biosciences, San José, CA, USA). El análisis de la expresión de CD47 se realizó con un anticuerpo FITC anti-CD47 humano (clon B6H12.2, BD Biosciences). El análisis de tinción celular y citometría de flujo se realizó como se ha descrito anteriormente.

Evaluación del valor pronóstico de CD47 en NHL. Se analizaron la expresión génica y los datos clínicos de ocho cohortes de pacientes adultos con NHL descritas anteriormente, incluyendo cuatro estudios de pacientes con DLBCL, tres con B-CLL y uno con MCL. Los criterios de valoración clínicos analizados incluyeron supervivencia general (OS), libre de progresión (PFS) y libre de eventos (EFS), con eventos definidos como el intervalo entre la inscripción en el estudio y la necesidad de terapia o muerte por cualquier causa, con datos censurados para pacientes que no tuvieron un evento en la última visita de seguimiento.

Anticuerpos Terapéuticos. El rituximab (anti-CD20, IgG1 humana) se obtuvo del Centro Médico de la Universidad de Stanford, el anti-CD20 humano de ratón, IgG2a de Beckman Coulter (Miami, FL., USA) y el anticuerpo anti-CD47 BRIC126, IgG2b de AbD Serotec (Raleigh, NC, USA). Se usaron otros anticuerpos anti-CD47 como en Majeti et al. (2009). Todos los experimentos de anticuerpos in vivo se realizaron usando el anticuerpo anti-CD47 B6H12.2.

Estudios de isobolograma in vitro. Los ensayos de fagocitosis in vitro se realizaron con células de NHL incubadas con anticuerpo anti-CD47 (B6H12.2), IgG2a anti-CD20 o rituximab solos o en combinación a concentraciones de 1 gg/ml a 10 gg/ml. Se determinó la concentración de cada anticuerpo requerida para producir un efecto de agente individual definido (índice fagocítico) para cada tipo de célula. Las concentraciones de los dos anticuerpos combinados para lograr este mismo índice fagocítico se trazaron luego en un isobolograma y se determinó el índice de combinación (CI). El CI se calculó a partir de la fórmula CI = (d1/D1) (d2/D2), donde d1 = dosis del fármaco 1 en combinación para lograr el índice fagocítico, d2 = dosis del fármaco 2 en combinación para lograr el índice fagocítico, D1 = dosis del fármaco 1 solo para lograr el índice fagocítico, D2 = dosis del fármaco 2 solo para lograr el índice fagocítico. Un CI de menor que, igual a, mayor que 1 indica sinergia, aditividad, y antagonismo, respectivamente.

Ensayo de injerto de prerrecubrimiento in vivo. Los ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente (Majeti et al., 2009). Las células prerrecubiertas se trasplantaron por vía intravenosa en ratones SCID o se irradiaron subletalmente (200 rads) NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales para animales de la Universidad de Stanford.

Tratamiento con anticuerpos in vivo en un modelo de xenoinjerto de linfoma diseminado. Se inyectaron por vía intravenosa 1,5 x 106 células Raji marcadas con luciferasa en el seno retroorbital de ratones SCID o NSG de 6 a 10 semanas de edad. Los ratones con linfoma positivo para luciferasa recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de 200 gg de control de IgG de ratón, anticuerpo anti-CD47, rituximab o 200 gg de anticuerpo anti-CD47 200 gg de rituximab durante 3 semanas. Luego, se detuvo el tratamiento con anticuerpos y se hizo un seguimiento de los ratones para el análisis de supervivencia. Una remisión completa (RC) se definió como ninguna evidencia de linfoma por bioluminiscencia al final del tratamiento. Una recaída se definió como evidencia de linfoma por bioluminiscencia después del final del tratamiento en un ratón con CR previa.

Tratamiento con anticuerpos in vivo en un modelo de xenoinjerto de linfoma localizado. Se inyectaron subcutáneamente 3 x 106 células Raji marcadas con luciferasa en el costado derecho de ratones NSG de 6 a 10 semanas de edad. Los ratones con linfoma positivo para luciferasa recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de 400 gg de control de IgG de ratón, 400 gg de anti-CD47, 200 gg de rituximab o 400 gg de anti-CD47 200 gg de rituximab durante 4 semanas. El volumen del tumor se midió cada 3-4 días usando la fórmula (longitud x anchura)/2. Luego, se detuvo el tratamiento con anticuerpos y se hizo un seguimiento de los ratones para el análisis de supervivencia.

Tratamiento con anticuerpos in vivo de ratones con injertos primarios de NHL. Se trasplantaron 2 x 106 células de NHL por vía intravenosa a través del plexo retroorbitario en ratones NSG irradiados subletalmente. De dos a diez semanas más tarde, se aspiró la médula ósea de estos ratones y los ratones con evidencia de injerto de linfoma humano (células de médula ósea hCD45+CD19/CD10+) se trataron con el mismo régimen de anticuerpos que en el modelo de linfoma diseminado. Después de 14 días, se aspiraron las células de la médula ósea de estos ratones y se detuvo el tratamiento con anticuerpos y se hizo un seguimiento de los ratones para el análisis de supervivencia. Una CR se definió como ausencia de evidencia de linfoma en la BM al final del tratamiento. Una recaída se definió como evidencia de linfoma en la BM después del final del tratamiento en un ratón con CR previa.

Fagocitosis in vivo. La fagocitosis in vivo se realizó como se ha descrito con anterioridad (Majeti et al., 2009) analizando ratones trasplantados con células GFP+ Raji en ratones NSG adultos. A los ratones se les administró una única dosis de anticuerpo y se analizaron 4 h más tarde para determinar la fagocitosis in vivo.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Una com binación sinérgica de agentes para su uso en el tra tam iento de un cáncer hem atológico en un paciente, en donde el cáncer hem atológico es linfom a no Hodgkin (NHL) y en donde el NHL es un linfom a de célu las B grandes difuso, en donde la com binación de agentes com prende un prim er agente que bloquea selectivam ente CD47 y un segundo agente que se une a CD20,

en donde el p rim er y el segundo agente están com prendidos en un anticuerpo de acoplam iento a FcR biespecífico para CD47 y para CD20.