ES2964512T3 - Carga remota de fármacos escasamente solubles en agua en liposomas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones de liposomas que contienen fármacos escasamente solubles que se usan para tratar enfermedades potencialmente mortales. Un método preferido para encapsular un fármaco dentro de un liposoma es mediante carga remota o activa. La carga remota de un fármaco en liposomas que contienen un gradiente electroquímico transmembrana se inicia mezclando conjuntamente una suspensión de liposomas con una solución de fármaco, mediante lo cual la forma neutra del compuesto entra libremente en el liposoma y se carga electrostáticamente, evitando así la transferencia inversa fuera del liposoma. liposoma. Hay una acumulación continua de compuesto dentro del interior del liposoma hasta que se disipa el gradiente electroquímico o todo el fármaco se encapsula en el liposoma. Sin embargo, este proceso como se describe en la literatura se ha limitado a fármacos que son libremente solubles en solución acuosa o solubilizados como un complejo soluble en agua. Esta invención describe composiciones y métodos para cargar de forma remota fármacos con baja solubilidad en agua (< 2 mg/ml). En la realización preferida, el fármaco en el agente solubilizante se mezcla con los liposomas en suspensión acuosa de modo que la concentración del agente solubilizante se reduce por debajo de su capacidad para solubilizar completamente el fármaco. Esto da como resultado que el fármaco precipite pero se conserva la capacidad de carga remota. El proceso es escalable y, en liposomas en los que la composición de lípidos y el agente de carga remota están optimizados, los liposomas cargados de fármaco resultantes se caracterizan por altas proporciones de fármaco a lípido y una retención prolongada del fármaco cuando el fármaco encapsulado en liposomas se administra a un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Carga remota de fármacos escasamente solubles en agua en liposomas

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a los campos de las composiciones farmacéuticas, a los métodos para prepararlas y a los usos de las composiciones resultantes en terapia farmacológica. Las composiciones farmacéuticas incluyen el agente terapéutico activo encapsulado dentro del interior acuoso de una vesícula liposómica.

Descripción de la técnica relacionada

La industria farmacéutica, en su búsqueda de fármacos mejorados, ha generado una gran cantidad de compuestos potentes que son escasamente solubles en agua, el disolvente universal que hace posible la vida. La baja solubilidad en agua de estos nuevos fármacos ha dificultado su administración en animales, incluidos los humanos. Esto ha creado la necesidad de sistemas de administración de fármacos que puedan solubilizar fármacos escasamente solubles en agua para permitir su administración en el cuerpo.

Los liposomas son estructuras vesiculares compuestas normalmente por una membrana bicapa de moléculas anfipáticas, tales como los fosfolípidos, que atrapan un núcleo acuoso. Los diámetros y la morfología de diversos tipos de liposomas se ilustran en la figura 1. Los fármacos están ya sea encapsulados en el núcleo acuoso o interdigitados en la membrana bicapa. Los fármacos interdigitados en la membrana salen del liposoma cuando se diluyen en el cuerpo. Es importante destacar que los fármacos que están encapsulados en el núcleo acuoso o mantenidos en complejos en el núcleo acuoso se retienen sustancialmente más tiempo que los fármacos en la bicapa. El uso de liposomas con fármacos encapsulados en el núcleo acuoso para la administración de fármacos está bien establecido (D. Drummond et al., J. Pharm. Sci., (2008) 97(11):4696-4740, PMID 10581328).

Está disponible una variedad de métodos de carga para encapsular compuestos funcionales, particularmente fármacos, en liposomas. Los compuestos hidrofílicos, por ejemplo, se pueden encapsular en liposomas hidratando una mezcla de compuestos funcionales y lípidos formadores de vesículas. Esta técnica se llama carga pasiva. El compuesto funcional se encapsula en el liposoma a medida que se forma la nanopartícula. Los procedimientos de producción de vesículas lipídicas (liposomas) disponibles son satisfactorios para la mayoría de las aplicaciones en las que se encapsulan fármacos solubles en agua (G. Gregoriadis, Ed., Liposome Technology, (2006) Liposome Preparation and Related Techniques, 3rd Ed.). Sin embargo, la fabricación de vesículas lipídicas que encapsulan fármacos que no son solubles en agua (por ejemplo, con una solubilidad en agua menor que 2 mg/mL) en el compartimento interno acuoso del liposoma es extremadamente difícil (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80, PMID 19508880).

La carga pasiva de compuestos funcionales lipofílicos y, en menor medida, anfifílicos es algo más eficiente que los compuestos funcionales hidrofílicos porque se dividen tanto en la bicapa lipídica como en el medio acuoso intraliposomal (interno). Sin embargo, al usar carga pasiva, la proporción final entre compuesto funcional y lípido, así como la eficiencia de encapsulación, son generalmente bajas. La concentración de fármaco en el liposoma es igual a la del fluido circundante y el fármaco que no queda atrapado en el medio acuoso interno se elimina por lavado después de la encapsulación. Además, los fármacos cargados en la bicapa se liberan del liposoma muy rápidamente cuando el liposoma se inyecta en un sujeto. Para una liberación sostenida del fármaco en un paciente, es preferible que el fármaco esté encapsulado dentro del interior del liposoma.

Determinados compuestos hidrofílicos o anfifílicos se pueden cargar en liposomas preformados usando gradientes de pH o iones transmembrana (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80). Esta técnica se llama carga activa o remota. Los compuestos susceptibles de carga activa deberían poder cambiar de una forma no cargada, que puede difundirse a través de la membrana liposomal, a una forma cargada que no es capaz de hacerlo. Por lo general, el compuesto funcional se carga agregándolo a una suspensión de liposomas preparada para tener un gradiente de iones o pH interior más bajo/exterior más alto. Mediante la carga activa, se puede lograr una alta proporción de masa de compuesto funcional a lípido y una alta eficiencia de carga (hasta el 100 %). Algunos ejemplos son la carga activa de fármacos contra el cáncer doxorrubicina, daunorrubicina y vincristina (P.R. Cullis et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1997) 1331:187-211, y las referencias en este).

Los fármacos hidrofóbicos solo se consideran capaces de cargarse en liposomas a través de la intercalación de membranas mediante algún mecanismo de carga/ensamblaje pasivo. Wasan et al. afrima "Agents that have hydrophobic attributes can intercalate into the lipid bilayer and this can be achieved by adding the agent to the preformed liposomes" en una descripción del uso de micelas para transferir agentes escasamente solubles a una bicapa de liposoma (Estados Unidos 2009/0028931).

La carga remota de un fármaco escasamente soluble en un liposoma en condiciones en las que el fármaco está por encima de su límite de solubilidad y está en forma de precipitado es un evento inesperado. D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80 afirma: "Hydrophobic molecules may aggregate, and these aggregates have low permeability across the liposomal membrane. Thus, when the non-polar/polar surface area ratio is >2.31 (véase la figura 4 en Zucker et al. Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80), it is necessary that the drug would have a reasonable solubility, >1.9 mM, in order to achieve high loading because only soluble uncharged molecules can enter the liposome." (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139:73-80).

Hasta la fecha no se ha desarrollado ningún método para cargar activamente el núcleo acuoso de un liposoma con un agente poco soluble en agua a partir de un precipitado.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra los diámetros y la morfología de diversos tipos de liposomas.

La figura 2. Se incubaron formulaciones de liposomas compuestas de HSPC/Chol/Peg-DSPE que contenían sulfato de sodio (tono claro) o sulfato de amonio (tono oscuro) con carfilzomib en dos proporciones de fármaco a lípido de entrada usando las condiciones que se describen a continuación. Los liposomas se purificaron a partir del fármaco no encapsulado y se muestra la cantidad de carfilzomib encapsulado dentro de los liposomas, expresada como |jg de carfilzomib por jm ol de lípido.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra el efecto del agente atrapador sobre la carga de liposomas de carfilzomib.

La figura 4 es un gráfico de barras que muestra un método de efecto de la introducción del fármaco sobre la carga de liposomas de carfilzomib.

La figura 5 es un gráfico de líneas que muestra la carga de carfilzomib a partir del precipitado demostrada por la reducción de la dispersión de la luz a 600 nm.

La figura 6 es un cromatograma HPLC de carfilzomib antes de cargarlo en liposomas (superior) y después de cargarlo en liposomas a partir de un precipitado y luego liberarse de los liposomas usando un gradiente inverso de sulfato de amonio donde se convierte nuevamente en un precipitado en la solución extraliposomal (inferior).

La figura 7 es un gráfico de líneas que muestra la eficiencia de encapsulación de liposomas en función de [DMSO]. La proporción fármaco-lípido de entrada fue de 200 jg /jm o l.

La figura 8 es un gráfico lineal que muestra la dispersión de la luz de la solución de carfilzomib en función de la concentración de DMSO. La concentración de carfilzomib fue de 0.2 mg/mL.

La figura 9 es un gráfico de barras que muestra el efecto del tiempo de retraso entre la formación del precipitado del fármaco y la carga del precipitado en liposomas.

La figura 10 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de la concentración del agente atrapador de sulfato de amonio sobre la carga útil del fármaco liposómico de carfilzomib cargado a partir de un precipitado.

La figura 11 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de la concentración del agente atrapador de sulfato de amonio sobre la eficiencia de carga de liposomas de carfilzomib a partir del precipitado.

La figura 12 es un gráfico de líneas que carga el precipitado de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio.

La figura 13 es un gráfico de líneas que muestra la transferencia del precipitado de carfilzomib insoluble a liposomas mediante carga remota.

La figura 14 es un gráfico de barras que muestra la comparación de la carga de liposomas de aripiprazol cuando se mezcla con liposomas como un complejo SBCD (Abilify) o cuando se diluye de una solución madre de DMSO directamente en liposomas, creando una suspensión de fármaco.

La figura 15 es un gráfico de barras que muestra la absorbancia a 600 nm (dispersión) de soluciones de fármacos (barras oscuras) y mezclas de fármacos liposómicos (barras grises). El rectángulo indica las muestras en las que se midió una disminución sustancial en la dispersión tras la incubación con liposomas que indican la carga del fármaco. La figura 16 es un gráfico de barras que muestra la eficiencia de carga de DFX en liposomas de acetato de calcio. La figura 17 es un gráfico que muestra la capacidad de carga de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio como agente atrapador.

La figura 18 es un gráfico que muestra la capacidad de carga de DFX en liposomas que contienen diferentes agentes atrapantes de acetato.

Sumario de la invención

Al usar liposomas para la administración de compuestos funcionales, generalmente es deseable cargar los liposomas a una alta concentración, lo que da como resultado una alta proporción de masa de compuesto funcional-lípido, ya que esto reduce la cantidad de liposomas que se deben administrar por tratamiento para lograr el efecto terapéutico requerido, tanto más cuanto que diversos lípidos usados en liposomas tienen por sí mismos una toxicidad que limita la dosis. El porcentaje de carga también es importante para la rentabilidad, ya que una carga deficiente conduce a una gran pérdida del compuesto activo.

La invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro de un liposoma, dicha formulación fabricada mediante un método que comprende:

cargar remotamente un precipitado de un agente activo sólido a través de membranas liposomales de liposomas, en un medio acuoso interno de los liposomas, a partir de una suspensión acuosa que comprende el precipitado del agente activo sólido y los liposomas, teniendo el agente activo sólido una solubilidad en agua menor que 2 mg/mL, comprendiendo el método:

(a) preparar una suspensión acuosa de los liposomas que tienen un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma;

(b) preparar un precipitado del agente activo sólido: y

(c) formar una suspensión de carga de (a) y (b), e incubar la suspensión de carga, cargando así remotamente el precipitado del agente activo sólido a través de la membrana liposomal en el medio acuoso interno de los liposomas mediante un gradiente de protones o iones transmembrana, formando una suspensión de liposomas de producto que encapsulan el precipitado del agente sólido. La invención también proporciona

Un método para cargar de forma remota un liposoma con un agente que es escasamente soluble en agua, en el que el método comprende:

(a) preparar una suspensión acuosa de los liposomas que tienen un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma;

(b) preparar un precipitado del agente activo sólido: y

(c) formar una suspensión de carga de (a) y (b), e incubar la suspensión de carga, cargando así remotamente el precipitado del agente activo sólido a través de la membrana liposomal en el medio acuoso interno de los liposomas mediante un gradiente de protones o iones transmembrana, formando una suspensión de liposomas de producto que encapsulan el precipitado del agente sólido. en el que dicha suspensión de carga dispersa más luz que dicha suspensión de liposomas; y (d) incubar la suspensión final de (c) cargar así el agente sólido escasamente soluble en agua del medio acuoso en los liposomas mediante el gradiente de protones o iones.

Otras realizaciones, objetos y ventajas se establecen en la descripción detallada que sigue.

Descripción de las realizaciones preferidas

La invención se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención.

Al usar liposomas para la administración de compuestos funcionales, generalmente es deseable cargar los liposomas a una alta concentración, lo que da como resultado una proporción de masa de agente-lípido alta, ya que esto reduce la cantidad de liposomas que se van a administrar por tratamiento para lograr el efecto terapéutico requerido del agente, tanto más cuanto que diversos lípidos usados en liposomas tienen por sí mismos una toxicidad que limita la dosis. El porcentaje de carga también es importante para la rentabilidad, ya que una carga deficiente da como resultado una mayor pérdida de agente durante la carga del agente en el liposoma.

La presente invención proporciona agentes encapsulantes de liposomas, por ejemplo, escasamente solubles en agua, métodos para preparar tales liposomas, formulaciones que contienen tales liposomas y métodos para preparar los liposomas y formulaciones de la invención.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona un liposoma que tiene una membrana que encapsula un compartimento acuoso. El liposoma se prepara de manera que exista un gradiente de protones y/o iones a través de la membrana liposomal entre el compartimento acuoso interno y el medio acuoso externo. El agente se disuelve en un disolvente aprótico a una concentración que cuando se diluye en la suspensión de liposomas para formar la mezcla de carga remota se excede su solubilidad en la suspensión y el agente forma un precipitado. Una porción del precipitado del agente se carga en el compartimento acuoso del liposoma usando un gradiente de protones y/o iones a través de la membrana liposomal entre el compartimento acuoso interno y el medio acuoso externo.

En algunas realizaciones, esencialmente la cantidad total del precipitado del agente insoluble en la mezcla de carga remota se carga en el compartimento acuoso del liposoma. En una realización de ejemplo, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 70 % del precipitado de fármaco insoluble en la mezcla de carga remota se carga en el compartimento acuoso del liposoma.

Liposomas

El término liposoma se usa en este documento de acuerdo con su significado habitual, refiriéndose a vesículas lipídicas microscópicas compuestas por una bicapa de fosfolípidos o cualquier lípido anfipático similar que encapsule un medio acuoso interno. Los liposomas de la presente invención pueden ser vesículas unilaminares tales como vesículas unilaminares pequeñas (SUV) y vesículas unilaminares grandes (LUV), y vesículas multilaminares (MLV), por lo general varían en tamaño de 30 nm a 200 nm. No se impone ninguna limitación particular a la estructura de la membrana liposomal en la presente invención. El término membrana liposomal se refiere a la bicapa de fosfolípidos que separa el medio acuoso interno del medio acuoso externo.

Se pueden formar membranas liposomales de ejemplo útiles en la presente invención a partir de una variedad de lípidos formadores de vesículas, que incluyen por lo general lípidos de cadena dialifática, tales como fosfolípidos, diglicéridos, glicolípidos dialifáticos, lípidos individuales tales como esfingomielina y glicoesfingolípido, colesterol y derivados de los mismos, y combinaciones de los mismos. Como se define en este documento, los fosfolípidos son agentes anfifílicos que tienen grupos hidrofóbicos formados por cadenas alquílicas de cadena larga y un grupo hidrofílico que contiene una unidad estructural fosfato. El grupo de los fosfolípidos incluye ácido fosfatídico, fosfatidilgliceroles, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositoles, fosfatidilserinas y mezclas de los mismos. Preferiblemente, los fosfolípidos se eligen entre 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de soja (SPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), disrearoilfosfatidilglicerol. (DSPG), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) distearoil fosfatidilcolina (DSPC), fosfatidilcolina de yema de huevo (EYPC)) o fosfatidilcolina de yema de huevo hidrogenada (HEPC), lípidos modificados con esteroles (SML), lípidos catiónicos y lípidos zwitter inversos.

Las membranas liposomales según la presente invención pueden comprender además ionóforos como nigericina y A23187.

En el método según la presente invención, una temperatura de transición de fase liposomal de ejemplo está entre -25 °C y 100 °C, por ejemplo, entre 4 °C y 65 °C. La temperatura de transición de fase es la temperatura requerida para inducir un cambio en el estado físico de los lípidos que constituyen el liposoma, desde la fase de gel ordenada, donde las cadenas de hidrocarburos están completamente extendidas y estrechamente empaquetadas, hasta la fase cristalina líquida desordenada, donde las cadenas de hidrocarburo están orientadas aleatoriamente y son fluidas. Por encima de la temperatura de transición de fase del liposoma, aumenta la permeabilidad de la membrana liposomal. La elección de una temperatura de transición alta, en la que el liposoma siempre estaría en estado de gel, podría proporcionar una composición liposomal sin fugas, es decir, la concentración del agente escasamente soluble en agua en el medio acuoso interno se mantiene durante la exposición al medio ambiente. Alternativamente, un liposoma con una temperatura de transición entre la temperatura inicial y final del entorno al que está expuesto proporciona un medio para liberar el agente escasamente soluble en agua cuando el liposoma pasa por su temperatura de transición. De este modo, la temperatura del procedimiento para la técnica de carga activa por lo general está por encima de la temperatura de transición de fase liposomal para facilitar el procedimiento de carga activa. Como se sabe generalmente en la técnica, las temperaturas de transición de fase de los liposomas pueden verse influenciadas, entre otros parámetros, por la elección de los fosfolípidos y por la adición de esteroides como colesterol, lanosterol, colestanol, estigmasterol, ergosterol y similares. Por tanto, en una realización de la invención, se proporciona un método según cualquiera de los anteriores en el que los liposomas comprenden uno o más componentes seleccionados entre diferentes fosfolípidos y colesterol en varias relaciones molares para modificar la transición, la temperatura requerida del procedimiento y la estabilidad de los liposomas en plasma. Menos colesterol en la mezcla dará como resultado liposomas menos estables en el plasma. Una composición de fosfolípidos de ejemplo de uso en la invención comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 % mol de esteroides, preferiblemente colesterol.

De acuerdo con la invención, los liposomas se pueden preparar mediante cualquiera de las técnicas ahora conocidas o desarrolladas posteriormente para preparar liposomas. Por ejemplo, los liposomas se pueden formar mediante la técnica convencional para preparar vesículas lipídicas multilamelares (MLV), es decir, depositando uno o más lípidos seleccionados en las paredes interiores de un recipiente apropiado disolviendo los lípidos en cloroformo y luego evaporando el cloroformo y agregando luego la solución acuosa que se va a encapsular al recipiente, permitiendo que la solución acuosa hidrate el lípido y agitando o agitando en vórtex la suspensión de lípidos resultante. Este procedimiento genera una mezcla que incluye los liposomas deseados. Alternativamente, para producir los liposomas se pueden usartécnicas usadas para producir vesículas lipídicas unilaminares grandes (LUV), tales como evaporación en fase inversa, procedimientos de infusión y dilución con detergente. Se puede encontrar una revisión de estos y otros métodos para producir vesículas lipídicas en el texto Liposome Technology, Volume I, Gregory Gregoriadis Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., (1984). Por ejemplo, las partículas que contienen lípidos pueden estar en forma de vesículas lipídicas esteroides, vesículas lipídicas plurilamelares estables (SPLV), vesículas monofásicas (MPV) o portadores de matriz lipídica (LMC). En el caso de las MLV, si se desea, los liposomas pueden someterse a múltiples (cinco o más) ciclos de congelación-descongelación para potenciar sus volúmenes atrapados y sus eficiencias de captura y para proporcionar una distribución interlamelar de soluto más uniforme.

Después de la preparación de los liposomas, los liposomas se dimensionan opcionalmente para lograr un intervalo de tamaño deseado y una distribución relativamente estrecha de tamaños de liposomas. Un intervalo de tamaño desde aproximadamente 20-200 nanómetros permite esterilizar la suspensión de liposomas mediante filtración a través de un filtro convencional, por lo general un filtro de 0.22 o 0.4 micrómetros. El método de esterilización por filtro se puede llevar a cabo con un alto rendimiento si los liposomas se han reducido a aproximadamente 20-200 nanómetros. Están disponibles varias técnicas para dimensionar los liposomas al tamaño deseado. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación con baño o sonda produce una reducción progresiva del tamaño hasta pequeñas vesículas unilaminares menor que aproximadamente 50 nanómetros de tamaño. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las vesículas multilaminares se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, por lo general entre aproximadamente 50 y 500 nanómetros. En ambos métodos, la distribución del tamaño de las partículas se puede controlar mediante la determinación del tamaño de las partículas con rayo láser convencional. La extrusión de liposomas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica también es un método eficaz para reducir el tamaño de los liposomas a una distribución de tamaño relativamente bien definida. Por lo general, la suspensión se hace circular a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño de liposoma deseada. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas de poros sucesivamente más pequeños, para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas. Alternativamente, se pueden preparar liposomas de tamaño controlado usando técnicas de microfluidos en las que el lípido en un disolvente orgánico tal como etanol o mezclas de etanol-disolvente aprótico se mezcla rápidamente con el medio acuoso, de modo que la proporción disolvente orgánico/agua sea menos de 30 %, en un microcanal con dimensiones inferiores a 300 micrómetros y preferentemente inferiores a 150 micrómetros de ancho y 50 micrómetros de alto. A continuación se elimina el disolvente orgánico de los liposomas mediante diálisis. Los expertos en la técnica conocen otros métodos de dimensionamiento útiles tales como sonicación, vaporización de disolvente o evaporación en fase inversa.

Los liposomas de ejemplo para su uso en diversas realizaciones de la invención tienen un tamaño desde aproximadamente 30 nanómetros a aproximadamente 40 micrómetros.

El medio acuoso interno, como se hace referencia en este documento, por lo general es el medio original en el que se prepararon los liposomas y que inicialmente queda encapsulado tras la formación del liposoma. De acuerdo con la presente invención, los liposomas recién preparados que encapsulan el medio acuoso original se pueden usar directamente para la carga activa. Sin embargo, también se prevén realizaciones en las que los liposomas, después de la preparación, se deshidratan, por ejemplo, para almacenamiento. En tales realizaciones, el presente procedimiento puede implicar la adición de los liposomas deshidratados directamente al medio acuoso externo usado para crear los gradientes transmembrana. Sin embargo, también es posible hidratar primero los liposomas en otro medio externo, como entenderán los expertos en la técnica. Los liposomas se deshidratan opcionalmente a presión reducida usando un equipo de liofilización estándar o un aparato equivalente. En diversas realizaciones, los liposomas y el medio que los rodea se congelan en nitrógeno líquido antes de deshidratarlos y colocarlos a presión reducida. Para garantizar que los liposomas sobrevivan al procedimiento de deshidratación sin perder una porción sustancial de su contenido interno, por lo general se emplean uno o más azúcares protectores para interactuar con las membranas de las vesículas lipídicas y mantenerlas intactas a medida que se elimina el agua del sistema. Se puede usar una variedad de azúcares, incluidos azúcares como trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa y dextrano. En general, se ha descubierto que los azúcares disacáridos funcionan mejor que los azúcares monosacáridos, siendo los azúcares disacáridos trehalosa y sacarosa los más eficaces. También se pueden usar otros azúcares más complicados. Por ejemplo, se ha descubierto que los aminoglucósidos, incluidas la estreptomicina y la dihidroestreptomicina, protegen los liposomas durante la deshidratación. Por lo general, se incluyen uno o más azúcares como parte del medio interno o externo de las vesículas lipídicas. Lo más preferible es que los azúcares se incluyan tanto en el medio interno como en el externo de manera que puedan interactuar tanto con las superficies internas como externas de las membranas de los liposomas. La inclusión en el medio interno se logra agregando el azúcar o azúcares al agente regulador que queda encapsulado en las vesículas lipídicas durante el procedimiento de formación de liposomas. En estas realizaciones, el medio externo usado durante el procedimiento de carga activa también debería incluir preferiblemente uno o más de los azúcares protectores.

Como saben generalmente los expertos en la técnica, los conjugados de polietilenglicol (PEG)-lípido se han usado ampliamente para mejorar los tiempos de circulación de compuestos funcionales encapsulados en liposomas, para evitar o reducir la fuga prematura del compuesto funcional de la composición liposomal y para evitar la detección de liposomas por el sistema inmunitario del cuerpo. La unión de lípidos derivados de PEG a liposomas se denomina PEGilación. Por tanto, en una realización de ejemplo de la invención, los liposomas son liposomas PEGilados. La PEGilación se puede lograr incubando un derivado reactivo de PEG con los liposomas diana. Los lípidos derivados de PEG apropiados según la invención incluyen conjugados de DSPE-PEG, funcionalizados con uno de los ácidos carboxílicos, glutatión (GSH), maleimidas (MAL), ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (PDP), cianuro, azidas., aminas, biotina o folato, en los que el peso molecular del PEG está comprendido entre 2.000 y 5.000 g/mol. Otros lípidos derivados de PEG apropiados son los mPEG conjugados con ceramida, que tienen Cs- o C16-colas, en las que el peso molecular del mPEG está entre 750 y 5000 dalton. Otros ligandos más apropiados son mPEG o PEG funcionalizados conjugados con glicerofosfolípidos como 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2 -dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3fosfoetanolamina (DSPE), y similares. La PEGilación de liposomas es una técnica generalmente conocida por los expertos en la técnica.

En diversas realizaciones, los liposomas son PEGilados con conjugados DSPE-PEG-GSH (hasta 5 % mol) y/o conjugados DSPE-mPEG (en los que el peso molecular del PEG está por lo general dentro del intervalo de 750-5000 dalton, por ejemplo, 2000 dalton). La composición de fosfolípidos de un liposoma PEGilado de ejemplo de la invención puede comprender hasta 5-20 % mol de conjugados PEG-lípido.

Adicionalmente, en determinadas realizaciones, se incorporan a la membrana una o más unidades estructurales que dirigen específicamente el liposoma a un tipo de célula, tejido o similar particular. Se ha descrito anteriormente el direcciobnamiento de liposomas usando una variedad de unidades estructurales de direccionamiento (por ejemplo, ligandos, receptores y anticuerpos monoclonales). Ejemplos apropiados de tales unidades estructurales de direccionamiento incluyen ácido hialurónico, anticuerpos anti-ErbB y fragmentos de anticuerpos, lipoproteína lipasa (LPL), [a]2-macroglobulina ([a]2M), proteína asociada al receptor (RAP), lactoferrina, desmoteplasa, activador del plasminógeno de tipo tisular y uroquinasa (tPA/uPA), inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-I), complejos tPA/uPA:PAI-l, melanotransferrina (o P97), trombospondina 1 y 2, lipasa hepática, inhibidor de la vía del factor Vila/factor de tejido (TFPI), factor Villa, factor IXa, A[p]l-40, proteína precursora de amiloide-[p] (APP), inhibidor de CI, complemento C3, apolipoproteína E (apoE), exotoxina A de pseudomonas, CRM66, Proteína HIV-I Tat, rinovirus, metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9), MMP-13 (colagenasa-3), proteína activadora de espingolípidos (SAP), proteína de la zona de embarazo, antitrombina III, cofactor de heparina II, [a]l-antitripsina, proteína de choque térmico 96 (HSP-96), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), apolipoproteína J (apoJ o clusterina), A[p] unida a apoJ y apoE, aprotinina, angiopep-2 (TFFYGGSRGKRNNFKTEEY), lipoproteína de muy baja densidad<( v L D l ) ,>transferrina, insulina, leptina, un factor de crecimiento similar a la insulina, factores de crecimiento epidérmico, lectinas, anticuerpos monoclonales peptidomiméticos y/o humanizados, anticuerpos de cadena sencilla o péptidos específicos para dichos receptores (por ejemplo, secuencias HAIYPRH y THRPPMWSPVWP que se unen al receptor de transferrina humana, 0 anticuerpo monoclonal del receptor de transferrina anti-humana (TfR) A24), hemoglobina, porción no tóxica de una cadena polipeptídica de la toxina de la difteria, toda o una porción de la cadena B de la toxina de la difteria, toda o una porción de un mutante no tóxico de la toxina de la difteria CRM197, apolipoproteína B, apolipoproteína E (por ejemplo, después de unirse al recubrimiento de polisorb-80), proteína de unión a vitamina D, proteína de unión a vitamina A/retinol, proteína transportadora plasmática de vitamina B12/cobalamina, glutatión y transcobalamina-B 12.

Los mecanismos de direccionamiento generalmente requieren que los agentes de direccionamiento se coloquen en la superficie del liposoma de tal manera que las unidades estructurales diana estén disponibles para interactuar con el objetivo, por ejemplo, un receptor de superficie celular. En una realización de ejemplo, el liposoma se fabrica para incluir una porción conectora incorporada a la membrana en el momento de formar la membrana. Una porción de conector de ejemplo tiene una porción lipofílica que está firmemente incrustada y anclada en la membrana. Una porción de conector de ejemplo también incluye una porción hidrofílica que está químicamente disponible en la superficie acuosa del liposoma. La porción hidrofílica se selecciona de modo que sea químicamente apropiada para formar un enlace químico estable con el agente de dirección, que se agrega más tarde. Las técnicas para incorporar una unidad estructural de direccionamiento en la membrana liposomal se conocen generalmente en la técnica.

En una realización de ejemplo, el liposoma incluye HSPC, colesterol, PEG-DSPE y una combinación de los mismos. En una realización de ejemplo, el liposoma incluye desde aproximadamente 50 moles a aproximadamente 70 moles de HSPC, desde aproximadamente 30 moles a aproximadamente 50 moles de colesterol y desde aproximadamente 1 mol a aproximadamente 10 moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye aproximadamente 60 moles de HSPC, aproximadamente 40 moles de colesterol y aproximadamente 5 moles de PEG DSPE.

Agente escasamente soluble en agua

Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona liposomas que encapsulan un agente escasamente soluble en agua. En el contexto de la presente invención, el término "escasamente soluble en agua" significa que es insoluble o que tiene una solubilidad muy limitada en agua, más en particular que tiene una solubilidad acuosa menor que 2 mg/mL, por ejemplo, menos de 1.9 mg/mL, por ejemplo, que tiene una solubilidad acuosa menor que 1 mg/mL. Como se usa en este documento, las solubilidades en agua se refieren a solubilidades medidas a temperatura ambiente, que por lo general es aproximadamente 20 °C. En una realización de ejemplo, la solubilidad en agua del agente se mide a aproximadamente pH = 7.

Según una realización de ejemplo de la invención, el agente escasamente soluble en agua es un agente terapéutico seleccionado del grupo de un agente terapéutico seleccionado de un grupo que consiste en un compuesto de antraciclina, un compuesto de camptotecina, un alcaloide de vinca, un compuesto de elipticina, un compuesto de taxano, un compuesto de wortmanina, un compuesto de geldanamicina, un compuesto de pirazolopirimidina, un compuesto basado en péptidos tal como carfilzomib, un compuesto esteroide, un derivado de cualquiera de los anteriores, un profármaco de cualquiera de los anteriores y un análogo de cualquiera de los anteriores.

Los compuestos de molécula pequeña de ejemplo que tienen una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 2 mg/mL incluyen, pero no se limitan a, carfilzomib, voriconazol, amiodarona, ziprasidona, aripiprazol, imatinib, lapatinib, ciclopamina, oprozomib, CUR-61414, PF-05212384, PF-4691502, toceranib, PF-477736, PF-337210, sunitinib, SU14813, axitinib, AG014699, veliparib, MK-4827, ABT-263, SU11274, PHA665752, Crizotinib, XL880, PF-04217903, XR5000, AG14361, veliparib, bosutunib, PD-0332991, PF-01367338, AG14361, NVP-ADW742, NVP-AUY922, NVP-LAQ824, NVP-TAE684, NVP-LBH589, erubulina, doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, epirrubicina, pirarubicina, rubidomicina, carcinomicina, N- acetiladriamicina, rubidazona, 5-imidodaunomicina, N-acetildaunomicina, daunorilina, mitoxantrona, camptotecina, 9-aminocamptotecina, 7-etilcamptotecina, 7-etil-10-hidroxi-camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, 10,11-metilendioxicamptotecina, 9-amino-10,11-metilendioxicamptotecina, 9-cloro-10,11-metilendioxicamptotecina, irinotecán, lurtotecán, silatecán, (7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina, 7-(4-metilpiperazinometileno)-10, II-metilendioxi-20(S)-camptotecina, 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)-camptotecina, CKD-602, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vinflunina, vinpocetina, vindesina, elipticina, 6-3-aminopropil-elipticina, 2-dietilaminoetil-elipticinio, dateliptium, reteliptina, paclitaxel, docetaxel, diclofenaco, bupivacaína, 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina, cetirizina, fexofenadina, primidona y otras catecolaminas., epinefrina, ácido (S)-2-(2,4-dihidroxifenil)-4,5-dihidro-4-metil-4-tiazolcarboxílico (deferitrina), ácido (S)-4,5-dihidro-2-(3- hidroxi-2-piridinil)-4-metil-4-tiazolcarboxílico (desferritiocina), ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6,9,12-tetraoxatrideciloxi)fenilo]-4-metil-4-tiazolocarboxílico, ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6-dioxaheptiloxi)fenil]-4-metil-4-tiazolocarboxílico, (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6-dioxaheptiloxi)fenil]-4-metil-4-tiazolcarboxilato de etilo, ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-3-(3,6,9-trioxadeciloxi)]-4-metil-4-tiazolcarboxílico, sales de desazadesferritiocina, profármacos y derivados de estos compuestos medicinales y mezclas de los mismos.

Un agente terapéutico de ejemplo se selecciona de: un antihistamínico derivado de etilendiamina, bromfenifamina, difenhidramina, un fármaco antiprotozoario, quinolona, yodoquinol, un compuesto de amidina, pentamidina, un compuesto antihelmíntico, pirantel, un fármaco antiesquistosómico, oxaminiquina, un derivado de triazol antifúngico, fliconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, una cefalosporina antimicrobiana, agentes quelantes, deferoxamina, deferasirox, deferiprona, FBS0701, cefazolina, cefonicid, cefotaxima, ceftazimida, cefuoxima, un derivado betalactámico antimicrobiano, aztreopam, cefmetazol, cefoxitina, un antimicrobiano del grupo eritromicina, eritromicina, azitromicina, claritromicina, oleandomicina, un compuesto de penicilina, bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina, cloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, carbenicilina, un compuesto de tetraciclina, novobiocina, espectinomicina, vancomicina; un fármaco antimicobacteriano, ácido aminosalicíclico, capreomicina, etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampicina, clofazimina, un compuesto antiviral de adamantano, amantadina, rimantadina, un compuesto de quinidina, quinina, quinacrina, cloroquina, hidroxicloroquina, primaquina, amodiaquina, mefloquina, un antimicrobiano, qionolona, ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, una sulfonamida; un antimicrobiano del tracto urinario, nitrofurantoína, trimetoprim; derivado de anitroimidazoles, metronidazol, un compuesto colinérgico de amonio cuaternario, ambetinio, neostigmina, fisostigmina, una aminoacridina anti-Alzheimer, tacrina, un fármaco antiparkinsonal, benzotropina, biperideno, prociclidina, trihexilhenidilo, un agente antimuscarínico, atropina, hiosciamina, escopolamina, propantelina, un compuesto adrenérgico, dopamina, serotonina, un inhibidor de hedgehog, albuterol, dobutamina, efedrina, epinefrina, norepinefrina, isoproterenol, metaproperenol, salmetrol, terbutalina, un inhibidor de la recaptación de serotonina, un derivado de ergotamina, un miorelajante, una serie de curare, un miorrelajante de acción central, baclofeno, ciclobencepina, dentroleno, nicotina, un antagonista de los receptores de nicotina, un beta-adreno-bloqueador, acebutilo, amiodarona, compuesto de abenzodiazepina, ditiazem, un fármaco antiarrítmico, diisopiramida, encaidina, un compuesto anestésico local, procaína, procainamida, lidocaína, flecaimida, quinidina, un inhibidor de la ACE, captopril, enelaprilato, inhibidor de Hsp90, fosinoprol, quinapril, ramipril; un derivado opiáceo, codeína, meperidina, metadona, morfina, un antilipidémico, fluvastatina, gemfibrosil, un inhibidor de la HMG-coA, pravastatina, un fármaco hipotensor, clonidina, guanabenz, prazocina, guanetidina, granadril, hidralazina, un vasodilatador no coronario, dipiridamol, un inhibidor de la acetilcolina esterasa, pilocarpina, un alcaloide, fisostigmina, neostigmina, un derivado de cualquiera de los anteriores, un profármaco de cualquiera de los anteriores y un análogo de cualquiera de los anteriores.

Esta lista de agentes, sin embargo, no pretende limitar el alcance de la invención. De hecho, el compuesto encapsulado dentro del liposoma puede ser cualquier base débil anfipática o ácido débil anfipático escasamente soluble en agua. Como se señaló anteriormente, la presente invención también abarca realizaciones en las que el agente escasamente soluble en agua no es un agente farmacéutico o medicinal.

Por lo general, en el contexto de la presente invención, las bases débiles anfipáticas escasamente solubles en agua tienen un coeficiente de distribución de octanol-agua (logD) a pH 7 entre -2.5 y 2 y pKa < 11, mientras que los ácidos débiles anfipáticos escasamente solubles en agua tienen un logD a pH 7 entre -2.5 y 2 y pKa > 3.

Por lo general, los términos base débil y ácido débil, como se usan anteriormente, se refieren respectivamente a compuestos que están sólo parcialmente protonados o desprotonados en agua. Los ejemplos de agentes protonables incluyen compuestos que tienen un grupo amino, que pueden protonarse en medios ácidos, y compuestos que son zwitteriónicos en medios neutros y que también pueden protonarse en ambientes ácidos. Los ejemplos de agentes desprotonables incluyen compuestos que tienen un grupo carboxi, que pueden desprotonarse en medios alcalinos, y compuestos que son zwitteriónicos en medios neutros y que también pueden desprotonarse en ambientes alcalinos.

El término zwitteriónico se refiere a compuestos que pueden transportar simultáneamente una carga eléctrica positiva y negativa en diferentes átomos. El término anfipático, tal como se usa anteriormente, se emplea por lo general para referirse a compuestos que tienen unidades estructurales tanto lipofílicas como hidrofílicas. Lo anterior implica que las soluciones acuosas de compuestos que son ácidos o bases anfipáticos débiles comprenden simultáneamente formas cargadas y no cargadas de dichos compuestos. Sólo las formas no cargadas pueden cruzar la membrana liposomal.

Cuando los agentes de uso en la presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas o ácidas, las sales de dichos compuestos se incluyen en el alcance de la invención. Las sales se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido o base deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte apropiado. Ejemplos de sales para compuestos relativamente ácidos de la invención incluyen sales de sodio, potasio, calcio, amonio, aminoácidos orgánicos o magnesio, o sales similares. Cuando los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas, las sales de adición de ácidos se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte apropiado. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrógenocarbónico, fosfórico, monohidrógenofosfórico, dihidrogenfosfórico, sulfúrico, monohidrógenosulfúrico, yodhídrico o fosfórico y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos. como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónico o galactunórico y similares (véase, por ejemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 1977, 66: 1-19). Determinados compuestos específicos de la presente invención contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición ya sea de bases o de ácidos.

Las formas neutras de los compuestos se regeneran preferiblemente poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando el compuesto original de la manera convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas de sal en determinadas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los fines de la presente invención.

Un agente de ejemplo es una pequeña molécula orgánica con un peso molecular entre aproximadamente 100 Da y 3000 Da.

Carga activa

El procedimiento de carga activa implica el uso de potenciales transmembrana. El principio de carga activa, en general, se ha descrito ampliamente en la técnica. Los términos carga activa y carga remota son sinónimos y se usarán indistintamente.

Durante la carga activa, el precipitado del agente escasamente soluble en agua se transfiere desde el medio acuoso externo a través de la membrana liposomal al medio acuoso interno mediante un gradiente de protones o iones transmembrana. El término gradiente de un compuesto particular como se usa en este documento se refiere a un aumento discontinuo de la concentración de dicho compuesto a través de la membrana liposomal desde el exterior (medio acuoso externo) hasta el interior del liposoma (medio acuoso interno).

Para crear el gradiente de concentración, los liposomas por lo general se forman en una primera fase líquida, por lo general acuosa, seguido de la sustitución o dilución de dicha primera fase líquida. El medio externo diluido o nuevo tiene una concentración diferente de la especie cargada o una especie cargada totalmente diferente, estableciendo así el gradiente de iones o protones.

La sustitución del medio externo se puede lograr mediante diversas técnicas, tales como hacer pasar la preparación de vesículas lipídicas a través de una columna de filtración en gel, por ejemplo, una columna de Sephadex o Sepharose, que se ha equilibrado con el nuevo medio, o mediante centrifugación, diálisis., o técnicas relacionadas.

La eficiencia de la carga activa en liposomas depende, entre otros aspectos, de las propiedades químicas del complejo a cargar y del tipo y magnitud del gradiente aplicado. En una realización de la invención, se proporciona un método como se define en cualquiera de los anteriores empleando un gradiente a través de la membrana liposomal, en el que el gradiente se elige entre un gradiente de pH, un gradiente de sulfato, fosfato, fosfonato, citrato., o gradiente de sal de acetato, un gradiente de ion EDTA, un gradiente de sal de amonio, un gradiente de sal de amonio alquilado, por ejemplo, metil-, etil-, propil-y amilo, un gradiente de Mn2+, Cu2+, Na+-, K+, con o sin uso de ionóforos, o una combinación de ellos. Estas técnicas de carga se han descrito ampliamente en la técnica.

Preferiblemente, el medio acuoso interno de los liposomas preformados, es decir, descargados, comprende un llamado agente regulador de carga activa que contiene agua y, dependiendo del tipo de gradiente empleado durante la carga activa, puede comprender además una solución de sulfato, fosfato o, sal de fosfonato, citrato o acetato, una sal de amonio, una sal de amonio alquilada, por ejemplo, de metilo, etil, propilo y amilo, una sal de Fe+2, Mn2+, Cu2+, Na+ y/o K+, una sal de ion EDTA y opcionalmente un agente regulador de pH para mantener un gradiente de pH. Las sales pueden ser poliméricas tales como sulfato de dextrano, polietilenimina, dendrímeros de poliamidoamina, la versión terminal 1,5 carboxilato de poliamidoaminas, polifosfatos, heparina de bajo peso molecular o ácido hialurónico. En una realización de ejemplo, la concentración de sales en el medio acuoso interno de los liposomas descargados está entre 1 y 1000 mM.

El medio acuoso externo, usado para establecer el gradiente transmembrana para la carga activa, comprende agua, el precipitado del agente o agentes escasamente solubles en agua a cargar y, opcionalmente, sacarosa, solución salina o algún otro agente para ajustar la osmolaridad y/o un quelante como EDTA para ayudar a la actividad del ionóforo, más preferiblemente sacarosa y/o EDTA.

En una realización de ejemplo, el gradiente se elige entre una amina o una sal metálica de un miembro seleccionado entre un carboxilato, sulfato, fosfonato, fosfato o un acetato. Como saben generalmente los expertos en la técnica, se pueden usar gradientes de pH transmembrana (pH interior más bajo, pH exterior más alto) o gradientes de acetato catiónico para cargar activamente ácidos débiles anfifílicos. Las bases débiles anfipáticas también se pueden cargar activamente en liposomas usando un gradiente de sulfato de amonio o sulfato de trietilamina o cloruro de amonio.

Los carboxilatos de uso en la invención incluyen, sin limitación, carboxilato, citrato, dietilentriaminopentaacetato, acetato mellético, 1,2,3,4-butanotetracarboxilato, benzoato, isofalato, ftalato, 3,4-bis(carboximetil)ciclopentanocarboxilato, la generación de carboxilato de dendrímeros de poliamidoamina, bencenetricarboxilatos, bencenetetracarboxilatos, ascorbato, glucuronato y ulosonato.

Los sulfatos de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, sulfato, 1,5-naftalenodisulfonato, sulfato de dextrano, sulfobutlieter beta ciclodextrina, octasulfato de sacarosa, bencenosulfonato, poli(4-estirenosulfonato)-transresveratrol-trisulfato.

Los fosfatos y fosfonatos de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, fosfato, hexametafosfato, vidrios de fosfato, polifosfatos, trifosfato, trimetafosfato, bifosfonatos, etanohidroxibifosfonato, hexafosfato de inositol.

Las sales de ejemplo de uso en la invención incluyen una mezcla de carboxilato, sulfato o fosfato que incluye, pero no se limitan a: 2-carboxibensulfonato, fosfato de creatina, fosfocolina, fosfato de carnitina, la generación carboxilo de poliamidoaminas.

Las aminas de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, monoaminas, poliaminas, trimetilamonio, trietilamonio, tributilamonio, dietilmetilamonio, diisopropiletilamonio, triisopropilamonio, N-metilmorfolinio, N-etilmorfolinio, N-hidroxietilpiperidinio, N-metilpirrolidinio, N, N-dimetilpiperazinio, isopropiletilamonio, isopropilmetilamonio, diisopropilamonio, tert-butiletilamonio, diciclohexilamonio, formas protonizadas de morfolina, piridina, piperidina, pirrolidina, piperazina, imidazol, tert-butilamina, 2-amino-2-metilpropanol, 2-amino-2-metilo -propandiol, tris-(hidroxietil)-aminometano, dietil-(2-hidroxietil)amina, tris-(hidroximetil)-aminometano, tetrametilamonio, tetraetilamonio, N-metilglucamina y tetrabutilamonio, polietilenimina y dendrímeros de poliamidoamina.

Dependiendo de la permeabilidad de las membranas de las vesículas lipídicas, el potencial transmembrana completo correspondiente al gradiente de concentración se formará espontáneamente o se puede agregar al medio un agente potenciador de la permeabilidad, por ejemplo, un ionóforo de protones. Si se desea, el agente potenciador de la permeabilidad se puede eliminar de la preparación de liposomas después de que se complete la carga con el complejo usando cromatografía u otras técnicas.

Por lo general, la temperatura del medio durante la carga activa está entre aproximadamente -25 °C y aproximadamente 100 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 70 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 4 °C y 65 °C.

La eficiencia de encapsulación o carga, definida como la cantidad encapsulada (por ejemplo, medida en gramos de agente/moles de fosfolípido o g de fármaco/g de lípido total) del agente escasamente soluble en agua en la fase acuosa interna dividida por la cantidad inicial en la fase acuosa externa multiplicada por 100 % es al menos 10 %, preferiblemente al menos 50 %, al menos 90 %.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona un método para cargar un agente escasamente soluble en agua en un liposoma. Un método de ejemplo comprende poner en contacto una suspensión acuosa de dicho liposoma con una suspensión acuosa del agente en condiciones apropiadas para encapsular el agente escasamente soluble en agua en dicho liposoma. El liposoma tiene un ambiente acuoso interno encapsulado por una membrana lipídica. La suspensión acuosa del liposoma comprende un gradiente seleccionado entre un gradiente de protones, un gradiente de iones y una combinación de los mismos a través de la membrana. El agente escasamente soluble en agua y la suspensión de liposomas se incuban en condiciones y durante un período de tiempo seleccionado apropiado para que el agente escasamente soluble en agua atraviese la membrana y se concentre en el entorno acuoso interno, formando así dicha formulación farmacéutica.

En diversas realizaciones, la mezcla de reacción anterior se incuba durante un período de tiempo seleccionado y el gradiente de pH, gradiente de sulfato, gradiente de fosfato, gradiente de fosfonato, gradiente de carboxilato (gradiente de citrato, gradiente de acetato, etc.), gradiente de ion EDTA, gradiente de sal de amonio., gradiente de sales de amonio alquiladas, gradiente de Mg+2, Mn+2, Cu+2, Na+, K+ o una combinación de los mismos, existe a través de la membrana liposomal durante la incubación.

En realizaciones de ejemplo de la invención, el agente terapéutico escasamente soluble en agua no está unido covalentemente a un componente del liposoma, ni está unido covalentemente a ningún componente del pH o gradiente de sal usado para formar la preparación del agente liposomal de la invención.

Solvente aprótico

En una realización de ejemplo, el agente escasamente soluble en agua se disuelve completamente en un disolvente aprótico miscible con agua. La solución del agente se agrega a la suspensión acuosa de liposomas a una concentración que es mayor que la solubilidad del agente farmacológico en la suspensión de liposomas o en la mezcla de suspensión de liposomas/disolvente aprótico, por lo que se forma un precipitado. Los disolventes apróticos de ejemplo incluyen dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, 1 -metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, éter monometílico de etilenglicol, éter monometílico de dietilenglicol, PEG400 y polietilenglicoles.

Precipitado de agente escasamente soluble en agua

La invención proporciona métodos para cargar un precipitado insoluble dentro del compartimento interno acuoso de la membrana lipídica de un liposoma. Un precipitado de ejemplo se conceptualiza como una porción insoluble del agente en suspensión. La porción insoluble se define como una porción del agente que no está solvatada como lo indica cualquiera de los siguientes: cualquier apariencia de turbidez mayor que la de la suspensión de liposomas en ausencia del agente, cualquier grado de mayor dispersión de la luz a una longitud de onda cuando el contenido no absorba luz, como a 600 nm más que la suspensión de liposomas sola, cualquier porción del fármaco que pueda aislarse (granularse) mediante centrifugación a una velocidad inferior a 12,000 RPM durante 15 minutos, cualquier porción del agente farmacológico que no sea Se puede aislar mediante filtración a través de un filtro de 0.2 um.

Formulación de ejemplo

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación de un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende colesterol, PEG-DSPE y un componente lipídico con un grupo principal de fosfocolina y uno o dos residuos de ácidos grasos. En diversas realizaciones, el liposoma comprende una combinación de HSPC, colesterol y PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 50 por ciento en moles a aproximadamente 70 por ciento en moles de HSPC, desde aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y desde aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG- DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 60 por ciento en moles de HSPC, aproximadamente 40 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el agente se encapsula en el liposoma mediante carga activa.

En una realización de ejemplo adicional, la invención proporciona una formulación de un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende una combinación de esfingomielina (SM), colesterol y PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 45 a aproximadamente 75 SM, desde aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y desde aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 55 por ciento en moles de SM, aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-DSPE.

En una realización de ejemplo, la proporción entre el agente escasamente soluble en agua (por ejemplo, carfilxomib) o una sal, un análogo o derivado del mismo:lípido es desde aproximadamente 30 mg a aproximadamente 90 mg de agente a aproximadamente 90 mg a aproximadamente 250 mg de lípido. En una realización de ejemplo, en la formulación la proporción agente:lípido es aproximadamente 60 mg de agente por aproximadamente 170 mg de lípido.

En diversas realizaciones, la proporción agente (|jg):lípido (jm ol) es desde aproximadamente 250 a aproximadamente 450. En una realización de ejemplo, esta proporción es desde aproximadamente 300 a aproximadamente 400.

En una realización de ejemplo, el agente de carga remota es una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato. En diversas realizaciones, el agente de carga remota es sulfato de trietilamonio dextrano.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende aproximadamente 60 mg de agente encapsulado dentro de una población de liposomas cuya masa es desde aproximadamente 90 mg a aproximadamente 200 mg. Los liposomas comprenden una membrana lipídica que define un compartimento acuoso interno. El agente está encapsulado dentro del compartimento acuoso definido por la membrana lipídica. La membrana lipídica tiene una relación molar de componentes: (a) desde aproximadamente 55 por ciento en moles de esfingomielina (SM); (b) aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol; y (c) aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-(1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) (PEG-DSPE). La formulación se selecciona entre una formulación liofilizada y una formulación en la que dichos liposomas están suspendidos en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación liposomal de un agente en la que el agente tiene una T1/2in vivodesde aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, por ejemplo, desde aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, en un sujeto al que se administra. En una formulación de ejemplo, el agente está en forma libre o encapsulada.

Una formulación farmacéutica de ejemplo de la invención incluye un liposoma que encapsula además el sulfato de carbohidrato. En una realización de ejemplo, el sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano.

En una realización de ejemplo, la formulación de la invención se forma mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión del liposoma en una solución acuosa de una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato, formando una primera población de dicha sal de amonio encapsulada dentro de dicho liposoma y una segunda población de dicha sal externa a dicho liposoma; (b) reemplazar la sal externa a dicho liposoma con un agente regulador acuoso, formando así un gradiente de dicho sulfato de carbohidrato a través de dicha membrana lipídica; y (c) agregar una solución de agente en un disolvente aprótico a la suspensión formada en (b), formando un precipitado de agente que permite que el agente atraviese la membrana lipídica, concentrándose en dicho compartimento acuoso interno, encapsulando así el agente.

En una realización de ejemplo, la sal de amonio del sulfato de carbohidrato es sulfato de trietilamonio dextrano o sulfato de amonio dextrano.

En una realización de ejemplo, los liposomas cargados con agente tienen un diámetro desde aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.

En diversas realizaciones, el agente encapsulado se solubiliza en el compartimento acuoso interno. En diversas realizaciones, el agente está en forma de suspensión. En una realización de ejemplo, la fracción de agente está parcialmente solubilizada y parcialmente en forma de suspensión.

Como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros individuales establecidos anteriormente se pueden combinar libremente en cualquier formato útil.

Kits

En una realización de ejemplo, la invención proporciona un kit que contiene uno o más componentes de los liposomas 0 formulaciones de la invención e instrucciones sobre cómo combinar y usar los componentes y la formulación resultante de la combinación. En diversas realizaciones, el kit incluye un agente escasamente soluble en agua en un recipiente y una preparación de liposomas en otro recipiente. Una preparación de liposomas de ejemplo incluye una distribución de sal en el exterior y el interior de la membrana lipídica para establecer y/o mantener un gradiente iónico, tal como el descrito en este documento. También se incluyen instrucciones para combinar el contenido de los recipientes para producir un liposoma o una formulación del mismo de la invención. En diversas realizaciones, la cantidad de complejo y liposoma es suficiente para formular una formulación de dosificación unitaria del agente complejado.

En una realización de ejemplo, un recipiente incluye un liposoma o solución de liposomas, que se usa para convertir al menos parte del contenido de un recipiente de una formulación de agente terapéutico escasamente soluble en agua (por ejemplo, de un agente terapéutico aprobado) en una formulación líquida. del agente terapéutico encapsulado en liposomas en el punto de atención para su administración a un sujeto. En una realización de ejemplo, el contenido de los recipientes es suficiente para formular una formulación de dosificación unitaria del agente terapéutico.

En la realización en la que se forma un formato de dosificación unitaria, el recipiente incluye desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg del agente terapéutico, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg, por ejemplo, desde aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg. por ejemplo, desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 60 mg.

En una realización de ejemplo, el agente terapéutico aprobado es carfilzomib y está presente en el recipiente en una cantidad desde aproximadamente 40 mg a aproximadamente 80 mg, por ejemplo, desde aproximadamente 50 mg a aproximadamente 70 mg. En una realización de ejemplo, el carfilzomib está presente en aproximadamente 60 mg.

Formulación de ejemplo

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación de un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende colesterol, PEG-DSPE y un componente lipídico con un grupo principal de fosfocolina y uno o dos residuos de ácidos grasos. En diversas realizaciones, el liposoma comprende una combinación de HSPC, colesterol y PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 50 por ciento molar a aproximadamente 70 por ciento molar de HSPC, desde aproximadamente 25 por ciento molar a aproximadamente 50 por ciento molar de colesterol y desde aproximadamente 1 por ciento molar a aproximadamente 10 por ciento molar de PEG- DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 60 por ciento en moles de HSPC, aproximadamente 40 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el agente se encapsula en el liposoma mediante carga activa.

En una realización de ejemplo adicional, la invención proporciona una formulación de un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende una combinación de esfingomielina (SM), colesterol y PEG-DSPE. En una realización de ejemplo, el liposoma incluye una relación molar de componentes desde aproximadamente 45 a aproximadamente 75 SM, desde aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y desde aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 55 por ciento en moles de SM, aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-DSPE.

En una realización de ejemplo, la proporción entre el agente escasamente soluble en agua (por ejemplo, carfilxomib) o una sal, un análogo o derivado del mismo:lípido es desde aproximadamente 30 mg a aproximadamente 90 mg de agente a aproximadamente 90 mg a aproximadamente 250 mg de lípido. En una realización de ejemplo, en la formulación la proporción agente:lípido es aproximadamente 60 mg de agente por aproximadamente 170 mg de lípido.

En diversas realizaciones, la proporción agente (|jg):lípido (jm ol) es desde aproximadamente 250 a aproximadamente 450. En una realización de ejemplo, esta proporción es desde aproximadamente 300 a aproximadamente 400.

En una realización de ejemplo, el agente de carga remota es una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato. En diversas realizaciones, el agente de carga remota es sulfato de trietilamonio dextrano.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende aproximadamente 60 mg de agente encapsulado dentro de una población de liposomas cuya masa es desde aproximadamente 90 mg a aproximadamente 200 mg. Los liposomas comprenden una membrana lipídica que define un compartimento acuoso interno. El agente está encapsulado dentro del compartimento acuoso definido por la membrana lipídica. La membrana lipídica tiene una relación molar de componentes: (a) de aproximadamente 55 por ciento en moles de esfingomielina (SM); (b) aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol; y (c) aproximadamente 2.8 por ciento en moles de PEG-(1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) (PEG-DSPE). La formulación se selecciona entre una formulación liofilizada y una formulación en la que dichos liposomas están suspendidos en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación liposomal de un agente en la que el agente tiene una T1/2in vivodesde aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, por ejemplo, desde aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, en un sujeto al que se administra. En una formulación de ejemplo, el agente está en forma libre o encapsulada.

Una formulación farmacéutica de ejemplo de la invención incluye un liposoma que encapsula además el sulfato de carbohidrato. En una realización de ejemplo, el sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano.

En una realización de ejemplo, la formulación de la invención se forma mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión del liposoma en una solución acuosa de una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato, formando una primera población de dicha sal de amonio encapsulada dentro de dicho liposoma y una segunda población de dicha sal externa a dicho liposoma; (b) reemplazar la sal externa a dicho liposoma con un agente regulador acuoso, formando así un gradiente de dicho sulfato de carbohidrato a través de dicha membrana lipídica; y (c) agregar una solución de agente en un disolvente aprótico a la suspensión formada en (b), formando un precipitado de agente que permite que el agente atraviese la membrana lipídica, concentrándose en dicho compartimento acuoso interno, encapsulando así el agente.

En una realización de ejemplo, la sal de amonio del sulfato de carbohidrato es sulfato de trietilamonio dextrano o sulfato de amonio dextrano.

En una realización de ejemplo, los liposomas cargados con agente tienen un diámetro desde aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.

En diversas realizaciones, el agente encapsulado se solubiliza en el compartimento acuoso interno. En diversas realizaciones, el agente está en forma de suspensión. En una realización de ejemplo, la fracción de agente está parcialmente solubilizada y parcialmente en forma de suspensión.

Como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros individuales establecidos anteriormente se pueden combinar libremente en cualquier formato útil.

Usos. La invención puede ser útil en el tratamiento de un trastorno proliferativo, por ejemplo, un cáncer, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

En una realización, la formulación farmacéutica se administra en combinación con uno o más agentes anticancerígenos adicionales, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos descritos en este documento, y radiación.

En una realización, el cáncer es un cáncer descrito en este documento. Por ejemplo, el cáncer puede ser un cáncer de vejiga (incluido el cáncer de vejiga acelerado y metastásico), de mama (por ejemplo, cáncer de mama positivo para receptor de estrógeno; cáncer de mama negativo para receptor de estrógeno; cáncer de mama positivo para HER-2; cáncer de mama negativo para HER-2; cáncer de mama positivo para receptor de progesterona; cáncer de mama negativo para receptor de progesterona; cáncer de mama negativo para con receptor de estrógeno, negativo para HER-2 y negativo para receptor de progesterona (es decir, cáncer de mama triple negativo); cáncer de mama inflamatorio), colon (incluido el cáncer colorrectal), riñón (por ejemplo, carcinoma de células transicionales), hígado, pulmón (incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y cáncer de células escamosas), tracto genitourinario, por ejemplo, ovario (incluidos los cánceres de trompas de Falopio y peritoneales), cuello uterino, próstata, testículos, riñón y uréter, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluido el carcinoma de páncreas exocrino), esófago, estómago, vesícula biliar, tiroides, piel (incluido el carcinoma de células escamosas), cerebro (incluido el glioblastoma multiforme), cabeza y cuello (por ejemplo, primario oculto) y tejido blando (por ejemplo, sarcoma de Kaposi (por ejemplo, sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA), leiomiosarcoma, angiosarcoma e histiocitoma).

En una realización de ejemplo, el cáncer es mieloma múltiple o un tumor sólido. En una realización, la formulación farmacéutica de la invención incluye carfilzomib como agente terapéutico escasamente soluble en agua.

En un aspecto, la divulgación presenta el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con inflamación, por ejemplo, una reacción alérgica o una enfermedad autoinmune, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

En una realización, la enfermedad o trastorno asociado con la inflamación es una enfermedad o trastorno descrito en este documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno asociado con la inflamación puede ser, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad articular degenerativa, esponduloartropatías, artritis gotosa, lupus eritematoso sistémico, artritis juvenil, artritis reumatoide, osteoartritis, osteoporosis, diabetes (p. ej., diabetes mellitus insulinodependiente o diabetes juvenil), calambres menstruales, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Crohn, colitis mucosa, colitis ulcerosa, gastritis, esofagitis, pancreatitis, peritonitis, enfermedad de Alzheimer, choque, espondilitis anquilosante, gastritis, conjuntivitis, pancreatitis (aguda o crónica), síndrome de lesión multiorgánica (por ejemplo, secundaria a septicemia o traumatismo), infarto de miocardio, aterosclerosis, accidente cerebrovascular, lesión por reperfusión (por ejemplo, debido a bypass cardiopulmonar o diálisis renal), glomerulonefritis aguda, vasculitis, lesión térmica (es decir, quemaduras solares), enterocolitis necrotizante, síndrome asociado a transfusión de granulocitos y/o síndrome de Sjogren. Los estados inflamatorios de la piel de ejemplo incluyen, por ejemplo, eccema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, urticaria, esclerodermia, psoriasis y dermatosis con componentes inflamatorios agudos. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune de órgano y tejido (por ejemplo, síndrome de Raynaud), esclerodermia, miastenia gravis, rechazo de trasplante, choque de endotoxinas, sepsis, psoriasis, eczema, dermatitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, uveítis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Addison, enfermedad poliglandular autoinmune (también conocida como síndrome poliglandular autoinmune) o enfermedad de Grave.

En otra realización, se puede usar una formulación farmacéutica de la invención para tratar o prevenir alergias y afecciones respiratorias, incluyendo asma, bronquitis, fibrosis pulmonar, rinitis alérgica, toxicidad del oxígeno, enfisema, bronquitis crónica, síndrome de dificultad respiratoria aguda y cualquier enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). La formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se puede usar para tratar la infección por hepatitis crónica, incluidas la hepatitis B y la hepatitis C.

En un aspecto, la divulgación presenta el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, enfermedades cardíacas, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

En una realización, la enfermedad cardiovascular es una enfermedad o trastorno descrito en este documento. Por ejemplo, la enfermedad cardiovascular puede ser una miocardiopatía o miocarditis; tales como miocardiopatía idiopática, miocardiopatía metabólica, miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía inducida por fármacos, miocardiopatía isquémica y miocardiopatía hipertensiva. También son tratables o prevenibles usando una formulación farmacéutica de las invenciones, partículas, composiciones y métodos descritos en este documento los trastornos ateromatosos de los vasos sanguíneos principales (enfermedad macrovascular) tales como la aorta, las arterias coronarias, las arterias carótidas, las arterias cerebrovasculares, las arterias renales, las arterias ilíacas, las arterias femorales y las arterias poplíteas. Otras enfermedades vasculares que pueden tratarse o prevenirse incluyen las relacionadas con la agregación plaquetaria, las arteriolas de la retina, las arteriolas glomerulares, los vasa nervorum, las arteriolas cardíacas y los lechos capilares asociados del ojo, el riñón, el corazón y el sistema central y periférico. sistemas nerviosos. Otros trastornos más que pueden tratarse con la formulación farmacéutica de la invención incluyen reestenosis, por ejemplo, después de una intervención coronaria, y trastornos relacionados con un nivel anormal de colesterol de alta y baja densidad.

En una realización, la formulación farmacéutica de la invención se puede administrar a un sujeto que se somete o se ha sometido a una angioplastia. En una realización, la formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se administra a un sujeto que se somete o se ha sometido a una angioplastia con colocación de un stent. En algunas realizaciones, la formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se puede usar como puntal de un stent o como recubrimiento para un stent.

En un aspecto, la divulgación proporciona el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con el riñón, por ejemplo, trastornos renales, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano.

En una realización, la enfermedad o trastorno asociado con el riñón es una enfermedad o trastorno descrito en este documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno asociado con el riñón puede ser, por ejemplo, insuficiencia renal aguda, síndrome nefrítico agudo, nefropatía analgésica, enfermedad renal ateroembólica, insuficiencia renal crónica, nefritis crónica, síndrome nefrótico congénito, enfermedad renal terminal, síndrome de Goodpasture, nefritis intersticial, daño renal, infección renal, lesión renal, cálculos renales, nefritis lúpica, GN I membranoproliferativa, GN II membranoproliferativa, nefropatía membranosa, enfermedad de cambios mínimos, glomerulonefritis necrotizante, nefroblastoma, nefrocalcinosis, diabetes insípida nefrogénica, nefrosis (síndrome nefrótico)), poliquistosis renal, GN postestreptocócica, nefropatía por reflujo, embolia de la arteria renal, estenosis de la arteria renal, necrosis papilar renal, acidosis tubular renal tipo I, acidosis tubular renal tipo II, hipoperfusión renal, trombosis de la vena renal.

En una realización de ejemplo, la divulgación proporciona el tratamiento de la toxicidad del metal o la sobrecarga del metal. Ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con el metal incluyen trastornos por sobrecarga de hierro (por ejemplo, talasemia o anemia de células falciformes), trastornos por sobrecarga de cobre (por ejemplo, enfermedad de Wilson) y contaminación por radioisótopos (por ejemplo, que ocurre después de la contaminación con plutonio, uranio y otros radioisótopos).

Una "cantidad efectiva" o "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de la formulación farmacéutica de la invención que es eficaz, tras administraciones de dosis únicas o múltiples a un sujeto, para tratar una célula, o curar, aliviar, aliviar o mejorar un síntoma de un trastorno. Una cantidad eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Como se usa en este documento, el término "prevenir" o "que previene" como se usa en el contexto de la administración de un agente a un sujeto, se refiere a someter al sujeto a un régimen, por ejemplo, la administración de una formulación farmacéutica de la invención tal que la aparición de al menos un síntoma del trastorno se retrasa en comparación con lo que se vería en ausencia del régimen.

Como se usa en este documento, se pretende que el término "sujeto" incluya animales humanos y no humanos. Los sujetos humanos de ejemplo incluyen un paciente humano que tiene un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en este documento, o un sujeto normal. El término "animales no humanos" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, no mamíferos (tales como pollos, anfibios, reptiles) y mamíferos, tales como primates no humanos, animales domesticados y/o útiles en agricultura, por ejemplo, ovejas, perros, gato, vaca, cerdo, etc.

Como se usa en este documento, el término "tratar" o "que trata" a un sujeto que tiene un trastorno se refiere a someter al sujeto a un régimen, por ejemplo, la administración de una formulación farmacéutica de la invención tal que se cura al menos un síntoma del trastorno. curado, aliviado, aliviado, alterado, remediado, mejorado o mejorado. El tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz para aliviar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, mejorar o afectar el trastorno o los síntomas del trastorno. El tratamiento puede inhibir el deterioro o empeoramiento de un síntoma de un trastorno.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones de ejemplo de la invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Atrapamiento de liposomas de carfilzomib mediante carga remota

Materiales y método

Se preparó una solución de sulfato de amonio disolviendo sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 250 mM (500 mequivilentes de anion/L), no se realizó ningún ajuste de pH para producir un pH final de 5.6. Se preparó una solución de sulfato de sodio (250 mM) agregando 0.35 g de sulfato de sodio a 10 mL de agua desionizada.

Los liposomas se formaron por extrusión. Los lípidos se disolvieron en etanol a una concentración de HSPC 500 mM (591 mg/mL de lípidos totales) a 65 °C y los 9 volúmenes de la solución del agente atrapador calentada a 65 °C se agregaron a la solución de etanol/lípidos también a 65 °C. La mezcla se agitó y se transfirió a una extrusora Lipex de 10 mL controlada termostáticamente (65 °C). Los liposomas se formaron extruyendo 10 veces a través de membranas de policarbonato que tenían poros de 0.1 |jm. Después de la extrusión, los liposomas se enfriaron en hielo. El gradiente electroquímico transmembrana se formó mediante purificación de los liposomas mediante diálisis en tubos de diálisis que tenían un peso molecular límite de 12,000-14,000. Las muestras se dializan frente a HEPES 5 mM, sacarosa al 10 %, pH 6.5 (agitando a 4 °C) en un volumen que es 100 veces mayor que el volumen de la muestra. El dializado se cambió después de 2 h y luego 4 veces más después de 12 h cada una. Se midió la conductividad de la solución de liposomas y fue indistinguible del medio de diálisis ~40 jS/cm.

La concentración de lípidos se determina midiendo el colesterol mediante HPLC usando un HPLC Agilent 1100 con una columna Eclipse XDB-C8 Agilent Zorbax 5 um, 4.6 x 150 mM y una fase móvil de A= 0.1 % de TFA, B= 0.1 % de TFA/ MeOH con una elución isocrática de 99 % de B. El caudal es de 1.0 mL/min, la temperatura de la columna es de 50 °C, inyección de 10 jL y detección por absorbancia a 205 nm. El tiempo de retención del colesterol es de 4.5 min. El tamaño del liposoma se mide mediante dispersión dinámica de luz.

Se disolvió carfilzomib (Selleck Chemicals) en DMSO a una concentración de 10 mg/mL. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en una proporción de carfilzomib a HSPC de 100 g de fármaco/mol de HSPC (proporción de fármaco a lípidos totales (peso/peso) de 0.12). Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10 %, pH 4.0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que después de la adición del fármaco la concentración final de DMSO sea del 2 %. Se agregó carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente, luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 min y luego se agitaron cada 5 min durante un tiempo de calentamiento total de 30 min. Todas las muestras estaban muy turbias cuando se agregó el fármaco y todas se volvieron claras (igual que los liposomas sin fármaco agregado) después de 15 minutos. Después de calentar durante 30 min, todas las muestras se colocaron en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados se agitaron y se mantuvieron 100 jL de muestra como "columna anterior" y el resto se transfirió a tubos de microcentrífuga y se centrifugó a 10,000 RPM durante 5 minutos. Los sobrenadantes se purificaron en una columna Sephadex G25, se recogieron y se analizaron mediante HPLC. El análisis por HPLC de carfilzomib se realizó en el mismo sistema descrito para el análisis de colesterol. La fase móvil consiste en A = 0.1 % de TFA, B = 0.1 % de TFA/MeOH con un gradiente de elución que comienza en 50 % de B y aumenta a 83 % de B en 13 min con 7 min de equilibrio hasta 50 % de B. El caudal es 1.0 mL/min, la temperatura de la columna es 30 °C, inyección de 10 j l y detección por absorbancia a 205 nm. El tiempo de retención de carfilzomib es de 12.2 min. La concentración de lípidos se determina mediante análisis del colesterol mediante HPLC.

Resultados

La carga de liposomas que contenían sulfato de amonio 250 mM dio como resultado una proporción final entre fármaco y lípido de 95.26 ± 3.47 g de fármaco/mol de liposomas HSPC cuando el fármaco se agregó a 100 g de fármaco/mol de lípido HSPC (95.26 ± 3.47 % de eficiencia) y una proporción final entre fármaco y lípido de 136.9 ± 7.35 g de fármaco/mol de liposomas HSPC cuando el fármaco se agregó a 200 g de fármaco/mol de lípido HSPC (67.94 ± 3.67 % de eficiencia) (Figura 2). Esto demuestra que la capacidad de carga de estos liposomas particulares está entre 100 y 200 g de fármaco/mol de fosfolípido. Los liposomas de control que contienen sulfato de sodio 250 mM que no tienen gradiente electroquímico para la carga remota dieron como resultado una carga final de fármaco de 33.28 ± 0.79 y 29.01 ± 0.79 g de fármaco/mol de HSPC cuando el fármaco se agregó en una proporción de 100 y 200 g de fármaco. /mol de HSPC respectivamente. Esto demuestra que la capacidad para cargar estos liposomas se saturó por debajo de 100 g de fármaco/mol de HSPC y con esta proporción de entrada de fármaco los liposomas cargados remotamente exhiben una capacidad de carga > 3 veces mayor. La saturación de la capacidad de carga de fármaco para los liposomas de sulfato de sodio en una proporción al menos 3 veces menor que la de los liposomas de sulfato de amonio indica que cuando no hay gradiente electroquímico presente para la carga remota, el fármaco se divide en la bicapa lipídica pero no forma una sal con el agente de captura interior. La figura 5 ilustra que el precipitado todavía está presente después del procedimiento de carga con liposomas de sulfato de sodio pero no con liposomas de sulfato de amonio.

Conclusión

Los liposomas de idéntica composición y tamaño de matriz lipídica pero que variaban en la composición de la sal de sulfato atrapada internamente tenían capacidades muy diferentes para cargar carfilzomib. El liposoma capaz de generar un gradiente electroquímico (sulfato de amonio) fue capaz de cargar cerca del 100 % del fármaco en condiciones óptimas y el que no pudo crear un gradiente tuvo una eficiencia de carga deficiente, lo que sugiere que la carga remota o activa fue el mecanismo principal para la incorporación de carfilzomib al liposoma.

Ejemplo 2

Comparación de agentes atrapadores de liposomas

Introducción

Los liposomas que se usarán para la carga remota se forman en una solución iónica destinada a formar complejos con el fármaco cargado en forma de sal. Los agentes atrapadores pueden formar complejos con fármacos cargados y la estabilidad de este complejo es un factor que dicta la capacidad de carga, la estabilidad y las tasas de liberación del fármaco en los liposomas. Se realizó una comparación de diferentes agentes atrapadores de liposomas evaluando la eficacia de la carga de carfilzomib.

Métodos

Se usaron tres formulaciones de liposomas, todas en una relación molar de 3 HSPC/2 Chol/0.15 PEG-DSPE, cada una con un agente atrapador diferente: 1. ácido melítico; 2. sulfato de amonio; y 3. ácido naftileno disulfonónico. Se disolvió ácido melítico (MA) en agua y se tituló con dietilamina hasta un pH final de 5.5 y una concentración de 83 mM (500 mequivilentes de anion/L). Se preparó sulfato de amonio disolviendo sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 250 mM (500 mequivilentes de anion/L). No se realizó ningún ajuste de pH para producir un pH final de 5.6.

Se disolvió ácido naftelendisulfónico (NDS) en agua y se tituló con dietilamina hasta un pH final de 8.0 y una concentración de 250 mM (500 mequivilentes de anion/L).

Véase el ejemplo 1, Atrapamiento de liposomas de carfilzomib mediante carga remota para obtener detalles sobre cómo se fabricaron, purificaron y caracterizaron los liposomas.

Para garantizar la eliminación completa del DMSO agregado con carfilzomib, las muestras de carfilzomib liposomal se dializaron en tubos de diálisis que tenían un límite de peso molecular de 12,000-14,000. Las muestras se dializan frente a HEPES 5 mM, sacarosa al 10 %, pH 6.5 (agitando a 4 °C) en un volumen que es 100 veces mayor que el volumen de la muestra. El dializado se cambió después de 2 h y luego 2 veces más después de 12 h cada una. Los liposomas de carfilzomib se analizaron nuevamente para determinar la concentración delo fármaco y lípidos como se describió anteriormente.

Resultados

La eficiencia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a 100 g de fármaco/mol de lípido HSPC para liposomas con los agentes atrapantes ácido melítico, sulfato de amonio y ácido naftalendisulfónico fue 37.4 % ± 2.01 %, 97.0 % ± 2.38 % y 95.1 % ± 1.76. % respectivamente (Figura 3).

Conclusión

La invención descrita aquí permite que la carga remota de carfilzomib desde un precipitado insoluble en liposomas se pueda lograr con diversos usos del gradiente electroquímico generado por diversos agentes atrapadores que incluyen ácido melítico, sulfato de amonio y ácido naftalendisulfónico.

Ejemplo 3

Comparación del método para introducir el fármaco

Método

Una comparación del método usado para la adición del fármaco a los liposomas durante el procedimiento de carga. El procedimiento de carga fue el mismo que el descrito anteriormente en el ejemplo 1 con la excepción de que el fármaco se agrega a la solución de carga de liposomas como un polvo sólido, como una solución de DMSO de 10 mg/mL rápidamente y como una solución de DMSO de 10 mg/mL lentamente.

Resultados

La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a 100 g de fármaco/mol de lípido HSPC para el fármaco que se agregó como polvo sólido fue de 3.88 % ± 0.053 % y 3.47 % ± 0.030 % cuando se calentó a 65 °C, durante 30 y 120 min respectivamente. La eficiencia de cargar el fármaco como una solución de DMSO de 10 mg/mL fue del 97.0 % ± 2.38 % cuando el fármaco/DMSO se agregó rápidamente y del 96.3 % ± 1.09 % cuando el fármaco/DMSO se agregó en 5 incrementos durante 1 min a una solución de liposoma mientras se agita. La mezcla de fármaco/liposoma que resulta de la adición lenta del fármaco es más clara que la mezcla de fármaco/liposoma que resulta de la adición rápida del fármaco. Sin embargo, ambas soluciones no tienen precipitado visible (o precipitado centrífugo a 10,000 rpm durante 5 min) después de calentar a 65 °C, durante 30 min, lo que es el resultado de que todo el fármaco se carga en los liposomas independientemente del precipitado formado tras la adición del fármaco (Figura 4).

Ejemplo 4

Carga de carfilzomib en liposomas a temperatura ambiente

Introducción

La capacidad de cargar un fármaco en liposomas a temperatura ambiente es beneficiosa para reducir la degradación del fármaco inducida por el calor, simplificar la fabricación y permitir la carga de liposomas junto a la cama. El transporte eficaz a través de la membrana del liposoma requiere que la membrana esté en fase fluida. Esto se logra con fosfolípidos saturados que tienen una temperatura de transición de fase alta (T<m>) tal como HSPC (T<m>=55 °C) calentando los liposomas por encima de la T<m>durante el procedimiento de carga. Una alternativa al calentamiento es usar lípidos que estén en fase fluida a temperatura ambiente. La desventaja de estos lípidos es que son inestables en la circulación y provocan una rápida liberación del fármaco. Los lípidos modificados con esterol incorporan una nueva construcción lipídica en la que el colesterol (esterol) está unido covalentemente al grupo principal fosfato. Se ha demostrado que los lípidos modificados con esterol hacen que el esterol no sea intercambiable de la bicapa lipídica en circulación. Los lípidos modificados con esteroles también se encuentran en fase fluida a temperatura ambiente, lo que los hace ideales para la carga a temperatura ambiente de fármacos en liposomas que se usarán para la administración in vivo de productos terapéuticos.

Método

La carga de carfilzomib en liposomas a temperatura ambiente se realizó mediante el uso de dos formulaciones de liposomas compuestas por una relación molar de 95 PChemsPC/5 PEG-DSPE y otra con una relación molar de 3 POPC/2 Chol/0.15 PEG-DSPE que contenía cada una 250 mM. sulfato de amonio como agente atrapador. Los liposomas se prepararon usando el procedimiento, proporción fármaco/liposoma, tampones y pH como se describe en el ejemplo 1. Los liposomas se agitaron a temperatura ambiente (20 °C) y se agregó carfilzomib como una solución de DMSO de 10 mg/mL en 5 incrementos durante 1 min para dar como resultado una solución turbia. La mezcla de liposoma/fármaco se agitó a temperatura ambiente durante un total de 30 minutos para producir una solución transparente con el mismo aspecto que la solución de liposoma antes de agregar el fármaco.

Resultados

La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a 100 g de fármaco/mol de PChemsPC fue del 95.5 % ± 1.23 %. La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a 187 g de fármaco/mol de 3 POPC/2 Chol/0.15 PEG-DSPE fue del 100.52 %. ±1.01 %

Conclusión

La invención descrita aquí no pudo cargar carfilzomib en liposomas agregando la forma cristalina del fármaco directamente a la solución de carga. El fármaco requiere solubilización en algún disolvente antes de agregarlo a la solución de carga a una concentración superior a la solubilidad del fármaco. La eficacia de carga de liposomas del precipitado que se forma tras la adición del fármaco a la solución de carga no depende de la velocidad de adición en este caso usando carfilzomib.

Ejemplo 5

Carga de precipitado del fármaco en liposomas determinada por dispersión de luz a 600 nm.

Introducción

La carga liposomal del fármaco desde un precipitado hacia los liposomas se evidencia por la proporción fármaco-lípido resultante y la clarificación de la solución a medida que el precipitado del fármaco se transfiere al liposoma. Para obtener una medida cuantitativa de la carga de liposomas a partir de un precipitado de fármaco, se midió la dispersión de la luz a 600 nm durante el procedimiento de carga.

Método

Liposomas que contienen sulfato de amonio 250 mM como agente atrapador y sulfato de sodio 250 mM como liposomas de control que no cargarían remotamente el fármaco. Los liposomas se prepararon y cargaron usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 excepto que se usó una cubeta de poliestireno desechable como recipiente de reacción. La dispersión de la luz a 600 nm se midió con un espectrofotómetro UV/vis durante el procedimiento de carga.

Resultados/Conclusión

Los liposomas de sulfato de sodio no muestran ninguna clarificación del precipitado durante el procedimiento de carga, lo que indica que el fármaco no se está cargando de forma remota en los liposomas. (véase la figura 5). Los liposomas de sulfato de amonio cargan eficazmente el fármaco, lo que da como resultado la clarificación de la solución en 15 minutos.

Ejemplo 6

Confirmación de la liberación de fármacos a partir de liposomas cargados de forma remota

Introducción

Se usó un gradiente inverso para intentar liberar el fármaco activo desde el interior del liposoma. La teoría es que si un fármaco puede liberarse desde el interior de un liposoma con un gradiente inverso, existe una alta probabilidad de que se produzca la liberación del fármacoin vivo.

Método

Los liposomas se cargaron con carfilzomib como se describe en el ejemplo 1 y se purificaron en agua desionizada. La muestra se dividió en dos alícuotas. A la primera alícuota se agregó Hepes concentrado a pH 7.4 y NaCl de modo que la concentración final fuera Hepes 5 mM, NaCl (HBS) 145 mM. A la segunda alícuota se agregó sulfato de amonio concentrado de modo que la concentración final fuera de 250 mM. Inicialmente no se observaron cambios físicos obvios. Luego las muestras se calentaron a 65 °C, durante 30 min. Las muestras se transfirieron a tubos eppendorf limpios y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se separaron los sobrenadantes y los precipitados y se analizó el contenido de carfilzomib mediante un ensayo de HPLC. El fármaco liberado precipitó, el fármaco encapsulado en liposomas permaneció en el sobrenadante. El % de carfilzomib liberado se calculó mediante

Cantidad del fármaco en el precipitado

% de Liberación= -----------------------------------------------------------Cantidad total del fármaco

Resultados

Tabla 2. La liberación de fármacos dirigida por gradiente inverso desde los liposomas.

El fármaco liberado que usa el gradiente inverso es 6.5 veces mayor que el fármaco liberado desde el control sin gradiente inverso (Tabla 2). El cromatograma de HPLC del fármaco liberado fue idéntico al material de partida, lo que indica que no se había producido degradación de carfilzomib (Figura 7). El tiempo de retención de HPLC para la solución madre de carfilzomib fue de 12.2 min y el tiempo de retención para el carfilzomib que se liberó del liposoma cargado remotamente fue de 12.3 min, como se muestra en la figura 6. Estos dos tiempos de separaciones están dentro de la variabilidad del sistema HPLC y no son estadísticamente diferentes entre sí.

Conclusión

Se liberó carfilzomib del liposoma usando un gradiente inverso para producir la molécula original como lo indica el análisis de HPLC.

Ejemplo 7

Carga de carfilzomib en función del contenido de DMSO

Introducción

La forma física del fármaco cuando se agrega a los liposomas es importante para la eficacia de la carga, es decir, cuando se agrega como polvo seco casi no se observa carga, pero la adición usando una solución predisuelta en un disolvente aprótico puede conducir a una alta eficacia de atrapamiento. Este estudio analiza el efecto de la concentración de disolvente aprótico sobre la eficiencia de carga del fármaco de carfilzomib.

Método

Los liposomas que contenían sulfato de amonio se diluyeron en agente regulador de sacarosa de ácido cítrico 50 mM (10 % peso/peso), pH 4.0 a fosfolípido 1 mM. Se agregaron diversas cantidades de DMSO de modo que cuando se agregaron 20o |jg de fármaco de una solución de carfilzomib de 10 mg/mL en DMSO, la concentración final de DMSO osciló entre 1 y 10 % v/v.

Tabla 2. La eficiencia de carga de la liberación de fármaco dirigida por gradiente inverso desde los liposomas oscila entre el 74 % y el 94 %, observándose eficiencias más altas a concentraciones más altas de DMSO (Figura 7). Cabe señalar que se observaron precipitados del fármaco en todas las muestras antes de que comenzara la carga, lo que sugiere que las concentraciones de DMSO usadas aquí están por debajo de la concentración mínima requerida para solubilizar eficazmente carfilzomib en la concentración del fármaco usada (0.2 mg/mL).

Conclusiones

La introducción de carfilzomib presolubilizado es necesaria para una carga remota eficiente. Sin embargo, por encima del 1 % de DMSO hay un cambio relativamente pequeño en la eficiencia de carga, hasta un 10 %.

Ejemplo 8

Solubilidad de carfilzomib en función del contenido de DMSO

Introducción

En las condiciones descritas anteriormente, el carfilzomib se solubiliza en DMSO antes de diluirse en una solución agente regulador de liposomas antes de la carga. Luego precipita inmediatamente antes de la carga remota. Este estudio está diseñado para determinar la concentración de DMSO necesaria para solubilizar eficazmente carfilzomib a temperatura ambiente y a la temperatura requerida para la carga de liposomas en liposomas compuestos de lípidos de alta Tm (65 °C).

Método

Se agregó carfilzomib desde una solución madre de 10 mg/mL en DMSO a 1 mL de una mezcla de ácido cítrico/DMSO de modo que la composición de DMSO fuera del 2 %, 25 %, 50 %, 75 % y 100 %. La concentración final del fármaco fue de 0.2 mg/mL. Las soluciones se prepararon y se midió la densidad óptica a 600 nm. La densidad óptica a 600 nm es una buena medida de qué tan turbio o cuánto material de dispersión (tal como precipitados de fármacos) hay en una solución; generalmente, cuanto más precipitados, mayor es la absorbancia. De la figura 8 es evidente que a concentraciones de DMSO inferiores al 50 % vol/vol (25 °C) y al 25 % vol/vol (65 °C), el fármaco permanece en forma precipitada. Sólo cuando se aumenta la concentración de DMSO se solubiliza eficazmente a esta concentración de 0.2 mg/mL.

Para probar la integridad de los liposomas en DMSO al 25 %, se intentó cargar de forma remota los fármacos de base débil solubles en agua doxorrubicina y 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) y los comparamos con la misma carga sin DMSO. Se descubrió que la eficiencia de carga se vio afectada negativamente (Tabla 3).

Resultados

Con 0.2 mg/mL de carfilzomib, el fármaco precipita y los agregados son lo suficientemente grandes como para provocar una señal de dispersión de luz a 600 nm. A medida que aumenta el % de DMSO, la señal se reduce e indica la solubilización del fármaco. Se observó que se requiere >25 % vol/vol de DMSO para disolver completamente el fármaco a 0.2 mg/mL a una temperatura de 65 °C.

Tabla 3. Comparación de carga remota de doxorrubicina y 17-DMAG en liposomas que contienen sulfato de amonio en presencia y ausencia de DMSO al 25 %.

Conclusiones

Estudios anteriores de carga de carfilzomib se realizaron usando DMSO al 10 % v/v o menos y los resultados de dispersión de luz anteriores muestran que la gran mayoría del fármaco en estas condiciones se encuentra en forma precipitada en las concentraciones usadas. Agregar suficiente disolvente aprótico para solubilizar completamente el fármaco (es decir, más del 25 % de DMSO a 65 °C) tiene un impacto negativo en la carga de liposomas de fármacos anfipáticos de base débil, lo que indica inestabilidad del liposoma causada por fuga de contenido o disipación de gradiente electroquímico, por ejemplo. En condiciones que mantienen una buena estabilidad de los liposomas, no hemos encontrado una concentración de DMSO que solubilice completamente el carfilzomib o, alternativamente, no hemos encontrado condiciones usando DMSO en las que simultáneamente el fármaco se solubilice completamente y los liposomas no se desestabilicen adversamente.

Ejemplo 9

Efecto del retraso en la carga de liposomas de carfilzomib después de que se forma el precipitado del fármaco

Introducción

La invención descrita en esta solicitud permite cargar un precipitado de fármaco insoluble en liposomas. El Ejemplo 9 evalúa el efecto del tiempo entre la formación del precipitado del fármaco y el momento en que se carga en los liposomas.

Procedimiento

Los liposomas se prepararon a partir de la misma composición y métodos descritos en el ejemplo 1.

Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/mL y se agregó hasta una concentración final de 2 % (v/v) a citrato 50 mM, 10 % de sacarosa a pH 3.5 que no contenía liposomas. Tras la adición del fármaco al agente regulador citrato se formó un precipitado. Los liposomas para la carga se agregaron a la solución que contenía el precipitado del fármaco inmediatamente después de la formación, después de un retraso de 1 h o después de un retraso de 12 h y luego el precipitado se cargó en los liposomas usando las condiciones de carga descritas en el ejemplo 1.

Resultados/Conclusión

El tiempo entre la formación del precipitado del fármaco y la carga del precipitado no tiene un impacto significativo en la eficiencia del procedimiento de carga de liposomas para carfilzomib incluso si el tiempo de retraso es de hasta 12 h.

Ejemplo 10

Efecto de la carga útil del fármaco liposomado sobre la eficiencia del carfilzomib cargado a partir del precipitado

Procedimiento

Los liposomas se prepararon a partir de la misma composición y métodos descritos en Comparación de agentes atrapadores excepto que la concentración de agente de captura interna de sulfato de amonio fue de 250 mM o 500 mM.

Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/mL. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en proporciones de carfilzomib a HSPC de 91.8, 167, 251, 338 y 433 g de fármaco/mol de HSPC para los liposomas que tenían sulfato de amonio 250 mM como agente atrapador y 451, 546, 639 y 759 g. fármaco/mol HSPC para los liposomas que tienen sulfato de amonio 500 mM como agente atrapador. Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10 %, pH 4.0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que después de la adición del fármaco la concentración final de DMSO sea del 10 %. Se agregó carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente, luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 min y luego se agitaron cada 5 min durante un tiempo de calentamiento total de 30 min. Todas las muestras estaban muy turbias cuando se agregó el fármaco y todas se volvieron claras (igual que los liposomas sin fármaco agregado) después de 15 minutos. Después de calentar durante 30 min, todas las muestras se colocaron en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados se purificaron y analizaron como se describe en el ejemplo 1.

Resultados/Conclusión

La carga útil del fármaco resultante aumenta a medida que aumentan las proporciones de fármaco a lípidos de entrada del liposoma en la solución de carga. La eficiencia es mayor con la proporción de entrada más baja usada para cada concentración diferente de agente atrapador de sulfato de amonio. Usando las condiciones descritas en este ejemplo, se puede cargar carfilzomib en liposomas a partir de un precipitado insoluble hasta una carga útil final del fármaco de 469 ± 4.9 g de fármaco/mol HSPC (relación en peso de lípidos totales fármaco/portador de 0.4) con una eficiencia de 61.7 ± 1.2%.

Ejemplo 11

Carga de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio

Introducción

La carga remota de fármacos en liposomas se realiza habitualmente mediante un gradiente de sulfato de amonio. Algunas moléculas de fármaco, incluido el ejemplo carfilzomib usado aquí, tienen un grupo epóxido que es necesario para su actividad. El epóxido de estos fármacos es potencialmente susceptible a la aminolisis debido al amoníaco restante que se usa en la carga remota de sulfato de amonio. En este ejemplo 11, el sulfato de amonio se reemplaza con un agente de carga remota de sulfato de trietilamonio para eliminar reacciones potenciales de amoníaco/epóxido mediante la sustitución con trietilamina no reactiva.

Métodos

Los liposomas se prepararon usando las mismas composiciones y procedimiento que se describen en atrapamiento de liposomas de carfilzomib mediante carga remota con la siguiente excepción de que se usó sulfato de trietilamonio 50 mM como agente atrapador. Se preparó sulfato de trietilamonio valorando ácido sulfúrico 1 M con trietilamina hasta un pH final de 7.3 y una concentración de sulfato de 500 mM.

Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/mL. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en proporciones de carfilzomib a HSPC de 650 g de fármaco/mol de HSPC. Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10 %, pH 4.0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que después de la adición del fármaco la concentración final de DMSO sea del 10 %. Se agregó carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente, luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 minutos y luego se agitaron cada 5 minutos. Se extrajo una muestra de la mezcla de carga a los 10, 20, 30 y 40 min durante el procedimiento de carga y se colocó en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados se agitaron y se mantuvieron 100 pL de muestra como "columna anterior" y el resto se transfirió a tubos de microcentrífuga y se centrifugó a 10,000 RPM durante 5 minutos. Los sobrenadantes se purificaron en una columna Sephadex G25, se recogieron y se analizaron mediante HPLC. Los sedimentos del precipitado del fármaco se disolvieron en DMSO/MeOH (10:1) y se analizaron mediante HPLC.

Resultados/Conclusión

La carga de un precipitado de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio da como resultado liposomas similares a los producidos usando un gradiente de sulfato de amonio (Ejemplo 1). La figura 12 ilustra la dependencia del tiempo de la carga de liposomas, que comienza rápidamente a los 10 min. La mayor carga útil alcanzada fue de 440 ± 12.6 g de fármaco/mol HSPC (eficiencia de 65.9 ± 1.98 %) a los 30 min. Este resultado usando trietilamina 500 mM como agente atrapador en proporciones de fármaco a HSPC de 650 g de fármaco/mol HSPC es muy similar al que usa sulfato de amonio 500 mM como agente atrapador en proporciones de fármaco a HSPC de 639 g de fármaco/mol HSPC, lo que resultó en una proporción final de fármaco a lípidos de 440 ± 10.2 g de fármaco/mol HSPC (eficiencia de 68.7 ± 4.80 %).

El precipitado del fármaco insoluble en el exterior del liposoma se transfiere (se carga de forma remota) al interior del liposoma, lo que indica una reducción en la cantidad de precipitado en la mezcla durante el transcurso del procedimiento de carga. La figura 12 muestra que la mayor reducción en el precipitado extraliposomal ocurre entre 0 10 minutos, lo que corresponde a la carga del precipitado en los liposomas como se ve en la figura 13.

Ejemplo 12

Carga de otro fármaco escasamente soluble a partir de un precipitado

Introducción

Otro fármaco, el aripiprazol, está formulado con sulfobutil ciclodextrano (SBCD) y se usa para tratar los trastornos bipolares y la esquizofrenia (Abilify, Pfizer). El fármaco es muy insoluble en agua y cuando se agrega a una suspensión de liposomas, se observan inmediatamente finos precipitados.

Se probó si el aripiprazol se cargara remotamente en condiciones similares descritas anteriormente para carfilzomib.

Método

Se diluyeron liposomas (HSPC/Chol/PEG-DSPE 3/2/0.15 mol/mol/mol) que contenían sulfato de amonio 250 mM o sulfato de sodio 250 mM en 1 mL de ácido cítrico 50 mM, sacarosa al 10 % (peso/peso), pH 4.0 hasta una concentración de fosfolípido 6 mM. Se agregaron 0.3 mg de aripiprazol a partir de una solución madre de 15 mg/mL en DMSO, de modo que la concentración final de DMSO fue del 2 % (v/v). Se observaron precipitados finos inmediatamente después de agregar el fármaco a ambas muestras de liposomas. Las muestras se calentaron a 65 °C, durante 30 minutos y luego se enfriaron en hielo. Las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de polietersulfona de 0.2 pm para eliminar cualquier precipitado de fármaco, seguido de purificación en una columna Sephadex G25 equilibrada con HBS, pH 6.5 para eliminar cualquier fármaco extraliposomal soluble. La fracción turbia se recogió y se analizó en busca de lípidos y fármacos como se describe anteriormente.

Resultados

Tabla 5. Resultados de la carga de aripiprazol en liposomas que contienen sulfato de amonio y sodio.

Se encontró que los liposomas que contenían sulfato de amonio cargaban aproximadamente el 85%del fármaco, mientras que la carga en los liposomas de sulfato de sodio era inferior al 2 %, con un aumento desde aproximadamente 50 veces en la carga atribuible a la capacidad de los liposomas de sulfato de amonio para facilitar la carga remota. (Tabla 5).

El ariprazol, cuando se introdujo en la solución de liposomas en forma de un complejo SBCD (del producto farmacéutico Abilify) dio una eficiencia de carga del 68 % en las mismas concentraciones y condiciones de carga (Figura 14).

Conclusión

Este es otro ejemplo de un fármaco poco soluble, que se puede cargar de forma remota en liposomas usando el enfoque descrito anteriormente y proporciona una carga ligeramente mejor que si el fármaco se introdujera como un complejo SBDC.

Ejemplo 13

Carga de fármaco escasamente soluble a partir de precipitados elaborados diluyendo varias soluciones de disolventes farmacológicos en una solución de liposomas

Este ejemplo describe una técnica para cargar de forma remota fármacos poco solubles en liposomas que comienza con la disolución del fármaco en un agente solubilizante que inicialmente forma precipitados del fármaco cuando se agrega a una solución acuosa de liposomas. Después de un tiempo de incubación, el fármaco ingresa al liposoma en respuesta a un gradiente electroquímico y se acumula en el núcleo del liposoma. Los disolventes que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, 1 -metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, éter monometílico de etilenglicol, éter monometílico de dietilenglicol, polietilenglicol.

Método

El aripiprazol se disolvió en una variedad de disolventes indicados a continuación a 4 mg/mL. Se usaron liposomas compuestos de HSPC/Chol/PEG-DSPE (3/2/0.15 mol/mol/mol) que se prepararon en sulfato de amonio 250 mM y se diluyeron a 6 mM en sacarosa regulada con Hepes al 10 % (peso/peso) (HBSuc pH 6.5). Se introdujeron 0.3 mg de fármaco mediante la adición lenta de cada disolvente mientras se agitaba. La concentración final de disolvente fue del 7.5 % para todas las muestras. Como controles, se agregó el fármaco de cada disolvente al mismo volumen de HBSuc pH 6.5 sin los liposomas. Las muestras se calentaron a 65 °C, durante 30 minutos y luego se enfriaron en hielo. Después de alcanzar nuevamente la temperatura ambiente, se midió la absorbancia de las muestras a 600 nm (espectrómetro Cary 100 Bio UV-Vis) y los valores se muestran a continuación (Figura 15).

Resultados

Todas las soluciones sin liposomas se volvieron extremadamente turbias o se produjo una gran precipitación y sedimentación (especialmente en el caso de metanol y 1-butanol). Algunas de las muestras de liposomas también estaban muy turbias, pero algunas aclararon el precipitado del fármaco de acuerdo con resultados anteriores que indicaban que se había producido la carga del precipitado del fármaco (es decir, en los casos en los que el fármaco se disolvió inicialmente en DMSO, 1-4-metilpirrolidona, dietilenmonoetiléter o polietilenglicol (MW400), véase la figura 15.

Ejemplo 14

Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato

La carga remota de deferasirox en liposomas que contienen acetato de calcio demuestra el uso de un gradiente de acetato para cargar un agente quelante de hierro. La carga remota en gradiente de acetato de calcio difiere de la carga remota de sulfato de amonio en que la molécula del fármaco que se carga debe tener un carboxilato (o hidroxamato) en lugar de una amina. Se sabe que el deferasirox tiene una toxicidad renal significativa y la administración de liposomas es una técnica para reducir la toxicidad renal.

Método

La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato se realiza de la misma manera que la carga con acetato de carboxifluorosceína soluble y ácido nalidíxico por Clerc y Barenholtz 1995 (PMID 8541297). Los liposomas se preparan como se describe en el ejemplo 1 pero en este caso los liposomas se extruyen en una solución de acetato de calcio 120 mM a pH 8. El gradiente de acetato se forma intercambiando el medio externo por sulfato de sodio 120 mM a pH 6,0. El deferasirox se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/mL y se agrega a la suspensión de liposomas donde forma un precipitado. El precipitado se carga en los liposomas calentándolo a 65 °C, durante 1 h y la purificación y el análisis se realizan como se describe en el ejemplo 1.

Resultados

El deferasirox forma un precipitado cuando se diluye a partir de una solución madre de DMSO de 10 mg/ml hasta una concentración de 1 mg/ml en la suspensión de carga de liposomas debido a su escasa solubilidad en agua (~0.038 mg/mL). El precipitado de deferasirox insoluble se carga en los liposomas usando un gradiente de acetato de calcio con una eficacia al menos 5 veces mayor que la que se carga en los liposomas de control que contienen sulfato de sodio y ningún gradiente de acetato.

La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en el liposoma proporciona un ejemplo del uso de un gradiente de acetato para cargar remotamente un fármaco carboxilato a partir de un precipitado. En este ejemplo, el fármaco que se carga es un agente quelante, en particular un agente quelante del hierro. La carga 5 veces mayor en los liposomas que tienen un gradiente de acetato respecto a los liposomas de control indica que la mayor parte del deferasirox está cargado remotamente en lugar de intercalado en la bicapa lipídica.

Ejemplo 15

Introducción

Un objetivo de la administración liposomal de carfilzomib es proteger el fármaco de la degradación y eliminación que requería que el fármaco se retuviera dentro del liposoma. Una técnica para evaluar la retención del fármaco dentro del liposoma y, de este modo, los beneficios obtenidos de la administración del liposoma, es medir la farmacocinética del fármaco en ratones. Las formulaciones estables con mayor retención del fármaco dentro del liposoma darán como resultado una mayor concentración de fármaco no metabolizado en plasma de ratón en comparación con formulaciones menos estables o fármacos no encapsulados.

Materiales y métodos

Se formaron, purificaron y cargaron fármacos de liposomas de 100 nm compuestos por HSPC/colesterol/PEG-DSPE (60/40/5 mol/mol/mol) y esfingomielina/colesterol/PEG-DSPE (55/45/2,8, mol/mol/mol) y cargaron con fármaco carfilzomib usando los métodos descritos en el ejemplo 1. Los agentes atrapadores usados para cargar carfilzomib de forma remota fueron sulfato de trietilamonio dextrano (1.0 M SO<4>) o sacaroseoctasulfato de trietilamonio (1.0 M SO<4>). Los liposomas cargados con fármaco se purificaron mediante filtración de flujo tangencial con intercambio de agente regulador en HBS, pH 6.5. Los liposomas se filtraron de forma estéril a través de filtros de polietersulfona de 0.2 pm y se analizó el contenido de carfilzomib y lípidos como se describe en el ejemplo 1. Se calcularon la proporción fármacolípido, la concentración del fármaco y la eficiencia de carga y los resultados se muestran en la tabla 6.

Resultados.

Tabla 6. Concentración de carfilzomib en plasma de ratón después de administración IV de formulaciones de liposomas.

Además, se examinó la farmacocinética de carfilzomib encapsulado en las formulaciones de liposomas en ratones macho CD1. Los ratones recibieron una dosis de 5 mg/kg de carfilzomib mediante inyección intravenosa en bolo a través de la vena de la cola usando 3 ratones por formulación. A las 4 h, los ratones se sacrificaron y se recogió plasma mediante centrifugación de la sangre. Se mezclaron 0.1 mL de plasma con 0.2 mL de metanol, se mezclaron bien y se midió la concentración de carfilzomib mediante HPLC como se describe en el ejemplo 1. La eficiencia de carga, la proporción fármaco/lípido y el porcentaje de la dosis inyectada que permanece en el plasma 4 horas después de una inyección en la vena de la cola del liposoma carfilzomib (% ID @ 4 h) se muestran en la tabla 6. Si bien no se hizo ningún esfuerzo para distinguir entre fármacos no atrapados en liposomas y fármacos atrapados en liposomas en el plasma, ya que nuestro análisis mide el contenido total del fármaco, suponemos que la mayor parte del carfilzomib medido está atrapado en liposomas porque el fármaco se elimina muy rápidamente en el torrente sanguíneo (t-i/2 < 20 minutos) (Yang et al 2011, Drug Metab Dispos. 2011 Oct;39(10):1873-82). Se observó un intervalo de retención del fármaco de 100 veces del 0.65 % al 66.3 % ID, dependiendo de la composición de la formulación del liposoma. El liposoma más estable probado estaba basado en esfingomielina y contenía una solución interna de sulfato de dextrano de amonio. Los liposomas descritos anteriormente aumentaron la retención plasmática de carfilzomib de 46 a 4735 veces más que una formulación de SBCD, o de 5 a 510 veces más que las formulaciones de liposomas publicadas a las 4 h después de la administración. (Chu et al 2012 AAPS Meeting, Poster T2082).

Ejemplo 16

Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato

Introducción

La carga remota de deferasirox (DFX) en liposomas que contienen acetato de calcio demuestra el uso de un gradiente de acetato para cargar un agente quelante de hierro. La carga remota en gradiente de acetato de calcio difiere de la carga remota de sulfato de amonio en que la molécula del fármaco que se carga debe tener un carboxilato (o hidroxamato) en lugar de una amina. Se sabe que el deferasirox tiene una toxicidad renal significativa y la administración de liposomas es una técnica para reducir la toxicidad renal.

Método

Los liposomas se prepararon usando el método de extrusión y purificación descrito en el ejemplo 1. La composición lipídica fue HSPC/colesterol (3/0.5, mol/mol) o POPC/colesterol (3/0.5, mol/mol). El agente atrapador consistió en acetato de calcio o sulfato de sodio, cada uno en una concentración de 120 mM. Se agregó lentamente una solución de DFX en DMSO a 20 mg/mL a la solución de liposomas durante 30 segundos mientras se agitaba para producir un precipitado de fármaco en la solución de liposomas. La proporción fármaco diana/fosfolípido fue 100 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 minutos (a 45 °C para liposomas POPC y 65 °C para liposomas HSPC) y luego se enfrió en hielo. Se extrajo una muestra para determinar la proporción entre fármaco y lípidos y la solución restante se hizo girar en una centrífuga a 12,000 RpM durante 5 minutos para peletizar cualquier fármaco descargado. El sobrenadante se purificó adicionalmente a partir del fármaco descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25 eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6.5. Los liposomas purificados se analizan para determinar el contenido de fármaco y lípidos mediante HPLC usando el sistema descrito en el ejemplo 1 y un programa que consiste en elución en gradiente de 65 % de B a 98 % de B en 6 min con 5 min de equilibrio de regreso al 65 % de B (A = 0.1 % de TFA, B= 0.1 % de TFA/MeOH, 1.0 mL/min), temperatura de la columna mantenida constante a 30 °C, inyección de 10 ul y detección por absorbancia a 254 nm.

Resultados

Tras la adición del fármaco en DMSO a los liposomas que contenían acetato de calcio como agente atrapador, la solución de liposomas POPC estaba menos turbia que la solución de liposomas HSPC; ambos contenían fármaco precipitado antes de la carga. Después de calentar, las soluciones se aclararon y aparecieron como liposomas sin precipitado de fármaco. Los liposomas que contenían sulfato de sodio como agente atrapador de control nunca se aclararon durante el procedimiento de calentamiento y se formó un precipitado de fármaco tras la centrifugación. La carga de liposomas que contienen acetato de calcio elaborado a partir de POPC y HSPC fue muy eficaz. Ambos liposomas que contenían el atrapador de acetato de calcio dieron como resultado una eficiencia de carga >90 %. Los liposomas que contienen sulfato de sodio dieron como resultado una eficiencia de carga del 3.3 %, lo que indica que la carga de DFX en liposomas de acetato de calcio no es pasiva sino que puede describirse como carga remota. Los resultados de la carga de DFX se muestran en la tabla 7 (Figura 16).

Tabla 7. Eficiencia de carga de DFX en liposomas de acetato de calcio 2

Conclusión

La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en el liposoma proporciona un ejemplo del uso de un gradiente de acetato para cargar remotamente un fármaco carboxilato a partir de un precipitado. En este ejemplo, el fármaco cargado era un agente quelante, en particular un agente quelante de hierro. La carga 28 veces mayor en los liposomas que tienen un gradiente de acetato respecto a los liposomas de control indica que la mayor parte del deferasirox está cargado remotamente en lugar de intercalado en la bicapa lipídica.

Ejemplo 17

Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas. Evaluación de la proporción fármaco-lípido y la concentración del agente atrapador de acetato de calcio.

Introducción

La capacidad de carga remota de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio se evaluó usando diferentes concentraciones de acetato de calcio en el interior del liposoma y cargando una variedad de diferentes proporciones de DFX a lípidos.

Método

Los liposomas se prepararon usando el método de extrusión y purificación descrito en el ejemplo 1. La composición lipídica fue POPC/colesterol (3/0.5, mol/mol). El agente atrapador consistió en acetato de calcio 120 mM, 250 mM o 500 mM. Se agregó lentamente una solución de DFX en d Ms O a 20 mg/mL a la solución de liposomas durante 30 segundos mientras se agitaba para producir un precipitado de fármaco en la solución de liposomas. La proporción fármaco diana/fosfolípido fue 100, 200 o 300 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 min a 45 °C y luego se enfrió en hielo. Se extrajo una muestra para determinar la proporción entre fármaco y lípidos y la solución restante se hizo girar en una centrífuga a 12,000 RPM durante 5 minutos para sedimentar cualquier fármaco descargado. El sobrenadante se purificó adicionalmente a partir del fármaco descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25 eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6.5. Los liposomas purificados se analizan para determinar el contenido de fármaco y lípidos mediante HPLC como se describe en el ejemplo 16.

Resultados

Tras la adición del fármaco en DMSO a los liposomas que contienen acetato de calcio como agente atrapador, el DFX forma un precipitado antes de la carga. Después de calentar, las soluciones se aclaran y parecen liposomas sin precipitado de fármaco. La carga máxima de fármaco fue mayor para los liposomas que contenían acetato de calcio 250 y 500 mM en comparación con acetato de calcio 120 mM. La carga y eficiencia máximas del fármaco se lograron con una entrada de 200 g de DFX/mol de fosfolípido para liposomas que contenían ya sea acetato de calcio 250 mM o acetato de calcio 500 mM. La eficiencia de carga para una diana de 100 g de DFX/mol de fosfolípido osciló entre 99.2 a 103 % para las tres concentraciones de acetato de calcio interno. Cuando la carga de fármaco diana se aumentó a 200 g de DFX/mol de fosfolípido, la eficacia de los liposomas que tenían 250 o 500 mM de acetato de calcio interno fue al menos dos veces mayor que la de los liposomas que tenían una concentración de acetato de calcio interno de 120 mM. La capacidad de los tres liposomas se superó con una entrada de 300 g de DFX/mol de fosfolípido, lo que dio como resultado una eficiencia de n <24 %. Los resultados se muestran en la figura 17.

Conclusión

La capacidad de carga útil del fármaco de DFX cuando se carga de forma remota en liposomas se puede aumentar sustancialmente aumentando la concentración del agente atrapador dentro del liposoma. Este ejemplo demuestra la dependencia de la capacidad de carga de la concentración del agente atrapador de acetato de calcio. Este ejemplo también demuestra que la carga de liposomas DFX puede tener una proporción óptima entre fármaco y lípidos donde la eficiencia y la carga de fármaco son mayores. La proporción fármaco-lípido lograda permite que el DFX se administre a un animal usando una dosis tolerada de lípidos.

Ejemplo 18

Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas. Evaluación del agente atrapador.

La capacidad de carga remota de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio, acetato de magnesio y acetato de zinc se evaluó preparando liposomas con diferentes agentes atrapadores en el interior y cargando una variedad de diferentes proporciones de DFX a lípidos.

Método

Los liposomas se prepararon usando el método de extrusión y purificación descrito en el ejemplo 1. La composición lipídica fue POPC/colesterol (3/0.5, mol/mol). El agente atrapador consistió en acetato de calcio, acetato de magnesio o acetato de zinc a 120 mM. Se agregó lentamente una solución de DFX en DMSO a 20 mg/mL a la solución de liposomas durante 30 segundos mientras se agitaba para producir un precipitado de fármaco en la solución de liposomas. La proporción fármaco diana/fosfolípido fue 100, 150 o 200 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 min a 45 °C y luego se enfrió en hielo. Se extrajo una muestra para determinar la proporción entre fármaco y lípidos y la solución restante se hizo girar en una centrífuga a 12,000 RPM durante 5 minutos para peletizar cualquier fármaco descargado. El sobrenadante se purificó adicionalmente a partir del fármaco descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25 eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6.5. Los liposomas purificados se analizan para determinar el contenido de fármaco y lípidos mediante HPLC como se describe en el ejemplo 16.

Resultados

Tras la adición del fármaco en DMSO a los liposomas, el DFX forma un precipitado antes de la carga. Después del calentamiento, las soluciones que contenían liposomas con acetato de calcio y acetato de magnesio se volvieron mucho menos turbias que los liposomas que contenían acetato de zinc como agente atrapador. La carga máxima de fármaco fue la más alta para los liposomas que contenían magnesio, la segunda más alta para los liposomas que contenían acetato de calcio y los liposomas que contenían acetato de zinc dieron como resultado la carga útil de fármaco más baja. La eficiencia de carga para una diana de 100 g de DFX/mol de fosfolípido fue de 5.3 ± 0.07 % usando acetato de zinc, mientras que la eficiencia usando acetato de calcio o acetato de magnesio fue de 97.6 ± 0.41 % y 99.2 ± 2.42 %, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 18.

Conclusión

La capacidad de carga útil del fármaco de DFX cuando se carga remotamente en liposomas puede depender de la sal metálica particular de acetato usada para la carga remota. Este ejemplo demuestra que el acetato de magnesio es un mejor agente atrapador para DFX que el acetato de calcio o el acetato de zinc, y ambos son agentes atrapadores muy superiores al acetato de zinc.

Ejemplo 19

Introducción

El agente de carga y la composición de los liposomas influyen en la eficacia con la que se pueden preparar las formulaciones de liposomas que contienen carfilzomib y en la capacidad de propiedades farmacocinéticasin vivode los liposomas.

Materiales y métodos

Se formaron, purificaron y cargaron con el fármaco carfilzomib liposomas de 100 nm compuestos por HSPC/colesterol/PEG-DSPE (60/40/5 mol/mol/mol) y esfingomielina/colesterol/PEG-DSPE (55/45/2,8, mol/mol/mol) usando los métodos descritos en el ejemplo 1. Los agentes atrapadores usados para cargar carfilzomib de forma remota fueron ácido cítrico 0.65 M, citrato de trietilamonio 0.65, acetato melítico de trietilamonio 0.33 M y disulfato de naftaleno de trietilamonio (SO4 1.0 M). Los liposomas cargados con fármaco se purificaron mediante diálisis con intercambio de agente regulador en HBS, pH 6.5. Los liposomas se filtraron de forma estéril a través de filtros de polietersulfona de 0.2 pm y se analizó el contenido de carfilzomib y lípidos como se describe en el ejemplo 1. Se calcularon la proporción fármaco-lípido, la eficiencia de carga y el porcentaje de dosis inyectada restante en plasma 4 h después de una inyección en la cola en un ratón (% ID @ 4 h) y los resultados se muestran en la Tabla 8.

Resultados.

Tabla 8. Resultados de carga de liposomas de carfilzomib y concentración en plasma de ratón después de la administración IV de formulaciones de liposomas.

Tras la adición del fármaco en DMSO a los liposomas, el carfilzomib forma un precipitado antes de la carga. Después del calentamiento, las formulaciones 1-3 en la Tabla 8 mostraron un aumento en la turbidez debido a grandes agregados en la mezcla de carga remota que no permitieron la purificación de los liposomas. La formulación 4 de la Tabla 8 se volvió menos turbia después del calentamiento y dio como resultado una eficiencia de carga de 85.7 ± 4.67 %. Se evaluó la retención del fármaco en plasma de la formulación 4 de la Tabla 8 cuatro horas después de la inyección intravenosa en ratones. Cuatro horas después de la inyección, no había carfilzomib detectable en el plasma. Esto debe contrastarse con los resultados de la tabla 6, donde las cuatro formulaciones tenían cantidades mensurables y significativas de carfilzomib en plasma cuatro horas después de la inyección.

Conclusión

A partir de la inspección de los datos de las tablas 6 y 8, queda claro que la optimización de la formulación de liposomas para la retención de carfilzomib en plasma después de la inyección intravenosa en ratones requiere: control preciso de la composición de liposomas y la encapsulación del agente de carga remota apropiado. Formulaciones basadas en el ampliamente usado Doxil® aprobado por la FDA. El producto fue inferior a la composición lipídica óptima de SM/Chol/PEG-DSPE (55/45/2.8). Se encapsuló la sal de amina de sulfato de dextrano.

Las descripciones anteriores de realizaciones específicas de la presente invención se han presentado con fines de ilustración y descripción.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica que comprende un agente escasamente soluble en agua encapsulado dentro de un liposoma, dicha formulación fabricada mediante un método que comprende:

cargar remotamente un precipitado de un agente activo sólido a través de membranas liposomales de liposomas, en un medio acuoso interno de los liposomas, a partir de una suspensión acuosa que comprende el precipitado del agente activo sólido y los liposomas, teniendo el agente activo sólido una solubilidad en agua menor que 2 mg/mL, comprendiendo el método:

(a) preparar una suspensión acuosa de los liposomas que tienen un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma;

(b) preparar un precipitado del agente activo sólido; y

(c) formar una suspensión de carga de (a) y (b), e incubar la suspensión de carga, cargando así remotamente el precipitado del agente activo sólido a través de la membrana liposomal en el medio acuoso interno de los liposomas mediante un gradiente de protones o iones transmembrana, formando una suspensión de liposomas de producto que encapsulan el precipitado del agente sólido.

2. La formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que al menos aproximadamente el 70 % del agente activo sólido escasamente soluble en agua en la suspensión de carga se carga de forma remota en el liposoma.

3. La formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que los liposomas tienen un tamaño desde aproximadamente 30 nanómetros a aproximadamente 40 micrómetros.

4. La formulación farmacéutica de cualquier reivindicación anterior, en la que el liposoma consiste en 50 por ciento en moles a 70 por ciento en moles de HSPC, desde 25 por ciento en moles a 5o por ciento en moles de colesterol y desde 0 por ciento en moles a 10 por ciento en moles de PEG-DSPE.

5. La formulación farmacéutica según la reivindicación 4, en la que los liposomas comprenden aproximadamente un 60 % mol de HSPC, aproximadamente un 40 % mol de colesterol y aproximadamente un 5 % mol de PEG-DSPE.

6. La formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que los liposomas comprenden desde aproximadamente 45 % mol a aproximadamente 75 % mol de esfingomielina, desde aproximadamente 25 % mol a aproximadamente 50 % mol de colesterol y desde aproximadamente 0 % mol a aproximadamente 10 % mol de PEG-DSPE.

7. La formulación farmacéutica según la reivindicación 6, en la que los liposomas comprenden aproximadamente un 55 % mol de esfingomielina, aproximadamente un 45 % mol de colesterol y aproximadamente un 2.8 % mol de PEG-DSPE.

8. La formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el agente activo escasamente soluble en agua tiene una solubilidad acuosa menor que 2 mg/mL.

9. La formulación farmacéutica según la reivindicación 8, en la que el agente activo escasamente soluble en agua tiene una solubilidad acuosa a pH 7 menor que 2 mg/mL.

10. La formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente es carfilzomib.

11. La formulación farmacéutica según cualquier reivindicación anterior, en la que el disolvente aprótico se selecciona entre dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, I-metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, éter monometílico de etilenglicol, éter monometílico de dietilenglicol, polietilenglicol.

12. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 en la que la eficacia de encapsulación es al menos del 50 %.

13. La formulación farmacéutica según la reivindicación 12, en la que la eficacia de encapsulación es al menos del 90 %.

14. La formulación farmacéutica de cualquier reivindicación anterior, en la que el medio acuoso interno comprende un agente regulador de carga activa que consiste en agua, opcionalmente una sal seleccionada de una sal de sulfato, fosfato, fosfonato, citrato o acetato, una sal de amonio, una sal de amonio alquilada, por ejemplo, sal de metilo, etilo, propilo y amilo, una sal de Fe+2, Mn2+-, Cu2+- Na+ y/o K+, una sal de ion EDTA, y opcionalmente un agente regulador de pH para mantener un gradiente de pH.

15. Un método para cargar de forma remota un liposoma con un agente que es escasamente soluble en agua en el que el método comprende:

(a) preparar una suspensión acuosa de los liposomas que tienen un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma;

(b) preparar un precipitado del agente activo sólido; y

(c) formar una suspensión de carga de (a) y (b), e incubar la suspensión de carga, cargando así remotamente el precipitado del agente activo sólido a través de la membrana liposomal en el medio acuoso interno de los liposomas mediante un gradiente de protones o iones transmembrana, formando una suspensión de liposomas de producto que encapsulan el precipitado del agente sólido. en el que dicha suspensión de carga dispersa más luz que dicha suspensión de liposomas; y (d) incubar la suspensión final de (c) cargar así el agente sólido escasamente soluble en agua del medio acuoso en los liposomas mediante el gradiente de protones o iones.