KR101723784B1 - ｃ－ΜΕΤ 억제제를 유효성분으로 포함하는 독소루비신 및 광역학 치료 항암 효과 증진용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물 및 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하는 광역동 치료의 항암 효과 증진용 약학 조성물에 대한 것으로, 상기 약학 조성물은 PI3K 억제제를 더 포함할 수 있으며, 상기 c-MET 억제제 단독 또는 c-MET 억제제, PI3K 억제제 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 암세포에 독소루비신과 공동 처리하거나 PDT 치료 전 암세포에 처리하는 경우, 세포 내 독소루비신 축적 및 ROS 레벨이 증가되고 세포내 광감각제의 축적이 증가되어 세포사멸을 유도할 수 있다. 따라서 독소루비신 또는 PDT 치료에 대한 암세포의 내성을 방지하고, 독소루비신 또는 PDT에 대한 감수성을 증진시켜 항암치료의 효율을 높일 수 있다.

Description

ｃ－ΜΕΤ 억제제를 유효성분으로 포함하는 독소루비신 및 광역학 치료 항암 효과 증진용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for enhancing effect to doxorubicin and Photodynamic therapy against cancer comprising c-MET inhibitor}
본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하는 독소루비신 및 광역학 치료의 항암 효과 증진용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째로 높은 사망 원인이며, 사망자 4명 중의 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다.
이러한 사망의 대부분은 고형암으로 인한 것이다. 특정 암의 의학적 치료에는 상당한 진보가 있어 왔지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 과거 20년간 약 10％ 정도만 개선되었다. 암, 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에, 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것이 극도로 어렵다.
현재, 암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있다. 이 중에서, 화학요법은 항암제를 이용하여 암을 치료하는 방법을 말하며 융모막 암(choriocarcinoma)에 메토트레세이트(methotrexate)를 사용하여 완치효과를 얻음으로써 본격적으로 사용되었다. 오늘날에는 약 60여종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 최근 암 발생 및 암세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
그러나 화학요법은 지속적인 항암제 투여에 의하여 발생한 암세포의 내성때문에 치료 효과가 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 암 환자에 대한 항암 화학요법이 성공하기 위해서는 정상조직이 살아남을 수 있는 혈중농도에서 환자는 부작용을 감수할 수 있어야 하고 암세포는 살해되어야 하는데, 항암제에 대한 약제 내성은 암세포를 죽일 수 있는 농도에 도달할 수 있는 양의 항암제를 투여했음에도 불구하고 암세포가 죽지 않는 경우를 말한다. 항암제 내성은 환자 개개인에 따라 다를 수 있으며 심지어 같은 조직으로부터 유래된 종양들 사이의 유전적 차이 등을 포함한 다양한 인자들에 의해 유발될 수 있다.
더불어 화학요법은 암세포의 사멸과 정상세포의 생존을 위한 적절한 농도를 결정하는 데에도 많은 문제점을 가지고 있다. 암세포를 더 효과적으로 치료하기 위해 높은 농도의 항암제를 투여하게 되면 정상세포까지 세포사멸을 유도할 수 있기 때문에 낮은 농도의 항암제를 투여해도 암세포의 성장을 억제하거나 사멸을 유도할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
한편, 광역동 치료법(Photodynamic therapy, PDT)은 최근 주목받고 있는 암 치료 방법 중 하나이다.
광역동 치료에 사용되는 광감작제(photosensitizer)는 빛에 노출되지 않을 경우 세포독성이 거의 없다가, 특정 파장의 빛을 조사하면 광감작제가 빛을 받아 여기되면서 발생되는 광 에너지가 종양 조직 내의 산소로 전달되고, 기저상태에 있던 산소는 화학 반응성이 뛰어난 반응성 산소종 (단일항산소(singlet oxygen), 산소 라디칼, 초과산화물(superoxide) 및 과산화물(peroxide))을 발생시키게 된다. 이러한 반응성 산소종은 주변 세포성분과 혈관조직을 화학적으로 파괴하기 시작하여 세포자멸괴사(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)로 진행시킨다. 또한, 이러한 광감작제는 정맥 내 투여 후 암 조직에 특이적으로 축적되는 성질을 가지고 있어, 일정시간이 지난 뒤에 특정 파장의 빛을 조사하게 되면 암 조직만 괴사하고 정상조직은 보존될 수 있다. 따라서 광역동 치료는 일반적인 항암제 치료 요법에 비해 부작용 완화에 큰 장점을 가지고 있다. 이처럼, 광역동 치료는 정상 세포를 보존하면서 암 세포만 선택적으로 제거할 수 있는 장점이 있으며, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있고, 간단한 국소 마취만으로 시술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.
그러나 현재 사용 중인 광역동 치료는 빛의 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용되고 있지 못하며 특히, 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못하고 있다.
따라서 항암 치료에서 화학요법과 광역동 치료의 감수성을 높일 수 있는 방안이 필요하다.
1. 대한민국 등록특허 제 10-1309844호.
따라서 본 발명은 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
또한 본 발명은 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하며, 독소루비신의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하며, 광역동 치료(Photo Dynamic Therapy, PDT)의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 c-MET 억제제는 SU11274, 크리조티닙(crizotinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 포레티닙(foretinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807 및 JNJ-38877605으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다.
본 발명에 따르면 암세포에 독소루비신(Doxorubicin)을 처리할 때 c-MET 억제제를 투여하면 독소루비신의 세포내 축적이 증가되고 세포 사멸이 증가되며, 독소루비신에 대한 내성을 지닌 암세포의 사멸효과를 증진시킬 수 있고 더불어 암세포를 광역동 치료(Photo Dynamic Therapy, PDT)하기 전 c-MET 억제제를 투여하면 PDT 처리에 의한 세포내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 레벨이 증가되고, 세포내 광감작제의 축적이 증가되며 이를 통해 세포 사멸이 증가되고, PDT 치료에 대한 내성을 지닌 암세포의 사멸효과를 증진시킬 수 있다.
도 1은 독소루비신(Doxorubicin) 및 PDT 세포 독성에 대한 A2780DR 세포의 내성을 확인한 결과이고,
도 2는 독소루비신 외의 항암제인 시스플라틴, 파클리탁셀 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)에 대한 A2780DR 세포의 내성을 확인한 결과이고,
도 3은 A2780DR 세포에서 PDT 처리에 의한 ROS 및 Pba 레벨을 확인한 결과이고,
도 4 및 도 5는 A2780DR 세포에서 BCRP/ABCG2 활성화와 Dox 내성과의 연관성을 확인한 결과이고,
도 6은 A2780DR 세포에서 BCRP/ABCG2 활성화에 의한 Pba 반응성 감소를 확인한 결과이고,
도 7은 A2780 세포과 A2780DR 세포의 원암 유전자 c-MET(proto-oncogene c-MET)의 발현을 비교한 결과이고,
도 8은 A2780DR 세포에서 Dox 내성에 대한 c-MET 과발현 및 c-MET/PI3K 신호전달의 영향을 확인한 결과이고,
도 9는 c-MET/PI3K/AKT 신호전달과 A2780DR 세포의 PDT 내성과의 연관성을 확인한 결과이고,
도 10은 A2780DR 세포에서 c-MET 증가와 BCRP/ABCG2 과발현과의 연관성을 확인한 결과이고,
도 11은 유방암 및 대장암 세포에서 c-MET-BCRP/ABCG2 신호 전달을 확인하고, 독소루비신에 대한 감수성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자는 항암치료에서 암세포의 독소루비신과 광역동 치료(Photo Dynamic Therapy, PDT)에 대한 감수성을 증가시키는 방법에 대하여 연구하던 중, 독소루비신(Doxorubicin)과 c-MET 억제제인 SU11274(SU112)를 함께 암세포에 병용투여하는 경우 세포내 독소루비신의 축적이 증가되고, SU11274를 처리한 암세포를 광역동 치료하면 세포내 광감작제의 축적이 증가되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하며, 독소루비신의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 c-MET는 MET 또는 간세포증식인자수용체(hepatocyte growth factor receptor, HGFR)이라 불리며 사람에서 MET 유전자(MET proto-oncogene, receptor tyrosine kinase)에 의해 코딩된다. 상기 c-MET는 상처 치유 및 배아 발달에 필수적인 막 수용체로 알려져 있다.
상기 c-MET 억제제는 SU11274, 크리조티닙(crizotinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 포레티닙(foretinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807 및 JNJ-38877605으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며, 보다 바람직하게는 SU11274이지만 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 본 발명의 일 실시예에 따르면, PI3K 억제제인 LY294002(LY294)와 독소루비신을 병용투여한 결과, 세포내 독소루비신의 축적이 증가되는 것이 확인되었다.
따라서 본 발명에 따른 약학 조성물은 포스파티딜이노시톨3-인산화효소(phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K) 억제제를 더 포함할 수 있다.
상기 PI3K는 세포막에서 발견되는 수많은 인지질 중 하나인 포스파티딜이노시톨(phosphatidyl inositol)의 이노시톨 링의 3번 위치를 인산화하는 효소이다.
PI3K는 세포 성장, 증식, 분화, 이동, 생존 및 세포내 수송(intracellular trafficking)과 같은 세포 기능에 관여하여 암에 관여하는 효소 패밀리이며, 지질 및 단백질 키나제 활성 모두를 이용하여 다수의 세포내 신호전달 경로를 조절하여 하류 세포 과정들의 범위를 조절하는 것으로 알려져 있다.
상기 PI3K 억제제는 LY294002, 이델랄리십(idelalisib) 부파리십(buparlisib), GDC-0941, GDC-0980, PX-866, BAY 80-6946, BEZ-235, BYL-719, GSK-2126458 및 PKI-587로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며, 보다 바람직하게는 LY294002이지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암 효과는 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 고형암의 항암 효과이며, 상기 고형암은 이 외에도 자궁경부암, 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 췌장암, 갑상선암, 결장암, 위암 및 신장암 등을 포함할 수 있다.
더불어 본 발명은 c-MET 억제제를 유효성분으로 포함하며, 광역동 치료(Photo Dynamic Therapy, PDT)의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 c-MET 억제제는 SU11274, 크리조티닙(crizotinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 포레티닙(foretinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, EMD 1214063, Golvatinib, INCB28060, MK-2461, 티반티닙(tivantinib), NVP-BVU972, AMG458, BMS 794833, BMS 777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-754807 및 JNJ-38877605으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며, 보다 바람직하게는 SU11274이지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 포스파티딜이노시톨3-인산화효소(phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K) 억제제를 더 포함할 수 있다.
상기 PI3K 억제제는 LY294002, 이델랄리십(idelalisib) 부파리십(buparlisib), GDC-0941, GDC-0980, PX-866, BAY 80-6946, BEZ-235, BYL-719, GSK-2126458 및 PKI-587로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며, 보다 바람직하게는 LY294002이지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암 효과는 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 고형암의 항암 효과이며, 상기 고형암은 이 외에도 자궁경부암, 전립선암, 간암, 폐암, 뇌암, 후두암, 췌장암, 갑상선암, 결장암, 위암 및 신장암 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 약효가 충분히 발휘될 수 있도록 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 이러한 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 비강흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함된 SU11274 및 LY294002는 이미 의학적 용도에 처방되고 있어 안전성이 확보되어 있는 물질이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
< 실시예 1> 실험 방법
1. 화학 물질 및 항체 준비
페오포르비드 a(pheophorbide a, Pba)는 산타 크루즈 생명공학(Santa Cruz Biotechnology)에서 구매하였다.
독소루비신(doxorubicin, Dox), Ko143((3S, 6S, 12aS)-1,2,3,4,6,7,12,12a-옥타하이드로-9-메톡시-6-(2-메틸프로필)-1,4-다이옥소피라지노[1',2':1,6]피리도[3,4-b]인돌-3-프로피온 산 1,1-다이메틸에틸 에스테르 하이드레이트)((3S,6S,12aS)-1,2,3,4,6,7,12,12a-octahydro-9-methoxy-6-(2-methylpropyl)-1,4-dioxopyrazino[1',2':1,6]pyrido[3,4-b]indole-3-propanoic acid 1,1-dimethylethyl ester hydrate), LY294002(2-모르폴린-4-일-8-페닐크로멘-4-온)(LY294;2-morpholin-4-yl-8-phenylchromen-4-one), SU11274((3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-(3,5-다이메틸-4-[4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일메틸렌-N-메틸-2-옥소-2,3-다이하이드로-1H-인돌-5-설폰아마이드)((3Z)-N-(3-chlorophenyl)-3-(3,5-dimethyl-4-[(4-methylpiperazin-1-yl)carbonyl]-1H-pyrrol-2-ylmethylene)-N-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonamide)), 프로피디움 요오드화물 (Propidium iodide, PI), 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 및 퓨로마이신(puromycin)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)에서 구매하였다.
훼히스트(Hoechst) 33342(H342;2'-[4-에톡시페닐]-5-[4-메틸-1-피페라지닐]-2,5'-비-1H-벤조이미다졸 트리하이드로클로라이드 트리하이드레이트)(H342;2'-[4-ethoxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride trihydrate), 트랜스-1-(2'-메톡시비닐)피렌(trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyrene), 카복시-2'(carboxy-2'), 7'-디클로르플루오레세인 디아세테이트(7'-dichlorofluorescein diacetate) 및 알렉사 플루오르 488 고트 항-래빗 IgG(H1L)(Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(H1L))은 라이프 테크놀러지(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 구매하였다.
SYBR 프리믹스 ExTaq 시스템(The SYBR Premix ExTaq system)은 타카라(Takara, Otsu, Japan)에서 얻었다.
단백질인산화효소 B(protein kinase B, AKT) 항체, 인산화-AKT(phospho-AKT, p-AKT)항체, 유방암 내성 단백질(breast cancer resistance protein, BCRP)/ATP-결합 카세트 서브-패밀리 G 멤버 2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)에서 구매하였다.
β-튜불린(β-Tubulin) 항체는 산타 크루즈 생명공학(Santa cruz biotechnology)에서 구입하였고 시스플라틴(Cisplatin) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)은 시그마-알드리치(Sigma-aldrich)로부터 구입하였다.
파클리탁셀(Paclitaxel)은 메드쿠 바이오사이언스(MedKoo Biosciences, Chapel Hill, NC)로부터 구입하였다.
2. 세포 배양
인간 난소암 세포주(Human ovarian cancer cell line)인 A2780은 유로피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐(European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)에서 구입하였다.
Dox에 내성을 보이는 A2780DR은 Dox가 함유된 배지에서 배양한 인간 난소암으로부터 생성하였다.(Free Radic Biol Med 47:1619-1631, 2009 참고).
상기 세포들은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Hyclone)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin,WelGene Inc., Daegu, South Korea)가 포함된 RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT)에서 배양하였다.
인간 유방암 세포주(Human breast cancer cell line)인 MDA-MB-231과 대장암 세포주(colon cancer cell line)인 HT29는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American type culture collection, Rockville, MD)에서 구매하였다.
37℃, 5% CO2 분위기하의 가습 환경에서 상기 MDA-MB-231은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Hyclone) 배지로 배양하였고 HT29는 RPMI-1640 배지로 배양하였다.
3. 광역동 치료( photodynamic therapy, PDT)
상기 실시예 1 중 2에서 준비한 A2870과 A2780DR을 5×103 cells/well의 밀도로 96웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 동안 배양하고 PDT를 수행하였다.
이를 위하여 먼저, 세포들에 Pba(0.025 내지 2.5 mg/ml)를 6시간 동안 처리한 후, Pba가 함유된 배지를 제거하였다.
그런 후, 670nm LED 하이브리드 램프 시스템(LED hybrid Lamp system, Quantum Spectra Life, Barneveld, WI)과 1.2 J/cm2 레이저를 이용하여 세포를 조사하였고, 추가 분석을 위해 18시간 동안 완전 배지(complete medium)에 회복시켰다.
4. MTT 분석
세포를 3×103 cells/well의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하고 PDT 또는 항암제를 처리한 후, MTT 용액(2mg/ml)을 첨가하고 4시간 동안 배양하였다.
배양 후 MTT용액을 제거하고 디메틸설폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)를 각 웰에 첨가하였다.
그런 후 SPECTRO 스타 나노 마이크로플레이트 리더기(SPECTRO star Nano microplate reader, BMG Laboratory Technologies, Offenburg, Germany)를 사용하여 570nm에서 측정하였다.
5. 활성 산소의 측정
상기에서 준비한 세포들을 7×103 cells 밀도로 커버 유리 슬라이드(cover glass slide, SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea)에 도포하였다.
PDT 처리한 후, 세포들을 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고 트랜스-1(2'-메톡시비닐)피렌(trans-1(2'-methoxyvinyl)pyrene, 50mM) 또는 카복시-2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate, 30mM)과 함께 37℃에서 배양하였다.
형광 이미지는 LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)의 필터(488/524nm)을 이용하여 얻었고, ZEN2011 소프트웨어(Carl Zeiss)를 이용하여 강도를 조절하였다.
세포의 형광 이미지를 분석하기 위하여, 세포 분석 휴대용 세포 이미지(Cell Insight Personal Cell Imager, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하였고, 96웰 플레이트에 접종한 세포와 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된 형광 이미지(495/529nm)는 h342(350/461nm)를 이용해서 핵을 염색하여 정량화하였다.
6. Dox와 Pba의 세포내 축적 측정
상기 세포들을 7×103 cells의 밀도로 커버 유리 슬라이드(cover glass slides)에 도포하고 Dox 또는 Pba와 함께 6시간 동안 배양한 후, Dox 또는 Pba를 제거하고 PBS로 세척하였다.
Dox(548/680nm) 또는 Pba(633/693nm)의 적색 형광의 세기는 LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss)를 이용하여 수득하였다.
정량을 위한 또 다른 방법으로, 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, Dox 또는 Pba와 함께 배양하였다.
세포 세척과 핵 염색 후 세포 분석 휴대용 세포 이미지(Cell Insight Personal Cell Imager, Thermo Fisher Scientific)을 이용해서 적색 형광을 검출하였고, 강도는 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
7. 세포내 Pba의 형광 결정
96 웰 플레이트에서 세포를 Pba와 함께 6시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고 1% 황산 도데실나트륨(Sodium dodecylsulfate, SDS)으로 용해하였다.
세포의 Pba를 용해하기 위해 세포 용해물에 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가하고 형광 강도를 스펙트라맥스 M5(SpectraMax M5, Molecular devices, Synnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다(415nm Ex/673nm Em).
8. 총 RNA 추출 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 분석(Real-Time Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction Analysis)
TRIzol 시약(Life Technologies)를 이용하여 세포로부터 이용하여 총 RNA를 분리하였고, cDNA의 합성을 위하여 역전사(reverse-transcriptase, RT) 반응을 수행하였다. 이를 위하여, 총 RNA의 200ng과 RT(promega)와 0.5mg/ml 올리고 dT15(oligo dT15, Promega, Madison, WI)을 포함하는 반응 혼합물을 함께 배양하였다.
실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, PCR)분석의 mRNA 레벨의 상대적인 정량은 로슈라이트싸이클러(Roche LightCycler, Roche, Mannheim, Germany)와 SYBR 프리믹스 Extaq 시스템(SYBR Premix ExTaq system, Takara)를 사용하여 수행하였다.
각각의 프라이머는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, South korea)에서 구입한 것을 사용하였으며, 프라이머의 서열번호는 하기와 같다:
[MDR1/ABCB1(sense) 5′- CTATGCTGGATGTTTCCGGT -3′(서열번호 1)와 (antisense) 5′- TCTTCACCTGGCTCAGT-3′(서열번호 2)], [MRP1/ABCC1 (sense) 5′- AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC -3′(서열번호 3)와 (anti-sense) 5′- CGGCAAATGTGCACAAGGCCAC -3′(서열번호 4)], [MRP2/ABCC2 (sense) 5′- GCTGCCACACTTCAGGCTCT - 3′(서열번호 5)와 (anti-sense) 5′- GGCAGCCAGCAGTGAAAGC -3′(서열번호 6)], [BCRP/ABCG2 (sense) 5′- CACAACCATTGCATCTTGGCTG -3′(서열번호 7)와 (anti-sense) 5′- TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3′(서열번호 8)], [간세포증식인자(hepatocyte growth factor, HGF) (sense) 5′- ACAGCTTTTTGCCTTCGAGC -3′(서열번호 9)와 (anti-sense) 5′- TAACTCTCCCCATTGCAGGT-3′(서열번호 10)], [c-MET (sense) 5′- TATGTGGCTGGGACTTTGGA -3′(서열번호 11)와 (anti-sense) 5′- GCTTATTCATGGCAGGACCAAC-3′(서열번호 12)].
9. 마이크로어레이 분석( Microarray analysis)
총 RNA를 A2780과 A2780DR 세포로부터 Totally RNA 키트(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 추출하였고, RNeasy 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA)으로 정제한 후, cDNA 합성과 cRNA 라벨링(Enzo Biochemical, Farmingdale, NY)를 위해 사용하였다.
그리고 단편화된 cRNAs(12.5mg)는 45℃에서 인간 유전자 ST 배열(Human gene ST array, HuGene-1-0-ST-v1, Affymetrix, Santa Clara, CA)에 16시간 동안 하이브리드(Hybrid)하였다.
데이터는 GenPlex 버전 3.0 소프트웨어(ISTECH, Seoul, South Korea)를 이용하여 생성하였다.
10. 웨스턴 블롯 분석
세포를 단백질분해효소 억제제 칵테일(Sigma- Aldrich)가 포함된 용해 버퍼(50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1% 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올-40(nonyl phenoxypolyethoxylethanol-40, NP-40))를 이용하여 용해하였다.
단백질 농도는 BCA 단백질 키트(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 측정하였다.
얻어진 단백질 샘플은 8 내지 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gels)을 이용하여 전기영동을 통해 분리하였고 나이트로셀룰로오스 맴브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다.
맴브레인은 5% 스킴 밀크(skim milk) 또는 3% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 한시간 동안 블럭킹하였고, 밤새 1차 항체와 함께 배양하였다.
이를 트윈 20(Tween 20)이 함유된 PBS을 이용하여 세척하고 2차 항체와 함께 한시간 동안 배양하였다.
화학발광 이미지(chemiluminescent images)는 Image Quant LAS 4000 mini(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 촬영하였다.
11. 면역세포화학( Immunocytochemical ) 분석
세포는 7×103 cells/well의 밀도로 커버 유리 슬라이드에 도포하였고 약물을 처리하였다.
세포를 차가운 PBS로 3회 세척하고, 차가운 메탄올로 10분 동안 고정시킨 후, 항-BCRP/ABCG2(1:200) 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다.
다음날, 세포를 PBS로 세척하고 Alexa Fluor 488 고트 항-래빗 항체(Alexa Fluor 488 goat anti- rabbit antibody, 1:500)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다.
그런 후, 핵 염색을 위하여 PI(1:250)과 함께 10분 동안 배양하였다.
형광 이미지는 LSM710 공초점 현미경(Carl Zesis)를 사용하여 얻었다.
12. c-MET siRNA 형질전환
미리 디자인된 c-MET siRNA(#51(1), 5′- GUGAAGAUCCCAUUGUCUA -3′(서열번호 13) 및 #51(2), 5′-UAGACAAUGGGAUCUUCAC -3′(서열번호 14))와 뒤섞은(scrambled) 컨트롤 siRNA는 바이오니아(Bioneer)에서 구매하였다.
세포는 5×104 cells의 밀도로 60mm 플레이트에 접종하였고 밤새 성장시키고 다음날 리포펙트아민(Lipofectamin) 2000 시약(Life Technologies)를 이용하여 c-MET siRNA로 형질전환시켰다.
형질전환된 세포는 완전 배지에서 24시간 동안 회복시킨 후, RNA와 단백질을 추출하였다.
< 실시예 2> A2780DR의 Dox 축적과 PDT 세포독성에 대한 강한 내성 확인
상기 실시예 1 중 1에서 준비한 A2780과 A2780DR 세포를 Dox(0.2 - 1.6 mM)와 함께 7시간 배양했을 때, A2780DR 세포는 A2780 세포보다 더 높은 내성을 보여주었다(도 1A).
Dox가 있는 안트라사이클린계 발색단(anthracycline chromophore) 그룹은 발형광단이기 때문에, Dox의 세포내 축적을 가시화할 수 있고 형광 세포 이미저(fluorescent cell imager)를 사용해서 정량화할 수 있다.
Dox와 함께한 배양은 두 세포주 모두에서 농도 의존적으로(concentration-dependent manner (1 - 4 mM)) 세포내 형광을 증가시켰으나, A2780DR 세포의 증가는 상당히 미미했다(도 1B).
4mM Dox와 A2780의 6시간 동안의 공동배양에서는 세포내 Dox 레벨이 11 배 증가된 반면, A2780DR과 Dox의 공동 배양에서는 5.5배 증가된 것을 관찰할 수 있었다(도 1B).
PDT는 다양한 고형 종양에 대하여 효과적인 치료법으로 잘 알려져 있으며, PDT의 반응에서 분자 결정인자의 식별은 PDT의 치료 효과를 최적화하기 위하여 필요하다.
이러한 측면에서, Dox 내성의 A2780DR 세포가 PDT에 대하여 차등 감수성을 가질 수 있을지를 광감작제로 Pba를 이용한 PDT에 대한 A2780DR의 반응을 기반으로 조사하였다.
MTT 분석은 2.5mg/ml까지의 Pba(24시간)는 A2780과 A2780DR 모두에 영향을 보이지 않는다는 것을 보여주었다(도 1C).
Pba와 함께 배양된 A2780에 60초 동안 레이저광을 조사하였을 때, 생존 세포의 수는 농도의존적으로 감소하였다.
PDT와 0.125 및 0.25mg/ml Pba에 대하여 각각 25%, 14%의 세포가 생존하였다(도 1D).
A2780DR은 PDT 세포독성에 대하여 명확하게 내성을 보였으며, 0.25mg/ml Pba-PDT에 대하여 83%의 세포가 생존하였다.
이러한 결과는 A2780DR이 Dox와 PBa-PDT에 크로스 내성(crossresistant)를 보인다는 것을 의미한다.
더불어 항암제 내성에 있어서, 시스플라틴(cisplain), 파클리탁셀(paclitaxel), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 같은 다른 항암제에서 A2780DR의 감도는 A2780과 크게 다르지 않았다(도 2).
이는 A2780DR의 Dox 내성이 특정한 메커니즘을 통해 개발된 것임을 보여주었다.
PDT는 ROS의 증가를 유도하고, A2780DR에서 세포내 Pba 축적을 완화시켰다.
< 실시예 3> A2780DR에서 PDT 처리에 의한 ROS 및 Pba 레벨 확인
A2780 세포와 일중항 산소-특이적인 다이(singlet oxygen-specific dye)를 함께 배양하였을 때 녹색 형광의 증가를 보였다.
형광강도 또한 0.25 및 2.5 mg/ml 그룹에서 각각 1.3 및 1.6 배의 증가를 보인 반면(도 3A), A2780DR에서는 일중항 산소의 존재가 유의하게 낮았다.
마찬가지로, PDT가 처리된 A2780은 세포내 ROS의 높은 레벨을 보여주었지만, A2780DR에서는 세포내 ROS가 관찰되지 않았다(도 3B).
이러한 결과는 A2780DR의 PDT에 대한 감소된 세포독성 응답성을 보여주었다.
특히, A2780DR에서 생성된 일중항 산소 레벨은 광감작제(photosensitizer) Pba의 세포 수준이 차이를 보일 수 있음을 의미한다.
A2780을 6시간 동안 Pba와 배양하면, Pba로부터 파생된 세포의 적색 형광 강도는 2.5mg/ml 농도의 Pba를 처리하였을 때 25배 증가되는 것을 확인하였다.
한편, A2780DR 세포에는 Pba가 덜 축적되었다: 2.5mg/ml 농도의 Pba를 처리하였을 때 형광 강도는 10.5배 증가하였다(도 3C).
상기 결과들을 통해 Dox-내성의 난소암 세포에서 PDT 감수성은 낮았으며, 이러한 현상은 PBa의 세포 레벨 감소와 연관되어 있음을 의미하였다.
< 실시예 4> A2780DR에서 BCRP / ABCG2 활성화와 Dox 내성과의 연관성 확인
세포 Dox의 유출은 MDR1/ABCB1, BCRP/ABCG2 및 MRP1/ABCC1과 같은 ABC 운반체(transporters)에 의해 매개된다.
Dox와 Pba의 낮은 세포 레벨의 원인을 밝히기 위하여, A2780DR의 운반체 발현 패턴을 A2780과 비교하였다.
특히 A2780DR에서 50% 이상 발현이 상승되는 50 샘플의 ABC 운반체 중 하나인 BCRP/ABCG2에 주목하였다.
A2780DR에서 BCRP/ABCG2의 전사 레벨은 A2780에 비교하였을 때 45배인 것을 확인하였다(도 4).
다음으로 실시간 RT-PCR 분석을 이용하여 BCRP/ABCG2, MDR1/ABCB1 및 MRP1-2/ABCC1-2의 전사 레벨을 측정하였다.
그 결과 A2780DR에서 BCRP/ABCG2의 mRNA 레벨은 71배 높았으며, 이를 통해 Pba 축적에서 BCRP/ABCG2이 중요한 역할을 할 것임을 유추하였다(도 5A).
마찬가지로, 웨스턴 블롯 분석 결과 A2780과 비교하였을 때 A2780DR에서 BCRP/ABCG2의 단백질 레벨이 더 높은 것으로 나타났다(도 5B).
또한, 면역조직 화학적 분석에서 A2780DR의 상승된 BCRP/ABCG2의 발현은 세포막에서 크게 관찰되었다(도 5C).
BCRP/ABCG2의 발현 증가의 기능적인 의미는 BCRP/ABCG2의 기질인 H342에 의해 확인할 수 있다.
A2780은 10분 동안 H342 다이(Dye)와 배양한 결과 핵 염색을 보여주었으며 반면, A2780DR은 세포외 H342 축적과, 낮은 세포 레벨을 보여주었다(도 5D).
반면, MRP/ABCC의 기질인 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트(5-chloromethylfluorescein diacetate)의 세포 레벨은 양쪽 세포 모두 유사하였다(도 5E).
마지막으로, BCRP/ABCG2의 발현은 다른 Dox 축적과 강하게 연관이 있었다: A2780DR의 감소된 Dox의 세포내 레벨은 A2780에 BCRP/ABCG2 억제제인 Ko143를 처리한 경우와 비교하였을 때, 완벽하게 복원이 되었다(도 5F).
이를 통하여, A2780가 Dox 내성을 습득하는 동안 BCRP/ABCG2이 발현되며, 이 메커니즘은 내성 세포에서 Dox 축적의 감소를 이끈다는 것을 확인하였다.
< 실시예 5> A2780DR에서 BCRP / ABCG2 활성화에 의한 Pba 반응성 감소 확인
A2780DR의 PDT 내성에 대하여 BCRP/ABCG2 발현이 관여하는지를 확인하기 위하여, BCRP/ABCG2 억제제를 투여한 후 세포의 Pba 레벨을 측정하였다.
그 결과, A2780DR에서 Pba의 낮은 레벨은(0.25 및 2.5mg/ml) Ko143를 전처리하였을 때 증가하였다(도 6A).
더불어 A2780DR에 Ko143를 전처리하는 경우, Pba-PDT의 처리 농도에 따라 일중항 산소의 레벨이 증가였으며(1.38 내지 2.35배), A2780에서는 대조군과 차이가 없었다(도 6B).
또한 A2780DR의 PDT 세포 생존의 증가는 Ko134 처리에 의하여 차단되었다(도 6C).
이러한 결과를 통해 A2780DR의 증가된 BCRP/ABCG2 기능은 강화된 Pba의 세포외 전송을 이끌어, PDT 세포 독성에 대하여 세포를 보호하게 되는 것을 확인하였다.
< 실시예 6> A2780DR에서 c-MET 과발현 및 그에 따른 Dox 내성 확인
상기 실시예4 및 실시예 5에서 A2780DR에 PDT와 Dox를 처리할 시 BCRP/ABCG2의 과발현과 그에 따른 내성이 발생되는 것을 확인하였고, 이를 기반으로 BCRP/ABCG2 증가의 분자 메커니즘을 확인하고자 하였다.
그 결과, 부모격인 A2780 세포와 비교하였을 때, A2780DR에서 원암 유전자 c-MET(proto-oncogene c-MET)의 발현이 상대적으로 높았다(도 7).
c-MET는 강화된 종양의 성장, 전이 및 생존에 대한 PI3K/AKT 경로에 신호를 변환하며, A2780은 c-MET을 매우 낮은 수준으로 발현한다고 보고되어 있다.
한편, 마이크로 어레이 결과에서 A2780DR의 c-MET의 전사체 레벨은 3.6배 높은 것으로 관찰되었으며(도 7), 실시간 RT-PCR 분석(real-time RT-PCR analysis)에서도 유사한 증가를 확인하였다(도 8A).
그럼에도 불구하고, A2780DR 과 A2780 사이의 HGF, AKT 및 PI3K의 촉매 서브유닛(catalytic subunits)의 전사체 레벨과 인산가수분해효소(phosphatase), 텐신 동족체(tensin homolog)의 유의한 차이는 발견되지 않았다.
A2780DR 세포의 웨스턴 블롯 결과에서 PI3K 조절 서브유닛-1(PI3K regulatory subunit-1)이 1.92배 증가하였으며, c-MET(140kDa)의 증가된 레벨을 확인할 수 있었다(도 8B).
마이크로 어레이 분석에서도 유사한 패턴이 관찰되며, PI3K의 PI3K 조절 서브유닛-1(PI3K regulatory subunit-1)의 발현은 A2780DR에서 미미하게 증가하였다.
또한, 활성화된 PI3K의 다운스트림인 인산화된 AKT의 단백질 레벨은 A2780DR 세포에서 현저히 높았으며, 이들 세포에서 c-MET/PI3K/AKT 신호전달의 활성을 확인할 수 있었다.
PI3K/AKT의 활성화는 BCRP/ABCG2 활성을 상향조절할 수 있다고 보고된 바 있기 있기 때문에, 상기 결과들을 바탕으로 A2780DR에서 BCRP/ABCG2의 발현과 증가된 c-MET 발현은 연관성이 있을 것이라 추측하였다.
3시간 동안 PI3K 특이 억제제인 LY294002(5 또는 10mM)와 A2780DR을 예비배양한 결과, 세포내 Dox의 레벨은 A2780의 레벨 수준으로 증가하였다(도 8C).
이와 유사하게, A2780DR에 c-MET 특이 티로신 키나아제 억제제(c-MET-specific tyrosine kinase inhibitor)인 SU11274(1 또는 2mM)를 3시간 동안 처리하였을 때, Dox의 세포 내 레벨이 50% 증가하였다(도 8D).
또한 A2780DR의 Dox에 대한 내성도 SU11274에 의해 크게 감소되었다(도 8E).
이러한 결과를 통해 A2780DR에서 c-MET/PI3K 신호전달은 Dox 축적을 감소시킬 수 있을 것이라 판단되었다.
< 실시예 7> A2780DR에서 c-MET/ PI3K / AKT 신호전달과 PDT 내성과의 연관성 확인
A2780DR의 PDT 내성에서 c-MET/PI3K 신호전달의 역할을 확인하기 위해, PDT 세포독성, 일중항 산소 레벨 및 Pba 축적에서 약리학적 억제제의 효과를 확인하였다.
그 결과, 세포와 LY294002(5mM)를 같이 예비 배양하였을 때, A2780DR의 Pba 축적은 강화되었으며(도 9A) 일중항 산소의 레벨도 A2780의 레벨만큼 증가되었다(도 9B).
마지막으로, A2780DR에서 PDT 세포의 생존은 PI3K에 의해 영향을 받았으며, 생존 세포의 비율은 LY294002 처리에 의해 76%에서 31%로 감소되었다(도 9C).
다음으로, 세포에 SU11274(1mM)를 전처리한 후, PDT에 대한 반응을 조사하였다.
그 결과, c-MET 억제제의 첨가는 A2780DR의 Pba의 세포내 축적을 회복시켰고(도 9D), 일중항 산소의 레벨도 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 9E).
따라서, A2780DR 세포 생존율은 62%에서 33%로 감소되었다(도 9F).
이러한 결과를 통해, 증가된 c-MET 발현과 뒤이은 PI3K 신호전달은 A2780DR의 PDT 내성과 밀접한 연관이 있다는 것을 확인하였다.
< 실시예 8> A2780DR에서 c-MET 증가와 BCRP / ABCG2 과발현과의 연관성 확인
약학적 억제제를 처리한 후, BCRP/ABCG2 발현에서 c-MET/PI3K 신호절단의 관여를 c-MET, PI3K, AKT 및 BCRP/ABCG2의 레벨을 측정하여 평가하였다.
세포를 PI3K 억제제인 LY294002와 함께 3, 6, 또는 24시간 동안 배양한 결과, A2780DR에서 p-AKT의 레벨은 점차 감소되었다(도 10A).
특히, A2780DR에서 상승된 BCRP/ABCG2 단량체의 수준은 LY294002에 의하여 시간 의존적으로 점차 감소하였다.
또한 A2780DR의 면역조직 화학적 분석에서도 BCRP/ABCG2의 발현 감소를 확인하였고, BCRP/ABCG2-양성 형광 강도는 3시간의 배양 동안 감소되었다(도 10B).
특히, 공초점 이미지의 x-s 분석에서 A2780DR의 세포막에서 BCRP/ABCG2 레벨이 증가하며, LY294002에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 내성 세포의 BCRP/ABCG2 과발현과 PI3K은 관련이 있는 것을 확인하였다.
다음으로, BCRP/ABCG2 발현에서 c-MET 억제제의 효과를 조사하였다.
SU11274를 3 내지 24시간 동안 처리한 결과, A2780DR에서 p-AKT 레벨과 BCRP 단량체 레벨이 억제된 것을 확인하였다(도 10C).
더불어 c-MET 억제제 처리는 세포막 BCRP/ABCG2 레벨의 감소를 이끌었다(도 10D).
c-MET과 BCRP/ABCG2 와의 연관성을 확인하기 위해, A2780DR에 c-MET-특이적 siRNA(#51 및 #52)를 처리하여 일시적으로 c-MET 발현을 억제하고 BCRP 발현을 조사하였다.
그 결과, c-MET의 유전적 억제는 효과적으로 BCRP 단백질 레벨을 감소시켰다(도 10E).
< 실시예 9> 추가 암세포에서 c-MET- BCRP / ABCG2 신호 전달 확인
상기 실시예를 통해 활성화된 c-MET 신호전달이 BCRP/ABCG2 과발현을 이끌며, 이는 A2780DR에서 Dox와 PDT에 대한 내성을 유도한다는 것을 확인하였다.
더불어 추가 암세포에서도 이를 확인하였다.
이를 위해, c-MET 과발현 암 세포주로써 유방암 세포주인 MDA-MB-231과 결장암 세포인 HT29를 선택하여 c-MET 억제제의 BCRP/ABCG2 발현과 Dox 반응에 대한 영향을 확인하였다.
그 결과 먼저, 웨스턴 블롯 분석을 통해 c-MET 단백질이 두 가지 암세포 모두에서 높게 발현된다는 것을 발견하였다(도 11A).
다음으로, C-MET-특이 siRNA(#51)를 형질주입하였을 때, BCRP/ABCG2 단백질 레벨이 두 세포주 모두 감소된 것을 확인하였다(도 11B).
더불어 C-MET-특이 siRNA가 주입된 MDA-MB-231 세포에 Dox를 처리했을 때, 세포 사멸이 더 증가됨을 보였다(도 11C).
마찬가지로, SU11274가 처리된 HT29 세포는 대조군과 비교하였을 때 Dox에 대한 감수성이 더 증가된 것을 보였다(도 11D).
이러한 결과를 통해 추가적인 암세포에서도 증가된 c-MET 신호전달은 BCRP/ABCG2 과발현과 관련이 있음을 확인하였다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for enhancing effect to doxorubicin and Photodynamic therapy against cancer comprising c-MET inhibitor <130> ADP-2015-0215 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDR1/ABCB1(sense) primer <400> 1 ctatgctgga tgtttccggt 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDR1/ABCB1(anti-sense) primer <400> 2 tcttcacctg gctcagt 17 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP1/ABCC1 (sense) primer <400> 3 agctttatgc ctgggagctg gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP1/ABCC1 (anti-sense) primer <400> 4 cggcaaatgt gcacaaggcc ac 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP2/ABCC2 (sense) primer <400> 5 gctgccacac ttcaggctct 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRP2/ABCC2 (anti-sense) primer <400> 6 ggcagccagc agtgaaagc 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCRP/ABCG2 (sense) primer <400> 7 cacaaccatt gcatcttggc tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCRP/ABCG2 (anti-sense) primer <400> 8 tgagagatcg atgccctgct tt 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF (sense) primer <400> 9 acagcttttt gccttcgagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF (anti-sense) primer <400> 10 taactctccc cattgcaggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-MET (sense) primer <400> 11 tatgtggctg ggactttgga 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-MET (anti-sense) primer <400> 12 gcttattcat ggcaggacca ac 22 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Predesigned c-MET siRNA#51(1) <400> 13 gugaagaucc cauugucua 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Predesigned c-MET siRNA#51(2) <400> 14 uagacaaugg gaucuucac 19

Claims (10)

  1. SU11274 [(3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-(3,5-다이메틸-4-[4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일메틸렌-N-메틸-2-옥소-2,3-다이하이드로-1H-인돌-5-설폰아마이드]를 유효성분으로 포함하며, 상기 SU11274는 독소루비신에 대한 내성을 감소시켜 독소루비신의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 LY294002 (2-모르폴린-4-일-8-페닐크로멘-4-온)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 항암 효과는 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 고형암의 항암 효과인 것을 특징으로 하는 독소루비신의 항암 효과 증진용 약학 조성물.
  6. SU11274 [(3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-(3,5-다이메틸-4-[4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일메틸렌-N-메틸-2-옥소-2,3-다이하이드로-1H-인돌-5-설폰아마이드]를 유효성분으로 포함하며, 상기 SU11274는 광역동 치료(Photo Dynamic Therapy, PDT)의 내성을 감소시켜 PDT의 항암 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 LY294002 (2-모르폴린-4-일-8-페닐크로멘-4-온)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 6항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 항암 효과는 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 고형암의 항암 효과인 것을 특징으로 하는 광역동 치료의 감수성 증진용 약학 조성물.





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