ES2963635T3

ES2963635T3 - Vacunas de péptido PD1 humano y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2963635T3
Application number: ES18778305T
Authority: ES
Inventors: Pravin T P Kaumaya; Tanios Bekaii-Saab
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Ohio State Innovation Foundation
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Ohio State Innovation Foundation
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2024-04-01
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: BR112019020386A2; EP3600398A1; JP7346302B2; CN110636855A; RU2019131252A; AU2018243920A1; CA3058393A1; US20200197498A1; WO2018183488A1; JP2020512375A; RU2019131252A3; KR102653567B1; EP3600398A4; US11684660B2; KR20190137826A; EP3600398B1

Abstract

Se divulgan composiciones relacionadas con péptidos PD-1 sintéticos, péptidos PD-1 quiméricos, anticuerpos anti-PD-1 y métodos para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y enfermedad de Alzheimer usando dichos péptidos o anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas de péptido PD1 humano y usos de las mismas

Antecedentes

El cáncer es actualmente la causa principal de muerte en los países desarrollados y en todo el mundo. La carga económica de esta enfermedad, y más importante, el sufrimiento que causa, es inmenso. Existe una necesidad evidente y urgente de acelerar el desarrollo y aplicación de nuevos tratamientos anticáncer más eficaces. El campo de la oncología es vasto y comprende varias indicaciones, incluyendo algunas formas raras/huérfanas. Aunque la oncología continúa siendo una de las áreas más activas en términos de desarrollo de fármacos, todavía sigue existiendo una significativa necesidad no satisfecha.

Los últimos avances en la inmunología del cáncer han documentado la importancia de la inmunidad antitumoral mediada por linfocitos T contra los cánceres humanos, y los receptores inhibitorios expresados por los linfocitos T se han convertido en importantes dianas para la inmunoterapia del cáncer. La señalización a través del punto de control inmunitario de la proteína-1 de muerte celular programada (PD-1, por sus siglas en inglés) permite el avance tumoral al amortiguar las respuestas inmunitarias antitumorales. El bloqueo terapéutico del eje de señalización entre PD-1 y su ligando, la proteína-1 de muerte celular programada (PD-L1, por sus siglas en inglés) utilizando anticuerpos monoclonales ha tenido un notable éxito clínico en el tratamiento del cáncer y ha demostrado una actividad impresionante en un amplio conjunto de subtipos de cáncer, incluso en estadios avanzados y metastásicos de la enfermedad. Los terapéuticos con diana en dicha ruta actualmente se encuentran en ensayo clínico. El pembrolizumab y el nivolumab son los primeros de esta familia de ruta anti-PD-1 de inhibidores de punto de control en obtener una aprobación acelerada por parte de la Administración estadounidense de alimentos y fármacos (FDA) para el tratamiento del melanoma refractario al ipilimumab.

Los anticuerpos monoclonales con diana en puntos de control inmunitario y especialmente el eje PD-1/PD-L1 han proporcionado resultados espectaculares en el tratamiento del cáncer en los últimos años. A pesar de su probada utilidad, los anticuerpos adolecen de desventajas específicas como terapéuticos, entre ellas la reducida penetrancia en tejidos/tumor, lo que puede ser especialmente pertinente en el caso de que la diana sea la ruta de señalización PD-1:PD-L1. Por ejemplo, se han observado linfocitos T efectores que expresan PD-1 infiltrados dentro del tejido sólido de tumores expresantes de PD-L1. Lo anterior resulta problemático para los anticuerpos, a los que resulta difícil entrar en los tumores debido a que son muy grandes. Por lo tanto, se infiere que los anticuerpos podrían no antagonizar en absoluto la señalización de PD-1:PD-L1 en el sitio terapéutico deseado dentro de los tumores, comportando una eficacia subóptima.

Los bloqueos de punto de control han activado un nuevo cambio de paradigma en la inmunoterapia del cáncer. Sin embargo, en muchos pacientes de cáncer no se ha observado respuesta a los bloqueos del punto de control PD-1/PD-L1. Lo que se necesita son nuevos inhibidores del punto de control PD-1/PD-L1 para el tratamiento del cáncer, las infecciones víricas, las enfermedades autoinmunes y la enfermedad de Alzheimer.

Sumario

Se dan a conocer métodos y composiciones relacionados con péptidos PD-1 sintéticos según se definen en las reivindicaciones.

En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos quiméricos PD-1 para estimular una respuesta inmunitaria a una proteína PD-1 que comprende uno o más epítopos de linfocitos B de PD-1, un epítopo de linfocito T ayudante (Th, por sus siglas en inglés) (que consiste en un péptido de proteína de fusión de virus del sarampión, SEC iD n.° 6 y un conector (tal como, por ejemplo, la SEC ID n.° 7) que se une el epítopo de linfocito B de PD-1 al epítopo Th, en el que el epítopo o epítopos de los linfocitos B de PD-1 consisten en la SEC ID n.° 5.

En la presente memoria se dan a conocer, además, péptidos quiméricos de cualquier aspecto precedente, en los que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 11.

En un aspecto (no cubierto por las reivindicaciones de la invención), en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos para estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína PD-1 que comprende una o más de las secuencias indicadas en SEC ID n.° 12, SEC ID n° 13, SEC ID n.° 14 o SEC ID n.° 15, incluyendo el enantiómero D de las secuencias dadas a conocer. En un aspecto, el péptido sintético puede estar acetilado.

En la presente memoria se dan a conocer, además, péptidos quiméricos que comprenden el péptido sintético de cualquier aspecto precedente, que comprende adicionalmente un epítopo de Th (un péptido de proteína de fusión de virus del sarampión que consiste en la SEC ID n.° 6) y un conector (tal como, por ejemplo, la SEC ID n.° 7) que une el péptido PD-1 sintético al epítopo Th.

En la presente memoria se dan a conocer, además, péptidos quiméricos (no cubiertos por las reivindicaciones de la invención) de cualquier aspecto precedente, en los que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18 o SEC ID n° 19.

En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más péptidos quiméricos o sintéticos de cualquiera de los precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se dan a conocer, además, composiciones farmacéuticas de cualquier aspecto precedente que comprenden, además, uno o más epítopos de linfocito B HER-2 (tales como, por ejemplo, la SEC ID n° 27, SEC ID n° 28, SEC ID n° 29 o SEC ID n° 30) y/o uno o más anticuerpos anti-Her-2.

En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos quiméricos PD-1 tal como se definen en las reivindicaciones para el uso en métodos de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer o enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprenden administrar en el sujeto cualquiera de los péptidos o composiciones de cualquier aspecto precedente.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de la presente especificación, ilustran varias realizaciones y junto con la descripción ilustran las composiciones y métodos dados a conocer. Algunas realizaciones dadas a conocer que no están cubiertas por las reivindicaciones sin embargo están representadas en las figuras.

La figura 1 muestra vistas de detalle de la interfaz PD-1_h/PD-L1_h. Se representa PD-1_h y PD-L1_h como cintas azules y verdes, respectivamente. Todos los residuos que son importantes para la interacción se destacan en forma de bastones. Los residuos que forman el núcleo hidrofóbico se han coloreado de amarillo. Las moléculas de agua se muestran como esferas rojas. Los enlaces de hidrógeno se ilustran como líneas discontinuas negras. (A) Vista frontal Zak et al., 2015, Structure 23, 2341-2348. (B) Péptidos PD-1 modelados.

Las figuras 2A, 2B y 2C muestran el modelado de los péptidos PD-1 como epítopos de conformación. La figura 2A<muestra PD-1 (32-50) (SEC ID n.° 2). La figura 2B muestra PD-1 (73-90)>(SeC<ID n.° 4). La figura 2C muestra PD-1>(92-110) (SEC ID n.° 5).

Las figuras 3A, 3B, 3C, 3D y 3E muestran la espectroscopía de resonancia del plasmón superficial para experimentos de unión al dominio extracelular del PD-L1_h humano. Los niveles de inmovilización resultantes para PD-L1_rh (figura 3a), nivolumab (figura 3B), IgG humana (figura 3C) eran 2345 UR, 12264 UR y 11651 UR, respectivamente. Se realizó la validación del chip sensor mediante la medición de la especificidad de la unión de PD-1_fh y del nivolumab. Se inyectó PD-1_rh 1 pM (17,3 pg/ml) en el chip durante 3 minutos a razón de 10 pl/min (figura 3D). Se utilizó BSA 1 pM como control negativo. El chip se regeneró con glicina-HCl 10 mM, pH 2,5 (figura 3E).

Las figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E y 4F muestran que los péptidos MVF y los péptidos acetilados se unen a PD-L1_rh y al nivolumab. MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90) y MVF-PD-1 (92-110) se unen a PD-L1_rh inmovilizado (figura 4A) o a nivolumab (figura 4B). Ac-PD-1 (45-64), Ac -PD-1 (73-90) y Ac -PD-1 (92-110) se unen a PD-L1_rh inmovilizado (figuras 4C y 4D) o a nivolumab (figuras 4E y 4F).

La figura 5A muestra que la 1a (1Y+39, 3a (2Y+3) y 6a (3Y+3) extracciones de ensayo se sometieron a ensayo mediante ELISA a razón de 200 ng/pocillo de Péptido MVF. Los sueros se diluyeron inicialmente 1:2000 y después se diluyeron en serie bajando en la placa hasta un máximo de 1:250.000. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm.

La figura 5B muestra que los sueros de extracciones terminales se sometieron a ensayo mediante ELISA a razón de 200 ng/pocillo de los diversos constructos peptídicos (Péptido MVF, péptido acetilado, péptido libre y proteína PD-1 humana recombinante). Los sueros se diluyeron inicialmente 1:20000 y después se diluyeron en serie bajando en la placa hasta un máximo de 1:250.000. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm.

La figura 5C muestra un anticuerpo purificado a partir de los sueros terminales que se sometió a ensayo mediante ELISA a razón de 200 ng/pocillo de péptido. El anticuerpo se diluyó inicialmente a 20 pg/ml y después se diluyó en serie bajando en la placa hasta un máximo de 625 ng/ml. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm.

La figura 6 muestra que los esplenocitos de ratones transgénicos para RCT no expuestos resultaron activados con MBP Ac1-11 durante 3 días. Se determinó la expresión de PD-1 mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con anticuerpos a-mPD-1 o a-PD-1_h, según se indica. Se seleccionaron las células que eran linfocitos T CD4+.

La figura 7 muestra que los anticuerpos policlonales a-PD-1_h purificados alteran la proliferación específica de antígeno de las células T CD4 específicas de mielina. (A) Se marcaron con CFSE esplenocitos procedentes de ratones transgénicos para RCT no expuestos y se activaron con MBP Ac1-11 en la presencia de 50 mg/ml de anticuerpos aPD-1_h o IgG de conejo de control, durante 4 días. Se seleccionaron las células que eran linfocitos CD4+. (B) Superposición de histogramas de CFSE de células tratadas con anticuerpo aPD-1_h específico (azul) con las tratadas con IgG de conejo de control (rojo) en (A).

La figura 8 muestra un esquema de la vacunación de ratones y la injertación de tumores. Los ratones recibieron un total de 3 vacunaciones a intervalos de 3 semanas. Diez días después de la tercera vacunación, se retaron los ratones con 1x105 célula tumorales CT26 de carcinoma de colon murino por vía subcutánea en el flanco derecho. Los ratones de control fueron inoculados con la línea celular CT26 y tratados cada 3 días con un anticuerpo monoclonal de PD-1 de ratón.

La figura 9 muestra la inmunogenicidad de las vacunas de PD-1. Se sometieron a ensayo conjuntos de sueros mediante ELISA a razón de 200 ng/pocillo de Péptido MVF. Se sometieron a ensayo concentraciones de suero entre 1:100 y 1:250.000. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm.

La figura 10 muestra que se aislaron esplenocitos (A) y células infiltrantes de tumor (B) de la totalidad de los 5 grupos de ratones tratados. Se determinaron las células CD4 y CD8 mediante citometría de flujo (seleccionadas a partir de células CD45+CD3+). Se determinaron las células T reguladoras Foxp3+CD25+CD4+ mediante tinción intracelular. Todos los linfocitos T CD4 y CD8 se seleccionaron a partir de células CD45+CD3+. Las células Treg se seleccionaron a partir de células CD45+CD3+CD4+. Grupo A=péptido de control, Grupo B=32-50; Grupo C=45-64; Grupo D=73-90; Grupo E=92-110; Grupo F=a-PD-1 de ratón (control positivo).

Las figuras 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G y 11H muestran los gráficos individuales de crecimiento tumoral en ratones Balb/c (5/grupo) inmunizados para cada uno de los cuatro constructos de PD-1. A: (PD-1(32-50), B: PD-1 (45 64), C: PD-1 (73-90) y D: PD-1 (92-110), péptido de control (E: péptido irrelevante) y un grupo de control positivo (F) tratado con anticuerpo monoclonal anti-PD-1 de ratón. Las figuras 11G y 11H muestran gráficos individuales en ratones Balb/c singénicos inmunizados con constructos de vacuna de PD-1 y retados 10 días después de la tercera vacunación con células de carcinoma CT26 (1x105). Se realizó un seguimiento de los ratones con tumor y se clasificaron según la formación de tumores palpables, dos veces a la semana, y se sacrificaron el día 19.

Las figuras 12A, 12B, 12C y 12D muestran la distribución de las medidas de LWW y LWH el día 14 para MVF-PD-1(32-50), MVF-PD-1(45-64), MVF-PD-1(73-90) y MVF-PD-1(92-110). Se muestran LWW (12A) y LWH (12B) para MVF-PD-1(92-110). La figura 12C muestra la distribución de LWW14 para cada uno de MVF-PD-1(32-50), MVF-PD-1(45-64), MVF-PD-1(73-90) y MVF-PD-1(92-110). La figura 12D muestra la distribución de LWH14 para cada uno de MVF-PD-1(32-50), MVF-PD-1(45-64), MVF-PD-1(73-90) y MVF-PD-1(92-110).

Las figuras 13A y 13B muestran que aPD_h-1-45 y aPD_h-1-73 suprimen la proliferación específica de mielina. Los esplenocitos marcados con CFSE procedentes de ratones transgénicos para RCT Va2.3/Vp8.2 no expuestos que son específicos para MBP Ac1-11 resultaron activados por MBP Ac1-11 en la presencia de 50 pg/ml de anticuerpos aPD-1_h o IgG de conejo de control. Se analizó CFSE mediante citometría de flujo (13A). Se seleccionaron las células que eran linfocitos CD4+. Los números de células por generación de proliferación se resume en 13B.

La figura 14 muestra la inmunogenicidad de las vacunas de PD-1. Se sometieron a ensayo mediante ELISA sueros agrupados a razón de 200 ng/pocillo de Péptido MVF. Se sometieron a ensayo concentraciones de suero entre 1:100 y 1:250.000. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 leída a A de 415 nm^.

La figura 15 muestra gráficos de medias de crecimiento tumoral en ratones Balb/c singénicos (5/grupo) inmunizados con cuatro constructos de vacuna MVF de PD-1. A: (PD-1(32-50), B: PD-1 (45-64), C: PD-1 (73-90) y D: PD-1 (92 110), E: control positivo (péptido irrelevante); F: anticuerpo monoclonal anti-PD-1 de ratón de control positivo (29F.1A12). Los ratones se retaron 15 días después de la tercera vacunación con células de carcinoma CT26 (1x105). Se realizó un seguimiento de los ratones y se clasificaron según la formación de tumores palpables; se midieron los tumores dos veces a la semana utilizando un pie de rey. Los animales se sacrificaron el día 19.

La figura 16 muestra el programa de vacunación de combinación en ratones BALB/c seguido del reto con células de carcinoma CT26/HER-2. Se utilizó el modelo tumoral CT-26-HER-2 en ratones Balb/c para someter a ensayo los efectos sinérgicos de la terapia de inmunización anti-PD1 en combinación con terapia de inmunización anti-HER2. Las vacunas peptídicas se administraron solas o en combinación, tal como se indica. Las vacunas se disolvieron en agua y se emulsificaron en Montanide ISA 720 (1:1) y 50 pg no-MDP (N-acetilglucosamina-3-il-acetil-I-alanil-d-isoglutamina). Los ratones recibieron un total de 3 vacunaciones a intervalos de 3 semanas. Se inmunizaron ratones Balb/c hembra (Charles River Laboratories) de 5 a 6 semanas de edad, tres veces a intervalos de 3 semanas con 100 pg de cada vacuna peptídica, y 2 semanas después de la tercera inmunización, los ratones fueron retados por vía subcutánea (s.c.) en el flanco derecho con células tumorales CT-26-HER-2 neu (1x105 células/ratón). Los ratones Balb/c fueron tratados dos veces a la semana con el mAb anti-PD-1 de ratón 29F.1A12 (Bio X Cell, West Lebanon, NH). Se utilizó una dosis de 200 pg como control positivo o PBS como control negativo. Se realizó un seguimiento de los ratones y se clasificaron según la formación de tumores palpables, dos veces a la semana durante un máximo de 21 días, y se sacrificaron en el caso de que los tumores se volviesen necróticos o superasen el tamaño predeterminado, de 2.000 mm<3>. Se midieron los volúmenes tumorales en milímetros cúbicos con un pie de rey se calcularon con la fórmula siguiente: A*B<2>*0,5, en la que "A" es el diámetro máximo y "B" es el diámetro mínimo.

V = [ (longitud x anchura<2>) / 2]

Durante la inmunización, se extrajo sangre cada dos semanas y se utilizó en ensayos ELISA para monitorizar los títulos de anticuerpo. Los ratones fueron eutanizados al final del tratamiento y se extrajeron los tumores y se conservaron muestras taradas de los tumores para el estudio adicional y para el examen histológico. También se extrajo el bazo para un examen adicional. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la política de cuidado humano y uso de animales de laboratorio de Servicio de salud pública estadounidense y con la aprobación del Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Ohio State University, y tal como se detalla en el protocolo acordado.,

La figura 17 muestra los antígenos individuales de inmunogenicidad en ratones tratados con las tres dosis de vacuna. Se sometieron a ensayo mediante ELISA agrupados de sueros procedentes de ratones inmunizados con 3 péptidos (HER-2(266-296), HER-2(597-626) y PD-1(92-110)) en 200 ng/pocillo de Péptido MVF. Se sometieron a ensayo concentraciones de suero entre 1:100 y 1:512.000. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo; la reacción enzimática se detuvo tras 10 minutos con una solución de SDS al 0,1 %. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm. Se extrajeron muestras de suero 1Y+3, 2Y+1, 2Y+3 y 3Y+2 antes del reto con tumor CT-26 HER-2 neu. Las muestras 3Y+3 y 3Y+5 se extrajeron 1 y 3 semanas después del reto, respectivamente.

La figura 18 muestra que la triple vacunación HER-2(266) HER-2(597) PD-1 (92) causa una inhibición significativa (p<0,001) del crecimiento tumoral en ratones BABL/c retados con la línea celular de carcinoma de colon CT26/HER-2 en comparación con el mAb a-PD-1 de ratón (29F.1A12), MVF-PD-1 (92-110), PBS de control negativo o péptido irrelevante.

Las figuras 19A y 19B muestran que la combinación de vacunas de HER-2 y PD-1 muestra una inmunogenicidad e inhibición mejoradas del crecimiento tumoral. Los gráficos de crecimiento tumoral en ratones Balb/c singénicos (10/grupo) inmunizados 3 veces a intervalos de 3 semanas con PD-1 (92-110) solo, en combinación con inmunización con dos inmunógenos de péptido HER-2 o con inmunógenos HER-2 solos. Los ratones fueron retados 15 a 18 días después de la tercera vacunación con células de carcinoma CT-26 HER-2 (1x10<5>). Los ratones con PBS (controles negativos) fueron retados con tumores y seguidamente tratados dos veces a la semana con inyecciones IP de PBS. Se realizó un seguimiento de los ratones y se clasificaron según la formación de tumores palpables, que después se midieron periódicamente con un pie de rey. Las barras de error son una representación del error estándar para el grupo de ratones y los valores de p comparan diversos grupos de ratones tratados con PBS de control negativo.

Las figuras 20A, 20B, 20C y 20D muestran que se aislaron linfocitos infiltrantes de tumor (LIT) de cada ratón en 4 grupos. Se determinaron los linfocitos T CD4 (20A) y CD8 (20B) mediante citometría de flujo (seleccionadas de células CD45<+>). Se determinaron los linfocitos T<reg>Foxp3<+>CD25<+>CD4<+>(0C) mediante tinción intracelular (seleccionadas de células CD45<+>CD4<+>). La figura 20D muestra la relación de linfocitos T CD8<+>a T<reg>. Se calcularon las medias de grupo y se compararon mediante ANOVA.

Las figuras 21A y 21B muestran el análisis linfocitos infiltrantes de tumor procedentes de ratones vacunas con péptido. La figura 21A muestra los datos combinados del primer experimentoin vivoy los grupos 5 y 6 del segundo experimentoin vivo.Se aislaron las células infiltrantes de tumor de tejido tumoral agrupado de los 5 grupos (grupos A a F) de ratones tratados en el primer experimentoin vivo.Se aislaron las células infiltrantes de tumor de cada ratón en los grupos 5 y 6 del segundo experimentoin vivo.Se determinaron las células CD4 y CD8 mediante citometría de flujo (seleccionadas de células infiltrantes CD45<+>). Se determinó la expresión de FoxP3 en células T CD25<+>CD4<+>mediante tinción intracelular (seleccionadas de células CD45<+>CD4<+>). La figura 21B muestra las células infiltrantes de tumor aisladas de cada ratón en los grupos 1 a 4 del segundo experimentoin vivo. Se determinaron las células CD4 y CD8 mediante citometría de flujo (seleccionadas de células infiltrantes CD45<+>). Se determinó la expresión de FoxP3 en los linfocitos T CD25<+>CD4<+>mediante tinción intracelular (seleccionadas de células CD45<+>CD4<+>). Se calcularon las medias de grupo y se compararon mediante ANOVA. Las barras de error denotan los errores estándares de la media (s.e.m., por sus siglas en inglés).

Descripción detallada

Antes de que se den a conocer y describan los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, debe entenderse que no se encuentran limitados a métodos sintéticos específicos o a métodos biotecnológicos recombinantes específicos, a menos que se especifique lo contrario, o a reactivos particulares, a menos que se especifique lo contrario, ya que estos evidentemente pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y que no pretender ser limitativa.

A. Definiciones

Tal como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas individuales «un», «una» y «el» o «la», incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de dichos portadores, y similares.

Los intervalos pueden expresarse en la presente memoria entre "aproximadamente" un valor particular y/o "aproximadamente" otro valor particular. En el caso de que se exprese dicho intervalo, otra realización incluye entre un valor particular y/o el otro valor particular. De manera similar, en el caso de que se expresen valores como aproximaciones, mediante la utilización del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá, además, que los extremos de cada uno de los intervalos son significativos en relación al otro extremo, e independientemente del otro extremo. Se entiende además que existen varios valores dados a conocer en la presente memoria y que cada valor también se da a conocer en la presente memoria como "aproximadamente" ese valor particular además del valor mismo. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer el valor "10", entonces también se da a conocer "aproximadamente 10". También se entiende que, en el caso de que se dé a conocer un valor "inferior o igual al valor", también se están dando a conocer un valor "superior o igual al valor" y los posibles intervalos entre valores, según entenderá apropiadamente el experto en la materia. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer que el valor "10" también se da a conocer un valor "inferior o igual a 10", así como un valor "superior o igual a 10". Se entiende, además, que, a lo largo de toda la solicitud, se proporcionan datos en varios formatos diferentes, y que estos datos representan extremos y puntos iniciales, e intervalos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular "15", se entenderá que superior a, superior o igual a, inferior a, inferior o igual a, e igual a "10" y "15" también han sido dados a conocer como entre "10" y "15". Se entiende además que cada unidad entre dos unidades particulares también se ha dado a conocer. Por ejemplo, en el caso de que se den a conocer 10 y 15, entonces también se han dado a conocer 11, 12, 13 y 14.

En la presente especificación y en las reivindicaciones siguientes se hará referencia a varios términos que se definirán con los significados siguientes.

El término "opcional", u "opcionalmente", se refiere a que el suceso o circunstancia indicado seguidamente puede ocurrir o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que dicho suceso o circunstancia ocurre y casos en los que no ocurre.

El término "administrar" se refiere a una administración que es oral, tópica, intravenosa, subcutánea, transcutánea, transdérmica, intramuscular, intraarticular, parenteral, intraarteriolar, intradérmica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal, mediante inhalación o mediante un depósito implantado. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal, o técnicas de infusión.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que comprende" pretende referirse a que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero sin excluir otros elementos. La expresión "que consiste esencialmente en" cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significará que excluye otros elementos de cualquier significación esencial para la combinación. De esta manera, una composición que consista esencialmente en los elementos definidos en la presente memoria no excluirá contaminantes residuales por el método de aislamiento y purificación y portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes y similares.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosis.

Los términos "tratar", "tratando y "tratamiento", y variaciones gramaticales de los mismos tal como se utilizan en la presente memoria, incluyen retrasar, aliviar, mitigar o reducir parcial o totalmente la intensidad de uno o más síntomas acompañantes de un trastorno o afección y/o aliviar, mitigar o bloquear una o más causas de un trastorno o afección. Pueden aplicarse tratamientos según la invención de manera preventiva, profiláctica, paliativa o terapéutica. En algunos casos, los términos "tratar", "tratando", "tratamiento" y variaciones gramaticales de los mismos incluyen reducir parcial o totalmente el tamaño del tumor, reducir el número de tumores y reducir la gravedad/capacidad metastásica del tumor en comparación con la situación anterior al tratamiento del sujeto o en comparación con la incidencia de dicho síntoma en una población general o de estudio.

El término "inhibe" se refiere a una reducción de una actividad, respuesta, afección, enfermedad u otro parámetro biológico. Lo anterior puede incluir, aunque sin limitación, la ablación total de la actividad, respuesta, afección o enfermedad. Lo anterior puede incluir, además, por ejemplo, una reducción de 10 % de la actividad, respuesta, afección o enfermedad en comparación con el nivel nativo o de control. De esta manera, la reducción puede ser una reducción de 10 %, 20, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, o cualquier cantidad de reducción intermedia en comparación con los niveles nativos o de control.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "sujeto" se refiere a un individuo. De esta manera, el "sujeto" puede incluir animales domesticados (p. ej., gatos, perros, etc.), ganado (p. ej., vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (p. ej., ratones, conejos, ratas, cobayas, etc.) y aves. El término "sujeto" también puede incluir mamíferos, tales como primates o seres humanos.

El término "reduce" u otras formas del término, tales como "reductor" o "reducción", se refieren a bajar la incidencia de un suceso o característica (p. ej., el crecimiento tumoral). Se entiende que lo anterior habitualmente está relacionado con algún valor estándar o esperado; en otras palabras, es relativo, aunque no es siempre necesario hacer referencia al valor estándar o relativo. Por ejemplo, "reduce el crecimiento tumoral" se refiere a reducir la tasa de crecimiento de un tumor respecto a un estándar o un control.

El término "prevenir", u otras formas del término, tales como "previniendo" o "prevención", se refieren a detener un suceso o característica particular, a estabilizar o retrasar el desarrollo o progresión de un suceso o característica particular, o a minimizar la probabilidad de que ocurra un suceso o característica particular. Prevenir no requiere la comparación con un control, ya que habitualmente es más absoluto que, por ejemplo, reducir. Tal como se utiliza en la presente memoria, podría reducirse algo, pero no prevenirse, aunque algo que se reduce también podría prevenirse. De manera similar, algo podría prevenirse, pero no reducirse, aunque algo que se previene también podría reducirse. Se entiende que en donde se utiliza reducir o prevenir, a menos que se indique específicamente lo contrario, también se da a conocer expresamente la utilización del otro término.

Las referencias en la especificación y reivindicaciones finales de partes en peso de un elemento o componente particular en una composición denotan la relación en peso entre el elemento o componente y cualesquiera otros elementos o componentes en la composición o artículo del que se expresa una parte en peso. De esta manera, en un compuesto que contiene 2 partes en peso de componente X y 5 partes en peso de componente Y, X e Y están presentes en una proporción en peso de 2:5 y se encuentran presentes en dicha proporción con independencia de si se encuentran contenidos componentes adicionales en el compuesto. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "% en peso" o "porcentaje en peso" de un componente, a menos que se indique específicamente lo contrario, se refiere a la proporción del peso del componente respecto al peso total de la composición en la que está incluido el componente, expresado en porcentaje.

A lo largo de toda la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones.

B. Composiciones

Se dan a conocer los componentes que deben utilizarse para preparar las composiciones dadas a conocer, así como las composiciones mismas que deben utilizarse en los métodos dados a conocer en la presente memoria. Dichos materiales, y otros, se dan a conocer en la presente memoria, y se entiende que, al darse a conocer combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de dichos materiales, aunque la referencia específica a cada una de diversas combinaciones individuales y colectivas, y la permutación de dichos compuestos, podría no darse a conocer explícitamente, cada una se encuentra específicamente contemplada y descrita en la presente memoria. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer y se analice un péptido PD-1 sintético o quimérico particular y se analicen varias modificaciones en varias moléculas, incluyendo el péptido PD-1 sintético o quimérico, se encuentran específicamente contempladas todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del péptido PD-1 sintético o quimérico y las modificaciones que son posibles, a menos que se indique específicamente lo contrario. De esta manera, en el caso de que una clase de moléculas A, B y C se dé a conocer, así como una clase de moléculas D, E y F y un ejemplo de una molécula de combinación, se dan a conocer A a D, entonces, aunque cada uno no se cite individualmente, se encuentra individual y colectivamente contemplado, es decir, las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se consideran dadas a conocer. De manera similar, se da a conocer además cualquier subgrupo o combinación de ellos. De esta manera, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se consideraría dado a conocer. Dicho concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud, incluyendo, aunque sin limitación, etapas en los métodos de preparación y utilización de las composiciones dadas a conocer. De esta manera, en el caso de que haya una diversidad de etapas adicionales que pueden llevarse a cabo, se entiende que cada una de dichas etapas adicionales puede llevarse a cabo con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos dados a conocer.

El gen PD-1, que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas, codifica una proteína transmembranal de tipo I de 55 kDa. Tanto la PD-1 de ratón como la PD-1 humana consisten en 288 aminoácidos y presentan un péptido de señal en el extremo N-terminal (20 aminoácidos) y en la región hidrofóbica en la parte intermedia, que es una región transmembranal. Las proteínas PD-1 humanas y murinas comparten una identidad de aminoácidos de aproximadamente 60 % a 80 % con la conservación de cuatro sitios posibles de N-glucosilación y residuos que definen el dominio V de la Ig. PD-1 se expresa sobre los linfocitos T, los linfocitos B y los macrófagos. Los ligandos de PD-1 son los miembros de la familia B7 siguientes: PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC). La señalización a través del punto de control inmunitario de la proteína-1 de muerte celular programada (PD-1, por sus siglas en inglés) permite el avance tumoral al amortiguar las respuestas inmunitarias antitumorales. El bloqueo terapéutico del eje de señalización entre PD-1 y su ligando, la proteína-1 de muerte celular programada (PD-L1) utilizando anticuerpos monoclonales ha tenido un notable éxito clínico en el tratamiento del cáncer y ha demostrado una actividad impresionante en un amplio conjunto de subtipos de cáncer. En la presente memoria se dan a conocer mejoras de los bloqueos tradicionales PD-1/PD-L1 utilizando terapéuticos peptídicos no anticuerpos que son más pequeños y vacunas peptídicas que bloquean directamente la interacción entre PD-1 y PD-L1 o que pueden estimular respuestas inmunitarias del huésped para generar anticuerpos contra PD-1 que bloquean la interacción PD-1/PD-L1.

Mediante la utilización de análisis asistido por ordenador de los epítopos de linfocitos B de PD-1, se obtuvieron secuencias correspondientes a PD-1 (SEC ID n.° 1) residuos 32-50, 45-64, 73-90 y 92-110. De esta manera, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos para estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína PD-1 que comprende los residuos 32-50, 45-64, 73-90 (no cubiertos por la invención) y/o 92-100 de PD-1. Por ejemplo, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos para estimular una respuesta inmunitaria contra la proteína PD-1 que comprenden VLNWYRMSPSNQTd KlAAF (SEC ID n.° 2), KLAAFPEDRSQPGQDCRFR (SEC ID n.° 3), DFHMSVVRARRNDSGTYL (SEC ID n° 4) (no cubierta por la invención) y/o GAISLAPKAQIKESLRAEL (SEC ID n.° 5). En un aspecto, los péptidos pueden acilarse y/o amidarse. De esta manera, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos para estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína PD-1 que comprende (SEC ID n.° 2), (SEC ID n.° 3), (SEC ID n.° 4) (no cubierta por la invención) y/o (SEC ID n.° 5), en los que el péptido sintético se acila y/o se amida.

En algunos casos, los usos de un análogo de la secuencia de L-aminoácidos puede proporcionarse ventajas a la secuencia de bases, tales como la resistencia a la degradación, estabilidad, facilidad de síntesis o presentar secuencias que pueden comprender la secuencia de L-aminoácidos en orden inverso de extremo aminoterminal a carboxiterminal. Por ejemplo, la secuencia retro de SEC ID n.° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4) (no cubierta por la invención) y SEC ID n.° 5, son FAALKDTQNSPSMRYWNLV (SEC ID n.° 12), RFRCDQGPQSRDEPFAALK (SEC ID n.° 13), LYTGSDNRRARVVSMHFD (SEC ID n.° 14), y LEARLSEKIQAKPALSIAG (SEC ID n.° 15), respectivamente. Dichas secuencias retro también pueden presentar la conformación especular de la secuencia de bases. De esta manera, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos que comprenden una o más de las secuencias indicadas en SEC ID n.° 12, SEC ID n.° 13, Se C ID n.° 14, y/o SEC ID n.° 15. Al igual que con la SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, y SEC ID n.° 5, los péptidos sintéticos que comprenden SEC ID n.° 12, SEC ID n.° 13, SEC ID n.° 14 y/o SEC ID n.° 15 pueden acetilarse y/o amidarse.

Además, de los análogos retro de la secuencia de L-aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4) (no cubierta por la invención) y SEC ID n.° 5 que no se indican en la SEC ID n.° 12, SEC ID n.° 13, SEC ID n.° 14 y SEC ID n.° 15 son análogos de D-enantiómero de la secuencia de L-aminoácidos directa (SEC ID n.° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, y SEC ID n.° 5) y de la secuencia retro de L-aminoácidos (SEC ID n.° 12, s Ec ID n.° 13, SEC ID n.° 14 y SEC ID n.° 15) que pueden poseer una resistencia incrementada a la degradación y proteolisis, permitiendo una mejor administración oral, una eficacia ampliada y una mayor facilidad de síntesis. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos que comprenden una o más de SEC ID n.° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 5, SEC ID n.° 12, SEC ID n.° 13, SEC ID n.° 14 y/o SEC ID n.° 15, en las que los aminoácidos que comprende la secuencia son D-aminoácidos.

En un aspecto, se entiende, y está contemplado en la presente memoria, que los péptidos PD-1 sintéticos dados a conocer pueden presentar una estimulación incrementada de los linfocitos B mediante la unión de los péptidos PD-1 sintéticos a y un epítopo de linfocito T ayudante (Th) que estimula la liberación de citoquinas que ayudan a evadir la restricción del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (es decir, un epítopo promiscuo de célula Th), para formar un péptido PD-1 quimérico. Por ejemplo, en la presente memoria se dan a conocer péptidos quiméricos PD-1 para estimular una respuesta inmunitaria a una proteína PD-1 que comprenden uno o más epítopos de linfocitos B de PD-1 que comprenden, además, un epítopo de linfocito T ayudante (Th) (SEC ID n.° 6), en los que uno o más epítopos de linfocito B de PD-1 consiste en la secuencia SEC ID n.° 5. Se entiende, y se encuentra contemplado en la presente memoria, que el epítopo de linfocito B (es decir, el péptido sintético PD-1), puede comprender D-aminoácidos.

El epítopo de Th puede presentar entre aproximadamente 14 y aproximadamente 22, más preferentemente entre aproximadamente 15 y 21, lo más preferentemente 16 aminoácidos de longitud. En la invención, el epítopo de linfocito T consiste en la SEC ID n.° 6. Otras secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla 1 no forman parte de la invención.

Tabla 1

(continuación)

Para unir el péptido PD-1 sintético y el epítopo de célula Th, puede utilizarse un conector de aminoácidos. Preferentemente, el conector es un péptido de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 15 aminoácidos, más preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 aminoácidos y lo más preferentemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 aminoácidos de longitud. El conector más preferente comprende la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Ser-Leu (SEC ID n.° 7). De esta manera, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer, además, péptidos quiméricos que comprenden el péptido sintético de cualquier aspecto precedente, que comprende adicionalmente un epítopo de Th (que consiste en un péptido de proteína de fusión del virus del sarampión, SEC ID n.° 6) y un conector (tal como, por ejemplo, la SEC iD n.° 7) que une el péptido PD-1 sintético al epítopo Th. En la presente memoria se dan a conocer, en un aspecto, péptidos PD-1 quiméricos para estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína PD-1 que comprende uno o más epítopos de linfocito B de PD-1, un epítopo de linfocito T ayudante (Th) (que consiste en un péptido de proteína de fusión de virus del sarampión, SEC ID n.° 6) y un conector (tal como, por ejemplo, la SEC ID n.° 7) que une el epítopo de linfocito B al epítopo de Th, en el que el péptido PD-1 quimérico comprende la secuencia de aminoácidos indicada en KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLGAISLAPKAQIKESLRAEL (SEC ID n.° 11).

Al igual que con los péptidos sintéticos, se entiende, y se encuentra contemplado en la presente memoria, que los aminoácidos de los péptidos PD-1 sintéticos comprendidos dentro de los péptidos PD-1 quiméricos pueden ser análogos de D-aminoácido de los L-aminoácidos en la secuencia. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos quiméricos que comprenden cualquiera de los péptidos PD-1 sintéticos dados a conocer en la presente memoria, que comprenden, además, un epítopo de Th (que consiste en una proteína de fusión de virus del sarampión, SEC ID n.° 6) y un conector (tal como, por ejemplo, SEC ID n.° 7) que une el péptido PD-1 sintético al epítopo Th. En la presente memoria se dan a conocer, en un aspecto, péptidos PD-1 quiméricos que comprenden la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 11, en la que la secuencia del péptido PD-1 sintético (es decir, el epítopo de linfocito B) comprende D-aminoácidos.

1. Similitudes de secuencia.

Se entiende que, tal como se comenta en la presente memoria, la utilización de los términos "homología" e "identidad" tienen el mismo significado que "similitud". De esta manera, por ejemplo, en el caso de que el término "homología" se utilice entre dos secuencias no naturales, se entiende que ello no indica necesariamente una relación evolutiva entre dichas dos secuencias, sino que está centrado en la similitud o grado de relación entre sus secuencias de ácidos nucleicos. Muchos de los métodos para determinar la homología entre dos moléculas evolutivamente relacionadas se aplican de manera habitual en dos o más ácidos nucleicos o proteínas cualesquiera para el fin de medir la similitud de secuencias, con independencia de si están relacionadas evolutivamente o no.

En general, se entiende que una manera de definir cualesquiera variantes y derivados conocidos o aquellos que puedan aparecer, de los genes y proteínas dados a conocer en la presente memoria, es mediante las variantes y derivados en términos de homología respecto a secuencias conocidas específicas. Dicha identidad de secuencias particulares dada a conocer en la presente memoria también se comenta en otros sitios en la presente memoria. En general, las variantes de los genes y proteínas dados a conocer en la presente memoria normalmente presentan un porcentaje de homología aproximado de por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 respecto a la secuencia indicada o respecto a la secuencia nativa. El experto en la materia entenderá fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas o ácidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homología puede calcularse después de alinear las dos secuencias de manera que la homología se encuentre en su nivel alto.

Otra manera de calcular la homología puede llevarse a cabo mediante algoritmos publicados. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Se entiende que puede utilizarse habitualmente cualquiera de los métodos y que en determinados casos los resultados de dichos diversos métodos pueden diferir, aunque el experto en la materia entenderá que si se encuentra identidad con por lo menos uno de dichos métodos, se afirmará que las secuencias presentan la identidad indicada y que se darán a conocer en la presente memoria.

Por ejemplo, tal como se utiliza en la presente memoria, una secuencia que se indique que presenta un porcentaje de homología particular respecto a otra secuencia se refiere a secuencias que presentan la homología indicada según el cálculo mediante uno o más cualesquiera de los métodos de cálculo indicados anteriormente. Por ejemplo, una primera secuencia presenta una homología de 80 por ciento, tal como se define en la presente memoria, respecto a una segunda secuencia en el caso de que se calcule que la primera secuencia presenta una homología de 80 por ciento respecto a la segunda secuencia utilizando el método de cálculo de Zuker, aunque la primera secuencia no presente una homología de 80 por ciento respecto a la segunda secuencia según el cálculo mediante cualquiera de los demás métodos de cálculo. A título de otro ejemplo, una primera secuencia presenta una homología de 80 por ciento, tal como se define en la presente memoria, respecto a una segunda secuencia en el caso de que se calcule que la primera secuencia presenta una homología de 80 por ciento respecto a la secuencia utilizando tanto el método de cálculo de Zuker como el método de cálculo de Pearson y Lipman, aunque la primera secuencia no presente una homología de 80 por ciento respecto a la segunda secuencia según el cálculo mediante el método de cálculo de Smith y Waterman, el método de cálculo de Needleman y Wunsch, los métodos de cálculo de Jaeger o cualesquiera otros métodos de cálculo. A título de todavía otro ejemplo, una primera secuencia presenta una homología de 80 por ciento, tal como se define en la presente memoria, respecto a una segunda secuencia en el caso de que se calcule que la primera secuencia presenta 80 por ciento de homología respecto a la segunda secuencia utilizando cada uno de los métodos de cálculo ((aunque, en la práctica, los diferentes métodos de cálculo con frecuencia resultarán en diferentes porcentajes calculados de homología).

2. Péptidos

a) Variantes de proteína y péptido.

Tal como se comenta en la presente memoria, existen numerosas variantes de los péptidos PD-1 sintéticos y péptidos PD-1 quiméricos que se conocen y se contemplan en la presente memoria. Además, a las variantes conocidas de la cepa PD-1 funcional se suman derivados de los péptidos PD-1 sintéticos y péptidos PD-1 quiméricos que también funcionan en los métodos y composiciones dados a conocer. Las variantes y derivados de proteínas son bien conocidos por el experto en la materia y pueden implicar modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos normalmente se encuentran comprendidas en una o más de tres clases: variantes por sustitución, por inserción o por deleción. Entre las inserciones se incluyen fusiones aminoterminales y/o carboxiloterminales, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos individuales o múltiples. Las inserciones habitualmente serán inserciones más pequeñas que las de las fusiones aminoterminales o carboxiloterminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Los derivados de proteína de fusión inmunogénicos, tales como los indicados en los ejemplos, se generan mediante fusión de un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana mediante entrecruzamientoin vitroo mediante cultivo de células recombinantes transformadas con ADN codificante de la fusión. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos aminoácidos de la secuencia de la proteína. Normalmente se delecionan no más de aproximadamente 2 a 6 residuos en un sitio cualquiera dentro de la molécula de la proteína. Dichas variantes habitualmente se preparan mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN codificante de la proteína, produciendo de esta manera ADN codificante de la variante, y después expresando el ADN en el cultivo celular recombinante. Las técnicas para generar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN que presenta una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, la mutagénesis de cebador de M13 y la mutagénesis por PCR. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de residuos individuales, aunque pueden ocurrir en varias localizaciones diferentes simultáneamente; las inserciones habitualmente son del orden de aproximadamente entre 1 y 10 residuos aminoácidos y las deleciones serán de entre aproximadamente 1 y 30 residuos. Las deleciones o inserciones preferentemente se llevan a cabo en pares contiguos, es decir, una deleción de 2 residuos o la inserción de 2 residuos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para llegar a un constructo final. Las mutaciones no deben situar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Las variantes por sustitución son aquellas en las que se ha eliminado por lo menos un residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Dichas sustituciones generalmente se llevan a cabo de acuerdo con las Tablas 2 y 3, a continuación, y se denominan "sustituciones conservadoras".

TABLA 2: abreviaturas de aminoácidos.

(continuación)

TABLA 3: sustituciones de aminoácidos.

Se llevan a cabo cambios sustanciales en la función o identidad inmunitaria mediante la selección de las sustituciones que son menos conservadores que las indicadas en la Tabla 3; es decir, seleccionando residuos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios más grandes en las propiedades de la proteína serán aquellas en las que: (a) un residuo hidrofílico, p. ej., serilo o treonilo, se sustituya por (o con) un residuo hidrofóbico, p. ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo, (b) se sustituya una cisteína o prolina por (o con) cualquier otro residuo, (c) se sustituya un residuo que presenta una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histidilo, por ((o con) un residuo electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo, o (d) se sustituya un residuo que presenta una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, por (o con) una que no presente una cadena lateral, p. ej., glicina, en este caso, (e) mediante el incremento del número de sitios para la sulfatación y/o la glucosilación.

Por ejemplo, la sustitución de un residuo aminoácido por otro que es biológica y/o químicamente similar es conocida por el experto en la materia como "sustitución conservadora". Por ejemplo, una sustitución conservadora sustituiría un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Entre las sustituciones se incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Dichas variaciones sustituidas conservadoramente de cada secuencia dada a conocer explícitamente están incluidas dentro de los polipéptidos mosaico proporcionados en la presente memoria.

Puede utilizarse la mutagénesis por sustitución o por deleción para insertar sitios para la N-glucosilación (Asn-X-Thr/Ser) o la O-glucosilación (Ser o Thr). Las deleciones de cisteína u otros residuos lábiles también pueden resultar deseable. Las deleciones o sustituciones de posibles sitios de proteolisis, p. ej., Arg, se consigue, por ejemplo, mediante deleción de uno de los residuos básicos o mediante la sustitución de uno de ellos por residuos glutaminilo o histidilo.

Determinadas derivatizaciones postraduccionales son la consecuencia de la acción de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan postraduccionalmente en los residuos glutamilo y asparilo correspondientes. Alternativamente, dichos residuos se desamidan bajo condiciones levemente ácidas. Entre otras modificaciones postraduccionales se incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos o-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco páginas 79 a 86 [1983]), acetilación de la amina N-terminal y, en algunos casos, la amidación del carboxilo C-terminal.

Se entiende que una manera de definir las variantes y derivados de las proteínas dadas a conocer en la presente memoria es mediante la definición de las variantes y derivados en términos de homología/identidad respecto a las secuencias conocidas específicas. Se dan a conocer específicamente variantes de dichas proteínas y de otras proteínas que presentan una identidad de por lo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % respecto a la secuencia indicada. El experto en la materia entenderá fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología puede calcularse después de alinear las dos secuencias de manera que la homología se encuentre en su nivel alto.

Otra manera de calcular la homología puede llevarse a cabo mediante algoritmos publicados. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Pueden obtenerse los mismos tipos de homología para los ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos dados a conocer en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989.

Se entiende que la descripción de mutaciones conservadoras y homología pueden combinarse entre sí en cualquier combinación, tal como realizaciones que presentan una homología de por lo menos 70 % respecto a una secuencia particular en la que las variantes son mutaciones conservadoras.

Debido a que la presente especificación comenta diversas proteínas y secuencias de proteínas, se entiende que también se dan a conocer los ácidos nucleicos que pueden codificar esas secuencias de proteínas. Lo anterior incluiría todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de proteína específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que presentan una secuencia que codifica una secuencia de proteína particular, así como todos los ácidos nucleicos, incluyendo los ácidos nucleicos degenerados, codificantes de las variantes y derivados dados a conocer de las secuencias de proteína. De esta manera, aunque cada secuencia particular de ácido nucleico podría no especificarse en la presente memoria, se entiende que todas y cada una de las secuencias de hecho han sido dadas a conocer y señaladas en la presente memoria mediante la secuencia de proteína dada a conocer. Se entiende, además, que, aunque ninguna secuencia de aminoácidos indica qué secuencia particular de ADN codifica esa proteína dentro de un organismo, en donde se dan a conocer en la presente memoria variantes particulares de una proteína dada a conocer, la secuencia conocida de ácido nucleico que codifica ese péptido o proteína también es conocida y se da a conocer y se señala en la presente memoria.

Se entiende que existen numerosos análogos de aminoácido y péptido que pueden incorporarse en las composiciones dadas a conocer. Por ejemplo, existen numerosos D-aminoácidos o aminoácidos que presentan un sustituyente funcional diferente a los aminoácidos mostrados en las Tablas 2 y 3. Se dan a conocer los estereoisómeros opuestos de péptidos naturales, así como los estereoisómeros de análogos de péptido. Dichos aminoácidos pueden incorporarse fácilmente en cadenas polipeptídicas mediante la carga de moléculas de ARNt con el aminoácido de elección y constructos de ingeniería genética que utilizan, por ejemplo, codones ámbar, para insertar el aminoácido análogo en una cadena peptídica de una manera específica de sitio.

Pueden producirse moléculas que son similares a péptidos, pero que no se conectan mediante un enlace peptídico natural. Por ejemplo, entre los enlaces para aminoácidos o análogos de aminoácido pueden incluirse CH<2>NH--, --CHzS--, --CHz--CHz --, --CH=CH-- (cis y trans), --COCHz --,-CH(OH)CHz-- y --CHH<2>SO- (estos y otros pueden encontrarse en Spatola, A. F., en: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, página 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), vol. 1, número 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm Sci (1980) páginas 463 a 468; Hudson, D. et al., Int J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (1979) (--CHzNH--, CHzCHz--); Spatola et al., Life Sci. 38:1243-1249 (1986) (--CH Hz--S); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis y trans); Almquist et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH<2>--); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982) (--COCH<2>--); Szelke et al., European Appln., EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CHz--); Holladay et al., Tetrahedron. Lett.

24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CHz--); y Hruby, Life Sci. 31:189-199 (1982) (--CHz--S--); Un enlace no peptídico particularmente preferente es --CHzNH--. Se entiende que los análogos peptídicos pueden presentar más de un átomo entre los átomos del enlace, tales como b-alanina, ácido g-aminobutírico y similares.

Los análogos de aminoácido y los análogos de péptido con frecuencia presentan propiedades mejoradas o deseables, tales como, una producción más económica, una mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), una especificidad alterada (p. ej., un espectro amplio de actividades biológicas), una antigenicidad reducida, y otras.

Pueden utilizarse D-aminoácidos para generar péptidos más estables, debido a que los D-aminoácidos no son reconocidos por las peptidasas y similares. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede utilizarse para generar péptidos más estables. En otras palabras, en la presente memoria se contempla el inverso (es decir, la sustitución por D-aminoácido) de cualquier secuencia dada a conocer. Pueden utilizarse residuos de cisteína para ciclizar o unir entre sí dos o más péptidos. Ello puede resultar beneficioso para restringir los péptidos a conformaciones particulares. En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 sintéticos que comprenden SEC ID n.° 5, en los que los aminoácidos del péptido son enantiómeros D.

En un aspecto, los péptidos sintéticos dados a conocer pueden encontrarse en orden inverso de manera que el extremo amino al extremo carboxi del péptido están invertidos (es decir, es la secuencia retro). En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer las secuencias retro de SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4 (no cubierta por la invención y la SEC ID n.° 5, que comprende, la SEC ID n.° 12, la SEC ID n° 13, la SEC ID n.° 14 y la SEC ID n° 15, respectivamente. Dichas secuencias retro también pueden presentar la conformación especular de la secuencia de bases. En un aspecto, la secuencia retro puede comprender, además, una secuencia de sustitución de D-aminoácido (es decir, el retroinverso).

Se entiende que puede utilizarse cualquiera de los péptidos sintéticos con sustitución de D-aminoácidos dados a conocer en la presente memoria como el epítopo de PD-1 en los péptidos quiméricos de PD-1. Por ejemplo, en la presente memoria se dan a conocer péptidos de PD-1 quiméricos que comprenden uno o más epítopos de linfocito B de PD-1, un epítopo de linfocito T ayudante (Th) y un conector que une el epítopo de linfocito B de PD1 al epítopo de Th, en donde el epítopo o epítopos de linfocito B de PD-1 consiste en la SEC ID n.° 5 y en donde los aminoácidos del péptido son enantiómeros D. En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 quiméricos, en los que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 11 y en la que los aminoácidos del péptido de PD-1 sintético son los enantiómeros D.

3. Portadores farmacéuticos/Administración de productos farmacéuticos.

Tal como se ha indicado anteriormente, los péptidos de PD-1 sintéticos y los péptidos de PD-1 quiméricos dados a conocer en la presente memoria también pueden administrarsein vivoen un portador farmacéuticamente aceptable. De esta manera, en un aspecto, en la presente memoria se da a conocer una composición farmacéutica que comprende uno o más cualesquiera de los péptidos de PD-1 indicados en la SEC ID n.° 5 y en la SEC ID n.° 11.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no resulta biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse en un sujeto junto con el ácido nucleico o vector sin provocar ningún efecto biológico indeseable ni interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los demás componentes de la composición farmacéutica en los que se encuentra contenido. El portador naturalmente se seleccionaría para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualesquiera efectos adversos en el sujeto, tal como sería perfectamente conocido por el experto en la materia.

Se entiende y se encuentra contemplado en la presente memoria que las composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos PD-1 dadas a conocer resultan particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades o afecciones en las que ocurre una inmunosupresión mediada por PD-1. De esta manera, en un aspecto, la composición farmacéutica dada a conocer que comprende uno o más péptidos PD-1 dados a conocer en la presente memoria puede combinarse con un tratamiento o vacuna específico de la enfermedad, a fin de incrementar adicionalmente la eficacia de los péptidos PD-1. Por ejemplo, puede combinarse una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos PD-1 con anticuerpos anti-HER2 o epítopos de linfocito B HER-2 para la utilización en el tratamiento, la inhibición y/o la prevención del cáncer de mama. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más del péptido PD-1, péptidos sintéticos o péptidos quiméricos dados a conocer en la presente memoria (por ejemplo, la SEC ID n.° 5 y la SEC ID n.° 11), que comprenden, además, uno o más epítopos de linfocito B HER-2 (por ejemplo, la SEC ID n° 27 o n.° 29 o los epítopos quiméricos SEC ID n.° 28 o n.° 30) y/o anticuerpos anti-Her-2. En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer específicamente composiciones farmacéuticas que comprenden MVF-PD1 (92-110), tal como se indica en la SEC ID n.° 11; un péptido MVF-HER-2 (266-296) (por ejemplo, tal como se indica en la SEC ID n.° 28) y un péptido MVF-HER-2 (597-626) (por ejemplo, tal como se indica en la SEC ID n.° 30).

Las composiciones pueden administrarse por vía oral, parenteral (p. ej., intravenosa), mediante inyección intramuscular, mediante inyección intraperitoneal, vía transdérmica, extracorpórea, tópica o similar, incluyendo la administración intranasal tópica o la administración mediante inhalante. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "administración intranasal tópica" se refiere a la administración de la composición en la nariz y vías nasales mediante una o ambas fosas nasales y puede comprender la administración mediante un mecanismo de pulverización o mecanismo de goteo, o mediante aerosolización del ácido nucleico o vector. La administración de las composiciones mediante inhalante puede ser a través de la nariz o boca mediante administración utilizando un mecanismo de pulverización o goteo. La administración también puede ser directamente en cualquier zona del sistema respiratorio (p. ej., los pulmones) mediante intubación. La cantidad exacta de las composiciones requeridas variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, la gravedad del trastorno alérgico bajo tratamiento, del ácido nucleico o vector particular utilizado, su modo de administración y similares. De esta manera, no resulta posible especificar la cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, el experto ordinario en la materia podrá determinar la cantidad apropiada utilizando solo experimentación rutinaria a partir de las enseñanzas contenidas en la presente memoria.

La administración parenteral de la composición, en caso de utilizarse, generalmente se caracteriza por la inyección. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, en forma de soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o en forma de emulsiones. Un enfoque más recientemente revisado para la administración por vía parenteral implica la utilización de un sistema de liberación lenta o sostenida, de manera que se mantenga una dosis constante. Ver, p. ej., la patente US n.° 3.610.795.

Los materiales pueden encontrarse en solución, suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas o células). Pueden administrarse de manera dirigida a un tipo celular particular mediante anticuerpos, receptores o ligandos de receptores. Las referencias siguientes son ejemplos de la utilización de dicha tecnología para dirigir proteínas específicas a tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451 (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281 (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703 (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9 (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425 (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80 (1992) y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065 (1991)). Vehículos, tales como "vehículos encubiertos", y otros liposomas conjugados con anticuerpos (incluyendo la administración dirigida de fármacos mediada por lípidos al carcinoma colónico), la administración dirigida mediada por receptores de ADN a través de ligandos específicos celulares, la administración dirigida a tumor de linfocitos y la administración dirigida retroviral terapéutica altamente específica con diana en células de glioma murinoin vivo.Las referencias siguientes son ejemplos de la utilización de dicha tecnología para dirigir las proteínas específicas al tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). En general, en las rutas de endocitosis intervienen receptores, sean constitutivos o inducidos por ligando. Dichos receptores se agrupan en fosas recubiertas con clatrina, entran en la célula mediante vesículas recubiertas con clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores y después se reciclan a la superficie celular, y resultan almacenados intracelularmente o resultan degradados en lisosomas. Las rutas de internalización presentan una diversidad de funciones, tales como la incorporación de nutrientes, la eliminación de proteínas activadas, la eliminación de macromoléculas, la entrada oportunista de virus y toxinas, la disociación y degradación de ligandos y la regulación al nivel de receptores. Muchos receptores siguen más de una ruta intracelular, según el tipo celular, la concentración de receptor, el tipo de ligando, la valencia del ligando y la concentración del ligando. Se ha publicado una revisión de los mecanismos moleculares y celulares de la endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

a) Portadores farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones, incluyendo los anticuerpos, pueden utilizarse terapéuticamente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Habitualmente se utiliza una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para convertirla en isotónica Entre los ejemplos del portador farmacéuticamente aceptable se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, y más preferentemente, de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7,5. Entre los portadores adicionales se incluyen preparaciones de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, en el que las matrices presentan la forma de artículos conformados, p. ej. películas, liposomas o micropartículas. Resultará evidente para el experto en la materia que pueden resultar más preferentes determinados portadores según, por ejemplo, la vía de administración y la concentración de la composición que se administra.

Los portadores farmacéuticos son conocidos por el experto en la materia. Estos más habitualmente serían portadores estándares para la administración de fármacos en el ser humano, incluyendo soluciones, tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones pueden administrarse por vía intramuscular o subcutánea. Se administran otros compuestos de acuerdo con procedimientos estándares utilizados por el experto en la materia.

Entre las composiciones farmacéuticas pueden incluirse portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes activos en superficie y similares, además de la molécula de elección. Entre las composiciones farmacéuticas pueden incluirse, además, uno o más ingredientes activos, tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares.

La composición farmacéutica puede administrarse de varias maneras según si se desea el tratamiento local o sistémico, y según la zona que deba tratarse. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal e intranasal), oral, mediante inhalación, o parenteral, por ejemplo, mediante goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos dados a conocer pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria o transdérmica.

Entre las preparaciones líquidas para la administración parenteral se incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de solventes no acuosos, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, inclusión solución salina y medios tamponados. Entre los vehículos parenterales se incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer lactato, o aceites fijos. Entre los vehículos intravenosos incluirse reabastecedores de líquidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden encontrarse presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidante, agentes quelantes, y gases inertes, y similares.

Entre las formulaciones para la administración tópica pueden incluirse pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Pueden resultar necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, polvos o aceitosas, espesantes y similares.

Entre las composiciones para la administración oral se incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden resultar deseables espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o ligantes.

Algunas de las composiciones potencialmente pueden administrarse en forma de sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable, formarse mediante reacción con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos, tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o mediante reacción con una base inorgánica, tal como hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico y bases orgánicas, tales como mono-, di-, trialquil- y arilaminas y etanolaminas sustituidas.

b) Usos terapéuticos.

Las dosis eficaces y regímenes para la administración de las composiciones pueden determinarse empíricamente y la realización de tales determinaciones se encuentra comprendida en los conocimientos del experto en la materia. Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones son suficientemente grandes para producir el efecto deseado sobre los síntomas del trastorno. La dosis no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, la vía de administración o si se incluyen otros fármacos en el régimen, y pueden ser determinados por el experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en el caso de cualquier contraindicación. La dosis puede variar, y puede administrarse en una o más administraciones de dosis cada día, en uno o en varios días. Puede encontrarse una guía en la literatura sobre las dosis apropiadas para las clases dadas de productos farmacéuticos. Por ejemplo, puede encontrarse una guía para la selección de las dosis apropiadas de anticuerpos en la literatura sobre los usos terapéuticos de los anticuerpos, p. ej., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) capítulo 22 y páginas 303 a 357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) páginas 365 a 389. Una dosis diaria habitual del anticuerpo utilizado solo puede estar comprendida entre aproximadamente 1 pg/kg y hasta 100 mg/kg de peso corporal o más al día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

Los péptidos PD-1 sintéticos, quimeras y anticuerpos dados a conocer en la presente memoria que inhiben la interacción de PD-1 y PD-L1 pueden administrarse profilácticamente en pacientes o sujetos que corren el riesgo de desarrollar un cáncer, una enfermedad autoinmune o enfermedad de Alzheimer o terapéuticamente (es decir, tras el diagnóstico de una enfermedad o la aparición de síntomas) para el tratamiento de un cáncer, enfermedad autoinmune o enfermedad de Alzheimer.

Pueden utilizarse otras moléculas o anticuerpos que interactúan con PD-1 o PD-L1 inhibiendo las interacciones PD-1/PD-L1 (por ejemplo, el pembrolixumab y el nivolumab) en combinación con los péptidos PD-1 sintéticos, péptidos PD-1 quiméricos o anticuerpos anti-PD-1 dados a conocer para el tratamiento de un cáncer, enfermedad autoinmune o enfermedad de Alzheimer en un sujeto.

4. Anticuerpos 1

(1) Anticuerpos en general.

El término "anticuerpos" se utiliza en la presente memoria en un sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas, también se incluyen en el término "anticuerpos" los fragmentos o polímeros de dichas moléculas de inmunoglobulina, y versiones humanas o humanizadas de moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas, con la condición de que se seleccionan para su capacidad de interactuar con PD-1, de manera que resulte inhibida la interacción de PD-1 con PD-L1. Los anticuerpos que se unen a SEC ID n.° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n.° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n.° 5, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n.° 10, SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13, SEC ID n.° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18, y/o SEC ID n.° 19, implicados en la interacción entre PD-1 y PD-L1 también se dan a conocer, aunque no forman parte de la invención. Los anticuerpos pueden someterse a ensayo para su actividad deseada utilizando los ensayosin vitrodescritos en la presente memoria, o mediante métodos análogos, después de los cuales se someten a ensayo las actividades terapéuticas y/o profilácticasin vivode acuerdo con métodos de análisis clínico conocidos. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. El experto en la materia podría reconocer las clases correspondientes en el ratón. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina se denominan alfa, delta, epsilón, gamma y mu, respectivamente.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales en la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de las moléculas de anticuerpo. Entre los anticuerpos monoclonales en la presente memoria se incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad antagonista deseada.

Los anticuerpos monoclonales dados a conocer pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento que produzcan anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, pueden prepararse los anticuerpos monoclonales dados a conocer utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256.495 (1975). En un método de hibridoma, normalmente se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizador a fin de inducir los linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizador. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarsein vitro.

Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales dados a conocer puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (p. ej., mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). También pueden generarse bibliotecas de anticuerpos o fragmentos activos de anticuerpos y cribarse mediante técnicas de exposición fágica, p. ej., tal como se describe en la patente US n.° 5.804.440 de Burton et al., y en la patente US n.° 6.096.441 de Barbas et al.

Los métodosin vitrotambién resultan adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede llevarse a cabo mediante técnicas rutinarias conocidas de la técnica. Por ejemplo, la digestión puede llevarse a cabo utilizando papaína. Se describen ejemplos de la digestión con papaína en el documento n.° WO 94/29348, publicado el 22 de diciembre de 1994, y en la patente US n° 4.342.566. La digestión con papaína de los anticuerpos habitualmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada uno de los cuales presenta un único sitio de unión a antígeno y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento que presenta dos sitios de combinación con antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con el antígeno.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo o fragmentos del mismo" comprende anticuerpos quiméricos y anticuerpos híbridos, con especificidades de antígeno o epítopo duales o múltiples, y fragmentos, tales como F(ab')<2>, Fab', Fab, Fv, sFv y similares, incluyendo fragmentos híbridos. De esta manera, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos que conservan la capacidad de unirse a sus antígenos específicos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos que mantienen la actividad de unión a PD-1 o que se unen a SEC ID n.° 1, s Ec ID n° 2, SEC ID n.° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n.° 5, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n.° 10, SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13, SEC ID n.° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18 y/o SEC ID n.° 19 se encuentran incluidos en el significado de la expresión "anticuerpo o fragmento del mismo". Dichos anticuerpos y fragmentos pueden prepararse mediante técnicas conocidas y pueden cribarse para especificidad y actividad según los métodos proporcionados en los Ejemplos y en métodos generales para producir anticuerpos y el cribado de anticuerpos para especificidad y actividad (ver Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)).

También incluido dentro del significado de "anticuerpo o fragmentos del mismo" están los conjugados de fragmentos de anticuerpos y proteínas de unión a antígeno (anticuerpos de cadena sencilla).

Los fragmentos, estén unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o residuos específicos de aminoácidos, con la condición de que la actividad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo no se altere o deteriore significativamente en comparación con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no modificado. Dichas modificaciones pueden proporcionar alguna propiedad adicional, tal como eliminar/añadir aminoácidos capaces de establecer enlaces disulfuro, incrementar su biolongevidad, alterar sus características de secreción, etc. En cualquier caso, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, tal como unión específica a su antígeno afín. Pueden identificarse regiones funcionales o activas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo mediante mutagénesis de una región específica de la proteína, seguido de la expresión y ensayo del polipéptido expresado. Dichos métodos resultan inmediatamente evidentes para el experto en la materia y pueden incluir la mutagénesis específica de sitio del ácido nucleico codificante del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. (Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" o "anticuerpos" también puede referirse a un anticuerpo humano y/o un anticuerpo humanizado. Muchos anticuerpos no humanos (p. ej., los derivados de ratones, ratas o conejos) son naturalmente antigénicos en el ser humano y, de esta manera, pueden dar lugar a respuestas inmunitarias no deseables al administrarlos en seres humanos. Por lo tanto, la utilización de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos sirve para reducir la probabilidad de que un anticuerpo administrado en un ser humano induzca una respuesta inmunitaria no deseable.

(2) Anticuerpos humanos.

Los anticuerpos humanos dados a conocer pueden prepararse mediante cualquier técnica. Los anticuerpos humanos dados a conocer también pueden obtenerse a partir de animales transgénicos. Por ejemplo, se han descrito ratones mutantes transgénicos que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en respuesta a la inmunización (ver, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)). Específicamente, la deleción homocigótica del gen de la región de unión (J(H), por sus siglas en inglés) de la cadena pesada de anticuerpo en dichos ratones mutantes quiméricos y de línea germinal resulta en la inhibición total de la producción endógena de anticuerpos y la transferencia con éxito de la serie génica de anticuerpos de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos frente al reto antigénico. Se seleccionan los anticuerpos que presentan la actividad deseada utilizando complejos de Env-CD4-correceptor tal como se describe en la presente memoria.

(3) Anticuerpos humanizados.

Las técnicas de humanización de anticuerpos generalmente implican la utilización de tecnología de ADN recombinante para manipular la secuencia de ADN codificante de una o más cadenas polipeptídicas de una molécula de anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, una forma humanizada de un anticuerpo no humano (o un fragmento del mismo) es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimérico (o un fragmento del mismo, tal como un sFv, Fv, Fab, Fab', F(ab')<2>u otra parte de unión a antígeno de un anticuerpo) que contiene una parte de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (donante) no humano integrado en el marco de un anticuerpo (receptor) humano.

Para generar un anticuerpo humanizado, se sustituyen los residuos de una o más regiones determinantes de complementariedad (RDC) de una molécula de anticuerpo (humano) receptor por residuos de una o más RDC de una molécula de anticuerpo (no humano) donante que es conocido que presenta características de unión a antígeno deseadas (p. ej., un nivel determinado de especificidad y afinidad para el antígeno diana). En algunos casos, los residuos del marco de Fv (FR) del anticuerpo humano se sustituyen por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden contener, además, residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en los RDC importados o en las secuencias de marco. Generalmente, un anticuerpo humanizado presenta uno o más residuos aminoácidos que han sido introducidos de una fuente que es no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados habitualmente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de RDC y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos humanizados generalmente contienen por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo (Fc), habitualmente la de un anticuerpo humano.

(4) Administración de anticuerpos.

La administración de los anticuerpos puede llevarse a cabo tal como se da a conocer en la presente memoria; sin embargo, no se reivindica en la invención. También existen enfoques de ácidos nucleicos para la administración de anticuerpos. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anti-PD1 ampliamente neutralizantes (incluyendo cualquier anticuerpo que se una a SEC ID n.° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n.° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n.° 5, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n.° 10, SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13, SEC ID n.° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18 y/o SEC ID n.° 19) también pueden administrarse en pacientes o sujetos en forma de una preparación de ácidos nucleicos (p. ej., de ADN o ARN) que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, de manera que las propias células del paciente o sujeto incorporan el ácido nucleico y producen y secretan el anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificado. La administración del ácido nucleico puede realizarse por cualquier medio, tal como se da a conocer en la presente memoria, por ejemplo.

C. Método de tratamiento de enfermedades.

Se entiende y se encuentra contemplado en la presente memoria que las composiciones, péptidos PD-1 sintéticos y péptidos PD-1 quiméricos dados a conocer puedan utilizarse para tratar cualquier enfermedad en la que la supresión inmunitaria y la prevención de la muerte celular programada resulta ventajosa a la enfermedad, tal como la enfermedad de Alzheimer, las enfermedades autoinmunes o cualquier enfermedad en la que ocurre la proliferación celular incontrolada, tal como los cánceres.

Una lista no limitativa de diferentes tipos de enfermedad autoinmune que pueden tratarse con los péptidos quiméricos 0 sintéticos o composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, soriasis, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, síndrome poliendocrino autoinmune, diabetes mellitus de tipo 1, tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Graves, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, artritis psoriásica, artritis reumatoide, policondritis recidivante, miastenia grave, encefalomielitis diseminada aguda y granulomatosis con poliangitis.

Una lista no limitativa de diferentes tipos de cánceres que pueden tratarse con los péptidos quiméricos o sintéticos o composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, linfomas (de Hodgkin y no de Hodgkin), leucemias, carcinomas, carcinomas de tejidos sólidos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, sarcomas, gliomas, gliomas de grado alto, blastomas, neuroblastomas, plasmacitomas, histiocitomas, melanomas, adenomas, tumores hipóxicos, mielomas, linfomas o sarcomas relacionados con el SIDA, cánceres metastásicos o cánceres en general.

A continuación se proporciona una lista representativa, aunque no limitativa, de los cánceres con los que pueden utilizarse las composiciones, péptidos quiméricos y péptidos sintéticos dados a conocer para el tratamiento: linfoma, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, micosis fungoide, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer renal, cánceres pulmonares, tales como el cáncer pulmonar microcítico y el cáncer pulmonar no microcítico, neuroblastoma/glioblastoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer cutáneo, cáncer hepático, melanoma, carcinomas de células escamosas de la boca, garganta, laringe y pulmón, cáncer de colon, cáncer de cuello uterino, carcinoma de cuello uterino, cáncer mamario y cáncer epitelial, cáncer renal, cáncer genitourinario, cáncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeza y cuello, cáncer de intestino grueso, cánceres hematopoyéticos, cáncer testicular, cánceres de colon y rectal, cáncer prostático, melanoma refractario a ipilimumab o cáncer pancreático.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 para la utilización en métodos de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer o una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto un péptido PD-1 sintético, en el que el péptido PD-1 sintético comprende SEC ID n.° 5. Se entiende, y se encuentra contemplado en la presente memoria, que los péptidos sintéticos pueden estar acetilados, amidados y/o ser el enantiómero D. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 para la utilización en métodos de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer o una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto un péptido PD-1 sintético, en el que el péptido PD-1 sintético comprende el enantiómero D y/o el enantiómero D retroinverso de SEC ID n.° 5 o SEC ID n.° 11.

En un aspecto, se entiende que las composiciones dadas a conocer pueden combinarse con otros tratamientos para una enfermedad o afección dada. Por ejemplo, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 para la utilización en métodos de tratamiento de un cáncer, que comprenden administrar en el sujeto un péptido PD-1, un péptido PD-1 sintético o un péptido PD-1 quimérico, en el que la enfermedad o afección es cáncer de mama, y en el que el método comprende, además, administrar en el sujeto uno o más epítopos de linfocito B HER-2 (por ejemplo, uno o más de los péptidos HER-2 indicados en SEC ID n.° 27 o n.° 29, o péptidos MVF-HER-2 quiméricos tal como se indica en la SEC ID n.° 28 o 30) y/o uno o más anticuerpos anti-HER-2. Se entiende que en donde se administra un epítopo de linfocito B HER-2 o anticuerpo anti-HER-2 en el sujeto, la administración puede llevarse a cabo en forma de una administración concurrente separada, antes de la administración del epítopo de linfocito B HER-2 o anticuerpo anti-HER-2, después de la administración del epítopo de linfocito B HER-2 o anticuerpo anti-HER-2, o un epítopo de linfocito B HER-2 o anticuerpo anti-HER-2 que es un componente en la misma formulación farmacéutica que el péptido PD-1, el péptido PD-1 sintético o el péptido PD-1 quimérico. Por ejemplo, los péptidos PD-1 para la utilización en un método de tratamiento del cáncer de mama pueden comprender la administración en el sujeto de una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos PD-1 indicados en SEC ID n.° 5; péptidos PD-1 quiméricos indicados en SEC ID n.° 11; en donde el método comprende, además, administrar en el sujeto uno o más epítopos de linfocito B HER-2, HER-2(266-296), tal como se indica en SEC ID n.° 27 y/o HER-2 (597-626), tal como se indica en SEC ID n.° 29 y/o epítopos quiméricos del péptido MVF-HER-2 (266-296) (por ejemplo, tal como se indica en SEC ID n.° 28 y un péptido Mv F-HER-2 (597-626) (por ejemplo, tal como se indica en s Ec ID n.° 30). De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, en la presente memoria se da a conocer un péptido PD-1 para la utilización en un método de tratamiento del cáncer de mama que comprende administrar en el sujeto con cáncer de mama, una composición farmacéutica que comprende MVF-PD1 (92-110) tal como se indica en SEC ID n.° 11; un péptido MVF-HER-2 (266-296) (por ejemplo, tal como se indica en SEC ID n.° 28) y un péptido MVF-HER-2 (597-626) (por ejemplo, tal como se indica en SEC ID n.° 30).

Se entiende, además, y se encuentra contemplado en la presente memoria, que los péptidos sintéticos para la utilización en el tratamiento de un cáncer, enfermedad autoinmune o enfermedad de Alzheimer puede ser un componente de un péptido quimérico. De esta manera, en un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 para la utilización en métodos de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer o una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto un péptido PD-1 quimérico en el que el péptido quimérico comprende uno o más epítopos de linfocito B PD-1, un epítopo de linfocito T ayudante (Th) y un conector que une el epítopo de linfocito B PD-1 al epítopo de Th, en el que el epítopo o epítopos de linfocito B PD-1 consiste en la secuencia SEC ID n.° 5. Se entiende, y se encuentra contemplado en la presente memoria, que los péptidos PD-1 sintéticos (es decir, los epítopos de linfocito B PD-1) utilizados en los péptidos quiméricos pueden estar acetilados, amidados y/o ser el enantiómero D. En un aspecto, por ejemplo, en la presente memoria se dan a conocer péptidos PD-1 para la utilización en métodos de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer, o una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto un péptido quimérico PD-1 en el que el péptido quimérico comprende SEC ID n.° 11.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se explican con el fin de proporcionar al experto ordinario en la materia una exposición y descripción completas de cómo los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente memoria se producen y evalúan, y pretenden ser puramente ejemplares y no pretenden ser limitativos de la exposición. Los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos aparte de los reivindicados también se dan a conocer en los ejemplos. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p.ej., cantidades, temperaturas, etc.), aunque debe considerarse cierto error y desviación experimental. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura se expresa en °C o es la temperatura ambiente, y la presión es igual o próxima a la atmosférica.

Ejemplo 1: selección, diseño y modelado de epítopos peptídicos para PD-1.

La selección de los epítopos de linfocito B candidatos que se expresaban sobre la superficie de PD-1 se llevó a cabo mediante un análisis asistido por ordenador del propio laboratorio (Peptide Companion™, 5x.com) utilizando seis correlatos de antigenicidad en la revisión de Kaumaya et al.: (a) Los perfiles de flexibilidad y movilidad de cadena de las secuencias individuales se calcularon de acuerdo con Karplus y Schultz; (b) los perfiles de hidropatía se generaron en un ajuste de ventana de siete residuos y después se suavizaron en una ventana de tres residuos utilizando la escala de Kyte y Doolittle; (c) se generaron perfiles de hidrofobicidad en una ventana de seis residuos utilizando el programa de Hopp y Woods; (d) se llevó a cabo un análisis de la exposición de un residuo aminoácido a agua (sonda 1.4A) mediante el algoritmo de exposición a solvente de Rose et al.; (e) se calcularon los índices de protuberancia mediante el método de Thornton et al., que predice las partes de la proteína que son accesibles y sobresalen hacia el solvente; (f) se determinó la probabilidad de que una secuencia de cinco residuos sea antigénica mediante el método de Welling et al.; se asignó una puntuación a las secuencias entre 1 y 6 basándose en sus valores de índice respectivos y se ordenador: las secuencias de rango más alto presentaban la puntuación individual más alta para los análisis examinados (6/6), y los candidatos sucesivos presentaban la siguiente puntuación más alta (5/6), etc. Los epítopos con mejores puntuaciones se ordenaron adicionalmente mediante correlación con sus atributos estructurales secundarios, p. ej., resulta preferente una secuencia a-helicoidal anfifílica o un bucle de giro p sobre fragmentos de una hélice aleatoria. Se utilizaron los programas informáticos de Chou y Fasman y de Novotny et al. para predecir la estructura secundaria (hélice a, cadena/hoja p, giro/bucle p, hélice aleatoria) y momento anfifílico a-helicoidal. Finalmente, se consideró la secuencia individual de aminoácidos. También se consideraron las parejas iónicas electrostáticas y la interacción de dipolo helicoidal en el segmento helicoidal (p. ej., el equilibrio hidrofóbico/hidrofílico). Las secuencias que obtuvieron las puntuaciones más altas se muestran en la Tabla 4. Mediante la utilización de dicho método se priorizaron cuatro de las doce secuencias de epítopo de linfocito B de puntuación más alta de la PD-1 humana. Se seleccionaron los aminoácidos *32-50, *45-64, *73-90 y 92-110 (el asterisco denota que el ítem no se reivindica en la invención: se aplica en toda la memoria) para la evaluación, en combinación con información de la estructura cristalina de PD-1:PDL1 (20). Se han determinado las estructuras de la PD-1 humana (PDB 3RRQ) y la PD-L1 humana (PDB 3BIS, 3FN3, 4Z18, 5C3T), pero estas a su vez no explican la plasticidad significativa dentro de la PD-1 humana con la formación del complejo, demostrada solo muy recientemente por la estructura del complejo PD1/PD-L1 totalmente humano (20). Aunque las estructuras anteriores proporcionan una descripción completa de la interacción, la superficie plana de la interfaz proteína-proteína todavía complica los esfuerzos del diseño farmacológico en ausencia de información estructural sobre los inhibidores de molécula pequeña en complejo con PD-1 o PD-L1 para guiar el desarrollo racional ulterior de fármacos. La estructura cristalina demuestra que la interacción de receptorligando está mediada en su mayor parte por residuos de cadenas C0CFG dentro tanto de PD-1 como de PDL1 (figura 1). Los contactos proteína-proteína implican tanto interacciones hidrofóbicas como interacciones polares, y entierran una superficie total de 1.970 A2. La interacción se construye en torno a un núcleo hidrofóbico central contribuido por ambos miembros de la pareja y constituido por residuos no polares en la hoja frontal de PD-1 (Val64, Ile126, Leu128, Ala132, Ile134) y los de la hoja frontal de PD-L1 (LIle54, LTyr56, LMet115, LAla121, LTyr123), incluyendo una interacción alquilo-p característica de las cadenas laterales de Ile134 y LTyr123. Dicha región hidrofóbica está abierta al solvente en el potencial sitio de unión a antígeno y contiguamente presenta una región enterrada de interacciones mixtas polares/no polares en el lado contrario de la molécula. Ambas regiones están circundadas por una red periféricas de residuos polares (seguros en el lado del bucle RDC), que proporcionan interacciones adicionales mediadas por enlaces de hidrógeno entre el receptor y el ligando. La estructura muestra que PD-1_h, que comprende los residuos 16-127 del polipéptido maduro, consiste en un sándwich de dos capas con la topología de dominios IgSF (es decir, dos hojas p (GFCC y ABED)) estabilizados por un enlace disulfuro (Cys34-Cys103). Las figuras 2A, 2B y 2C muestran el modelado de los péptidos PD-1 como epítopos de conformación.

TABLA 4. Epítopos de linfocitos B predichos de PD-1 humana.

2. Ejemplo 2: síntesis, purificación y caracterización de péptidos PD-1 y péptidos MVF-PD-1.

Se llevó a cabo la síntesis de péptidos utilizando el sintetizador de péptidos en fase sólida 9600 Milligen/Biosearch (Millipore, Bedford, MA) utilizando reacciones de Fmoc/Boc. Se utilizó una resina de amida transparente (0,50 mmol/g) (Peptide International, Louisville, KY) y aminoácidos protegidos con Fmoc (P3Biosystems, Louisville, KY) para la síntesis de todos los péptidos. En el caso de los péptidos quiméricos, se sintetizaron colinealmente los epítopos de linfocitos B con el epítopo MVF (residuos 288-302) de Th promiscuo utilizando protecciones regioselectivas de cadena lateral y un conector GPSL. Algunos de los epítopos de linfocito B se acetilaron utilizando acetilimidazol (Sigma-Aldrich St. Louis, MO) en DMF. Los péptidos se hicieron reaccionar durante la noche y después se lavaron con DMF antes de la escisión. Los péptidos se escindieron utilizando reactivo R (ácido trifluoroacético: ácido trifluoroacético Tiansol: EDT: anisol, 90:5:3:2) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los péptidos en bruto se purificaron mediante HPLC de fase inversa en un sistema de gradiente utilizando una columna C-4 vydac en agua/acetonitrilo (ácido trifluoroacético al 0,1 %) en un sistema Waters. Al final de la purificación, seguidamente se analizaron las fracciones puras en HPLC analítica y se agruparon las fracciones de interés y se liofilizaron en solución de ácido acético al 10 %. A continuación, se identificaron los péptidos purificados finales enumerados en la Tabla 5 utilizando espectrometría de masas (Campus Chemical Instrumentation Center, The Ohio State University, Columbus, OH).

Tabla 5: secuencias peptídicas de PD-1.

(continuación)

Ejemplo 3: especificidad de unión de péptidos PD-1 mediante BIACORE.

a) Inmovilización de Biacore.

Con el fin de someter a ensayo la actividad de todos los péptidos seleccionados, se utilizó la espectroscopia de resonancia de plasmón superficial (RPS) (Biacore T200 a 258 °C) para medir sus afinidades de unión al dominio extracelular de la PD-L1 humana (PD-L1_h). Se inmovilizó ectodominio de PD-L1_h recombinante sobre la superficie de oro de un chip sensor CM5 mediante acoplamiento de amina directo. Para confirmar que el ectodominio de PD-L1_h inmovilizado era funcional, se comprobó su afinidad para el ectodominio de PD-1 (PD-1_h) humano recombinante.

Con el fin de obtener la respuesta máxima teórica tras la unión de péptido, la cantidad de inmovilización calculada de PD-L1_hr, nivolumab e IgG humana era de 9790 UR, 14286 UR y 14286 UR, respectivamente. Se inyectaron 20 pg/ml de PD-L1_hr con NaAc 10 mM pH 5.5; nivolumab con HEPES 10 mM, pH 7,5 e IgG humana con HEPES 10 mM, pH 7,0, sobre el chip tras la activación con EDC/NHS durante 7 min a razón de 10 pl/min. Los niveles de inmovilización resultantes para PD-L1_rh (figura 3a), nivolumab (figura 3B), IgG humana (figura 3C) eran 2345 UR, 12264 UR y 11651 UR, respectivamente.

b) Especificidad de la prueba de unión de PD-1_hr y nivolumab.

Para validar el chip sensor preparado, se inyectó PD-1_hr 1 pm (17,3 pg/ml) sobre el chip durante 3 min a razón de 10 pl/min (figura 3D). Como control negativo se utilizó BSA 1 pM. El chip se regeneró con glicina-HCl 10 mM, pH 2,5 (figura 3E). Puede observarse que, con la inyección de PD-1_hr, el nivolumab generó una señal fuerte con una respuesta (3740 UR) y PD-L1_hr causó una señal débil (461 UR), mientras que la IgG humana no mostró ninguna señal de unión. El BSA no condujo a ninguna unión, indicando que la unión de PD-1 al nivolumab y a PD-L1_hr es específica.

c) Especificidad de la unión del péptido PD-1 a PD-L1_r y nivolumab mediante Biacore.

Se inyectó 1 pM de diversos péptidos PD-1 sobre el chip durante 1 min a 10 pl/min, seguido de una disociación de 1 min y después 1 min de regeneración con glicina-HCl 10 mM, pH 2,5, para cada tanda. La figura 4A muestra que MVF-PD-1 *(45-64), MVF-PD-1 *(73-90) y MVF-PD-1 (92-110) se unen a PD-L1_hr inmovilizado, resultando en aproximadamente 110 UR. En contraste, MVF,PD-1(32-50) mostraba una unión muy débil (11 UR), que era similar a la del control negativo, MVF-HER-2(266-296) (20 UR). Los mismos tres péptidos MVF positivos revelaron una unión más fuerte al nivolumab: 1030 UR, 1000 UR y 970 UR, respectivamente (figura 4B). Nuevamente, MVF-PD-1 *(32-50) mostró una capacidad de unión despreciable (20 UR), indicando que esta secuencia no representa un epítopo viable. Se concluyó que MVF-PD-1 (45-64, 73-90 y 92-110) era capaz de reconocer tanto PD-L1_hr como nivolumab, mientras que MVF-PD-1 *(32-50), no. Además, los péptidos acetilados también se unen a PD-L1_hr y a nivolumab, aunque más débilmente que los péptidos MVF quiméricos (figura 4C-4D). Los péptidos libres también se unen tanto a PD-L1 como a nivolumab; PD-1 (73-90) muestra una unión más fuerte a PD-L1_hr y a nivolumab que PD-1 (45-64) y PD-1 (92-110) (figura 4E, 4F). PD-1(45-64) es el segundo conector más fuerte. Por lo tanto, la eficiencia de unión de los péptidos libres puede clasificarse como: 73-90>46-64>92-110. A partir de estos estudios de unión puede concluirse que los péptidos PD-1 46-64, 73-90 y 92-110 pueden reconocer PD-L1_r y pueden actuar como inhibidores peptídicos pequeños de la interacción PD-1:PD-L1.

Ejemplo 4: pruebas de inmunogenicidad de péptidos PD-1 en conejos.

a) Los péptidos MVF-PD-1 inducen títulos elevados de anticuerpos antipéptido.

Se sintetizaron las cuatro secuencias de PD-1 como constructos quiméricos con un epítopo de linfocito T ayudante promiscuo derivado de la proteína de fusión del virus del sarampión (MVF, por sus siglas en inglés, aminoácidos 288 302). Los constructos de vacuna con 1 mg de péptido se emulsificaron en Montanide ISA 720 (Seppic, Paris, Francia) y adyuvante no MDP (N-acetil-glucosamina-3il-acetil L-alanil-D-isoglutamina) y se utilizaron para inmunizar conejos New Zealand blancos adquiridos de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts y alojados en las instalaciones del The Ohio State University's University Laboratory Animal Resources (ULAR). Se vacunaron los conejos un total de tres veces a intervalos de tres semanas. Los animales se sangraron semanalmente y se sacrificaron a las nueve semanas y se realizó un sangrado terminal mediante punción cardíaca en el momento del último sangrado de ensayo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la política de cuidado humano y uso de animales del Servicio de salud pública de EE. UU. y fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Ohio State University y que se detallan en el protocolo aceptado. Se purificaron anticuerpos de vacuna peptídica mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A/G y se midió la concentración mediante ensayo de proteína Coomassie.

La totalidad de los cuatro epítopos indujo un título elevado de anticuerpos >250.000 contra la vacuna inmunizadora (figura 5A). Los anticuerpos del sangrado terminal también reconocieron la proteína PD-1 humana recombinante, así como el péptido inmunizador MVF-PD-1, péptido acetilado y péptido libre (figura 5B).

b) (ii) Homología entre secuencias de epítopos seleccionados de PD-1 humano y de ratón.

Existe una homología global de 65 % entre la secuencia de PD-1 humana y de ratón. Los epítopos seleccionados muestran una homología de entre 67 % y 74 % entre la secuencia humana y de ratón. De esta manera, resulta importante comprobar si los epítopos humanos seleccionados pueden unirse a PD-1 de ratón a fin de validar los estudios en ratones.

c) (iii) Los anticuerpos policlonales de a-PD-1_h de conejo se unen a PD-1 de ratón.

Con el fin de determinar si los anticuerpos policlonales de a-PD-1_h de conejo reconoce el PD-1 murino; los esplenocitos procedentes de ratones transgénicos para RCT específicos de proteína básica de la mielina (PBM) no expuesta se activaron con PBM Ac1-11 durante 72 h. La expresión de PD-1 se analizó mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la figura 6, la totalidad de los cuatro anticuerpos de a-PD-1_h policlonales se unieron a PD-1 de ratón, validando la utilización del PD-1 humano en los estudios tumorales en ratones.

d) (iv) Regulación de la proliferación de los linfocitos T por anticuerpos de a-PD-1_hu.

La proliferación de los linfocitos T específicos de antígeno reflejan una importante función efectora de los linfocitos T efectores. Con el fin de determinar si los cuatro anticuerpos de a-PD-1_h alteran la función de los linfocitos T efectores mediante la activación o la inhibición de la ruta de señalización de PD-1, se llevaron a cabo ensayos de proliferación basados en CFSE (figura 7). Brevemente, se marcaron con CFSE esplenocitos procedentes de ratones transgénicos para RCT específicos de PBM no expuestos y activados con PBM Ac1-11 en la presencia de 50 mg/ml de anticuerpos a-PD-1_h o IgG de conejo de control durante 4 días. Se analizó la expresión de CFSE mediante citometría de flujo. Los datos muestran que 81 % de los linfocitos T CD4 tratados con a-PD_h-1-92-110 presentan un alto nivel de proliferación en comparación con solo 70 % de los linfocitos T con alto nivel de proliferación en el grupo tratado con IgG de control, indicando que a-PD-1_h-92-110 bloquea la interacción PD-1/PD-L1 y conduce a una función de los linfocitos T efectores incrementada, representada por una proliferación específica de antígeno incrementada de los linfocitos T CD4 específicos de mielina. Por el contrario, los linfocitos T tratados con *a-PD-1_h(45-64) o a-PD-1_h(73-90) mostraban una proliferación reducida, indicando que activan la señalización de PD-1 e inhiben la función efectora de los linfocitos T CD4 específicos de mielina. Además, *a-PD-1_h(32-50) no presenta ningún efecto sobre la función de los linfocitos T efectores debido a que las células tratadas con a-huPD-1(32-50) proliferan al mismo nivel que las células tratadas con IgG de control. Conjuntamente, estos datos indican que a-PD-1_h(92-110) potencia la función de los linfocitos T efectores y presenta una capacidad terapéutica en la inhibición del crecimiento tumoralin vivo.Los epítopos 45-64 y 73-90 en virtud de su propiedad de activación de la señalización de PD-1 pueden servir de diana para las enfermedades autoinmunes.

Ejemplo 5: pruebas de inmunogenicidad de los péptidos PD-1 en ratones inmunocompetentes y experimentos de reto tumoral.

a) Vacunación de ratones y protocolos de reto tumoral.

Se adquirieron ratones Balb/c inmunocompetentes de 6 a 8 semanas de edad de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts y se alojaron en instalaciones del University Laboratory Animal Resources (ULAR) de The Ohio State University. Se utilizó isoflurano para anestesiar los animales antes de la inyección de células y la terminación. Se obtuvieron muestras de suero preinmunes a partir de los ratones; a continuación, se inmunización con 100 |jg de péptido emulsificado en Montanide ISA 720 (Seppic, Paris, Francia) y adyuvante no MDP (N-acetilglucosamina-3-il-acetil L-alanil-D-isoglutamina). Los ratones recibieron inmunizaciones de refuerzo 3 y 6 semanas después de la primera. Se obtuvieron varias muestras de sueros de ensayo de los ratones (figura 8).

b) Reto tumoral:

Diez días después del segundo refuerzo, los ratones fueron inoculados con 1x105 células tumorales CT26 de carcinoma de colon murino por vía subcutánea en el flanco derecho. Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral tres veces a la semana y se obtuvieron muestras de suero semanalmente y tras el sacrificio del animal. En ratones de control el día 0 se injertaron 1x105 células tumorales CT26 por vía subcutánea. Los animales recibieron 150 jg de inyecciones de anticuerpos antirratón dirigidos contra PD-1. Se realizó un seguimiento de los ratones y se puntuaron para la formación de tumores palpables dos veces a la semana y se sacrificaron si los tumores se volvían necróticos o excedían de un tamaño predeterminado de 2.000 mm3. Se midieron los diámetros tumorales dos veces a la semana. Se calculó el tamaño tumoral según la fórmula: V = [(longitud * anchura2)/2]. Se midieron los volúmenes tumorales en milímetros cúbicos con un pie de rey se calcularon con la fórmula siguiente: A*B2*0.5, en la que "A" es el diámetro máximo y "B" es el diámetro mínimo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la política de cuidado humano y uso de animales de laboratorio de Servicio de salud pública estadounidense y con la aprobación del Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Ohio State University, y tal como se detalla en el protocolo acordado.,

c) Inmunogenicidad de constructos de vacuna de PD-1 en ratones.

Todos los ratones individuales montaron una respuesta de anticuerpos robusta a la totalidad de las 4 vacunas. Se realizó un seguimiento de la respuesta inmunitaria (figura 9 y Tabla 6) a los sueros agrupados en diversos intervalos (2Y+1, 2Y+3, 3Y+1, 3Y+2, 3Y+3) contra los constructos de vacuna.

Tabla 6: antigenicidad de sangrados terminales en conejos y ratones contra la proteína PD-1_hu recombinante.

d) Detección de células inmunitarias en tejidos de ratón.

Se recogieron los tumores y ganglios linfáticos que drenaban los tumores para el análisis de FACS posterior a fin de estudiar la respuesta inmunitaria en ratones. Se prepararon suspensiones celulares a partir de los tejidos, mediante disociación mecánica o mediante digestión enzimática. Se analizaron las células teñidas con un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) dotado de 3 láseres de excitación a las longitudes de onda de 405, 488 y 633 nm. Se purificaron linfocitos T CD8<+>y T CD4<+>CD25<+>a partir de leucocitos tumorales, en una columna MACS o en FACSaria.

e) Perfilado inmunitario de respuestas de linfocitos T en ratones tratados.

Se llevó a cabo análisis de citometría de flujo para evaluar la expresión de marcadores de superficie (CD45, CD3, CD4, CD8 y CD25) y el factor de transcripción FoxP3 en esplenocitos y linfocitos T infiltrantes de tumor. Brevemente, se extrajeron los bazos de los ratones y se pasaron por tamices celulares, seguido de una incubación corta con glóbulos rojos y tampón de lisis para lisarlos. A continuación, se recolectaron las células, se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción (BSA al 1 % en PBS). De manera similar, se extrajeron los tumores de los ratones y se pasaron por tamices celulares, seguido de un lavado con Percoll al 37 %. A continuación, se lavaron las células tumorales con PBS y se resuspendieron en tampón de tinción. Los esplenocitos y las células tumorales se incubaron con mAb de los marcadores de superficie celular durante 30 min a 4 °C. Tras lavar dos veces con tampón de tinción, se fijaron las células y se permeabilizaron con solución Cytofix/Cytoperm durante 60 min a 4 °C. Las células se tiñeron para FoxP3 durante 30 min a 4 °C. Se adquirieron 80.000 a 100.000 sucesos de células vivas en un FACSCanto (BD) utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). Para diferenciar las células infiltrantes de las células tumorales, las células tumorales en primer lugar se seleccionaron de células CD45<+>. A continuación, se analizaron las células CD3<+>CD4<+>y CD3<+>CD8<+>. Las células T<reg>están representadas por las células CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>. Tal como se muestra en la figura 10, los subgrupos de CD4 y CD8 se encuentran a niveles similares en el bazo, mientras que los grupos C, E y F muestran una población de T<reg>incrementada en el bazo en comparación con el grupo A (control negativo). En los tumores, el grupo C presentaba el número más alto de T<reg>de los demás cuatro grupos (figura 10B), indicando que la vacunación con péptido PD1-45-64 había llevado a un desarrollo incrementado de T<reg>en el microambiente tumoral. El grupo E presentaba el nivel más bajo de T<reg>.

f) Estudios de eficacia en ratones Balb/c singénicos inmunizados con constructos de PD-1 y retados con 1x10 células tumorales CT26 de carcinoma de colon murino.

La figura 11 muestra gráficos individuales de crecimiento tumoral en ratones (5 por grupo) para cada uno de los cuatro constructos de PD-1; A: (*PD-1(32-50), B: *PD-1 (45-64), C: *PD-1 (73-90) y D: PD-1 (92-110), péptido de control (E: péptido irrelevante) y un grupo de control positivo (F) tratado con anticuerpo monoclonal anti-PD-1 de ratón.

g) Análisis estadístico preliminar de datos de crecimiento tumoral en ratones.

Con el fin de evaluar el rendimiento de 4 tratamientos de vacuna diferentes sobre el crecimiento tumoral, se midió periódicamente el tamaño tumoral en ratones y se compararon los resultados con los de controles positivos y negativos. Había 5 ratones en cada grupo de tratamiento, en donde cada uno recibió el péptido de MVF asignado y después se inoculó con 1x105 células tumorales CT26 (colon) diez días después del refuerzo final del tratamiento. Se consideró que el día 14 era el punto temporal principal de interés, ya que los investigadores consideraron que la espera hasta el día 19 permitiría que los tumores creciesen en exceso, resultando en tamaños similares en ese punto del experimento. Se midió el tamaño tumoral de tres maneras: LWW (1/2*longitud*anchura*anchura) en todos los puntos temporales, LWH (1/2*longitud*anchura*altura) en todos los puntos temporales, y peso tumoral terminal al final del estudio. Se sacrificaron los ratones con MVF-PD-a(45), grupo C, antes del día 19 debido a la muerte de un ratón, por lo que solo pudieron realizarse las comparaciones entre tamaños tumorales el día 14. El tamaño tumoral se expresa en unidades de mm3 para LWW y LWH y gramos para el peso tumoral terminal.

Debido a los pequeños tamaños tumorales en cada grupo y la imposibilidad de suponer la normalidad, se utilizó la prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon para analizar las posibles diferencias sistemáticas entre las distribuciones de tamaño tumoral los días 14 y 19 (figura 12A-D y Tablas 7 a 10). Los valores de P proporcionados son para la prueba de comparación del control de esa columna con el tratamiento respectivo, y son de dos colas para considerar la posibilidad de que el tamaño tumoral sea sistemáticamente más grande o más pequeño entre tratamiento y control. Debido a que estos son datos preliminares, los valores de p no se han ajustado para comparaciones múltiples. Globalmente, hay pocos casos de diferencias significativas entre las distribuciones de un control y un tratamiento.

Tabla 7: comparación de la mediana de tamaño de * MVF-PD-1 (32-50) con los tamaños de control

Para MVF-PD-a(32), no se encontraron diferencias significativas en las distribuciones de tamaño tumoral entre el tratamiento y los controles positivos o los controles negativos.

Tabla 8: comparación de la mediana de tamaño de *MVF-PD-1(45-64) con los tamaños de control.

Para MVF-PD-1(45-64), tal como se ha indicado anteriormente, las comparaciones solo pudieron realizarse para los datos el día 14. En este caso, no se observaron diferencias significativas en la distribución de tamaño temporal entre este tratamiento y cualquiera de los controles.

Tabla 9: comparación de la mediana de tamaño de * MVF-PD-1 (73-90) con los tamaños de control

Para MVF-PD-1(73-90), no se observaron diferencias significativas entre las distribuciones de tamaño tumoral entre este tratamiento y cualquiera de los controles el día 14. Se observó un valor de p destacablemente pequeño (<0,1) para LWH el día 19 al comparar el tratamiento con el control positivo, indicando una posible diferencia en las distribuciones de tamaño tumoral.

Tabla 10: comparación de la mediana de tamaño de MVF-PD-1(92-110) y los tamaños de control.

Para MVF-PD-1(92-110), se observaron valores de p destacablemente pequeños al comparar dicho tratamiento con el control positivo utilizando tanto las medidas de LWW como las de LWH. El tratamiento aparentemente presentaba una distribución de tamaños tumorales sistemáticamente más pequeños que el control positivo.

Ejemplo 6: los anticuerpos de péptido PD-1 son inhibitorios o activadores.

La proliferación de los linfocitos T específicos de antígeno reflejan una importante función efectora de los linfocitos T efectores. Con el fin de determinar si los cuatro anticuerpos de a-PD-1_hu alteran la función de los linfocitos T efectores mediante activación o inhibición de la ruta de señalización de PD-1, se llevó a cabo un ensayo de proliferación basado en CFSE. En el ensayo de proliferación, se marcaron con CFSE esplenocitos procedentes de ratones transgénicos para RCT específicos para PBM no expuestos y se activaron con PBM Ac1-11 en la presencia de 50 mg/ml de anticuerpos de a-PD-1_hu o IgG de conejo de control durante 4 días. Se analizó la expresión de CFSE mediante citometría de flujo (fig. 13). Los datos muestran que 81 % de los linfocitos T CD4 tratados con a-PD-1_h-92-110 presentan un alto nivel de proliferación en comparación con solo 70 % de los linfocitos T con alto nivel de proliferación en el grupo tratado con IgG de control, indicando que a-PD-1_h-92-110 bloquea la interacción PD-1/PD-L1 y conduce a una función de los linfocitos T efectores incrementada, representada por una proliferación específica de antígeno incrementada de los linfocitos T CD4 específicos de mielina. Por el contrario, los linfocitos T tratados con a-PD-1_h(45-64) o a-PD-1_h(73-90) mostraban una proliferación reducida, indicando que activan la señalización de PD-1 e inhiben la función efectora de los linfocitos T CD4 específicos de mielina. Conjuntamente, estos datos indican que a-PD-1_h(92-110) potencia la función de los linfocitos T efectores y podría presentar un potencial terapéutico en la inhibición del crecimiento tumoralin vivo.Los epítopos 45-64 y 73-90 en virtud de su propiedad de activación de la señalización de PD-1 pueden servir de diana para las enfermedades autoinmunes.

Ejemplo 7: estudios de eficacia de cribado preliminar en ratones Balb/c singénicos inmunizados con diferentes constructos de PD-1 y retados con 1x10 células tumorales CT26 de carcinoma de colon murino.

Se inmunizaron ratones Balb/c inmunocompetentes (5 ratones/grupo) de 6 a 8 semanas de edad con 100 |jg de péptido emulsificado en Montanide ISA 720 (Seppic, Paris, Francia) y adyuvante no MDP (N-acetil-glucosamina-3-il-acetil L-alanil-D-isoglutamina). Los ratones recibieron inmunizaciones de refuerzo 3 y 6 semanas después del reto tumoral: 10 días después del segundo refuerzo, los ratones fueron inoculados con 1x105 células tumorales CT26 de carcinoma de colon murino por vía subcutánea y se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral tres veces a la semana. En los ratones de control el día 0 se injertaron 1x105 células tumorales CT26 por vía subcutánea y recibieron inyecciones de 150 jg de anticuerpos antirratón dirigidos contra PD-1. Se realizó un seguimiento de la respuesta inmunitaria (fig. 14) contra los sueros agrupados a diversos intervalos. (2Y+1, 2Y+3, 3Y+1, 3Y+2, 3Y+3) contra los constructos de vacuna y contra la proteína PD-1 recombinante (Tabla 11). Todos los ratones individuales montaron una respuesta de anticuerpos robusta para la totalidad de las 4 vacunas.

Tabla 11

Los sueros de ratón y conejo terminales se sometieron a ensayo para reactividad contra la proteína PD1_hu recombinante, 600 ng/pocillo. Los sueros se sometieron a ensayo a las diluciones de 1:100 y 1:200. Se utilizó ABTS como sustrato en el ensayo. Las muestras se leyeron a una A de 415 nm y se puntuaron A y se puntuaron.

Ejemplo 8: validación de epítopo PD-1(92-110) como un candidato de vacuna.

Todos los ratones vacunados mostraron una elevada inmunogenicidad, desarrollando títulos elevados de anticuerpos contra los inmunógenos respectivos. Solo los ratones vacunados con MVF-PD-1(92-110) mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral el día 14 (fig. 15), indicando que este epítopo es una vacuna inhibitoria útil. Esta conclusión resultó validada adicionalmente por estudios que mostraban que los epítopos 45-64 y 73-90 no eran inhibitorios y, por lo tanto, potenciaban el crecimiento tumoral. Por otra parte, el mAb de PD-1 de ratón (29F.1A12), que es un control positivo, debería haber inhibido el crecimiento tumoral. Se concluyó que solo el epítopo PD-1(92-110) es un candidato principal de vacuna, ya que el epítopo se diseñó basándose en las propiedades de unión al nivolumab.

Ejemplo 9: eficacia de los constructos de vacuna de combinación de PD-1 y HER-2 en ratones Balb/c singénicos retados con 1x10 células tumorales CT26/HER-2 de carcinoma de colon murino (esquema en la fig. 16).

La justificación de este estudio es si la bien establecida vacuna de HER-2 en combinación con una vacuna de PD-1(92-110) puede potenciar/incrementar la inmunogenicidad, potenciar las respuestas antitumorales y proporcionar un beneficio sinérgico en la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo singénico de cáncer. Se inmunizaron ratones Balb/c (10 ratones/grupo) con la combinación de constructos de vacuna de péptidos MVF-PD-1 (92-110), MVF-HER-2 (266-296) y MVF-HER-2(597-626) emulsificados con nor-MDP e ISA 720. Los animales recibieron un refuerzo dos veces a intervalo de 3 semanas. Se determinaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA en 200 ng/pocillo de péptido MVF.

Dos semanas después del refuerzo final, se trasplantaron 1x105 células tumorales de líneas tumorales CT26/HER-2 por vía s.c. Se retaron ratones de control con 1x105 células tumorales y se trataron con anticuerpo anti-PD-1 (29F.1A12) dos veces a la semana durante todo el experimento. Se determinó la carga tumoral mediante medición de los tumores una vez habían alcanzado un tamaño palpable según medición con pie de rey. Los ratones portadores de tumor CT-26/HER-2 se sacrificaron 21 días después del trasplante. Se recogieron muestras de sangre y tejido de dichos ratones en el momento del sacrificio y se obtuvo el peso final de la masa tumoral extirpada. Se sometieron a ensayo concentraciones de suero entre 1:100 y 1:512.000. Se utilizó ABTS como un sustrato en el ensayo; la reacción enzimática se detuvo tras 10 minutos con una solución de SDS al 0,1 %. Se definieron los títulos como la dilución final que todavía presentaba una absorbancia >0,200 al leerla a una A de 415 nm. Se extrajeron muestras de suero 1Y+3, 2Y+1, 2Y+3 y 3Y+2 antes del reto con tumor CT-26 HER-2 neu. Las muestras 3Y+3 y 3Y+5 se extrajeron 1 y 3 semanas después del reto, respectivamente. Se indujeron respuestas robustas de anticuerpos de HER-2 y PD-1 en todos los ratones vacunados (fig. 17).

Gráficos individuales de crecimiento tumoral en ratones Balb/c singénicos (10 por grupo) inmunizados 3 veces a intervalos de 3 semanas con PD-1(92-110) solo o en combinación con la inmunización de dos inmunógenos de péptido Her2. Se incluyó un grupo de control de inmunización con péptido irrelevante. Los ratones se retaron 15 días después de la 3a vacunación con células de carcinoma CT-26 Her2 neu (1x105). Los ratones de control también se retaron con las células de carcinoma CT-26 Her2 neu. Los ratones de control se trataron dos veces a la semana IP con mAb anti-Ms PD-1 (control positivo) o PBS (control negativo). Se realizó un seguimiento de los ratones y se puntuaron para la formación de tumores palpables; a continuación, se midieron las dimensiones tumorales periódicamente utilizando un pie de rey. Los animales se sacrificaron el día 21 después del trasplante de células tumorales. Las barras de error son una representación del error estándar para el grupo de ratones y los valores de p comparan diversos grupos a ratones triplemente vacunados. Los resultados indican que la triple vacunación resulta eficaz para reducir el crecimiento tumoral en un modelo de Balb/c singénico de carcinoma de colon frente a la vacuna de PD-1 o, más importante, el estándar de oro de control positivo: el anticuerpo monoclonal anti-PD-1 de ratón (29F.1A12) (fig. 18).

Los datos demuestran que el grupo de triple vacunación MVF-PD-1(92-110) MVF-HER-2(266+296) MVF-HER-2(597-626) resultó más eficaz en la prevención del crecimiento tumoral que el control positivo mAb anti-PD-1 de ratón (29F.1A12) o la vacunación con MVF-PD-1 solo (figs. 19A y 19B). De esta manera, la estrategia de triple vacunación con la combinación de péptidos HER-2 y PD-1 es una propuesta viable que demuestra sinergia/aditividad que culmina en una inmunogenicidad potenciada y la inhibición del crecimiento tumoral.

Ejemplo 10: las vacunas de PD-1 son seguras y no muestran toxicidad o autoinmunidad.

Todos los ratones vacunados a lo largo de un periodo de 9 semanas no mostraron signos de desaliño, lesiones y letargia. Se recolectaron órganos (bazo, hígado, corazón, pulmón, riñón y tumor) de los ratones Balb/c vacunados con péptidos de combinación (HER-2 y PD-1) y se sometieron a análisis en las instalaciones centrales de patología comparativa y fenotipado de ratón del departamento del Comprehensive Cancer Center de Veterinary Biosciences (patóloga: Krista M. D. La Perle, DVM, PhD, Dipl. ACVP). No se observaron lesiones significativas en ninguno de los órganos sometidos a evaluación histológica. Tampoco se observaron anormalidades bioquímicas manifiestas. Todos los ratones presentaban vacuolación hepatocelular consistente con glucogenosis. La acumulación de glucógeno en el hígado se interpreta como un resultado normal y varía según el estado fisiológico del animal. También se observó acumulación de glucógeno como una manifestación de toxicidad o con enfermedades de almacenamiento del glucógeno.

Ejemplo 11: la vacuna peptídica de combinación incrementó significativamente la proporción CD8/Treg en células infiltrantes tumorales (CIT).

Los linfocitos T reguladores CD25<+>FoxP3<+>CD4 (T<reg>) son una de las poblaciones supresoras principales en el microambiente tumoral que contribuye significativamente al desarrollo de un microambiente tumoral inmunosupresor (MTI). Por otra parte, un número elevado de linfocitos T en el sitio tumoral, especialmente linfocitos T CD8, es un denominado clave de supervivencia global (SG) en pacientes de cáncer. Se ha asociado una proporción CD8/T<reg>elevada con un pronóstico favorable del cáncer. Por lo tanto, se determinó que la proporción CD8/T<reg>en las CIT en ratones portadores tumorales vacunados con péptidos de combinación o péptido de control (descrito anteriormente). Se extrajeron los tumores de cuatro grupos de ratones (descritos anteriormente) y se pasaron por tamices celulares, seguido de dos lavados con Percoll al 37 %. A continuación, se incubaron las células con mAb de los marcadores de superficie celular (CD45, CD4, CD8 y CD25). A continuación, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando solución de Cytofix/Cytoperm (eBioscience) durante 60 min a 4 °C, seguido de la tinción para FoxP3 durante 30 min a 4 °C. Se adquirieron 80.000 a 100.000 sucesos de células vivas en un FACSCantolI (BD) y se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). Para diferenciar las CIT de las células tumorales, las células en primer lugar se seleccionaron de células CD45+. A continuación, se analizaron las células CD4<+>(fig. 20A) y CD8<+>(fig. 20B). Las Treg están representadas por las células CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>(fig 20C). Se utilizó el software GraphPad (GraphPad Prism Software, Inc.,San Diego, CA, EE. UU.) para el análisis estadístico. Se calcularon las medias de grupo y se compararon mediante ANOVA. Los linfocitos T CD8<+>presentaban un número significativamente más elevado en el grupo de vacuna de combinación (grupo vacunado con HER-2/PD1-92) en comparación con el grupo vacunado con péptido de control (fig. 20B). No se observaron diferencias significativas de linfocitos T CD4 o linfocitos T<reg>entre todos los grupos (figs.

20A y 20B). Sin embargo, la proporción CD8/T<reg>era significativamente más alta en el grupo de vacuna de combinación que en el grupo vacunado con péptido de control (fig. 20D). Por lo tanto, estos datos indican una proporción CD8/T<reg>incrementada en el grupo vacunado con HER-2/PD-1 respecto al grupo vacunado con péptido de control) durante 30 min a 4

Ejemplo 12: análisis de los linfocitos infiltrantes de tumor procedentes de ratones vacunados con péptido.

Se ha asociado una proporción CD8/T<reg>elevada con un pronóstico favorable del cáncer. Con el fin de determinar si la vacuna de péptido incrementaba la proporción CD8/T<reg>, se analizaron linfocitos infiltrantes de tumor CD8<+>, CD4<+>y T reguladores (FoxP3<+>CD25<+>CD4<+>) en ratones vacunados con péptido. Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo para evaluar la expresión de marcadores de superficie (CD45, CD4, CD8 y CE25) y se determinó la expresión del factor de transcripción FoxP3 mediante tinción intracelular (fig. 21A). Brevemente, se extrajeron los tumores de ratones y se pasaron por tamices celulares, seguido de dos lavados con Percoll al 37 %. A continuación, se resuspendieron las células en tampón de tinción y se incubaron con mAb contra los marcadores de superficie celular durante 30 min a 4 °C. Tras lavar dos veces con tampón de tinción, se fijaron las células y se permeabilizaron con solución Cytofix/Cytoperm (eBioscience) durante 60 min a 4 °C. A continuación, las células se tiñeron para FoxP3 durante 30 min a 4 °C. Se adquirieron 80.000 a 100.000 sucesos de células vivas en un FACSCanto II (BD) y se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). Para diferenciar las células infiltrantes (CD45<+>) de las células tumorales (CD45<->), las células totales en primer lugar se seleccionaron de células CD45<+>. A continuación, se analizó el porcentaje de células CD4<+>y CD8<+>en la población infiltrante tumoral CD45<+>. Las células T<reg>están representadas por las células FoxP3<+>CD25<+>CD4<+>. Se utilizó el software GraphPad (GraphPad Prism Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para el análisis estadístico. Se calcularon las medias de grupo y se compararon mediante ANOVA. Tal como se muestra en la fig. 21B, los linfocitos T CD8<+>presentaban un número significativamente más alto en los grupos vacunados con péptido PD-1 o PD-1/Her-2 (grupos 1 y 2) en comparación con el grupo vacunado con péptido de control (grupo 3). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas de células T<reg>entre el grupo de péptido PD-1, el grupo vacunado con PD-1/Her-2 y el grupo vacunado con péptido de control. Conjuntamente, estos datos indican una proporción CD8/T<reg>incrementada en el grupo vacunado con péptido PD-1 o PD-1/Her-2 en comparación con el grupo vacunado con péptido de control.

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Secuencias

SEC ID n° 1 PD1 humano, residuos 1-128 PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQD

CRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKLQIKESLRAERVTERRAEVP TAHPSPSP

* SEC ID n.° 2 PD1 (32-50)

VLNWYRMSPSNQTDKLAAF

* SEC ID n.° 3 PD1 (45-64)

KLAAFPEDRSQPGQDCRFR

* SEC ID n.° 4 PD1 (73-90)

DFHMSVVRARRNDSGTYL SEC ID n° 5 PD1 (92-110)

GAISLAPKAQIKESLRAEL SEC ID n° 6 Proteína de fusión de virus de sarampión (MVF)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEPPTFSPALLYYTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQD

CRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKLQIKESLRAERVTERRAEVP

TAHPSPSPSEC ID n° 7, Conector

GPSL

* SEC ID n.° 8 MVF-PD1 (32-50)

KLLSLIKGVIVHIZLEGVEGPSLVLNWYRMSPSNQTDKLAAF

* SEC ID n.° 9 MVF-PD1 (45-64)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLKLAAFPEDRSQPGQDCRFR

* SEC ID n.° 10 MVF-PD1 (73-90)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLDFHMSVVRARRNDSGTYL SEC ID n° 11 MVF-PD1 (92-110)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLGAISLAPKAQIKESLRAEL

* SEC ID n.° 12 PD1 (32-50) D-PÉPTIDO RETROINVERSO

FAALKDTQNSPSMRYWNLV

* SEC ID n.° 13 PD1 (45-64) D-PÉPTIDO RETROINVERSO

RFRCDQGPQSRDEPFAALK

* SEC ID n.° 14 PD1 (73-90) PÉPTIDO D RETROINVERSO

LYTGSDNRRARVVSMHFD

* SEC ID n.° 15 PD1 (92-110) D-PÉPTIDO RETROINVERSO

LEARLSEKIQAKPALSIAG

* SEC ID n.° 16 MVF PD1 (32-50) PÉPTIDO D RETROINVERSO KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLFAALKDTQNSPSMRYWNLV

* SEC ID n.° 17 MVF PD1 (45-64) PÉPTIDO D RETROINVERSO KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLRFRCDQGPQSRDEPFAALK

* SEC ID n.° 18 MVF PD1 (73-90) PÉPTIDO D RETROINVERSO KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLYTGSDNRRARVVSMHFD

* SEC ID n.° 19 MVF PD1 (92-110) PÉPTIDO D RETROINVERSO

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLEARLSEKIQAKPALSIAG

* SEC ID n° 20 TT

NSVDDALINSTIYSYFPSV

* SEC ID n.° 21 TT1

PGINGKAIHLVNNQSSE

* SEC ID n° 22 P2

QYIKANSKFIGITEL

* SEC ID n.° 23 P30

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

* SEC ID n° 24, MVF (natural)

LSEIKGVIVHRI,EGV

* SEC ID n.° 25 HBV

FFLLTRILTIPQSLN

* SEC ID n.° 26 CSP

TCGVGVRVRSRVNAANKKPE SEC ID n° 27 HER-2 (266-296) LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV SEC ID n° 28 MVF HER-2(266-296) KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV SEC ID n° 29 HER-2 (597-626) VARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPL SEC ID n° 30 MVF HER-2 (597-626) KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPL

*ya no reivindicado en la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

i .Péptido quimérico PD-1 para estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína PD-1, que comprende uno o más epítopos de linfocito B de PD-1, un epítopo de linfocito T ayudante (Th) y un conector que une el epítopo de linfocito B de PD-1 al epítopo de Th, en el que el epítopo o epítopos de linfocito B de PD-1 consisten en<s>E<c>ID n.° 5 y en el que el epítopo de Th consiste en SEC ID n.° 6.
2. Péptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID n.° 11.
3. Péptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el conector comprende SEC ID n.° 7.
4. Composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende, además, uno o más epítopo de linfocito B HER-2.
6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, en el que los epítopos de linfocito B HER-2 comprenden una o más de las secuencias quiméricas indicadas en SEC ID n.° 28 o 30, o en el que los epítopos de linfocito B HER-2 comprenden uno o más epítopos de linfocito B HER-2 indicados en SEC ID n.° 27 o n.° 29.
7. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el vehículo es biodegradable y se selecciona del grupo que consiste en una emulsión que comprende una emulsión de aceite/agua farmacéuticamente aceptable y una microesfera o nanoesfera biodegradable que comprende un polímero de poliláctido-ácido poliglicólico.
8. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 para la utilización en un método de tratamiento de un cáncer, enfermedad de Alzheimer o enfermedad autoinmune en un sujeto.
9. Péptido o composición farmacéutica según la reivindicación 8, para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer se selecciona del grupo de cánceres que consiste en linfoma, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, micosis fungoide, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer del sistema nervioso, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, neuroblastoma, glioblastoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer prostático, cáncer cutáneo, cáncer hepático, melanoma, carcinomas de células escamosas de la boca, garganta, laringe y pulmón, cáncer de colon, cáncer de cuello uterino, carcinoma de cuello uterino, cáncer de mama, cáncer epitelial, cáncer renal, cáncer genitourinario, cáncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeza y cuello, cáncer de intestino grueso, cáncer hematopoyético, cáncer testicular, cáncer prostático o cáncer pancreático, preferentemente en el que el cáncer es cáncer mamario.
10. Péptido o composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 9, para la utilización en un método de tratamiento del cáncer mamario en un sujeto, en el que el péptido o composición farmacéutica se administra en el sujeto en combinación con uno o más epítopos de linfocito B HER-2, en el que los epítopos de linfocito B HER-2 preferentemente comprenden una o más de las secuencias quiméricas indicadas en SEC ID n.° 28 o n.° 30, o en el que los epítopos de linfocito B HER-2 preferentemente comprenden uno o más epítopos de linfocito B HER-2 indicados en SEC ID n.° 27 o n.° 29.
11. Péptido o composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 10, en el que los epítopos de linfocito B HER-2 se administran en la misma composición que los epítopos de PD-1.
12. Péptido o composición farmacéutica según la reivindicación 8, para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto, en el que la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en soriasis, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, síndrome poliendocrino autoinmune, diabetes mellitus de tipo 1, tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Graves, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, artritis soriásica, artritis reumatoide, policondritis recidivante, miastenia grave, encefalomielitis diseminada aguda y granulomatosis con poliangitis.