KR20190137826A - 인간 pd1 펩티드 백신 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

합성 PD-1 펩티드, 키메라 PD-1 펩티드, 항-PD-1 항체에 관한 조성물 및 상기 펩티드 또는 항체를 사용하여 암, 자가면역 질병, 및 알츠하이머병을 치료하는 방법이 개시된다.

Description

인간 PD1 펩티드 백신 및 이의 용도

1. 암은 이제 선진국에서 그리고 전세계적으로 사망의 주요 원인이다. 이 질병의 경제적 부담과, 더 중요하게는, 그것이 야기하는 고통이 엄청나다는 것이다. 새로운, 더 효능있는 항암 요법의 개발 및 적용을 가속화하는 것에 대한 명백하고 긴급한 요구가 존재한다. 종양학 분야는 거대하며, 일부 드문/희귀성 형태를 포함한 몇몇 적응증을 포함한다. 종양학이 계속해서 약물 개발의 관점에서 가장 활발한 영역 중 하나이지만, 여전히 상당한 충족되지 않은 요구가 존재한다.

2. 암 면역학의 최근의 진보는 인간 암에 대한 T 세포-매개 항-종양 면역의 중요성을 기재해 왔으며, T 세포에 의해 발현되는 억제성 수용체는 암 면역요법에 대한 중요한 표적이 되어 왔다. 면역 관문 프로그래밍된 세포사 단백질-1 (PD-1)을 통한 신호전달은 항종양 면역 반응을 둔화시킴으로써 종양 진행을 가능하게 한다. 단일클론 항체에 의한 PD-1과 그의 리간드 프로그래밍된 세포사 리간드-1 (PD-L1) 사이의 신호전달 축의 치료적 차단은 암의 치료에서 현저한 임상 성공을 보여왔으며, 심지어 질병의 진행기 및 전이기에서도 광범위한 암 아형 세트에 걸쳐 인상적인 활성을 입증해왔다. 이러한 경로를 표적화하는 치료제는 현재 임상 시험 중에 있다. 펨브롤리주맙 및 니볼루맙은 이필리무맙-불응성 흑색종의 치료를 위하여 미국 식품의약국 (FDA)으로부터의 신속한 승인을 얻기 위한 관문 억제제들의 이러한 항-PD-1 경로 패밀리 중 최초이다.

3. 면역학적 관문 및 특히 PD-1/PD-L1 축을 표적화하는 단일클론 항체는 최근 수년에 암 요법에서 눈부신 결과를 제공하였다. 입증된 유용성에도 불구하고, 항체는 치료제로서의 특정한 결점을 갖는데, 이러한 결점에는 불량한 조직/종양 침투율이 포함되며, 이는 PD-1:PD-L1 신호전달 경로를 표적화할 때 특히 관련 있을 수 있다. 예를 들어, PD-1-발현 이펙터 T 세포가 PD-L1-발현 종양의 고형 조직 내에서 침윤된 상태로 발견된다. 이는 항체에 있어서 문제가 되는데, 항체는 그들의 큰 크기로 인해 종양에의 진입이 방해받는다. 따라서, 항체는 종양 내의 의도된 치료 부위에서의 PD-1:PD-L1 신호전달을 완전히 길항시키는 데 실패하며, 이는 최적에 못 미치는 효능을 초래하게 되는 결과를 가져온다.

4. 관문 차단은 암에 대한 면역요법에서 새로운 패러다임 전환을 맞이하게 한다. 그러나, 많은 암 환자는 PD-1/PD-L1 관문 차단에 반응하지 못하였다. 필요한 것은 암, 바이러스성 감염, 자가면역 질병 및 알츠하이머병의 치료를 위한 새로운 PD-1/PD-L1 관문 억제제이다.

5. 합성 PD-1 펩티드와 관련된 방법 및 조성물이 개시된다.

6. 일 태양에서, 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6), 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커(linker) (예컨대, 서열 번호 7)를 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 PD-1 키메라 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.

7. 임의의 선행하는 태양의 키메라 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 펩티드가 본 명세서에 또한 개시된다.

8. 일 태양에서, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 (개시된 서열의 D 거울상 이성질체를 포함함) 중 하나 이상을 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시된다. 일 태양에서, 합성 펩티드는 아세틸화될 수 있다.

9. 임의의 선행하는 태양의 합성 펩티드를 포함하며, Th 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6), 및 상기 합성 PD-1 펩티드를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커 (예컨대, 서열 번호 7)를 추가로 포함하는 키메라 펩티드가 본 명세서에 또한 개시된다.

10. 임의의 선행하는 태양의 키메라 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 펩티드가 본 명세서에 또한 개시된다.

11. 일 태양에서, 임의의 선행하는 하나 이상의 키메라 펩티드 또는 합성 펩티드 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다.

12. 임의의 선행하는 태양의 약제학적 조성물에 있어서, 하나 이상의 HER-2 B 세포 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 또는 서열 번호 30) 및/또는 하나 이상의 항-Her-2 항체를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물이 또한 개시된다.

13. 일 태양에서, 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 임의의 선행하는 태양의 임의의 펩티드 또는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

14. 본 명세서 내에 포함되어 그의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 몇몇 실시 형태를 예시하고, 상세한 설명과 함께 개시된 조성물 및 방법을 예시한다.
15. 도 1은 각각 청색 및 녹색 리본에 의해 나타낸 hPD-1과 hPD-L1의 hPD-1/hPD-L1 계면의 확대도를 나타낸다. 상호작용에 중요한 모든 잔기는 막대로서 강조되어 있다. 소수성 코어를 형성하는 잔기는 황색으로 되어 있다. 물 분자는 적색 구체로서 나타나 있다. 수소 결합은 흑색 파선으로 표시되어 있다. (도 1a) 정면측에서 본 모습 (문헌[Zak et al., 2015, Structure 23, 2341 - 2348]). (도 1b) PD-1 펩티드가 모델링됨.
16. 도 2a, 도 2b 및 도 2c는 입체구조적 에피토프로서의 PD-1 펩티드의 모델링을 보여준다. 도 2a는 PD-1 (32-50) (서열 번호 2)을 나타낸다. 도 2b는 PD-1 (73-90) (서열 번호 4)을 나타낸다. 도 2c는 PD-1 (92-110) (서열 번호 5)을 나타낸다.
17. 도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d 및 도 3e는 인간 hPD-L1의 세포외 도메인에 대한 결합 실험에 대한 표면 플라즈몬 공명 분광법을 나타낸다. rhPD-L1 (도 3a), 니볼루맙 (도 3b), 인간 IgG (도 3c)에 대한 생성된 고정화 수준은 각각 2345 RU, 12264 RU 및 11651 RU이다. 센서 칩의 검증은 fhPD-1 및 니볼루맙 결합의 특이성을 측정함으로써 확인되었다. 1 μM (17.3 ㎍/ml) rhPD-1을 10 μl/min으로 3분 동안 칩 위로 주입하였다 (도 3d). 1 μM BSA를 음성 대조군으로 사용하였다. 칩을 10 mM 글리신-HCl (pH 2.5)에 의해 재생하였다 (도 3e).
18. 도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d, 도 4e, 및 도 4f는 MVF 펩티드 및 아세틸화 펩티드가 rhPD-L1 및 니볼루맙에 결합함을 보여준다. MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90), MVF-PD-1 (92-110)은 고정화된 rhPD-L1 (도 4a) 또는 니볼루맙 (도 4b)에 결합한다. Ac-PD-1 (45-64), Ac-PD-1 (73-90), Ac-PD-1 (92-110)은 고정화된 rhPD-L1 (도 4c 및 도 4d) 또는 니볼루맙 (도 4e 및 도 4f)에 결합한다.
19. 도 5a는 첫 번째 (1Y+3), 세 번째 (2Y+3) 및 여섯 번째 (3Y+3) 시험 채혈을 200 ng/웰의 MVF-펩티드 상에서 ELISA에 의해 시험한 것을 보여준다. 혈청을 처음에 1:2000으로 희석시키고, 이어서 최대 1:250,000까지 플레이트를 연속 희석시켰다. ABTS를 본 검정에서 기질로서 사용하였다. 역가는, 415 λ에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다.
20. 도 5b는 종말 채혈 혈청을 200 ng/웰의 다양한 펩티드 작제물 (MVF-펩티드, 아세틸화 펩티드, 유리 펩티드 및 재조합 인간 PD-1 단백질)에 대해 ELISA에 의해 시험한 것을 보여준다. 혈청을 처음에 1:2000으로 희석시키고, 이어서 최대 1:250,000까지 플레이트를 연속 희석시켰다. ABTS를 본 검정에서 기질로서 사용하였다. 역가는, 415 λ에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다.
21. 도 5c는 종말 혈청으로부터 정제된 항체를 200 ng/웰의 펩티드 상에서 ELISA에 의해 시험한 것을 보여준다. 항체를 처음에 20 ㎍/ml로 희석시키고, 이어서 최대 625 ng/ml까지 플레이트를 연속 희석시켰다. ABTS를 본 검정에서 기질로서 사용하였다. 역가는, 415 λ에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다.
22. 도 6은 나이브(

) TCR 유전자도입 마우스로부터의 비장세포를 MBP Ac1-11로 3일 동안 활성화한 것을 보여준다. 유세포측정에 의해 PD-1 발현을 결정하였다. 세포를 표지된 그대로의 α-mPD-1 또는 α-hPD-1 항체로 염색하였다. 세포를 CD4⁺ T 세포 상에서 게이팅하였다.
23. 도 7은 정제된 α-hPD-1 다중클론 항체가 미엘린-특이적 CD4 T 세포의 항원-특이적 증식을 변경시킴을 보여준다. (도 7a) 나이브 TCR 유전자도입 마우스로부터의 비장세포에 CFSE를 표지하고, 50 mg/ml의 αhPD-1 항체 또는 대조군 토끼 IgG의 존재 하에서 MBP Ac1-11로 4일 동안 활성화시켰다. 세포를 CD4⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. (도 7b) 도 7a에서 특이적 αhPD-1 항체로 처리된 세포 (청색)와 대조군 토끼 IgG로 처리된 세포 (적색)의 CFSE 히스토그램의 오버레이.
24. 도 8은 마우스 백신화 및 종양 생착의 계획을 나타낸다. 마우스는 3주 간격으로 총 3회의 백신화를 제공받았다. 세 번째 백신화 후 10일째에, 마우스의 우측 옆구리에 1x10⁵개의 뮤린 결장 암종 CT26 종양 세포를 피하 시험투여하였다. 대조군 마우스에 CT26 세포주를 접종하고, 마우스 PD-1 단일클론 항체로 매 3일마다 처리하였다.
25. 도 9는 PD-1 백신의 면역원성을 보여준다. 혈청 풀을 200 ng/웰의 MVF-펩티드 상에서 ELISA에 의해 시험하였다. 1:100 내지 1:250,000의 혈청 농도를 시험하였다. ABTS를 본 검정에서 기질로서 사용하였다. 역가는, 415 λ에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다.
26. 도 10은 비장세포 (도 10a) 및 종양 침윤 세포 (도 10b)를 처리된 마우스의 5개의 모든 군으로부터 단리한 것을 보여준다. CD4 및 CD8 세포를 유세포측정에 의해 결정하였다 (CD45⁺CD3⁺ 세포 상에서 게이팅함). Foxp3⁺CD25⁺CD4 T 조절성 세포를 세포내 염색에 의해 결정하였다. 모든 CD4 및 CD8 T 세포는 CD45⁺CD3⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. Treg는 CD45⁺CD3⁺CD4⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. 군 A= 대조 펩티드, 군 B=32-50; 군 C=45-64; 군 D=73-90; 군 E=92-110; 군 F=α-마우스 PD-1 (양성 대조군).
27. 도 11a, 도 11b, 도 11c, 도 11d, 도 11e, 도 11f, 도 11g, 및 도 11h는 4개의 PD-1 작제물 (A: PD-1 (32-50), B: PD-1 (45-64), C: PD-1 (73-90) 및 D: PD-1 (92-110)), 대조 펩티드 (E: 비관련 펩티드) 및 항-마우스 PD-1 단일클론 항체로 처리된 양성 대조군 (F)의 각각에 대해 면역화된 Balb/c 마우스 (5 마리/군)에서의 종양 성장의 개별 도표를 나타낸다. 도 11g 및 도 11h는, PD-1 백신 작제물로 면역화되고 CT26 암종 세포 (1x10⁵개)가 세 번째 백신화 후 10일째에 시험투여된 유전자적 동계 Balb/c에서의 개별 도표를 나타낸다. 종양 마우스를 매주 2회 촉진가능한 종양의 형성에 대해 모니터링하고 점수를 매기고, 일수 19에서 희생시켰다.
28. 도 12a, 도 12b, 도 12c, 및 도 12d는 MVF-PD-1 (32-50), MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90), 및 MVF-PD-1 (92-110)에 대한 일수 14에서의 LWW 및 LWH 측정치의 분포를 나타낸다. MVF-PD-1 (92-110)에 대한 LWW (도 12a) 및 LWH (도 12b)가 나타나 있다. 도 12c는 MVF-PD-1 (32-50), MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90), 및 MVF-PD-1 (92-110) 각각에 의한 LWW14의 분포를 나타낸다. 도 12d는 MVF-PD-1 (32-50), MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90), 및 MVF-PD-1 (92-110) 각각에 의한 LWH14의 분포를 나타낸다.
29. 도 13a 및 도 13b는 αhPD1-45 및 αhPD1-73이 미엘린-특이적 증식을 억제함을 보여준다. MBP Ac1-11에 특이적인 나이브 Vα2.3/Vβ8.2 TCR 유전자도입 마우스로부터의 CFSE 표지 비장세포를 50 ㎍/ml의 αhPD-1 항체 또는 대조 토끼 IgG의 존재 하에서 MBP Ac1-11로 활성화시켰다. 유세포측정에 의해 CFSE를 분석하였다 (도 13a). 세포를 CD4⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. 증식의 생성당 세포의 양이 도 13b에 요약되어 있다.
30. 도 14는 PD-1 백신의 면역원성을 보여준다. 풀링된 혈청을 200 ng/웰의 MVF-펩티드 상에서 ELISA에 의해 시험하였다. 1:100 내지 1:250,000의 혈청 농도를 시험하였다. 역가는, 415 λ에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다.
31. 도 15는 4개의 PD-1 MVF-백신 작제물 (A: PD-1 (32-50), B: PD-1 (45-64), C: PD-1 (73-90) 및 D: PD-1 (92-110)), E: 음성 대조군 (비관련 펩티드); F: 양성 대조군 항-마우스 PD-1 단일클론 항체 (29F.1A12)로 면역화된 유전자적 동계 Balb/c 마우스 (5 마리/군)에서의 종양 성장의 평균 도표를 나타낸다. CT26 암종 세포 (1x105개)를 세 번째 백신화 후 15일째에 마우스에 시험투여하였다. 마우스를 매주 2회 촉진가능한 종양의 형성에 대해 모니터링하고 점수를 매기고, 캘리퍼스를 사용하여 종양을 측정하였다. 동물을 일수 19일에서 희생시켰다.
32. 도 16은 BALB/c에서의 병용 백신화 후의 CT26/HER-2 암종 세포의 시험투여 일정을 나타낸다. Balb/c에서의 CT-26-HER-2 종양 모델을 사용하여, 항-HER2 면역화 요법과 병용한 항-PD1 면역화 요법의 상승적 효과에 대해 시험하였다. 펩티드 백신을 언급된 바와 같이 단독으로 또는 병용하여 제공하였다. 백신을 물 중에 용해시키고, Montanide ISA 720 (1:1) 및 50 ㎍의 노르-MDP (N-아세틸글루코사민-3일-아세틸-l-알라닐-d-아이소글루타민) 중에 유화시켰다. 마우스는 3주 간격으로 총 3회의 백신화를 제공받았다. 5 내지 6주령된 암컷 Balb/c 마우스 (Charles River Laboratories)를 100 ㎍의 각각의 펩티드 백신으로 3주 간격으로 3회 면역화하고, 세 번째 면역화 후 2주째에, 마우스의 우측 옆구리에 CT-26-HER-2 neu 종양 세포 (마우스당 1x10⁵개의 세포)를 피하 (s.c) 시험투여하였다. Balb/c 마우스를 양성 대조군으로서 사용된 항-마우스 PD-1 MAb 29F.1A12 (미국 뉴햄프셔주 웨스트 레바논 소재의 Bio × Cell) 200 ug/용량으로 주 2회 처리하거나 음성 대조군으로서 사용된 PBS로 처리하였다. 최대 21일 동안 매주 2회 촉진가능한 종양의 형성에 대해 마우스를 모니터링하고 점수를 매기고, 종양이 괴사하게 되거나 2,000 ㎣의 미리 결정된 크기를 초과하게 되면 희생시켰다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 세제곱 밀리미터 단위로 측정하고, 하기 식으로 계산하였다: A × B2 × 0.5 (여기서, A는 최대 직경이고, B는 최소 직경임).
V = [(길이 × 폭2)/2].
면역화 동안, 혈액을 격주로 채취하고 ELISA에서 사용하여 Ab 역가를 모니터링하였다. 처리의 종료 시점에서 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 칭량하고, 그러한 종양의 샘플을 추가의 연구를 위해 그리고 조직학적 검사를 위해 저장하였다. 추가의 검사를 위해 비장을 또한 수집하였다. 모든 실험은 미국 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 공공 건강 서비스 정책(U.S. Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였으며, 오하이오 주립 대학교 IACUC (Institutional Animals Care and Use Committee)에 의해 승인되었으며, 허용된 프로토콜에 상세히 기재되어 있다.
33. 도 17은 삼중 백신 처리된 마우스에서의 개별 항원의 면역원성을 나타낸다. 3개의 펩티드 (HER-2 (266-296), HER-2 (597-626), 및 PD-1 (92-110))로 면역화된 마우스로부터의 혈청 풀을 200 ng/웰의 MVF-펩티드 상에서 ELISA에 의해 시험하였다. 1:100 내지 1:512,000의 혈청 농도를 시험하였다. ABTS를 이 검정에서 기질로서 사용하였으며, 0.1% SDS 용액을 사용하여 10분 후에 효소 반응을 중단시켰다. 역가는, 415 nm에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다. 혈청 샘플 1Y+3, 2Y+1, 2Y+3, 및 3Y+2를 CT-26 HER-2 neu 종양 시험투여 전에 채취하였다. 샘플 3Y+3 및 3Y+5를 시험투여 후 각각 1주째 및 3주째에 채취하였다.
34. 도 18은 삼중 HER-2 (266) + HER-2 (597) + PD-1 (92) 백신화가 양성 대조군 α-마우스 PD-1 mAb (29F.1A12), MVF-PD-1 (92-110), 음성 대조군 PBS 또는 비관련 펩티드에 비하여, 결장 암종 세포주 CT26/HER-2가 시험투여된 BALB/c에서 종양 성장의 유의한 (p < 0.001) 억제를 야기함을 보여준다.
35. 도 19a 및 도 19b는 HER-2 및 PD-1 병용 백신이 향상된 면역원성 및 종양 성장의 억제를 나타냄을 보여준다. PD-1 (92-110) 단독으로, 2개의 HER-2 펩티드 면역원에 의한 면역화와 병용하여, 또는 HER-2 면역원 단독으로 3주 간격으로 3회 면역화된 유전자적 동계 Balb/c 마우스 (10 마리/군)에서의 종양 성장의 도표. CT-26 HER-2 암종 세포 (1x10⁵개)를 세 번째 백신화 후 15일째 내지 18일째에 마우스에 시험투여하였다. PBS (음성 대조군)에 종양을 시험투여하고, 이어서 PBS의 IP 주사로 주 2회 처리하였다. 마우스를 촉진가능한 종양의 형성에 대해 모니터링하고 점수를 매기고, 이어서 캘리퍼스를 사용하여 정기적으로 측정하였다. 오차 막대는 마우스군에 대한 표준 오차의 표현이고, p-값은 다양한 군 대 음성 대조군 PBS 처리된 마우스를 비교한다.
36. 도 20a, 도 20b, 도 20c, 및 도 20d는 TIL을 4개의 군 내의 각각의 마우스로부터 단리한 것을 나타낸다. CD4 (도 20a) 및 CD8 (도 20b) T 세포를 유세포측정에 의해 결정하였다 (CD45⁺ 세포 상에서 게이팅함). Foxp3⁺CD25⁺CD4 Treg (0C)를 세포내 염색에 의해 결정하였다 (CD45⁺CD4⁺ 세포 상에서 게이팅함). 도 20d는 CD8⁺ T 세포 대 Treg의 비를 나타낸다. 군 평균을 계산하고, 분산분석(Anova)을 사용하여 비교하였다.
37. 도 21a 및 도 21b는 펩티드-백신화된 마우스로부터의 종양 침윤 림프구의 분석을 나타낸다. 도 21a는 첫 번째 생체내 실험으로부터의 데이터와 두 번째 생체내 실험으로부터의 군 5 및 군 6의 데이터를 합한 데이터를 나타낸다. 종양 침윤 세포를 첫 번째 생체내 실험에서 처리된 마우스의 5개의 군 (군 A 내지 군 F)으로부터 합한 종양 조직으로부터 단리하였다. 종양 침윤 세포를 두 번째 생체내 실험으로부터의 군 5 및 군 6 내의 각각의 마우스로부터 단리하였다. CD4 및 CD8 세포를 유세포측정에 의해 결정하였다 (CD45⁺ 침윤 세포 상에서 게이팅함). CD25⁺CD4⁺ T 세포 상에서의 FoxP3 발현을 세포내 염색에 의해 결정하였다 (CD45⁺CD4⁺ 세포 상에서 게이팅함). 도 21b는 종양 침윤 세포를 두 번째 생체내 실험으로부터의 군 1 내지 군 4 내의 각각의 마우스로부터 단리한 것을 보여준다. CD4 및 CD8 세포를 유세포측정에 의해 결정하였다 (CD45⁺ 침윤 세포 상에서 게이팅함). CD25⁺CD4⁺ T 세포 상에서의 FoxP3 발현을 세포내 염색에 의해 결정하였다 (CD45⁺CD4⁺ 세포 상에서 게이팅함). 군 평균을 계산하고, 분산분석을 사용하여 비교하였다. 오차 막대는 s.e.m을 나타낸다.

38. 본 화합물, 조성물, 물품, 디바이스, 및/또는 방법을 개시 및 기술하기에 앞서, 이들은 달리 명시되지 않는 한 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 바이오기술 방법으로, 또는 달리 명시되지 않는 한 특정 시약으로 제한되지 않음이 이해되어야 하며, 이들은 그 자체로 물론 변동될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.

A. 정의

39. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "약제학적 담체"에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 담체들의 혼합물 등을 포함한다.

40. 범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 "약" 다른 하나의 특정 값까지로 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현되는 경우, 다른 실시 형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 하나의 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행어 "약"의 사용에 의해 근사치로서 표현될 때, 특정 값은 다른 실시 형태를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점이 나머지 다른 종점과 관련하여, 그리고 또한 나머지 다른 종점과 무관하게 유의함이 추가로 이해될 것이다. 또한, 본 명세서에는 다수의 값이 개시되어 있으며, 각각의 값은 또한 본 명세서에서 그 값 자체에 더하여 "약" 그러한 특정 값으로서 개시됨이 이해되어야 한다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되는 경우, "약 10"이 또한 개시된다. 또한, 소정의 값이 개시되는 경우, 당업자에게 적절히 이해되는 바와 같이, 그 값 "이하", "그 값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되는 경우, "10 이하"뿐만 아니라 "10 이상"이 또한 개시된다. 또한, 본 출원 전체에 걸쳐, 다수의 상이한 포맷으로 데이터가 제공되고, 이러한 데이터는 종점 및 출발점을 나타내고, 데이터 포인트들의 임의의 조합에 대한 범위임이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 개시되는 경우, 10 및 15 초과, 10 및 15 이상, 10 및 15 미만, 10 및 15 이하, 및 10 및 15뿐만 아니라 10 내지 15가 개시된 것으로 여겨짐이 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위들 사이의 각각의 단위가 또한 개시됨이 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.

41. 본 명세서에서 그리고 하기 청구범위에서는, 다수의 용어를 참조할 것이며, 이들 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 것이다:

42. "선택적" 또는 "선택적으로"는 이어서 설명되는 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 또는 일어나지 않을 수 있음을 의미하고, 상세한 설명이 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.

43. 용어 "투여하는"은 경구, 국소, 정맥내, 피하, 경피, 경진피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 진피내, 뇌실내, 두개내, 복막내, 병변내, 비강내, 직장, 질내, 흡입에 의한, 또는 이식된 저장소를 통한 투여를 지칭한다. 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 경막내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.

44. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않음을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 조합에 대해 어떠한 본질적인 유의성을 갖는 다른 요소를 배제함을 의미할 것이다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 요소들로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 방부제 등을 배제하지 않을 것이다. 이들 이행 용어 각각에 의해 정의되는 실시 형태는 본 발명의 범주 내에 있다.

45. "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투입으로 투여될 수 있다.

46. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형 형태는 장애 또는 질환의 하나 이상의 수반되는 증상의 강도를 부분적으로 또는 완전히 지연, 경감, 완화 또는 감소시키고/시키거나 장애 또는 질환의 하나 이상의 원인을 경감, 완화 또는 방해하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 예방적으로, 예방학적으로, 고식적으로 또는 구체적으로 적용될 수 있다. 일부 경우에, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형 형태는 대상체의 치료 전과 비교하여 또는 일반적 집단 또는 연구 집단에서의 그러한 증상의 발병률과 비교하여 종양의 크기를 부분적으로 또는 완전히 감소시키는 것, 종양의 수를 감소시키는 것, 및 종양의 중증도/전이능을 감소시키는 것을 포함한다.

47. 용어 "억제하다"는 활성, 반응, 질환, 질병, 또는 다른 생물학적 파라미터의 감소를 지칭한다. 이는 활성, 반응, 질환, 또는 질병의 완전한 근절을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 이는 또한, 예를 들어, 천연 또는 대조군 수준과 대비하여, 활성, 반응, 질환, 또는 질병의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는, 천연 또는 대조군 수준과 대비하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 이들 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.

48. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 개체를 의미한다. 따라서, "대상체"는 길들여진 동물 (예를 들어, 고양이, 개 등), 가축 (예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험실 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니 피그 등), 및 조류를 포함할 수 있다. "대상체"는 또한 포유동물, 예컨대 영장류 또는 인간을 포함할 수 있다.

49. "감소시키다" 또는 이 단어의 다른 형태, 예컨대 "감소시키는" 또는 "감소"는 사건 또는 특징 (예를 들어, 종양 성장)의 저하를 의미한다. 이는 전형적으로 일부 표준 또는 예상된 값과 관련되지만, 다시 말해 그것은 상대적이지만, 표준 또는 상대 값이 항상 언급되어야 할 필요가 있는 것은 아님이 이해된다. 예를 들어, "종양 성장을 감소시킨다"는 표준 또는 대조군과 대비하여 종양의 성장 속도를 감소시키는 것을 의미한다.

50. "예방하다" 또는 이 단어의 다른 형태, 예컨대 "예방하는" 또는 "예방"은 특정 사건 또는 특징을 정지시키는 것, 특정 사건 또는 특징의 발생 또는 진행을 안정화 또는 지연시키는 것, 또는 특정 사건 또는 특징이 일어날 기회를 최소화하는 것을 의미한다. 예방은 대조군과의 대비를 필요로 하지 않는데, 그 이유는, 이것은, 예를 들어 감소보다 전형적으로 더 절대적이기 때문이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어떤 것은 감소될 수 있지만 예방되지 않을 수 있으나, 감소되는 어떤 것은 또한 예방될 수 있다. 마찬가지로, 어떤 것은 예방될 수 있지만 감소되지 않을 수 있으나, 예방되는 어떤 것은 또한 감소될 수 있다. 감소 또는 예방이 사용되는 경우, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 다른 한쪽의 단어의 사용이 또한 명시적으로 개시되는 것으로 이해된다.

51. 본 명세서 및 최종 청구항에서의 조성물 내의 특정 요소 또는 성분의 중량부에 대한 언급은 중량부가 표현되는 조성물 또는 물품 내의 요소 또는 성분과 임의의 다른 요소 또는 성분 사이의 중량 관계를 나타낸다. 따라서, 2 중량부의 성분 X 및 5 중량부의 성분 Y를 함유하는 화합물에서, X 및 Y는 2:5의 중량비로 존재하고, 추가의 성분이 화합물 내에 함유되어 있는지에 관계없이 그러한 비로 존재한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 성분의 "중량%" 또는 "중량 퍼센트" 또는 "중량 기준 퍼센트"는 구체적으로 반대로 언급되지 않는 한, 성분이 포함되어 있는 조성물의 총 중량에 대한 성분의 중량의 비를 백분율로 표현한 것을 지칭한다.

52. 본 출원 전체에 걸쳐, 다양한 공개 문헌들이 참조된다. 이러한 공개 문헌들의 개시 내용 전체는 이로써 이와 관련된 최신 기술을 더 충분히 설명하기 위해서 본 출원에 참고로 포함된다. 개시된 참고문헌은 또한, 참고문헌이 의존되는 문장에서 논의되는 것들에 포함되는 자료에 대하여 개별적으로 그리고 구체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

B. 조성물

53. 개시된 조성물을 제조하는 데 사용되는 성분들뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 조성물 그 자체가 개시된다. 이들 및 다른 재료가 본 명세서에 개시되며, 이들 재료의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등이 개시되는 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 구체적인 언급이 명시적으로 개시되어 있지 않을 수 있지만, 각각은 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 기술되어 있음이 이해된다. 예를 들어, 특정 합성 또는 키메라 PD-1 펩티드가 개시 및 논의되고, 합성 또는 키메라 PD-1 펩티드를 포함한 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 합성 또는 키메라 PD-1 펩티드의 각각 하나하나의 모든 조합 및 순열 및 구체적으로 반대로 나타내지 않는 한 가능한 변형이 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 A, B, 및 C의 부류가 개시될 뿐만 아니라 분자 D, E, 및 F의 부류 및 조합 분자, A-D의 예가 개시되는 경우, 각각이 개별적으로 언급되어 있지 않더라고, 각각은 개별적으로 그리고 집합적으로 고려되며, 이는 조합, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F가 개시된 것으로 여겨짐을 의미한다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 또한 개시된다. 따라서, 예를 들어 A-E, B-F, 및 C-E의 하위-그룹이 개시된 것으로 간주될 것이다. 이러한 개념은 개시된 조성물의 제조 및 사용 방법에서의 단계를 포함하지만 이로 한정되지 않는 본 출원의 모든 태양에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있다면, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 구체적인 실시 형태 또는 실시 형태들의 조합으로 수행될 수 있음이 이해된다.

54. 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 PD-1 유전자는 55 kDa I형 막관통 단백질을 인코딩한다. 마우스 PD-1 및 인간 PD-1 둘 모두는 288개의 아미노산으로 이루어지고, N 말단에서 신호 펩티드 (20개의 아미노산)를 그리고 중간 부분에서 막관통 영역인 소수성 영역을 갖는다. 인간 및 뮤린 PD-1 단백질은 4개의 잠재적인 N-글리코실화 부위의 보존을 가지면서 약 60% 내지 80%의 아미노산 동일성을 공유하고, Ig-V 도메인을 한정하는 잔기를 공유한다. PD-1은 T 세포, B 세포, 및 대식세포 상에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 B7 패밀리 구성원 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)이다. 면역 관문 프로그래밍된 세포사 단백질-1 (PD-1)을 통한 신호전달은 항종양 면역 반응을 둔화시킴으로써 종양 진행을 가능하게 한다. 단일클론 항체에 의한 PD-1과 그의 리간드 프로그래밍된 세포사 리간드-1 (PD-L1) 사이의 신호전달 축의 치료적 차단은 암의 치료에서 현저한 임상 성공을 보여왔으며, 광범위한 암 아형 세트에 걸쳐 인상적인 활성을 입증해왔다. PD-1과 PD-L1의 상호작용을 직접 차단하거나 숙주 면역 반응을 자극하여 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 PD-1에 대한 항체를 생성할 수 있는 더 작은 비-항체 펩티드 치료제 및 펩티드 백신을 사용하여 전통적인 PD-1/PD-L1 차단에 대해 개선하는 것이 본 명세서에 개시되어 있다.

55. PD-1 B 세포 에피토프의 컴퓨터 이용 분석을 사용하여, PD-1 (서열 번호 1) 잔기 32-50, 45-64, 73-90, 및 92-110에 상응하는 서열을 도출하였다. 따라서, 일 태양에서, PD-1의 잔기 32-50, 45-64, 73-90 및/또는 92-100을 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시된다. 예를 들어, VLNWYRMSPSNQTDKLAAF (서열 번호 2), KLAAFPEDRSQPGQDCRFR (서열 번호 3), DFHMSVVRARRNDSGTYL (서열 번호 4), 및/또는 GAISLAPKAQIKESLRAEL (서열 번호 5)을 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시된다. 일 태양에서, 펩티드는 아실화 및/또는 아미드화될 수 있다. 따라서, (서열 번호 2), (서열 번호 3), (서열 번호 4), 및/또는 (서열 번호 5)를 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 합성 펩티드는 아실화 및/또는 아미드화된다.

56. 일부 경우에, L-아미노 서열의 유사체의 사용은 염기 서열에 대한 이점, 예컨대 분해 저항성, 안정성, 합성 용이성을 가질 수 있거나, 더 큰 효능을 가질 수 있다. 일 태양에서, 개시된 합성 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 역순으로의 L-아미노 서열을 포함할 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 역방향 서열(retro sequence)은 각각 FAALKDTQNSPSMRYWNLV (서열 번호 12), RFRCDQGPQSRDEPFAALK (서열 번호 13), LYTGSDNRRARVVSMHFD (서열 번호 14), 및 LEARLSEKIQAKPALSIAG (서열 번호 15)이다. 이들 역방향 서열은 또한 염기 서열의 거울 형태를 가질 수 있다. 따라서, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및/또는 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시된다. 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5와 마찬가지로; 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및/또는 서열 번호 15를 포함하는 합성 펩티드는 아세틸화 및/또는 아미드화될 수 있다.

57. 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15에 제시된, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5에 제시된 L-아미노산 서열의 역방향 유사체에 더하여, 순방향 L-아미노 서열 (서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5) 및 역방향 L-아미노 서열 (서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15)의 D 거울상 이성질체 유사체가 존재하는데, 이들은 증가된 분해 저항성 및 단백질 가수분해(proteolysis) 저항성을 가져서 더 우수한 경구 투여, 연장된 효능, 및 증가된 합성 용이성을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 일 태양에서, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 및/또는 서열 번호 15 중 하나 이상을 포함하는 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 서열을 포함하는 아미노산은 D 아미노산이다.

58. 일 태양에서, 개시된 합성 PD-1 펩티드는 MHC 제한을 우회하는 데 도움이 되는 사이토카인의 방출을 촉진하는 헬퍼 T (Th) 세포 에피토프 (즉, 무차별적(promiscuous) Th 세포 에피토프)에 합성 PD-1 펩티드를 연결시켜 키메라 PD-1 펩티드를 형성함으로써, 증가된 B 세포 자극을 가질 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 일 태양에서, 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프를 포함하고, T 헬퍼 (Th) 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6)를 추가로 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 PD-1 키메라 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및/또는 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다. B 세포 에피토프 (즉, PD-1 합성 펩티드)는 D 아미노산을 포함할 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다.

59. Th 에피토프는 약 14 내지 약 22개, 더 바람직하게는 약 15 내지 21개, 가장 바람직하게는 16개의 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게는, Th 세포 에피토프는 표 1에 제공된 하기 아미노산 서열들 중 하나를 갖는다.

[표 1]

60. 합성 PD-1 펩티드와 Th 세포 에피토프를 결합시키기 위하여, 아미노산 링커가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 약 2 내지 약 15개의 아미노산 길이, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 10개의 아미노산 길이, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 6개의 아미노산 길이의 펩티드이다. 가장 바람직한 링커는 아미노산 서열 Gly-Pro-Ser-Leu (서열 번호 7)를 포함한다. 따라서, 일 태양에서, 임의의 선행하는 태양의 합성 펩티드를 포함하며, Th 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6), 및 상기 합성 PD-1 펩티드를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커 (예컨대, 서열 번호 7)를 추가로 포함하는 키메라 펩티드가 본 명세서에 또한 개시된다. 예를 들어, 일 태양에서, 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6), 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커 (예컨대, 서열 번호 7)를 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 키메라 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 키메라 PD-1 펩티드는 KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLVLNWYRMSPSNQTDKLAAF (서열 번호 8), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLKLAAFPEDRSQPGQDCRFR (서열 번호 9), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLDFHMSVVRARRNDSGTYL (서열 번호 10), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLGAISLAPKAQIKESLRAEL (서열 번호 11), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLFAALKDTQNSPSMRYWNLV (서열 번호 16), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLRFRCDQGPQSRDEPFAALK (서열 번호 17), KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLYTGSDNRRARVVSMHFD (서열 번호 18), 및/또는 KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLEARLSEKIQAKPALSIAG (서열 번호 19)에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

61. 합성 펩티드와 마찬가지로, 키메라 PD-1 펩티드 내에 포함되는 합성 PD-1 펩티드의 아미노산은 서열 내의 L-아미노산의 D 아미노산 유사체일 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 일 태양에서, 본 명세서에 개시된 임의의 합성 PD-1 펩티드를 포함하며, Th 에피토프 (예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드, 예컨대 서열 번호 6), 및 상기 합성 PD-1 펩티드를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커 (예컨대, 서열 번호 7)를 추가로 포함하는 키메라 펩티드가 본 명세서에 개시된다. 예를 들어, 일 태양에서, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 키메라 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 합성 PD-1 펩티드 서열 (즉, B 세포 에피토프)은 D 아미노산을 포함한다.

1. 서열 유사성

62. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 용어 상동성 및 동일성의 사용은 유사성과 동일한 것을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 단어 상동성의 사용이 2개의 비천연 서열 사이에 사용되는 경우, 이는 이들 2개의 서열 사이의 진화적 관계를 반드시 나타내는 것이 아니라, 오히려 그들의 핵산 서열들 사이의 유사성 또는 관련성을 모색하고 있는 것으로 이해된다. 2개의 진화적으로 관련된 분자들 사이의 상동성을 결정하기 위한 많은 방법이, 진화적으로 관련되는지의 여부에 관계없이 서열 유사성을 측정하기 위한 목적으로, 임의의 2개 이상의 핵산 또는 단백질에 일상적으로 적용된다.

63. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 유전자 및 단백질의 임의의 알려진 변이체 및 유도체 또는 생길 수 있는 것들을 정의하기 위한 한 가지 방법은 특정한 알려진 서열에 대한 상동성의 관점에서 그러한 변이체 및 유도체를 정의함에 의한 것임이 이해된다. 본 명세서에 개시된 특정 서열의 이러한 동일성은 또한 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 논의되어 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 유전자 및 단백질의 변이체는 전형적으로 언급된 서열 또는 천연 서열과 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 상동성을 갖는다. 당업자는 2개의 단백질 또는 핵산, 예컨대 유전자의 상동성을 결정하는 방법에 대해 용이하게 이해한다. 예를 들어, 상동성은, 2개의 서열을 상동성이 그의 최고 수준에 있도록 정렬한 후에 계산될 수 있다.

64. 상동성을 계산하는 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 스미스 및 워터만 (문헌[Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)])의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만 및 분쉬 (문헌[Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)])의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 (문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)])의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화 구현 (미국 위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재의 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 조사에 의해 수행될 수 있다.

65. 상기 임의의 방법이 전형적으로 사용될 수 있으며, 소정의 경우에는 이들 다양한 방법의 결과가 상이할 수 있지만, 이들 방법들 중 적어도 하나에 대해 동일성이 확인된다면, 당업자는 서열이 언급된 동일성을 가지며 본 명세서에 개시된 것으로 말할 수 있음을 이해한다는 것이 이해된다.

66. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다른 서열과 특정 % 상동성을 갖는 것으로 언급된 서열은 전술된 계산 방법들 중 임의의 하나 이상에 의해 계산될 때 언급된 상동성을 갖는 서열을 지칭한다. 예를 들어, 제1 서열이 상기 다른 계산 방법들 중 임의의 것에 의해 계산될 때 제2 서열과 80% 상동성을 갖지 않는다 할지라도, 주커(Zuker) 계산 방법을 사용하여 제1 서열이 제2 서열과 80% 상동성을 갖는 것으로 계산된다면, 제1 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같이 제2 서열과 80% 상동성을 갖는다. 다른 예로서, 제1 서열이 스미스 및 워터만 계산 방법, 니들만 및 분쉬 계산 방법, 재거(Jaeger) 계산 방법, 또는 상기 다른 계산 방법들 중 임의의 것에 의해 계산될 때 제2 서열과 80% 상동성을 갖지 않는다 할지라도, 주커 계산 방법 및 피어슨 및 립만 계산 방법 둘 모두를 사용하여 제1 서열이 제2 서열과 80% 상동성을 갖는 것으로 계산된다면, 제1 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같이 제2 서열과 80% 상동성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제1 서열이 각각의 계산 방법을 사용하여 제2 서열과 80% 상동성을 갖는 것으로 계산된다면, 제1 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같이 제2 서열과 80% 상동성을 갖는다 (그렇지만, 실제로, 상이한 계산 방법들은 종종 상이하게 계산된 상동성 백분율을 나타낼 것이다).

2. 펩티드

a) 단백질 및 펩티드 변이체

67. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 합성 PD-1 펩티드 및 키메라 PD-1 펩티드의 다수의 변이체가 알려져 있고 본 명세서에서 고려된다. 게다가, 알려진 기능성 PD-1 균주 변이체들에 대하여, 개시된 방법 및 조성물에서 또한 기능하는 합성 PD-1 펩티드 및 키메라 PD-1 펩티드의 유도체들이 있다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 내부에 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 전형적으로 하기 3가지 부류 중 하나 이상에 속한다: 치환 변이체, 삽입 변이체 또는 결실 변이체. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 삽입보다는 더 작은, 예를 들어 대략 1개 내지 4개의 잔기 정도의 삽입일 것이다. 실시예에 기재된 것들과 같은 면역원성 융합 단백질 유도체는 시험관내(in vitro) 가교결합에 의하거나, 융합체를 인코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양물에 의해 표적 서열에 면역원성을 부여하기에 충분히 큰 폴리펩티드를 융합함으로써 제조된다. 결실은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 약 2 내지 6개 이하의 잔기가 단백질 분자 내의 어느 한 부위에서 결실된다. 이들 변이체는 통상 단백질을 인코딩하는 DNA 내의 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이생성(mutagenesis)에 의해 제조되며, 그럼으로써 변이체를 인코딩하는 DNA를 생성하고, 이후에 재조합 세포 배양물에서 DNA를 발현한다. 알려진 서열을 갖는 DNA 내의 미리결정된 부위에 치환 돌연변이를 생성하는 기법, 예를 들어, M13 프라이머 돌연변이생성 및 PCR 돌연변이생성은 잘 알려져 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기에 대한 것이지만, 동시에 다수의 상이한 위치에서 일어날 수 있으며; 삽입은 통상 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 정도일 것이며; 결실은 약 1 내지 30개의 잔기 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍, 즉 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입으로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 임의의 이들의 조합은 최종 작제물에 도달하도록 조합될 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임(reading frame) 밖의 서열에서 일어나서는 안 되며, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 영역을 생성하지 않을 것이다. 치환 변이체는, 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 그러한 치환은 일반적으로 하기 표 2 및 표 3에 따라 이루어지며, 보존적 치환으로 지칭된다.

[표 2]

[표 3]

68. 기능 또는 면역학적 동일성에 있어서의 실질적인 변화는 표 3에 있는 것들보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체구조로서의, 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는 데 미치는 영향이 더 현저하게 상이한 잔기를 선택함으로써 이루어진다. 일반적으로 단백질 특성의 가장 큰 변화를 생성할 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어 류실, 아이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐 대신 (또는 이에 의해) 치환되는 것; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기 대신 (또는 이에 의해) 치환되는 것; (c) 양전성(electropositive) 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전성(electronegative) 잔기, 예를 들어 글루타밀 또는 아스파르틸 대신 (또는 이에 의해) 치환되는 것; 또는 (d) 부피가 큰(bulky) 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들어 글리신 대신 (또는 이에 의해) 치환되는 것, 이 경우에는 (e) 황산화 및/또는 글리코실화를 위한 부위의 수를 증가시킴에 의한 것일 것이다.

69. 예를 들어, 하나의 아미노산 잔기의 생물학적으로 그리고/또는 화학적으로 유사한 다른 것으로의 대체는 당업자에게 보존적 치환으로서 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 하나의 소수성 잔기로 또는 하나의 극성 잔기를 다른 하나의 극성 잔기로 대체하는 것일 것이다. 치환은, 예를 들어 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 각각의 명시적으로 개시된 서열의 그러한 보존적으로 치환된 돌연변이는 본 명세서에 제공되는 모자이크 폴리펩티드(mosaic polypeptide) 내에 포함된다.

70. 치환 또는 결실 돌연변이생성은 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)를 위한 삽입 부위에 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정한(labile) 잔기의 결실이 또한 바람직할 수 있다. 잠재적 단백질 가수분해 부위, 예를 들어 Arg의 결실 또는 치환은, 예를 들어 염기성 잔기들 중 하나를 결실시키거나 하나를 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기로 치환함으로써 달성된다.

71. 소정의 번역후 유도체화는 발현된 폴리펩티드 상에서의 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 번역후 탈아미드화(post-translationally deamidated)된다. 대안적으로, 이들 잔기는 약산성 조건 하에서 탈아미드화된다. 다른 번역후 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노 기의 메틸화 (문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 일부 경우에, C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.

72. 본 명세서에 개시된 단백질의 변이체 및 유도체를 정의하기 위한 한 가지 방법은 특정한 알려진 서열에 대한 상동성/동일성의 관점에서 그러한 변이체 및 유도체를 정의함에 의한 것임이 이해된다. 본 명세서에 개시된 이들 및 다른 단백질의 언급된 서열과 적어도 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 동일성을 갖는 변이체가 구체적으로 개시된다. 당업자는 2개의 단백질의 상동성을 결정하는 방법에 대해 용이하게 이해한다. 예를 들어, 상동성은, 2개의 서열을 상동성이 그의 최고 수준에 있도록 정렬한 후에 계산될 수 있다.

73. 상동성을 계산하는 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 스미스 및 워터만 (문헌[Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)])의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만 및 분쉬 (문헌[Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)])의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 (문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)])의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화 구현 (문헌[GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI])에 의해, 또는 조사에 의해 수행될 수 있다.

74. 동일한 상동성 유형들이, 예를 들어 문헌[Zuker, M. Science 244:48-52, 1989], 문헌[Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989], 문헌[Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989])에 개시되어 있는 알고리즘에 의해 핵산에 대해 획득될 수 있다.

75. 보존적 돌연변이 및 상동성에 대한 기술은, 변이체가 보존적 돌연변이인 특정 서열과 적어도 70% 상동성을 갖는 실시 형태와 같이, 임의의 조합으로 함께 조합될 수 있음이 이해된다.

76. 본 명세서에서 다양한 단백질 및 단백질 서열이 논의될 때, 그러한 단백질 서열을 인코딩할 수 있는 핵산이 또한 개시됨이 이해된다. 이것은 특정 단백질 서열과 관련된 모든 축퇴 서열, 즉 하나의 특정 단백질 서열을 인코딩하는 서열을 갖는 모든 핵산뿐만 아니라, 단백질 서열의 개시된 변이체 및 유도체를 인코딩하는, 축퇴 핵산을 포함한 모든 핵산을 포함할 것이다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본 명세서에 기재되어 있지 않을 수 있지만, 각각 하나하나의 모든 서열은 실제로 개시된 단백질 서열을 통해 본 명세서에 개시 및 기술되어 있는 것으로 이해된다. 아미노산 서열이 어떠한 특정 DNA 서열이 유기체 내의 그 단백질을 인코딩하는지를 나타내지는 않지만, 개시된 단백질의 특정 변이체가 본 명세서에 개시되어 있는 경우, 그 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 기지의 핵산 서열이 또한 알려져 있고 본 명세서에 개시되고 기재된 것임이 또한 이해된다.

77. 개시된 조성물 내로 혼입될 수 있는 다수의 아미노산 및 펩티드 유사체가 있음이 이해된다. 예를 들어, D-아미노산, 또는 상이한 기능성 치환체를 갖는 아미노산이 많이 있으며, 이들 아미노산은 표 2 및 표 3에 제시되어 있다. 천연 발생 펩티드의 반대의 입체 이성질체뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체가 개시되어 있다. 이들 아미노산은, 선택된 아미노산으로 tRNA 분자를 충전하고, 부위 특이적 방식으로 펩티드 사슬 내로 유사 아미노산을 삽입하기 위하여, 예를 들어 앰버 코돈(amber codon)을 이용하는 유전자 작제물을 조작함으로써 폴리펩티드 사슬 내로 용이하게 포함될 수 있다.

78. 펩티드와 유사하지만, 천연 펩티드 결합을 통해 연결되지 않는 분자들이 생성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 결합은 CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂--CH₂ --, --CH=CH-- (시스 및 트랜스), --COCH₂ --, --CH(OH)CH₂--, 및 --CHH₂SO-를 포함할 수 있다 (이들 및 다른 것들은 문헌[Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]; 문헌[Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications] (전반적 개관); 문헌[Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468]; 문헌[Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)] (--CH₂NH--, CH₂CH₂--); 문헌[Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986)] (--CH H₂--S); 문헌[Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982)] (--CH--CH--, 시스 및 트랜스); 문헌[Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)] (--COCH₂--); 문헌[Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982)] (--COCH₂--); 문헌[Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982)] (--CH(OH)CH₂--); 문헌[Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983)] (--C(OH)CH₂--); 및 문헌[Hruby Life Sci 31:189-199 (1982)] (--CH₂--S--)에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다). 특히 바람직한 비-펩티드 결합은 --CH₂NH--이다. 펩티드 유사체는 b-알라닌, g-아미노부티르산 등과 같이 결합 원자들 사이에 하나 초과의 원자를 가질 수 있음이 이해된다.

79. 아미노산 유사체 및 펩티드 유사체는 종종 향상되거나 바람직한 특성, 예컨대 더 경제적인 생산, 더 큰 화학적 안정성, 향상된 약리학적 특성 (반감기, 흡수, 효력, 효능(efficacy) 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위 스펙트럼의 생물학적 활성), 감소된 항원성, 및 기타 특성을 갖는다.

80. D-아미노산은 펩티다제 등에 의해 인식되지 않기 때문에, D-아미노산은 더 안정한 펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 전체적 치환 (예를 들어, L-라이신 대신 D-라이신)이 더 안정한 펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 다시 말하면, 임의의 개시된 서열의 거울상(inverso) (즉, D-아미노산 치환)이 본 명세서에서 고려된다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩티드를 함께 환화(cyclize)하거나 부착시키는 데 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정 입체구조 내로 구속하는 데 유익할 수 있다. 일 태양에서, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 펩티드의 아미노산은 D 거울상 이성질체이다.

81. 일 태양에서, 개시된 합성 펩티드는 펩티드의 아미노부터 카르복시 말단까지가 역전되도록 역순 (즉, 역방향 서열)일 수 있다. 일 태양에서, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 역방향 서열이 본 명세서에 개시되며, 이들은 각각 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및 서열 번호 15를 포함한다. 이들 역방향 서열은 또한 염기 서열의 거울 형태를 가질 수 있다. 일 태양에서, 역방향 서열은 또한 D 아미노산 치환 (즉, 역방향-거울상(retro-inverso)) 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는 합성 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 펩티드의 아미노산은 D 거울상 이성질체이다.

82. 본 명세서에 개시된 임의의 D 아미노산 치환된 합성 펩티드는 개시된 PD-1 키메라 펩티드에서 PD-1 에피토프로서 사용될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프, 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커를 포함하는 키메라 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지고; 상기 펩티드의 아미노산은 D 거울상 이성질체이다. 일 태양에서, 키메라 PD-1 펩티드가 본 명세서에 개시되며, 상기 펩티드는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; 합성 PD-1 펩티드의 아미노산은 D 거울상 이성질체이다.

3. 약제학적 담체/의약품의 전달

83. 전술된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 합성 PD-1 펩티드 및 키메라 PD-1 펩티드는 또한 약제학적으로 허용되는 담체 내에 존재하는 상태로 생체내에서 투여될 수 있다. 따라서, 일 태양에서, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 PD-1 펩티드들 중 임의의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다.

84. "약제학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질을 의미하는 것으로, 즉, 그가 함유된 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하거나 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기함이 없이, 상기 물질은 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에 투여될 수 있다. 담체는 본질적으로, 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 활성 성분의 어떠한 분해도 최소화하고 대상체에 어떠한 유해한 부작용도 최소화하도록 선택될 것이다.

85. PD-1 펩티드를 포함하는 개시된 약제학적 조성물은 PD-1 매개 면역 억제가 일어나는 질병 또는 질환의 치료에 특히 유용함이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 일 태양에서, 본 명세서에 개시된 PD-1 펩티드들 중 하나 이상을 포함하는 개시된 약제학적 조성물은 질병-특이적 치료제 또는 백신과 병용되어 PD-1 펩티드의 효능을 추가로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, PD-1 펩티드들 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 유방암을 치료, 억제, 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 항-HER2 항체 또는 HER-2 B 세포 에피토프와 병용될 수 있다. 따라서, 일 태양에서, 본 명세서에 개시된 PD-1 펩티드, 합성 펩티드, 또는 키메라 펩티드 (예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19) 중 하나 이상을 포함하며, 하나 이상의 HER-2 B 세포 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 27 또는 29 또는 키메라 에피토프 서열 번호 28 또는 30) 및/또는 항-Her-2 항체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 일 태양에서, 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 MVF-PD1 (92-110); (예를 들어, 서열 번호 28에 제시된 바와 같은) MVF-HER-2 (266-296) 펩티드, 및 (예를 들어, 서열 번호 30에 제시된 바와 같은) MVF-HER-2 (597-626) 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 구체적으로 본 명세서에 개시된다.

86. 조성물은 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내), 근육내 주사, 복막내 주사, 경피, 체외, 국소 투여 등 - 국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함함 - 으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "국소 비강내 투여"는 한쪽 또는 양쪽 외비공을 통한 코 및 비도(nasal passage) 내로의 조성물의 전달을 의미하며, 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한, 또는 분무 메커니즘 또는 적하 메커니즘에 의한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 적하 메커니즘에 의한 전달을 통해 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다. 전달은 또한 삽관을 통해 호흡계의 임의의 영역 (예를 들어, 폐)에 직접 행해질 수 있다. 조성물의 정확한 필요량은 대상체의 종, 연령, 체중 및 전신 상태, 치료되는 알레르기성 장애의 중증도, 사용된 특정 핵산 또는 벡터, 그의 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대해 정확한 양을 지정하는 것은 불가능하다. 그러나, 본 명세서에서의 교시내용을 고려하여 일상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 적절한 양이 결정될 수 있다.

87. 조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우, 대체적으로 주사에 의해 특징지어진다. 주사용 물질은 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 보다 최근에 수정된 접근법은 일정 투여량이 유지되도록 저속 방출 또는 지속 방출 시스템의 사용을 수반한다. 예를 들어, 미국 특허 제3,610,795호를 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.

88. 물질은 용액 상태, 현탁액 (예를 들어, 미세입자, 리포좀 또는 세포 내로 혼입됨) 상태일 수 있다. 이들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형을 표적으로 할 수 있다. 하기 참고문헌은 특정 단백질이 종양 조직을 표적으로 하기 위한 이러한 기술의 사용의 예이다 (문헌[Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991)]; 문헌[Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989)]; 문헌[Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988)]; 문헌[Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)]; 문헌[Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)]; 문헌[Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)]; 및 문헌[Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)]). 비히클, 예컨대 "스텔스" 및 다른 항체가 접합된 리포좀 (결장 암종을 표적으로 하는 지질 매개 약물을 포함함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 유도 종양 표적화, 및 생체내 뮤린 신경교종 세포의 고특이적인 치료적 레트로바이러스 표적화가 있다. 하기 참고문헌은 특정 단백질이 종양 조직을 표적으로 하기 위한 이러한 기술의 사용의 예이다 (문헌[Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989)]; 및 문헌[Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)]). 일반적으로, 수용체는 구성성 또는 리간드 유도성의 세포내이입 경로에 관여한다. 이들 수용체는 클라트린-피복 소공 내에 클러스터링되고, 클라트린-피복 소포를 통해 세포에 들어가고, 산성화된 엔도솜을 통과하고, 여기서 수용체들이 분류되고, 이어서 세포 표면으로 재순환되거나, 세포내에 저장되거나, 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로는 영양 섭취, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스 및 독소의 기회적 유입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-수준 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체들이 세포 유형, 수용체 농도, 리간드의 유형, 리간드 가수, 및 리간드 농도에 따라 하나 초과의 세포내 경로를 따른다. 수용체-매개 세포내이입의 분자 및 세포 기전이 검토되어 있다 (문헌[Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)]).

a) 약제학적으로 허용되는 담체

89. 항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 배합되어 치료적으로 사용될 수 있다.

90. 적합한 담체 및 그의 제형이 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995]에 기재되어 있다. 전형적으로, 제형에 등장성(isotonic)을 부여하기 위해 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염이 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 또한, 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 제제를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 미세입자의 형태이다. 소정의 담체가, 예를 들어 투여되는 조성물의 투여 경로 및 농도에 따라 더 바람직할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

91. 약제학적 담체는 당업자에게 알려져 있다. 이들 대부분은 전형적으로 생리학적 pH의 완충 용액, 식염수, 및 멸균수와 같은 용액을 포함한, 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체일 것이다. 조성물은 근육내 또는 피하 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.

92. 약제학적 조성물은 선택된 분자에 더하여 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 방부제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항미생물제, 항염증제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.

93. 약제학적 조성물은 국부 치료 또는 전신 치료 어느 것이 요구되는지에 따라, 그리고 치료하려는 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 투여 (안내, 질내, 직장내, 비강내 투여를 포함함), 경구 투여, 흡입에 의한 투여, 또는 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 점적, 피하, 복막내 또는 근육내 주사에 의한 투여일 수 있다. 개시된 항체는 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 강내(intracavity), 또는 경피 투여될 수 있다.

94. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 알코올 용액/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 이에는 식염수 및 완충 매체가 포함된다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트산 첨가 링거액 또는 고정유(fixed oil)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등을 포함한다. 또한, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제가 존재할 수 있다.

95. 국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 기제(base), 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.

96. 경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매체 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사셰(sachet) 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

97. 조성물들 중 일부는 잠재적으로 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산과 같은 무기 산, 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산, 및 푸마르산과 같은 유기 산과의 반응에 의해, 또는 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘과 같은 무기 염기, 및 모노-, 다이-, 트라이알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과 같은 유기 염기와의 반응에 의해 형성된, 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기- 부가 염으로 투여될 수 있다.

b) 치료적 용도

98. 조성물을 투여하기 위한 유효 투여량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 장애의 증상에 미치는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 투여량은 원치 않는 교차-반응, 아나필락시 반응 등과 같은 유해한 부작용을 야기할 정도로 커서는 안 된다. 대체적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 계획(regimen)에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 어떠한 금기가 있는 경우에는 개인 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며, 1일 또는 수 일 동안 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 지정된 부류의 의약품의 적정 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 항체의 적정 용량 선택에 대한 지침은 항체의 치료적 용도에 관한 문헌, 예를 들어 문헌[Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357]; 문헌[Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]에서 찾아볼 수 있다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 체중/일 내지 최대 100 mg/㎏ 체중/일 또는 그 이상의 범위일 수 있다.

99. PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하는 본 명세서에 개시된 합성 PD-1 펩티드, 키메라, 및 항체는 암, 자가면역 질병, 또는 알츠하이머병이 발생될 위험이 있는 환자 또는 대상체에게 예방적으로 투여될 수 있거나, 또는 암, 자가면역 질병, 또는 알츠하이머병의 치료를 위해 치료적으로 (즉, 질병의 진단 또는 증상의 개시 후에) 투여될 수 있다.

100. PD-1 또는 PD-L1과 상호작용하여 PD-1/PD-L1 상호작용을 억제하는 다른 분자 또는 항체 (예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙)가 대상체에서 암, 자가면역 질병 또는 알츠하이머병을 치료하기 위해 개시된 합성 PD-1 펩티드, 키메라 PD-1 펩티드, 또는 항-PD-1 항체와 병용하여 사용될 수 있다.

4. 항체 1

(1) 일반적 항체

101. 용어 "항체"는 본 명세서에서 넓은 의미로 사용되며, 다중클론 항체 및 단일클론 항체 둘 모두를 포함한다. 온전한 면역글로불린 분자에 더하여, 용어 "항체"에는 그러한 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 면역글로불린 분자 또는 이의 단편의 인간 또는 인간화 버전이 또한 포함되는데, 이는, 이들이 PD-1과 상호작용하여 PD-1이 PD-L1과 상호작용하는 것으로부터 억제되도록 하는 그들의 능력에 대해 선택되는 한에 있어서 그러하다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용에 관여하는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19에 결합하는 항체가 또한 개시된다. 항체는 본 명세서에 기재된 시험관내 검정을 사용하여, 또는 유사한 방법에 의해 이들의 원하는 활성에 대해 시험될 수 있으며, 이후에 이들의 생체내 치료적 및/또는 예방적 활성이, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험된다. 인간 면역글로불린에는 5가지의 주요 부류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (동종형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가로 세분될 수 있다. 당업자는 마우스에 대한 비교가능한 부류를 인식할 것이다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마, 및 뮤로 불린다.

102. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭하는데, 즉 집단 내의 개별 항체들이 항체 분자의 작은 하위세트 내에 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이의 가능성을 제외하고는 동일하다. 본 명세서에서의 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이며, 한편 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체뿐만 아니라, 원하는 길항적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 "키메라" 항체를 특별히 포함한다.

103. 개시된 단일클론 항체는 단일클론 항체를 생성하는 임의의 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 개시된 단일클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물이 전형적으로 면역제(immunizing agent)로 면역화되어, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유인한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.

104. 단일클론 항체는 또한 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 개시된 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 항체 또는 활성 항체 단편의 라이브러리가 또한, 예를 들어 Burton 등의 미국 특허 제5,804,440호 및 Barbas 등의 미국 특허 제6,096,441호에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생성되고 스크리닝될 수 있다.

105. 시험관내 방법이 또한 1가 항체를 제조하는 데 적합하다. 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 분해(digestion)는 당업계에 알려진 일상적인 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 분해는 파파인(papain)을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 분해의 예는 1994년 12월 22일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 WO 94/29348호 및 미국 특허 제4,342,566호에 기재되어 있다. 항체의 파파인 분해는 전형적으로, 각각이 단일 항원 결합 부위를 갖는, Fab 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편과 나머지 Fc 단편을 생성한다. 펩신 처리는, 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차-결합이 가능한 단편을 생성한다.

106. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 또는 이의 단편"은 이중 또는 다중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 키메라 항체 및 하이브리드 항체, 및 단편, 예컨대 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv 등 (하이브리드 단편을 포함함)을 포함한다. 따라서, 특이적 항원과 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편이 제공된다. 예를 들어, PD-1 결합 활성을 유지하거나 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19와 결합하는 항체의 단편은 용어 "항체 또는 이의 단편"의 의미에 포함된다. 그러한 항체 및 단편은 당업계에 알려진 기법에 의해 제조될 수 있으며, 실시예에 그리고 항체를 생성하고 특이성 및 활성에 대해 항체를 스크리닝하기 위한 일반적 방법 (문헌[Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) 참조)에 제시된 방법에 따라 특이성 및 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

107. 항체 단편 및 항원 결합 단백질 (단일쇄 항체)의 접합체가 "항체 또는 이의 단편"의 의미 안에 또한 포함된다.

108. 단편은, 다른 서열에 부착되어 있는지의 여부에 관계 없이, 특정 영역 또는 특이적 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환, 또는 다른 선택된 변형을 또한 포함할 수 있는데, 단 이는, 항체 또는 항체 단편의 활성이 비변형된 항체 또는 항체 단편과 대비하여 유의하게 변경 또는 손상되지 않는다는 것을 조건으로 한다. 이들 변형은, 이황화물 결합을 가능하게 하는 아미노산의 제거/부가, 그의 생체-수명(bio-longevity)의 증가, 그의 분비 특성의 변경 등과 같은 일부 추가의 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 또는 항체 단편은 그의 동종 항원에 대한 특이적 결합과 같은 생물활성 특성을 가져야만 한다. 항체 또는 항체 단편의 기능성 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역을 돌연변이생성시킨 후, 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 시험함으로써 확인될 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이생성을 포함할 수 있다 (문헌[Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992]).

109. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 지칭할 수 있다. 많은 비인간 항체 (예를 들어, 마우스, 래트, 또는 토끼로부터 유래된 것들)는 인간에게 있어서 천연 항원성이며, 이에 따라 인간에게 투여될 때 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 방법에서의 인간 또는 인간화 항체의 사용은 인간에게 투여되는 항체가 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성을 줄이는 역할을 한다.

(2) 인간 항체

110. 개시된 인간 항체는 임의의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 개시된 인간 항체는 또한 유전자도입 동물로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 면역화에 반응하여, 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 돌연변이 마우스가 기재되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; 문헌[Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)] 참조). 구체적으로, 이들 키메라 및 생식세포계열 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(J(H)) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 가져오며, 그러한 생식세포계열 돌연변이 마우스 내에의 인간 생식세포계열 항체 유전자 배열의 성공적인 전달은 항원 시험투여(challenge) 시에 인간 항체를 생성시킨다. 원하는 활성을 갖는 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 Env-CD4-공-수용체 복합체를 사용하여 선택된다.

(3) 인간화 항체

111. 항체 인간화 기법은 일반적으로 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 DNA 서열을 조작하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용을 수반한다. 따라서, 비인간 항체 (또는 이의 단편)의 인간화 형태는 인간 (수용자) 항체의 프레임워크 내로 통합된 비인간 (공여자) 항체로부터의 항원 결합 부위의 일부를 함유하는 키메라 항체 또는 항체 사슬 (또는 이의 단편, 예컨대 sFv, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원-결합 부분)이다.

112. 인간화 항체를 생성하기 위하여, 수용자 (인간) 항체 분자의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 항원 결합 특성 (예를 들어, 표적 항원에 대한 소정 수준의 특이성 및 친화도)을 갖는 것으로 알려진 공여자 (비인간) 항체 분자의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 항체의 Fv 프레임워크 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한, 수용자 항체 또는 유입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열 어느 곳에서도 발견되지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 항체 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 항체의 것의 적어도 일부분을 함유한다.

(4) 항체의 투여

113. 항체의 투여는 본 명세서에 개시된 바와 같이 행해질 수 있다. 항체 전달을 위한 핵산 접근법이 또한 존재한다. 광범위하게 중화시키는 항-PD1 항체 및 항체 단편 (서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및/또는 서열 번호 19에 결합하는 임의의 항체를 포함함)이 또한 그러한 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산 제제 (예를 들어, DNA 또는 RNA)로서 환자 또는 대상체에게 투여되어, 환자 또는 대상체 자신의 세포가 핵산을 흡수하고, 인코딩된 항체 또는 항체 단편을 생성하고 분비하도록 할 수 있다. 핵산의 전달은, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 수단에 의해 행해질 수 있다.

C. 질병의 치료 방법

114. 개시된 조성물, 합성 PD-1 펩티드, 및 키메라 PD-1 펩티드는 면역 억제 및 프로그래밍된 세포사의 예방이 질병에 유리한 임의의 질병, 예컨대 알츠하이머병, 자가면역 질병, 또는 제어되지 않는 세포 증식이 발생하는 임의의 질병, 예컨대 암을 치료하는 데 사용될 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다.

115. 본 명세서에 개시된 키메라 펩티드 또는 합성 펩티드 또는 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 상이한 유형의 자가면역 질병의 비제한적 목록은 건선, 원형 탈모증, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 다내분비선 증후군, 1형 진성 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 궤양성 결장염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 재발성 다발연골염, 중증 근무력증, 급성 파종성 뇌척수염, 및 다발성 혈관염을 동반하는 육아종증을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

116. 본 명세서에 개시된 키메라 펩티드 또는 합성 펩티드 또는 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 상이한 유형의 암의 비제한적인 목록은 림프종 (호지킨 및 비호지킨), 백혈병, 암종, 고형 조직의 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종, 신경교종, 고등급 신경교종, 아세포종, 신경아세포종, 형질세포종, 조직구종, 흑색종, 선종, 저산소성 종양, 골수종, AIDS-관련 림프종 또는 육종, 전이성 암, 또는 일반적인 암을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

117. 개시된 조성물, 키메라 펩티드, 및 합성 펩티드가 치료에 사용될 수 있는 대표적이나 비제한적인 암의 목록은 하기와 같다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두부 및 경부의 편평 세포 암종, 신장암, 폐암(lung cancer), 예를 들어 소세포 폐암(small cell lung cancer) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 신경아세포종/교아세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암, 및 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암(pulmonary cancer), 식도 암종, 두부 및 경부 암종, 대장암, 조혈암, 고환암, 결직장암, 전립선암, 이필리무맙-불응성 흑색종, 또는 췌장암.

118. 따라서, 일 태양에서, 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 PD-1 합성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 PD-1 합성 펩티드는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함한다. 합성 펩티드는 아세틸화, 아미드화될 수 있고/있거나, D 거울상 이성질체를 포함할 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 일 태양에서, 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 PD-1 합성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 PD-1 합성 펩티드는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 18, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11의 D 거울상 이성질체 및/또는 D 거울상 이성질체 역방향 거울상을 포함한다.

119. 일 태양에서, 개시된 조성물은 주어진 질병 또는 질환을 위한 다른 치료제와 병용될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 일 태양에서, 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 PD-1 펩티드, PD-1 합성 펩티드, 또는 PD-1 키메라 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 질병 또는 질환은 유방암이고, 상기 방법은 하나 이상의 HER-2 B 세포 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 27 또는 29에 제시된 바와 같은 HER-2 펩티드 또는 서열 번호 28 또는 30에 제시된 바와 같은 키메라 MVF-HER-2 펩티드 중 하나 이상) 및/또는 하나 이상의 항-HER-2 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. HER-2 B 세포 에피토프 또는 항-HER-2 항체가 대상체에게 투여되는 경우, 이러한 투여는 개별적 병행 투여, HER-2 B 세포 에피토프 또는 항-HER-2 항체의 사전 투여, HER-2 B 세포 에피토프 또는 항-HER-2 항체의 후속 투여, 또는 PD-1 펩티드, PD-1 합성 펩티드, 또는 PD-1 키메라 펩티드로서 동일한 약제학적 제형 내의 성분인 HER-2 B 세포 에피토프 또는 항-HER-2 항체로서의 투여로서 행해질 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 유방암을 치료하는 방법은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5에 제시된 PD-1 펩티드; 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 키메라 PD-1 펩티드; 및/또는 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 및 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 역방향-거울상 PD-1 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 하나 이상의 서열 번호 27에 제시된 바와 같은 HER-2 B 세포 에피토프 HER-2 (266-296) 및/또는 서열 번호 29에 제시된 바와 같은 HER-2 (597-626) 및/또는 (예를 들어, 서열 번호 28에 제시된 바와 같은) 키메라 에피토프 MVF-HER-2 (266-296) 펩티드, 및 (예를 들어, 서열 번호 30에 제시된 바와 같은) MVF-HER-2 (597-626) 펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 일 태양에서, 유방암을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 MVF-PD1 (92-110); (예를 들어, 서열 번호 28에 제시된 바와 같은) MVF-HER-2 (266-296) 펩티드, 및 (예를 들어, 서열 번호 30에 제시된 바와 같은) MVF-HER-2 (597-626) 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 유방암을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

120. 암, 자가면역 질병 또는 알츠하이머병을 치료하는 데 사용하기 위한 합성 펩티드가 키메라 펩티드의 성분일 수 있음이 추가로 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 일 태양에서, 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 PD-1 키메라 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 키메라 펩티드는 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프, 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커를 포함하며, 상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 및 서열 번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다. 키메라 펩티드에 사용되는 합성 PD-1 펩티드 (즉, PD-1 B 세포 에피토프)는 아세틸화, 아미드화될 수 있고/있거나, D 거울상 이성질체를 포함할 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 일 태양에서, 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 상기 방법은 PD-1 키메라 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 키메라 펩티드는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 또는 서열 번호 19를 포함한다.

D. 실시예

121. 하기 실시예들은 본 명세서에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 디바이스 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되는지에 대한 완벽한 개시와 설명을 당업자에게 제공하도록 개시되어 있으며, 오로지 예시적인 것으로 의도되고 본 발명을 제한하고자 하지 않는다. 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확도를 보장하기 위하여 노력하였지만, 약간의 오류 및 편차는 감안해야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이거나 주위 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

1. 실시예 1: PD-1에 대한 펩티드 에피토프의 선택, 설계, 및 모델링

122. PD-1의 표면 상에서 발현되는 후보 B-세포 에피토프의 선택은 문헌[Kaumaya et al.]에 의해 검토된 항원성의 6가지의 상관관계를 사용하여 자체 개발한 (Peptide Companion^™, 5x.com) 컴퓨터 이용 분석에 의해 달성하였다: (a) 개별 서열들의 사슬 가요성 및 이동성의 프로파일을 문헌[Karplus and Schultz]에 따라 계산하였음; (b) 7-잔기 스팬(span) 설정에 걸쳐 소수성 프로파일(hydropathy profile)을 생성하고, 이어서 문헌[Kyte and Doolittle]의 척도를 사용하여 3-잔기 스팬으로 평탄하게 하였음; (c) 문헌[Hopp and Woods]의 프로그램을 사용하여 6-잔기 범위에 걸친 친수성 프로파일을 생성하였음; (d) 문헌[Rose et al.]의 용매 노출 알고리즘에 의해 물(1.4A 프로브)에 대한 아미노산 잔기의 노출의 분석을 수행하였음; (e) 접근가능하고 용매 내로 돌출하는 단백질의 부분을 예측하는 문헌[Thornton et al.]의 방법에 의해 돌출 지수를 계산하였음; (f) 5-잔기 서열이 항원성일 확률을 문헌[Welling et al.]의 방법에 의해 결정하였음. 서열들은 그들 각각의 인덱스 값에 기초하여 1 내지 6의 점수가 주어졌으며 순위가 매겨졌다: 최고 순위 서열들은 검사된 분석에 대해 가장 높은 개별 점수를 가졌고(6/6), 연속하는 후보들은 그 다음 최고 점수(5/6)를 가졌으며, 등등이다. 최상의 점수의 에피토프들은 그들의 2차 구조적 속성과의 상관관계에 의해 추가로 순위가 매겨졌으며; 예를 들어, 양친매성 α-나선형 서열 또는 β-턴 루프 영역이 랜덤 코일 단편에 비해 바람직하다. 문헌[Chou and Fasman and Novotny et al.]에 의한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2차 구조 (α-나선, β-가닥/시트, β-턴/루프, 랜덤 코일) 및 α-나선형 양친매성 모멘트를 예측하였다. 마지막으로, 개별 아미노산 서열에 대한 고려가 주어졌다. 나선형 세그먼트 내의 정전기 이온 쌍 및 나선 쌍극자 상호작용이 또한 고려되었다 (예를 들어, 소수성/친수성 균형). 최고 점수를 받은 서열들이 표 4에 나타나 있다. 이 방법을 사용하여, 인간 PD-1의 12개의 최고 점수 B-세포 에피토프 서열 중 4개를 우선순위화하였다. 아미노산 32-50, 45-64, 73-90 및 92-110을 PD-1:PDL1 (20)의 결정 구조로부터의 정보와 조합하여 평가를 위해 선택하였다. 인간 PD-1 (PDB 3RRQ) 및 인간 PD-L1 (PDB 3BIS, 3FN3, 4Z18, 5C3T)의 구조가 결정되었지만, 이들은 결국 복합체 형성 시에 인간 PD-1 내에서의 유의한 가소성에 대해 해명하지 못하였으며, 이는 완전 인간 PD-1/PD-L1 복합체 (20)의 구조에 의해 단지 매우 최근에 입증되었다. 상기 구조가 상호작용에 대한 완전한 설명을 제공하였지만, 단백질-단백질 계면의 편평한 표면은 추가의 합리적인 약물 개발을 안내할 PD-1 또는 PD-L1과 복합체를 형성하는 소분자 억제제에 대한 구조 정보의 부재 하에서 약물 설계 노력을 여전히 어렵게 한다. 결정 구조는 수용체-리간드 상호작용이 PD-1 및 PDL1 둘 모두 내에 있는 C0CFG 가닥의 잔기에 의해 그의 주요 부분에서 매개됨을 입증한다 (도 1). 단백질-단백질 접촉들은 소수성 상호작용 및 극성 상호작용 둘 모두를 수반하고, 총 1,970 Ų의 표면적을 매립한다. 상호작용은, 양쪽 파트너에 의해 기여되고, PD-1의 정면 시트(front sheet) 내의 비극성 잔기 (Val64, Ile126, Leu128, Ala132, Ile134) 및 PD-L1의 정면 시트의 것들 (LIle54, LTyr56, LMet115, LAla121, LTyr123) (Ile134와 LTyr123의 측쇄의 특징적인 알킬-p 상호작용을 포함함)에 의해 구성되는 중심 소수성 코어 주위에서 형성된다. 이러한 소수성 영역은 예정된 항원-결합 부위 상에서 용매에 개방되고, 분자의 반대편 면 상의 혼합된 극성/비극성 상호작용의 매립된 영역이 이웃하게 된다. 이들 영역 둘 모두는 (CDR 루프 측에서 안전한) 극성 잔기의 주변 네트워크에 의해 둘러싸여, 수용체와 리간드 사이에 추가의 수소 결합-매개 상호작용을 제공한다. 이 구조는 성숙 폴리펩티드의 잔기 16-127을 포함하는 hPD-1이 IgSF 도메인들의 토폴로지를 갖는 2층 샌드위치 (즉, 이황화물 결합 (Cys34 - Cys103)에 의해 안정화된 2개의 β 시트 (GFCC 및 ABED))로 이루어짐을 나타낸다. 도 2a, 도 2b 및 도 2c는 입체구조적 에피토프로서의 PD-1 펩티드의 모델링을 보여준다.

[표 4]

도 2a, 도 2b 및 도 2c는 입체구조적 에피토프로서의 PD-1 펩티드의 모델링을 보여준다.

2. 실시예 2: PD-1 펩티드 및 MVF-PD-1 펩티드의 합성, 정제, 및 특성화

123. Fmoc/Boc 화학을 사용하여 9600 Milligen/Biosearch 고상 펩티드 합성기 (미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 Millipore)를 사용하여 펩티드 합성을 수행하였다. 투명 아미드 수지 (0.50 mmol/g) (미국 켄터키주 루이스빌 소재의 Peptide International) 및 Fmoc 보호된 아미노산 (미국 켄터키주 루이스빌 소재의 P3BioSystems)을 모든 펩티드의 합성에 사용하였다. 키메라 펩티드의 경우에, 위치선택적 측쇄 보호 및 GPSL 링커를 사용하여 무차별적 Th MVF (잔기 288-302) 에피토프에 의해 B 세포 에피토프들을 공선적으로(colinearly) 합성하였다. B 세포 에피토프들 중 일부를 DMF 중 아세틸이미다졸 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)을 사용하여 아세틸화하였다. 펩티드를 하룻밤 반응시키고, 이어서 절단 전에 DMF로 세척하였다. 펩티드를 시약 R (트라이플루오로아세트산 (TFA):티오아니솔:EDT:아니솔, 90:5:3: 2) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)을 사용하여 절단하였다. 조 펩티드를 Waters 시스템 상에서 물/아세토니트릴 (0.1% 트라이플루오로아세트산) 중에서 C-4 Vydac 컬럼을 사용하는 구배 시스템으로 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 이어서, 정제의 종료 시점에서, 순수한 분획을 분석용 HPLC에서 분석하고, 관심 분획을 함께 풀링하고, 10% 아세트산 용액 중에서 동결건조시켰다. 이어서, 질량 분석 (미국 오하이오주 콜럼버스 소재의 오하이오 주립 대학교의 CCIC (Campus Chemical Instrumentation Center))을 사용하여 표 5에 열거된 최종 정제된 펩티드를 확인하였다.

[표 5]

3. 실시예 3: BIACORE에 의한 PD-1 펩티드의 결합 특이성

a) Biacore 고정화

124. 모든 선택된 펩티드의 활성을 시험하기 위하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법 (Biacore T200, 258C에서)을 사용하여 인간 PD-L1 (hPD-L1)의 세포외 도메인에 대한 그들의 결합 친화성을 측정하였다. 재조합 hPD-L1 엑토도메인을 직접 아민 커플링에 의해 CM5 센서 칩의 금 표면 상에 고정화하였다. 고정화된 hPD-L1 엑토도메인이 기능적임을 확인하기 위하여, 재조합 인간 PD-1 (hPD-1) 엑토도메인에 대한 그의 친화성을 검사하였다.

125. 펩티드 결합 시에 이론적 최대 반응을 얻기 위하여, rhPD-L1, 니볼루맙 및 인간 IgG의 계산된 고정화 양은 각각 9790 RU, 14286 RU 및 14286 RU이다. 10 mM NaAc (pH 5.5)의 rhPD-L1, 10 mM HEPES (pH 7.5)의 니볼루맙 및 10 mM HEPES (pH 7.0)의 인간 IgG 20 ㎍/ml를 10 μl/min으로 7분 동안 EDC/NHS로 활성화 후에 칩 위로 주입하였다. rhPD-L1 (도 3a), 니볼루맙 (도 3b), 인간 IgG (도 3c)에 대한 생성된 고정화 수준은 각각 2345 RU, 12264 RU 및 11651 RU이다.

b) rhPD-1과 니볼루맙 결합 시험의 특이성

126. 제조된 센서 칩을 검증하기 위하여, 1 μM (17.3 ㎍/ml) rhPD-1을 10 μl/min으로 3분 동안 칩 위로 주입하였다 (도 3d). 1 μM BSA를 음성 대조군으로 사용하였다. 칩을 10 mM 글리신-HCl (pH 2.5)에 의해 재생하였다 (도 3e). rhPD-1 주입 시에, 니볼루맙은 반응 (3740 RU)을 갖는 강한 신호를 생성하였고, rhPD-L1은 약한 신호 (461 RU)를 야기한 반면, 인간 IgG는 어떠한 결합 신호도 나타내지 않았음을 알 수 있다. BSA는 어떠한 결합으로도 이어지지 않았는데, 이는 니볼루맙 및 rhPD-L1에 대한 PD-1 결합이 특이적임을 나타낸다.

c) Biacore에 의한 rPD-L1 및 니볼루맙에 대한 PD-1 펩티드 결합의 특이성

127. 각각의 실시에 대해, 1 μM의 다양한 PD-1 펩티드를 10 μl/min으로 1분 동안 칩 위로 주입한 후, 1분 해리시키고, 이어서 10 mM 글리신-HCl (pH 2.5)로 1분 재생시켰다. 도 4a는 MVF-PD-1 (45-64), MVF-PD-1 (73-90), MVF-PD-1 (92-110)이 고정화된 rhPD-L1에 결합하여, 대략 110 RU가 얻어짐을 보여준다. 대조적으로, MVF-PD-1 (32-50)은 매우 약한 결합 (11 RU)을 나타내는데, 이는 음성 대조군, MVF-HER-2 (266-296) (20 RU)와 유사하다. 동일한 3개의 양성 MVF-펩티드가 니볼루맙에 대해 각각 1030 RU, 1000 RU, 970 RU의 더 강한 결합을 나타내었다 (도 4b). 역시 MVF-PD-1 (32-50)은 무시할만한 결합 용량 (20 RU)을 나타내었는데, 이는 이 서열이 생존가능한 에피토프(viable epitope)를 나타내지 않음을 나타낸다. MVF-PD-1 (45-64, 73-90 및 92-110)은 rhPD-L1 및 니볼루맙 둘 모두를 인식할 수 있는 반면, MVF-PD-1 (31-49)은 그렇지 않은 것으로 결론지었다. 추가적으로, 아세틸화 펩티드 또한, 비록 키메라 MVF 펩티드보다 더 약할지라도 (도 4c 및 도 4d), rhPD-L1 및 니볼루맙에 결합한다. 유리 펩티드 또한, PD-L1 및 니볼루맙 둘 모두에 결합하며, PD-1 (73-90)은 PD-1 (45-64) 및 PD-1 (92-110)보다 rhPD-L1 및 니볼루맙에 대해 훨씬 더 강한 결합을 나타낸다 (도 4e, 도 4f). PD-1 (45-64)은 두 번째로 더 강한 결합제이다. 따라서, 유리 펩티드의 결합 효율은 하기와 같이 순위가 매겨질 수 있다: 73-90> 46-64> 92-110. 이들 결합 연구로부터, PD-1 펩티드 46-64, 73-90 및 92-110은 rPD-L1을 인식할 수 있고 PD-1:PD-L1 상호작용의 작은 펩티드 억제제로서 작용할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

4. 실시예 4: 토끼에서의 PD-1 펩티드의 면역원성 시험

a) MVF-PD-1 펩티드는 높게 역가측정된(high tittered) 항-펩티드 항체를 유도한다.

128. 4개의 PD-1 서열을 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF, 아미노산 288-302)로부터 유래된 무차별적 T 헬퍼 에피토프와 함께 키메라 작제물로서 합성하였다. 백신 작제물 1 mg의 펩티드를 Montanide ISA 720 (프랑스 파리 소재의 Seppic) 및 노르-MDP 애쥬번트(adjuvant) (N-아세틸-글루코사민-3 일-아세틸 L-알라닐-D-아이소글루타민) 중에 유화시키고, 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Charles River Laboratories로부터 구매되고 미국 오하이오 주립 대학교의 ULAR (University Laboratory Animal Resources) 시설에 수용된 뉴질랜드 화이트 토끼를 면역화하는 데 사용하였다. 토끼를 3주 간격으로 총 3회 백신화하였다. 동물을 매주 채혈하고, 9주째에 희생시키고, 마지막 시험 채혈 시점에서 심장 천자에 의해 종말 채혈하였다. 모든 실험은 미국 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 공공 건강 서비스 정책에 따라 수행하였으며, 오하이오 주립 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며, 허용된 프로토콜에 상세히 기재되어 있다. 단백질 A/G 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 펩티드 백신 항체를 정제하고, 농도를 쿠마시(Coomassie) 단백질 검정에 의해 측정하였다.

129. 4개의 모든 에피토프는 면역화 백신에 대해 250,000 초과의 높게 역가측정된 항체를 유도하였다 (도 5a). 종말 채혈 항체는 또한 재조합 인간 PD-1 단백질뿐만 아니라 면역화 펩티드 MVF-PD-1, 아세틸화 펩티드, 및 유리 펩티드를 인식하였다 (도 5b).

b) (ii) 선택된 에피토프의 인간 PD-1 서열과 마우스 PD-1 서열 사이의 상동성.

130. 인간 PD-1 서열과 마우스 PD-1 서열 사이의 전체 상동성은 65%이다. 선택된 에피토프는 인간 서열과 마우스 서열 사이에 67% 내지 74%의 상동성을 나타낸다. 따라서, 선택된 인간 에피토프가 마우스 PD-1에 결합하여 마우스 연구를 검증할 수 있는지의 여부를 확인하는 것이 중요하였다.

c) (iii) α-hPD-1 토끼 다중클론 항체는 마우스 PD-1에 결합한다

131. α-hPD-1 토끼 다중클론 항체가 뮤린 PD-1을 인식하는지의 여부를 결정하기 위하여, 나이브 미엘린 염기성 단백질 (MBP)-특이적 TCR 유전자도입 마우스로부터의 비장세포를 MBP Ac1-11로 72시간 동안 활성화시켰다. PD-1 발현을 유세포측정에 의해 분석하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 마우스 PD-1에 결합된 4개의 모든 다중클론 α-hPD-1 항체는 종양 마우스 연구에서의 인간 PD-1의 사용을 검증한다.

d) (iv) α-huPD-1 항체에 의한 T 세포 증식의 조절

132. 항원 특이적 T 세포 증식은 T 이펙터 세포의 중요한 이펙터 기능을 반영한다. 4개의 α-huPD-1 항체가 PD-1 신호전달 경로를 활성화시키거나 억제함으로써 T 이펙터 기능을 변경시키는지를 결정하기 위하여, CFSE-기반 증식 검정을 수행하였다 (도 7). 간략하게 말하면, 나이브 MBP-특이적 TCR 유전자도입 마우스로부터의 비장세포에 CFSE를 표지하고, 50 mg/ml의 α-huPD-1 항체 또는 대조군 토끼 IgG의 존재 하에서 MBP Ac1-11로 4일 동안 활성화시켰다. 유세포측정에 의해 CFSE 발현을 분석하였다. 데이터는, T 세포의 단지 70%만이 대조 IgG 처리군에서 고도로 증식하는 것과 대비하여, α-hPD-1-92-110 처리된 CD4 T 세포의 81%가 고도로 증식함을 보여주는데, 이는, α-hPD-1-92-110이 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하고, 미엘린-특이적 CD4 T 세포의 증가된 항원-특이적 증식에 의해 나타나는 향상된 T 이펙터 기능으로 이어짐을 나타낸다. 대조적으로, α-hPD-1 (45-64) 또는 α-hPD-1 (73-90) 처리된 T 세포는 감소된 증식을 나타내는데, 이는, 이들이 PD-1 신호전달을 활성화시키고, 미엘린-특이적 CD4 T 세포의 이펙터 기능을 억제함을 나타낸다. 추가로, α-hPD-1 (32-50)은 T 이펙터 기능에 영향을 미치지 않는데, 그 이유는 α-huPD-1 (32-50)로 처리된 세포는 대조 IgG로 처리된 세포와 동일한 수준으로 증식하기 때문이다. 종합하면, 이들 데이터는 α-hPD-1 (92-110)이 T 이펙터 기능을 향상시키고, 생체내에서의 종양 성장을 억제함에 있어서 치료적 능력을 가짐을 나타낸다. PD-1 신호전달을 활성화시키는 특성으로 인해 45-64 및 73-90 에피토프는 자가면역 질병에 대한 표적으로서의 역할을 할 수 있다.

5. 실시예 5: 면역적격성 마우스에서의 PD-1 펩티드의 면역원성 시험 및 종양 시험투여 실험

a) 마우스 백신화 및 종양 시험투여 프로토콜.

133. 6 내지 8주령된 면역적격성 Balb/c 마우스를 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Charles River Laboratories로부터 구매하고, 미국 오하이오 주립 대학교의 ULAR 시설에 수용하였다. 아이소플루란을 사용하여 세포 주사 및 종료 전에 동물을 마취시켰다. 면역전 혈청 샘플을 마우스로부터 채취하고, 이어서 이들을 Montanide ISA 720 (프랑스 파리 소재의 Seppic) 및 노르-MDP 애쥬번트 (N-아세틸-글루코사민-3 일-아세틸 L-알라닐-D-아이소글루타민) 중에 유화된 펩티드 100 ㎍으로 면역화하였다. 마우스는 최초의 면역화 후에 3주째 및 6주째에 부스터 면역화(booster immunization)를 제공받았다. 마우스로부터 몇몇 시험 혈청 샘플을 채취하였다 (도 8).

b) 종양 시험투여:

134. 두 번째 부스팅 후 10일째에, 마우스의 우측 옆구리에 1x10₅개의 뮤린 결장 암종 CT26 종양 세포를 피하 접종하였다. 종양 성장을 주 3회 모니터링하고, 혈청 샘플을 매주 그리고 동물의 희생 시에 채취하였다. 일수 0에서 대조군 마우스에 1x10₅개의 CT26 종양 세포를 피하 생착하고 제공받았다. 동물은 PD-1에 대해 유도된 항-마우스 항체 150 ㎍을 주사받았다. 매주 2회 촉진가능한 종양의 형성에 대해 마우스를 모니터링하고 점수를 매기고, 종양이 괴사하게 되거나 2,000 ㎣의 미리 결정된 크기를 초과하게 되면 희생시켰다. 종양 직경을 주 2회 측정하였다. 종양 크기는 하기 식에 따라 계산하였다: V = [(길이 × 폭2)/2]. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 세제곱 밀리미터 단위로 측정하고, 하기 식으로 계산하였다: A × B2 × 0.5 (여기서, A는 최대 직경이고, B는 최소 직경임). 모든 실험은 미국 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 공공 건강 서비스 정책에 따라 수행하였으며, 오하이오 주립 대학교 IACUC에 의해 승인되었으며, 허용된 프로토콜에 상세히 기재되어 있다.

c) 마우스에서의 PD-1 백신 작제물의 면역원성.

135. 모든 개별 마우스는 4개의 모든 백신에 대해 강력한 항체 반응을 가졌다. 풀링된 혈청에 대한 면역 반응 (도 9 및 표 6)을 백신 작제물에 대해 다양한 간격 (2Y+1, 2Y+3, 3Y+1, 3Y+2, 3Y+3)으로 모니터링하였다.

[표 6]

d) 마우스 조직에서의 면역 세포 검출

136. 마우스에서의 면역 반응을 연구하기 위한 후속 FACS 분석을 위하여 종양 및 종양 배출 림프절을 수집하였다. 세포 현탁액을 기계적 해리에 의해 또는 효소적 분해에 의해 조직으로부터 준비하였다. 염색된 세포를 파장 405, 488 및 633 nm에서 3개의 여기 레이저가 구비된 LSR II 유세포측정기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 종양 백혈구로부터의 CD8⁺ T 세포 및 CD4⁺CD25⁺ T 세포를 MACS 컬럼 또는 FACSAria 상에서 정제하였다.

e) 처리된 마우스에서의 T 세포 반응의 면역-프로파일링

137. 유세포측정 분석을 수행하여 비장세포 및 종양 침윤 T 세포에서 표면 마커 (CD45, CD3, CD4, CD8 및 CD25) 및 전사 인자 FoxP3의 발현을 평가하였다. 간략하게 말하면, 비장을 마우스로부터 적출하고 세포 스트레이너(cell strainer)를 통해 가압한 후, 적혈구 용해 완충액과 짧게 인큐베이션하여 적혈구를 용해시켰다. 이어서, 세포를 수집하고, 세척하고, 염색 완충액 (PBS 중 1% BSA) 중에 재현탁시켰다. 유사하게, 종양을 마우스로부터 적출하고 세포 스트레이너를 통해 가압한 후, 37% 퍼콜(percoll)로 1회 세척하였다. 이어서, 종양 세포를 PBS로 세척하고, 염색 완충액 중에 재현탁시켰다. 비장세포 및 종양 세포를 4℃에서 30분 동안 세포-표면 마커에 대한 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 염색 완충액으로 2회 세척한 후에, 4℃에서 60분 동안 Cytofix/Cytoperm 용액을 사용하여 세포를 고정시키고 투과화하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 FoxP3에 대해 염색하였다. 80,000 내지 100,000개의 살아있는 세포 사건을 FACSCanto (BD) 상에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 침윤 세포를 종양 세포로부터 구별하기 위하여, 종양 세포를 먼저 CD45⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. 이어서, CD3⁺CD4⁺ 및 CD3⁺CD8⁺ 세포를 분석하였다. Treg는 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ 세포에 의해 표현되었다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, CD4 및 CD8 하위세트는 비장에서 유사한 수준인 반면, 군 C, E 및 F는 군 A (음성 대조군)와 대비하여 비장에서 증가된 Treg 집단을 나타내었다. 종양에 있어서, 군 C는 다른 4개의 군과 대비하여 최고 Treg를 갖는데(도 10b), 이는, 펩티드 PD1-45-64 백신화가 종양 미세환경에서 증가된 Treg 발생으로 이어졌음을 나타낸다. 군 E는 최저 Treg를 가졌다.

f) PD-1 작제물로 면역화되고 1x10 ₅ 개의 뮤린 결장 암종 CT26 종양 세포가 시험투여된 유전자적 동계 Balb /c 마우스에서의 효능 연구

138. 도 11은 4개의 PD-1 작제물 (A: PD-1 (32-50), B: PD-1 (45-64), C: PD-1 (73-90) 및 D: PD-1 (92-110)), 대조 펩티드 (E: 비관련 펩티드) 및 항-마우스 PD-1 단일클론 항체로 처리된 양성 대조군 (F)의 각각에 대한 마우스 (5 마리/군)에서의 종양 성장의 개별 도표를 나타낸다.

g) 마우스 종양 성장 데이터의 예비 통계학적 분석

139. 종양 성장에 대한 4가지의 상이한 백신 처리의 성능을 평가하기 위하여, 종양 크기를 마우스에서 주기적으로 측정하고, 결과를 양성 대조군 및 음성 대조군의 것과 비교하였다. 각각의 처리군에는 5 마리의 마우스가 있었으며, 각각은 할당된 MVF-펩티드를 제공받고, 이어서 최종 처리 부스팅 후 10일째에 1e5 CT26 (결장) 종양 세포를 접종하였다. 일수 14는 1차 관심 시점으로 간주되었는데, 그 이유는, 연구자들은 일수 19까지의 대기가 종양이 너무 많은 시간 동안 성장할 수 있게 하여, 실험의 그 시점에서 유사한 크기가 되게 할 것으로 여겼기 때문이다. 종양 크기는 하기 3가지 방식으로 측정하였다: 모든 시점에서 LWW (1/2*길이*폭*폭), 모든 시점에서 LWH (1/2*길이*폭* 높이), 그리고 연구 종료 시점에서 종말 종양 중량. MVF-PD-a (45)로 처리된 마우스, 군 C는 한 마리의 마우스의 사망으로 인해 일수 19 전에 희생시켰으며, 이에 따라 단지 일수 14에서의 종양 크기간에만 비교가 이루어질 수 있다. 종양 크기는 LWW 및 LWH에 대해서는 ㎣의 단위이고, 종말 종양 중량에 대해서는 그램이다.

140. 각각의 군에서의 작은 샘플 크기 및 정규성 추정 불능으로 인해, 정확한 윌콕손 순위합 검정을 사용하여, 14일째 및 19일째의 시점에서의 종양 크기의 분포간의 계통적 차이(systematic difference)에 대해 검사하였다 (도 12a 내지 도 12d 및 표 7 내지 표 10). 주어진 p-값은 그러한 컬럼의 대조군 대 각각의 처리군을 비교하는 검정에 대한 것이며, 종양 크기가 처리군과 대조군 사이에서 계통적으로 더 크거나 더 작을 가능성을 고려하기 위하여 양측(two-sided)으로 되어 있다. 이것은 예비 데이터이기 때문에, p-값은 다중 비교를 위해 조정되지 않는다. 전체적으로, 대조군과 처리군의 분포간에 유의한 차이가 있는 경우는 거의 없었다.

[표 7]

MVF-PD-a (32)의 경우, 처리군과 양성 대조군 또는 음성 대조군 사이의 종양 크기의 분포에 있어서 유의한 차이는 없었다.

[표 8]

MVF-PD-1 (45-64)의 경우, 앞서 언급된 바와 같이, 비교는 일수 14에서의 데이터에 대해서만 행해질 수 있었다. 여기서는, 이 처리군과 대조군들 중 어느 하나 사이에서 발견되는 종양 크기 분포에 있어서의 유의한 차이가 없었다.

[표 9]

MVF-PD-1 (73-90)의 경우, 일수 14에서 이 처리군과 대조군들 중 어느 하나 사이의 종양 크기 분포 사이에 유의한 차이가 없었다. 처리군 대 양성 대조군을 비교할 때, 일수 19에서 LWH에 대한 p-값이 현저하게 작았는데 (<0.1), 이는 종양 크기 분포의 가능한 차이를 나타낸다.

[표 10]

MVF-PD-1 (92-110)의 경우, LWW 및 LWH 측정치 둘 모두를 사용하여 이 처리군 대 양성 대조군을 비교할 때 p-값이 또한 현저하게 작았다. 이 처리군은 양성 대조군보다 계통적으로 더 작은 종양 크기의 분포를 갖는 것으로 나타났다.

6. 실시예 6: PD-1 펩티드 항체는 억제성 또는 활성화성이다

141. 항원 특이적 T 세포 증식은 T 이펙터 세포의 중요한 이펙터 기능을 반영한다. 4개의 α-huPD-1 항체가 PD-1 신호전달 경로를 활성화시키거나 억제함으로써 T 이펙터 기능을 변경시키는지를 결정하기 위하여, CFSE-기반 증식 검정을 수행하였다. 증식 검정에서, 나이브 MBP-특이적 TCR 유전자도입 마우스로부터의 비장세포에 CFSE를 표지하고, 50 mg/ml의 α-huPD-1 항체 또는 대조군 토끼 IgG의 존재 하에서 MBP Ac1-11로 4일 동안 활성화시켰다. 유세포측정에 의해 CFSE 발현을 분석하였다 (도 13). 데이터는, T 세포의 단지 70%만이 대조 IgG 처리군에서 고도로 증식하는 것과 대비하여, α-hPD-1-92-110 처리된 CD4 T 세포의 81%가 고도로 증식함을 보여주는데, 이는, α-hPD-1-92-110이 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하고, 미엘린-특이적 CD4 T 세포의 증가된 항원-특이적 증식에 의해 나타나는 향상된 T 이펙터 기능으로 이어짐을 나타낸다. 대조적으로, α-hPD-1 (45-64) 또는 α-hPD-1 (73-90) 처리된 T 세포는 감소된 증식을 나타내는데, 이는, 이들이 PD-1 신호전달을 활성화시키고, 미엘린-특이적 CD4 T 세포의 이펙터 기능을 억제함을 나타낸다. 종합하면, 이들 데이터는 α-hPD-1 (92-110)이 T 이펙터 기능을 향상시키고, 생체내에서의 종양 성장을 억제함에 있어서 치료적 잠재력을 가질 수 있음을 나타낸다. PD-1 신호전달을 활성화시키는 특성으로 인해 45-64 및 73-90 에피토프는 자가면역 질병에 대한 표적으로서의 역할을 할 수 있다.

7. 실시예 7: 상이한 PD-1 작제물로 면역화되고 1x10 ⁵ 개의 뮤린 결장 암종 CT26 종양 세포가 시험투여된 유전자적 동계 Balb/c 마우스에서의 예비 스크리닝 효능 연구

142. 6 내지 8주령된 면역적격성 Balb/c 마우스 (5 마리의 마우스/군)를 Montanide ISA 720 (프랑스 파리 소재의 Seppic) 및 노르-MDP 애쥬번트 (N-아세틸-글루코사민-3 일-아세틸 L-알라닐-D-아이소글루타민) 중에 유화된 펩티드 100 ㎍으로 면역화하였다. 마우스는 종양 시험투여 후 3주째 및 6주째에 부스터 면역화를 제공받았다. 두 번째 부스팅 후 10일째에, 마우스에 1x10⁵개의 뮤린 결장 암종 CT26 종양 세포를 피하 접종하고, 종양 성장을 주 3회 모니터링하였다. 일수 0에서 대조군 마우스에 1x10⁵개의 CT26 종양 세포를 피하 생착하고, PD-1에 대해 유도된 항-마우스 항체 150 ㎍을 주사받았다. 풀링된 혈청에 대한 면역 반응 (도 14)을 백신 작제물에 대해 그리고 재조합 PD-1 단백질에 대해 다양한 간격 (2Y+1, 2Y+3, 3Y+1, 3Y+2, 3Y+3)으로 모니터링하였다 (표 11). 모든 개별 마우스는 4개의 모든 백신에 대해 강력한 항체 반응을 가졌다.

[표 11]

종말 마우스 및 토끼 혈청을 재조합 huPD1 단백질 600 ng/웰에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 혈청을 1:100 및 1:200 희석물로 시험하였다. ABTS를 본 검정에서 기질로서 사용하였다. 샘플을 415 λ에서 판독하고, 점수를 매겼다.

8. 실시예 8: 백신 후보로서의 PD-1 (92-110) 에피토프의 검증:

143. 모든 백신화된 마우스는 각각의 면역원에 대해 높은 항체 역가를 나타내는 높은 면역원성을 보여주었다. MVF-PD-1 (92-110)로 백신화된 마우스만이 일수 14에서 종양 성장의 유의한 억제를 나타냈는데 (도 15), 이는, 이 에피토프가 유용한 억제성 백신임을 나타낸다. 이러한 결론은 에피토프 45-64 및 73-90이 억제성이 아니며, 이에 따라 종양 성장을 향상시킨다는 것을 보여준 연구에 의해 추가로 검증된다. 한편, 양성 대조군인 마우스 PD1 mAb (29F.1A12)는 종양 성장을 억제하였을 것이다. 단지 PD-1 (92-110) 에피토프만이 백신에 대한 가장 우수한 후보인 것으로 결론지었는데, 그 이유는 그러한 에피토프는 니볼루맙에 대한 결합 특성에 기초하여 설계되었기 때문이다.

9. 실시예 9: 1x10 ⁵ 개 뮤린 결장 암종 CT26/HER-2 종양 세포가 시험투여된 유전자적 동계 Balb/c 마우스에서의 PD-1 및 HER-2 병용 백신 작제물의 효능 (계획(Scheme): 도 16)

144. 이 연구를 위한 이론적 근거는 PD-1 (92-110) 백신과 병용된 잘 확립된 HER-2 백신이 유전자적 동계 암 모델에서 면역원성을 강화/증가시키고, 항-종양 반응을 향상시키고, 종양 성장을 억제하는 데 있어서 상승적 효과를 제공할 수 있는지의 여부이다. Balb/c 마우스 (10 마리의 마우스/군)를 노르-MDP 및 ISA 720으로 유화된 MVF-PD-1 (92-110), MVF-HER-2 (266-296), 및 MVF-HER-2 (597-626) 펩티드 백신 작제물의 병용물로 면역화하였다. 동물을 3주 간격으로 2회 부스팅하였다. 200 ng/웰의 MVF-펩티드 상에서 ELISA에 의해 항체 역가를 결정하였다.

145. 최종 부스팅 후 2주째에, CT26/HER-2 종양 세포주로부터의 1x10⁵개의 종양 세포를 s.c. 이식하였다. 어느 것이든 대조군 마우스에 1x10⁵개의 종양 세포를 시험투여하고, 실험의 지속기간 동안 주 2회 항-PD-1 항체 (29F.1A12)로 처리하였다. 일단 종양이 캘리퍼스를 사용하여 촉진가능한 크기에 도달하였으면, 이것을 측정함으로써 종양 부하를 결정하였다. CT-26/HER-2 종양 보유 마우스를 이식 후 21일째에 희생시켰다. 혈액 및 조직 샘플을 희생 시점에서 이들 마우스로부터 수집하고, 절제된 종양 덩어리의 최종 체중을 구하였다. 1:100 내지 1:512,000의 혈청 농도를 시험하였다. ABTS를 이 검정에서 기질로서 사용하였으며, 0.1% SDS 용액을 사용하여 10분 후에 효소 반응을 중단시켰다. 역가는, 415 nm에서 판독될 때 여전히 흡광도가 0.200 초과인 최종 희석물로서 정의되었다. 혈청 샘플 1Y+3, 2Y+1, 2Y+3, 및 3Y+2를 CT-26 HER-2 neu 종양 시험투여 전에 채취하였다. 샘플 3Y+3 및 3Y+5를 시험투여 후 각각 1주째 및 3주째에 채취하였다. 강력한 HER-2 및 PD-1 항체 반응이 모든 백신화된 마우스에서 유도되었다 (도 17).

146. PD-1 (92-110) 단독으로 또는 2개의 Her2 펩티드 면역원에 의한 면역화와 병용하여 3주 간격으로 3회 면역화된 유전자적 동계 Balb/c 마우스 (10 마리/군)에서의 종양 성장의 개별 도표. 비관련 펩티드로 면역화된 면역화 대조군을 포함시켰다. CT-26 Her2 neu 암종 세포 (1x10⁵개)를 세 번째 백신화 후 15일째에 마우스에 시험투여하였다. 대조군 마우스에도 또한 CT-26 Her2 neu 암종 세포를 시험투여하였다. 대조군 마우스를 항-M PD-1 MAb (양성 대조군) 또는 PBS (음성 대조군)로 매주 2회 IP 처리하였다. 마우스를 촉진가능한 종양의 형성에 대해 모니터링하고 점수를 매기고, 이어서 종양 치수를 캘리퍼스를 사용하여 정기적으로 측정하였다. 종양 세포 이식 후 일수 21에서 동물을 희생시켰다. 오차 막대는 마우스군에 대한 표준 오차의 표현이고, p-값은 다양한 군 대 삼중 백신 마우스를 비교한다. 결과는 삼중 백신화가 PD-1 백신 또는 더 중요하게는 양성 대조군 골드 스탠다드(gold standard)인 항-마우스 PD-1 단일클론 항체 (29F.1A12)와 대비하여 결장 암종의 Balb/c 유전자적 동계 모델에서 종양 성장을 감소시키는 데 효과적임을 나타낸다 (도 18).

147. 데이터는 삼중 백신화 군 MVF-PD-1 (92-110) + MVF-HER-2 (266+296) + MVF-HER-2 (597-626)이 양성 대조군 항-마우스 PD-1 Mab (29F.1A12) 또는 MVF-PD-1 단독에 의한 백신화와 대비하여 종양 성장을 예방하는 데 있어서 더 효과적이었음을 입증한다 (도 19a 및 도 19b). 따라서, 콤보 HER-2 및 PD-1 펩티드와의 삼중 백신화의 전략이 향상된 면역원성 및 종양 성장의 억제에 있어서 절정에 달하는 상승적/상가성을 입증하는 실현가능한 제안이다.

10. 실시예 10: PD-1 백신은 안전하고 독성 또는 자가면역을 나타내지 않는다

148. 9주의 기간에 걸쳐 백신화된 모든 마우스는 지저분함(scruffiness), 병변, 및 기면의 어떠한 징후도 보여주지 않았다. 병용 펩티드 (HER-2와 PD-1)로 백신화된 Balb/c 마우스로부터의 기관 (비장, 간, 심장, 폐, 신장, 및 종양)을 마우스로부터 수집하고, Veterinary Biosciences의 종합 암 센터(Comprehensive cancer center) 부서의 Comparative Pathology & Mouse.Phenotyping Core 시설에서의 분석을 위해 제출하였다 (병리학자: Krista M. D. La Perle, DVM, PhD, Dipl. ACVP). 조직학적 평가를 위해 제출된 기관의 어느 것에서도 유의한 병변이 언급되지 않았다. 또한, 명시적인 생화학적 비정상이 언급되지 않았다. 모든 마우스는 당원병(glycogenosis)과 일치하는 간세포 공포화(hepatocellular vacuolation)를 가졌다. 간에서의 글리코겐 축적은 정상적인 소견인 것으로 해석되며, 동물의 생리학적 상태에 따라 변동된다. 글리코겐 축적은 또한 독성의 징후로서 또는 글리코겐 저장 질병을 갖는 것으로 볼 수 있다.

11. 실시예 11: 병용 펩티드 백신은 종양 침윤 세포 (TIL)에서 CD8/Treg 비를 유의하게 증가시켰다

149. CD25⁺FoxP3⁺ CD4 T 조절성 세포 (Treg)는 면역억제성 종양 미세환경 (TME)의 발생에 유의하게 기여하는 종양 미세환경에서의 주요 억제성 집단들 중 하나이다. 한편, 종양 부위에서의 다수의 T 세포, 특히 CD8 T 세포는 암 환자에서의 전체 생존 (OS)을 위한 주요 분모이다. 높은 CD8/Treg 비는 암에서의 유리한 예후와 관련되어 있다. 따라서, 병용 펩티드 또는 대조 펩티드 (전술됨)로 백신화된 종양-보유 마우스의 TIC에서 CD8/Treg 비를 결정하였다. 종양을 4개의 마우스군 (전술됨)으로부터 적출하고 세포 스트레이너를 통해 가압한 후, 37% 퍼콜로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 세포-표면 마커 (CD45, CD4, CD8, CD25)에 대한 mAb와 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 60분 동안 Cytofix/Cytoperm 용액 (eBioscience)을 사용하여 고정시키고 투과화한 후, 4℃에서 30분 동안 FoxP3에 대해 염색하였다. 80,000 내지 100,000개의 살아있는 세포 사건을 FACSCantoII (BD) 상에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. TIL을 종양 세포로부터 구별하기 위하여, 세포를 먼저 CD45⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. 이어서, CD4⁺ (도 20a) 및 CD8⁺ (도 20b) 세포를 분석하였다. Treg는 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ 세포에 의해 표현되었다 (도 20c). GraphPad 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 GraphPad Prism Software, Inc.)를 통계학적 분석에 이용하였다. 군 평균을 계산하고, 분산분석을 사용하여 비교하였다. CD8⁺ T 세포는 대조 펩티드-백신화된 군에 비하여 병용 백신군 (HER-2/PD1-92 백신화된 군)에서 유의하게 더 높았다 (도 20b). 모든 군간에 CD4 T 세포 또는 Treg 세포의 유의한 차이는 없다 (도 20a 및 도 20b). 그러나, CD8/Treg 비는 대조 펩티드-백신화된 군에 비하여 병용 백신군에서 유의하게 더 높다 (도 20d). 따라서, 이들 데이터는 대조 펩티드-백신화된 군에 비하여 HER-2/PD-1 백신화된 군에서 증가된 CD8/Treg 비를 나타낸다.

12. 실시예 12: 펩티드-백신화된 마우스로부터의 종양 침윤 림프구의 분석

150. 높은 CD8/Treg 비는 암에서의 유리한 예후와 관련되어 있다. 펩티드 백신이 CD8/Treg 비를 증가시키는지를 결정하기 위하여, CD8⁺, CD4⁺ 및 T 조절성 (FoxP3⁺CD25⁺CD4⁺) 종양 침윤 림프구를 펩티드-백신화된 마우스에서 분석하였다. 유세포측정 분석을 수행하여 표면 마커 (CD45, CD4, CD8 및 CD25)의 발현을 평가하고, 전사 인자 FoxP3의 발현을 세포내 염색에 의해 결정하였다 (도 21a). 간략하게 말하면, 종양을 마우스로부터 적출하고 세포 스트레이너를 통해 가압한 후, 37% 퍼콜로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 염색 완충액 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 세포-표면 마커에 대한 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 염색 완충액으로 2회 세척한 후에, 4℃에서 60분 동안 Cytofix/Cytoperm 용액 (eBioscience)을 사용하여 세포를 고정시키고 투과화하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 30분 동안 FoxP3에 대해 염색하였다. 80,000 내지 100,000개의 살아있는 세포 사건을 FACSCanto II (BD) 상에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 침윤 세포 (CD45⁺)를 종양 세포 (CD45^-)로부터 구별하기 위하여, 총 세포를 먼저 CD45⁺ 세포 상에서 게이팅하였다. 이어서, CD45⁺ 종양 침윤 집단 내의 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 백분율을 분석하였다. Treg는 FoxP3⁺CD25⁺CD4⁺ 세포에 의해 표현되었다. GraphPad 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 GraphPad Prism Software, Inc.)를 통계학적 분석에 이용하였다. 군 평균을 계산하고, 분산분석을 사용하여 비교하였다. 도 21b에 나타낸 바와 같이, CD8⁺ T 세포는, 대조 펩티드-백신화된 군 (군 3)에 비하여 PD-1 펩티드 또는 PD-1/Her-2 백신화된 군 (군 1 및 군 2)에서 유의하게 더 높았다. 그러나, PD-1 펩티드 백신화된 군, PD-1/Her-2 백신화된 군 및 대조 펩티드-백신화된 군간에 Treg 세포에 있어서 유의한 차이가 없었다. 종합하면, 이들 데이터는 대조 펩티드-백신화된 군에 비하여 PD-1 펩티드 또는 PD-1/Her 2 백신화된 군에서 증가된 CD8/Treg 비를 나타낸다.

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F. 서열

서열 번호 1 인간 PD1 잔기 1-128

PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKLQIKESLRAERVTERRAEVPTAHPSPSP

서열 번호 2 PD1 (32-50)

VLNWYRMSPSNQTDKLAAF

서열 번호 3 PD1 (45-64)

KLAAFPEDRSQPGQDCRFR

서열 번호 4 PD1 (73-90)

DFHMSVVRARRNDSGTYL

서열 번호 5 PD1 (92-110)

GAISLAPKAQIKESLRAEL

서열 번호 6 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF)

KLLSLIKGVIVHRLEGVE

서열 번호 7 링커

GPSL

서열 번호 8 MVF-PD1 (32-50)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLVLNWYRMSPSNQTDKLAAF

서열 번호 9 MVF-PD1 (45-64)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLKLAAFPEDRSQPGQDCRFR

서열 번호 10 MVF-PD1 (73-90)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLDFHMSVVRARRNDSGTYL

서열 번호 11 MVF-PD1 (92-110)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLGAISLAPKAQIKESLRAEL

서열 번호 12 PD1 (32-50) D 펩티드 역방향-거울상

FAALKDTQNSPSMRYWNLV

서열 번호 13 PD1 (45-64) D 펩티드 역방향-거울상

RFRCDQGPQSRDEPFAALK

서열 번호 14 PD1 (73-90) D 펩티드 역방향-거울상

LYTGSDNRRARVVSMHFD

서열 번호 15 PD1 (92-110) D 펩티드 역방향-거울상

LEARLSEKIQAKPALSIAG

서열 번호 16 MVF PD1 (32-50) D 펩티드 역방향-거울상

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLFAALKDTQNSPSMRYWNLV

서열 번호 17 MVF PD1 (45-64) D 펩티드 역방향-거울상

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLRFRCDQGPQSRDEPFAALK

서열 번호 18 MVF PD1 (73-90) D 펩티드 역방향-거울상

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLYTGSDNRRARVVSMHFD

서열 번호 19 MVF PD1 (92-110) D 펩티드 역방향-거울상

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLEARLSEKIQAKPALSIAG

서열 번호 20 TT

NSVDDALINSTIYSYFPSV

서열 번호 21 TT1

PGINGKAIHLVNNQSSE

서열 번호 22 P2

QYIKANSKFIGITEL

서열 번호 23 P30

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

서열 번호 24 MVF (천연)

LSEIKGVIVHRLEGV

서열 번호 25 HBV

FFLLTRILTIPQSLN

서열 번호 26 CSP

TCGVGVRVRSRVNAANKKPE

서열 번호 27 HER-2 (266-296)

LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV

서열 번호 28 MVF HER-2 (266-296)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLLHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV

서열 번호 29 HER-2 (597-626)

VARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPL

서열 번호 30 MVF HER-2 (597-626)

KLLSLIKGVIVHRLEGVEGPSLVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPL

SEQUENCE LISTING <110> Ohio State Innovation Foundation <120> HUMAN PD1 PEPTIDE VACCINES AND USES THEREOF <130> 10336-315WO1 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn 1 5 10 15 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala 35 40 45 Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val 50 55 60 Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala 65 70 75 80 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala 85 90 95 Pro Lys Leu Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Arg Val Thr Glu 100 105 110 Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 115 120 125 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 1 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 12 Phe Ala Ala Leu Lys Asp Thr Gln Asn Ser Pro Ser Met Arg Tyr Trp 1 5 10 15 Asn Leu Val <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 13 Arg Phe Arg Cys Asp Gln Gly Pro Gln Ser Arg Asp Glu Pro Phe Ala 1 5 10 15 Ala Leu Lys <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 Leu Tyr Thr Gly Ser Asp Asn Arg Arg Ala Arg Val Val Ser Met His 1 5 10 15 Phe Asp <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 15 Leu Glu Ala Arg Leu Ser Glu Lys Ile Gln Ala Lys Pro Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Ala Gly <210> 16 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 16 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Phe Ala Ala Leu Lys Asp Thr Gln Asn Ser 20 25 30 Pro Ser Met Arg Tyr Trp Asn Leu Val 35 40 <210> 17 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 17 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Arg Phe Arg Cys Asp Gln Gly Pro Gln Ser 20 25 30 Arg Asp Glu Pro Phe Ala Ala Leu Lys 35 40 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 18 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Leu Tyr Thr Gly Ser Asp Asn Arg Arg Ala 20 25 30 Arg Val Val Ser Met His Phe Asp 35 40 <210> 19 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 19 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Leu Glu Ala Arg Leu Ser Glu Lys Ile Gln 20 25 30 Ala Lys Pro Ala Leu Ser Ile Ala Gly 35 40 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 20 Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Ile Tyr Ser Tyr Phe 1 5 10 15 Pro Ser Val <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 21 Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Gln Ser Ser 1 5 10 15 Glu <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 22 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 23 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 24 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 25 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asn 1 5 10 15 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 26 Thr Cys Gly Val Gly Val Arg Val Arg Ser Arg Val Asn Ala Ala Asn 1 5 10 15 Lys Lys Pro Glu 20 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 27 Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser 1 5 10 15 Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val 20 25 30 <210> 28 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 28 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn 20 25 30 Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe 35 40 45 Gly Ala Ser Cys Val 50 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 29 Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro 1 5 10 15 Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Leu 20 25 30 <210> 30 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 30 Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Gly Pro Ser Leu Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro 20 25 30 Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala 35 40 45 Cys Gln Pro Leu 50

Claims (29)

1. 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프, 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커(linker)를 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 PD-1 키메라 펩티드로서,
   상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는, PD-1 키메라 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드를 포함하는, 키메라 펩티드.
3. 제1항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열 번호 6을 포함하는, 키메라 펩티드.
4. 제1항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 7을 포함하는, 키메라 펩티드.
5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 펩티드.
6. 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는, PD-1 단백질에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 합성 PD-1 펩티드.
7. 제6항에 있어서, 상기 합성 PD-1 펩티드를 포함하는 아미노산은 D 거울상 이성질체인, 합성 펩티드.
8. 제6항 또는 제7항의 하나 이상의 합성 펩티드를 포함하는 키메라 펩티드로서,
   Th 에피토프, 및 상기 합성 PD-1 펩티드를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커를 추가로 포함하는, 키메라 펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 홍역 바이러스 융합 단백질 펩티드를 포함하는, 키메라 펩티드.
10. 제8항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열 번호 6을 포함하는, 키메라 펩티드.
11. 제8항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 7을 포함하는, 키메라 펩티드.
12. 제8항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 또는 서열 번호 19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 펩티드.
13. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 펩티드는 아세틸화되는, 합성 펩티드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 하나 이상의 키메라 펩티드 또는 합성 펩티드 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 HER-2 B 세포 에피토프를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 HER-2 B 세포 에피토프는 서열 번호 27 또는 29에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
17. 제15항에 있어서, 상기 HER-2 B 세포 에피토프는 서열 번호 28 또는 30에 제시된 바와 같은 하나 이상의 합성 HER-2 B 세포 에피토프를 포함하는, 약제학적 조성물.
18. 제14항에 있어서, 상기 비히클은 생분해성이고, 약제학적으로 허용되는 오일/물 에멀젼을 포함하는 에멀젼 및 폴리락티드-폴리글리콜산 중합체를 포함하는 생분해성 미소구체 또는 나노구체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 임의의 키메라 펩티드 또는 합성 펩티드에 특이적으로 결합하는, 항체.
20. 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 임의의 펩티드 또는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
21. 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서,
    PD-1 키메라 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 키메라 펩티드는 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프, T 헬퍼 (Th) 에피토프, 및 상기 PD-1 B 세포 에피토프를 상기 Th 에피토프에 결합시키는 링커를 포함하며, 상기 하나 이상의 PD-1 B 세포 에피토프는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는, 방법.
22. 대상체에서 암, 알츠하이머병, 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서,
    PD-1 합성 펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 PD-1 합성 펩티드는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 15에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두부 및 경부의 편평 세포 암종, 폐암(lung cancer), 소세포 폐 암종(small cell lung carcinoma), 비소세포 폐 암종(non-small cell lung carcinoma), 신경아세포종, 교아세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암, 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암(pulmonary cancer), 식도 암종, 두부 및 경부 암종, 대장암, 조혈암, 고환암, 전립선암, 또는 췌장암으로 이루어진 암의 군으로부터 선택되는, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 HER-2 B 세포 에피토프를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 HER-2 B 세포 에피토프는 서열 번호 27 또는 29에 제시된 바와 같은 서열들 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 HER-2 B 세포 에피토프는 서열 번호 28 또는 30에 제시된 바와 같은 하나 이상의 합성 HER-2 B 세포 에피토프를 포함하는, 방법.
28. 제25항에 있어서, 상기 HER-2 B 세포 에피토프는 상기 PD-1 에피토프와 함께 동일한 조성물로 투여되는, 방법.
29. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역 질병은 건선, 원형 탈모증, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 다내분비선 증후군, 1형 진성 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 궤양성 결장염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 재발성 다발연골염, 중증 근무력증, 급성 파종성 뇌척수염, 및 다발성 혈관염을 동반하는 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

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