ES2961352T3 - Procedimiento de detección óptica de un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método y un dispositivo para la detección óptica in vitro de un movimiento en una muestra biológica con una extensión espacial en forma de un cultivo celular y/o tisular tridimensional o un grupo de células o una muestra formada por células que nadan libremente. microorganismos. El método comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un receptáculo para la muestra (1), una fuente de haz de luz (6), una unidad óptica (7, 8) y un detector (2), (a1) en el que la unidad óptica (7, 8) está realizado para iluminar toda la muestra (1) en el receptáculo con radiación que emana de la fuente de haz de luz y para guiar al menos parte de la radiación (11) de la fuente de haz de luz (6), que se cambia en cualquier punto dentro de la muestra (1) mediante una interacción con la muestra (1) en términos de la dirección del haz de la misma, el estado de polarización de la misma y/o el patrón de difracción de la misma, a una superficie de detección (2a) del detector (2), y (a2) en el que el detector (2) está realizado para generar una señal de medición (9) de una manera dependiente de la radiación detectada, cuyo perfil de tiempo de la señal de medición especifica un perfil de tiempo de una intensidad de la radiación detectada (11) y/o a partir del cual se puede derivar el desarrollo temporal de la intensidad de la radiación detectada (11); (b) iluminar la muestra (1) con radiación de la fuente del haz de luz; y (c) detectar un movimiento en la muestra biológica (1) de una manera dependiente de un cambio temporal en la señal de medición (9). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección óptica de un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial
La invención se refiere a un procedimiento de detección ópticain vitrode un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial.
Se sabe por la práctica que existe la necesidad de supervisar la dinámica activa de cultivos celulares y tisulares cerrados y tridimensionales en sectores, tales como la biología del desarrollo, las pruebas de toxicidad y la investigación farmacéutica.
Por ejemplo, en el marco de pruebas de toxicidad se utilizan muestras de tejido cultivadas a partir de células madre embrionarias, que se han diferenciado en tejido muscular, para evaluar la nocividad de una sustancia que se va a analizar. A este respecto, se investiga si una sustancia aplicada al tejido muscular influye en las contracciones musculares del tejido muscular, lo que puede ser un indicador de la toxicidad de la sustancia. Para ello, se requieren procedimientos de medición para detectar un movimiento, por ejemplo una contracción, en una muestra biológica tridimensional de este tipo en forma de una agrupación de células. Los diámetros típicos de estas agrupaciones de células varían de 100 a 400 pm, siendo posibles también diámetros en el intervalo de milímetros.
Actualmente, estos estudios se realizan principalmente mediante observaciones visuales y, rara vez, mediante microscopía de video seguida de análisis de imágenes. Las primeras requieren mucho tiempo y siempre están asociadas a una evaluación subjetiva. La última tiene el inconveniente de que se requieren ópticas de formación de imágenes complejas y un análisis de imágenes complejo junto con un esfuerzo de cálculo considerable. Otra desventaja es su sensibilidad inherente con respecto a pequeños desplazamientos.
Los procedimientos no ópticos, tales como, las mediciones de impedancia, solo funcionan en contacto con la muestra. Sin embargo, si la forma de la muestra difiere de una superficie plana (monocapa adherente) o incluso es tridimensional, y todavía se encuentra flotando libremente en un medio, no pueden aplicarse las técnicas mencionadas anteriormente.
Los procedimientos de obtención de imágenes automatizados tienen la desventaja de que, por ejemplo, con una profundidad de foco de 10 pm y el tamaño típico de las agrupaciones celulares mencionado anteriormente de 100 a 400 pm, tendrían que medirse de 10 a 40 planos de imagen de la muestra. Con un tiempo de medición mínimo típico de aproximadamente 10 segundos para poder detectar un movimiento y el tiempo adicional requerido para reposicionar o, respectivamente, enfocar, dichos procedimientos no son adecuados para supervisar con rapidez una pluralidad de muestras.
Generalmente, una medición en serie de un gran número de muestras no está indicada en vista de la duración relativamente larga del periodo de observación debido a las escalas temporales de la dinámica biológica. Sin embargo, en la práctica existe la necesidad de llevar a cabo una detección del movimiento de este tipo en una pluralidad de muestras separadas entre sí, por ejemplo alojadas en una placa multipocillo, también denominada placa de microvaloración, por ejemplo con 96 o 384 pocillos. Los procedimientos de obtención de imágenes no son adecuados para la medición en paralelo de una pluralidad de tales muestras, ya que es difícil, por razones geométricas y de espacio de instalación, disponer un dispositivo óptico de obtención de imágenes en cada pocillo de la placa multipocillo.
El documento WO 2014/123156 A1 divulga la detección del movimiento en una muestra de células musculares mediante el cálculo del contraste de un patrón moteado representado.
El artículo: JA COLE ET AL: "Laser speckle spectroscopy-a new method for using small swimming organisms as biomonitors", BIOIMAGING, Vol. 4, N° 4, diciembre de 1996, páginas 243-253, divulga una medición puntual de un patrón moteado con posterior transformación de Fourier (FFT) para analizar el movimiento de microorganismos.
Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento mejorado para detectar un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial con el que se puedan evitar las desventajas de las técnicas convencionales. El objetivo de la invención es, en particular, proporcionar un procedimiento robusto y sin contacto para la detección de movimiento que no requiera ningún análisis de imágenes complejo. Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento que sea adecuado para el análisis paralelo de una pluralidad de muestras en un entorno de detección.
Estos objetivos se alcanzan mediante un procedimiento que tiene las características de la reivindicación independiente 1. De las reivindicaciones dependientes se desprenden formas de realización y aplicaciones ventajosas de la invención, que se explican con más detalle en la descripción siguiente con referencia parcial a las figuras.
La invención se basa en el conocimiento técnico de que los procedimientos ópticos son los más adecuados para realizar una supervisión sin contacto y que, dado que no se conoce de antemano el lugar exacto de un posible movimiento en la muestra, es necesario iluminar toda la muestra. Dado que la muestra posee generalmente una extensión considerable en profundidad, es decir superior a la profundidad de foco de una óptica de formación de imágenes, las interacciones de la luz con la muestra deben medirse acumulativamente en todo su recorrido a través de la muestra. Por lo tanto, los procedimientos de transmisión no son adecuados, ya que en este caso se mediría la parte de la luz que no interactúa y las fluctuaciones esperables irían acompañadas de un elevado ruido de fondo y de interferencias, lo que haría que la técnica no fuera sensible. Por lo tanto, el enfoque descrito se basa en la detección de la radiación dispersada, polarizada y/o según la invención difractada por la muestra iluminada, buscándose las fluctuaciones provocadas por el movimiento de la muestra en la parte de la luz que, mediante la interacción con la muestra, ha cambiado su dirección de radiación, su estado de polarización y/o según la invención su patrón de difracción. Para ello resulta ventajoso separar la luz transmitida de la radiación dispersada, polarizada y/o difractada mediante filtros adecuados. En el contexto de la presente invención también se utiliza el término "luz" en lugar del término "radiación". Ambos términos deben considerarse sinónimos en el contexto de la presente invención e incluyen radiación electromagnética en el intervalo visible, IR y UV.
Por lo tanto, según aspectos generales de la invención, se proporciona un procedimiento para la detección ópticain vitrode un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial.
El procedimiento según la invención comprende proporcionar un alojamiento para la muestra, una fuente de radiación lumínica, una óptica y un detector. A este respecto, la óptica está diseñada para iluminar toda la muestra presente en el alojamiento con radiación que parte de la fuente de radiación lumínica y para dirigir por lo menos una parte de la radiación de la fuente de radiación lumínica, que se modifica en su patrón de difracción en cualquier punto dentro de la muestra mediante interacción con la muestra a una superficie de detección del detector, de modo que las interacciones de la radiación que sale de la fuente de radiación lumínica con la muestra se midan acumulativamente a lo largo de todo su recorrido a través de la muestra. El detector está diseñado para generar en función de la radiación detectada una señal de medición, cuya evolución temporal indica una evolución temporal de la intensidad de la radiación detectada y/o a partir de la cual se puede derivar la evolución temporal de la intensidad de la radiación detectada.
El procedimiento según la invención también comprende iluminar la muestra con radiación de la fuente de radiación lumínica y detectar un movimiento en la muestra biológica en función de un cambio temporal de la señal de medición.
Una ventaja particular del enfoque según la invención es que la dinámica de la muestra se puede derivar directamente de la magnitud de medición del procedimiento, dado que las fluctuaciones provocadas por un movimiento de la muestra en la parte de la luz, cuyo patrón de difracción ha cambiado por interacción con la muestra son visibles directamente como fluctuaciones en la señal de medición. De este modo se puede prescindir de un procesamiento complejo de los datos de medición, tal como es el caso en los procedimientos de obtención de imágenes.
De forma no perteneciente a la invención, es posible detectar un movimiento en la muestra si un cambio de la señal de medición excede un valor umbral predeterminado. Según la invención, al examinar las contracciones en el tejido muscular, se detecta un movimiento si el cambio temporal de la señal de medición presenta una periodicidad. El procedimiento se puede llevar a cabo utilizando elementos ópticos comparativamente simples. No es necesaria una óptica para enfocar planos de imagen individuales y para realizar una exploración sucesiva del volumen de la muestra. Por lo tanto, el dispositivo para llevar a cabo el procedimiento puede diseñarse de forma económica y estructuralmente compacta.
Gracias a la sencilla evaluación de la señal de medición y a su construcción estructuralmente compacta, el procedimiento también es adecuado para la supervisión en paralelo de una pluralidad de muestras y puede integrarse de forma eficaz para el proceso en entornos de detección o, respectivamente, en procedimientos automatizados de alto rendimiento, por ejemplo procedimientos de detección de alto rendimiento.
Según una variante de forma de realización particularmente preferida, el detector está configurado como un detector monocanal o, respectivamente, el detector emite una señal de medición monocanal. La señal de medición indica preferentemente solo la intensidad de la radiación que incide en la superficie del detector por unidad de tiempo. Por lo tanto, se puede detectar directamente un movimiento en la muestra basándose en un cambio o, respectivamente, una fluctuación temporal de la señal.
Según la invención, el detector es un detector no formador de imágenes o un detector con una señal de medición no resuelta espacialmente, por ejemplo un fotodetector sin resolución espacial, por ejemplo un fotodiodo. Estos detectores son compactos y económicos.
Por una muestra biológica con extensión espacial se entiende una muestra biológica tridimensional, por ejemplo, en forma de un cultivo celular y/o tisular tridimensional o, respectivamente, de una agrupación de células.
El diámetro de la muestra biológica puede ser de por lo menos 50 micrómetros (|jm) en por lo menos una dirección espacial, más preferentemente de por lo menos 5o micrómetros en todas las direcciones espaciales, y a menudo es superior a 100 jm en todas las direcciones espaciales.
El diámetro de la muestra se encuentra preferentemente en el intervalo de 100 pm a 5 mm, de forma más preferida en el intervalo comprendido entre 100 pm y 1 mm. La muestra biológica es una muestra de células vivas, es decir, de células que presentan dinámica activa, es decir, de células que pueden desencadenar un movimiento.
Por detección de un movimiento en la muestra biológica se debe entender, en particular, un movimiento dentro de la muestra o un movimiento de un componente de muestra de la muestra biológica. En otras palabras, en general debería ser posible detectar fenómenos dinámicos en o, respectivamente, dentro de muestras biológicas con extensión espacial. En el caso de cultivos celulares de células musculares, estos movimientos pueden desencadenarse, por ejemplo, mediante la contracción de células musculares individuales.
Según la invención, la muestra biológica no puede ser una muestra de microorganismos que nadan libremente, por ejemplo esperma. En este caso, el procedimiento puede usarse para detectar el movimiento de los microorganismos que nadan libremente; en el caso de los espermatozoides, por ejemplo, para determinar la motilidad espermática.
La óptica puede comprender una óptica de iluminación dispuesta en el lado de iluminación, mediante la cual la radiación de la fuente de radiación lumínica se dirige a toda la muestra para iluminar la muestra de forma completa y lo más uniforme posible. La óptica también puede comprender una óptica de detección, mediante la cual la luz emitida por la muestra, que debido a la interacción con la muestra cambia su dirección de radiación, su estado de polarización y/o su patrón de difracción, se dirige a una superficie de detección del detector. Esta propiedad funcional de la óptica se puede implementar, a este respecto, utilizando uno o varios elementos constituyentes y componentes ópticos conocidos, dispuestos y configurados adecuadamente, tales como, por ejemplo, filtros, lentes, diafragmas, elementos refractivos, etc., lo que se explica a continuación con referencia a otros ejemplos de realización.
Una variante de forma de realización ventajosa prevé que la óptica esté configurada y/o el detector esté dispuesto con respecto a la trayectoria óptica de iluminación y a la muestra de tal manera que no existan trayectorias ópticas en las que la radiación de la fuente de radiación lumínica transmitida a través de la muestra incida en el detector y/o en las que la luz de la fuente de radiación lumínica incida en el detector eludiendo la muestra.
Según esta variante de forma de realización, por lo tanto, incide solo en el detector la luz de la fuente de radiación lumínica que ha cambiado su dirección de radiación, su estado de polarización y/o su patrón de difracción mediante interacción con la muestra, mientras que la óptica impide que la radiación de transmisión o la radiación que elude la muestra incida en la superficie de detección del detector. De esta forma, se reducen las señales de fondo perturbadoras y aumenta la sensibilidad de la medición.
Según la invención, se detecta un movimiento en la muestra por medio de un cambio en el patrón de difracción. Según esta variante, la fuente de radiación lumínica genera luz coherente. Además, la óptica está configurada, por ejemplo, mediante un filtro espacial, para representar una zona de borde de un patrón de difracción, que se genera mediante la luz de la fuente de radiación lumínica difractada por la muestra, en el detector. Un movimiento dentro de la muestra produce un cambio en el patrón de difracción, según la invención un patrón moteado. Investigaciones dentro del alcance de la invención han demostrado que el cambio del patrón de difracción en su centro es difícil de medir, dado que el cambio relativo de la intensidad de radiación es pequeño. Sin embargo, en la zona de borde el cambio se puede detectar de forma fiable y, por ejemplo, puede dar lugar a un cambio a corto plazo de un máximo de difracción local a un mínimo de difracción local o viceversa en el patrón de difracción. En un patrón de difracción, cada punto del patrón contiene la información de difracción de toda la muestra.
Según la invención, la óptica comprende un diafragma perforado que está dispuesto entre la muestra y el detector de tal manera que en la zona de borde del patrón de difracción generado por la muestra está dispuesto un orificio del diafragma perforado.
Por diafragma perforado se entiende una abertura en forma de orificio, preferentemente una abertura en forma de orificio pequeña y preferentemente sin lente. Los diafragmas perforados se utilizan para recoger la luz de forma delimitada localmente. Los lados frontales de fibras ópticas se utilizan desde hace mucho tiempo con el mismo fin, especialmente en microscopios confocales.
Todos los ángulos de observación en los que no se recibe luz transmitida deben considerarse preferentemente como zona de borde del patrón de difracción. El patrón de difracción está provocado por la interferencia positiva y negativa de ondas de luz que han sido difractadas por objetos, en este caso la muestra. El que se interfiera positivamente o negativamente depende del tamaño del objeto, la longitud de onda de la luz y el ángulo de observación. La luz que atraviesa la muestra sin interactuar, es decir, luz transmitida, fotones balísticos, tiene un ángulo de observación de 0° e incide en el centro del patrón de difracción. El patrón de difracción es eclipsado por la luz transmitida y la relación S/B (S/B:signal-to-background)y la relación S/N (S/N:signal-to-noise)disminuyen drásticamente. Por lo tanto, como zona de borde del patrón de difracción deben considerarse preferentemente todos los ángulos de observación en los que no se recibe luz transmitida. Dado que en este caso se irradia toda la muestra y la iluminación no se realiza de forma colimada, la "zona de recepción" de la radiación transmitida presenta un tamaño mayor que el de únicamente un punto.
Según otra variante de esta forma de realización, el diafragma perforado también puede presentar varios orificios, que están dispuestos con respecto al patrón de difracción de tal manera que se encuentran en una zona de borde del patrón de difracción. A este respecto, los orificios deben estar dispuestos de tal manera que la superposición de la radiación de difracción que incide en el detector a través de los orificios potencie el efecto de difracción y no lo empeore.
Según otra variante de la forma de realización, que detecta un movimiento en la muestra por medio de un cambio del patrón de difracción, la óptica puede comprender un diafragma dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra, que está diseñado de tal manera que la radiación de la fuente de radiación lumínica que sale a través de una abertura de diafragma del diafragma no incide en el orificio del diafragma perforado directamente, es decir, elude la muestra. Además, la óptica puede presentar un elemento óptico refractivo dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra, es decir, un elemento que refracta la radiación, por ejemplo una lente convexa o un prisma, que está diseñado de tal manera que la radiación desviada por el elemento refractivo no incide en el orificio del diafragma perforado directamente, es decir, elude la muestra. Estas variantes representan un ejemplo rentable y fácil de ajustar de una óptica que solo dirige la radiación difractada al orificio del diafragma perforado.
Según una forma de realización que no es conforme a la invención, se detecta un movimiento en la muestra por medio de una fluctuación de luz polarizada provocada por el movimiento. Según esta forma de realización, la óptica comprende un primer filtro de polarización y un segundo filtro de polarización que presentan diferentes direcciones de polarización, en la que el primer filtro de polarización está dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra y el segundo filtro de polarización está dispuesto entre la muestra y el detector. Un movimiento en la muestra provoca un cambio en la interacción de la luz polarizada con la muestra y un cambio de los estados de polarización, lo que da como resultado una fluctuación en la señal del detector.
En este caso, el detector y el segundo filtro de polarización pueden estar dispuestos con respecto a la fuente de radiación lumínica en el lado opuesto de la muestra, lateralmente a la muestra o en el mismo lado que la fuente de radiación lumínica.
Según otra forma de realización que no es conforme a la invención, se detecta un movimiento en la muestra por medio de una fluctuación de la luz dispersada en la muestra provocada por el movimiento. En este caso, el detector puede estar dispuesto en el mismo lado de la muestra (1) que la fuente de radiación lumínica para la epidetección de luz dispersada por la muestra. Alternativamente, el detector para detectar la radiación dispersada lateral de la muestra puede estar dispuesto de forma inclinada con respecto a la dirección de la trayectoria óptica de iluminación y/o lateralmente a la muestra.
Estas variantes que no son según la invención ofrecen la ventaja de que son necesarios componentes ópticos tales como, por ejemplo, diafragmas para evitar que la radiación de transmisión incida en el detector.
Además, el detector para la detección de luz transmitida de la luz dispersada por la muestra puede estar dispuesto en la dirección de la luz transmitida a la muestra. Según esta variante, la óptica comprende un diafragma dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra, que está configurado para bloquear la radiación lumínica en la trayectoria óptica de iluminación que incidiría en el detector como radiación transmitida a través de la muestra. Como alternativa o adicionalmente, la óptica puede comprender un elemento óptico refractivo dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra, que está diseñado para cambiar la dirección de la trayectoria óptica de iluminación de modo que la radiación lumínica transmitida a través de la muestra no incida en el detector.
Además, es ventajoso que la óptica presente un filtro paso banda, que está dispuesto delante del detector y está configurado para suprimir la luz ambiental. De este modo, se puede aumentar aún más la sensibilidad de la detección.
Según otra variante ventajosa, la óptica, en particular la óptica de iluminación, comprende un axicón. El uso de un axicón ofrece la ventaja de una iluminación más homogénea de muestras espacialmente "profundas" en comparación con lentes convexas, ya que el foco de un axicón se extiende a lo largo del eje óptico, en lugar de solo en un punto. Otra ventaja de un axicón es el sencillo filtrado espacial de la luz irradiada (no afectada), ya que se refracta con un ángulo constante con respecto al eje óptico.
Una posibilidad de implementación según la invención prevé que la muestra pueda encontrarse sobre una matriz de soporte. Por tanto, el alojamiento para la muestra puede incluir una matriz de soporte, preferentemente un biopolímero. La muestra también puede encontrarse en una gota colgante. Por tanto, el alojamiento de la muestra puede comprender una gota colgante. Además, el alojamiento de la muestra puede estar diseñado como una matriz de soporte que se encuentra en una gota colgante, preferentemente un biopolímero tal como, por ejemplo, alginato.
Para la aplicación del procedimiento en entornos de detección, el alojamiento para la muestra puede ser un pocillo de una placa multipocillo (placa de microvaloración). Además, el alojamiento puede ser un pocillo de una placa multipocillo que está configurado para formar una gota colgante en los pocillos individuales (la denominada placa multipocillo de gotas colgantes). Estas placas multipocillo de gotas colgantes se comercializan, por ejemplo, por la empresa InspheroAG, CH-8952 Schlieren, con la denominación "GravityPLUS™ 3D Culture and Assay Platform". También el documento de patente EP 2342317 B1 divulga una placa de este tipo.
Ya se mencionó anteriormente que el procedimiento es especialmente adecuado para la supervisión en paralelo de una pluralidad de muestras, por ejemplo de muestras que se examinarán en el marco de procedimientos automatizados de alto rendimiento.
Por lo tanto, un desarrollo ventajoso del procedimiento prevé que con el mismo se lleve a cabo una detección óptica en paralelo de un movimiento en varias muestras biológicas separadas entre sí. En este caso, el alojamiento para las muestras biológicas es preferentemente una placa multipocillo que presenta una pluralidad de pocillos dispuestos en filas y columnas para alojar las muestras. El detector está configurado como una matriz de detectores, preferentemente como una matriz de fotodiodos, correspondiendo una distancia entre cuadrículas de los detectores individuales a una distancia entre cuadrículas de los pocillos de la placa multipocillo.
La fuente de radiación lumínica está diseñada para iluminar los pocillos individuales. Según una variante ventajosa, la fuente de radiación lumínica para iluminar las muestras en los pocillos está diseñada como una matriz de diodos láser, correspondiendo una distancia entre cuadrículas de los distintos diodos láser a la distancia entre cuadrículas de los pocillos de la placa multipocillo. Una matriz de diodos láser representa una fuente de iluminación que ahorra espacio y ahorra energía.
Para posibilitar una buena disipación del calor, el soporte para la matriz de diodos láser puede estar fabricada de un material conductor del calor, preferentemente aluminio. Además, la óptica según esta variante puede comprender una matriz de lentes, por ejemplo una matriz de microlentes, estando asociada cada lente de la matriz de lentes con uno de los diodos láser, y las lentes dirigen la luz de los diodos láser a los pocillos.
En lugar de una matriz de diodos láser como fuente de radiación lumínica, la fuente de radiación lumínica puede estar diseñada como una fuente de luz convencional (láser, lámpara de arco, etc.), acoplándose la luz de la fuente de radiación lumínica para iluminar las muestras a través de un haz de fibra óptica a los pocillos individuales que contienen las muestras. Cada fibra óptica está asignada a un pocillo. Esto ofrece la ventaja de que la fuente de luz puede operar a una distancia suficiente de la muestra como para evitar una acumulación excesiva de calor en las proximidades de la muestra.
Además, según otra variante alternativa, existe la posibilidad de iluminar de forma plana la placa multipocillo con una fuente de radiación lumínica, lo que representa una variante de forma de realización sencilla pero que tiene desventajas en términos de eficacia energética, ya que la fuente de radiación lumínica debe ser correspondientemente potente. En este caso es ventajoso que la luz se paralelice y se direccione de forma específica a los pocillos a través de una óptica de condensador diseñada adecuadamente y, dado el caso, filtros de transmisión dependientes del ángulo.
Según otro aspecto de la invención, que no es conforme a la invención, está previsto un dispositivo para la detecciónin vitrosin contacto de un movimiento en una muestra biológica con extensión espacial. El dispositivo comprende un alojamiento para la muestra biológica, una fuente de radiación lumínica, un detector y una óptica que está configurada para iluminar toda la muestra presente en el alojamiento con radiación que parte de la fuente de radiación lumínica y para dirigir por lo menos parte de la radiación de la fuente de radiación lumínica que ha cambiado su dirección de radiación, su estado de polarización y/o su patrón de difracción en cualquier lugar dentro de la muestra mediante interacción con la muestra a una superficie de detección del detector. El detector está configurado para generar en función de la radiación detectada una señal de medición, que indica la evolución temporal de la intensidad de la radiación detectada y/o de la cual se puede derivar la evolución temporal de la intensidad de la radiación detectada.
El dispositivo también puede presentar una unidad de evaluación que esté configurada para detectar un movimiento en la muestra biológica mediante la detección y/o la evaluación de un cambio temporal en la radiación detectada.
Más detalles y ventajas de la invención se describen a continuación con referencia a las figuras adjuntas. Estas muestran:
Figura 1: una representación muy esquemática de un procedimiento no según la invención y de un dispositivo no según la invención según una forma de realización;
Figuras 2A-2E: formas de realización no según la invención que utilizan luz dispersada por la muestra para la detección de movimiento;
Figuras 3A-3C: formas de realización no según la invención que utilizan luz polarizada para la detección de movimiento;
Figuras 4A-4C: formas de realización de la invención que utilizan un patrón de difracción de la muestra para la detección de movimiento;
Figura 5A: una muestra en forma de modelo de tejido de miocardio sobre una matriz de soporte;
Figura 5B: representación de un patrón moteado en dos puntos temporales consecutivos; y
Figura 5C: una evolución temporal de una señal de medición a modo de ejemplo.
Las partes idénticas están provistas en las figuras de los mismos símbolos de referencia y no se describen por separado.
La figura 1 muestra una representación muy esquematizada de un procedimiento no según la invención y de un dispositivo no según la invención.
Para llevar a cabo el procedimiento está previsto un dispositivo 100 para la detección ópticain vitrode un movimiento en una muestra biológica 1 con extensión espacial.
El dispositivo 100 comprende un alojamiento (no mostrado) para la muestra tridimensional 1, una fuente de radiación lumínica 6, una óptica 7, 8 y un detector 2.
El alojamiento no se limita a un tipo específico de alojamientos, sino que puede estar configurado según la aplicación y el tipo de muestra, por ejemplo, como soporte, placa de soporte, como recipiente, como pocillo de una placa multipocillo o como matriz de soporte en forma de biopolímero, por ejemplo alginato, sobre el que se cultiva la muestra.
La fuente de luz 6 puede, pero no tiene por qué ser, una fuente de luz coherente, por ejemplo un láser. Únicamente las variantes de realización que utilizan un patrón de difracción de la muestra para la detección de movimiento (véanse las figuras 4A a 4C, 5a a 5C) requieren una radiación coherente.
La representación de la óptica 7, 8 en la figura 1 es únicamente esquemática y tiene como objetivo ilustrar la propiedad funcional de la óptica, no representar determinados elementos ópticos, ya que en principio son posibles una pluralidad de variantes de realización ópticas concretas, algunas de las cuales se describen a modo de ejemplo en las figuras siguientes.
Esta propiedad funcional de la óptica se puede implementar, a este respecto, utilizando uno o más elementos constituyentes y componentes ópticos conocidos, dispuestos y configurados apropiadamente, tales como, por ejemplo, filtros, lentes, diafragmas, elementos refractivos, etc.
La óptica 7, 8 comprende una óptica de iluminación 7 dispuesta en el lado de iluminación, mediante la cual la radiación 10 de la fuente de radiación lumínica 6 se dirige a toda la muestra 1 para iluminar la muestra de una forma completa y lo más uniforme posible. Para ello, la óptica de iluminación puede comprender elementos o, respectivamente, componentes ópticos adecuados para la formación de la radiación, tales como diafragmas, lentes y/o filtros. Es especialmente ventajoso el uso de un axicón.
La óptica 7, 8 también comprende una óptica de detección 8, mediante la cual la luz 11 emitida por la muestra, es decir, la luz de la fuente de radiación lumínica 6 que debido a la interacción con la muestra 1 ha cambiado su dirección de radiación, su estado de polarización y/o patrón de difracción, se dirige a una superficie de detección 2a del detector 2. La figura 1 representa, por ejemplo, un proceso de dispersión en el punto P1, en el que la luz 11 se dispersa en dirección al detector 2 y se representa en el detector 2 mediante la óptica de detección 8. Dado que toda la muestra 1 está iluminada uniformemente, la interacción de la luz incidente 10 puede tener lugar en cualquier punto dentro de la muestra 1, de modo que las interacciones de la luz con la muestra se miden de forma acumulativa por el detector 2 a lo largo de todo su recorrido a través de la muestra.
La óptica de detección 8 también puede contener elementos ópticos que garanticen que la luz que no ha cambiado su dirección de radiación, su estado de polarización y/o patrón de difracción mediante interacción con la muestra no incida en el detector 2. La óptica de detección 8 puede presentar, por ejemplo, un filtro paso banda, que está dispuesto delante de la entrada del detector y que filtra o suprime la luz ambiental, pero deja pasar luz con una longitud de onda de la fuente de radiación lumínica 6. Esto presupone que se utilice una fuente de radiación lumínica monocromática o que en la salida de la fuente de radiación lumínica esté dispuesto un filtro correspondiente para iluminar la muestra solo con una determinada longitud de onda de luz.
Además, la óptica de detección 8 puede bloquear, mediante diafragmas, lentes, etc., trayectorias ópticas en las que la radiación de la fuente de radiación lumínica 6 transmitida a través de la muestra 1 incidiría en el detector y/o en las que la luz de la fuente de radiación lumínica 6 incidiría en el detector 2 eludiendo la muestra.
Adicionalmente o como alternativa, el detector también puede estar dispuesto de tal manera que ninguna luz transmitida 12 incida en su superficie de detector 2a, por ejemplo mediante la disposición lateral del detector 2 con respecto a la trayectoria óptica de iluminación 10, tal como se ilustra en la figura 1.
El detector 2 está configurado para generar en función de la radiación 11 detectada una señal de medición 9, cuya evolución temporal indica una evolución temporal de una intensidad de la radiación 11 detectada.
La señal del detector 9 corresponde, por lo tanto, a una medición de volumen (en inglés:full-volume measurement)de la muestra. Según la invención, el detector 2 es un detector no formador de imágenes o un detector con una señal de medición no resuelta espacialmente, preferentemente monocanal, de modo que solo se genera una magnitud de medición 9 que corresponde a la fluctuación de la intensidad de la luz registrada por el detector por unidad de tiempo. El detector 2 es, por ejemplo, un fotodiodo convencional 2.
Con el dispositivo 100 representado en la figura 1 se ilumina la muestra 1 y se evalúa la señal de medición 9 correspondiente.
Si tiene lugar un movimiento en la muestra 1, por ejemplo una contracción en el caso de tejido muscular cultivado, entonces la interacción de la muestra 1 con la luz que incide en la muestra también cambia debido al movimiento producido en la muestra, es decir, la proporción de luz 11 que incide en la muestra que cambia su dirección de radiación, su estado de polarización y/o según la invención su patrón de difracción como resultado de una interacción con la muestra 1, se modifica y produce un cambio en la señal del detector 9. Según el procedimiento, mediante la fluctuación de la señal del detector 9 se puede detectar, por lo tanto, un movimiento en la muestra biológica.
A continuación, se describen algunas formas de realización a modo de ejemplo de la invención, que representan configuraciones específicas del enfoque representado en la figura 1. La fuente de radiación lumínica 6 no está representada en las figuras 2A a 3C, sino que se encuentra encima de la disposición de óptica y detector representada, visible desde la trayectoria óptica 10.
Las figuras 2A a 2E muestran unas formas de realización no según la invención que utilizan luz dispersada por la muestra para la detección de movimiento. En las figuras 2A y 2B, el detector 2 para la detección de luz transmitida de la luz dispersada 11 por la muestra 2 está dispuesto en la dirección de luz transmitida a la muestra 1. Para evitar que la radiación transmitida a través de la muestra 2 incida en el detector 2, en la figura 1 está dispuesto un diafragma 3 que bloquea la radiación lumínica que incidiría como radiación transmitida a través de la muestra en el detector 2 o que puede incidir lateralmente en el detector eludiendo la muestra. Por lo tanto, la óptica de iluminación en forma de diafragma 3 solo permite la radiación 12 transmitida a través de la muestra que no incida en el detector 12.
La particularidad de la variante de forma de realización representada en la figura 2B es que en lugar de un diafragma 3 grande se utiliza un diafragma 3 más pequeño, que está dispuesto posteriormente a un elemento óptico refractivo, por ejemplo una lente, un axicón, etc., que modifica la dirección de la trayectoria óptica de iluminación 10 que pasa a través del diafragma 3 de tal manera que la radiación 12 transmitida a través de la muestra 2 no pueda incidir en el detector 2.
La particularidad de la variante de forma de realización mostrada en la figura 2C es que el detector 2 para la epidetección de luz dispersada en forma de radiación de reflexión de la muestra 1 está dispuesto en el mismo lado de la muestra 1 que la fuente de radiación lumínica 6, estando orientada la superficie del detector 2a a su vez hacia la muestra 2. Esto ofrece la ventaja de que no se requiere ningún diafragma para bloquear la luz transmitida. Sin embargo, en el presente caso está previsto un diafragma que rodea el detector 2, con el que se puede reducir la influencia de influjos lumínicos perturbadores.
La particularidad de las variantes de formas realización representadas en las figuras 2D y 2E es que se detecta la luz dispersada lateral 11. Para ello, el detector 2 está dispuesto lateralmente a la dirección de iluminación. En la figura 2D, está dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra 1 un elemento óptico refractivo, por ejemplo una lente o prisma 4, que cambia la dirección de la trayectoria óptica de tal manera que la luz de la trayectoria óptica de iluminación 10 no puede incidir en el detector 2 directamente, es decir, eludiendo la muestra 1.
La variante de forma de realización representada en la figura 2E se diferencia de la variante de la figura 2E en que en lugar del elemento óptico refractivo 4 se utiliza un diafragma 3a que presenta una abertura para estrechar la trayectoria óptica 10, de tal manera que de nuevo no puede incidir luz de la trayectoria óptica de iluminación 10 en el detector 2 directamente, es decir, eludiendo la muestra 1.
Las figuras 3A a 3C muestran formas de realización no según la invención que utilizan luz polarizada para la detección de movimiento. Para ello, la óptica de iluminación comprende un primer filtro de polarización 5a, que está dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra 1. La óptica de detección comprende un segundo filtro de polarización 5b, que presenta una dirección de polarización diferente en comparación con el primer filtro de polarización 5a y está dispuesto entre la muestra 1 y el detector 2, preferentemente en la entrada del detector.
El detector 2 y el segundo filtro de polarización 5b pueden estar dispuestos con respecto a la fuente de radiación lumínica en el lado opuesto de la muestra 1, lateralmente con respecto a la muestra 1 o en el mismo lado que la fuente de radiación lumínica, lo que está representado por las diferentes variantes de las figuras 3A a 3C.
Debido a la diferente dirección de polarización de los dos filtros de polarización 5a y 5b, el filtro de polarización 5b solo deja pasar luz que se ha "despolarizado" mediante interacción con la muestra. La disposición de los dos filtros de polarización 5a y 5b garantiza así que no se detecte luz transmitida a través de la muestra o luz que haya eludido la muestra.
Un movimiento en la muestra modifica la proporción de luz despolarizada y da lugar a una fluctuación en la señal del detector, de modo que un movimiento en la muestra 1 puede detectarse a su vez directamente por medio de la fluctuación de la señal del detector.
Para reducir los efectos de luz dispersada puede estar dispuesto antes del primer filtro de polarización 5a un elemento óptico refractivo 4, por ejemplo una lente convexa o un prisma, que enfoca la trayectoria óptica de iluminación 10 sobre la muestra (figuras 3A y 3C).
En la variante de forma de realización de la figura 3B, el detector 2 para la epidetección de luz dispersada en forma de radiación de reflexión de la muestra 1 está dispuesto en el mismo lado de la muestra 1 que la fuente de radiación lumínica 6. En este caso puede estar previsto un diafragma 3 que rodee el detector 2, que puede reducir la influencia de influjos lumínicos perturbadores.
Las figuras 4A a 4C muestran formas de realización de la invención que utilizan un patrón de difracción de la muestra en forma de un patrón moteado para la detección de movimiento. La fuente de luz 6 es una fuente de luz coherente, por ejemplo un diodo láser. La luz de la fuente de radiación lumínica 6 difractada en la muestra produce un patrón de difracción con un centro Z de alta intensidad y una región de borde R de baja intensidad.
La óptica de detección comprende un diafragma perforado 3b dispuesto delante del detector 2, que está dispuesto entre la muestra 1 y el detector 2 de tal manera que un orificio 3c del diafragma perforado 3b esté dispuesto en la región de borde R del patrón de difracción generado por la muestra.
Según la variante de la figura 4A, la óptica de iluminación comprende un diafragma 3a dispuesto entre la fuente de radiación lumínica y la muestra, que está diseñado de tal manera que la radiación de la fuente de radiación lumínica 6 que sale a través de una abertura de diafragma 3d del diafragma 3a no incide directamente en el orificio 3c del diafragma perforado 3b.
Según las variantes de las figuras 4B y 4C, la óptica de iluminación comprende un elemento óptico refractivo 4a dispuesto entre la fuente de radiación lumínica 6 y la muestra 1, por ejemplo una lente convexa, que está diseñado de tal manera que la radiación difractada por el elemento óptico refractivo 4a no incide en el orificio 3c del diafragma perforado 3b directamente, es decir, eludiendo la muestra.
En la variante de la figura 4C, entre la muestra 1 y el diafragma perforado 3b también está dispuesto un filtro paso banda 13, que filtra la luz ambiental que no se corresponde con la longitud de onda de la fuente de radiación lumínica 6. Con la estructura mostrada en la figura 4C, los latidos del músculo cardiaco actualmente se pueden detectar con una sensibilidad comparable a la observación visual (en el microscopio).
La figura 5A muestra a modo de ejemplo una muestra 1 en forma de una agrupación de células. La agrupación de células se encuentra en una gota colgante, de la que solo se puede observar una parte en la figura 5A, formada en un pocillo de una placa de multivaloración de gotas colgantes. La muestra consiste en un modelo de tejido de músculo cardiaco diferenciado a partir de células madre, que está adherido a perlas de soporte 15 en forma de alginato. La muestra que se muestra en la figura 5A tiene aproximadamente 1 milímetro de diámetro.
La muestra 1 se ilumina completamente con un diodo láser con luz de longitud de onda de 650 nm. La muestra 1, que está estructurada en diferentes escalas de tamaño, difracta la luz coherente de diversas maneras y genera un patrón de difracción complejo (denominado "patrón moteado") en la dirección de la luz transmitida. Las ligeras deformaciones de estas estructuras en el tejido provocadas por las contracciones locales del músculo cardiaco provocan un cambio en todo el patrón moteado.
La figura 5B muestra a modo de ejemplo las imágenes 17a y 17b, que muestran dos estados diferentes de un patrón moteado con una desviación mínima y máxima de la contracción. Las imágenes 17a y 17b se presentan solo con fines de mayor claridad, pertenecen a un experimento diferente y no muestran el patrón moteado de la muestra 1 de la figura 5A. Sin embargo, el principio de medición es el mismo. A través de un filtro espacial, por ejemplo, a través del diafragma perforado 3b se representa un punto en la zona de borde R del patrón de difracción 17a, 17b en el detector 2. La modificación del patrón 17a, 17b da lugar ahora a una cantidad de luz fluctuante que se deja pasar a través del diafragma perforado 3b y, por tanto, a una señal de detector 9 fluctuante, que se representa en la figura 5C. La fluctuación periódica de la señal 9 corresponde a las contracciones periódicas del tejido muscular. La ilustración de la figura 5C se presenta solo con fines de mayor claridad, pero tampoco muestra ninguna señal de medición medida durante la iluminación de la muestra mostrada en la figura 1A.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a determinados ejemplos de realización, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversos cambios y pueden utilizarse equivalentes de forma sustitutiva sin apartarse del alcance de la invención. Además, se pueden realizar muchas modificaciones sin abandonar el sector asociado. Por consiguiente, la invención no debería limitarse a las formas de realización divulgadas, sino que debería incluir todas las formas de realización que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención también reivindica protección para el objeto de las reivindicaciones dependientes independientemente de las reivindicaciones a las que se haga referencia.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de detección ópticain vitrode un movimiento en una muestra (1) biológica con extensión espacial en forma de un cultivo celular y/o tisular tridimensional o de una agrupación de células, en el que la muestra (1) presenta unas células musculares vivas, que comprende las etapas siguientes:
a) proporcionar un alojamiento para la muestra (1), una fuente de radiación lumínica (6), una óptica (7, 8) y un detector (2),
a1)en el que la fuente de radiación lumínica (6) genera una luz coherente;
a2)en el que la óptica (7, 8) está configurada para iluminar toda la muestra (1) en el alojamiento con una radiación que parte de la fuente de radiación lumínica (6) y para dirigir por lo menos una parte de la radiación (11) de la fuente de radiación lumínica (6), que se modifica en su patrón de difracción en cualquier punto dentro de la muestra (1) mediante una interacción con la muestra (1) sobre una superficie de detección (2a) del detector (2), y
a3)en el que el detector (2) está configurado para generar en función de la radiación detectada una señal de medición (9), cuya evolución temporal indica una evolución temporal de una intensidad de la radiación detectada (11) y/o a partir de la cual se puede derivar la evolución temporal de la intensidad de la radiación detectada (11);
a4)en el que el detector (2) es un detector no formador de imágenes o un detector con una señal de medición no resuelta espacialmente;
a5)en el que la óptica (7, 8) está configurada para representar en el detector (2) una zona de borde de un patrón moteado generado por la luz de la fuente de radiación lumínica (6) difractada por la muestra (1); y
a6)en el que la óptica (7, 8) comprende un diafragma perforado (3b), que está dispuesto entre la muestra (1) y el detector (2) de tal manera que un orificio (3c) del diafragma perforado (3b) está dispuesto en la zona de borde (R) del patrón moteado generado por la muestra;
b) iluminar la muestra (1) con radiación de la fuente de radiación lumínica (6); y
c) detectar un movimiento en la muestra biológica (1) en función de un cambio temporal de la señal de medición (9);
en el que se detecta un movimiento en la muestra (1), si un cambio temporal de la señal de medición (9) presenta una periodicidad,
en el que una fluctuación periódica de la señal de medición (9) corresponde a unas contracciones periódicas de las células musculares.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que un diámetro de la muestra (1)
a) tiene por lo menos 50 micrómetros (pm) en por lo menos una dirección espacial, o
b) se encuentra en un intervalo comprendido entre 100 pm y 1 mm.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que
a) el detector (2) emite una señal de medición monocanal (9); y/o
b) el detector (2) es un fotodiodo.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la óptica (7, 8) está configurada y/o el detector (2) está dispuesto con respecto a la trayectoria óptica de iluminación (10) y a la muestra (1), de tal manera que no existan trayectorias ópticas, en las que la radiación (12) de la fuente de radiación lumínica (6) transmitida a través de la muestra (1) incida en el detector (2) y/o en las que luz de la fuente de radiación lumínica (6) incida en el detector eludiendo la muestra (1).
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la óptica (7, 8) comprende: a) un diafragma (3a) dispuesto entre la fuente de radiación lumínica (6) y la muestra (1) que está realizado, de tal manera que una radiación de la fuente de radiación lumínica (6) que sale a través de una abertura de diafragma (3d) del diafragma (3a) no incida directamente en el orificio (3c) del diafragma perforado (3b), y/o b) un elemento óptico refractivo (4a) dispuesto entre la fuente de radiación lumínica (6) y la muestra (1), que está realizado de tal manera que la radiación difractada por el elemento refractivo (4a) no incida directamente en el orificio (3c) del diafragma perforado (3b).
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la óptica (7, 8) presenta un filtro paso banda (13) dispuesto antes del detector (2), que está configurado para suprimir la luz ambiente.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el alojamiento para la muestra comprende una matriz de soporte, preferentemente un biopolímero (15).
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