JPH0623749B2 - 毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法 - Google Patents
毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法Info
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- JPH0623749B2 JPH0623749B2 JP5216286A JP5216286A JPH0623749B2 JP H0623749 B2 JPH0623749 B2 JP H0623749B2 JP 5216286 A JP5216286 A JP 5216286A JP 5216286 A JP5216286 A JP 5216286A JP H0623749 B2 JPH0623749 B2 JP H0623749B2
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- light
- cytochrome
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/631—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited using photolysis and investigating photolysed fragments
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、毒素、薬剤に起因する細胞損傷を測定する方
法に関する。より詳細には、本発明は、毒素、薬剤に起
因する生体細胞の特定部位の損傷を、分光学的に検知す
ることにより測定する方法に関する。
法に関する。より詳細には、本発明は、毒素、薬剤に起
因する生体細胞の特定部位の損傷を、分光学的に検知す
ることにより測定する方法に関する。
従来の技術 現在、ガンの化学的治療に用いられている制ガン剤は、
ガン細胞のみならず正常な細胞をも損傷する。また、Ｃ
Cl４のような毒物、あるいはあえて毒物と分類されてい
ない薬物であっても体内に蓄積されて正常細胞を損傷す
ることがある。
ガン細胞のみならず正常な細胞をも損傷する。また、Ｃ
Cl４のような毒物、あるいはあえて毒物と分類されてい
ない薬物であっても体内に蓄積されて正常細胞を損傷す
ることがある。
従来、このような細胞損傷の測定は極めて初等的な方法
に依って行われていた。すなわち、例えば、顕微鏡下で
一定時間内に形態学的に死んだ細胞の数を数えるとか、
あるいは、螢光色素トリパンブルー等を細胞に摂取させ
て、この色素を排泄できない死んだ細胞の数を数える等
の方法に依っていた。
に依って行われていた。すなわち、例えば、顕微鏡下で
一定時間内に形態学的に死んだ細胞の数を数えるとか、
あるいは、螢光色素トリパンブルー等を細胞に摂取させ
て、この色素を排泄できない死んだ細胞の数を数える等
の方法に依っていた。
しかしながら、これらの初等的方法は、制ガン剤等の薬
剤又は毒素の作用部位に的を絞った直接測定法ではな
く、全体としての細胞の生死を不明瞭な基準で扱ってい
るに過ぎない。また、これらの測定に要する労力、時間
も多大なものである。
剤又は毒素の作用部位に的を絞った直接測定法ではな
く、全体としての細胞の生死を不明瞭な基準で扱ってい
るに過ぎない。また、これらの測定に要する労力、時間
も多大なものである。
また、このような全体としての細胞の生死を判定するの
ではなく、細胞活性のより直接的な指標として蛋白質の
活性を測定する方法も知られている。しかし、従来の蛋
白質活性の測定方法は、組織をすりつぶし、濾過し、吸
着カラムで分画する等の複雑な手順によって蛋白質を精
製した後、分光学的方法、例えばチトクロームオキシダ
ーゼについていえば、チトクロームオキシダーゼが還元
形チトクロームＣを酸化するという性質を利用して、還
元形チトクロームＣの吸収の減少を測定するという方法
等に依っていた。
ではなく、細胞活性のより直接的な指標として蛋白質の
活性を測定する方法も知られている。しかし、従来の蛋
白質活性の測定方法は、組織をすりつぶし、濾過し、吸
着カラムで分画する等の複雑な手順によって蛋白質を精
製した後、分光学的方法、例えばチトクロームオキシダ
ーゼについていえば、チトクロームオキシダーゼが還元
形チトクロームＣを酸化するという性質を利用して、還
元形チトクロームＣの吸収の減少を測定するという方法
等に依っていた。
しかし、これらの方法は、蛋白質の精製操作が複雑でか
つ時間がかかり過ぎるという欠点があった。
つ時間がかかり過ぎるという欠点があった。
発明が解決しようとする問題点 以上述べたように、制ガン剤等の薬剤並びに毒物による
正常細胞の損傷を評価するための従来の方法は間接的か
つ不明瞭な基準での扱いしかできないか、もしくは複雑
かつ熟練を要する蛋白質の分離精製操作を必要としてい
た。
正常細胞の損傷を評価するための従来の方法は間接的か
つ不明瞭な基準での扱いしかできないか、もしくは複雑
かつ熟練を要する蛋白質の分離精製操作を必要としてい
た。
このような情況の下で、各種毒素、薬剤が細胞のいずれ
の部位にどの程度の損傷を与えたかを、細胞全体として
の生死というあいまいな基準ではなく、より直接的な蛋
白質の活性を基準として経時的、定量的に、かつ簡便に
測定できる方法を開発し、例えば制ガン剤が細胞の各部
に異なった損傷を与えながら作用してゆく様子を的確に
認識し、治療中の患者に最良の治療を施し、副作用等の
発現を最小限度に抑える上で極めて重要である。これは
また、制ガン剤の種類によって作用する部位が異なるこ
とからも重要である。
の部位にどの程度の損傷を与えたかを、細胞全体として
の生死というあいまいな基準ではなく、より直接的な蛋
白質の活性を基準として経時的、定量的に、かつ簡便に
測定できる方法を開発し、例えば制ガン剤が細胞の各部
に異なった損傷を与えながら作用してゆく様子を的確に
認識し、治療中の患者に最良の治療を施し、副作用等の
発現を最小限度に抑える上で極めて重要である。これは
また、制ガン剤の種類によって作用する部位が異なるこ
とからも重要である。
本発明の目的も上記のような優れた効果を奏する新規な
細胞損傷の検査方法を提供することにある。
細胞損傷の検査方法を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明者は、毒素、薬剤に起因する生体細胞の特定部位
の損傷を、当該部位における蛋白質の回転運動性をレー
ザー・フラッシュ・ホトリシス法で測定することがより
直接的な蛋白質の活性を基準とした細胞損傷の検査方法
として極めて有効であることを見出した。
の損傷を、当該部位における蛋白質の回転運動性をレー
ザー・フラッシュ・ホトリシス法で測定することがより
直接的な蛋白質の活性を基準とした細胞損傷の検査方法
として極めて有効であることを見出した。
即ち、本発明の方法は、毒素、薬剤が投与または摂取さ
れた被検体の特定部位の細胞または組織を採取し、該細
胞または組織に含まれる蛋白質にＣＯガスを選択的に吸
着させ、これに鉛直線偏光したレーザー・フラッシュ光
を照射して励起させ、その際の特定波長光の吸光度の変
化を追跡することにより、該蛋白質の回転運動性を測定
することを特徴とする。
れた被検体の特定部位の細胞または組織を採取し、該細
胞または組織に含まれる蛋白質にＣＯガスを選択的に吸
着させ、これに鉛直線偏光したレーザー・フラッシュ光
を照射して励起させ、その際の特定波長光の吸光度の変
化を追跡することにより、該蛋白質の回転運動性を測定
することを特徴とする。
本発明において、毒素、薬剤により損傷を受ける生体細
胞の特定部位とは特にミトコンドリアおよびミクロゾー
ムが考えられ、従って回転運動性を判断するための蛋白
質は夫々チトクローム・オキシダーゼおよびチトクロー
ムＰ-450である。
胞の特定部位とは特にミトコンドリアおよびミクロゾー
ムが考えられ、従って回転運動性を判断するための蛋白
質は夫々チトクローム・オキシダーゼおよびチトクロー
ムＰ-450である。
本発明の分光学的測定法はレーザー・フラッシュ・ホト
リシス法（微粒子回転測定法）といい、本発明者により
開発された技術である。この方法は、ミクロゾームある
いはミトコンドリアに一酸化炭素（ＣＯ）を通気して、
膜蛋白であるチトクロームにＣＯを選択的に吸着させ
て、ラベルした後、該チトクローム・ＣＯコンプレック
スに鉛直線偏光したレーザー・フラッシュを照射して励
起させ、その際に光解離によってＣＯがはずれた解離チ
トクローム分子の吸光度の変化を測定することからな
る。
リシス法（微粒子回転測定法）といい、本発明者により
開発された技術である。この方法は、ミクロゾームある
いはミトコンドリアに一酸化炭素（ＣＯ）を通気して、
膜蛋白であるチトクロームにＣＯを選択的に吸着させ
て、ラベルした後、該チトクローム・ＣＯコンプレック
スに鉛直線偏光したレーザー・フラッシュを照射して励
起させ、その際に光解離によってＣＯがはずれた解離チ
トクローム分子の吸光度の変化を測定することからな
る。
すなわち、鉛直線偏光したレーザー・フラッシュの照射
によってＣＯが解離した分子は、励起直後には鉛直方向
に揃っているが、時間の経過と共に再び運動を始める。
その際の水平、鉛直方向の吸光度変化の時間依存性（緩
和時間）によってチトクローム分子の運動性を測定する
ものである。
によってＣＯが解離した分子は、励起直後には鉛直方向
に揃っているが、時間の経過と共に再び運動を始める。
その際の水平、鉛直方向の吸光度変化の時間依存性（緩
和時間）によってチトクローム分子の運動性を測定する
ものである。
添付第１図に、本発明の方法を実施するのに有用なレー
ザー・フラッシュ・ホトリシス用装置を概略的に示し
た。以下第１図に沿って、本発明の方法を更に詳しく説
明する。
ザー・フラッシュ・ホトリシス用装置を概略的に示し
た。以下第１図に沿って、本発明の方法を更に詳しく説
明する。
第１図において、サンプル10は、図示していないサンプ
ル台に置かれる。一方、タングステンハロゲンランプ12
が、図示しない集光手段により集光された光をサンプル
台上のサンプル10に照射するように配置されている。ま
た、例えばＮｄ／ＹＡＧレーザ発振器14が、特定波長の
垂直偏光パルス（パルス巾約10nsec）を同様にサンプル
台上のサンプル10に照射するように配置されている。
ル台に置かれる。一方、タングステンハロゲンランプ12
が、図示しない集光手段により集光された光をサンプル
台上のサンプル10に照射するように配置されている。ま
た、例えばＮｄ／ＹＡＧレーザ発振器14が、特定波長の
垂直偏光パルス（パルス巾約10nsec）を同様にサンプル
台上のサンプル10に照射するように配置されている。
この状態で、サンプル台上のサンプル10には連続的にラ
ンプ12からの光が照射され、一方一定の時間々隔でレー
ザー・フラッシュが照射される。サンプル10からの透過
光の一部が、図示しない集光手段により集光されて、特
定波長の光のみ透過するように調製されたモノクロメー
タ16に入射される。このモノクロメータ16を透過した光
は、プリズム偏光ビームスプリッタ18に入射され、この
偏光ビームスプリッタ18で分けられた水平偏光と垂直偏
光とは、それぞれ光電子増倍管20及び22に入射される。
ンプ12からの光が照射され、一方一定の時間々隔でレー
ザー・フラッシュが照射される。サンプル10からの透過
光の一部が、図示しない集光手段により集光されて、特
定波長の光のみ透過するように調製されたモノクロメー
タ16に入射される。このモノクロメータ16を透過した光
は、プリズム偏光ビームスプリッタ18に入射され、この
偏光ビームスプリッタ18で分けられた水平偏光と垂直偏
光とは、それぞれ光電子増倍管20及び22に入射される。
これら光電子増倍管20及び22の出力は、信号処理装置24
に入力される。この信号処理装置24は、入力信号を時間
分割し、また、加算した信号を出力する。
に入力される。この信号処理装置24は、入力信号を時間
分割し、また、加算した信号を出力する。
水平偏光と垂直偏光の平均出力レベルは、オシロスコー
プ26に入力され、ここで水平偏光と垂直偏光の出力比を
示す波形が表示される。
プ26に入力され、ここで水平偏光と垂直偏光の出力比を
示す波形が表示される。
更に、水平偏光と垂直偏光の出力レベルは、計算機28に
入力され、以下に詳しく説明される式(1)の計算がなさ
れ、プロッタ30に入力され、時間分解吸収異方性〔ｒ
（ｔ）〕の経時変化を示すグラフが作成される。
入力され、以下に詳しく説明される式(1)の計算がなさ
れ、プロッタ30に入力され、時間分解吸収異方性〔ｒ
（ｔ）〕の経時変化を示すグラフが作成される。
以上のような装置を使用した本発明による測定を次に説
明する。サンプルの調製については以下の実施例で詳し
く述べる。
明する。サンプルの調製については以下の実施例で詳し
く述べる。
タングステンハロゲンランプ12からスペクトルの広い円
偏波光をサンプル10に連続的に照射している状態におい
て、Ｎｄ／ＹＡＧレーザ14を発振し、注目するサンプル
中の蛋白質に特異的な波長のレーザ光フラッシュをサン
プル10に照射する。該レーザ光により、サンプル10中の
チトクローム・ＣＯ錯体は光解離してＣＯを分離し、解
離チトクローム自体は運動をはじめ、それに応じて特定
波長の光の吸光度が変化する。従って、タングステンハ
ロゲンランプ12からの光の内の特定波長の光の水平偏光
成分及び垂直偏光成分に対する吸光度が変化する。
偏波光をサンプル10に連続的に照射している状態におい
て、Ｎｄ／ＹＡＧレーザ14を発振し、注目するサンプル
中の蛋白質に特異的な波長のレーザ光フラッシュをサン
プル10に照射する。該レーザ光により、サンプル10中の
チトクローム・ＣＯ錯体は光解離してＣＯを分離し、解
離チトクローム自体は運動をはじめ、それに応じて特定
波長の光の吸光度が変化する。従って、タングステンハ
ロゲンランプ12からの光の内の特定波長の光の水平偏光
成分及び垂直偏光成分に対する吸光度が変化する。
それ故、サンプル10からの散乱光の一部を受けて測定波
長の光のみを透過するモノクロメータ16の出力光を、偏
光ビームスプリッタ18を介してそれぞれ受ける光電子増
倍管20及び22は、サンプル10の散乱光の内の特定波長の
光の水平偏光成分及び垂直偏光成分をそれぞれ検出す
る。
長の光のみを透過するモノクロメータ16の出力光を、偏
光ビームスプリッタ18を介してそれぞれ受ける光電子増
倍管20及び22は、サンプル10の散乱光の内の特定波長の
光の水平偏光成分及び垂直偏光成分をそれぞれ検出す
る。
次いで、光電子増倍管20及び22の出力を受ける信号処理
装置24は、入力信号を時間分割して加算し計算機28に出
力し、その計算機28は、以下の式(1)の計算を実施し、
プロッタ30にｒ（ｔ）の経時変化を示すグラフが作成さ
れる。
装置24は、入力信号を時間分割して加算し計算機28に出
力し、その計算機28は、以下の式(1)の計算を実施し、
プロッタ30にｒ（ｔ）の経時変化を示すグラフが作成さ
れる。
測定の開始は信号処理装置24の測定開始ボタンをＯＮす
ることによって行なう。又この装置にあるセットした回
数の入力が終ると測定は自動的に終了するようになって
いる。その際、オシロスコープ26に、水平偏光と垂直偏
光の出力比を示す波形が表示される。
ることによって行なう。又この装置にあるセットした回
数の入力が終ると測定は自動的に終了するようになって
いる。その際、オシロスコープ26に、水平偏光と垂直偏
光の出力比を示す波形が表示される。
上記装置によって鉛直線偏光したレーザー・フラッシュ
を照射し、ＣＯを光解離すると、注目する蛋白質の特性
吸収波長の光の吸光度が大きく変化する。水平および鉛
直方向の吸光度変化の時間依存性から次式(1)によっ
て、時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）を求める。
を照射し、ＣＯを光解離すると、注目する蛋白質の特性
吸収波長の光の吸光度が大きく変化する。水平および鉛
直方向の吸光度変化の時間依存性から次式(1)によっ
て、時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）を求める。
ここで、ＡV（ｔ）はフラッシュ後の時間ｔにおける鉛
直方向の吸光度変化であり、ＡH（ｔ）は同様に水平方
向の吸光度変化である。
直方向の吸光度変化であり、ＡH（ｔ）は同様に水平方
向の吸光度変化である。
かくして得られる時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）から注目
する蛋白質の回転運動性、即ち回転速度及び静止してい
る蛋白質の割合がわかる。
する蛋白質の回転運動性、即ち回転速度及び静止してい
る蛋白質の割合がわかる。
かくして、本発明の方法は、アドリアマイシン、ドキソ
ルビシン等の各種制ガン剤はもとより、ＣＯ、ＣCl４な
どの生体にとって有害な物質並びに他の各種薬剤の正常
細胞に与える作用を検査するために有利に利用できる。
ルビシン等の各種制ガン剤はもとより、ＣＯ、ＣCl４な
どの生体にとって有害な物質並びに他の各種薬剤の正常
細胞に与える作用を検査するために有利に利用できる。
細胞中でミトコンドリアはＡＴＰを合成し、エネルギー
合成に関与する器官であり、ミクロゾームは薬物代謝を
司る器官である。その膜上に存在するチトクロームは、
Fe2+ Fe3+＋ｅ−の反応を行う電子伝達系の構成成分
をなすヘム蛋白質であって、ミトコンドリアにはチトク
ローム・オキシダーゼが、ミクロゾームにはチトクロー
ム Ｐ-450が夫々存在する。
合成に関与する器官であり、ミクロゾームは薬物代謝を
司る器官である。その膜上に存在するチトクロームは、
Fe2+ Fe3+＋ｅ−の反応を行う電子伝達系の構成成分
をなすヘム蛋白質であって、ミトコンドリアにはチトク
ローム・オキシダーゼが、ミクロゾームにはチトクロー
ム Ｐ-450が夫々存在する。
ここで、チトクロームは各器官の脂質から成る膜を突き
抜ける形で存在し、膜の法線の回りに回転しながら、あ
いは相互に衝突しながら電子授受を行っている。
抜ける形で存在し、膜の法線の回りに回転しながら、あ
いは相互に衝突しながら電子授受を行っている。
ところでアドリアマイシン、ドキソルビシン等の各種制
ガン剤は膜脂質の過酸化を起こし、過酸化の程度は投与
した制ガン剤の用量に依存することが知られている〔カ
ラシュらの；バイオケミカル アンド バイオフィジカ
ル リサーチ コミュニケーションズ（Biochemical an
d Biophysical Research Communications），18巻、３
号，1346−1352頁(1982)およびミムナウらの；キャンサ
ートリートメント レポーツ（Cancer Treatment Repor
ts），67巻，７号、 731−733 頁(1983)参照〕。更に、
ＣCl４等の毒素や２価の鉄イオンも膜脂質を過酸化する
ことが知られている。
ガン剤は膜脂質の過酸化を起こし、過酸化の程度は投与
した制ガン剤の用量に依存することが知られている〔カ
ラシュらの；バイオケミカル アンド バイオフィジカ
ル リサーチ コミュニケーションズ（Biochemical an
d Biophysical Research Communications），18巻、３
号，1346−1352頁(1982)およびミムナウらの；キャンサ
ートリートメント レポーツ（Cancer Treatment Repor
ts），67巻，７号、 731−733 頁(1983)参照〕。更に、
ＣCl４等の毒素や２価の鉄イオンも膜脂質を過酸化する
ことが知られている。
本発明者は、このように膜脂質が過酸化されると、その
後ゆっくりとチトクロームがアグリゲート（凝集体）を
形成し、その結果回転運動や相互の衝突運動が出来なく
なり、電子伝達を行うことが出来なくなることを見出し
た。このようにチトクロームが失活するとミトコンドリ
アでのＡＴＰ合成やミクロゾームでの薬物代謝を行うこ
とができなくなり、従って、細胞が損傷を受けたことに
なる。
後ゆっくりとチトクロームがアグリゲート（凝集体）を
形成し、その結果回転運動や相互の衝突運動が出来なく
なり、電子伝達を行うことが出来なくなることを見出し
た。このようにチトクロームが失活するとミトコンドリ
アでのＡＴＰ合成やミクロゾームでの薬物代謝を行うこ
とができなくなり、従って、細胞が損傷を受けたことに
なる。
従って、前記のように、本発明の方法に従って、細胞損
傷（特に過酸化）を受けた特定部位を採取し、そこに含
まれる蛋白質に着目し、その回転運動をレーザー・フラ
ッシュ・ホトリシス法で分光測定することにより、該細
胞の損傷の有無、その程度を直接的に、経時的かつ定量
的に測定することができる。
傷（特に過酸化）を受けた特定部位を採取し、そこに含
まれる蛋白質に着目し、その回転運動をレーザー・フラ
ッシュ・ホトリシス法で分光測定することにより、該細
胞の損傷の有無、その程度を直接的に、経時的かつ定量
的に測定することができる。
従って、本発明の方法によれば、個々の患者に適した薬
剤その量の選択、投与継続の適否、他の薬剤への切り替
え時期等の判断が可能となり、また各薬剤等の副作用を
最小限に抑えることができ、更にＣCl４等による職業病
等の診断にも利用することができるものと考えられる。
剤その量の選択、投与継続の適否、他の薬剤への切り替
え時期等の判断が可能となり、また各薬剤等の副作用を
最小限に抑えることができ、更にＣCl４等による職業病
等の診断にも利用することができるものと考えられる。
本発明の方法において、ＣＯを通気する理由は、第１
に、ＣＯ分子をミクロゾーム分画或いはミトコンドリア
分画に通気すると、ＣＯは夫々チトクローム Ｐ-450或
いはチトクローム・オキシダーゼとのみ特異的に結合
し、各チトクローム分子を特異的にラベルすることが可
能である点、第２に、該チトクローム・ＣＯコンプレッ
クスは可視光で光解離することが可能である点にある。
に、ＣＯ分子をミクロゾーム分画或いはミトコンドリア
分画に通気すると、ＣＯは夫々チトクローム Ｐ-450或
いはチトクローム・オキシダーゼとのみ特異的に結合
し、各チトクローム分子を特異的にラベルすることが可
能である点、第２に、該チトクローム・ＣＯコンプレッ
クスは可視光で光解離することが可能である点にある。
実施例 以下、実施例に沿って本発明を詳しく説明する。ただ
し、本発明の範囲は以下の実施例により何等制限されな
い。
し、本発明の範囲は以下の実施例により何等制限されな
い。
実施例１ ラット肝ミクロゾームのチトクローム Ｐ-450の回転運
動性を以下の方法で測定した。
動性を以下の方法で測定した。
ミクロゾームの調製 ラット（Wister系、雌）肝からレマーらの方法〔メソッ
ズ エンザイモロジー(Methods Enzymology)10巻,703−
708 頁(1967)〕によって肝臓ミクロゾームを調製した。
ズ エンザイモロジー(Methods Enzymology)10巻,703−
708 頁(1967)〕によって肝臓ミクロゾームを調製した。
チトクローム Ｐ-450の回転運動性の測定60％（W/
W)のシュークロース溶液をミクロゾームサスペンション
（Tris−ＨCl，pH7.8 ，150mM のＫClおよび10mMのMgCl
２を含有）に溶解する。最終的ヘムの濃度は２−８μＭ
であった。このサンプルを亜ジチオン酸で還元した後、
１分間ゆっくりと一酸化炭素（ＣＯ）を通気する。チト
クローム Ｐ-450がＣＯで飽和されるようゴムキャップ
をしめて、Ｐ-450・ＣＯコンプレックスを作製する。か
くして得られた試料を測定に用いる。
W)のシュークロース溶液をミクロゾームサスペンション
（Tris−ＨCl，pH7.8 ，150mM のＫClおよび10mMのMgCl
２を含有）に溶解する。最終的ヘムの濃度は２−８μＭ
であった。このサンプルを亜ジチオン酸で還元した後、
１分間ゆっくりと一酸化炭素（ＣＯ）を通気する。チト
クローム Ｐ-450がＣＯで飽和されるようゴムキャップ
をしめて、Ｐ-450・ＣＯコンプレックスを作製する。か
くして得られた試料を測定に用いる。
脂質過酸化 脂質過酸化は上記のようにして調製したミクロゾームを
FeSO４の依存下でＮＡＤＰＨ依存性酸素添加酵素系によ
って行った。即ち、 200μｇのミクロゾーム蛋白にFeＳ
Ｏ４：20μＭ、トリス・マレエート：40mM、pH7.4 およ
びＮＡＤＰＨ：0.2mMを加えた。
FeSO４の依存下でＮＡＤＰＨ依存性酸素添加酵素系によ
って行った。即ち、 200μｇのミクロゾーム蛋白にFeＳ
Ｏ４：20μＭ、トリス・マレエート：40mM、pH7.4 およ
びＮＡＤＰＨ：0.2mMを加えた。
第２図に示すように約18分でマロンアルデヒド(ＭＤＡ)
産出は最大となり(約90nmole ＭＤＡ／mgprotein)、こ
こでＥＤＴＡ1mMを加えて過酸化を止めた。これ以後37
℃で２時間放置してもマロンアルデヒドの量は変化しな
かったので、これを脂質過酸化のモデルとして用いた。
産出は最大となり(約90nmole ＭＤＡ／mgprotein)、こ
こでＥＤＴＡ1mMを加えて過酸化を止めた。これ以後37
℃で２時間放置してもマロンアルデヒドの量は変化しな
かったので、これを脂質過酸化のモデルとして用いた。
第３図は、このようにして調製した肝ミクロゾームのチ
トクローム Ｐ-450のレーザー・フラッシュ・ホトリシ
ス法によって算出したｒ（ｔ）と時間との関係を示した
図であって、曲線Ａは過酸化しないコントロールを、曲
線Ｂは、18分間の過酸化処理直後のｒ（ｔ）を、曲線Ｃ
は、過酸化後、更に２時間37℃で放置した後のｒ（ｔ）
を示す。なお、夫々の場合において、測定直前にサンプ
ルにＣＯを通気した。また、使用した励起レーザー光の
波長は 532ｎｍ、測定光の波長は 450ｎｍであった。
トクローム Ｐ-450のレーザー・フラッシュ・ホトリシ
ス法によって算出したｒ（ｔ）と時間との関係を示した
図であって、曲線Ａは過酸化しないコントロールを、曲
線Ｂは、18分間の過酸化処理直後のｒ（ｔ）を、曲線Ｃ
は、過酸化後、更に２時間37℃で放置した後のｒ（ｔ）
を示す。なお、夫々の場合において、測定直前にサンプ
ルにＣＯを通気した。また、使用した励起レーザー光の
波長は 532ｎｍ、測定光の波長は 450ｎｍであった。
第３図において、初期の勾配はチトクローム Ｐ-450の
回転速度を表わし、終点におけるｒ（ｔ）の大きさはチ
トクローム分子のうち、どの程度が静止しているかを示
すものである。第３図から明らかなように、ＣはＡに比
して、回転速度が遅く、かつ本来全てが回転しているは
ずのチトクロームＰ-450分子の約75％が前記脂質過酸化
により静止したことがわかる。
回転速度を表わし、終点におけるｒ（ｔ）の大きさはチ
トクローム分子のうち、どの程度が静止しているかを示
すものである。第３図から明らかなように、ＣはＡに比
して、回転速度が遅く、かつ本来全てが回転しているは
ずのチトクロームＰ-450分子の約75％が前記脂質過酸化
により静止したことがわかる。
実施例２ ミトコンドリアのチトクローム オキシダーゼの回転運
動性を実施例１と同様の方法で測定した。
動性を実施例１と同様の方法で測定した。
ただし、ミトコンドリアの調製法については、メソッズ
・エンザイモロジー（Methods Enzymology）32巻， 374
−391 頁に記載の方法に依った。
・エンザイモロジー（Methods Enzymology）32巻， 374
−391 頁に記載の方法に依った。
また、チトクローム オキシダーゼの回転運動性の測定
には、 590ｎｍで鉛直線偏光したレーザーフラッシュを
照射し、 446ｎｍにおける吸光度変化を測定した。その
結果、実施例１と同様な結果が得られた。
には、 590ｎｍで鉛直線偏光したレーザーフラッシュを
照射し、 446ｎｍにおける吸光度変化を測定した。その
結果、実施例１と同様な結果が得られた。
発明の効果 上述したように、本発明の方法を使用することよって、
毒素、薬剤に起因する生体細胞の特定部位の損傷を、当
該部位の蛋白質の回転運動性を指標として直接測定する
ことが可能となる。しかも本発明の方法を利用すれば、
ＣＯが特定蛋白質に特異的に結合するので、従来のよう
な蛋白質の面倒な精製を行わなくとも、ミクロゾーム、
或いはミトコンドリア分画のままで蛋白質の回転運動を
経時的、定量的にかつ簡便に測定することが可能とな
る。
毒素、薬剤に起因する生体細胞の特定部位の損傷を、当
該部位の蛋白質の回転運動性を指標として直接測定する
ことが可能となる。しかも本発明の方法を利用すれば、
ＣＯが特定蛋白質に特異的に結合するので、従来のよう
な蛋白質の面倒な精製を行わなくとも、ミクロゾーム、
或いはミトコンドリア分画のままで蛋白質の回転運動を
経時的、定量的にかつ簡便に測定することが可能とな
る。
第１図は本発明による測定を実施する装置の概略構成図
であり、 第２図はFeＳＯ４、ＮＡＤＰＨで過酸化した場合のマロ
ンアルデヒド（ＭＤＡ）産出量を示す図であり、 第３図は時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）と時間との関係を
示すグラフである。 （主な参照番号） 10……サンプル、 12……タングステンハロゲンランプ、 14……Ｎｄ／ＹＡＧレーザ、 16……モノクロメータ、 18……プリズム偏光ビームスプリッタ、 20……光電子増倍管、22……光電子増倍管、 24……信号処理装置、26……オシロスコープ、 28……計算機、30……プロッタ
であり、 第２図はFeＳＯ４、ＮＡＤＰＨで過酸化した場合のマロ
ンアルデヒド（ＭＤＡ）産出量を示す図であり、 第３図は時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）と時間との関係を
示すグラフである。 （主な参照番号） 10……サンプル、 12……タングステンハロゲンランプ、 14……Ｎｄ／ＹＡＧレーザ、 16……モノクロメータ、 18……プリズム偏光ビームスプリッタ、 20……光電子増倍管、22……光電子増倍管、 24……信号処理装置、26……オシロスコープ、 28……計算機、30……プロッタ
Claims (4)
- 【請求項１】毒素、薬剤が摂取または投与された被検体
の特定部位の細胞または組織を採取し、該細胞または組
織に含まれる蛋白質にＣＯガスを選択的に吸着させ、こ
れに鉛直線偏向したレーザー・フラッシュ光を照射して
励起させ、その際の特定波長光の吸光度変化を追跡する
ことにより、該蛋白質の回転運動性を測定することを特
徴とする、毒素、薬剤に起因する細胞損傷の検査法。 - 【請求項２】前記蛋白質が、細胞のミクロゾームにおけ
るチトクローム Ｐ-450であり、前記レーザー光の波長
が 532ｎｍであり、前記光の波長が 450ｎｍであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記蛋白質が、細胞のミトコンドリアにお
けるチトクロームオキシダーゼであり、前記レーザー光
の波長が 590ｎｍで、前記光の波長が 446ｎｍであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記薬剤が制ガン剤であることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項または第３項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5216286A JPH0623749B2 (ja) | 1986-03-10 | 1986-03-10 | 毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5216286A JPH0623749B2 (ja) | 1986-03-10 | 1986-03-10 | 毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62209338A JPS62209338A (ja) | 1987-09-14 |
| JPH0623749B2 true JPH0623749B2 (ja) | 1994-03-30 |
Family
ID=12907137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5216286A Expired - Lifetime JPH0623749B2 (ja) | 1986-03-10 | 1986-03-10 | 毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0623749B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100460854C (zh) * | 2005-07-14 | 2009-02-11 | 中国科学院半导体研究所 | 一种半导体晶片亚表面损伤层的测量方法 |
| DE102015003019A1 (de) * | 2015-03-06 | 2016-09-08 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren und Vorrichtung zur optischen Detektion einer Bewegung in einer biologischen Probe mit räumlicher Ausdehnung |
| CN111230307B (zh) * | 2019-12-23 | 2022-04-22 | 北京航天控制仪器研究所 | 一种金属材料表面与复合材料表面的粘接方法 |
-
1986
- 1986-03-10 JP JP5216286A patent/JPH0623749B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62209338A (ja) | 1987-09-14 |
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