JPS62209338A - 毒素、薬剤による細胞損傷の新しい分光測定による検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、毒素、薬剤に起因する細胞損傷を測定する方
法に関する。より詳細には、本発明は、毒素、薬剤に起
因する生体細胞の特定部位の損傷を、分光学的に検知す
ることにより測定する方法に関する。

従来の技術 現在、ガンの化学的治療に用いられている制ガン剤は、
ガン細胞のみならず正常な細胞をも損傷する。また、Ｃ
Ｃ１，のような毒物、あるいはあえて毒物と分類されて
いない薬物であっても体内に蓄積されて正常細胞を損傷
することがある。

従来、このような細胞損傷の測定は極めて初等的な方法
に依って行われていた。すなわち、例えば、顕微鏡下で
一定時間内に形態学的に死んだ細胞の数を数えるとか、
あるいは、螢光色素トリパンブルー等を細胞に摂取させ
て、この色素を排泄できない死んだ細胞の数を数える等
の方法に依っていた。

しかしながら、これらの初等的方法は、制ガン剤等の薬
剤又は毒素の作用部位に的を絞った直接測定法ではなく
、全体としての細胞の生死を不明瞭な基準で扱っている
に過ぎない。また、これらの測定に要する労力、時間も
多大なものである。

また、このような全体としての細胞の生死を判定するの
ではなく、細胞活性のより直接的な指標として蛋白質の
活性を測定する方法も知られている。しかし、従来の蛋
白質活性の測定方法は、組織をすりつぶし、濾過し、吸
着カラムで分画する等の複雑な手順によって蛋白質を精
製した後、分光学的方法、例えばチトクロームオキシダ
ーゼについていえば、チトクロームオキシダーゼが還元
形チトクロームＣを酸化するという性質を利用して、還
元形チトクロームＣの吸収の減少を測定するという方法
等に依っていた。

しかし、これらの方法は、蛋白質の精製操作が複雑でか
つ時間がかかり過ぎるという欠点があった。

発明が解決しようとする問題点 以上述べたように、制ガン剤等の薬剤並びに毒物による
正常細胞の損傷を評価するための従来の方法は間接的か
つ不明瞭な基準での扱いしかできないか、もしくは複雑
かつ熟練を要する蛋白質の分離精製操作を必要としてい
た。

このような情況の下で、各種毒素、薬剤が細胞のいずれ
の部位にどの程度の損傷を与えたかを、細胞全体として
の生死というあいまいな基準では、なく、より直接的な
蛋白質の活性を基準として経時的、定量的に、かつ簡便
に測定できる方法を開発し、例えば制ガン剤が細胞の各
部に異なった損傷を与えながら作用してゆく様子を的確
に認識し、治療中の患者に最良の治療を施し、副作用等
の発現を最小限度に抑える上で極めて重要である。これ
はまた、制ガン剤の種類によって作用する部位が異なる
ことからも重要である。

本発明の目的も上記のような優れた効果を奏する新規な
細胞損傷の検査方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者は、毒素、薬剤に起因する生体細胞の特定部位
の損傷を、当該部位における蛋白質の回転運動性をレー
ザー・フラッシュ・ホトリンス法で測定することがより
直接的な蛋白質の活性を基準とした細胞損傷の検査方法
として極めて有効であることを見出した。

即ち、本発明の方法は、毒素、薬剤が投与または摂取さ
れた被検体の特定部位の細胞または組織を採取し、該細
胞または組織に含まれる蛋白質にＣＯガスを選択的に吸
着させ、これに鉛直線偏光したレーザー・フラッシユ光
を照射して励起させ、その際の特定波長光の吸光度の変
化を追跡することにより、該蛋白質の回転運動性を測定
することを特徴とする。

本発明において、毒素、薬剤により損傷を受ける生体細
胞の特定部位とは特にミトコンドリアおよびミクロゾー
ムが考えられ、従って回転運動性を判断するための蛋白
質は夫々チ、トクローム・オキシダーゼおよびチトクロ
ームＰ−４５０である。

本発明の分光学的測定法はレーザー・フラッシュ・ホト
リンス法（微粒子回転測定法）といい、本発明者により
開発された技術である。この方法は、ミクロゾームある
いはミトコンドリアに一酸化炭素（ＣＯ）を通気して、
膜蛋白であるチトクロームにＣＯを選択的に吸着させて
、ラベルした後、該チトクローム・ＣＯコンプレックス
に鉛直線偏光したレーザー・フラッシュを照射して励起
させ、その際に光解離によってＣＯがはずれた解離チト
クローム分子の吸光度の変化を測定することからなる。

すなわち、鉛直線偏光、したレーザー・フラッシュの照
射によってＣＯが解離した分子は、励起直後には鉛直方
向に揃っているが、時間の経過と共に再び運動を始める
。その際の水平、鉛直方向の吸光度変化の時間依存性（
緩和時間）によってチトクローム分子の運動性を測定す
るものである。

添付第１図に、本発明の方法を実施するのに有用なレー
ザー・フラッシュ・ホトリシス用装置を概略的に示した
。以下第１図に沿って、本発明の方法を更に詳しく説明
する。

第１図において、サンプル１０は、図示していないサン
プル台に置かれる。一方、タングステンハロゲンランプ
１２が、図示しない集光手段により集光された光をサシ
プル台上のサンプル１０に照射するように配置されてい
る。また、例えばＮｄ／ＹＡＣＩ、レーザ発振器１４が
、特定波長の垂直偏光パルス（パルス巾約１０ｎｓｅｃ
　）を同様にサンプル台上のサンプル１０に照射するよ
うに配置されている。

この状態で、サンプル台上のサンプル１０には連続的に
ランプ１２からの光が照射され、一方一定の時間々隔で
レーザー・フラッシュが照射される。

サンプル１０からの透過光の一部が、図示しない集光手
段により集光されて、特定波長の光のみ透過するように
調製されたモノクロメータ１６に入射される。このモノ
クロメータ１６を透過した光は、プリズム偏光ビームス
プリッタ１８に入射され、この偏光ビームスプリッタ１
８で分けられた水平偏光と垂直偏光とは、それぞれ光電
子増倍管２０及び２２に入射される。

これら光電子増倍管２０及び２２の出力は、信号処理装
置２４に入力される。この信号処理装置２４は、入力信
号を時間分割し、また、加算した信号を出力する。

水平偏光と垂直偏光の平均出力レベルは、オシロスコー
プ２６に入力され、ここで水平偏光と垂直偏光の出力比
を示す波形が表示される。

更に、水平偏光と垂直偏光の出力レベルは、計算機２８
に人力され、以下に詳しく説明される式（１）の計算が
なされ、プロッタ３０に入力され、時間分解吸収異方性
（ｒ（ｔ）：］の経時変化を示すグラフが作成される。

以上のような装置を使用した本発明による測定を次に説
明する。サンプルの調製については以下の実施例で詳し
く述べる。

タングステンハロゲンランプ１２からスペクトルの広い
円偏波光をサンプル１０に連続的に照射している状態に
おいて、Ｎｄ／ＹＡＧレーザ１４を発振し、注目するサ
ンプル中の蛋白質に特異的な波長のレーザ光フラツシユ
をサンプル１０に照射する。

該レーザ光により、サンプル１０中のチトクローム・Ｃ
Ｏ錯体は光解離してＣＯを分離し、解離チトクローム自
体は運動をはじめ、それに応じて特定波長の光の吸光度
が変化する。従って、タングステンハロゲンランプ１２
からの光の内の特定波長の光の水平偏光成分及び垂直偏
光成分に対する吸光度が変化する。

それ故、サンプル１０からの散乱光の一部を受けて測定
波長の光のみを透過するモノクロメーク１６の出力光を
、偏光ビームスプリッタ１８を介してそれぞれ受ける光
電子増倍管２０及び２２は、サンプル１０の散乱光の内
の特定波長の光の水平偏光成分及び垂直偏光成分をそれ
ぞれ検出する。

次いで、光電子増倍管２０及び２２の出力を受ける信号
処理装置２４は、入力信号を時間分割して加算し計算機
２８に出力し、その計算機２８は、以下の式（１）の計
算を実施し、ブロック３０にｒ（ｔ）の経時変化を示す
グラフが作成される。

測定の開始は信号処理装置２４の一測定開始ボタンをＯ
Ｎすることによって行なう。又この装置にあるセットし
た回数の入力が終ると測定は自動的に終了するようにな
っている。その際、オシロスコープ２６に、水平偏光と
垂直偏光の出力比を示す波形が表示される。

上記装置によって鉛直線偏光したレーザー・フラッシュ
を照射し、ＣＯを光解離すると、注目する蛋白質の特性
吸収波長の光の吸光度が大きく変化する。水平および鉛
直方向の吸光度変化の時間、依存性から次式（１）によ
って、時間分解吸収異方性ｒ（ｔ）を求める。

ここで、ＡＶ（ｔ）はフラッシュ後の時間ｔにおける鉛
直方向の吸光度変化であり、Ａ＋＋（ｔ　）は同様に水
平方向の吸光度変化である。

かくして得られる時間分解吸収異方性ｒ　（ｔ）から注
目する蛋白質の回転運動性、即ち回転速度及び静止して
いる蛋白質の割合がわかる。

かくして、本発明の方法は、アドリアマイシン、ドキソ
ルビシン等の各種制ガン剤はもとより、Ｃ０１ＣＣ１４
などの生体にとって有害な物質並びに他の各種薬剤の正
常細胞に与える作用を検査するために有利に利用できる
。

細胞中でミトコンドリアはＡＴＰを合成し、エネルギー
合成に関与する器官であり、ミクロゾームは薬物代謝を
司る器官である。その膜上に存在するチトクロームは、
Ｆｅ２＋＝　　Ｆｅ”＋　ｅ−の反応を行う電子伝達系
の構成成分をなすヘム蛋白質であって、ミトコンドリア
にはチトクローム・オキシダーゼが、ミクロゾームには
チトクローム　Ｐ−４５０が夫々存在する。

ここで、チトクロームは各器官の脂質から成る膜を突き
抜ける形で存在し、膜の法線の回りに回転しながら、あ
いは相互に衝突しながら電子授受を行っている。

ところでアドリアマイシン、ドキソルビシン等の各種制
ガン剤は膜脂質の過酸化を起こし、過酸化の程度は投与
した制ガン剤の用量に依存することが知られている〔カ
ラシニらの・；バイオケミカル　アンド　バイオフィジ
カル　リサーチ　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）　、　１８
巻、３号、　１３４６−１３５２頁（１９８２）および
ミムナウらの；キャンサートリートメント　レボ−’７
　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ＋ｎｅｎｔＲｅｐｏｒｔ
ｓ）、　６７巻、７号、７３１−７３３頁（１９８３）
参照〕。

更に、ＣＣｌ４等の毒素や２価の鉄イオンも膜脂質を過
酸化することが知られている。

本発明者は、このように膜脂質が過酸化されると、その
後ゆっくりとチトクロームがアグリゲート（凝集体）を
形成し、その結果回転運動や相互の衝突運動が出来なく
なり、電子伝達を行うことが出来なくなることを見出し
た。このようにチトクロームが失活するとミトコンドリ
アでのＡＴＰ合成やミクロゾームでの薬物代謝を行うこ
とができなくなり、従って、細胞が損傷を受けたことに
なる。

従って、前記のように、本発明の方法に従って、細胞損
傷（特に過酸化）を受けた特定部位を採取し、そこに含
まれる蛋白質に着目し、その回転運動をレーザー・フラ
ッシュ・ホトリンス法で分光測定することにより、該細
胞の損傷の有無、その程度を直接的に、経時的かつ定量
的に測定することができ°る。

従って、本発明の方法によれば、個々の患者に適した薬
剤その量の選択、投与継続の適否、他の薬剤への切り替
え時期等の判断が可能となり、また各薬剤等の副作用を
最小限に抑えることができ、更にＣＣ１，等による職業
病等の診断にも利用することができるものと考えられる
。

本発明の方法において、ｃｏを通気する理由は、第１に
、００分子をミクロゾーム分画成いはミトコンドリア分
画に通気すると、ＣＯは夫々チトクローム　Ｐ−４５０
或いはチトクローム・オキシダーゼとのみ特異的に結合
し、各チトクローム分子を特異的にラベルすることが可
能である点、第２に、咳チトクローム・ＣＯコンプレッ
クスは可視光で光解離することが可能である点にある。

実施例 以下、実施例に沿って本発明の詳細な説明する。

ただし、本発明の範囲は以下の実施例により何等制限さ
れない。

実施例１ ラット肝ミクロゾームのチトクローム　Ｐ−４５０Ｄ回
転運動性を以下の方法で測定した。

■　ミクロゾームの調製 ラット（Ｗｉｓｔｅｒ系、雌）肝からレマーらの方法〔
メソッズ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）１０巻、７０３−７０８頁（１９６７
）　Ｅによって肝臓ミクロゾームを調製した。

■　チトクローム　Ｐ−４５０の回転運動性の測定６０
％（Ｗ／ｌ１ｌ）のシュークロース溶液をミクロゾーム
サスベニ／　’ｙ　Ｅ＋　７　（Ｔｒｙｓ　−ＨＣＩ　
、　ｐＨ７，８、１５０ｍＭのＫＣＩおよびｌｏｍＭの
ＭｇＣｌ２を含有）に溶解する。

最終的ヘムの濃度は２−８μＭであった。このサンプル
を亜ジチオン酸で還元した後、１分間ゆっくりと一酸化
炭素（Ｃｏ）を通気する。チトクローム　Ｐ−４５０が
ＣＯで飽和されるようゴムキャ・ノブをしめて、Ｐ−４
５０・ＣＯコンプレックスを作製する。かくして得られ
た試料を測定に用いる。

■　脂質過酸化 脂質過酸化は上記のようにして調製したミクロゾームを
Ｆｅ５Ｏ１の依存下でＮＡＤＰＨ依存性酸素添加酵素系
によって行った。即ち、２００μｇのミクロゾーム蛋白
にＦｅＳ○、：２０μＭ、）リス・マレエート：　４０
ｍＭ、　ｐＨ７，４およびＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ：０．２
ｍＭを加えた。

第２図に示すように約１８分でマロンアルデヒド（ＭＤ
Ａ）産出は最大となり（約９０ｎｍｏｌｅ　ＭＤΔ／ｍ
ｇｐｒｏｔｅｉｎ）、ここでＥＤＴＡｌｍＭを加えて過
酸化を止めた。これ以後３７℃で２時間放置してもマロ
ンアルデヒドの量は変化しなかったので、これを脂質過
酸化のモデルとして用いた。

第３図は、このようにして調製した肝ミクロゾームのチ
トクローム　Ｐ−４５０のレーザー・フラッシュ・ホト
リンス法によって算出もだｒ　（ｔ）と時間との関係を
示した図であって、曲線Ａは過酸化しないコントロール
を、曲線Ｂは、１８分間の過酸化処理直後のｒ　（ｔ）
を、曲線Ｃは、過酸化後、更に２時間３７℃で放置した
後のｒ　（ｔ）を示す。

なお、夫々の場合において、測定直前にサンプルにＣＯ
を通気した。また、使用した励起レーザー光の波長は５
３２ｎｍ、測定光の波長は４５０ｎｍであった。

第３図おいて、初期の勾配はチトクローム　Ｐ−４５０
の回転速度を表わし、終点におけるｒ　（ｔ）の大きさ
はチトクローム分子のうち、どの程度が静止しているか
を示すものである。第３図から明らかなように、ＣはＡ
に比して、回転速度が遅く、かつ本来全てが回転してい
るはずのチトクロームＰ−４５０分子の約７５％が前記
脂質過酸化により静止したことがわかる。

実施例２ ミトコンドリアのチトクローム　オキシダーゼの回転運
動性を実施例１と同様の方法で測定した。

ただし、ミトコンドリアの調製法については、メソッズ
、エンザイ％０ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）３２巻、　　３７４−３９１頁に記載の方法に
依った。

また、゛チトクローム　オキシダーゼの回転運動性の測
定には、５９０ｎｍで鉛直線偏光したレーザーフラッシ
ュを照射し、４４６ｎｍにおける吸光度変化を測定した
。その結果、実施例１と同様な結果が得られた。

発明の効果 上述したように、本発明の方法を使用することよって、
毒素、薬剤に起因する生体細胞の特定部位の損傷を、当
該部位の蛋白質の回転運動性を指標として直接測定する
ことが可能となる。しかも本発明の方法を利用すれば、
ＣＯが特定蛋白質に特異的に結合するので、従来のよう
な蛋白質の面倒な精製を行わなくとも、ミクロゾーム、
或いはミトコンドリア分画のままで蛋白質の回転運動を
経時的、定量的にかつ簡便に測定することが可能となる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による測定を実施する装置の概略構成図
であり、 第２図はＦｅ５Ｏｓ　、ＮＡＤＰＨで過酸化した場合の
マロンアルデヒド（ＭＤＡ）産出量を示す図であり、 第３図は時間分解吸収異方性ｒ　（ｔ）と時間との関係
を示すグラフである。 （主な参照番号） １０・・サンプル、 １２・・タングステンハロゲンランプ、１４・・Ｎｄ／
ＹＡＧレーザ、 １６・・モノクロメータ、

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）毒素、薬剤が摂取または投与された被検体の特定
   部位の細胞または組織を採取し、該細胞または組織に含
   まれる蛋白質にＣＯガスを選択的に吸着させ、これに鉛
   直線偏向したレーザー・フラッシュ光を照射して励起さ
   せ、その際の特定波長光の吸光度変化を追跡することに
   より、該蛋白質の回転運動性を測定することを特徴とす
   る、毒素、薬剤に起因する細胞損傷の検査法。
2. （２）前記蛋白質が、細胞のミクロゾームにおけるチト
   クロームＰ−４５０であり、前記レーザー光の波長が５
   ３２ｎｍであり、前記光の波長が４５０ｎｍであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）前記蛋白質が、細胞のミトコンドリアにおけるチ
   トクロームオキシダーゼであり、前記レーザー光の波長
   が５９０ｎｍで、前記光の波長が４４６ｎｍであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）前記薬剤が制ガン剤であることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項または第３項記載の方法。