ES2956684T3 - Productos para la administración de compuestos terapéuticos/de diagnóstico al corazón - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto que comprende una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) con carga superficial negativa que tiene un potencial ζ en el rango de -41,0 mV a -27,0 mV que comprende las etapas de: a) mantener una mezcla que tiene un pH en el intervalo de 7 a 10 y que comprende una solución acuosa de calcio, una solución acuosa de fosfato y una solución de iones citrato a una temperatura en el intervalo de 20 °C a 40 °C durante un tiempo en el intervalo de 30 segundos a 10 minutos; b) eliminar los iones que no reaccionaron de la solución del paso a), obteniendo así una suspensión de una o más nanopartículas de fosfato cálcico (CaP-NP); c) recuperar el producto de una o más nanopartículas de fosfato cálcico (CaP-NP) de la suspensión del paso b). En una realización ventajosa, el proceso de la invención proporciona, en la mezcla de la etapa a), también una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico. El producto de la invención se puede utilizar como vehículo para uno o más compuestos diagnósticos/terapéuticos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares mediante administración por inhalación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Productos para la administración de compuestos terapéuticos/de diagnóstico al corazón
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención es una estrategia terapéutica innovadora para el tratamiento de enfermedades cardíacas. Específicamente, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto que comprende una o más partículas de fosfato de calcio que encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y un producto obtenido mediante dicho proceso. La invención se refiere también al producto de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades cardíacas a través la administración por inhalación.
TÉCNICA ANTERIOR
[0002] Estudios recientes en medicina se han centrado en el diseño y desarrollo de nanopartículas (NP) multifuncionales para la administración específica de un fármaco a un órgano seleccionado con el objetivo de definir un enfoque terapéutico selectivo y eficaz para el tratamiento de ciertas afecciones patológicas. No obstante, existen varios problemas críticos que aún limitan la aplicación farmacológica de estas, tales como i) la naturaleza fisicoquímica de los nanomateriales utilizados, su biodegradabilidad, biocompatibilidad y citotoxicidad potencial intrínseca; ii) la efectividad de la administración; iii) la no selectividad de la administración específica del tejido, que está asociada con la aparición de efectos secundarios; iv) la liberación no controlada del fármaco en el torrente sanguíneo; v) la disolución/acumulación celular lenta; vi) la baja eficiencia en el cruce de barreras biológicas. Por lo tanto, sigue siendo fundamental el desarrollo de NP adecuadas que, a través de la definición de una vía de administración adecuada, puedan alcanzar selectivamente al órgano de interés.
[0003] Los materiales a base de fosfato de calcio (CaP) se usan ampliamente para diversas aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad y biodegradabilidad. La transfección con materiales a base de CaP se ha utilizado para liberar genes a diferentes tipos de células in vitro durante más de 40 años (Graham, F. L.; Erb, A. J. V. d. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973, 52, 456-467; V. Sokolova, M. Epple. Inorganic nanoparticles as carriers of nucleic acids into cells. Angew Chem Int Ed Engl, 47 (8) (2008), págs. 1382-1395). El método general consiste en encapsular genes en un precipitado que se forma espontáneamente después de mezclar concentraciones adecuadas de iones calcio y fosfato a ciertos valores de pH (superiores a 7). Este método tiene muchas ventajas, tales como: facilidad de producción, bajos costes y elevada eficiencia en la unión de nucleótidos y ácidos nucleicos. Además, los materiales a base de CaP tienen una estabilidad sensible al pH, lo que proporciona una rápida disolución en un entorno ácido (es decir, endosomas, lisosomas). La disolución completa de CaP en sus constituyentes iónicos previene la acumulación de material indeseable en células y tejidos, un inconveniente que se da a menudo con otros compuestos inorgánicos y metálicos. De este modo, las partículas de CaP pueden liberar de forma selectiva y segura el agente incorporado en estas solo después de la internalización celular.
[0004] No obstante, el mayor problema en la producción de partículas de CaP es su tendencia a la agregación y al crecimiento, que provoca serios problemas de reproducibilidad en las síntesis e impide su estabilidad coloidal óptima. Estas complicaciones han ralentizado su desarrollo y, por lo tanto, su uso in vitro e in vivo. De hecho, las partículas grandes de CaP (a escala micrométrica) también pueden provocar interferencias en la cantidad de calcio intracelular, con la consiguiente muerte de la propia célula (Neumann, S. et al. The use of size-defined DNA-functionalized calcium phosphate nanoparticles to minimize intracellular calcium disturbance during transfection. Biomaterials, 2009, 30 (35), 6794-802). Por lo tanto, resulta de gran interés tener éxito en la preparación de NP de CaP que sean capaces de administrar ácidos nucleicos u otros compuestos, protegiéndolos del entorno externo y para impedir la degradación o liberación prematura de los mismos. Para estabilizar las NP de CaP impidiendo su crecimiento descontrolado y ser capaz de conjugar el agente terapéutico, se han utilizado recubrimientos con materiales poliméricos sintéticos (polietilenglicol (PEG) (Kakizawa, Y.; Kataoka, K. Block Copolymer Self-Assembly into Monodispersive Nanoparticles with Hybrid Core of Antisense DNA and Calcium Phosphate. Langmuir, 2002, 18 (12), 4539-4543); polietilenimina (PEI) (T. Devarasu, et al. Potent calcium phosphate nanoparticle surface coating for in vitro and in vivo sírNa delivery: a step toward multifunctional nanovectors); quitosano (Giger, E. V. et al. Gene delivery with bisphosphonatestabilized calcium phosphate nanoparticles. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 2011, 150 (1), 87-93), bisfosfonatos (Lee, K. et al. Stabilized calcium phosphate nano-aggregates using a dopachitosan conjugate for gene delivery. International journal of pharmaceutics, 2013, 445 (1-2), 196-202) o lípidos (Li, J.; Yang, Y.; Huang, L. Calcium phosphate nanoparticles with an asymmetric lipid bilayer coating for siRNA delivery to the tumor. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 2012, 158 (1), 108-14). Sin embargo, dichos materiales poliméricos sintéticos generalmente no son completamente biodegradables y pueden provocar reacciones alérgicas.
[0005] En el tratamiento de los tumores, las NP a base de CaP se prepararon y se recubrieron con polietilenimina para la conjugación de microARN de cadena larga (Hyosook Jung et al "Long chain microRNA conjugates in calcium phosphate nanoparticles for efficient formulation and delivery", Arch. Pharm.Research, 2014). Estos conjugados se liberaron con éxito in vitro en células de cáncer de próstata. Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte, y también se han realizado intentos para su tratamiento a través del uso de NP. Sin embargo, el desarrollo y el uso de NP eficaces para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares está todavía en sus inicios. De hecho, hasta ahora solo se han investigado dendrímeros, liposomas o NP a base de polímeros sintéticos no biométricos para la administración in vivo de diversas moléculas terapéuticas a las células miocárdicas. Esta limitación se debe a varias preocupaciones que han obstaculizado el traslado de NP a la clínica, tales como: i) baja biodegradabilidad y biocompatibilidad; ii) subproductos tóxicos; iii) baja eficiencia de encapsulación; iv) baja estabilidad de almacenamiento; v) liberación descontrolada de fármaco en el torrente sanguíneo; vi) especificidad limitada de diana celular; vii) disolución/acumulación celular lenta; viii) baja eficiencia de enfoques de administración sistémica; ix) baja eficiencia en el cruce de barreras biológicas. Por lo tanto, resultan imprescindibles nuevos enfoques para la administración segura, eficaz y específica para el corazón de fármacos terapéuticos. Recientemente, (Michele Miragoli et al., "Functional interaction between charges nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for cardiac arrhythmia?" Nanomedicine (2013)8(5),725-737), se ha descrito cómo el látex de poliestireno (dimensiones de 50 nm) puede, en función de la carga eléctrica de su superficie, interactuar con células cardíacas polarizadas (cardiomiocitos). En concreto, se ha mostrado cómo el uso de n P con carga superficial negativa facilita la entrada de la propia NP en el cardiomiocito a través de la formación de nanoporos transitorios compatibles con la viabilidad, en contraste con la respuesta apoptótica y la posterior muerte celular desencadenadas por el uso de NP con carga positiva. No obstante, a pesar de la eficacia parcial en administraciones in vitro, el potencial de estas NP de látex de poliestireno cargadas negativamente como potenciales vehículos de fármacos se limita drásticamente para administraciones crónicas, debido a los principales efectos secundarios, como los cambios en el perfil electrofisiológico y la sensibilización a la arritmia, siendo por lo tanto un límite considerable para un potencial uso terapéutico de las mismas in vivo. En el documento WO 2016/012452 se da a conocer la presencia de un compuesto de fluoruro en un proceso para obtener nanopartículas de fosfato de calcio amorfo recubiertas con citrato.
[0006] El objeto de la presente invención es proporcionar un enfoque a base de nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) para el tratamiento de enfermedades cardíacas, que no tenga los inconvenientes de la técnica anterior, entre los que se encuentra la alteración del perfil electrofisiológico cardíaco.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0007] Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente un proceso para la preparación de un producto que consiste en una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) capaces de encapsular y/o tener la superficie funcionalizada con uno o más agentes terapéuticos/de diagnóstico que han demostrado ser capaces de suponer un enfoque terapéutico para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares sin provocar arritmia ni cambios en el perfil electrofisiológico de las células cardíacas y caracterizado por la administración directa al miocardio a través de una vía de administración por inhalación no invasiva. Además, se pueden proporcionar otras vías de administración enteral y parenteral (es decir, intravenosa, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, intraocular, tópica o transdérmica). Además, cuando la superficie está funcionalizada con compuestos de diagnóstico/terapéuticos específicos de células no cardíacas, la presente invención está destinada a dirigirse a otro tejido que no sea el corazón.
[0008] Por lo tanto, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto que comprende una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) con una carga superficial negativa que tiene un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV, que comprende las etapas de:
a) mantener una mezcla que tiene un pH en el intervalo de 7 a 10 y que comprende una solución acuosa de calcio, una solución acuosa de fosfato y una solución de iones citrato a una temperatura en el intervalo de 20 °C a 40 °C durante un tiempo en el intervalo de 30 segundos a 10 minutos;
b) eliminar iones que no han reaccionado de la solución obtenida de la etapa a), obteniendo así una suspensión de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP);
c) recuperar el producto de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) a partir de la suspensión de la etapa b),
donde, en la mezcla de la etapa a), también hay presente una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y las nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) presentan una Z media determinada por dispersión de luz dinámica (DLS) en el intervalo de 150 a 231 nm, o la una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) recuperadas de la etapa c) tienen la superficie funcionalizada con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y tienen un factor de división (SF) de 1,76 como máximo, y donde dichos compuestos terapéuticos/de diagnóstico se seleccionan del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos y sondas de diagnóstico.
[0009] El proceso de la invención permite obtener un producto hecho de una o más CaP-NP con potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV y que tiene un factor de división (SF) de 1,76 como máximo, siendo capaz dicha una o más CaP-NP de entrar en células cardíacas y no provocar la alteración del perfil electrofisiológico cardíaco. El producto de la invención ha demostrado ser ventajoso en forma de nanopartículas con una morfología esferoidal.
[0010] En un aspecto preferido y ventajoso de la invención, el proceso de la invención comprende añadir, en la etapa a), una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico.
[0011] Sorprendentemente, y en el proceso preferido de la invención, el producto de la invención que se puede obtener de acuerdo con el aspecto preferido y ventajoso de la invención, consiste en una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) que encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico. El producto de la invención que también encapsula uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico ha demostrado sorprendentemente consistir en una o más CaP-NP cargadas negativamente con un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV y con un diámetro hidrodinámico promedio (medido como Z media) en el intervalo de 150 a 231 nm. El producto de la invención ha demostrado ser ventajoso en forma de NP con una morfología esferoidal.
[0012] Por lo tanto, ventajosamente, la invención contempla la adición a la mezcla de la etapa a) de una solución de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico. La invención con la adición de la solución de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico permite obtener NP con dimensiones y carga definidas con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico encapsulados en estas.
[0013] Por lo tanto, los inventores han descubierto sorprendentemente una baja temperatura de formación de las NP que encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico que asegura la formación instantánea de CaP a una baja cristalinidad, similar a la estructura cristalográfica de un CaP amorfo y de dimensiones en el intervalo de 150 a 231 nm. Sin limitarse a ninguna teoría, los inventores de la presente invención creen que la selección de las condiciones de temperatura y tiempo, así como la presencia de ion citrato, que es un agente estabilizante más «bioamigable» en comparación con los que se usan en la técnica anterior, han permitido estabilizar las CaP-NP que encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico, especialmente debido al ion citrato de la mezcla que, al unirse en la superficie, impide el crecimiento adicional de estas y las hace estables a nivel coloidal. Además, la presencia de ion citrato en la superficie, como se apreciará en la parte experimental, es capaz de hacer que la superficie de las CaP-NP esté cargada negativamente y cambie su potencial superficial a valores ampliamente negativos capaces de hacer que sean estables a nivel coloidal. Además, las CaP-NP que se pueden obtener con el proceso de la invención han demostrado tener una baja cristalinidad al presentar un factor de división (SF) de como máximo 1,76, y han permitido la encapsulación/funcionalización en la superficie de mayores cantidades de compuestos terapéuticos/de diagnóstico. De hecho, de acuerdo con los inventores, la baja cristalinidad conduce a un mayor desorden estructural y, por lo tanto, a una gran cantidad de sitios iónicos libres capaces de unirse a compuestos terapéuticos/de diagnóstico. Además, se observó que las CaP-NP de una forma de realización preferida y ventajosa de la invención presentaban un promedio de diámetro hidrodinámico (medido como media Z) en el intervalo de 150 a 231 nm, que permite ventajosamente su uso en el tratamiento de enfermedades cardíacas.
[0014] Otra característica ventajosa de la presente invención consiste en mezclar el compuesto terapéutico/de diagnóstico directamente durante la síntesis de CaP-NP.
[0015] Además, el bajo nivel de cristalinidad (expresado como factor de división (SF) de 1,76 como máximo) obtenido mediante este procedimiento incrementa el tiempo de degradabilidad de CaP-NP, favoreciendo así una liberación más rápida del compuesto terapéutico/de diagnóstico. Además, al aumentar el nivel de cristalinidad obtenido mediante este procedimiento, disminuye el tiempo de degradabilidad de CaP-NP, favoreciendo así una liberación lenta del compuesto terapéutico/de diagnóstico.
[0016] Otra característica ventajosa de la presente invención consiste en la posible funcionalización de la superficie del producto CaP-NP final, favoreciendo así las necesidades distintivas de la especificidad dirigida al fármaco (es decir, la unión de una diana extracelular para la guía específica de la célula y/o la activación/inhibición del receptor).
[0017] En la presente invención, el término/definición:
- «compuesto(s) terapéutico(s)/de diagnóstico» hace referencia a uno o más compuestos médicos, p. ej., ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos o sondas de diagnóstico para su liberación al órgano de interés;
- la «Z media» en el intervalo de 150 a 231 nm significa el diámetro hidrodinámico medio determinado por dispersión de luz dinámica (DLS).
- «CaP-NP cargadas negativamente con potencial Z en el intervalo de -27,0 mV a -41,0 mV» se refiere a CaP-NP con potencial Z determinado mediante dispersión de luz electroforética (ELS);
- el «factor de división (SF)» mide el grado de cristalinidad calculado a partir de los espectros FT-IR de la NP de acuerdo con Weiner S. y Bar-Yosef O. (1990). States of preservation of bones from prehistoric sites in the Near East: a survey. Journal of Archaeological Science 17, 187-196.
[0018] En otro aspecto de la misma, la invención se refiere a un producto que se puede obtener con el proceso de la invención para su uso como vehículo en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través de la administración por inhalación.
[0019] En un aspecto adicional y ventajoso de la misma, la invención se refiere a un producto que se puede obtener con el proceso de la invención en su forma de realización preferida y ventajosa con uno o más compuestos encapsulados en la una o más CaP-NP para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través de administración por inhalación.
[0020] Por lo tanto, la invención es particularmente ventajosa en el campo de la nanomedicina aplicada al tratamiento no invasivo de enfermedades cardiovasculares a través de la administración por inhalación.
[0021] Los inventores de la presente invención tuvieron sorprendentemente la intuición de tratar enfermedades cardiovasculares con el producto de la invención a través de la administración por inhalación, que permitió que el producto de la invención alcanzase el miocardio a través del eje corazón-pulmón. Como consecuencia, y sorprendentemente, el tratamiento por inhalación del producto de la invención permitió pasar la barrera pulmonar y translocarse a la circulación sanguínea, entrando así en la circulación sanguínea pulmonar-corazón y alcanzando el corazón donde se dirigiría al tejido/células cardíaca(s), e interactuar y ser internalizado por cardiomiocitos polarizados. Esto facilitó la liberación del compuesto terapéutico/de diagnóstico al miocardio.
[0022] Además, la invención se refiere a un producto que se puede obtener con el proceso de la invención administrable a través de otras vías de administración enteral y parenteral (es decir, intravenosa, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, intraocular, tópica, administración por nebulización o transdérmica).
[0023] Los inventores de la presente invención también tuvieron la intuición de emplear nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) para la encapsulación de compuestos que se liberan al miocardio. En el estudio que condujo a la invención, las CaP-NP del proceso de la invención fueron sorprendentes en la internalización del compuesto tanto en células cardíacas in vitro como en el miocardio in vivo. Sin limitarse a ninguna teoría, los inventores establecieron que en la aplicación específica, las CaP-NP preparadas según la invención y cargadas negativamente eran menos tóxicas para las células y facilitaban la internalización dependiente de endocitosis compatible con la viabilidad celular. Sorprendentemente, la presencia de una carga negativa hizo que las CaP-NP, como tales o encapsulando uno o más compuestos para su liberación al miocardio, fueran compatibles con la viabilidad de internalización en células que presentan membranas hiperpolarizadas (tales como cardiomiocitos) y desprovistas de efectos secundarios, como la aparición de arritmias. En otro aspecto de la invención, las CaP-NP pueden estar funcionalizadas en la superficie con ligandos de direccionamiento (es decir, anticuerpos, péptidos, aptámeros) para la unión directa específica de la célula, internalización y liberación intracelular de fármacos terapéuticos funcionales al órgano deseado, mejorando así la eficacia del fármaco mientras se minimiza la exposición sistémica al fármaco y los efectos secundarios adversos en tejidos que no sean el miocardio.
[0024] La invención se describirá ahora de forma detallada y se ejemplificará a continuación en la parte experimental.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0025]
La figura 1 muestra los efectos del citrato en las CaP-NP preparadas de acuerdo con la invención. (A, B) Evaluación de la estabilidad coloidal y las dimensiones de CaP-NP sintetizadas sin y con cantidades crecientes de citrato; (A) Z media como medida del diámetro hidrodinámico medio y (B) recuento del número de fotones por segundo medidos continuamente durante una hora mediante DLS.
La figura 2 muestra los efectos del tiempo de maduración en las CaP-NP generadas. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) de las CaP-NP a diferentes tiempos de síntesis y usando una concentración de citrato igual a 80 mM. Los picos en 560 y 603 correlacionan el grado de cristalinidad.
La figura 3 muestra (A) la conductividad de la solución de dializado en función del tiempo y (B) la estabilidad de las CaP-NP en solución después de 6 horas de diálisis evaluada mediante DLS a través de mediciones de la media.
La figura 4 muestra un análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de las CaP-NP sintetizadas usando una concentración de citrato igual a 80 mM sin (A) y después de 6 horas de diálisis (B); y (C) un análisis de las CaP-NP que se muestran en la figura 2B mediante espectroscopía EDX (espectrometría de rayos X por energía dispersiva).
La figura 5 muestra un análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de las CaP-NP-miR usando una concentración inicial de miR igual a 10 μg/ml.
La figura 6 muestra (A) una evaluación de la citotoxicidad celular analizada mediante un ensayo de exclusión con azul de tripano, un tinte capaz de marcar selectivamente solo las células muertas. Se usaron inhibidores de clatrina o dinamina para resaltar los procesos endocitóticos implicados en la internalización de las CaP-NP. (B) Evaluación de los niveles de apoptosis celular analizados mediante ensayo de caspasa 3-7. (C) Imagen de fluorescencia analizada mediante microscopía confocal de células HL-1 tratadas con CaP-NP-FITC. La señal CaP-NP-FITC identifica la internalización de CaP-NP-FITC en compartimentos intracelulares. DAPI = núcleo.
La figura 7 muestra los efectos de las CaP-NP en la electrofisiología de HL-1 después de 24 horas de exposición de 20 μg/ml de CaP-NP. En particular, muestra un diagrama de caja de las propiedades pasivas [potencial de membrana en reposo (arriba), capacitancia de membrana (centro) y resistencia de membrana (abajo)] para células HL-1 no expuestas (negro) y expuestas (gris) a 20 μg/ml de CaP-NP.
La figura 8 muestra los efectos de las CaP-NP en la electrofisiología de HL-1 después de 24 horas de exposición de 20 μg/ml de CaP-NP. En particular, muestra (A) curvas I-V obtenidas con protocolos de rampa en células HL-1 en condiciones de control (izquierda, negro: media+SD; SD mostrada como una banda) y exposición (derecha, gris). Fila inferior. Superposición de las dos curvas (izquierda) y curva de corriente de membrana neta de diferencia media (derecha). (B) Trazas de corriente de sodio representativas para ambas condiciones. Abajo. Corrientes máximas de sodio I-V y dependencias del voltaje de la activación del canal de sodio (g/gmax, derecha) para células HL-1 de control (negro) y expuestas (gris).
La figura 9 muestra los efectos de las CaP-NP en la electrofisiología de cardiomiocitos ventriculares de ratones adultos después de 5 horas de exposición de 20 μg/ml de CaP-NP. En particular, (A) curvas I-V obtenidas con protocolos de rampa en miocitos ventriculares adultos en condiciones de control (izquierda, negro: media+SD; SD mostrada como una banda) y de exposición (derecha, gris). (B) Superposición de las dos curvas (izquierda) y curva de corriente de membrana neta de diferencia media (derecha).
La figura 10 muestra los efectos de las CaP-NP en la electrofisiología de cardiomiocitos ventriculares de ratones adultos después de 5 horas de exposición de 20 μg/ml de CaP-NP. En particular, (A) Potenciales de acción representativos registrados en «configuración de pinza de corriente de célula entera» en condiciones de control y tras la aplicación de 20 μg/ml de CaP-NP. (B) Efecto de las CaP-NP en el potencial de membrana (Vm), la capacidad de membrana (Cm) y la resistencia de membrana (Rm) (arriba) de cardiomiocitos adultos. Efecto de las CaP-NP en el umbral de potencial de acción (APth) y la amplitud AP (APA) (centro), tasa máxima de ascenso de AP (dV/dtmax) y duración de AP en 90 % de repolarización (APD90) (abajo).
La figura 11 muestra los efectos de las CaP-NP en la electrofisiología de cardiomiocitos ventriculares de ratones adultos tras 5 horas de exposición de 20 μg/ml de CaP-NP. En particular, (A) Corrientes de sodio representativas registrados en «configuración de pinza de tensión de célula entera» en condiciones de control y tras la intervención con 20 μg/ml de CaP-NP (arriba). Superposición de las densidades medias de los picos de corriente de sodio en función del potencial de control (protocolos de "escalones de tensión») y dependencia del voltaje de las curvas de activación en estado estacionario obtenidas en condiciones de control (negro) y tras la aplicación de 20 μg/ml de CaP-NP (gris) (abajo). (B) Corrientes de calcio representativas registradas en «configuración de pinza de tensión de célula entera» en condiciones de control y tras la intervención con 20 μg/ml de CaP-NP (arriba). Superposición de las densidades medias de los picos de corriente de calcio en función del potencial de control (protocolos de «escalones de tensión») y dependencia del voltaje de las curvas de activación en estado estacionario obtenidas en condiciones de control (negro) y tras la aplicación de 20 μg/ml de CaP-NP (gris) (abajo).
La figura 12 muestra los efectos de las CaP-NP en los niveles de calcio citosólico (transitorios de calcio) de células HL-1 tras una exposición durante 24 horas a 20 μg/ml de CaP-NP. Los transitorios de calcio reflejan las variaciones cíclicas del ion en la alternancia de las fases sistólica/diastólica de los cardiomiocitos. Las células, analizadas mediante el sistema lonOptix, se cargaron con el fluoróforo sensible al calcio Fura2.
La figura 13 muestra los resultados de la internalización de miR-133 después de la administración de dosis crecientes de CaP-NP-miR a células HEK293. La cantidad de miR-133 internalizado se midió mediante PCR cuantitativa sobre el extracto de ARN total La lipofectamina es un control positivo de la transfección de miR-133 con liposomas.
La figura 14 muestra un perfil de electrogramas realizados en ratas adultas después de la administración traqueal de solución salina sola (control) o nanopartículas de la invención (CaP-NP).
La figura 15 muestra un análisis de microscopía en dos fotones en tejido miocárdico de un animal tratado con CaP-NP-FICT a través de instilación traqueal. Las imágenes muestran el alcance real del tejido ventricular por las CaP-NP-FITC. En las imágenes de la preparación en la parte inferior, las CaP-NP-FITC también están presentes dentro de un vaso.
La figura 16 muestra el potencial terapéutico del péptido mimético (MP) descrito en el documento PCT/EP2015/051376 es un modelo de ratón de miocardiopatía diabética. El MP es un péptido corto de 9aa que pertenece a una nueva clase de inótropos positivos. Actuando mediante mecanismos no convencionales (es decir, normalización de la densidad de la superficie celular del canal de calcio de tipo L dependiente del voltaje, que es el elemento desencadenante que conduce a la contracción sistólica dependiente del calcio, y sin alterar las propiedades de activación del canal), el MP restaura la fuerza del latido cardíaco y evita los inconvenientes perjudiciales de la clase anterior de inótropos (es decir, arritmogénesis y desechos de oxígeno miocárdico). (A) Eco, ecocardiografía. Acortamiento fraccional (%) según lo determinado por ecocardiografía en ratones tratados con estreptozotocina (STZ) y MP no encapsulado en CaP-NP (MP), CaP-NP con carga aleatoria (CaP-NP-HA) o CaP-NP con carga MP (CaP-NP-MP). (n=10) (B) Mediciones de corriente de Ca2+ en cardiomiocitos adultos aislados de ratones tratados. Se muestran las relaciones I/V (n>16). Los datos se muestran como las medias ± SEM; ****, P<0,0001. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0026] Por lo tanto, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto que comprende una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) con una carga superficial negativa que tiene un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV, que comprende las etapas de:
a) mantener una mezcla que tiene un pH en el intervalo de 7 a 10 y que comprende una solución acuosa de calcio, una solución acuosa de fosfato y una solución de iones citrato a una temperatura en el intervalo de 20 °C a 40 °C durante un tiempo en el intervalo de 30 segundos a 10 minutos;
b) eliminar iones que no han reaccionado de la solución obtenida de la etapa a), obteniendo así una suspensión de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP);
c) recuperar el producto de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) de la suspensión de la etapa b), donde, en la mezcla de la etapa a), también hay presente una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y las nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) presentan una Z media determinada por dispersión de luz dinámica (DLS) en el intervalo de 150 a 231 nm, o la una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) recuperadas de la etapa c) tienen la superficie funcionalizada con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y tienen un factor de división (SF) de 1,76 como máximo, y donde dichos compuestos terapéuticos/de diagnóstico se seleccionan del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos y sondas de diagnóstico.
[0027] Según la invención, la solución acuosa de calcio en la mezcla de la etapa a) es preferiblemente una solución de cloruro de calcio que tiene una molaridad en el intervalo de 20 a 200 mM.
[0028] Según la invención, la solución acuosa de fosfato en la mezcla de la etapa a) es preferiblemente una solución de Na2HPO4 que tiene una molaridad en el intervalo de 24 a 140 mM.
[0029] La temperatura de la etapa a) está en el intervalo de 20 °C a 40 °C. Preferiblemente, está en el intervalo de 35 a 40 °C, más preferiblemente es de aproximadamente 37 °C.
[0030] El tiempo de mantenimiento a una temperatura en el intervalo de 20 a 40 °C de la mezcla en la etapa a) está en el intervalo de 30 segundos a 10 minutos, preferiblemente es de aproximadamente 5 minutos.
[0031] La solución de iones citrato es preferiblemente una solución acuosa de citrato de sodio que tiene una molaridad en el intervalo de 40 a 800 mM.
[0032] La mezcla de la etapa a) tiene un pH en el intervalo de 7 a 10, más preferiblemente el pH de la mezcla es de 10.
[0033] Al final de la etapa a), la mezcla se somete a un proceso de eliminación de iones que no han reaccionado. Preferiblemente, dicha etapa se lleva a cabo por medio de una membrana de diálisis. Alternativamente, se puede utilizar deposición electroforética o cromatografía de exclusión molecular.
[0034] Cuando la invención utiliza una membrana de diálisis, es preferiblemente una membrana de celulosa que tiene un corte de 3500 Dalton. La etapa de eliminación b), llevada a cabo con una membrana de diálisis, se produce preferiblemente durante un tiempo de 5 a 24 horas, más preferiblemente durante 6 horas.
[0035] Al final de la etapa de eliminación de iones que no han reaccionado b), se obtiene una suspensión de nanopartículas que se puede someter a adición de agua bidestilada y liofilizarse para para obtener las CaP-NP de la etapa c). Alternativamente, el producto de la etapa c) se puede liofilizar para obtener polvos.
[0036] El proceso de la invención permite obtener un producto hecho de una o más CaP-NP con un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV que sea capaz de entrar en las células cardíacas y no causar la alteración del perfil electrofisiológico cardíaco, como se mostrará en la parte experimental. El producto de la invención ha demostrado ser ventajoso en forma de NP con una morfología esferoidal. Además, las NP que se pueden obtener con el proceso de la invención han demostrado tener una baja cristalinidad medida como factor de división de las NP que permitió la encapsulación de mayores cantidades de compuestos terapéuticos/de diagnóstico. Las NP que se pueden obtener a partir del proceso de la invención tienen una baja cristalinidad en comparación con la de un fosfato de calcio amorfo (como quedará claro a partir de la siguiente parte experimental), que deriva, de hecho, en un mayor desorden estructural y, por lo tanto, en una gran cantidad de sitios iónicos libres capaces de unirse a compuestos terapéuticos/de diagnóstico. En un aspecto preferido y ventajoso de la invención, el proceso de la invención comprende la adición, en la etapa a), de una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico. Alternativamente, en otro aspecto preferido y ventajoso de la invención, el proceso de la invención comprende la adición de una funcionalización de superficie del producto final con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico. La funcionalización de la superficie de las CaP-NP con compuestos terapéuticos/de diagnóstico se puede llevar a cabo, por ejemplo, mezclando durante diferentes períodos de tiempo, suspensiones de CaP-NP con soluciones de compuestos terapéuticos/de diagnóstico, y a continuación procesos de lavado. La unión estable entre compuestos terapéuticos/de diagnóstico y CaP-NP se puede producir principalmente a través de la formación de interacciones electrostáticas.
[0037] Uno o más de los compuestos de diagnóstico/terapéuticos se seleccionan preferiblemente de los grupos que consisten en ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos y sondas de diagnóstico.
[0038] La presencia en la etapa a) de la solución de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico de interés permite obtener, al final de la etapa c), CaP-NP que tienen el/los compuesto(s) terapéutico(s)/de diagnóstico encapsulado(s) en la estructura. Por consiguiente, sorprendentemente, el producto de la invención que se puede obtener de acuerdo con el aspecto preferido y ventajoso de la invención comprende una o más CaP-NP que encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y/o comprende uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico con superficie funcionalizada. El producto de la invención que encapsula uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico ha demostrado sorprendentemente comprender una o más CaP-NP cargadas negativamente con un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV y con una Z media en el intervalo de 150 a 231 nm. El producto de la invención con el/los compuesto(s) terapéutico(s)/de diagnóstico encapsulado(s) en la estructura ha demostrado encontrarse ventajosamente en forma de CaP-NP con morfología esferoidal.
[0039] En otro aspecto de la misma, la invención se refiere a un producto que se puede obtener con el proceso de la invención para su uso como vehículo en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través de la administración por inhalación.
[0040] En una forma de realización preferida, la invención se refiere al producto para su uso según la reivindicación 14, donde el tratamiento se lleva a cabo a través de una vía de administración seleccionada de entre administración por inhalación, administración enteral, administración parenteral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración oral, administración sublingual, administración por nebulización, administración rectal, administración intraocular, administración tópica y administración transdérmica.
[0041] Las enfermedades cardiovasculares en la presente invención comprenden insuficiencia cardíaca, disminución de la contracción miocárdica, fibrilación, miocardiopatía diabética, miocardiopatía dilatada, enfermedades genéticas (tales como síndrome de Brugada, síndrome de Timothy o síndrome de QT corto, distrofia muscular), hipertrofia cardíaca, hipotensión, hipertiroidismo, hipotiroidismo, insuficiencia cardíaca aguda, insuficiencia cardíaca crónica, infarto de miocardio.
PARTE EXPERIMENTAL
Ejemplo 1A. Preparación de las nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) de la invención
[0042] Se preparó una solución que contenía: 12,5 volúmenes de una solución de CaCl2 (10-50 mM) y Nas (C6H5O7) (40­ 200 mM), 1 volumen de una solución de NaOH (0,1-0,5 M) y 12,5 volúmenes de una solución de Na2HPO4 (12-60 mM) y después se colocó en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
[0043] Para eliminar los reactivos sin reaccionar, la solución de CaP-NP se sometió a diálisis durante 6 horas en una membrana de diálisis de celulosa que tiene un corte de 3500 Dalton y se sumergió en 400 ml de agua bidestilada. A continuación, la solución se recuperó y se almacenó en un frigorífico a 4 °C. La cantidad de CaP se evaluó mediante la liofilización de la muestra y pesando posteriormente el residuo inorgánico. La concentración final de la suspensión acuosa de CaP estaba en el intervalo de 60 a 300 μg/ml, en función de la concentración de reactivos.
[0044] Para preparar las nanopartículas, la reacción de síntesis entre Ca2 y PO43' se llevó a cabo a pH 10 ajustando el pH añadiendo una solución de NaOH (0,1-0,5 M) para impedir la formación de otras especies químicas. El citrato de sodio, presente en la solución inicial junto con sales de calcio y fosfato, fue el agente estabilizante que permitió que las partículas de CaP formasen cristales de manera controlada (cambiando el nivel de sobresaturación de Ca2+ y PO43').
[0045] La suspensión de NP se analizó mediante dispersión de luz dinámica (DLS) que reveló una Z media de las partículas en el intervalo de 100-200 nm.
[0046] La concentración final de la suspensión acuosa de CaP-NP de la etapa b) estaba en el intervalo de 60 a 300 μg/ml, en función de la concentración de reactivos. El análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) del producto de la invención, es decir, de las CaP-NP, reveló una Z media de aproximadamente 50 nm de diámetro.
Ejemplo 1B: efectos de ion citrato y de las condiciones de temperatura y tiempo en las CaP-NP de la invención
[0047] Para evaluar la esencialidad de la presencia de iones citrato en la etapa a), se evaluó el efecto del citrato en las dimensiones y en la estabilidad coloidal de CaP-NP de antemano mediante DLS.
[0048] Se mezclaron volúmenes iguales de soluciones de Na2HPO4 (24 mM) y CaCl2 (20 mM) NasCit (20, 40, 80 mM) directamente en la cubeta desechable, se mantuvieron a 37 °C durante 5 minutos y se sometieron a mediciones de DLS para evaluar el tamaño y la estabilidad del precipitado de CaP-NP en ausencia o en presencia de citrato. Se usaron diferentes concentraciones de citrato de sodio (20, 40, 80 mM).
[0049] El diámetro hidrodinámico y el número de fotones por segundo se midieron durante un período continuo de 60 minutos mediante DLS (figura 1A, B).
[0050] Los datos representados en la figura 1A, donde la Z media de las CaP-NP sintetizadas en presencia y en ausencia de citrato se midió en función del tiempo de cristalización, muestran claramente que el promedio de diámetro hidrodinámico de las CaP-NP cristalizado en ausencia de citrato ya después de unos pocos segundos de cristalización fue de aproximadamente 2 μm y permaneció estable durante un período de 60 minutos. Por otra parte, la Z media de las CaP-NP sintetizadas en presencia de citrato después de unos pocos segundos fue significativamente menor que las CaP-NP preparadas en ausencia de citrato (aproximadamente 100 nm). El diámetro hidrodinámico medio de CaP-NP sintetizadas en presencia de citrato aumentó lentamente con el tiempo que la muestra de control sin citrato, lo que indica que el citrato estabiliza el tamaño de las NP y reduce la tendencia de las CaP-NP a formar agregados. Además, estos datos muestran que, al aumentar la cantidad de citrato durante la síntesis, la Z media de CaP-NP aumenta más lentamente y que, independientemente de la concentración, en tiempos de cristalización bajos, el citrato ejerce su función de estabilización del tamaño de las NP.
[0051] La figura 1B muestra que el recuento del número de fotones por segundo del CPC sintetizado sin citrato o con una cantidad de 20 mM de citrato disminuye con el tiempo, de manera que la cantidad de material en la cuveta se reduce después de su depósito en el fondo. Por otra parte, el número de fotones detectados en el caso de CaP-NP sintetizadas en presencia de una cantidad de citrato igual a 40 y 80 mM permaneció estable con el tiempo, lo que indica la excelente estabilidad coloidal de las CaP-NP sintetizadas de este modo. En conclusión, las CaP-NP cristalizadas en presencia de citrato mostraron una mejor estabilidad dimensional y coloidal, por lo que la presencia de citrato fue esencial para la estabilidad de las partículas.
[0052] Tras evaluar el efecto del citrato, se evaluó el tiempo de cristalización óptimo. Las muestras de CaP-NP cristalizadas en presencia de 80 mM de citrato se prepararon a diferentes tiempos de cristalización (es decir, 5, 10, 20 y 60 minutos). Los productos de reacción se lavaron tres veces con agua mediante centrifugación a 5000 RPM (3,689 x g) durante 10 minutos y se caracterizaron mediante DLS, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). La cantidad de CaP-NP se evaluó pesando el residuo inorgánico después del lavado y la liofilización.
[0053] Los espectros de FTIR (figura 2) de las CaP-NP sintetizadas en diferentes momentos se registraron para evaluar la estructura química de las partículas. En todos los casos, se destacaron las bandas típicas de CaP. En concreto, es posible observar las bandas debido a los principales grupos funcionales presentes en esta estructura, tales como: 2 bandas a aproximadamente 1040 cirr1 y 1100 c irr1 debido a las vibraciones de estiramiento de los fosfatos; dos picos a 603 cm'1 y 560 cirr1 atribuibles a las vibraciones de flexión de los fosfatos; dos bandas pequeñas alrededor de 1450 citt 1 atribuibles a las vibraciones de estiramiento de los iones carbonato. Puesto que las CaP-NP se prepararon en una atmósfera no controlada, los iones carbonato pueden entrar espontáneamente en la estructura cristalina del material. Este fenómeno también se observa habitualmente en apatitas biológicas. En todos los materiales, se evidencia una banda más intensa a aproximadamente 1600 cm-1 atribuible a la vibración de estiramiento del grupo carboxilo del citrato. De este modo, se puede confirmar la presencia real de citrato unido en la superficie del CaP. A medida que aumentaba el tiempo de cristalización, se observó una clara transformación de un material con un orden bajo de largo alcance similar a un material amorfo a uno más cristalino.
[0054] A medida que aumentaba el tiempo de cristalización, la Z media de lasa CaP-NP aumentó hasta alcanzar el valor de aproximadamente 2 μm en aquellas sintetizadas después de 60 minutos. Solo en los casos de CaP-NP sintetizadas después de 5 y 10 minutos, el radio hidrodinámico medio cumplió con las características requeridas para su uso en la invención.
[0055] El grado de cristalinidad se calculó a partir de los espectros FT-IR en la figura 2 evaluando el factor de división (SF) (Weiner S. y Bar-Yosef O. (1990). States of preservation of bones from prehistoric sites in the Near East: a survey. Journal of Archaeological Science 17, 187-196). El SF se midió mediante la suma de las alturas de pico del estiramiento de fosfatos a 603 and 560 cm-1 dividida por la altura del punto de valle entre estos. Todas las alturas se midieron por encima de una línea de referencia dibujada de aproximadamente 780 a 495-1. Cuanto mayor sea el SF, mayor será la cristalinidad del material, como se muestra en la tabla 1 a continuación. El SF de CaP-NP después de 5 minutos de cristalización no podía medirse, ya que las bandas de fosfatos a 603 and 560 cm'1 no se resolvieron, lo que indica un grado de cristalinidad muy bajo. Por otra parte, el SF aumentó con el incremento del tiempo de cristalización, lo que indica que el tiempo de cristalización afectó al grado de cristalinidad del material.
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
[0056] Con tiempos de cristalización superiores a 10 minutos, el nivel de cristalinidad alcanzado fue finalmente demasiado alto, lo que hace que el producto no sea adecuado para la aplicación prevista. Ventajosamente, la disminución del tiempo de degradabilidad de las CaP-NP permitió tener una liberación lenta del compuesto terapéutico/de diagnóstico, mientras que, al aumentar el nivel de cristalinidad obtenido por este procedimiento, se redujo el tiempo de degradabilidad de las CaP-NP, determinando así una liberación lenta del compuesto terapéutico/de diagnóstico.
Ejemplo 1C: efectos de la etapa b) de la invención
[0057] Para eliminar los iones que no han reaccionado durante la cristalización, se usó diálisis, como se indica en el ejemplo 1A.
[0058] Para comprobar el tiempo óptimo para que todos los iones en exceso en el entorno de reacción se eliminen mediante diálisis, se evaluó la conductividad del medio de diálisis a lo largo del tiempo, y se observó una meseta después de 6 horas (figura 3A). La meseta de conductividad alcanzada indicó que el intercambio iónico del medio de reacción al medio de análisis había terminado, y que la mayoría de los iones que no habían reaccionado se habían transferido al agua de lavado. El potencial Z de CaP-NP después del tiempo de diálisis se midió como se muestra en la Tabla 2 que se indica a continuación.
Tabla 2
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[0059] Los resultados indicaron que el aumento del tiempo de diálisis redujo el diámetro hidrodinámico medio de las CaP-NP, mientras que el potencial Z permaneció constante. La estabilidad de las CaP-NP tras 6 hora de diálisis había sido confirmada mediante DLS (figura 3B). La figura 3B muestra el valor de la Z media de CaP-NP tras 6 horas de diálisis en función del tiempo. Se puede apreciar que no se observaron alteraciones en las dimensiones de CaP-NP hasta 300 minutos, de hecho, el valor dimensional parece permanecer constante a lo largo del tiempo. El inserto en la figura 3B muestra el número de fotones detectados por segundo durante un período de hasta 300 minutos. Este análisis permitió reconocer una estabilidad coloidal óptima de CaP-NP después de 6 horas de diálisis en solución, ya que el número de fotones permaneció constante durante 300 minutos.
[0060] La figura 4 muestra el análisis TEM de CaP-NP sin (figura 4A) y después de 6 horas de diálisis (figura 4B). Se puede observar que, antes de la diálisis, las CaP-NP (reconocibles por la dimensión esférica y por el color más oscuro y con dimensiones de aproximadamente 20-30 nm de diámetro) se recubren con una capa de material orgánico que es probablemente el citrato que permaneció en solución que no está físicamente unido a las CaP-NP. En cambio, las CaP-NP después de 6 horas de diálisis, también en este caso, tenían una morfología esferoidal y dimensiones de aproximadamente 30-50 nm, pero estaban mejor definidas y visiblemente sin la parte orgánica superficial. Los análisis de espectroscopía EDX (figura 4C) en el área seleccionada se realizaron en las CaP-NP tras 6 horas de diálisis, y mostraron las señales debidas a elementos Ca, P (además de las de Cu debidas al portamuestras y las de O y C debidas tanto a la muestra como al entorno externo), confirmando que las CaP-NP consisten principalmente en fosfato de calcio y no se forma ninguna otra fase durante la diálisis.
Ejemplo 2: Marcado de las CaP-NP de la invención
[0061] Para evaluar la internalización celular de NP obtenida del ejemplo 1A, las NP se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0062] Las CaP-NP se prepararon como en el ejemplo 1A, pero con la inclusión del compuesto FITC, como se describe a continuación.
[0063] Se preparó una solución que contenía: 12,5 volúmenes de una solución de CaCl2 (10-50 mM) y Nas (C6H5O7) (40­ 200 mM), 1 volumen de una solución de NaOH (0,1-0,5 M) y 12,5 volúmenes de una solución de Na2HPO4 (12-60 mM) y después se colocó en un baño de agua a 37 °C durante 5 min. Para eliminar los reactivos sin reaccionar, la solución de CaP-NP se sometió a diálisis durante 6 horas en una membrana de diálisis de celulosa con un corte de 3500 Dalton y se sumergió en 400 ml de agua bidestilada. A continuación, se obtuvo una suspensión de CaP-NP.
[0064] Inicialmente, FITC se conjugó con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS) (en adelante, se hace referencia a esta mezcla como FITC-APTS) siguiendo este protocolo: FITC (0,025 mmol) y APTES (0,25 mmol) se añadieron a 10 ml de etanol y se mantuvieron en agitación a 600 rpm en la oscuridad durante 24 horas.
[0065] A continuación, se añadieron 100 μl de FITC-APTS, 100 μl de hidróxido de amonio (28 % en peso de NH3 en H2O) y 100 μl de ortosilicato de etraetilo (TEOS) a la suspensión acuosa de CaP-NP. Esta suspensión se mantuvo en agitación a 600 rpm en la oscuridad durante 24 horas. Las CaP-NP-FITC se lavaron 3 veces con agua bidestilada por centrifugación para eliminar el FITC que no había reaccionado.
[0066] Las CaP-NP-FITC obtenidas se utilizaron, por lo tanto, en los ejemplos posteriores para la evaluación de la actividad biológica.
Ejemplo 3: Preparación de CaP-NP que encapsulan microARN (ejemplo de compuesto terapéutico) (CaP-NP-miR)
[0067] La preparación de CaP-NP con encapsulación de microARN se llevó a cabo siguiendo de forma detallada el protocolo de preparación según lo descrito en el ejemplo 1A implementado mediante la inclusión del compuesto de microARN como se describe a continuación. El microARN, correspondiente a los microARN miR-133, es una secuencia de nucleótidos sintética (sintetizada por IBA, Alemania).
[0068] Una solución que contenía: 12,5 volúmenes de una solución de CaCl2 (10-50 mM) y Nas (C6H5O7) (40-200 mM), 1 volumen de una solución de NaOH (0,1-0,5 M), 12,5 volúmenes de una solución de Na2HPO4 (12-60 mM) que contenía distintas concentraciones de microARN (0,5-10). A continuación, la solución se colocó en un baño de agua a 37 °C durante 5 min. Posteriormente, la suspensión se dializó durante 6 horas y se almacenó a 4 °C.
[0069] Las CaP-NP resultantes que encapsulaban miR-133 (denominadas en adelante brevemente CaP-NP-miR) se analizaron a continuación en cuanto a dimensiones, potencial Z y morfología. A continuación, la solución se recuperó y se almacenó en un frigorífico a 4 °C.
[0070] La concentración final de la suspensión acuosa de CaP-NP-miR estaba en el intervalo de 60 a 300 μg/ml (véase la tabla 3).
[0071] La caracterización de las partículas CaP-NP-miR se muestra a continuación en la tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0002
[0072] La suspensión de CaP-NP-miR se analizó mediante DLS, revelando una Z media de partículas en el intervalo de 150-231 nm y un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a - 27,0 mV. Además, el pdl presentaba valores cercanos a 0, lo que indica una distribución estrecha de las dimensiones de la muestra. El análisis t Em del producto de la invención, es decir, de las CaP-NP-miR, reveló que el tamaño de cada partícula individual era de aproximadamente 50 nm (figura 5).
Ejemplo 4: Evaluación de la cantidad de miR-133 encapsulado en las CaP-NP-miR de la invención en el ejemplo 3
[0073] Con el fin de evaluar la cantidad exacta de miR-133 encapsulado en las CaP-NP-miR, se realizó una medición de PCR cuantitativa (qPCR) en los ácidos nucleicos totales extraídos de CaP-NP-miR. A partir de tres preparaciones de CaP-NP-miR según se describe en el ejemplo 3 y usando distintas concentraciones de miR-133 (2, 25, 50 |jg) utilizadas durante la síntesis, se usaron 500 j l de una solución de CaP-NP-miR para la extracción de ARN a través del reactivo Purezol (Promega). Un total de 40 ng de ARN extraídos para cada preparación de CaP-NP-miR se sometieron a transcripción inversa usando un kit universal de síntesis de ADNc (Exiqon). A continuación, se utilizó 1/40 de la reacción de transcripción inversa para la posterior qPCR específica de miR-133, que se llevó a cabo por triplicado en un sistema de PCR en tiempo real VlIa™ 7 (Applied Biosystem) usando la mezcla maestra Select de SYBR® (Invitrogen). Después se determinó la cantidad exacta de miR-133 usando un método de cuantificación absoluta usando diluciones en serie de un ADNc derivado de una cantidad conocida de oligo sintético de miR-133 (dilución 1:10 desde un punto de partida de 40 fentomoles). La cantidad de miR-133 unido a las CaP-NP se estimó trazando el Ct derivado en la curva estándar lineal. La cantidad de miR-133a unido a las CaP-NP se muestra en la tabla 4. Los resultados muestran que más del 50 % del microARN utilizado durante la reacción había sido encapsulado en las CaP-NP.
Tabla 4
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Ejemplo 5: Evaluación in vitro de CaP-NP y toxicidad
[0074] Las CaP-NP obtenidas en el ejemplo 1A se analizaron in vitro para determinar la biocompatibilidad y toxicidad, exponiendo la línea celular cardíaca HL-1 a dosis crecientes de CaP-NP (0-500 ug/ml). Como primera etapa, se llevó a cabo una evaluación de la citotoxicidad mediante un ensayo de exclusión con azul de tripano, un tinte capaz de marcar selectivamente solo las células muertas. Como se muestra en la figura 6A, la línea HL-1 toleró la administración de las cantidades analizadas, mientras que solo se observó un aumento en la mortalidad celular a dosis altas (>125 ug/ml). Posteriormente, se utilizó un ensayo de caspasa-3-7 para la evaluación de cualquier respuesta apoptótica inducida tras la administración de CaP-NP. Como se muestra en la figura 6B, solo se observaron diferencias significativas en términos de actividad apoptótica a altas concentraciones de CaP-NP > 250 ug/ml. Por lo tanto, ambos ensayos eligieron las CaP-NP como potencial vehículo para la internalización de los compuestos de interés en el miocardio.
Ejemplo 6: Evaluación de la internalización de CaP-NP
[0075] Con el fin de evaluar la internalización celular de CaP-NP, se expusieron células HL-1 a una concentración de 20 jg/m l de CaP-NP-FITC del ejemplo 2 y se llevó a cabo un análisis de microscopía confocal 24 horas después de la administración. Como se muestra en la figura 6C, se obtuvo una clara internalización de CaP-NP-FITC en distintos compartimentos vesiculares intracelulares. Para determinar si esta internalización se debió realmente a mecanismos activos de endocitosis, se utilizaron inhibidores específicos de clatrina o dinamina, proteínas implicadas en la invaginación y endocitosis de la membrana plasmática. Por lo tanto, las células HL-1 se trataron previamente con estos inhibidores y después se expusieron a concentraciones crecientes de CaP-NP. Como se muestra en la figura 6A, la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina/dinamina redujo significativamente la toxicidad celular (en el ensayo de exclusión con azul de tripano) inducida por las CaP-NP en todas las dosis, reflejando así una inhibición de la absorción celular de CaP-NP.
Ejemplo 7: Evaluación in vitro de CaP-NP y propiedades electrofisiológicas
[0076] Uno de los principales problemas en el uso de nanopartículas a base de calcio en células excitables, tales como cardiomiocitos, es el efecto potencial en las propiedades electrofisiológicas. Por consiguiente, se estudiaron las propiedades biofísicas de dos tipos de células (los cardiomiocitos ventriculares de ratón adulto y HL-1). En primer lugar, se analizaron las características del potencial de acción (AP) en células HL-1 tras la administración aguda y crónica de 20 jg/m l de CaP-NP del ejemplo 1A. Específicamente, 24 horas después de la administración, las HL-1 se utilizaron para experimentos en crónicos (24 horas de incubación con CaP-NP), mientras que los cardiomiocitos de ratón para los agudos (4 horas de incubación con CaP-NP). Tanto en condiciones crónicas como agudas, los experimentos electrofisiológicos, realizados con la técnica de fijación en parche en configuración de célula entera, no mostraron ninguna diferencia significativa entre las muestras tratadas y los controles, tanto en lo que respecta a las propiedades biofísicas de las células en reposo como para las características del potencial de acción obtenidas tras la estimulación eléctrica por encima del umbral (figura 7-11). Por lo tanto, se observó que los parámetros que definen el fenotipo eléctrico de estas células y que aportan las características típicas de excitabilidad a las mismas, tales como el potencial de membrana (Vm), la capacidad de membrana (Cm), la resistencia de membrana (Rm), el umbral de potencial de acción (AP), la anchura de AP (APA), la velocidad máxima de ascenso de AP (dV/dTmax) y la duración de AP (APD), no se alteraron significativamente tras la administración de CaP-NP a las concentraciones indicadas anteriormente. Además, los análisis, de nuevo con la técnica de fijación en parche, de las principales corrientes iónicas presentes normalmente en los dos tipos celulares estudiados en función del AP típico característico de las células cardíacas (corrientes de potasio, sodio y calcio) no mostraron diferencias significativas entre el control y el tratado con CaP-NP tanto en condiciones crónicas como agudas).
[0077] Por último, se llevó a cabo una evaluación de los cambios citosólicos en los niveles de calcio (transitorio de calcio) que refleja los cambios cíclicos en el calcio tras la alternancia de las fases sistólica/diastólica de los cardiomiocitos. Como se muestra en la figura 12, no se destacó ninguna alteración significativa entre las diferentes condiciones.
[0078] En conclusión, los datos anteriores muestran que las CaP-NP entraron efectivamente en el espacio citoplasmático intracelular sin alterar las propiedades fisiológicas de las células cardiomiocíticas.
Ejemplo 8: Efectos de CaP-NP con compuestos encapsulados terapéuticos/de diagnóstico
[0079] Se evaluó la internalización celular de CaP-NP con un oligo dúplex sintético que imita el miR-133 (utilizado en el ejemplo 3) encapsulado en esta. Por lo tanto, el producto de la invención se preparó como CaP-NP conjugadas con miR-133 (CaP-NP-miR) siguiendo el ejemplo 3 y utilizando una solución de miR-133 sintético. miR133, un microARN específico del músculo, que se sabía que era un modulador del receptor beta-adrenérgico negativo.
[0080] La internalización del compuesto de la invención se confirmó entonces mediante qPCR realizada en ARN total extraído de células previamente tratadas con dosis graduales de CaP-NP-miR. Como se muestra en la figura 13, cada tratamiento con dosis crecientes de CaP-NP-miR correspondía a valores graduales de miR-133 intracelular.
[0081] Estos datos proporcionaron pruebas de que el compuesto miR-133, encapsulado en las partículas de CaP-NP-miR, estaba realmente internalizado activamente en las células. Por lo tanto, dichas pruebas respaldan el uso de CaP-NP para una administración intracelular eficaz de compuestos terapéuticos/de diagnóstico.
Ejemplo 9: Evaluación in vivo de los posibles efectos adversos en la función cardíaca tras la administración del producto de la invención
[0082] Para evaluar si las CaP-NP producidas en el ejemplo 1A) alcanzaron con éxito el miocardio sin afectar a la actividad cardíaca, se realizó una prueba in vivo en rata adulta. A los animales, anestesiados según lo descrito en el documento Rossi et al. AJP 2008, se les administró por vía traqueal una solución salina tal como (CTL) o que contenía CaP-NP a una concentración de 3 mg por kg de peso corporal del animal. 4 horas después del tratamiento, los animales se sometieron a análisis electrofisiológico. Los electrogramas obtenidos de un dispositivo de electrodo situado en la superficie epicárdica se muestran en la figura 15. Como se muestra en la figura 14 y en la tabla 5 que se expone a continuación, los electrogramas no mostraron diferencias cualitativas entre los dos grupos experimentales en términos de P, PQ, QRS, QT, ERP, RR.
Tabla 5: Electrogramas de animales tratados con solución salina tal como (CTL) o que contiene las CaP-NP
Figure imgf000012_0001
[0083] Por lo tanto, la no alteración de los parámetros del ECG cardíaco confirmó que una administración de CaP-NP no condujo a ninguna forma de modulación de la excitabilidad cardíaca, anticipando así la tolerancia cardíaca fisiológica al producto de la invención y la superación del problema técnico anticipado por el uso de nanopartículas de una naturaleza distinta.
[0084] Por último, para evaluar la administración real de las CaP-NP al corazón, las ratas se expusieron a una única administración intratraqueal de una solución salina que contenía CaP-NP-FITC (isotiocianato de fluoresceína) (3 mg/kg) preparada como se muestra en el ejemplo 1B. 4 horas después de la administración, se aisló el corazón y se analizó mediante microscopía de dos fotones. Sorprendentemente, se observó una amplia distribución del producto de la invención en el tejido cardíaco, con abundancia particular en el ventrículo izquierdo, lo que sugiere que el producto de la invención llegó realmente al corazón a través de la administración traqueal. Este resultado se representa mediante la imagen de fluorescencia del tejido cardíaco como se muestra en la figura 15. Además, un enfoque de administración múltiple (una vez al día repetida tres veces y cada dos días) condujo a un incremento en la fluorescencia principalmente en la cámara ventricular izquierda del corazón, lo que sugiere que la biodisponibilidad cardíaca relacionada con el tejido cardíaco siguió un aumento dependiente de la dosis.
Ejemplo 10: Potencial terapéutico del producto de la invención en un modelo de ratón de enfermedad cardíaca (miocardiopatía diabética)
[0085] Para explorar aún más la posible aplicación terapéutica, las CaP-NP se produjeron como en el ejemplo 1A) implementado mediante la inclusión del péptido mimético (MP) como se describe para el microARN en el ejemplo 3. El m P es un péptido corto de 9aa (sintetizado por Genescript, EE. UU.) que pertenece a una nueva clase de inótropos positivos. Actuando mediante mecanismos no convencionales (es decir, normalización de la densidad de la superficie celular del canal de calcio de tipo L dependiente del voltaje, que es el elemento desencadenante que conduce a la contracción sistólica dependiente del calcio, y sin alterar las propiedades de activación del canal), el MP restaura la fuerza del latido cardíaco en condición de disfunción cardíaca donde la densidad LTCC y, en consecuencia, la contractilidad cardíaca, está regulada a la baja (es decir, miocardiopatía diabética, DM). Para inducir la DM, se les inyectó estreptozotocina (STZ) a los ratones, un compuesto que es tóxico para las células beta del páncreas que producen insulina. Curiosamente, 10 días de un tratamiento por inhalación con MP-CaP-NP de ratones con DM restauraron completamente la función cardíaca, mientras que no se obtuvieron efectos cuando se administró el MP solo o CaP-NP aleatorias (CaP-NP-HA) (figura 16A). Además, los análisis funcionales de cardiomiocitos aislados de los mismos ratones tratados revelaron que las MP-CaP-NP restauraron la corriente de calcio (Ica) (figura 16B).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Proceso para la preparación de un producto que comprende una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) con una carga superficial negativa que tiene un potencial Z determinado por dispersión de luz electroforética (ELS) en el intervalo de - 41,0 mV a -27,0 mV, que comprende las etapas de:
a) mantener una mezcla que tiene un pH en el intervalo de 7 a 10 y que comprende una solución acuosa de calcio, una solución acuosa de fosfato y una solución de iones citrato a una temperatura en el intervalo de 20 °C a 40 °C durante un tiempo en el intervalo de 30 segundos a 10 minutos;
b) eliminar iones que no han reaccionado de la solución obtenida de la etapa a), obteniendo así una suspensión de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP);
c) recuperar el producto de una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) a partir de la suspensión de la etapa b),
donde, en la mezcla de la etapa a), también hay presente una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y las nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) presentan una Z media determinada por dispersión de luz dinámica (DLS) en el intervalo de 150 a 231 nm, o la una o más nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) recuperadas de la etapa c) tienen la superficie funcionalizada con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y tienen un factor de división (SF) de 1,76 como máximo, calculado a partir de los espectros FT-IR de las NP de acuerdo con Weiner S. y Bar-Yosef 0. (1990), y
donde dichos compuestos de diagnóstico/terapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos y sondas de diagnóstico.
2. Proceso según la reivindicación 1, donde la solución acuosa de calcio en la mezcla de la etapa a) es una solución de cloruro de calcio que tiene una molaridad en el intervalo de 20 a 200 mM.
3. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la solución acuosa de fosfato en la mezcla de la etapa a) es una solución de Na2HPO4 con una molaridad en el intervalo de 24 a 240 mM.
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la temperatura de la etapa a) está en el intervalo de 35 a 40 °C, más preferiblemente es de aproximadamente 37°C.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el tiempo de mantenimiento de la mezcla de la etapa a) es de aproximadamente 5 minutos.
6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la solución de iones citrato es una solución acuosa de citrato de sodio que tiene una molaridad en el intervalo de 40 a 800 mM.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la mezcla de la etapa a) tiene un pH de aproximadamente 10.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la etapa b) de eliminación de los iones que no han reaccionado se lleva a cabo a través de una membrana de diálisis.
9. Proceso según la reivindicación 8, donde la membrana de diálisis es una membrana de celulosa que tiene un corte de 3500 Dalton.
10. Proceso según la reivindicación 9, donde la etapa de eliminación b), llevada a cabo con una membrana de diálisis, se produce durante un tiempo de 5 a 24 horas, preferiblemente durante 6 horas.
11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la etapa de recuperación c) de las nanopartículas de fosfato de calcio (CaP-NP) se lleva a cabo mediante liofilización.
12. Producto que comprende una o más CaP-NP de encapsulación y/o con superficie funcionalizada con uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico, pudiendo obtenerse dichas CaP-NP mediante el proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde:
- las NP presentan una carga superficial negativa que tiene un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV y que tiene un factor de división (SF), calculado a partir de los espectros fT-IR de la NP de acuerdo con Weiner S. y Bar-Yosef O. (1990), de como máximo 1,76, o
- en la mezcla de la etapa a) hay también presente una solución acuosa de uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico y donde las NP encapsulan uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico, presentan una carga superficial negativa que tiene un potencial Z determinado mediante dispersión de luz electroforética (ELS) en el intervalo de -41,0 a -27,0 mV, y una Z media determinada mediante dispersión de luz dinámica (DLS) en el intervalo de 150 a 231 nm, y
donde dichos compuestos de diagnóstico/terapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, péptidos, compuestos sintéticos y sondas de diagnóstico.
13. Producto según la reivindicación 12 cuando presenta una carga superficial negativa que tiene un potencial Z en el intervalo de -41,0 mV a -27,0 mV y que tiene un factor de división (SF) de como máximo 1,76, donde la una o más CaP-NP comprende(n) uno o más compuestos terapéuticos/de diagnóstico funcionalizados en la superficie.
14. Producto según la reivindicación 12-13 para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
15. Producto para su uso según la reivindicación 14, donde el tratamiento se lleva a cabo a través de una vía de administración seleccionada de entre administración por inhalación, administración enteral, administración parenteral, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración oral, administración sublingual, administración por nebulización, administración rectal, administración intraocular, administración tópica y administración transdérmica.
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