IT202000021292A1 - Composizione in forma di polvere a base di microparticelle incorporanti nanoparticelle per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?COMPOSIZIONE IN FORMA DI POLVERE A BASE DI MICROPARTICELLE INCORPORANTI NANOPARTICELLE PER LA VEICOLAZIONE DI COMPOSTI TERAPEUTICI/DIAGNOSTICI?
DESCRIZIONE
Il progetto che ha portato a questa domanda ha ricevuto un finanziamento dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 CUPIDO dell'Unione Europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 720834.
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una composizione in forma di polvere per uso inalatorio comprendente una popolazione di microparticelle comprendenti almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici.
STATO DELLA TECNICA
Sono noti e in via di progressivo sviluppo medicinali a base di nanoparticelle di calcio fosfato ad uso medicale in grado di veicolare composti terapeutici/diagnostici ad un organo, allo scopo di trattare terapeuticamente in modo selettivo ed efficace una determinata condizione patologica in un paziente.
Ad esempio, WO 2016/102576 descrive la preparazione di un prodotto comprendente una o pi? nanoparticelle di fosfato di calcio con carica superficiale negativa avente un potenziale ? nell'intervallo da -41.0 mV a -27.0 mV comprendente le fasi di: a) mantenere una miscela avente un pH compreso tra 7 e 10 e comprendente una soluzione acquosa di ioni di calcio, una soluzione acquosa di ioni fosfato e una soluzione di ioni citrato ad una temperatura compresa tra 20 ? C e 40 ? C per un tempo compreso tra 30 secondi e 10 minuti; b) rimuovere gli ioni non reagiti dalla soluzione del passaggio a), ottenendo cos? una sospensione di una o pi? nanoparticelle di fosfato di calcio; c) recuperare il prodotto di una o pi? nanoparticelle di fosfato di calcio dalla sospensione della fase b). Il prodotto dell'invenzione pu? essere utilizzato come veicolo per uno o pi? composti diagnostici / terapeutici per il trattamento di patologie quali le malattie cardiovascolari.
Un aerosol ? definito come una fine dispersione di particelle (solide o liquide) in aria e nel settore delle tecnologie farmaceutiche gli aerosol per inalazione sono promettenti mezzi di somministrazione oggetto di studio anche per quanto riguarda i medicinali a base di nanoparticelle, poich? permettono di sfruttare i polmoni anche come sito di assorbimento di farmaci ad azione sistemica, oltre che per il trattamento locale di malattie come l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva, le infezioni polmonari ecc.
Tuttavia, la Richiedente ha rilevato che l?utilizzo di aerosol per inalazione per la somministrazione di materiali nanoparticellari in grado di veicolare composti terapeutici/diagnostici oltre a richiedere l?impiego di idonei dispositivi di erogazione (inalatori) che impongono vincoli relativi al loro dosaggio ed emissione, presenta ad oggi limiti tecnici e funzionali di duplice natura, che necessitano ancora di essere affrontati e bilanciati reciprocamente.
Sotto un primo profilo, vi ? infatti l?esigenza di controllare adeguatamente ed ottimizzare i fenomeni di deposizione polmonare delle particelle dell?aerosol stesso (caratteristica generalmente indicata come ?respirabilit??), in quanto particelle di dimensioni troppo piccole dopo inalazione vengono facilmente espirate senza depositarsi. La Richiedente ha riscontrato che questo fenomeno pu? comportare in particolare una non efficace somministrazione del farmaco e/o la necessit? di dover ricorrere all?emissione ed inalazione da parte del paziente di maggiori quantit? di aerosol, con ci? impattando negativamente sui costi e sull?efficacia del trattamento terapeutico.
Sotto un ulteriore profilo, vi sono inoltre anche altre caratteristiche dei materiali nanoparticellari che possono precluderne una efficace somministrazione mediante aerosol per inalazione. Le nanoparticelle infatti possono facilmente andare incontro a fenomeni di aggregazione e questo ne rende difficoltoso il dosaggio e l?erogazione, in quanto altera in maniera non controllabile le propriet? aerodinamiche dell?aerosol. Inoltre, fenomeni di aggregazione nei materiali nanoparticellari possono avere un impatto negativo sull?efficacia della loro somministrazione, poich? alterandone le caratteristiche dimensionali e superficiali delle nanoparticelle, ne compromettono una corretta deposizione polmonare ed un efficace assorbimento da parte dell?organismo del paziente e, conseguentemente, anche la veicolazione dei composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
La Richiedente ha riscontrato che esistono e sono oggetto di sperimentazione tecnologie volte a migliorare le caratteristiche di respirabilit? delle nanoparticelle che prevedono l?incorporazione delle stesse in matrici micrometriche (cos? da ottenere le cosiddette ?nano embedding microparticles?, NEM).
La Richiedente ha tuttavia riscontrato che il ricorso a dette tecnologie non risolve ed anzi pu? favorire l?aggregazione delle nanoparticelle, con ci? compromettendone le caratteristiche dimensionali e superficiali e quindi la corretta deposizione polmonare e l?efficace assorbimento da parte dell?organismo del paziente e, conseguentemente, la capacit? di veicolare composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
Scopo primario della presente invenzione ? pertanto quello di individuare una composizione per somministrare in maniera efficace ad un paziente per via inalatoria nanoparticelle ad uso medicale in grado di veicolare ad un sito bersaglio composti terapeutici/diagnostici, cos? da superare i limiti tecnici e funzionali di cui sopra.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
In accordo con la presente invenzione, la Richiedente ha sorprendentemente riscontrato che queste desiderate caratteristiche possono essere conseguite individuando una specifica tipologia di matrice in cui incorporare nanoparticelle di fosfato di calcio che gi? comprendono uno o pi? composti terapeutici/diagnostici, ottenendo cos? una composizione in forma di polvere micronizzata particolarmente adatta ad essere utilizzata per somministrare in maniera efficace ad un paziente per via inalatoria nanoparticelle ad uso medicale in grado di veicolare ad un sito bersaglio composti terapeutici/diagnostici.
Pertanto, in un suo primo aspetto la presente invenzione si riferisce ad una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
Grazie alla incorporazione di nanoparticelle di fosfato di calcio che comprendono uno o pi? composti terapeutici/diagnostici in una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione, infatti, permette di somministrare efficacemente per via inalatoria nanoparticelle ad uso medicale in grado di veicolare composti terapeutici/diagnostici, garantendo un?elevata resa di deposizione polmonare delle stesse e prevenendo fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle stesse, anche nel sito di deposizione, assicurando cos? un adeguato assorbimento dei composti terapeutici/diagnostici e la loro efficace veicolazione al sito bersaglio.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che utilizzando un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua ? possibile incorporare in maniera efficace nanoparticelle di calcio fosfato che gi? comprendono uno o pi? composti terapeutici/diagnostici ottenendo cos? microparticelle di dimensioni idonee per generare un aerosol per inalazione caratterizzato da elevata respirabilit?, con ci? permettendo una efficace somministrazione e deposizione a livello polmonare nel paziente. Una volta depositate le microparticelle, la matrice di veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua si discioglie efficientemente liberando cos? le nanoparticelle, che vengono vantaggiosamente riottenute in forma dispersa e con le desiderate caratteristiche superficiali e dimensionali e che possono quindi efficacemente veicolare i composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che la specifica interazione tra il veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua e la nanoparticella di calcio fosfato in presenza di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici permette da un lato di prevenire fenomeni di aggregazione in fase di preparazione della microparticella stessa, contribuendo cos? ad ottenere microparticelle con caratteristiche idonee alla loro respirabilit?, e dall?altro, previene fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle successivamente alla dissoluzione della matrice nel sito di deposizione polmonare.
In questo modo, la composizione secondo la presente invenzione vantaggiosamente permette la somministrazione mediante aerosol per inalazione di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici e al contempo di renderle prontamente disponibili nel sito di deposizione dopo dissoluzione della matrice che le incorpora con le giuste dimensioni e caratteristiche superficiali per poter veicolare efficacemente al sito bersaglio detti composti terapeutici/diagnostici.
Pertanto, la presente invenzione riguarda, in un suo ulteriore aspetto la composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, per l'uso come medicinale.
Sotto un ulteriore e vantaggioso aspetto, la presente invenzione riguarda la composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, per l'uso nel trattamento di malattie cardiovascolari, di malattie respiratorie, nonch? per l?uso come sostanza immunostimolante.
In un aspetto vantaggioso della presente invenzione, la composizione in polvere secondo la presente invenzione, quando utilizzata come medicinale, ad esempio nel trattamento di malattie cardiovascolari, viene somministrata per inalazione.
Le propriet? della composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione ne rendono infatti particolarmente vantaggiosa la somministrazione per inalazione come polvere secca.
La presente invenzione, pertanto, in un suo ulteriore aspetto riguarda un dispositivo per l'inalazione comprendente un contenitore contenente una composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione.
Convenientemente, la composizione in polvere secondo la presente invenzione presenta l?ulteriore vantaggio di essere ottenibile mediante un metodo semplice e altamente riproducibile. Ci? contribuisce a rendere la produzione della composizione secondo la presente invenzione economicamente competitiva.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione pertanto riguarda un metodo per la preparazione della composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, comprendente le fasi di:
- predisporre una prima dispersione acquosa di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici;
- disciogliere nella dispersione della fase a) almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, cos? da ottenere una seconda dispersione acquosa;
- essiccare a spruzzo detta seconda dispersione acquosa.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Nei disegni:
- La Figura 1 mostra le microparticelle dell?esempio 1 viste mediante SEM (1a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (1b);
- La Figura 2 mostra le microparticelle dell?esempio 2 viste mediante SEM (2a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (2b);
- La Figura 3 mostra le microparticelle dell?esempio 3 viste mediante SEM (3a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (3b);
- La Figura 4 mostra le microparticelle dell?esempio 4 viste mediante SEM (4a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (4b);
- La Figura 5 mostra le microparticelle dell?esempio 5 viste mediante SEM (5a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (5b); e
- La Figura 6 mostra le microparticelle dell?esempio 6 viste mediante SEM (6a) e sezionate mediante Focus Ion Beam (6b).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Nell?ambito della presente invenzione si ? individuata una nuova composizione per somministrare in maniera efficace ad un paziente per via inalatoria nanoparticelle ad uso medicale in grado di veicolare composti terapeutici/diagnostici, cos? da superare i limiti tecnici e funzionali dell?arte nota.
Pi? in particolare, la presente invenzione, in un suo primo aspetto, si riferisce ad una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
Nell?ambito della presente descrizione e nelle successive rivendicazioni, tutte le grandezze numeriche indicanti quantit?, parametri, percentuali, e cos? via sono da intendersi precedute in ogni circostanza dal termine ?circa? se non diversamente indicato. Inoltre, tutti gli intervalli di grandezze numeriche includono tutte le possibili combinazioni dei valori numerici massimi e minimi e tutti i possibili intervalli intermedi, oltre a quelli indicati specificamente nel seguito.
Nella presente invenzione quando si usa la definizione:
- ?microparticella?, si intende una particella avente un diametro volume inferiore a 10 ?m;
- ?nanoparticella?, si intende si intende una particella avente un diametro volume inferiore a 300 nm;
- ?dose predosata? (nel prosieguo anche indicata come ?MD?), si intende la massa di composizione in forma di polvere caricata in un dispositivo per l'inalazione di una composizione in forma di polvere mediante aerosol (inalatore). Solitamente detta composizione viene caricata in una cartuccia, o capsula rigida;
- ?dose emessa? (nel prosieguo anche indicata come ?ED?), si intende la quantit? di dose predosata emessa dall?inalatore, a seguito di un atto inalatorio. La dose emessa ? misurabile secondo il metodo della Farmacopea Europea 9.0 capitolo 2.9.18, utilizzando gli impattatori Fast Screening Impactor e Next Generation Impactor.
- ?frazione emessa? (nel prosieguo anche indicata come ?EF?), si intende il rapporto tra dose emessa e dose predosata, ovvero il rapporto ED/MD;
- ?diametro aerodinamico? si intende il diametro di una sfera di densit? unitaria che ha la stessa velocit? di sedimentazione della particella reale presa in esame. Detto valore ? misurabile applicando il metodo descritto in Farmacopea Europea 9.0 capitolo 2.9.18, utilizzando gli impattatori Fast Screening Impactor e Next Generation Impactor;
- ?diametro aerodinamico mediano di massa? (nel prosieguo anche indicato come ?MMAD?), si intende la mediana della distribuzione del diametro aerodinamico delle particelle della composizione in forma di polvere;
- ?diametro proiezione? si intende il diametro sferico equivalente che corrisponde al diametro del cerchio che possiede la stessa area di proiezione su di un piano della particella, determinato con una qualsiasi idonea tecnica microscopica (ad esempio con un Microscopio a Scansione Elettronica);
- ?particelle fini? (nel prosieguo anche indicate ?FP?) si intendono particelle con diametro aerodinamico inferiore a 5.0 ?m;
- ?particelle extra-fini? (nel prosieguo anche indicate ?EFP?) si intendono particelle con diametro aerodinamico inferiore a 3.0 ?m;
- ?dose di particelle fini? (nel prosieguo anche indicata come ?FPD?), si intende la quantit? di particelle fini di una composizione in forma di polvere;
- dose di particelle extra-fini? (nel prosieguo anche indicata come ?EFPD?), si intende la quantit? di particelle extra-fini di una composizione in forma di polvere;
- ?frazione di particelle fini? (nel prosieguo anche indicata come ?FPF?), si intende il rapporto tra dose di particelle fini e dose emessa, ovvero il rapporto FPD/ED;
- ?frazione di particelle extra-fini? (nel prosieguo anche indicata come ?EFPF?), si intende il rapporto tra dose di particelle extra-fini e dose emessa, ovvero il rapporto EFPD/ED;
- ?diametro volume? si intende il diametro di una sfera perfetta avente lo stesso volume della particella in analisi. Il diametro volume ? misurabile con un metodo di diffrazione della luce laser.
- ?Dv50? (nel prosieguo anche indicato come ?diametro volume mediano? o ?VMD?) si intende la mediana della distribuzione di diametri volume di una pluralit? di particelle in analisi;
- ?Dv10? si intende il 10? percentile della distribuzione dei diametri volume di una pluralit? di particelle in analisi. ? il diametro al di sotto del quale si trova il 10% delle particelle del campione preso in analisi;
- ?Dv90? si intende il 90 ? percentile della distribuzione dei diametri volume di una pluralit? di particelle in analisi. ? il diametro al di sotto del quale si trova il 90% delle particelle del campione preso in analisi; e
- "alta respirabilit?" si intende una composizione in forma di polvere avente FPF maggiore di 0.5.
Grazie alla incorporazione di nanoparticelle di fosfato di calcio che comprendono uno o pi? composti terapeutici/diagnostici in una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione, infatti, permette di somministrare efficacemente per via inalatoria nanoparticelle ad uso medicale in grado di veicolare composti terapeutici/diagnostici, garantendo un?elevata resa di deposizione polmonare delle stesse e prevenendo fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle stesse, anche nel sito di deposizione, assicurando cos? un adeguato assorbimento dei composti terapeutici/diagnostici e la loro efficace veicolazione al sito bersaglio.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che utilizzando un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua ? possibile incorporare in maniera efficace nanoparticelle di calcio fosfato che gi? comprendono uno o pi? composti terapeutici/diagnostici ottenendo cos? microparticelle di dimensioni idonee per generare un aerosol per inalazione caratterizzato da elevata respirabilit?, con ci? permettendo una efficace somministrazione e deposizione a livello polmonare nel paziente. Una volta depositate le microparticelle, la matrice di veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua si discioglie efficientemente liberando cos? le nanoparticelle, che vengono vantaggiosamente riottenute in forma dispersa e con le desiderate caratteristiche superficiali e dimensionali e che possono quindi efficacemente veicolare i composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che la specifica interazione tra il veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua e la nanoparticella di calcio fosfato in presenza di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici permette da un lato di prevenire fenomeni di aggregazione in fase di preparazione della microparticella stessa, contribuendo cos? ad ottenere microparticelle con caratteristiche idonee alla loro respirabilit?, e dall?altro, previene fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle successivamente alla dissoluzione della matrice nel sito di deposizione polmonare.
La presente invenzione pu? presentare in uno o pi? dei suoi aspetti una o pi? delle caratteristiche preferite qui di seguito riportate, le quali possono essere combinate fra loro a seconda delle esigenze applicative.
La composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione comprende una pluralit? di microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua che incorpora almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
Preferibilmente detta almeno una nanoparticella ha diametro idrodinamico medio (Z-medio) determinato mediante diffrazione della luce laser compreso tra 50 e 300 nm, pi? preferibilmente tra 50 e 100 nm. Dimensioni in questo intervallo si sono infatti rivelate particolarmente efficaci per l?assorbimento delle nanoparticelle attraverso i polmoni e per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
Preferibilmente detta almeno una nanoparticella ha carica superficiale negativa avente potenziale ? determinato mediante Electrophoretic Light Scattering (ELS) nell?intervallo da -10 mV a -41 mV, pi? preferibilmente da -15 mV a -30 mV. Potenziali ? in questo intervallo si sono infatti rivelati particolarmente efficaci per l?assorbimento delle nanoparticelle attraverso i polmoni e per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio
Preferibilmente detta almeno una nanoparticella comprende da 0.03% a 32% in peso, rispetto al peso di fosfato di calcio, di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
Preferibilmente, detta nanoparticella incapsula detto uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
Preferibilmente, detto uno o pi? composti terapeutici/diagnostici sono scelti nel gruppo che consiste di: un acido nucleico, un peptide, una proteina, un anticorpo, e un composto di sintesi, pi? preferibilmente scelti nel gruppo che consiste di: un acido nucleico, e un peptide.
In una forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione, detto acido nucleico ? selezionato nel gruppo che consiste di: un RNA interference (shRNA, siRNA, microRNA, lncRNA, aptamero), un RNA mimetico (microRNA mimics, lncrNA o altro RNA non codificante), un RNA codificante (mRNA), un RNA legante molecole (aptamero, lncRNA), un DNA codificante (cDNA) o legante molecole (aptamero), o un PNA (acido peptidonucleico).
In una ulteriore forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione, detto peptide ? selezionato nel gruppo che consiste di: un L- o D-retroinverso-peptide (<100 aminoacidi), un L- o D-retro-inverso-peptide mimetico, (<100 aminoacidi), o un L- o D-retro-inverso-peptide (mimetico) modificato, (<100 aminoacidi).
Senza per questo voler essere legati ad una particolare teoria, si ritiene che composti terapeutici/diagnostici quali quelli qui sopra descritti, ed in particolare acidi nucleici e peptidi, oltre a svolgere il proprio ruolo terapeutico/diagnostico nei confronti del paziente sorprendentemente contribuiscano anche sotto altri aspetti alle propriet? della composizione in polvere secondo la presente invenzione. Gli inventori hanno infatti riscontrato che i composti terapeutici/diagnostici nella nanoparticella di fosfato di calcio migliorano sia le caratteristiche aerodinamiche delle microparticelle sia l?interazione tra la nanoparticella di fosfato di calcio stessa e il veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, contribuendo cos?, da un lato, all?ottenimento di valori di respirabilit? particolarmente elevati, sia a prevenire fenomeni di aggregazione tra le nanoparticelle anche successivamente alla dissoluzione della matrice nel sito di deposizione polmonare, con ci? preservando la possibilit? per le nanoparticelle stesse di essere assorbite a livello polmonare.
Preferibilmente, nella pluralit? di microparticelle della composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione il rapporto in peso (fosfato di calcio):(veicolo farmaceuticamente accettabile) ? compreso tra 1:2.5 e 1:7, pi? preferibilmente compreso tra 1:2.5 e 1:6, ancor pi? preferibilmente compreso tra 1:3 e 1:5, ottimamente compreso tra 1:3.5 e 1:4.5.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che rapporti in peso tra fosfato di calcio e un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua in detti intervalli influenzano positivamente le propriet? aerodinamiche delle microparticelle, contribuendo cos? all?ottenimento di una composizione in polvere dotata di una particolarmente alta respirabilit?.
Preferibilmente detto almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile ? un polialcolo, quale preferibilmente un composto selezionato nel gruppo che consiste di: mannitolo, xilitolo, sorbitolo, o lactitolo.
Pi? preferibilmente detto almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile ? mannitolo, che si ? mostrato particolarmente idoneo agli scopi della presente invenzione grazie all?instaurarsi di una interazione particolarmente efficace con la nanoparticella di calcio fosfato che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici, in grado cos? di contribuire all?ottenimento di una composizione in polvere avente propriet? aerodinamiche ideali per la realizzazione di un aerosol per inalazione e, al tempo stesso, in grado di prevenire fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle stesse sia durante la preparazione della composizione in polvere, che successivamente alla dissoluzione del veicolo stesso nel sito di deposizione. Dette caratteristiche permettono una efficace somministrazione delle nanoparticelle per via inalatoria garantendo un?elevata resa di deposizione delle stesse e un adeguato assorbimento dei composti terapeutici/diagnostici, nonch? la loro efficace veicolazione al sito bersaglio.
La composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione presenta propriet? aerodinamiche che la rendono particolarmente adatta ad essere utilizzata per la somministrazione mediante aerosol per inalazione, ed in grado di raggiungere efficacemente il sito di deposizione polmonare in elevata resa.
Preferibilmente, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione presenta una FPF maggiore di 0.5, pi? preferibilmente compresa tra 0.5 e 0.85, ancor pi? preferibilmente maggiore o uguale a 0.6.
Preferibilmente, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione presenta una EFPF superiore a 0.4.
Preferibilmente, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione presenta un diametro volume mediano (Dv50) inferiore a 5.0 ?m.
Preferibilmente, la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione presenta una frazione di microparticelle con diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) compreso tra 1.0 ?m e 5.0 ?m.
Caratteristiche aerodinamiche di FPF, EFPF, MMAD, e/o Dv50 negli intervalli sopra indicati rendono infatti la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione una composizione ad alta respirabilit?, consentendo cos? una efficace deposizione polmonare delle microparticelle prima dell?assorbimento delle nanoparticelle al fine di veicolare i composti terapeutici/diagnostici al sito bersaglio.
Preferibilmente, le microparticelle della composizione secondo la presente invenzione comprendono una quantit? d?acqua uguale o inferiore al 6 % in peso.
Preferibilmente, le microparticelle della composizione secondo la presente invenzione presentano una struttura interna porosa. Pi? preferibilmente, le microparticelle con struttura porosa presentano pori aventi diametro proiezione inferiore a 50 nm, ancor pi? preferibilmente compreso tra 10 e 50 nm, ottimamente di 20 nm.
In questo modo, le microparticelle secondo la presente invenzione mostrano valori di respirabilit? particolarmente elevati e gli inventori hanno in particolare osservato che la presenza di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici nelle nanoparticelle, preferibilmente acidi nucleici e peptidi, contribuisce all?ottenimento di una tale struttura porosa.
Pertanto, in una forma di realizzazione particolarmente preferita, la presente invenzione si riferisca ad una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle aventi struttura interna porosa e comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici, in cui detto uno o pi? composti terapeutici/diagnostici sono selezionati nel gruppo che consiste di: un acido nucleico, e un peptide.
In una forma di realizzazione particolarmente preferita, detto acido nucleico ? selezionato nel gruppo che consiste di: un RNA interference (shRNA, siRNA, microRNA, lncRNA, aptamero), un RNA mimetico (microRNA mimics, lncrNA o altro RNA non codificante), un RNA codificante (mRNA), un RNA legante molecole (aptamero, lncRNA), un DNA codificante (cDNA) o legante molecole (aptamero), un PNA (acido peptidonucleico).
In una ulteriore forma di realizzazione particolarmente preferita, detto peptide ? selezionato nel gruppo che consiste di: un L- o D-retro-inverso-peptide (<100 aminoacidi), o un L- o D-retro-inverso-peptide mimetico (<100 aminoacidi), o un L-o D-retro-inverso-peptide (mimetico) modificato, (<100 aminoacidi).
La composizione secondo la presente invenzione vantaggiosamente permette la somministrazione mediante aerosol per inalazione di nanoparticelle di calcio fosfato comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici e al contempo alle stesse di rendersi disponibili nel sito di deposizione dopo dissoluzione della matrice che le incorpora con le giuste dimensioni per poter veicolare efficacemente al sito bersaglio i composti terapeutici/diagnostici in esse.
Pertanto, la presente invenzione riguarda, in un suo ulteriore aspetto la composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, per l'uso come medicinale.
Sotto un ulteriore e vantaggioso aspetto, la presente invenzione riguarda la composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, per l'uso nel trattamento di malattie cardiovascolari, di malattie respiratorie, preferibilmente nasali, retronasali e polmonari, nonch? per l?uso come sostanza immunostimolante.
I vantaggi di questi ulteriori aspetti dell?invenzione sono gli stessi di quelli della composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto dell?invenzione.
In un aspetto vantaggioso della presente invenzione, la composizione in polvere secondo la presente invenzione, quando utilizzata come medicinale, ad esempio nel trattamento di malattie cardiovascolari, viene somministrata per inalazione.
Le propriet? della composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione ne rendono infatti particolarmente vantaggiosa la somministrazione per inalazione.
La presente invenzione, pertanto, in un suo ulteriore aspetto riguarda un dispositivo per l'inalazione comprendente un contenitore contenente una composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione. Preferibilmente, detto contenitore ? selezionato nel gruppo che consiste di: una cartuccia, una capsula rigida, o un blister.
In un ancor ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce anche ad una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio, in cui il rapporto in peso (fosfato di calcio):(un veicolo farmaceuticamente accettabile) ? compreso tra 1:2.5 e 1:7, pi? preferibilmente compreso tra 1:2.5 e 1:6, ancor pi? preferibilmente compreso tra 1:3 e 1:5, ottimamente compreso tra 1:3.5 e 1:4.5.
Gli inventori hanno infatti sorprendentemente scoperto che rapporti in peso tra fosfato di calcio e un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua in detti intervalli influenzano positivamente le propriet? aerodinamiche delle microparticelle, contribuendo cos? all?ottenimento di una composizione in polvere dotata di una particolarmente alta respirabilit?.
Detta composizione pu? essere vantaggiosamente utilizzata per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici di vario genere, ad esempio per la somministrazione mediante aerosol per inalazione.
Convenientemente, la composizione in polvere secondo la presente invenzione presenta l?ulteriore vantaggio di essere ottenibile mediante un metodo semplice e altamente riproducibile. Ci? contribuisce a rendere la produzione della composizione secondo la presente invenzione economicamente competitiva.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione pertanto riguarda un metodo per la preparazione della composizione in forma di polvere secondo il primo aspetto della presente invenzione, comprendente le fasi di:
a) predisporre una prima dispersione acquosa di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici;
b) disciogliere nella dispersione della fase a) almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, cos? da ottenere una seconda dispersione acquosa; e
c) essiccare a spruzzo detta seconda dispersione acquosa della fase b).
Sebbene la composizione in polvere secondo la presente invenzione sia ottenibile anche mediante altre tecniche note allo scopo all?esperto del ramo, il metodo per la preparazione della composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione vantaggiosamente risulta di semplice implementazione e elevata riproducibilit?, nonch? facilmente scalabile, con ci? rendendo competitiva e affidabile la preparazione della composizione stessa.
La preparazione della prima dispersione acquosa secondo la fase a), pu? essere effettuata in uno qualsiasi dei modi noti allo scopo all?esperto del ramo, ad esempio secondo quanto riportato nella domanda di brevetto WO 2016/102576.
Preferibilmente, detta fase a) comprende le fasi di:
1) predisporre una miscela avente un pH nell?intervallo da 7 a 10 e comprendente una soluzione acquosa di ioni di calcio, una soluzione acquosa di ioni fosfato, una soluzione di ioni citrato, ed una soluzione acquosa di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici ad una temperatura nell?intervallo da 20?C a 40?C per un tempo nell?intervallo da 30 secondi a 10 minuti;
2) allontanare gli ioni non reagenti dalla soluzione ottenuta della fase 1) ottenendo una sospensione di nanoparticelle di calcio fosfato (NP-CaP); e
3) recuperare il prodotto di una o pi? nanoparticelle di calcio fosfato (NP-CaP) dalla sospensione della fase 2).
Preferibilmente, la soluzione acquosa di ioni di calcio della miscela della fase 1) ? una soluzione di cloruro di calcio con molarit? nell?intervallo da 20 a 200 mM.
Preferibilmente, la soluzione acquosa di ioni fosfato della miscela della fase 1) ? una soluzione di Na2HPO4 con molarit? nell?intervallo da 24 a 240 mM.
Preferibilmente, la temperatura della fase 1) ? nell?intervallo da 35 a 40?C, pi? preferibilmente essa ? circa 37?C.
Preferibilmente, il tempo di mantenimento della miscela della fase 1) ? circa 5 minuti.
Preferibilmente, la soluzione di ioni citrato ? una soluzione acquosa di citrato di sodio avente una molarit? nell?intervallo da 40 a 800 mM.
Preferibilmente, la miscela della fase 1) presenta un pH di circa 10.
Preferibilmente, la fase 2) di allontanamento degli ioni non reagiti viene effettuata mediante una membrana di dialisi. Preferibilmente, la membrana di dialisi ? una membrana di cellulosa con un cut-off inferiore o uguale a 3500 Dalton.
Preferibilmente, la fase di allontanamento 2) condotta con membrana di dialisi avviene per un tempo da 5 a 24 ore, preferibilmente per 6 ore.
Preferibilmente, la fase 3) di recupero delle nanoparticelle avviene mediante essiccamento, pi? preferibilmente per liofilizzazione. Ci? vantaggiosamente consente di recuperare le nanoparticelle allo stato solido.
Una volta ottenuta una dispersione acquosa di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici secondo la fase a), il metodo secondo la presente invenzione prevede una fase b) in cui in detta dispersione acquosa viene disciolto almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, cos? da ottenere una seconda dispersione acquosa.
In detta fase b), i rapporti in peso tra il veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua e il fosfato di calcio possono variare a seconda del rapporto finale che si vuole ottenere nelle microparticelle della composizione in forma di polvere, e sono preferibilmente quelli descritti con riferimento al primo aspetto dell?invenzione.
Preferibilmente, in detta seconda dispersione acquosa la concentrazione del solido ? compresa tra 0.1% p / v e 1.5% p / v, pi? preferibilmente tra 0.15% p / v e 1.0 % p / v, e ancor pi? preferibilmente tra 0.2% p / v e 0.9% p / v, determinata a 25?C.
Una volta ottenuta la seconda dispersione acquosa della fase b), il metodo secondo la presente invenzione prevede la fase c) di essiccare a spruzzo detta seconda dispersione acquosa.
L?essiccazione a spruzzo, comunemente nota anche come spray-drying, ? una tecnica nota all?esperto del ramo. Sebbene detta fase c) di essiccare a spruzzo possa essere effettuata secondo una qualsiasi delle tecniche di essiccazione a spruzzo note all?esperto del ramo, gli inventori hanno tuttavia sorprendentemente individuato alcune condizioni preferite per la conduzione di detta fase, al fine di ottenere risultati ottimali.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo la temperatura dell'aria di essiccazione ? compresa tra 110 ? C e 170 ? C, pi? preferibilmente tra 115 ? C e 160 ? C e ancor pi? preferibilmente tra 120 ? C e 150 ? C.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo la temperatura di uscita varia tra 45 ? C e 95 ? C, pi? preferibilmente tra 50 ? e 85 ? C e, ancor pi? preferibilmente tra 60 ? C e 75 ? C.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo la velocit? del flusso di aria di essiccazione ? compresa tra 100 litri / ora e 850 litri / ora, pi? preferibilmente tra 300 litri / ora e 750 litri / ora, e ancor pi? preferibilmente tra 450 litri / ora e 700 litri / ora.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo l'ugello ? di diametro compreso tra 0.3 mm e 1.0 mm, pi? preferibilmente tra 0.5 mm e 0.9 mm e ancor pi? preferibilmente tra 0.4 mm e 0.7 mm.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo la velocit? di spruzzo della soluzione tra 2.0 ml / minuto e 8.0 ml / minuto, pi? preferibilmente tra 2.5 ml / minuto e 7.0 ml / minuto e ancor pi? preferibilmente tra 3.0 ml / minuto e 5.0 ml / minuto.
Preferibilmente, in detta fase c) di essiccare a spruzzo la velocit? di aspirazione tra 20 m<3 >/ ora e 40 m<3 >/ ora, pi? preferibilmente tra 25 m<3 >/ ora e 38 m<3 >/ ora, e ancor pi? preferibilmente tra 30 m<3 >/ ora e 35 m<3 >/ ora.
Dette condizioni di temperatura dell'aria, temperatura di uscita, velocit? del flusso di aria di essiccazione, diametro dell?ugello, velocit? di spruzzo e velocit? di aspirazione possono essere combinate in diversi modi dall?esperto del ramo in funzione delle apparecchiature disponibili e delle esigenze applicative o di produttivit?, consentendo comunque di ottenere in elevata resa e in maniera riproducibile la composizione in forma di polvere secondo la presente invenzione.
Pertanto, in un ancor ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce ad una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici, ottenibile mediante il metodo secondo la presente invenzione.
L?invenzione viene ora illustrata mediante alcuni Esempi da intendersi a scopo illustrativo e non limitativo della stessa.
PARTE SPERIMENTALE
ESEMPIO 1
Due soluzioni acquose, una di CaCl20.1M, contenenti citrato di sodio 0.2M e l?altra di Na2HPO4 0.12M, sono state miscelate con un rapporto del volume di miscelazione fisso di 1: 1 (v / v) a pH 10.0.
La miscela ottenuta ? stata mantenuta a 37 ? C per 5 minuti, per consentire la precipitazione delle nanoparticelle e, quindi, dializzata durante la notte per rimuovere i sali non reagiti. La concentrazione delle nanoparticelle preparate nella dispersione acquosa era di circa 7.0 mg / ml. Le nanoparticelle di fosfato di calcio ottenute, analizzate mediante diffrazione della luce laser, mostravano diametro idrodinamico medio (Z-medio) di 80 ? 15 nm e potenziale ? determinato mediante Electrophoretic Light Scattering (ELS) di -37 ? 2 mV.
Successivamente, la dispersione di nanoparticelle di fosfato di calcio cos? preparata ? stata diluita con acqua purificata fino ad una concentrazione di solido di 0.5 mg / ml. Il mannitolo ? stato sciolto nella dispersione di nanoparticelle in modo da ottenere un rapporto in peso fosfato di calcio: mannitolo di 1:4. La concentrazione della soluzione da essiccare, come residuo secco, era di 2.5 mg / ml. Quindi, ? stato eseguito un processo di essiccazione a spruzzo con un essiccatore a spruzzo B?chi B-290, nelle condizioni riportate in Tabella 1. Infine, la polvere cos? ottenuta ? stata recuperata dal recipiente di raccolta e conservata in una fiala di vetro sigillata a 20-25 ? C.
Tabella 1
Le microparticelle cos? ottenute sono state analizzate mediante microscopia elettronica a scansione e la loro struttura interna analizzata con la tecnica di sezionamento delle particelle SEM / Focus Ion Beam (FIB).
La morfologia delle microparticelle e le caratteristiche superficiali delle polveri sono state studiate mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) / Focus Ion Beam (FIB).
Lo strumento impiegato era un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo - Fascio ionico focalizzato (FESEM-FIB, Auriga Compact, Zeiss, Germania) dotato di microscopio a emissione di campi a diverse risoluzioni e distanze di lavoro.
I campioni sono stati preparati ponendo 1-2 mg di microparticelle in un nastro di carbonio su un campione di alluminio. Le morfologie delle microparticelle sono state osservate utilizzando un Phenom-Prox SEM (Phenom-World, Paesi Bassi) con il rivelatore in modalit? per elettroni secondari con una tensione di esercizio di 1 kV e una pressione di esercizio di 1 Pa. Al fine di studiare la struttura interna delle microparticelle che incorporano CaP per l'analisi della porosit? ? stato utilizzato un Zeiss Auriga FIB-SEM (Zeiss, Germania) per tagliare le particelle mediante incisione FIB (course-line) con una tensione di esercizio di 1 kV e una corrente di 1 nA, seguita da lucidatura FIB (fine-line) con una tensione di esercizio di 30 kV e una corrente di 100 pA.
Durante il taglio mediante FIB, le immagini sono state scattate in modalit? SEM con le stesse condizioni operative SEM dopo l'elaborazione FIB con ingrandimenti compresi tra 5000x e 70.000x.
In Figura 1a ? mostrata una microfotografia al microscopio elettronico a scansione delle microparticelle ottenute, mentre in Figura 1b ? mostrata una microparticella sezionata.
? stato possibile notare che le microparticelle ottenute avevano forma sostanzialmente sferica. L'immagine ottenuta con la tecnica di sezionamento delle particelle SEM / FIB ha inoltre evidenziato la presenza di una struttura interna caratterizzata da una grande cavit? al centro, con pochi vuoti pi? piccoli sparsi attorno ad essa.
Le particelle sono state inoltre caratterizzate al fine di determinarne le caratteristiche dimensionali (Dv10, Dv50, Dv90), il contenuto residuo d?acqua, il comportamento aerodinamico (EF, FPF), nonch? la stabilit? delle nanoparticelle dopo dissoluzione della matrice di mannitolo.
Per quanto riguarda le caratteristiche dimensionali, i valori di Dv10, Dv 50, Dv90 sono stati determinati mediante una tecnica di laser scattering e calcolati dalla distribuzione dimensionale dei diametri misurati.
Il comportamento aerodinamico in vitro delle microparticelle ? stato misurato con il Fast Screening Impactor; una capsula rigida ? stata caricata con 40 mg di polvere, inserita nel dispositivo inalatore RS01? (Plastiape, ITA) e la polvere ? stata "inalata" in vitro applicando una velocit? d'aria di 60 L / min. La polvere ? stata emessa con successo dal dispositivo e i valori di EF e FPF sono stati determinati il primo pesando il dispositivo caricato con la capsula prima e dopo l?emissione, mentre FPF ? stato determinato misurando la quantit? di polvere depositata nel Fast screening sullo stadio 2 denominato Fine Fraction che trattiene le particelle pi? piccole di 5 ?m che a loro volta sono passate attraverso lo stadio 1 che ha trattenuto le particelle pi? grandi di 5 ?m.
Il contenuto d'acqua delle microparticelle ? stato determinato mediante analisi termogravimetrica (TGA).
La stabilit? delle dimensioni delle nanoparticelle dopo dissoluzione del mannitolo ? stata misurata secondo il seguente metodo: 2.5 mg di polvere sono stati sciolti in 1 ml di acqua purificata agitando delicatamente per ottenere 0.5 mg / ml di concentrazione di fosfato di calcio. Le nanoparticelle sospese sono state quindi analizzate per determinarne diametro idrodinamico medio (Z-medio) e potenziale ?, con gli stessi metodi descritti pi? sopra.
In Tabella 2 sono riportati i risultati ottenuti mediante dette caratterizzazioni.
? stato cos? possibile notare che le microparticelle ottenute mostravano dimensioni (Dv10, Dv50, Dv90) e caratteristiche di respirabilit? (EF, FPF) tali da renderle adatte all?utilizzo come aerosol per inalazione. Inoltre, dal confronto tra il diametro idrodinamico medio (Z-medio) e il potenziale ? delle nanoparticelle prima dell?incorporazione nella matrice di mannitolo e dopo la dissoluzione della matrice, ? stato possibile riscontrare una sostanziale coincidenza di valori, attestante l?assenza di significativi fenomeni di aggregazione delle nanoparticelle, e pertanto il mantenimento di propriet? tali da rendere le nanoparticelle assorbibili a livello polmonare.
ESEMPIO 2
Nanoparticelle di fosfato di calcio che comprendono il peptide mimetico (MP; 11 AA, MW: 1326 Da, struttura a-elica) destinate al legame della subunit? Cav?2 del canale del calcio (Domanda di brevetto Europea n. EP 3 107 933), sono state preparate seguendo la procedura dell'esempio 1, con la differenza di aggiungere il peptide mimetico ad una concentrazione di 0.6 mg / ml nella soluzione di Na2HPO40.12 M. Le nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti il peptide cos? ottenute mostravano un diametro idrodinamico medio (Z-medio) di 105 ? 20 nm e un potenziale ? di -25 ? 7 mV. Il contenuto di peptide, espresso come quantit? di peptide su quantit? di fosfato di calcio, misurato mediante HPLC, era del 6.0 ? 2.0% p / p.
Per la quantificazione del peptide ? stato utilizzato un metodo HPLC in gradiente ed utilizzata una colonna cromatografica C18 e con porosit? 5 ?m. Ad un ml di dispersione di CaP che comprendono il peptide, ? stato aggiunto 1 ml di HCl 0.1N. Si ? agitato delicatamente per completare la dissoluzione ed ottenere una soluzione chiara e limpida. La soluzione ? stata trasferita in una fiala di vetro da 1.5 ml e l?analisi HPLC ? stata eseguita utilizzando lo strumento Agilent 1200 LC Series (Agilent Technologies, USA).
Lo stesso essiccatore a spruzzo dell'Esempio 1 ? stato impiegato per fabbricare le microparticelle che incorporano le nanoparticelle di calcio fosfato comprendenti il peptide (dpCaPs/MP). Il mannitolo ? stato sciolto nella dispersione di nanoparticelle in modo da ottenere un rapporto in peso fosfato di calcio: mannitolo di 1:4, cos? che la soluzione per spruzzare a secco contenesse 2.0 mg / ml di mannitolo e 0.5 mg / ml di nanoparticelle di calcio fosfato comprendenti il peptide. La miscela ? stata agitata per alcuni minuti a temperatura ambiente per eseguire la dissoluzione del veicolo. Questa soluzione di alimentazione ? stata essiccata a spruzzo, nelle stesse condizioni adottate nell?esempio 1. Infine, la polvere recuperata ? stata conservata a temperatura ambiente in flaconcini sigillati. La resa del processo di essiccazione ? stata di circa il 65%. Le microparticelle cos? ottenute contenevano lo 0.5% p / p di peptide MP misurato con lo stesso metodo HPLC descritto nell?esempio 1, ad eccezione della preparazione del campione: 20 mg di microparticelle sono stati disciolti in 2 ml di HCl 0.1 N. Dopo 15 minuti ed a completa dissoluzione, la soluzione limpida ? stata analizzata mediante HPLC.
Le microparticelle ottenute sono state inoltre caratterizzate come nell?Esempio 1.
In Figura 2a ? mostrata una microfotografia al microscopio elettronico a scansione delle microparticelle ottenute, mentre in Figura 2b ? mostrata una microparticella sezionata con la tecnica FIB / SEM, secondo le metodiche descritte nell?Esempio 1, mentre i risultati delle altre caratterizzazioni effettuate sono riportati in Tabella 2.
Dalle immagini SEM ottenute e riportate in Figura 2a e 2b ? stato possibile osservare che anche le microparticelle ottenute nell?Esempio 2 mostravano forma sostanzialmente sferica. La struttura interna mostrata, tuttavia, differiva sostanzialmente da quella delle microparticelle secondo l?Esempio 1 e presentava una struttura porosa interna. Numerose piccole cavit? con un diametro da 2 a 20 nm, che appaiono in Figura 2b come una griglia, sono state infatti rivelate dall'analisi FIB / SEM. Questi numerosi pori determinavano una struttura interna delle microparticelle che ? possibile definire di tipo alveolare, che a conoscenza degli inventori non ? mai stata osservata prima in microparticelle quali quelle secondo la presente invenzione. ? stato inoltre notato che le microparticelle secondo l?esempio 2 mostravano propriet? aerodinamiche significativamente migliori rispetto alle microparticelle dell?esempio 1 (vedi tabella 2) e permettevano di riottenere, dopo la dissoluzione della matrice di mannitolo, le nanoparticelle di fosfato di calcio nella loro dimensione originale, come risulta evidente comparando i valori delle dimensioni delle nanoparticelle prima dell?incorporazione e dopo (Tabella 2, colonne ?Nanoparticelle originarie? e ?Nanoparticelle redisperse?). Queste microparticelle sono state inoltre caratterizzate per quanto riguarda la distribuzione del diametro aerodinamico dando luogo ad un valore di MMAD, che si ? attestato a 2.6 ?m con deviazione standard geometrica (GSD) di 1.72.
ESEMPIO 3
Le nanoparticelle di fosfato di calcio sono state preparate come riportato nell'Esempio 1, aggiungendo nella soluzione di ioni fosfato 0.014 mg / ml di micro-RNA mimetico del miR-133 (Qiagen, # 339174), che ? un noto composto terapeutico per le malattie cardiovascolari in grado di svolgere un ruolo chiave nel rimodellamento dei cardiomiociti. Le nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti il micro-RNA ottenute mostravano un diametro idrodinamico medio (Z-medio) di 1900 ? 50 nm, segnale della presenza di aggregati di nanoparticelle, un potenziale ? di -17 ? 5 mV, ed un contenuto di micro-RNA dello 0.03 % in peso, rispetto al peso di fosfato di calcio
Successivamente, le microparticelle incorporanti dette nanopartielle (dpCaPs / micro-RNA) sono state preparate mediante essiccazione a spruzzo.
A questo scopo, il mannitolo ? stato sciolto nella dispersione di nanoparticelle in modo da ottenere un rapporto in peso fosfato di calcio: mannitolo di 1:4, cos? che la soluzione per spruzzare a secco contenesse 2.0 mg / ml di mannitolo e 0.5 mg / ml di nanoparticelle di calcio fosfato comprendenti il micro-RNA. La dispersione cos? ottenuta ? stata agitata per alcuni minuti a temperatura ambiente per consentire la dissoluzione del vettore. Questa soluzione di alimentazione ? stata essiccata a spruzzo, nelle stesse condizioni adottate nell?esempio 1. Le microparticelle prodotte venivano conservate a temperatura ambiente in flaconi sigillati. La resa della procedura di essiccazione a spruzzo era di circa il 70%. Le microparticelle cos? ottenute contenevano lo 0.006 % p / p di micro-RNA.
Per la quantificazione del micro-RNA ? stato utilizzato un metodo di digital PCR. 1 ml di sospensione di CaP (in quadruplicato), centrifugato a 20.000 rcf per 15 minuti. Si preleva 0.1 ml di surnatante mentre il pellet viene risospeso in 1 ml di acqua da cui si prelevano 0.1 ml. 0.1ml di sospensione totale, pellet e surnatante vengono sottoposti a dissoluzione acida mediante HCl 0.1 N seguito da vortex per 5 minuti. RNA viene estratto da ciascun campione, retrotrascritto e il micro-RNA quantizzato mediante digital PCR
Le microparticelle ottenute sono state inoltre caratterizzate come nell?Esempio 1.
In Figura 3a ? mostrata una microfotografia al microscopio elettronico a scansione delle microparticelle ottenute, mentre in Figura 3b ? mostrata una microparticella sezionata con la tecnica FIB / SEM, secondo le metodiche descritte nell?Esempio 1, mentre i risultati delle altre caratterizzazioni effettuate sono riportati in Tabella 2.
Dall?analisi al microscopio elettronico a scansione (Figura 3a) ? stato possibile rilevare che le microparticelle secondo l?esempio 3 mostravano forma sostanzialmente sferica ed una superficie esterna rugosa, ed avevano diametro volume mediano inferiore a 5 micron. Le microparticelle sezionate (Figura 3b) mostravano anch?esse una struttura interna porosa di tipo alveolare, con diversi piccoli pori aventi un diametro di 10-50 nm. Come possibile evincere dai dati riportati in Tabella 2, gli inventori hanno inoltre riscontrato che queste microparticelle, una volta disciolta la matrice di mannitolo sono state sorprendentemente in grado di ripristinare nanoparticelle aventi dimensioni intorno a 250 nm, disaggregando i aggregati di nanoparticelle iniziali ottenuti al termine della preparazione delle nanoparticelle stesse. Gli inventori ritengono che il mannitolo abbia pertanto sorprendentemente anche svolto un ruolo molecolare attivo nella disaggregazione le nanoparticelle di fosfato di calcio.
ESEMPIO 4
L?esempio 2 ? stato ripetuto aggiungendo nella soluzione di ioni fosfato, al posto del peptide mimetico MP, 0.15 mg / ml di peptide R7W (R7W-MP) (19 amminoacidi, MW: 2605.9, struttura ?-elica). La resa del processo di essiccazione ? stata dell'84.4%. Il contenuto di peptide R7W-MP della microstruttura prodotta era dello 0.25% p / p.
In Figura 4a ? mostrata una microfotografia al microscopio elettronico a scansione delle microparticelle ottenute, mentre in Figura 4b ? mostrata una microparticella sezionata con la tecnica FIB / SEM, secondo le metodiche descritte nell?Esempio 1, mentre i risultati delle altre caratterizzazioni effettuate sono riportati in Tabella 2.
Anche in questo caso, l'analisi al microscopio elettronico a scansione ha mostrato microparticelle aventi una forma sferica (figura 4a) e con superficie ruvida, di dimensione media nell'intervallo da 200 nm a 2 ?m. Il SEM/FIB (Figura 4b) ha permesso di evidenziare anche in questo caso la presenza di una struttura interna porosa di tipo alveolare, con pori aventi un diametro di 20 nm o inferiore. Gli inventori ritengono che detta struttura interna derivi dall?interazione tra le nanoparticelle comprendenti il peptide R7W-MP e la matrice della microparticella, analogamente a quanto osservato negli esempi 2 e 3, in cui le nanoparticelle comprendevano anch?esse un composto terapeutico/diagnostico di struttura macromolecolare.
ESEMPIO 5
L?esempio 2 ? stato ripetuto aggiungendo nella soluzione di ioni fosfato, al posto del peptide mimetico, 0.15 mg / ml di peptide Influenza Hemagglutinin (HA) (YPYDVPDYA, peso molecolare 1102.05 Da, struttura secondaria meno organizzata rispetto a MP e R7W-MP, microRNA). La resa del processo di essiccazione ? stata dell?80%. Il contenuto di peptide HA della microstruttura prodotta era dello 0.25% p / p.
In Figura 5a ? mostrata una microfotografia al microscopio elettronico a scansione delle microparticelle ottenute, mentre in Figura 5b ? mostrata una microparticella sezionata con la tecnica FIB / SEM, secondo le metodiche descritte nell?Esempio 1, mentre i risultati delle altre caratterizzazioni effettuate sono riportati in Tabella 2.
Anche in questo caso, l'analisi al microscopio elettronico a scansione ha mostrato microparticelle aventi una forma sferica (figura 5a). Il SEM/FIB (figura 5b) ha permesso di evidenziare anche in questo caso la presenza di una struttura interna porosa di tipo con pori aventi un diametro di 20 nm o inferiore, in cui i pori appaiono per? meno regolarmente distribuiti rispetto agli esempi 2-4. Nonostante questa differenza, le microparticelle hanno comunque mostrato valori di respirabilit? in vitro elevati e la capacit? di ripristinare le nanoparticelle dopo dissoluzione della matrice di mannitolo, mantenendone sostanzialmente immutate le propriet? dimensionali e di carica superficiale (vedi Tabella 2).
ESEMPIO 6
L?esempio 2 ? stato ripetuto, utilizzando per la preparazione delle microparticelle un rapporto in peso fosfato di calcio: mannitolo di 1 : 6, invece che 1 : 4 ed utilizzando per la fase di essiccazione a spruzzo una soluzione di alimentazione contenente 11.5 mg / ml di mannitolo e 1.9 mg / ml di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti il peptide mimetico.
In Tabella 2 sono riportati i dati delle caratterizzazioni effettuate.
Le microparticelle dell?Esempio 6 hanno mostrato una alta respirabilit?, in linea con quella delle microparticelle secondo l?Esempio 2.
Tabella 2
(1) indica la percentuale in peso di composto terapeutico-diagnostico rispetto al peso totale della nanoparticella;
(2) indica la percentuale in peso di composto terapeutico-diagnostico rispetto al peso totale della microparticella;
(3) indica la percentuale in peso di acqua rispetto al peso totale della microparticella;
(4) indica il valore di EF della composizione in forma di polvere;
(5) indica il valore di FPF della composizione in forma di polvere;
(6) indica il valore di diametro volume;
(7) le colonne sottostanti si riferiscono ai valori di diametro idrodinamico medio e potenziale delle nanoparticelle originarie, prima della loro incorporazione nelle microparticelle;
(8) le colonne sottostanti si riferiscono ai valori di diametro idrodinamico medio e potenziale delle nanoparticelle dopo dissoluzione della matrice delle microparticelle;
Claims (17)
1. Una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio che comprende uno o pi? composti terapeutici/diagnostici.
2. La composizione in forma di polvere secondo la rivendicazione 1, in cui detto uno o pi? composti terapeutici/diagnostici sono scelti nel gruppo che consiste di: un acido nucleico, un peptide, una proteina, un anticorpo, e un composto di sintesi.
3. La composizione in forma di polvere secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il rapporto in peso (fosfato di calcio):(veicolo farmaceuticamente accettabile) ? compreso tra 1:2.5 e 1:7.
4. La composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile ? un polialcolo.
5. La composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta composizione presenta una frazione di microparticelle con diametro aerodinamico inferiore a 5.0 micron (FPF) maggiore di 0.5.
6. La composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta composizione presenta un diametro volume mediano (Dv50) inferiore a 5.0 ?m.
7. La composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta microparticella presenta una struttura interna porosa.
8. La composizione in forma di polvere secondo la rivendicazione 7, in cui detta microparticella con struttura porosa presenta pori aventi diametro proiezione inferiore a 50 nm.
9. Una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, per l'uso come medicinale.
10. Una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, per l'uso nel trattamento di malattie cardiovascolari.
11. Una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, per l'uso nel trattamento di malattie respiratorie.
12. Una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, per l'uso come sostanza immunostimolante.
13. La composizione in forma di polvere per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12, in cui detta polvere viene somministrata per inalazione.
14. Un dispositivo per l'inalazione comprendente un contenitore contenente una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13.
15. Una composizione in forma di polvere che comprende microparticelle comprendenti una matrice di almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua incorporante almeno una nanoparticella di fosfato di calcio, in cui il rapporto in peso tra fosfato di calcio e detto almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile ? compreso tra 1:2.5 e 1:7.
16. Un metodo per la preparazione di una composizione in forma di polvere secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, comprendente le fasi di:
a) predisporre una prima dispersione acquosa di nanoparticelle di fosfato di calcio comprendenti uno o pi? composti terapeutici/diagnostici;
b) disciogliere nella dispersione della fase a) almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile solubile in acqua, cos? da ottenere una seconda dispersione acquosa; e
c) essiccare a spruzzo detta seconda dispersione acquosa della fase b).
17. Il metodo secondo la rivendicazione 15, in cui detta fase a) comprende le fasi di:
1) predisporre una miscela avente un pH nell?intervallo da 7 a 10 e comprendente una soluzione acquosa di ioni di calcio, una soluzione acquosa di ioni fosfato, una soluzione di ioni citrato, ed una soluzione acquosa di uno o pi? composti terapeutici/diagnostici ad una temperatura nell?intervallo da 20?C a 40?C per un tempo nell?intervallo da 30 secondi a 10 minuti;
2) allontanare gli ioni non reagenti dalla soluzione ottenuta della fase 1) ottenendo una sospensione di nanoparticelle di fosfato di calcio; e
3) recuperare il prodotto di una o pi? nanoparticelle di fosfato di calcio dalla sospensione della fase 2).
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