JP6781712B2 - 心臓へ治療用／診断用化合物を送達するための生成物 - Google Patents

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Description

本発明は心臓病の治療のための革新的な治療戦略である。具体的には、本発明は、１種以上の診断用／治療用化合物を封入した１つ以上のリン酸カルシウムの粒子を含有する生成物の調製方法およびそのような方法によって得られた生成物に関する。本発明はまた、本発明の生成物の吸入投与による心臓病の治療における使用に関する。
最近の医学の研究では、特定の病的状態の治療のために選択的かつ有効な治療アプローチを規定する目的で、選択された器官に薬物を特異的に送達するための多機能性ナノ粒子（ＮＰ）を設計および開発することに焦点が当てられている。しかしながら、それらの薬理学的用途は、ｉ）用いられるナノ材料の物理化学的性質、それらの生分解性、生体適合性および固有の潜在的細胞毒性、ｉｉ）投与の有効性、ｉｉｉ）副作用の発現に関連する、組織に特異的な送達の非選択性、ｉｖ）血流中への非制御の薬物放出、ｖ）遅い細胞溶解／蓄積、ｖｉ）生物学的バリアの通過における低い効率のようないくつかの重大な課題により、依然として制限されている。従って、適当な投与経路の規定によって目的の器官に選択的に到達することができる適当なＮＰの開発は依然として重要である。
リン酸カルシウム（ＣａＰ）に基づく物質は、該物質の生体適合性および生分解性により、様々な生物医学的用途に広く用いられている。ＣａＰに基づく物質によるトランスフェクションは、４０年以上の間、インビトロで様々な細胞タイプに対して遺伝子を放出するために用いられてきた（非特許文献１および非特許文献２）。一般的な方法は、適当な濃度のカルシウムとリン酸イオンとを特定のｐＨ値（７超）で混合した後に自発的に形成する沈澱物中に遺伝子を封入することである。この方法は、製造し易く、低コストであり、ヌクレオチドおよび核酸を結合する効率が高いなどの多くの利点を有する。さらに、ＣａＰに基づく物質は、ｐＨ感受性が安定しており、よって酸性環境（すなわちエンドソーム、リソソーム）において迅速な溶解を提供する。ＣａＰのそのイオン成分における完全な溶解は、他の無機化合物および金属化合物によってしばしば遭遇する不都合である細胞内および組織内における望ましくない物質の蓄積を防止する。このように、ＣａＰ粒子は、内部に取り込んだ薬剤を細胞内移行後のみに選択的かつ安全に放出することができる。
しかしながら、ＣａＰ粒子の生成における最も大きな問題は、合成における再現性の深刻な問題の原因となり、それらの最適なコロイド安定性を妨げる、それらの粒子の凝集および成長の傾向である。これらの厄介な問題は、ＣａＰ粒子の開発、よってそれらのインビトロおよびインビボの使用を遅らせてきた。実際、大きな（マイクロメートルスケールの）ＣａＰの粒子はまた、細胞内カルシウムの量への干渉をもたらし、その細胞自体のその後の死を伴う（非特許文献３）。従って、核酸または他の化合物を送達することができ、それらを外的環境から保護し、かつそれらの時期尚早の放出または分解を防止するＣａＰのＮＰの調製に成功することは非常に興味深い。ＣａＰのＮＰを安定させて、それらの無制御成長を防止するため、および治療薬をコンジュゲートすることを可能にするためには、合成ポリマー材料によるコーティングが用いられてきた（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（非特許文献４）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（非特許文献５）；キトサン（非特許文献６）、ビスホスホネート（非特許文献７）、または脂質（非特許文献８））。しかしながら、そのような合成ポリマー材料は、通常、完全な生分解性ではなく、アレルギー反応を引き起こすことがある。
腫瘍の治療において、ミクロＲＮＡの長連鎖のコンジュゲーションのために、ＣａＰに基づくＮＰが調製され、ポリエチレンイミンで被覆された（非特許文献９）。これらのコンジュゲートは、前立腺癌細胞においてインビトロで成功裡に放出された。
循環器疾患は主要な死亡原因であり、ＮＰの使用によるそれらの治療の試みもなされてきた。しかしながら、循環器疾患の治療処置に対して有効なＮＰの開発および使用は依然としてその開始段階にある。実際、これまでに非生体模倣合成ポリマーに基づくデンドリマー、リポソームまたはＮＰのみが、心筋細胞への様々な治療用分子のインビボ送達のために調査されている。この制限は、ＮＰの臨床への移行を妨げているいくつかの懸念、例えば、ｉ）低い生分解性および生体適合性、ｉｉ）有毒な副生物、ｉｉｉ）不十分な封入効率、ｉｖ）不十分な保存安定性、ｖ）血流中における非制御の薬物放出、ｖｉ）限られた細胞標的特異性、ｖｉｉ）遅い細胞溶解／蓄積、ｖｉｉｉ）全身投与アプローチの不十分な効率、ｉｘ）生物学的バリアの通過における低い効率などに起因する。従って、安全で、効率的で、心臓に特異的な治療薬剤の送達のための新たなアプローチが強く必要とされている。最近（非特許文献１０）、ポリスチレンラテックスＮＰ（５０ｎｍ寸法）が、それらの表面電荷に応じて、どのように分極した心臓細胞（心筋細胞）と相互作用することができるかが述べられた。具体的には、正に帯電したＮＰの使用によってトリガされるアポトーシス反応およびそれに続く細胞死とは対照的に、負の表面電荷を有するＮＰの使用が、細胞生存に適合した一時的なナノ細孔の形成によって、心筋細胞内におけるＮＰ自身の進入をどのように促進するかが示された。しかしながら、インビトロ投与での部分的な効果にもかかわらず、これらの負に帯電したポリスチレンラテックスＮＰの潜在的な薬物担体としての可能性は、電気生理学的プロファイルの変化および不整脈に対する増感のような主な副作用のために、長期投与について大幅に制限される。よって、これはインビボにおける前記ＮＰの可能な治療的使用に対して相当な制限となる。
グレアム、エフ．エル．（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ）；エルプ、エー．ジェイ．ブイ．ディー．（Ｅｒｂ，Ａ．Ｊ．Ｖ．ｄ．）、「Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ５ ＤＮＡ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３年、第５２巻、ｐ．４５６−４６７ ブイ．ソコローワ（Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ）、エム．エップル（Ｍ．Ｅｐｐｌｅ）、「Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ」、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、第４７巻（８）（２００８年）、ｐｐ．１３８２−１３９５ ノイマン、エス．（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｓ．）ら、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｄｅｆｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｏ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９年、第３０巻（３５）、ｐ．６７９４−８０２） カキザワ、ワイ．；カタオカ、ケイ．、「Ｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｔｏ Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｏｒｅ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００２年、第１８巻（１２）、ｐ．４５３９−４５４３） ティー．デヴァラス（Ｔ．Ｄｅｖａｒａｓｕ）ら、「Ｐｏｔｅｎｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ａ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎａｎｏｖｅｃｔｏｒｓ」 ギーガー、イー．ブイ．（Ｇｉｇｅｒ，Ｅ．Ｖ．）ら、「Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２０１１年、第１５０巻（１）、ｐ．８７−９３ リー、ケイ．（Ｌｅｅ，Ｋ．）ら、「Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｏｐａｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１３年、第４４５巻（１−２）、ｐ．１９６−２０２ リ、ジェイ．（Ｌｉ，Ｊ）；ヤン、ワイ．（Ｙａｎｇ，Ｙ．）；ホアン、エル．（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、「Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２０１２年、第１５８巻（１）、ｐ．１０８−１４ ヒョスク ジョン（Ｈｙｏｓｏｏｋ Ｊｕｎｇ）ら、「Ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年 ミッシェル ミラゴリ（Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｍｉｒａｇｏｌｉ）ら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈａｒｇｅｓ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｔｉｓｓｕｅ： ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ？」、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１３年）、第８巻（５）、ｐ．７２５−７３７
本発明の目的は、従来技術の不都合、なかでも心臓の電気生理学的プロファイルの変調を有さない、心臓病の治療のためのリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）に基づくアプローチを提供することにある。
本発明の発明者らは、驚いたことに、不整脈または心臓細胞の電気生理学的プロファイルの変化を引き起こすことなく、循環器疾患の治療のための治療アプローチであり得ることが判明している１種以上の診断用／治療用を封入することができ、かつ／または前記１種以上の診断用／治療用によって表面機能化することができ、かつ非侵襲性の吸入投与経路を介した心筋への直接送達を特徴とする、１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）からなる生成物の調製方法を見出した。加えて、他の経腸投与および非経口（すなわち、静脈内、腹腔内、経口、舌下、直腸、眼内、局所的、または経皮的）投与経路が提供され得る。加えて、非心臓細胞に特異的な診断用／治療用化合物によって表面機能化された場合、本発明は心臓以外の他の組織のターゲッティングを意図する。
従って、本発明は、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を有する負の表面電荷を備えた１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を含有する生成物の調製方法に関する。前記方法は、
ａ）７〜１０の範囲にあるｐＨを有し、かつカルシウムの水溶液、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の水溶液およびクエン酸イオンの溶液を含有する混合物を２０℃〜４０℃の範囲の温度で３０秒間〜１０分間の範囲の時間にわたって維持する工程と、
ｂ）工程ａ）の得られた溶液から未反応のイオンを除去し、それによって１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の懸濁液を得る工程と、
ｃ）工程ｂ）の懸濁液から１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の生成物を回収する工程とを含む。
本発明の方法は、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を備え、かつ多くとも１．７６の分裂因子（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＳＦ）を有する１つ以上のＣａＰ−ＮＰから製造された生成物を得ることを可能にし、前記１つ以上のＣａＰ−ＮＰが心臓細胞中に進入することができるようにし、かつ心臓の電気生理学的プロファイルの変調を引き起こさないようにする。本発明の生成物は、球状のモルフォロジー（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を有するナノ粒子の形態において有利であることが判明した。
本発明の好ましく有利な態様において、本発明のプロセスは、工程ａ）において、１種以上の治療用／診断用化合物の水溶液を添加する工程を含む。
驚いたことに本発明の好ましい方法において、本発明の好ましく有利な態様に従って得られる本発明の生成物は、１種以上の診断用／治療用化合物を封入する１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）からなる。また１種以上の診断用／治療用化合物を封入する本発明の生成物は、驚いたことに、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を備え、かつ１５０〜２３１ｎｍの範囲にある平均流体力学的径（ａｖｅｒａｇｅ ｍｅａｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（Ｚ平均として測定）を有する１つ以上の負に帯電したＣａＰ−ＮＰからなることが判明した。本発明の生成物は、球状のモルフォロジーを有するＮＰの形態において有利であることが判明した。
従って、有利には、本発明は工程ａ）の混合物に１種以上の治療用／診断用化合物の溶液を添加する工程を提供する。前記１種以上の診断用／治療用化合物の溶液の添加を有する本発明は、規定された寸法および電荷を有し、１種以上の診断用／治療用化合物を内部に封入したＮＰを得ることを可能にする。
従って、本発明者らは、驚いたことに、非晶質のＣａＰに対する結晶構造と類似した低い結晶化度で、かつ１５０〜２３１ｎｍの範囲の寸法のＣａＰの即時の形成を保証する、１種以上の診断用／治療用化合物を封入するＮＰの形成の低い温度を見出した。いかなる理論に縛られるものでもないが、本発明の発明者らは、温度および時間条件の選択、並びに従来技術に用いられているものと比較してより「生物に優しい（ｂｉｏ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ）」安定化剤であるクエン酸イオンの存在によって、１種以上の診断用／治療用化合物を封入するＣａＰ−ＮＰを安定させることが可能となり、これは特に表面上で結合することによって前記ＣａＰ−ＮＰのさらなる成長を防止し、それらを一定のコロイドレベル（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｌｅｖｅｌ）で安定させる前記混合物のクエン酸イオンに起因すると考える。加えて、実験部に掲載するような表面上におけるクエン酸塩の存在は、負に帯電したＣａＰ−ＮＰの表面を形成することができ、それらの表面電位を、前記ＣａＰ−ＮＰを一定のコロイドレベルで安定させることができる広い負の値にシフトさせることができる。さらに、本発明の方法によって得ることができるＣａＰ−ＮＰは、多くとも１．７６の分裂因子（ＳＦ）を有することによって、低い結晶化度を有することを証明し、より大量の診断用／治療用化合物の封入／表面機能化を可能にした。本発明者らによれば、実際、結晶化度が低いことにより、より大きな構造破壊がもたらされ、よって治療用／診断用化合物を結合することができるより大量の自由なイオンサイトが生じる。さらに、本発明の好ましく有利な実施形態のＣａＰ−ＮＰは、心臓病の治療における前記ＣａＰ−ＮＰの使用を有利に可能にする１５０〜２３１ｎｍの範囲にある平均流体力学的径（Ｚ平均として測定）を有することが判明した。
本発明の別の有利な特徴は、ＣａＰ−ＮＰの合成中に、前記治療用／診断用化合物を直接混合することにある。
さらに、この手順によって得られた低レベルの結晶化度（多くとも１．７６の分裂因子（ＳＦ）として表現）は、ＣａＰ−ＮＰの分解性の時間（ｔｉｍｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ）を増大し、よって治療用／診断用化合物のより迅速な放出に有利に働く。さらに、この手順によって得られた結晶化度のレベルを増大することにより、ＣａＰ−ＮＰの分解性の時間は減少し、よって治療用／診断用化合物の徐放に有利に働く。
本発明の別の有利な特徴は、最終的なＣａＰ−ＮＰ生成物の可能な表面機能化にあり、よって薬物ターゲティングの特異性の特有の要求（すなわち細胞特異的な誘導および／または受容体の活性化／阻害のための細胞外標的の結合）に有利に働く。
本発明において、用語／定義は以下の通りである。
− 「治療用／診断用化合物（複数可）」は、目標の器官に対して放出するための１種以上の医療用化合物、例えば、核酸、ペプチド、合成化合物、または診断プローブを意味する。
− １５０〜２３１ｎｍの範囲にある「Ｚ平均」は、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）によって測定された平均流体力学的径を意味する。
− 「−２７．０ｍＶ〜−４１．０ｍＶの範囲にあるζ電位を有する負に帯電したＣａＰ−ＮＰ」とは、電気泳動光散乱（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＥＬＳ）によって測定されたζ電位を有するＣａＰ−ＮＰを意味する。
− 「分裂因子（ＳＦ）」は、ウェイナー エス．（Ｗｅｉｎｅｒ Ｓ．）およびバール−ヨセフ オー．（Ｂａｒ−Ｙｏｓｅｆ Ｏ．）（１９９０年）、「Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｈｉｓｔｏｒｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅａｒ Ｅａｓｔ： ａ ｓｕｒｖｅｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７巻、ｐ．１８７−１９６に従ってＮＰのＦＴ−ＩＲスペクトルから計算される結晶化度を測るものである。
本発明の別の態様において、本発明は、吸入投与による循環器疾患の治療におけるベヒクルとして使用するための本発明の方法により得られる生成物に関する。
本発明のさらなる有利な態様において、本発明は、吸入投与による循環器疾患の治療に用いるための、１つ以上のＣａＰ−ＮＰに封入された１種以上の化合物を有する、その好ましく有利な実施形態において本発明の方法によって得られる生成物に関する。
従って、本発明は、吸入投与による循環器疾患の非侵襲性治療に適用されるナノ医療の分野において特に有利である。
本発明の発明者らは、驚いたことに、本発明の生成物が心臓−肺軸線を通って心筋に到達することを可能にした吸入投与を通じて本発明の生成物によって循環器疾患を治療するという直観的知識を有していた。結果として、驚いたことに、本発明の生成物の吸入による治療は、肺バリアの通過および血液循環への移行を可能にし、それにより右心血液循環に進入して心臓に到達し、そこで前記生成物は心臓の組織／細胞を標的とし、分極した心筋細胞と相互作用し、分極した心筋細胞によって内部移行された。これは、心筋への治療用／診断用化合物の放出を容易にした。
加えて、本発明は、他の経腸および非経口（すなわち、静脈内、腹腔内、経口、舌下、直腸、眼内、局所的、または経皮的）投与経路によって投与可能な本発明の方法によって得られる生成物に関する。
本発明の発明者らはまた、心筋に放出される化合物を封入するためにリン酸カルシウムナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を用いる直観的知識を有していた。本発明につながった研究において、本発明の方法のＣａＰ−ＮＰがインビトロでの心臓細胞およびインビボでの心筋の双方において前記化合物を内部移行することは驚きに値した。いかなる理論にも縛られるものではないが、本発明者らは、特定の用途において、本発明に従って調製され、かつ負に帯電したＣａＰ−ＮＰは細胞に対する毒性が低く、細胞生存性に適合したエンドサイトーシス依存性の内部移行を促進したことを立証した。驚いたことに、負電荷の存在は、ＣａＰ−ＮＰそれ自体または心筋に放出される１種以上の化合物を封入したＣａＰ−ＮＰを、過分極した膜（例えば心筋細胞など）を有する細胞における内部移行の生存性に適合させ、不整脈の発症のような副作用を有さないようにした。本発明の別の態様において、ＣａＰ−ＮＰは、所望の器官への機能性治療薬剤の直接の細胞特異的結合、内部移行、および細胞内放出のために、ターゲッティングリガンド（すなわち抗体、ペプチド、アプタマー）によって表面機能化されることができ、よって全身性の薬物曝露および心筋以外の組織における有害な副作用を最小限にしながら、薬物の有効性を向上する。
これより本発明について詳細に説明し、以下で実験部において例示する。
本発明に従って調製されたＣａＰ−ＮＰに対するクエン酸塩の効果を示す。（Ａ，Ｂ）クエン酸塩なしで、および増大する量のクエン酸塩とともに、合成されたＣａＰ−ＮＰのコロイド安定性および寸法の評価；（Ａ）平均流体力学的径の尺度としてのＺ平均、および（Ｂ）ＤＬＳによって１時間にわたって連続的に測定した１秒当たりの光子数の計数。 生成されたＣａＰ−ＮＰに対する成熟時間（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）の効果を示す。８０ｍＭに相当するクエン酸塩の濃度を用いた異なる合成時間のＣａＰ−ＮＰのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）。５６０および６０３におけるピークは結晶化度に関連する。 （Ａ）時間の関数としての透析液の伝導度、および（Ｂ）ＤＬＳによってＺ平均の測定を通じて評価した６時間の透析後の溶液中におけるＣａＰ−ＮＰの安定性を示す。 ８０ｍＭに相当するクエン酸塩の濃度を用いて合成されたＣａＰ−ＮＰの（Ａ）透析なし、（Ｂ）６時間の透析後の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の分析、および（Ｃ）ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分析）分光法による図２Ｂに示したＣａＰ−ＮＰの分析を示す。 １０μｇ／ｍＬに相当するｍｉＲの初期濃度を用いたＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の分析を示す。 （Ａ）死細胞のみを選択的にマークすることができる染料であるトリパンブルーによる除外アッセイによって分析された細胞の細胞毒性の評価を示す。クラスリン阻害剤またはダイナミン阻害剤はＣａＰ−ＮＰの内部移行に関わるエンドシトーシスプロセスを強調するために用いられた。（Ｂ）カスパーゼ３−７アッセイによって分析された細胞アポトーシスレベルの評価。（Ｃ）ＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣで処置したＨＬ−１細胞の共焦点顕微鏡によって分析した蛍光画像。ＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣシグナルは、細胞内区画におけるＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣの内部移行を確認する。ＤＡＰＩ＝核。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの曝露の２４時間後におけるＨＬ−１の電気生理現象に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。具体的には、未曝露のＨＬ−１細胞（黒）および、２０ｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰに曝露したＨＬ−１細胞（灰色）に対する受動的特性［静止膜電位（上段）、膜容量（中段）および膜抵抗（下段）］のボックスプロットを示す。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの曝露の２４時間後におけるＨＬ−１の電気生理現象に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。具体的には、（Ａ）対照（左、黒色：平均＋ＳＤ；ＳＤは帯として表示）および曝露条件（右、灰色）のＨＬ−１細胞においてランププロトコルによって得られたＩ−Ｖ曲線を示す。下段は、２つの曲線の重ね合わせ（左）および平均差純膜電流曲線（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｎｅｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｕｒｖｅ）（右）。（Ｂ）双方の状態についての代表的なナトリウム電流トレース。下段は、対照（黒）および曝露されたＨＬ−１細胞（灰色）についてのピークナトリウム電流Ｉ−Ｖおよびナトリウムチャネル活性化の電圧依存性（ｇ／ｇｍａｘ、右）。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの曝露の５時間後における成体マウスの心室心筋細胞の電気生理現象に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。具体的には、（Ａ）対照（左、黒色：平均＋ＳＤ；ＳＤは帯として表示）および曝露条件（右、灰色）の成体心室筋細胞においてランププロトコルによって得られたＩ−Ｖ曲線、（Ｂ）２つの曲線の重ね合わせ（左）および平均差純膜電流曲線（右）。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの曝露の５時間後における成体マウスの心室心筋細胞の電気生理現象に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。具体的には、（Ａ）対照条件および２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの適用後における「全細胞電流クランプ構成（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌａｍｐ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」で記録した代表的活動電位、（Ｂ）成体心筋細胞の膜電位（Ｖｍ）、膜容量（Ｃｍ）および膜抵抗（Ｒｍ）に対するＣａＰ−ＮＰの効果（上段）。活動電位閾値（ＡＰｔｈ）およびＡＰ振幅（ＡＰＡ）（中段）、ＡＰ（ｄＶ／ｄｔｍａｘ）の最大上昇率および９０％再分極におけるＡＰ持続時間（ＡＰＤ９０）（下段）に対するＣａＰ−ＮＰの効果。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰの曝露の５時間後における成体マウスの心室心筋細胞の電気生理現象に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。具体的には、（Ａ）対照条件および２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰによる介入後における「全細胞電圧クランプ構成」で記録した代表的ナトリウム電流（上段）。対照電位（「電圧ステップ」プロトコル）の関数としてのナトリウム電流ピークの平均密度のオーバーラッピング、および対照条件（黒色）および２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰ（灰色）の適用後に得られた定常状態活性化曲線の電圧依存性（下段）。（Ｂ）対照条件および２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰによる介入後における「全細胞電圧クランプ構成」で記録した代表的カルシウム電流（上段）。対照電位（「電圧ステップ」プロトコル）の関数としてのカルシウム電流ピークの平均密度のオーバーラッピング、並びに対照条件（黒色）および２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰ（灰色）の適用後に得られた定常状態活性化曲線の電圧依存性（下段）。 ２０μｇ／ｍＬのＣａＰ−ＮＰに２４時間曝露した後の、ＨＬ−１細胞の細胞質カルシウムレベル（カルシウム移行）に対するＣａＰ−ＮＰの効果を示す。カルシウム移行は、心筋細胞の収縮期／拡張期の交番におけるイオンの循環的変動を反映する。ｌｏｎＯｐｔｉｘシステムによって分析された細胞は、カルシウム感受性の発蛍光団Ｆｕｒａ２を担持していた。 ＨＥＫ２９３細胞に対して増大する投与量のＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲを投与した後のｍｉＲ−１３３の内部移行の結果を示す。内部移行したｍｉＲ−１３３の量は全ＲＮＡ抽出物に対する定量的ＰＣＲによって測定された。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）は、リポソームによるｍｉＲ−１３３のトランスフェクションの陽性対照である。 塩水単独（対照）または本発明のナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の気管投与後に成体ラットにおいて実施された電位図のプロファイルを示す。 気管内注入によってＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＣＴで処置した動物の心筋組織上における２つの光子に対する顕微鏡分析を示す。画像は、ＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣが心室組織に実際に到達したことを示す。下段の組織標本の画像では、ＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣは血管の内側にも存在している。 糖尿病性心筋症のマウスモデルにおける、特許協力条約に基づく出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５１３７６号に記載されている模倣ペプチド（ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＭＰ）の治療電位を示す。ＭＰは、新規なクラスの陽性変力物質に入る短い９ａａペプチドである。従来にない機構によって作用すること（すなわちカルシウム依存性の収縮期収縮をもたらすトリガ要素であり、かつチャネルゲート特性を変えることがない電圧依存性Ｌ型カルシウムチャネルの細胞表面密度の正常化）により、ＭＰは心拍の力を回復し、以前のクラスの変力物質の有害な不都合（すなわち不整脈原性および心筋酸素の浪費）を回避する。（Ａ）エコー、心エコー検査。ストレプトゾトチン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ：ＳＴＺ）、およびＣａＰ−ＮＰ中に封入されていないＭＰ（ＭＰ）、スクランブル担持されたＣａＰ−ＮＰ（ＣａＰ−ＮＰ−ＨＡ）またはＭＰを担持したＣａＰ−ＮＰ（ＣａＰ−ＮＰ−ＭＰ）で治療したマウスにおいて超音波心臓検査法によって測定された短縮率（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（％）。（ｎ＝１０）（Ｂ）治療したマウスから分離された成体心筋細胞におけるＣａ２＋電流測定値。Ｉ／Ｖ関係が示されている（ｎ＞１６）。データは平均±ＳＥＭとして示される、Ｐ＜０．０００１。
従って、本発明は、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を有する負の表面電荷を備えた１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を含有する生成物の調製方法に関し、該方法は、
ａ）７〜１０の範囲にあるｐＨを有し、かつカルシウムの水溶液、リン酸塩の水溶液およびクエン酸イオンの溶液を含有する混合物を２０℃〜４０℃の範囲の温度で３０秒間〜１０分間の範囲の時間にわたって維持する工程と、
ｂ）工程ａ）の得られた溶液から未反応のイオンを除去し、それによって１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の懸濁液を得る工程と、
ｃ）工程ｂ）の懸濁液から１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の生成物を回収する工程とを含む。
本発明によれば、工程ａ）の混合物中のカルシウムの水溶液は、好ましくは２０〜２００ｍＭの範囲のモル濃度を有する塩化カルシウムの溶液である。
本発明によれば、工程ａ）の混合物中のリン酸塩の水溶液は、好ましくは２４〜１４０ｍＭの範囲のモル濃度を有するＮａ２ＨＰＯ４の溶液である。
工程ａ）の温度は２０℃〜４０℃の範囲にある。好ましくは、前記温度は、３５〜４０℃の範囲にあり、より好ましくは、前記温度は約３７℃である。
工程ａ）における前記混合物の２０〜４０℃の範囲の温度での維持時間は、３０秒間〜１０分間の範囲にあり、好ましくは約５分間である。
前記クエン酸イオンの溶液は、好ましくは４０〜８００ｍＭの範囲のモル濃度を有するクエン酸ナトリウムの水溶液である。
工程ａ）の混合物は７〜１０の範囲のｐＨを有し、より好ましくは前記混合物のｐＨは１０である。
工程ａ）が終わると、前記混合物は未反応イオンの除去のプロセスに供される。好ましくは、前記工程は透析膜によって行なわれる。これに代わって、電気泳動堆積または分子排除クロマトグラフィーが用いられてもよい。
本発明が透析膜を用いる場合、３５００ダルトンのカットオフを有するセルロース膜が好ましい。透析膜によって実施される除去工程ｂ）は、好ましくは５〜２４時間、より好ましく６時間にわたって行われる。
未反応イオンの除去の工程ｂ）が終わると、ナノ粒子の懸濁液が得られ、該懸濁液は、再蒸留水の添加を受け、凍結乾燥されて、工程ｃ）のＣａＰ−ＮＰを得ることができる。これに代わって、工程ｂ）の生成物を凍結乾燥して粉末を得ることができる。
本発明の方法は、実験部に示すように、心臓細胞中に進入することができ、かつ心臓の電気生理学的プロファイルの変調を引き起こさない、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲のζ電位を有する１種以上のＣａＰ−ＮＰから形成される生成物を得ることを可能にする。本発明の生成物は、球状のモルフォロジーを有するＮＰの形態において有利であることが判明した。さらに、本発明の方法によって得られるＮＰは、より大量の診断用／治療用化合物を封入することを可能にする、ＮＰの分裂因子として測定される低い結晶化度を有することが判明した。本発明の方法から得られるＮＰは、（以下の実験部から明らかであろうように）非晶質リン酸カルシウムのそれに匹敵する低い結晶化度を有し、その低い結晶化度は、実際、より大きな構造破壊をもたらし、よって治療用／診断用化合物を結合することができるより大量の自由なイオンサイトを生じる。本発明の好ましく有利な態様において、本発明の方法は、工程ａ）において１種以上の治療用／診断用化合物の水溶液の添加を含む。これに代わって、本発明のさらに好ましく有利な態様において、本発明の方法は、１種以上の治療用／診断用化合物による最終生産物の表面機能化の追加を含む。ＣａＰ−ＮＰの診断用／治療用化合物による表面機能化は、例えば、ＣａＰ−ＮＰの懸濁液を診断用／治療用化合物の溶液と異なる時間にわたって混合し、その後に洗浄手順を続けることによって行われ得る。診断用／治療用化合物とＣａＰ−ＮＰとの間の安定した結合は、主に静電相互作用の形成によって生じ得る。
１種以上の治療用／診断用化合物は、好ましくは核酸、ペプチド、合成化合物および診断プローブからなる群から選択される。
工程ａ）において対象の１種以上の診断用／治療用化合物の溶液が存在することにより、工程ｃ）の終わりに、構造内に封入された治療用／診断用化合物を有するＣａＰ−ＮＰを得ることが可能となる。
従って、驚いたことに、本発明の好ましく有利な態様に従って得られる本発明の生成物は、１種以上の診断用／治療用化合物を封入する１つ以上のＣａＰ−ＮＰを含み、かつ／または１種以上の表面機能化された治療用／診断用化合物を含む。前記１種以上の診断用／治療用化合物を封入する本発明の生成物は、驚いたことに、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲のζ電位と、１５０〜２３１ｎｍの範囲のＺ平均とを有する１つ以上の負に帯電したＣａＰ−ＮＰを含有することが判明した。前記治療用／診断用化合物が構造内に封入された本発明の生成物は、有利には球状のモルフォロジーを有するＣａＰ−ＮＰの形態にあることが判明した。
本発明は、その別の態様において、吸入投与による循環器疾患の治療におけるベヒクルとして使用するための本発明の方法によって得られた生成物に関する。
本発明における循環器疾患は、心不全、心筋収縮の低下、細動、糖尿病性心筋症、拡張型心筋症、遺伝子疾患（ブルガダ症候群、ティモシー症候群またはＱＴ短縮症候群、筋ジストロフィーなど）、心臓肥大、低血圧症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、急性心不全、慢性心不全、心筋梗塞を含む。
本発明は、さらなる有利なその態様において、上記で説明し、実験部に示すように、吸入投与による循環器疾患の治療において用いるための１つ以上のＣａＰ−ＮＰ中に封入された１種以上の化合物を有する、本発明の好ましく有利な実施形態において本発明の方法によって得られる生成物に関する。加えて、本発明は、他の経腸および非経口（すなわち、静脈内、腹腔内、経口、舌下、直腸、眼内、局所的、経皮的）投与経路によって投与可能な本発明の方法によって得られる生成物に関する。
実験部
実施例１Ａ． 本発明のリン酸カルシウムナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の調製。
１２．５体積のＣａＣｌ２（１０〜５０ｍＭ）およびＮａ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）（４０〜２００ｍＭ）の溶液、１体積のＮａＯＨ（０．１〜０．５Ｍ）の溶液、および１２．５体積のＮａ２ＨＰＯ４（１２〜６０ｍＭ）の溶液を含有する溶液を調製し、次いで３７℃の水浴中に５分間入れた。
未反応の試薬を除去するために、前記ＣａＰ−ＮＰの溶液を、３５００ダルトンのカットオフを有し、かつ４００ｍＬの再蒸留水中に浸漬されたセルロース透析膜において６時間にわたって透析に供した。次に、その溶液を回収し、４℃の冷蔵庫内で保存した。その試料を凍結乾燥した後に無機残留物を秤量することによって、ＣａＰの量を評価した。ＣａＰの水性懸濁液の最終濃度は、試薬の濃度の関数として、６０〜３００μｇ／ｍＬの範囲にあった。
ナノ粒子を調製するために、Ｃａ２＋とＰＯ４ ３−との間の合成反応は、他の化学種の形成を防止すべく、ＮａＯＨ（０．１〜０．５Ｍ）の溶液を添加することによってｐＨを調節して、ｐＨ１０で実施した。カルシウムおよびリン酸塩と共に初期の溶液中に存在するクエン酸ナトリウムは、ＣａＰ粒子が、（Ｃａ２＋およびＰＯ４ ３−の過飽和のレベルを変化させることにより）制御された方法で、結晶を形成するのを可能にする安定化剤であった。
前記ＮＰ懸濁液を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析したところ、１００〜２００ｎｍの範囲にある粒子のＺ平均を示した。
工程ｂ）のＣａＰ−ＮＰの水性懸濁液の最終濃度は、試薬の濃度の関数として、６０〜３００μｇ／ｍＬの範囲にあった。本発明の生成物、すなわち前記ＣａＰ−ＮＰの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析は、直径において約５０ｎｍのＺ平均を示した。
実施例１Ｂ：本発明のＣａＰ−ＮＰに対するクエン酸イオン、並びに温度および時間条件の効果。
工程ａ）におけるクエン酸イオンの存在の重要性を評価するために、ＣａＰ−ＮＰの寸法およびコロイド安定性に対するクエン酸塩の効果をＤＬＳによって予め評価した。
等量のＮａ２ＨＰＯ４（２４ｍＭ）およびＣａＣｌ２（２０ｍＭ）＋Ｎａ３Ｃｉｔ（２０ｍＭ、４０ｍＭおよび８０ｍＭ）の溶液を使い捨てキュベット中で直接混合し、３７℃で５分間維持し、クエン酸塩の不在下または存在下におけるＣａＰ−ＮＰ沈殿物の大きさおよび安定性を評価するためにＤＬＳ測定に供した。異なる濃度のクエン酸ナトリウム（２０ｍＭ、４０ｍＭおよび８０ｍＭ）を用いた。
流体力学的径および１秒当たりの光子数をＤＬＳによって６０分間の連続期間にわたって測定した（図１Ａ、図１Ｂ）。クエン酸塩の存在下および不在下で合成したＣａＰ−ＮＰのＺ平均を結晶化時間の関数として測定した図１Ａに示すデータは、結晶化の数秒後に既にクエン酸塩の不在下で結晶化したＣａＰ−ＮＰの平均流体力学的径は約２μｍであり、６０分間にわたって安定したままであったことを明らかに示している。一方、数秒後にクエン酸塩の存在下で合成されたＣａＰ−ＮＰのＺ平均は、クエン酸塩の不在下で調製されたＣａＰ−ＮＰより著しく小さかった（約１００ｎｍ）。クエン酸塩の存在下で合成されたＣａＰ−ＮＰの平均流体力学的径は、クエン酸塩を有さない対照試料よりも、時間とともにゆっくりと増大した。これはクエン酸塩がＮＰの大きさを安定させて、ＣａＰ−ＮＰの凝集体を形成する傾向を低下させることを示している。さらに、これらのデータは、合成中にクエン酸塩の量を増大することによって、ＣａＰ−ＮＰのＺ平均はよりゆっくり増大し、また濃度にかかわらず、低い結晶化時間において、クエン酸塩はＮＰの大きさを安定させるその役割を発揮することを示している。
図１Ｂは、クエン酸塩なし、または２０ｍＭの量のクエン酸塩ありで合成されたＣＰＣの１秒当たりの光子数の計数が経時的に減少し、よってキュベット中の物質の量は底部におけるその沈殿の後に減少することを示している。一方、４０ｍＭおよび８０ｍＭに相当する量のクエン酸塩の存在下で合成されたＣａＰ−ＮＰの場合に検出された光子数は経時的に安定したままであり、このように合成されたＣａＰ−ＮＰの優れたコロイド安定性を示している。結論として、クエン酸塩の存在下で結晶化したＣａＰ−ＮＰはより良好な寸法安定性およびコロイド安定性を示し、よってクエン酸塩の存在は粒子の安定性に必須であった。
クエン酸塩の効果を評価した後、最適な結晶化時間を評価した。８０ｍＭのクエン酸塩の存在下で結晶化したＣａＰ−ＮＰの試料を異なる結晶化時間（すなわち５、１０、２０および６０分間）で調製した。反応生成物は、５０００ＲＰＭ（３．６８９×ｇ）で１０分間の遠心分離により水で３回洗浄し、ＤＬＳ、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって特徴付けた。ＣａＰ−ＮＰの量は、洗浄および凍結乾燥の後に無機残留物を秤量することにより評価した。
異なる時間で合成したＣａＰ−ＮＰのＦＴＩＲスペクトル（図２）を記録して、粒子の化学構造を評価した。すべての場合において、ＣａＰに典型的なバンドを強調した。具体的には、この構造中に存在する主な官能基によるバンド、例えば、リン酸塩の伸縮振動による約１０４０ｃｍ−１および１１００ｃｍ−１における２つのバンド、リン酸塩の変角振動に起因する６０３ｃｍ−１および５６０ｃｍ−１における２つのピーク、炭酸イオンの伸縮振動に起因する約１４５０ｃｍ−１における２つの小さなバンドなどを見ることが可能である。前記ＣａＰ−ＮＰは非制御雰囲気中で調製されたので、炭酸イオンは物質の結晶性構造に自発的に進入し得る。この現象は、生体アパタイトにおいても一般に見られる。すべての物質において、より強力なバンドは、クエン酸塩のカルボキシル基の伸縮振動に起因する約１６００ｃｍ−１において明らかである。このように、ＣａＰの表面上に結合されたクエン酸塩が実際に存在することが確認され得る。結晶化時間が増大するにつれ、非晶質材料に類似した低い長距離秩序を有する物質からより結晶性の物質への明らかな変換が観察された。
結晶化時間が増大するにつれ、ＣａＰ−ＮＰのＺ平均は、６０分後に合成されたＣａＰ−ＮＰにおいて約２μｍの値に達するまで増大した。５分後および１０分後に合成されたＣａＰ−ＮＰの場合においてのみ、前記平均流体力学的半径は本発明に使用するのに必要とされる特徴に合致した。
結晶化度は図２のＦＴ−ＩＲスペクトルから分裂因子（ＳＦ）を評価することにより計算した（ウェイナー エス．（Ｗｅｉｎｅｒ Ｓ．）およびバール−ヨセフ オー．（Ｂａｒ−Ｙｏｓｅｆ Ｏ．）（１９９０年）、「Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｈｉｓｔｏｒｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅａｒ Ｅａｓｔ： ａ ｓｕｒｖｅｙ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７巻、ｐ．１８７−１９６）。前記ＳＦは、それらの間の谷底点の高さによって分割された６０３ｃｍ−１および５６０ｃｍ−１におけるリン酸塩の伸張のピーク高さの合計によって測定された。高さはすべて、約７８０〜４９５ｃｍ−１に描かれたベースライン上において測定した。下記の表１に示すように、ＳＦが高いほど、物質の結晶化度は高い。５分の結晶化後のＣａＰ−ＮＰのＳＦは、６０３ｃｍ−１および５６０ｃｍ−１におけるリン酸塩のバンドが分解していなかったために測定不能であった。これは非常に低い結晶化度を示す。一方、ＳＦは結晶化時間が増大するにつれて増大した。これは結晶化時間が物質の結晶化度に影響を与えたことを示す。
結晶化時間が１０分間より長いと、最終的に得られた結晶化度のレベルは高くなり過ぎ、従って、その生成物は意図した用途に適さなくなる。有利には、この手順によって得られる結晶化度のレベルの増大により、ＣａＰ−ＮＰの分解性の時間は減少するとともに、ＣａＰ−ＮＰの分解性の時間の減少は治療用／診断用化合物の徐放を得ることを可能にし、よって治療用／診断用化合物の徐放を決定した。
実施例１Ｃ：本発明の工程ｂ）の効果。
結晶化の間に未反応のイオンを除去するために、実施例１Ａにおいて示したように透析を用いた。
反応環境中の過剰なイオンすべてを透析によって除去することができるように最適な時間を試験するために、経時的な透析媒体の伝導度を評価したところ、プラトーは６時間後に観察された（図３Ａ）。到達した伝導度プラトーは、反応媒体から透析媒体へのイオン交換が終了し、大部分の未反応のイオンは洗浄水中に移動したことを示した。以下の表２に示すように、透析時間後のＣａＰ−ＮＰのζ電位を測定した。
結果は、透析時間の増大により、ＣａＰ−ＮＰの平均流体力学的径は低下したが、ζ電位は一定のままであったことを示した。６時間の透析後のＣａＰ−ＮＰの安定性をＤＬＳによって確認した（図３Ｂ）。図３Ｂは、時間の関数として６時間の透析後におけるＣａＰ−ＮＰのＺ平均の値を示す。ＣａＰ−ＮＰの寸法の変化は３００分まで観察されなかったことが分かり、実際、前記寸法の値は、経時的に一定のままであるように見える。図３Ｂ中の挿入図は、３００分間までの期間にわたって１秒当たりに検出された光子数を示す。この分析は、前記光子数が３００分間にわたって一定のままであったので、溶液中における６時間の透析後のＣａＰ−ＮＰの最適なコロイド安定性を認めることを可能にした。
図４は、透析なし（図４Ａ）および６時間の透析後（図４Ｂ）のＣａＰ−ＮＰのＴＥＭ分析を示す。透析前には、ＣａＰ−ＮＰ（球状の様相およびより暗色によって認識可能であり、かつ直径約２０〜３０ｎｍの寸法を有する）は、ＣａＰ−ＮＰに物理的に結合されていない溶液中に残存するクエン酸塩である可能性が最も高い有機物の層で被覆されていることが分かる。反対に、この場合の６時間の透析後のＣａＰ−ＮＰもまた球状のモルフォロジーおよび約３０〜５０ｎｍの寸法を有していたが、輪郭がより明瞭であり、目に見えて表面の有機部分を有していなかった。６時間の透析後のＣａＰ−ＮＰに対して選択領域におけるＥＤＸ分光分析（図４Ｃ）を実施した。前記ＥＤＸ分光分析は、（サンプルホルダに由来するＣｕのシグナル、並びに試料および外的環境の双方に由来するＯおよびＣのシグナルに加えて）Ｃａ元素、Ｐ元素に由来するシグナルを示し、ＣａＰ−ＮＰは主にリン酸カルシウムからなり、かつ透析中に他の相は形成されていないことを確認した。
実施例２：本発明のＣａＰ−ＮＰの標識。
実施例１Ａから得られたＮＰの細胞内移行を評価するために、ＮＰをイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識した。
実施例１Ａにおけるように、しかし以下に記載するようにＦＩＴＣ化合物を含んで、ＣａＰ−ＮＰを調製した。
１２．５体積のＣａＣｌ２（１０〜５０ｍＭ）およびＮａ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）（４０〜２００ｍＭ）の溶液、１体積のＮａＯＨ（０．１〜０．５Ｍ）の溶液、および１２．５体積のＮａ２ＨＰＯ４（１２〜６０ｍＭ）の溶液を含有する溶液を調製し、次いで３７℃の水浴中に５分間入れた。未反応の試薬を除去するために、ＣａＰ−ＮＰの溶液を、３５００ダルトンのカットオフを有し、４００ｍＬの再蒸留水中に浸漬されたセルロース透析膜において６時間にわたって透析に供した。その後ＣａＰ−ＮＰの懸濁液を得た。
最初に、このプロトコルに従って、すなわちＦＩＴＣ（０．０２５ｍｍｏｌ）および３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（０．２５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのエタノールに添加し、暗所で２４時間にわたって６００ｒｐｍで撹拌し続けて、ＦＩＴＣをＡＰＴＳとコンジュゲートした（以後、この混合物をＦＩＴＣ−ＡＰＴＳと称する）。
次に、１００μＬのＦＩＴＣ−ＡＰＴＳ、１００μＬの水酸化アンモニウム（Ｈ２Ｏ中２８重量％のＮＨ３）、および１００μＬのオルトケイ酸テトラエチル（ｅｔｒａｅｔｈｙｌ ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）（ＴＥＯＳ）をＣａＰ−ＮＰの水性懸濁液に添加した。この懸濁液を暗所で２４時間にわたって６００ｒｐｍで撹拌し続けた。未反応のＦＩＴＣを除去するために、ＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣを遠心分離によって再蒸留水で３回洗浄した。
その結果得られたＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣを後続の実施例において生物学的活性の評価に用いた。
実施例３：マイクロＲＮＡ（治療用化合物の例）を封入したＣａＰ−ＮＰ（ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲ）の調製。
マイクロＲＮＡの封入を伴うＣａＰ−ＮＰの調製は、以下に記載するようにマイクロＲＮＡ化合物の含有によって行われる実施例１Ａに記載したような調製プロトコルに詳細に従って実施した。マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−１３３に対応するマイクロＲＮＡは、合成ヌクレオチド配列（ドイツ国ＩＢＡによって合成）である。
１２．５体積のＣａＣｌ２（１０〜５０ｍＭ）およびＮａ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）（４０〜２００ｍＭ）の溶液、１体積のＮａＯＨ（０．１〜０．５Ｍ）の溶液、および１２．５体積のＮａ２ＨＰＯ４（１２〜６０ｍＭ）の溶液を含有する溶液は、異なる濃度のマイクロＲＮＡ（０．５〜１０）を含有する。次に前記溶液を３７℃の水浴中に５分間入れた。続いて、その懸濁液を６時間にわたって透析し、４℃で保存した。結果として生じたｍｉＲ−１３３を封入したＣａＰ−ＮＰ（以下、簡単にＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲと称する）を次いで、寸法、ζ電位およびモルフォロジーによって分析した。次に、前記溶液を回収し、４℃の冷蔵庫に保存した。
ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの水性懸濁液の最終濃度は、６０〜３００μｇ／ｍＬの範囲にあった（表３参照）。
ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲ粒子の特性分析を下記の表３に示す。
ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの懸濁液をＤＬＳによって分析したところ、１５０〜２３１ｎｍの範囲にある粒子のＺ平均と、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位とを示した。さらに、ｐｄＩは試料寸法の狭細な分布を示す０に近い値を有した。本発明の生成物、すなわちＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲのＴＥＭ分析は、すべての単一粒子の大きさは約５０ｎｍであることを示した（図５）。
実施例４：実施例３における本発明のＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲに封入されたｍｉＲ−１３３の量の評価。
ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲに封入されたｍｉＲ−１３３の正確な量を評価するために、ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲから抽出された全核酸に対して定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）測定を実施した。実施例３に記載したような、合成中に用いられる異なる濃度（２μｇ、２５μｇおよび５０μｇ）のｍｉＲ−１３３を用いたＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの３つの調製物から、５００μＬのＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの溶液をＰｕｒｅｚｏｌ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によるＲＮＡの抽出に用いた。次いでＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲの各調製物について抽出した合計４０ｎｇのＲＮＡをｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＩＩ ｋｉｔ（エキシコン（Ｅｘｉｑｏｎ））を用いて逆転写した。次に、逆転写反応の１／４０を後続のｍｉＲ−１３３に特異的なｑＰＣＲに用いた。前記ｑＰＣＲは、Ｖｉｌａ（商標）７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））上でＳＹＢＲ（登録商標） Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、３回繰り返して実施した。次に、既知量のｍｉＲ−１３３の合成オリゴから導出されるｃＤＮＡの連続希釈法を用いた絶対的定量化法を用いて、ｍｉＲ−１３３の正確な量を求めた（４０フェムトモルの出発点から１：１０希釈）。ＣａＰ−ＮＰに結合したｍｉＲ−１３３の量を、線形標準曲線において導出されるＣｔをトレースすることにより推定した。ＣａＰ−ＮＰに結合したｍｉＲ−１３３ａの量を表４に示す。結果は、反応中に用いられるマイクロＲＮＡの５０％超がＣａＰ−ＮＰ内に封入されたことを示している。
実施例５：ＣａＰ−ＮＰおよび毒性のインビトロ評価。
実施例１Ａで得られたＣａＰ−ＮＰを生体適合性および毒性について、心臓の細胞系統ＨＬ−１を増大する投与量（０〜５００ｕｇ／ｍＬ）のＣａＰ−ＮＰに曝露して、インビトロで試験した。第１工程として、死細胞のみを選択的にマークすることができる染料であるトリパンブルーによる除外アッセイによって、細胞毒性の評価を実施した。図６Ａに示すように、ＨＬ−１系統は試験した量の投与に耐性を有したが、高投与量（＞１２５ｕｇ／ｍＬ）のみにおいて細胞の死亡率の増大が観察された。続いて、ＣａＰ−ＮＰの投与後に誘発される任意のアポトーシス反応の評価にカスパーゼ−３−７アッセイを用いた。図６Ｂに示すように、アポトーシス活性に関する有意差は、≧２５０ｕｇ／ｍＬの高濃度のＣａＰ−ＮＰにおいてのみ観察された。従って、双方のアッセイは、ＣａＰ−ＮＰを心筋に対する目的の化合物の内部移行のための可能な担体として選択した。
実施例６：ＣａＰ−ＮＰの内部移行の評価。
ＣａＰ−ＮＰの細胞内移行を評価するために、ＨＬ−１細胞を２０μｇ／ｍＬの濃度の実施例２のＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣに曝露し、投与後２４時間に共焦点顕微鏡分析を実施した。図６Ｃに示すように、別々の細胞内小胞区画におけるＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣの明確な内部移行が得られた。この内部移行が実際に活性エンドサイトーシス機構によるものであったかを判定するために、原形質膜の陥入およびエンドサイトーシスに関わるタンパク質であるクラスリンまたはダイナミンに特異的な阻害剤を用いた。従って、ＨＬ−１細胞をこれらの阻害剤で前処置し、次いで増大する濃度のＣａＰ−ＮＰに曝露した。図６Ａに示すように、クラスリン／ダイナミン媒介エンドサイトーシス阻害は、すべての投与量においてＣａＰ−ＮＰによって誘発される（トリパンブルーによる除外アッセイにおける）細胞毒性を著しく低減し、よって、ＣａＰ−ＮＰの細胞吸収の阻害を反映する。
実施例７：ＣａＰ−ＮＰおよび電気生理的特性のインビトロ評価。
心筋細胞のような興奮性細胞上でのカルシウムに基づいたナノ粒子の使用における主な問題の１つは、電気生理学的特性に対する潜在的影響である。従って、２つの細胞タイプ（ＨＬ−１および成体マウス心室心筋細胞）の生物物理学的特性について検討した。最初に、２０μｇ／ｍＬの実施例１ＡのＣａＰ−ＮＰの短期投与後および長期投与後のＨＬ−１細胞における活動電位（ＡＰ）の特性を分析した。具体的には、投与後２４時間に、ＨＬ−１を長期の実験（ＣａＰ−ＮＰと共に２４時間のインキュベーション）に用い、一方、マウス心筋細胞は短期の実験（ＣａＰ−ＮＰと共に４時間のインキュベーション）に用いた。長期条件および短期条件の双方において、全細胞構成におけるパッチクランプ法によって実施した電気生理学的実験は、休止細胞の生物物理学的特性に関して、および閾値を超える電気刺激（図７〜図１１）後に得られる活動電位特性について、処置した試料および対照試料の双方の間において有意差を示さなかった。よって、これらの細胞の電気的表現型を決定し、それらに興奮性の典型的な特性を与えるパラメータ、例えば、膜電位（Ｖｍ）、膜容量（Ｃｍ）、膜抵抗（Ｒｍ）、活動電位閾値（ＡＰ）、ＡＰ幅（ＡＰＡ）、ＡＰ（ｄＶ／ｄＴｍａｘ）の最大上昇率およびＡＰ（ＡＰＤ）の持続時間などは、上記の濃度のＣａＰ−ＮＰの投与後に、有意に変更されなかったことが示された。また、典型的な心臓の細胞ＡＰ特性に基づいて検討した前記２つの細胞タイプに通常存在する主なイオン電流（カリウム電流、ナトリウム電流およびカルシウム電流）の、またパッチクランプ法による、分析は、対照と、短期条件および長期条件の双方においてＣａＰ−ＮＰによって処置したものとの間において有意差を示さなかった。
最後に、心筋細胞の収縮期／拡張期の交番によるカルシウムの周期的な変化を反映する細胞質のカルシウムレベルにおける変化（カルシウムトランジェント）の評価を実施した。図１２に示すように、異なる条件間における有意な変化は強調されなかった。結論として、上記のデータは、ＣａＰ−ＮＰが、心筋細胞の生理学的性質を変化させることなく、細胞内の細胞質空間に効率的に進入したことを示す。
実施例８：封入された診断用／治療用化合物を有するＣａＰ−ＮＰの効果。
ｍｉＲ−１３３（実施例３で使用）を模倣する合成二本鎖オリゴ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏ）を内部に封入したＣａＰ−ＮＰの細胞内移行を評価した。従って、本発明の生成物をｍｉＲ−１３３にコンジュゲートされたＣａＰ−ＮＰ（ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲ）として、実施例３に従って合成ｍｉＲ−１３３の溶液を用いて調製した。筋肉に特異的なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ１３３は、陰性のβ−アドレナリン作動性受容体調節薬であることが知られていた。
次に、本発明の化合物の内部移行を、漸増的な投与量のＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲで予め処置した細胞から抽出した全ＲＮＡに対して実施したｑＰＣＲによって確認した。図１３に示すように、増大する投与量のＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲによる各処置は、各細胞内ｍｉＲ−１３３の増分値に対応した。
これらのデータは、ＣａＰ−ＮＰ−ｍｉＲ粒子に封入されたｍｉＲ−１３３化合物が実際に細胞内に能動的に内部移行されたという証拠を提供した。従って、そのような証拠は、治療用／診断用化合物の効率的な細胞内送達のためのＣａＰ−ＮＰの使用を支援する。
実施例９：本発明の生成物の投与後の心機能に対する副作用の可能性のインビボ評価。
実施例１Ａにおいて生成したＣａＰ−ＮＰが、心臓の活動に影響を与えることなく、成功裡に心筋に到達したかを評価するために、インビボの試験を成体ラットにおいて行なった。ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）ら、ＡＪＰ、２００８年の文献に記載されているように麻酔した動物に、気管経路によって生理食塩水そのもの（ＣＴＬ）、または動物の体重１ｋｇ当たり３ｍｇの濃度でＣａＰ−ＮＰを含有する生理食塩水を投与した。処置後４時間に、前記動物を電気生理学的分析に供した。心外膜表面に配置した電極装置から得られた電位図を図１５に示す。図１４および下記の表５に示すように、電位図はＰ、ＰＱ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＥＲＰ、ＲＲに関して２つの実験群の間に定性的差異を示さなかった。
表５．生理食塩水そのもの（ＣＴＬ）またはＣａＰ−ＮＰを含有する生理食塩水で処置した動物の電位図。
従って、心臓ＥＣＧパラメータが変化しなかったことにより、ＣａＰ−ＮＰの投与が心興奮性のいかなる形の変調も引き起こさなかったことが確認され、よって、本発明の生成物に対する生理学的な心臓の耐性、および異なる性質のナノ粒子の使用によって予想される技術的問題の克服が期待される。
最後に、ＣａＰ−ＮＰの心臓への実際の送達を評価するために、ラットを実施例１Ｂに示したように調製したＣａＰ−ＮＰ−ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）（３ｍｇ／ｋｇ）を含有する生理食塩水の単回気管内投与に曝露した。投与後４時間に、心臓を分離して、２光子顕微鏡によって分析した。驚いたことに、前記心臓組織において、特に多くの量を左心室に有する本発明の生成物の広範囲の分布が観察され、よって、本発明の生成物が気管投与によって実際の心臓に到達したことを示唆した。この結果は、図１５に示すような心臓組織の蛍光画像によって表わされる。さらに、多回投与アプローチ（１日１回を隔日毎に３回繰り返した）は、主に左心室腔において蛍光の増大を生じて、心臓組織に関連する心臓のバイオアベイラビリティーは用量依存的な増大に従うことを示唆した。
実施例１０：心疾患（糖尿病性心筋症）のマウスモデルにおける本発明の生成物の治療電位。
治療用途の可能性をさらに調査するために、実施例３においてマイクロＲＮＡについて記載したような模倣ペプチド（ＭＰ）の含有によって行われる実施例１Ａにおけるように、ＣａＰ−ＮＰを生成した。ＭＰは、新規なクラスの陽性変力物質のうちに入る短い９ａａペプチド（米国ジーンスクリプト（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）により合成）である。従来にない機構によって作用すること（すなわち、カルシウム依存性の収縮期収縮をもたらすトリガ要素であり、かつチャネルゲート特性を変化させることがない、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャネルの細胞表面密度の正常化）により、ＭＰは、ＬＴＣＣ密度、従って心筋収縮能がダウンレギュレートされる心機能障害（すなわち糖尿病性心筋症、ＤＭ）の状態において心拍の力を回復する。ＤＭを誘発するために、膵臓のインシュリンを生成するβ細胞に有害な化合物であるストレプトゾトチン（ＳＴＺ）をマウスに注射した。興味深いことに、ＭＰ−ＣａＰ−ＮＰによるＤＭマウスの１０日間の吸入治療により、心機能は完全に回復し、一方、ＭＰ単体またはスクランブル−ＣａＰ−ＮＰ（ＣａＰ−ＮＰ−ＨＡ）を投与した場合には効果が得られなかった（図１６Ａ）。加えて、同一の治療されたマウスから分離した心筋細胞の機能分析により、ＭＰ−ＣａＰ−ＮＰがカルシウム電流（Ｉｃａ）を回復することが明らかとなった（図１６Ｂ）。

Claims (17)

  1. −４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を有する負の表面電荷を備えた１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を含有する生成物の調製方法であって、該方法は、
    ａ）７〜１０の範囲にあるｐＨを有し、かつカルシウムの水溶液、リン酸塩の水溶液、およびクエン酸イオンの溶液を含有する混合物を２０℃〜４０℃の範囲の温度で３０秒間〜１０分間の範囲の時間にわたって維持する工程と、
    ｂ）工程ａ）の得られた溶液から未反応のイオンを除去し、それによって１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の懸濁液を得る工程と、
    ｃ）工程ｂ）の懸濁液から１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の生成物を回収する工程とを含む、方法。
  2. 工程ａ）の混合物中に、１種以上の治療用／診断用化合物の水溶液も存在する、請求項１に記載の方法。
  3. 工程ｃ）から回収された前記１つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）は、１種以上の治療用／診断用化合物によって表面機能化されている、請求項１に記載の方法。
  4. 工程ａ）の混合物中のカルシウムの水溶液は、２０〜２００ｍＭの範囲のモル濃度を有する塩化カルシウムの溶液である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程ａ）の混合物中のリン酸塩の水溶液は、２４〜２４０ｍＭの範囲のモル濃度を有するＮａ２ＨＰＯ４の溶液である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 工程ａ）の前記温度は３５〜４０℃の範囲にある、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程ａ）の混合物の維持時間は約５分間である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記クエン酸イオンの溶液は、４０〜８００ｍＭの範囲のモル濃度を有するクエン酸ナトリウムの水溶液である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 工程ａ）の混合物は約１０のｐＨを有する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 未反応のイオンを除去する工程ｂ）は、透析膜によって実施される、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記透析膜は、３５００ダルトンのカットオフを有するセルロース膜である、請求項１０に記載の方法。
  12. 透析膜によって実施される除去工程ｂ）は、５〜２４時間にわたって行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記リン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）の回収工程ｃ）は、凍結乾燥によって実施される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. １つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を含有する生成物であって、前記ＣａＰ−ＮＰは、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位を有する負の表面電荷と、多くとも１．７６の分裂因子（ＳＦ）とを有するとともに、核酸、ペプチド、合成化合物および診断プローブからなる群から選択される１種以上の表面機能化された治療用／診断用化合物を含有する、生成物。
  15. １つ以上のリン酸カルシウムのナノ粒子（ＣａＰ−ＮＰ）を含有する生成物であって、前記ＣａＰ−ＮＰは、１種以上の治療用／診断用化合物を封入し、−４１．０ｍＶ〜−２７．０ｍＶの範囲にあるζ電位と、１５０〜２３１ｎｍの範囲にある平均流体力学的径（ａｖｅｒａｇｅ ｍｅａｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（Ｚ平均として測定）とを有する負の表面電荷を有するとともに、核酸、ペプチド、合成化合物および診断プローブからなる群から選択される１種以上の表面機能化された治療用／診断用化合物を含有する、生成物。
  16. 請求項１４又は１５に記載の生成物の、循環器疾患の治療用薬剤を製造するための使用。
  17. 前記治療は、吸入投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、舌下投与、噴霧投与、直腸内投与、眼内投与、局所投与および経皮的投与のうちから選択される投与経路を通じて実施される、請求項１６に記載の使用。
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