KR102532139B1 - 치료/진단 화합물을 심장으로 전달하기 위한 생성물 - Google Patents

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미켈레 미라골리
미켈레 이아피스코
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콘시글리오 나치오날레 델레 리체르체
이스티튜토 나치오날레 아씨쿠라지오네 콘트로 그리 인포르투니 술 라보로
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Abstract

본 발명은 a) 7 내지 10 범위의 pH를 갖고, 칼슘 수용액, 인산염 수용액 및 시트레이트 이온 용액을 포함하는 혼합물을 20℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 30초 내지 10분 범위의 시간 동안 유지시키는 단계; b) 단계 a)의 용액으로부터 미반응 이온을 제거하여 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 현탁액을 수득하는 단계; c) 단계 b)의 현탁액으로부터 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 생성물을 회수하는 단계를 포함하여, -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖는 음성 표면 전하를 갖는 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)를 포함하는 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 유리한 구현예에서, 본 발명의 방법은 단계 a)의 혼합물에 하나 이상의 치료/진단 화합물의 수용액을 또한 제공한다. 본 발명의 생성물은 흡입 투여를 통해 심혈관 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 진단/치료 화합물용 비히클로서 사용될 수 있다.

Description

치료/진단 화합물을 심장으로 전달하기 위한 생성물{PRODUCTS FOR THE DELIVERY OF THERAPEUTIC/DIAGNOSTIC COMPOUNDS TO THE HEART}
본 발명은 심장 질환을 치료하기 위한 혁신적인 치료 전략이다. 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는(encapsulating) 인산칼슘의 하나 이상의 입자를 포함하는 생성물의 제조방법 및 이러한 방법에 의해 수득된 생성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 흡입 투여를 통해 심장 질환을 치료하는 데 있어서 본 발명의 생성물의 사용에 관한 것이다.
최근의 의학 연구는 특정의 병리학적 상태의 치료를 위한 선택적이고 효과적인 치료 접근법을 정의할 목적으로 선택된 기관에의 약물의 특이적 전달을 위한 다작용성 나노 입자(NP)를 설계하고 개발하는데 초점을 두고 있다. 그러나, 다수의 중요한 문제는 이의 약리학적 적용, 예를 들면, i) 사용된 나노재료의 물리화학적 특성, 이들의 생분해성, 생체적합성 및 내재성 잠재적 세포독성; ii) 투여의 유효성; iii) 부작용의 발병과 관련되는 조직 특이적 전달의 비선택성; iv) 혈류 중의 조절되지 않은 약물 방출; v) 느린 세포 용해/축적; vi) 생물학적 장벽을 교차하는 데 있어서 낮은 효율을 여전히 제한한다. 따라서, 적절한 투여 경로의 정의를 통해, 목적하는 기관에 선택적으로 도달할 수 있는 적절한 NP의 개발이 여전히 중요하다.
인산칼슘(CaP)에 기초하는 재료는 이들의 생체적합성 및 생분해성 때문에 다양한 생물의학 적용에 널리 사용된다. CaP-기반 재료를 사용한 형질감염은 40년 이상 동안 유전자를 시험관 내에서 상이한 세포 유형으로 방출시키는 데 사용되어 왔다(참조: Graham, F. L.; Erb, A. J. V. d. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973, 52, 456-467; V. Sokolova, M. Epple. Inorganic nanoparticles as carriers of nucleic acids into cells. Angew Chem Int Ed Engl, 47 (8) (2008), pp. 1382-1395). 일반적인 방법은 특정 pH 값(7 이상)에서 적절한 농도의 칼슘 및 인산염 이온을 혼합한 후 자발적으로 형성되는 침전물에 유전자를 캡슐화하는 것이다. 이 방법은 뉴클레오티드 및 핵산을 결합하는 데 있어서 생산 용이성, 낮은 비용 및 높은 효율과 같은 다수의 이점을 갖는다. 또한, CaP 기반 재료는 pH-민감한 안정성이어서 산성 환경(즉, 엔도솜, 리소좀)에서 신속한 용해를 제공한다. 이온 성분에 CaP의 완전한 용해가 세포 및 조직에 바람직하지 않은 재료 축적을 방지하고, 결점은 종종 다른 무기 및 금속 화합물과 직면한다. 이러한 방식으로, CaP 입자는 세포 내재화 후에만 내부에 도입된 제제를 선택적이고 안전하게 방출할 수 있다.
그러나, CaP 입자를 제조하는 데 있어서 최대의 문제는 합성에서 재현성의 심각한 문제를 일으키고 이의 최적의 콜로이드성 안정성을 방해하는 응집 및 성장하는 경향이다. 이러한 합병증은 그들의 개발 속도가 느려지고, 따라서 그들의 시험관 내 및 생체내 사용이 느려졌다. 실제로, CaP의 큰 입자(마이크로미터 규모)는 또한 세포 자체의 후속적인 사망과 함께 세포내 칼슘의 양의 간섭을 유도할 수 있다(참조: Neumann, S. et al. The use of size-defined DNA-functionalized calcium phosphate nanoparticles to minimize intracellular calcium disturbance during transfection. Biomaterials, 2009, 30 (35), 6794-802). 따라서, 핵산 또는 다른 화합물을 전달하여 이를 외부 환경으로부터 보호할 수 있고, 이의 조기 방출 또는 분해를 방지하기 위해 CaP의 NP를 제조하는 데 성공하는 것이 매우 큰 관심사이다. 조절되지 않는 성장을 방지하고 치료제를 접합시킬 수 있는 CaP의 NP를 안정화시키기 위해, 합성 중합체 재료로의 코팅이 사용되어 왔다(폴리에틸렌 글리콜(PEG)(참조: Kakizawa, Y.; Kataoka, K. Block Copolymer Self-Assembly into Monodispersive Nanoparticles with Hybrid Core of Antisense DNA and Calcium Phosphate. Langmuir, 2002, 18 (12), 4539-4543); 폴리에틸렌이민(PEI)(참조: T. Devarasu, et al. Potent calcium phosphate nanoparticle surface coating for in vitro and in vivo siRNA delivery: a step toward multifunctional nanovectors); 키토산(참조: Giger, E. V. et al. Gene delivery with bisphosphonatestabilized calcium phosphate nanoparticles. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 2011, 150 (1), 87-93), 비스포스포네이트(참조: Lee, K. et al. Stabilized calcium phosphate nano-aggregates using a dopachitosan conjugate for gene delivery. International journal of pharmaceutics, 2013, 445 (1-2), 196-202) 또는 지질(참조: Li, J.; Yang, Y.; Huang, L. Calcium phosphate nanoparticles with an asymmetric lipid bilayer coating for siRNA delivery to the tumor. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 2012, 158 (1), 108-14). 그러나, 이러한 합성 중합체 재료는 일반적으로 완전 생분해성이 아니고 알레르기 반응을 일으킬 수 있다.
종양의 치료에서, CaP-기반 NP가 제조되고, 장쇄의 microRNA의 접합을 위한 폴리에틸렌이민으로 코팅되었다(참조: Hyosook Jung et al "Long chain microRNA conjugates in calcium phosphate nanoparticles for efficient formulation and delivery", Arch. Pharm.Research, 2014). 이러한 접합체는 전립선 암 세포에서 성공적으로 시험관 내 방출되었다.
심혈관 질한은 사망의 주요 원인이며, NP의 사용을 통해 그들을 치료하려는 시도가 또한 수행되었다. 그러나, 심혈관 질환의 치료적 치료를 위한 효율적인 NP의 개발 및 사용은 아직 시작 단계에 있다. 실제로, 비생체모방 합성 중합체에 기초하는 덴드리머, 리포좀 또는 NP만이 심근 세포로의 다양한 치료적 분자의 생체내 전달을 위해 지금까지 연구되어 왔다. 이러한 제한은 다음과 같은 클리닉으로의 NP 번역을 방해하는 몇 가지 우려로 인한 것이다: i) 낮은 생분해성 및 생체적합성; ii) 독성 부산물; iii) 불량한 캡슐화 효율; iv) 불량한 저장 안정성; v) 혈류에서 조절되지 않은 약물 방출; vi) 제한된 세포-표적 특이성; vii) 느린 세포 용해/축적; viii) 전신 투여 접근법의 불량한 효율; ix) 생물학적 장벽을 교차하는 데 있어서 낮은 효율. 따라서, 치료 약물의 안전하고, 효율적인 심장 특이적 전달을 위한 신규 접근법이 강하게 요구된다. 최근에(참조: Michele Miragoli et al., "Functional interaction between charges nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for cardiac arrhythmia?" Nanomedicine (2013)8(5),725-737), 폴리스티렌 라텍스 NP(50nm 치수)가, 표면 전하에 따라, 극성 심장 세포(심근 세포)와 어떻게 상호작용할 수 있는지를 기재했다. 특히, 그것은 양으로 하전된 NP의 사용에 의해 유발된 세포 사멸 반응 및 후속 세포 사망과 대조적으로, 음성 표면 전하를 갖는 NP의 사용이 세포 생존력에 적합한 일시적인 나노기공의 형성을 통해 심근 세포 내에서 NP 자체의 진입을 촉진시키는 방법을 나타내고 있다. 그러나, 시험관 내 투여에서의 부분적인 유효성에도 불구하고, 잠재적인 약물 담체로서 이러한 음으로 하전된 폴리스티렌 라텍스 NP의 전위는 전기생리학적 프로파일의 변화 및 부정맥에 대한 민감성과 같은 주요 부작용에 기인하여 만성 투여에 크게 제한되고, 따라서 생체내 이의 잠재적인 치료적 사용이 상당히 제한된다.
본 발명의 목적은 심장 전기생리학적 프로파일의 변화 중에서 종래 기술의 결점을 갖지 않는, 심장 질환을 치료하기 위한 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)에 기초하는 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 캡슐화될 수 있고/있거나 부정맥 또는 심장 세포의 전기생리학적 프로파일의 변화를 일으키지 않고 심혈관 질환을 치료하기 위한 치료적 접근법일 수 있는 것으로 입증되고, 비침습적 흡입 경로를 통해 심근에 직접 전달되는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 진단/치료제로 표면-작용화될 수 있는 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)로 이루어진 생성물의 제조방법을 발견하였다. 추가로, 다른 장관 및 비경구 투여 경로(즉, 정맥내, 복강내, 경구, 설하, 직장, 안내, 국소 또는 경피)가 제공될 수 있다. 추가로, 표면이 비-심장 세포 특이적 진단/치료 화합물로 작용화된 경우, 본 발명은 심장 이외의 다른 조직의 표적화를 위한 것이다.
따라서, 본 발명은
a) 7 내지 10 범위의 pH를 갖고, 칼슘 수용액, 인산염 수용액 및 시트레이트 이온 용액을 포함하는 혼합물을 20℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 30초 내지 10분 범위의 시간 동안 유지시키는 단계;
b) 수득된 단계 a)의 용액으로부터 미반응 이온을 제거하여 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 현탁액을 수득하는 단계;
c) 단계 b)의 현탁액으로부터 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 생성물을 회수하는 단계를 포함하여, -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖는 음성 표면 전하를 갖는 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖고 최대 1.76의 분할 계수(SF, splitting factor)를 갖는 하나 이상의 CaP-NP로 제조된 생성물을 수득하게 하고, 상기 하나 이상의 CaP-NP는 심장 세포로 진입할 수 있고 심장 전기생리학적 프로파일의 변화를 일으키지 않는다. 본 발명의 생성물은 회전 타원체 형태를 갖는 나노 입자의 형태로 유리한 것으로 판명되었다.
본 발명의 바람직하고 유리한 국면에서, 본 발명의 방법은 단계 a)에서, 하나 이상의 치료/진단 화합물의 수용액을 첨가하는 단계를 포함한다.
놀랍게도, 그리고 본 발명의 바람직한 방법에서, 본 발명의 바람직하고 유리한 국면에 따라서 수득가능한 본 발명의 생성물은 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)로 이루어진다. 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 본 발명의 생성물은 또한 놀랍게도 -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖고 150 내지 231nm 범위의 평균 평균 유체역학적 직경(Z-평균으로서 측정됨)을 갖는 하나 이상의 음으로 하전된 CaP-NP로 이루어지는 것으로 판명되었다. 본 발명의 생성물은 회전 타원체 형태를 갖는 NP의 형태로 유리한 것으로 판명되었다.
따라서, 유리하게는, 본 발명은 단계 a)의 혼합물에 하나 이상의 치료/진단 화합물의 용액을 첨가하는 단계를 제공한다. 하나 이상의 진단/치료 화합물의 용액을 첨가한 본 발명은 안에 캡슐화된 하나 이상의 진단/치료 화합물과 함께 정의된 치수 및 전하를 갖는 NP를 수득할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 무정형 CaP와 결정학적 구조가 유사한 낮은 결정화도에서 CaP의 즉시 형성을 보장하는 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 150 내지 231nm 범위의 치수의 NP의 저온 형성을 발견했다. 어떠한 이론에 결부시키지 않고, 본 발명의 발명자들은, 종래 기술에 사용된 것들과 비교하여 보다 더 "생물 친화적인" 안정화제인 시트레이트 이온의 존재 뿐만 아니라 온도 및 시간 조건의 선택이 특히 표면에 결합함으로써 이의 추가의 성장을 방지하고 콜로이드 수준에서 안정하게 하는 혼합물의 시트레이트 이온으로 인해 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 CaP-NP가 안정화되도록 허용하였다고 믿는다. 또한, 실험 파트에 나타난 바와 같이, 표면 상에 시트레이트의 존재는 CaP-NP의 표면을 음으로 하전되게 하고 콜로이드 수준에서 안정하게 할 수 있는 광범위한 음의 값으로 표면 전위를 이동시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 수득가능한 CaP-NP는 최대 1.76의 분할 계수를 가짐으로써 낮은 결정화도를 갖는 것으로 입증되고, 다량의 진단/치료 화합물의 캡슐화/표면-작용화를 가능하게 하였다. 발명자에 따르면, 사실상, 낮은 결정화도는 더 큰 구조적 장애를 초래하고, 따라서 치료/진단 화합물을 결합할 수 있는 다량의 유리 이온 부위를 유도한다. 또한, 본 발명의 바람직하고 유리한 구현예의 CaP-NP는 150 내지 231nm 범위의 평균 평균 유체역학적 직경(Z-평균으로 측정됨)을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는 유리하게는 심장 질환의 치료에 이의 사용을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 유리한 특징은 CaP-NP의 합성 동안 치료/진단 화합물을 직접 혼합하는 데 있다.
또한, 이 절차에 의해 수득된 낮은 수준의 결정화도(최대 1.76의 분할 계수로서 표현됨)는 CaP-NP의 분해성의 시간을 증가시키고, 따라서 치료/진단 화합물의 신속한 방출을 선호한다. 또한, 이 절차에 의해 수득된 결정화도의 수준을 증가시킴으로써 CaP-NP의 분해성의 시간을 감소시키고, 따라서 치료/진단 화합물의 서방성을 선호한다.
본 발명의 또 다른 유리한 특징은 최종 CaP-NP 생성물의 가능한 표면-작용화에 있고, 따라서 약물-표적화 특이성(즉, 세포-특이적 유도 및/또는 수용체 활성화/억제를 위한 세포외 표적의 결합)의 특유한 요구를 선호한다.
본 발명에서, 용어/정의는 다음과 같다:
- "치료/진단 화합물(들)"은 관심 있는 기관으로의 방출을 위한 하나 이상의 의학적 화합물, 예를 들면, 핵산, 펩티드, 합성 화합물 또는 진단 프로브를 의미한다;
- 150 내지 231nm 범위의 "Z-평균"은 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering; DLS)에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경을 의미한다.
- "-27.0mV 내지 -41.0mV 범위의 ζ-전위를 갖는 음으로 하전된 CaP-NP"는 전기영동 광 산란(Electrophoretic Light Scattering; ELS)에 의해 결정된 ζ-전위를 갖는 CaP-NP를 의미한다;
- "분할 계수"는 문헌(참조: Weiner S. and Bar-Yosef O. (1990). States of preservation of bones from prehistoric sites in the Near East: a survey. Journal of Archaeological Science 17, 187-196)에 따라 NP의 FT-IR 스펙트럼으로부터 계산된 결정화도의 정도를 측정한다.
이의 또 다른 국면에서, 본 발명은 흡입 투여를 통해 심혈관 질환을 치료하는 데 있어서 비히클로서 사용하기 위한 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다.
이의 추가의 유리한 국면에서, 본 발명은 흡입 투여를 통해 심혈관 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 CaP-NP에 캡슐화된 하나 이상의 화합물을 사용하는 이의 바람직하고 유리한 구현예에서 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 흡입 투여를 통해 심혈관 질환의 비침습적 치료에 적용되는 나노의약 분야에서 특히 유리하다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 생성물이 심장-폐 축을 통해 심근에 도달하게 하는 흡입 투여를 통해 본 발명의 생성물로 심혈관 질환을 치료하는 직관력을 가졌다. 결과적으로 놀랍게도, 본 발명의 생성물의 흡입에 의한 치료는 폐 장벽을 통과하여 혈액 순환으로 이동하여 폐-심혈 순환으로 들어가서 심장 조직/세포를 표적화하는 심장에 도달하고, 분극된 심근 세포와 상호작용하고 이에 의해 내재화되도록 하였다. 이는 치료/진단 화합물의 심근으로의 방출을 촉진시켰다.
추가로, 본 발명은 다른 장관 및 비경구 투여 경로(즉, 정맥내, 복강내, 경구, 설하, 직장, 안내, 국소 또는 경피)를 통해 투여할 수 있는 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 또한 심근에 방출될 화합물의 캡술화를 위해 인산칼슘 나노 입자(CaP-NP)를 사용하는 직관력을 가졌다. 본 발명에 이르는 연구에서, 본 발명의 방법의 CaP-NP는 놀랍게도 시험관 내 심장 세포 및 생체내 심근 둘 다에 화합물을 내재화시키는데 존재했다. 임의의 이론에 결부시키지 않고, 본 발명자들은, 특정 적용에서, 본 발명에 따라 제조되고 음으로 하전된 CaP-NP는 세포에 덜 독성이었고 세포 생존력에 적합한 엔도시토시스-의존성 내재화를 촉진시켰다는 것을 확립했다. 놀랍게도, 음전하의 존재는 그러한 또는 하나 이상의 화합물을 캡슐화하는 CaP-NP가 과분극된 막(예: 심근 세포)이 있고 부정맥의 발병과 같은 부작용이 없는 세포에서 내재화의 생존력에 적합한 심근으로 방출되도록 하였다. 본 발명의 다른 국면에서, CaP-NP는 목적하는 기관에 작용성 치료 약물의 직접 세포-특이적 결합, 내재화 및 세포내 방출을 위한 표적화 리간드(즉, 항체, 펩티드, 압타머)로 표면-작용화될 수 있고, 따라서 전신 약물 노출 및 심근 이외의 조직에서 부작용을 최소화하면서 약물 효능을 향상시킨다.
본 발명은 이하 실험 파트에서 상세히 기재되고 예시될 것이다.
도 1은 본 발명에 따라서 제조된 CaP-NP에 대한 시트레이트 이온의 효과를 나타낸다. (a, b) 시트레이트의 증가량을 사용하거나 사용하지 않고 합성된 CaP-NP의 콜로이드성 안정성 및 치수의 평가; (a) 평균 유체역학적 직경의 척도로서의 Z-평균 및 (b) DLS에 의해 1시간 동안 연속적으로 측정된 초당 광자수의 카운트.
도 2는 생성된 CaP-NP에 대한 성숙 시간의 효과를 나타낸다. 상이한 합성 시간 및 80mM의 시트레이트 농도를 사용하는 CaP-NP의 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy; FTIR). 560 및 603에서의 피크는 결정화도의 정도와 상호관련시킨다.
도 3은 (a) 시간의 함수로서 투석 용액의 전도율 및 (b) Z-평균의 측정을 통해 DLS에 의해 평가된 투석 6시간 후 용액 중의 CaP-NP의 안정성을 나타낸다.
도 4는 (a)가 없는 80mM 시트레이트 농도를 사용하여 합성된 및 6시간 투석 후(b) CaP-NP의 투과 전자 현미경(TEM)의 분석; 및 (c) EDX(에너지 분산형 x-선 분광법) 분광학에 의해 도 2b에 도시된 CaP-NP의 분석을 도시한다.
도 5는 10㎍/ml의 miR의 초기 농도를 사용하는 CaP-NP-miR의 투과 전자 현미경(TEM)의 분석을 도시한다.
도 6은 (a) 사멸 세포만을 선택적으로 마킹할 수 있는 염료인 트리판 블루를 사용하는 배제 검정으로 분석된 세포 세포독성의 평가를 나타낸다. 클라트린 또는 디나민 억제제는 CaP-NP의 내재화에 관련되는 엔도사이토틱 공정(endocytotic processes)을 강조하는데 사용되었다. (b) 카스파제 3 내지 7 검정에 의해 분석된 세포 아폽토시스 수준의 평가. (c) CaP-NP-FITC로 처리된 HL-1 세포의 공초점 현미경법에 의해 분석된 형광 이미지. CaP-NP-FITC 신호는 세포내 구획에서 CaP-NP-FITC의 내재화를 동정한다. DAPI = 핵.
도 7은 20㎍/mL CaP-NP의 24시간 노출 후 HL-1의 전기생리학에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 특히, 이는 노출되지 않은(블랙) 및 20㎍/ml CaP-NP에 노출된(그레이) HL-1 세포에 대한 수동적 특성의 박스-플롯[휴지 막 전위(상단), 막 용량(중간) 및 막 저항(하단)]을 나타낸다.
도 8은 20㎍/mL CaP-NP의 24시간 노출 후 HL-1의 전기생리학에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 특히, 이는 (a) 대조군(좌측, 블랙: 평균+SD; 밴드로서 나타낸 SD) 및 노출된 조건(우측, 그레이) HL-1 세포에서 램프 프로토콜로 수득된 I-V 곡선을 나타낸다. 하단 행. 두 곡선의 중첩(좌측) 및 평균 차이 순 막 전류 곡선(우측). (b) 두 조건에 대한 대표적인 나트륨 전류 추적. 하단. 대조군(블랙) 및 노출된(그레이) HL-1 세포에 대한 피크 나트륨 전류 I-V 및 나트륨 채널 활성화의 전압 의존성(g/gmax, 우측).
도 9는 20㎍/mL CaP-NP의 5시간 노출 후 성체 마우스의 전기생리학 심실 심근 세포에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 특히, (a) 대조군(좌측, 블랙: 평균+SD; 밴드로서 나타낸 SD) 및 노출된 조건(우측, 그레이) 성체 심실 심근에서 램프 프로토콜로 수득된 I-V 곡선. (b) 곡선의 중첩(좌측) 및 평균 차이 순 막 전류 곡선(우측).
도 10은 20㎍/mL CaP-NP의 5시간 노출 후 성체 마우스의 심실 심근 세포의 전기생리학에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 특히, (a) 대조 조건 및 20㎍/mL CaP-NP의 적용 후 "전체 세포 전류 클램프 구성"에 기록된 대표적인 작용 전위. (b) 성체 심근 세포의 막 전위(Vm), 막 용량(Cm) 및 막 저항(Rm)에 대한 CaP-NP의 효과(상단). 작용 전위 역치(APth) 및 AP 진폭(APA)(중간), AP의 최대 상승 속도(dV/dtmax) 및 90% 재분극에서 AP 지속 시간(APD90)(하단)에 대한 CaP-NP의 효과.
도 11은 20㎍/mL CaP-NP의 5시간 노출 후 성체 마우스의 심실 심근 세포의 전기생리학에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 특히, (a) 대조 조건 및 20㎍/mL CaP-NP의 개입 후 "전체 세포 전압 클램프 구성"에 기록된 대표적인 나트륨 전류(상단). 대조 전위("전압 단계" 프로토콜)의 함수로서 나트륨 전류 피크의 평균 밀도의 중첩 및 대조 조건(블랙) 및 20㎍/mL CaP-NP의 적용 후(그레이) 수득된 정상 상태 활성화 곡선의 전압 의존성(중간). (b) 대조 조건 및 20㎍/mL CaP-NP의 개입 후 "전체 세포 전압 클램프 구성"에 기록된 대표적인 칼슘 전류(상단). 대조 전위("전압 단계" 프로토콜)의 함수로서 칼슘 전류 피크의 평균 밀도의 중첩 및 대조 조건(블랙) 및 20㎍/mL CaP-NP의 적용 후(그레이) 수득된 정상 상태 활성화 곡선의 전압 의존성(하단).
도 12는 20㎍/mL CaP-NP에 24시간 동안 노출 후 HL-1 세포의 세포질 칼슘 수준(칼슘 과도현상)에 대한 CaP-NP의 효과를 나타낸다. 칼슘 과도현상은 심근 세포의 수축기/이완기의 교호에서 이온의 주기적인 변동을 반영한다. 시스템 IonOptix에 의해 분석된 세포는 칼슘 민감성 형광단 Fura2를 부하했다.
도 13은 HEK293 세포에 증가하는 용량의 CaP-NP-miR의 투여 후 miR-133의 내재화의 결과를 나타낸다. 내재된 miR-133의 양은 전체 RNA 추출물에 대해 정량적 PCR로 측정했다. 리포펙타민은 리포솜에 의한 miR-133의 형질감염의 양성 대조군이다.
도 14는 생리 식염수 단독(대조군) 또는 본 발명의 나노 입자(CaP-NP)의 기관내 투여 후 성체 랫트에서 수행된 전위도의 프로파일을 나타낸다.
도 15는 기관 점적 주입을 통해 CaP-NP-FICT로 처리된 동물의 심근 조직 상의 2개의 광자에 대한 현미경 분석을 나타낸다. 이미지는 CaP-NP-FITC에 의한 심실 조직의 실제 도달을 나타낸다. 하단의 제제의 이미지에서, CaP-NP-FITC는 또한 혈관 내부에 존재한다.
도 16은 당뇨병성 심근병증의 마우스 모델에서 PCT 출원 PCT/EP2015/051376에 기재된 모방 펩티드(MP)의 치료 가능성을 나타낸다. MP는 신규한 부류의 양성 변력물질에 속하는 짧은 9aa 펩티드이다. 비종래적 메카니즘(즉, 채널 게이팅 특성을 변경하지 않고, 칼슘 의존성 수축기 수축을 유도하는 유발 요소인 전압 의존성 L-형 칼슘 채널의 세포 표면 밀도의 정상화)을 통해 작용시킴으로써, MP는 심장 박동의 힘을 회복하고 이전 부류의 변력물질의 유해한 결점(즉, 부정맥 발생 및 심근 산소 낭비)을 우회한다. (a) 에코, 심초음파. 스트렙토조토신(STZ) 및 CaP-NP에 캡슐화되지 않은 MP(MP), 스크램블-부하된 CaP-NP(CaP-NP-HA) 또는 MP-부하된 CaP-NP(CaP-NP-MP)로 처리된 마우스에서 심초음파로 측정된 분획 단축(%). (n=10) (b) 처리된 마우스로부터 다니된 성체 심근 세포에서 Ca2 + 전류 측정. I/V 관계가 도시된다(n>16). 데이터는 평균 ± SEM; ****, P<0.0001로서 나타낸다.
따라서, 본 발명은
a) 7 내지 10 범위의 pH를 갖고, 칼슘 수용액, 인산염 수용액 및 시트레이트 이온 용액을 포함하는 혼합물을 20℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 30초 내지 10분 범위의 시간 동안 유지시키는 단계;
b) 수득된 단계 a)의 용액으로부터 미반응 이온을 제거하여 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 현탁액을 수득하는 단계;
c) 단계 b)의 현탁액으로부터 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 생성물을 회수하는 단계를 포함하여, -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖는 음성 표면 전하를 갖는 인산칼슘의 하나 이상의 나노 입자(CaP-NP)의 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 단계 a)의 혼합물 중의 칼슘 수용액은 바람직하게는 20 내지 200mM 범위의 몰 농도를 갖는 염화칼슘 용액이다.
본 발명에 따라서, 단계 a)의 혼합물 중의 인산염 수용액은 바람직하게는 24 내지 140mM 범위의 몰 농도를 갖는 Na2HPO4 용액이다.
단계 a)의 온도는 20℃ 내지 40℃ 범위이다. 바람직하게는, 이는 35 내지 40℃ 범위이고, 더욱 바람직하게는 이는 약 37℃이다.
단계 a)의 혼합물의 20 내지 40℃ 범위의 온도에서의 유지 시간은 30초 내지 10분 범위이고, 바람직하게는 이는 약 5분이다.
시트레이트 이온 용액은 바람직하게는 40 내지 800mM 범위의 몰 농도를 갖는 나트륨 시트레이트 수용액이다.
단계 a)의 혼합물은 7 내지 10 범위의 pH를 갖고, 더욱 바람직하게는 상기 혼합물의 pH는 10이다.
단계 a)의 말기에, 혼합물을 미반응 이온의 제거 공정에 적용한다. 바람직하게는, 상기 단계는 투석 막에 의해 수행된다. 또는, 전기영동 침착 또는 분자 배제 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
본 발명이 투석 막을 사용하는 경우, 이는 바람직하게는 3500달톤의 컷-오프(cut-off)를 갖는 셀룰로스 막이다. 투석 막을 사용하여 수행되는 제거 단계 b)는 5 내지 24시간의 시간 동안, 더 바람직하게는 6시간 동안 일어난다.
미반응 이온의 제거 단계 b)의 말기에, 이중 증류수를 첨가하고 동결 건조시켜 단계 c)의 CaP-NP를 수득할 수 있는 나노 입자의 현탁액이 수득된다. 또는, 단계 b)의 생성물을 동결 건조하여 분말을 수득할 수 있다.
본 발명의 방법은 실험 파트에서 나타낸 바와 같이, 심장 세포로 진입할 수 있고 심장 전기생리학적 프로파일의 변화를 일으키지 않는 -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 갖는 하나 이상의 CaP-NP로 제조된 생성물을 수득하게 한다. 본 발명의 생성물은 회전 타원체 형태를 갖는 NP 형태로 유리한 것으로 판명되었다. 또한, 본 발명의 방법으로 수득가능한 NP는 다량의 진단/치료 화합물을 캡슐화하게 하는 NP의 분할 계수로서 측정된 낮은 결정화도를 갖는 것으로 판명되었다. 본 발명의 방법으로부터 수득할 수 있는 NP는 무정형 인산칼슘에 필적할 만한 낮은 결정화도를 갖고(이는 하기 실험 파트로부터 명백하다), 이는 실제로 더 큰 구조적 장애 및 따라서 치료/진단 화합물을 결합시킬 수 있는 다량의 유리 이온 부위를 유도할 수 있다. 본 발명의 바람직하고 유리한 국면에서, 본 발명의 방법은 단계 a)에서, 하나 이상의 치료/진단 화합물의 수용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 또는, 본 발명의 추가의 바람직하고 유리한 국면에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 치료/진단 화합물에 의한 최종 생성물의 표면-작용화의 첨가를 포함한다. 예를 들면, 진단/치료 화합물에 의한 CaP-NP의 표면-작용화는 상이한 시간 동안 CaP-NP의 현탁액을 진단/치료 화합물의 용액과 혼합한 다음, 세척 절차에 의해 수행될 수 있다. 진단/치료 화합물과 CaP-NP 사이의 안정한 결합은 주로 정전기 상호작용의 형성을 통해 일어난다.
하나 이상의 치료/진단 화합물은 바람직하게는 핵산, 펩티드, 합성 화합물 및 진단 프로브로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
단계 a)에서 관심 있는 하나 이상의 진단/치료 화합물의 용액의 존재는 단계 c)의 말기에 구조에 캡슐화된 치료/진단 화합물(들)을 갖는 CaP-NP를 수득할 수 있게 한다.
따라서, 놀랍게도, 본 발명의 바람직하고 유리한 국면에 따라서 수득가능한 본 발명의 생성물은 하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 하나 이상의 CaP-NP를 포함하고/하거나 하나 이상의 표면-작용화된 치료/진단 화합물을 포함한다.
하나 이상의 진단/치료 화합물을 캡슐화하는 본 발명의 생성물은 놀랍게도 -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위 및 150 내지 231nm 범위의 Z-평균을 갖는 하나 이상의 음으로 하전된 CaP-NP를 포함하는 것으로 판명되었다. 구조에 캡슐화된 치료/진단 화합물(들)을 갖는 본 발명의 생성물은 회전 타원체 형태를 갖는 CaP-NP 형태로 유리한 것으로 판명되었다.
이의 다른 국면에서, 본 발명은 흡입 투여를 통해 심혈관 질환을 치료하는 데 있어서 비히클로서 사용하기 위한, 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다.
본 발명에서 심혈관 질환은 심부전, 심근 수축 감소, 세동, 당뇨병성 심근병증, 확장형 심근병증, 유전 질환(예: 브루가다 증후군(Brugada syndrome), 티모시 증후군(Timothy syndrome), 또는 짧은 QT 증후군, 근이영양증), 심장 비대증, 저혈압, 갑상선 기능 저하증, 갑상선 기능 항진증, 급성 심부전, 만성 심부전, 심근 경색을 포함한다.
이의 추가의 유리한 국면에서, 본 발명은 상기한 바와 같고 실험 파트에 나타낸 바와 같이, 흡입 투여를 통해 심혈관 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 CaP-NP에 캡슐화된 하나 이상의 화합물을 갖는 이의 바람직하고 유리한 구현예에서 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다른 장관 및 비경구 투여 경로(즉, 정맥내, 복강내, 경구, 설하, 직장, 안내, 국소 또는 경피)를 통해 투여될 수 있는 본 발명의 방법으로 수득가능한 생성물에 관한 것이다.
실험 파트
실시예 1A. 본 발명의 인산칼슘 나노 입자( CaP -NP)의 제조.
CaCl2(10 내지 50mM) 및 Na3(C6H5O7)(40 내지 200mM)의 용액 12.5용적, NaOH(0.1 내지 0.5M) 용액 1용적 및 Na2HPO4(12 내지 60mM) 용액 12.5용적을 함유하는 용액을 제조한 다음, 5분 동안 37℃ 수욕에 배치했다.
미반응 시약을 제거하기 위해, CaP-NP의 용액을 3500달톤의 컷오프를 갖는 셀룰로스 투석 막 중에서 6시간 동안 투석을 실시하고, 400ml의 이중 증류수에 침지시켰다. 이어서, 용액을 회수하고, 4℃에서 냉장고에 저장했다. CaP의 양은 샘플을 동결 건조시킨 후 무기 잔사를 칭량하여 평가했다. CaP의 수성 현탁액의 최종 농도는 시약의 농도의 함수로서 60 내지 300㎍/ml 범위였다.
나노 입자를 제조하기 위해, Ca2 +와 PO4 3- 사이의 합성 반응은 다른 화학종의 형성을 방지하기 위해 NaOH(0.1 내지 0.5M) 용액을 첨가하여 pH를 조정하여 pH 10에서 수행했다. 칼슘 및 인산염과 함께 초기 용액에 존재하는 나트륨 시트레이트는 CaP 입자가 조절된 방식으로(Ca2 + 및 PO4 3-의 과포화 수준을 변화시킴으로써) 결정을 형성하게 하는 안정화제였다.
NP 현탁액은 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering; DLS)으로 분석하여 100 내지 200nm 범위의 입자의 Z-평균을 나타내었다.
단계 b)의 CaP-NP의 수성 현탁액의 최종 농도는 시약의 농도의 함수로서 60 내지 300㎍/ml 범위였다.
본 발명의 생성물, 즉 CaP-NP의 투과 전자 현미경(TEM)에 의한 분석은 직경 약 50nm의 Z-평균을 나타내었다.
실시예 1B: 본 발명의 CaP -NP에 대한 시트레이트 이온 및 온도 및 시간 조건의 효과.
단계 a)에서 시트레이트 이온의 존재의 본질을 평가하기 위해, CaP-NP의 치수 및 콜로이드성 안정성에 대한 시트레이트의 효과는 DLS에 의해 사전에 평가하였다.
동일 용적의 Na2HPO4(24mM) 및 CaCl2(20mM) + Na3Cit(20, 40, 80mM)의 용액을 1회용 큐벳에서 직접 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 정치시키고, 시트레이트의 부재 또는 존재하에 CaP-NP 침전물의 크기 및 안정성을 평가하기 위해 DLS 측정을 실시했다. 상이한 농도의 나트륨 시트레이트(20, 40, 80mM)를 사용하였다.
유체역학적 직경 및 초당 광자의 수는 DLS에 의해 60분 동안 연속적으로 측정하였다(도 1a, b).
시트레이트의 존재 및 부재하에 합성된 CaP-NP의 Z-평균이 결정화 시간의 함수로서 측정된, 도 1a에 도시된 데이터는 명백하게 수초 결정화 후에 이미 시트레이트의 부재하에 결정화된 CaP-NP의 평균 평균 유체역학적 직경이 약 2㎛였고, 60분의 시간 동안 안정하게 유지되었음을 보여준다. 한편, 수초 후 시트레이트의 존재하에 합성된 CaP-NP의 Z-평균은 시트레이트의 부재하에 제조된 CaP-NP보다 상당히 작았다(약 100nm). 시트레이트의 존재하에 합성된 CaP-NP의 평균 평균 유체역학적 직경은 시트레이트 없는 대조군 샘플보다 경시적으로 서서히 증가되어, 시트레이트가 NP의 크기를 안정화시키고 응집체를 형성하는 CaP-NP의 경향을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 데이터는 합성 동안 시트레이트의 양을 증가시킴으로써, CaP-NP의 Z-평균이 보다 서서히 증가하고, 농도와 무관하게 보다 낮은 결정화 시간에 시트레이트는 NP의 크기를 안정화시키는 역할을 발휘한다는 것을 나타낸다.
도 1b는, 시트레이트의 부재하에 또는 20mM의 시트레이트 양을 사용하여 합성된 CPC의 초당 광자의 수의 카운트는 경시적으로 감소하여 큐벳 중의 재료의 양이 기저부 상에 침착 후 감소된다는 것을 보여준다. 한편, 40 및 80mM과 동일한 양의 시트레이트의 존재하에 합성된 CaP-NP의 경우에 검출된 광자의 수는 경시적으로 안정하게 잔류하여 이러한 방식으로 합성된 CaP-NP의 우수한 콜로이드성 안정성을 나타낸다. 결론적으로, 시트레이트의 존재하에 결정화된 CaP-NP는 우수한 치수 및 콜로이드성 안정성을 나타내었고, 따라서 시트레이트의 존재는 입자의 안정성에 필수적이었다.
시트레이트의 효과를 평가한 후, 최적의 결정화 시간을 평가하였다. 80mM의 시트레이트의 존재하에 결정화된 CaP-NP의 샘플은 상이한 결정화 시간(즉, 5, 10, 20 및 60분)에 제조했다. 반응 생성물을 10분 동안 5000 RPM(3.689 x g)에서 원심분리에 의해 물로 3회 세척하고, DLS, 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 특성화했다. CaP-NP의 양은 세척 및 동결 건조 후 무기 잔사를 칭량하여 평가하였다.
상이한 시간에 합성된 CaP-NP의 FTIR 스펙트럼(도 2)은 입자의 화학적 구조를 평가하기 위해 기록했다. 모든 경우에, CaP의 전형적인 밴드가 강조되었다. 특히, 다음과 같이, 이 구조에 존재하는 주요한 작용성 그룹으로 인해 밴드를 볼 수 있다: 인산염의 스트레칭 진동으로 인해 약 1040cm-1 및 1100cm-1에서 2개의 밴드; 인산염의 굴곡 진동에 기인한 603cm-1 및 560cm-1에서 두 개의 피크; 탄산염 이온의 스트레칭 진동에 기인하는 약 1450cm-1에서 두 개의 작은 밴드. CaP-NP가 조절되지 않은 대기에서 제조되었기 때문에, 탄산염 이온은 재료의 결정성 구조에 자발적으로 들어갈 수 있다. 이 현상은 일반적으로 생물학적 인회석에서도 나타난다. 모든 재료에서, 시트레이트의 카복실 그룹의 스트레칭 진동에 기인하여 약 1600cm-1에서 더 강한 밴드가 명백하다. 이러한 방식으로, CaP의 표면 상에 결합된 시트레이트의 실제 존재가 확인될 수 있다. 결정화 시간이 증가함에 따라, 무정형 재료와 유사한 낮은 장거리 차수(long-range order)를 갖는 재료로부터 보다 결정성인 재료까지 명확한 변환이 관찰되었다.
결정화 시간이 증가함에 따라, CaP-NP의 Z-평균은 60분 후에 합성된 것들에서 약 2㎛의 값에 도달할 때까지 증가하였다. 5분 및 10분 후에 합성된 CaP-NP의 경우에만 평균 평균 유체역학적 반경이 본 발명에 사용하기 위해 필요한 특징을 충족시킨다.
결정화도의 정도는 분할 계수를 평가함으로써 도 2의 FT-IR 스펙트럼으로부터 계산하였다(참조: Weiner S. and Bar-Yosef O. (1990). States of preservation of bones from prehistoric sites in the Near East: a survey. Journal of Archaeological Science 17, 187-196.). SF는 603 및 560cm-1에서 인산염의 스트레칭의 피크 높이의 합을 그들 사이의 골짜기 지점의 높이로 나눔으로써 측정되었다. 모든 높이는 약 780 내지 495cm-1로부터 인출된 기준선의 상방으로 측정하였다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, SF가 높을수록 재료의 결정화도가 높아진다. 5분 결정화 후 CaP-NP의 SF는 603 및 560cm-1에서 인산염의 밴드가 분해되지 않아서 측정할 수 없었고, 이는 매우 낮은 정도의 결정화도를 나타낸다. 한편, SF는 결정화 시간이 증가함에 따라 증가하여 결정화 시간이 재료의 결정화도의 정도에 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다.
결정화 시간 (분) 분할 계수
5 측정불가 (미분해 밴드)
10 1.76
20 2.16
60 2.25
10분보다 긴 결정화 시간으로, 최종적으로 달성된 결정화도의 수준은 너무 높아서 생성물이 의도된 적용에 적합하지 않도록 하였다. 유리하게는, CaP-NP의 분해 시간을 감소시키면 치료/진단 화합물의 서방성을 갖도록 하는 반면, 이 절차에 의해 수득된 결정화도의 수준을 증가시킴으로써, CaP-NP의 분해 시간은 감소되어 치료/진단 화합물의 서방성을 결정하였다.
실시예 1C: 본 발명의 단계 b)의 효과
결정화 동안 미반응 이온을 제거하기 위해, 실시예 1A에 나타낸 바와 같이 투석을 사용했다.
반응 환경에서 과량의 이온 모두가 투석에 의해 제거되도록 최적의 시간을 시험하기 위해, 경시적인 투석 매질의 전도율을 평가하고, 플라토를 6시간 후에 관찰하였다(도 3a). 도달된 전도율 플라토는, 반응 매질로부터 투석 매질로의 이온 교환이 종결되었고, 대부분의 미반응 이온이 세척수로 이동하였음을 나타내었다. 투석 시간 후 CaP-NP의 ζ-전위는 이하 표 2에 나타낸 바와 같이 측정되었다.
투석 시간 (시간) ζ-전위 (mV)
2 +37.0 ± 0.7
4 -35.6 ± 0.6
6 -39.5 ± 1.5
결과는, 투석 시간을 증가시키면 CaP-NP의 평균 평균 유체역학적 직경이 감소되는 반면, ζ-전위는 일정하게 유지된다는 것을 나타내었다. 투석 6시간 후 CaP-NP의 안정성은 DLS에 의해 확인하였다(도 3b). 도 3b는 투석 6시간 후 CaP-NP의 Z-평균 값을 시간의 함수로서 나타낸다. CaP-NP의 치수의 어떠한 변화도 300분까지 관찰되지 않았고, 실제로 치수 값은 경시적으로 일정하게 유지되는 것으로 보인다는 것을 알 수 있다. 도 3b에서 삽입부는 300분까지의 기간 동안 초당 검출된 광자의 수를 나타낸다. 이 분석은 광자 수가 300분 동안 일정하게 유지되었기 때문에 용액에서 6시간 투석한 후 CaP-NP의 최적의 콜로이드성 안정성을 인식할 수 있도록 하였다.
도 4는 부재(도 4a) 및 6시간 투석 후(도 4b) CaP-NP의 TEM 분석을 나타낸다. 투석 전에, CaP-NP(구형 치수 및 더 어두운 컬러로, 그리고 직경 약 20 내지 30nm의 치수로 인식가능)는 물리적으로 CaP-NP에 결합되지 않은 시트레이트가 용액에 잔류되어 있을 가능성이 높은 유기 재료의 층으로 코팅된다는 것을 알 수 있다. 반대로, 이러한 경우에도 6시간 투석 후 CaP-NP는 회전 타원체 형태 및 약 30 내지 50nm의 치수를 갖지만, 표면의 유기 파트 없이 분명히 더 양호하게 정의되었다. 선택된 영역에 대한 EDX 분광학 분석(도 4c)은 6시간 투석 후 CaP-NP 상에서 수행하였고, 그들은 원소 Ca, P(샘플 홀더로 인해 Cu의 것들 및 샘플 및 외부 환경 둘 다로 인해 O 및 C의 것들 이외에)에 기인하는 신호가, CaP-NP가 주로 인산칼슘으로 이루어지고 투석 동안 어떠한 다른 상이 형성되지 않음을 확인한다는 것을 나타냈다.
실시예 2: 본 발명의 CaP -NP의 태깅.
실시예 1A로부터 수득된 NP의 세포 내재화를 평가하기 위해, NP는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 마킹했다.
CaP-NP는 이후 기재되는 바와 같은 FITC 화합물을 포함시키는 것 이외에는, 실시예 1A에서와 같이 제조했다.
CaCl2(10 내지 50mM) 및 Na3(C6H5O7)(40 내지 200mM)의 용액 12.5용적, NaOH(0.1 내지 0.5M) 용액 1용적 및 Na2HPO4(12 내지 60mM) 용액 12.5용적을 함유하는 용액을 제조한 다음, 5분 동안 37℃ 수욕에 배치했다. 미반응 시약을 제거하기 위해, CaP-NP의 용액을 3500달톤의 컷오프를 갖는 셀룰로스 투석 막 중에서 6시간 동안 투석을 실시하고, 400ml의 이중 증류수에 침지시켰다. 이어서, CaP-NP의 현탁액을 수득하였다.
처음에, FITC는 다음 프로토콜에 따라 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTS)으로 접합시켰다(이후, 이 혼합물은 FITC-APTS로서 칭명된다): FITC(0.025mmol) 및 APTES(0.25mmol)를 10ml의 에탄올에 첨가하고, 24시간 동안 암흑에서 600rpm으로 교반하에 정치시켰다.
이어서, 100μL의 FITC-APTS, 100μL의 수산화암모늄(H20 중의 28wt% NH3) 및 100μL의 에트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)를 CaP-NP의 수성 현탁액에 첨가하였다. 이 현탁액을 24시간 동안 암흑에서 600rpm으로 교반하에 정치시켰다. CaP-NP-FITC를 원심분리에 의해 이중 증류수로 3회 세척하여 미만응 FITC를 제거하였다.
따라서, 수득된 CaP-NP-FITC는 생물학적 활성을 평가하기 위한 후속 실시예에 사용했다.
실시예 3: microRNA(치료 화합물의 예)를 캡슐화하는 CaP -NP( CaP -NP- miR )의 제조.
microRNA 캡슐화에 의한 CaP-NP의 제조는 상세하게 이후 기재되는 바와 같은 microRNA 화합물을 포함시킴으로써 구현된 실시예 1A에 기재된 바와 같은 제조 프로토콜에 따라 수행하였다. microRNA miR-133에 상응하는 microRNA는 합성 뉴클레오티드 서열(독일 IBA에 의해 합성됨)이다.
CaCl2(10 내지 50mM) 및 Na3(C6H5O7)(40 내지 200mM)의 용액 12.5용적, 1용적의 NaOH(0.1 내지 0.5M) 용액, 상이한 농도의 microRNA(0.5 내지 10)를 함유하는Na2HPO4(12 내지 60mM)의 용액 12.5용적을 함유하는 용액. 이어서, 용액을 5분 동안 37℃ 수욕에 배치하였다. 이어서, 현탁액을 6시간 동안 투석시키고, 4℃에서 저장했다.
이어서, miR-133을 캡슐화하는 생성되는 CaP-NP(이후, 간단하게 CaP-NP-miR로서 칭명됨)를 치수, ζ-전위 및 형태에 의해 분석했다. 이어서, 용액을 회수하고, 4℃에서 냉장고에 저장했다.
CaP-NP-miR의 수성 현탁액의 최종 농도는 60 내지 300㎍/ml 범위였다(참조: 표 3).
CaP-NP-miR 입자의 특성화는 이하 표 3에 나타낸다.
miRNA의 초기 농도
(㎍ ml-1)		 Z-평균 (nm) ζ-전위 (mV) 다분산도 지수 (pdI)
1 156 ± 6 -29.6 ± 2.6 0.33 ± 0.10
5 199 ± 11 -36.6 ± 1.6 0.29 ± 0.05
10 225 ± 6 -32.1 ± 3.0 0.17 ± 0.01
CaP-NP-miR의 현탁액을 DLS로 분석하여, 150 내지 231nm 범위의 입자의 Z-평균 및 -41.0mV 내지 -27.0mV 범위의 ζ-전위를 나타내었다. 또한, pdI는 0에 근접하는 값을 가져 샘플 치수의 협소한 분포를 나타내었다. 본 발명의 생성물, 즉 CaP-NP-miR의 TEM 분석은 모든 단일 입자의 크기가 약 50nm였음을 나타냈다(도 5).
실시예 4: 실시예 3에서 본 발명의 CaP -NP- miR에 캡슐화된 miR -133의 양의 평가
CaP-NP-miR에 캡슐화된 miR-133의 정확한 양을 평가하기 위해, 정량적인 PCR(qPCR) 측정을 CaP-NP-miR로부터 추출된 전체 핵산 상에서 수행했다. 실시예 3에 기재된 바와 같은 CaP-NP-miR의 3개의 제제로부터, 합성 동안 사용된 상이한 농도의 miR-133(2, 25, 50㎍)을 사용하여 500㎕의 CaP-NP-miR 용액을 퓨어졸(Purezol) 시약(Promega)을 통해 RNA의 추출용으로 사용했다. 이어서, CaP-NP-miR의 각 제제를 위해 추출된 총 40ng의 RNA를 유니버셜 cDNA 합성 II 키트(Exiqon)를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, 역전사 반응물의 1/40을 후속적인 miR-133-특이적 qPCR을 위해 사용하고, 이는 SYBR® Select Master Mix (Invitrogen)를 사용하여 VIIa™ 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem) 상에서 3회 수행하였다. 이어서, miR-133의 정확한 양은 miR-133의 합성 올리고의 공지된 양으로부터 유도된 cDNA의 일련의 희석물(40 펜토몰(fentomol)의 출발점으로부터 1:10 희석)을 사용하는 절대 정량화 방법을 사용하여 측정하였다. CaP-NP에 결합된 miR-133의 양은 선형 표준 곡선 상에서 유래된 Ct를 추적하여 추정하였다. CaP-NP에 결합된 miR-133a의 양은 표 4에 나타낸다. 결과는, 반응 동안 사용된 microRNA의 50% 이상이 CaP-NP 내에 캡슐화되었다는 것을 나타낸다.
CaP-NP-miR의 제조 합성에 사용된 miR-133
(㎍) 		CaP-NP-miR에 캡슐화된 miR-133
(㎍)
1 5 2.6
2 25 20.2
3 50 41.2
실시예 5: CaP -NP 및 독성의 시험관 내 평가
실시예 1A에서 수득된 CaP-NP는 심장 세포주 HL-1을 증가하는 용량의 CaP-NP(0 내지 500㎍/ml)에 노출시켜 생체적합성 및 독성에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 제1 단계로서, 세포독성의 평가는 사멸 세포만을 선택적으로 마킹할 수 있는 염료인 트리판 블루를 사용하는 배제 검정으로 수행하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, HL-1 라인은 시험된 양의 투여를 허용하는 반면, 세포 사망률의 증가는 고용량(>125㎍/ml)에서만 관찰되었다. 후속적으로, 카스파제-3-7 검정을 CaP-NP의 투여 후 야기된 임의의 세포 사멸 반응의 평가를 위해 사용하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 세포 사멸 활성의 측면에서 유의한 차이는 고농도의 CaP-NP ≥ 250㎍/ml에서만 관찰되었다. 따라서, 두 검정을 심근에 대한 관심 있는 화합물의 내재화를 위한 잠재적인 담체로서 CaP-NP를 선택했다.
실시예 6: CaP -NP의 내재화의 평가
CaP-NP의 세포 내재화를 평가하기 위해, 본 발명자들은 HL-1 세포를 실시예 2의 20㎍/ml CaP-NP-FITC의 농도에 노출시키고, 투여 24시간 후에, 공초점 현미경 분석을 수행하였다. 도 6c에 도시된 바와 같이, 별개의 세포내 소포성 구획에서의 CaP-NP-FITC의 명확한 내재화가 수득되었다. 이 내재화가 실제로 활성 엔도시토시스 메카니즘에 기인하였는지의 여부를 결정하기 위해, 클라트린- 또는 디나민-특이적 억제제를 사용하였고, 단백질을 혈장 막의 함입 및 엔도시토시스에 관련시켰다. 따라서, HL-1 세포를 이러한 억제제로 전처리한 다음, 증가하는 농도의 CaP-NP에 노출시켰다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 클라트린/디나민 매개 엔도시토시스 억제가 모든 용량에서 CaP-NP에 의해 유도된 세포 독성(트리판 블루에 의한 배제 검정에서)을 상당히 감소시켜 CaP-NP의 세포상 흡수의 억제를 반영하였다.
실시예 7: CaP -NP 및 전기생리학적 특성의 시험관 내 평가
심근 세포와 같은 흥분성 세포에 칼슘계 나노 입자의 사용에서 주요한 문제 중의 하나는 전기생리학적 특성에 대한 잠재적인 효과이다. 따라서, 본 발명자들은 두 세포 유형(HL-1 및 성체 마우스 심실 심근 세포)의 생물물리학적 특성을 연구했다. 최초로, 본 발명자들은 실시예 1A의 CaP-NP 20㎍/ml의 급성 및 만성 투여 후 HL-1 세포에서의 작용 전위(AP)의 특성을 분석했다. 구체적으로, 투여 24시간 후, HL-1을 만성 실험(CaP-NP로 24시간 항온배양)에 사용한 반면, 마우스 심근 세포는 급성 실험(CaP-NP로 4시간 항온배양)에 사용하였다. 만성 및 급성 조건 모두에서, 전체 세포 배열에서 패치-클램프 기술로 수행된 전기생리학적 실험은 휴식 세포의 생물물리학적 특성 및 임계치 이상의 전기 자극(도 7 내지 11) 후에 수득된 작용 전위 특성에 관해 모두 처리된 샘플 및 대조군 샘플 사이에 임의의 유의차를 나타내지 않았다. 따라서, 이들 세포의 전기적 표현형을 정의하고, 이에 막 전위(Vm), 막 용량(Cm), 막 저항(Rm), 작용 전위 임계치(AP), AP 폭(APA), AP의 최대 상승 속도(dV/dTmax) 및 AP의 지속 시간(APD)과 같은 흥분성의 전형적인 특징을 부여하는 파라미터가 상기 농도에서 CaP-NP의 투여 후에 유의적으로 변화되지 않았다는 것을 알 수 있었다. 또한, 심장 세포의 전형적인 AP 특징(칼륨, 나트륨 및 칼슘 전류)에 기초하여 연구된 두 세포 유형에 통상 존재하는 주이온 전류의 패치-클램프 기술을 다시 사용하는 분석은 만성 및 급성 조건 둘 다에서 대조군 및 CaP-NP로 처리된 군 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다).
최종적으로, 심근 세포의 수축/이완기 단계의 교호시의 칼슘의 주기적 변화를 반영하는 칼슘 수준(칼슘 과도현상)의 세포질 변화의 평가를 수행하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 상이한 조건 사이에서 어떤 유의한 변화도 강조되지 않았다.
결론적으로, 상기 데이터는 CaP-NP가 심근 세포의 생리학적 특성을 변화시키지 않고 세포내 세포질 공간으로 효과적으로 들어갔다는 것을 보여준다.
실시예 8: 캡슐화된 진단/치료 화합물을 갖는 CaP -NP의 효과
내부에 캡슐화된 miR-133(실시예 3에 사용됨)을 모방하는 합성 이중 올리고에 의한 CaP-NP의 세포 내재화를 평가했다. 따라서, 본 발명의 생성물은 합성 miR-133의 용액을 사용하여 실시예 3에 따르는 miR-133에 접합된 CaP-NP(CaP-NP-miR)로서 제조하였다. miR133, 음성 베타-아드레날린성 수용체 조절제인 것으로 공지된 근육-특이적 microRNA.
이어서, 본 발명의 화합물의 내재화는 CaP-NP-miR의 증분 용량으로 사전에 처리된 세포로부터 추출된 전체 RNA 상에서 수행된 qPCR에 의해 확인하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, CaP-NP-miR의 증가하는 용량에 의한 각각의 치료는 세포내 miR-133의 증분 값에 상응하였다.
이러한 데이터는, CaP-NP-miR 입자에 캡슐화된 miR-133 화합물이 실제 활성적으로 세포 내에 내재화되었다는 증거를 제공했다. 따라서, 이러한 증거는 치료/진단 화합물의 효율적인 세포내 전달을 위해 CaP-NP의 사용을 지지한다.
실시예 9: 본 발명의 생성물의 투여 후 심장 기능에 대한 잠재적인 부작용의 생체내 평가
실시예 1A)에서 제조된 CaP-NP가 심장 활동에 영향을 미치지 않고 성공적으로 심근에 도달하였는지의 여부를 평가하기 위해, 생체내 시험을 성체 랫트에 수행하였다. 문서(참조: Rossi et al. AJP 2008)에 기재된 바와 같이 마취된 동물은 그 자체(CTL) 또는 동물의 체중 kg당 3mg의 농도로 CaP-NP를 함유하는 생리식염수를 기관 경로로 투여했다. 4시간 처리 후, 동물은 전기생리학적 분석을 실시했다. 심외막 표면에 배치된 전극 장치에서 수득된 전위도는 도 15에 나타낸다. 도 14 및 이하 표 5에 나타낸 바와 같이, 전위도는 P, PQ, QRS, QT, ERP, RR의 관점에서 두 실험군 사이에 어떤 질적인 차이도 나타내지 않았다.
그 자체(CTL) 또는 CaP-NP를 함유하는 생리식염수로 처리된 동물의 전위도.
크로낙시
(Chronaxie)
(mA)		 P파 지속시간
(ms)		 PQ 간격
(ms)		 QT 간격
(ms)		 RR 간격
(ms)		 QRS 지속시간
(ms)
CTL 1.2±0.2 27.5±0.4 32.3±0.5 41.8±0.7 262.6±2.8 15.6±0.2
본 발명의 CaP-NP 0.9±0.2 29.6±0.5 33.0±0.5 37.8±0.6 285.2±2.5 14.9±0.1
따라서, 심장 ECG 파라미터의 비변경은 CaP-NP의 투여가 임의의 형태의 심장 흥분성의 조절을 유도하지 않고, 따라서 본 발명의 생성물에 대한 생리학적 심장 내성을 기대할 수 있고, 기술적 문제의 극복은 상이한 특성의 나노 입자의 사용에 의해 기대된다는 것을 확인했다.
최종적으로, CaP-NP의 심장으로의 실제 전달을 평가하기 위해, 랫트를 실시예 1B에 나타낸 바와 같이 제조된 CaP-NP-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트)(3mg/Kg)를 함유하는 생리식염수 용액의 단일 기관내 투여에 노출시켰다. 투여 4시간 후, 심장을 단리시키고, 2-광자 현미경법으로 분석했다. 놀랍게도, 본 발명의 생성물의 광범위한 분포가 심장 조직에서 관찰되었고, 특히 좌심실에서 풍부하여, 본 발명의 생성물이 실제로 기관 투여를 통해 심장에 도달하였음을 시사한다. 이 결과는 도 15에 도시된 바와 같이 심장 조직 형광 이미지로 표현된다. 또한, 다중 투여 접근법(1일 1회 3회 반복 및 격일)은 주로 좌심실에서 형광의 증가를 초래하여, 심장 조직과 관련된 심장 생체이용률이 용량 의존적 증가에 따른다는 것을 시사한다.
실시예 10: 심장 질환(당뇨병성 심근병증) 마우스 모델에서 본 발명의 생성물의 치료 가능성.
잠재적인 치료적 적용을 추가로 탐색하기 위해, CaP-NP를 실시예 3에서 microRNA에 대해 기재된 바와 같이 모방 펩티드(MP)의 포함에 의해 구현된 실시예 1A)에서와 같이 제조했다. MP는 양성 변력물질의 신규 부류에 속하는 짧은 9aa 펩티드(미국 제네스크립트(Genescript)에 의해 합성됨)이다. 비통상적인 메카니즘(즉, 칼슘 의존 수축기 수축으로 유도하는 트리거 요소인 전압 의존성 L-형 칼슘 채널의 세포 표면 밀도의 정상화 및 채널 게이팅 특성의 변경 없이)을 통해 작용시킴으로써, MP는 LTCC 밀도, 및 결과적으로 심장 수축력이 하향조절되는 심장 기능 장애(즉, 당뇨병성 심근병증, DM)의 상태에서 심장 박동의 힘을 회복시킨다. DM을 유도하기 위해, 마우스는 췌장의 인슐린 생산 베타 세포에 독성인 화합물 스트렙토조토신(STZ)을 주사했다. 흥미롭게도, MP-CaP-NP를 사용하는 DM 마우스의 10일간의 흡입 치료는 심장 기능을 완전히 회복시킨 반면, MP 단독 또는 스크램블-CaP-NP(CaP-NP-HA)를 투여한 경우 어떤 효과도 수득되지 않았다(도 16a). 또한, 동일 처리된 마우스로부터 단리된 심근 세포의 기능적 분석은 MP-CaP-NP가 칼슘 전류(Ica)를 회복했다는 것을 나타냈다(도 16b).

Claims (19)

  1. -41.0 mV 내지 -27.0 mV 범위의 전기영동 광 산란(Electrophoretic Light Scattering; ELS)에 의해 결정된 ζ-전위를 보유하는 음성 표면 전하를 갖고, 최대 1.76의 Weiner S. 및 Bar-Yosef O. (1990)에 따른 NP의 FT-IR 스펙트럼으로부터 계산된 분할 계수(SF)를 보유하는 하나 이상의 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)를 제조하는 방법으로서,
    a) 7 내지 10 범위의 pH를 갖고, 칼슘의 수용액, 인산염의 수용액 및 시트레이트 이온의 용액을 포함하는 혼합물을 20℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 30초 내지 10분 범위의 시간 동안 유지하는 단계로서, 상기 혼합물 중에 하나 이상의 치료/진단 화합물의 수용액이 또한 존재하는 단계;
    b) 단계 a)의 수득된 용액으로부터 미반응 이온을 제거하여 하나 이상의 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)의 현탁액을 수득하는 단계; 및
    c) 단계 b)의 현탁액으로부터 하나 이상의 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)를 회수하는 단계로서, 상기 하나 이상의 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)는 하나 이상의 치료/진단 화합물을 캡슐화하거나, 하나 이상의 치료/진단 화합물로 표면-작용화되거나, 또는 둘 다인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)로부터 회수된 하나 이상의 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)는 하나 이상의 치료/진단 화합물로 표면-작용화되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 a)의 혼합물 중의 칼슘의 수용액은 20 내지 200 mM 범위의 몰 농도를 보유하는 염화칼슘의 용액인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 a)의 혼합물 중의 인산염의 수용액은 20 내지 240 mM 범위의 몰 농도를 보유하는 Na2HPO4의 용액인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 a)의 온도는 35 내지 40℃ 범위인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 a)의 혼합물의 유지 시간은 5분인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 시트레이트 이온의 용액은 40 내지 800 mM 범위의 몰 농도를 보유하는 나트륨 시트레이트의 수용액인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 a)의 혼합물의 pH는 10인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 미반응 이온을 제거하는 단계 b)는 투석 막을 통해 수행되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 투석 막은 3500 달톤의 컷-오프(cut-off)를 보유하는 셀룰로스 막인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 투석 막으로 수행된 제거 단계 b)는 5 내지 24 시간 동안 일어나는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 인산칼슘의 나노 입자(CaP-NP)의 회수 단계 c)는 동결 건조에 의해 수행되는 방법.
  13. 하나 이상의 치료/진단 화합물을 캡슐화하거나, 하나 이상의 치료/진단 화합물로 표면-작용화되거나, 또는 둘 다인 CaP-NP로서,
    상기 CaP-NP는 제1항에 따른 방법에 의해 수득 가능하고,
    상기 NP는 전기영동 광 산란에 의해 결정된 -41.0 mV 내지 -27.0 mV 범위의 ζ-전위를 갖는 음성 표면 전하 및 Weiner S. 및 Bar-Yosef O. (1990)에 따른 상기 NP의 FT-IR 스펙트럼으로부터 계산된 최대 1.76의 분할 계수(SF)를 보유하거나, 또는
    단계 a)의 혼합물 중에 하나 이상의 치료/진단 화합물의 수용액이 또한 존재하고, NP는 하나 이상의 치료/진단 화합물을 캡슐화하고, 전기영동 광 산란에 의해 결정된 -41.0 mV 내지 -27.0 mV 범위의 ζ-전위를 보유하는 음성 표면 전하 및 150 내지 231 nm 범위의 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS)에 의해 결정된 Z-평균을 보유하는 CaP-NP.
  14. 제13항에 있어서, -41.0 mV 내지 -27.0 mV 범위의 ζ-전위를 보유하는 음성 표면 전하 및 최대 1.76의 분할 계수(SF)를 보유하는 경우, 하나 이상의 CaP-NP는 하나 이상의 표면-작용화된 치료/진단 화합물을 포함하는 CaP-NP.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 치료/진단 화합물은 핵산, 펩티드, 합성 화합물 및 진단 프로브로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CaP-NP.
  16. 심혈관 질환의 치료를 위한 제14항의 CaP-NP를 포함하는 의약품.
  17. 제16항에 있어서, 치료는 흡입 투여, 장관 투여, 비경구 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 설하 투여, 스프레이 투여, 직장 투여, 안내 투여, 국소 투여, 및 경피 투여 중에서 선택되는 투여 경로를 통해 수행되는 의약품.
  18. 삭제
  19. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11500044B2 (en) * 2018-02-19 2022-11-15 Bruker France Sas Nuclear spin hyperpolarization in a porous matrix
IT201800006753A1 (it) * 2018-06-28 2019-12-28 Calcio fosfato amorfo stabilizzato dopato con ioni fluoruro e un procedimento per produrlo
CN111870582B (zh) * 2020-06-28 2022-03-18 苏州天微肽生物医药科技有限公司 正硅酸乙酯-利拉鲁肽复合微球制剂及其制备方法和应用
IT202000021292A1 (it) 2020-09-09 2022-03-09 Consiglio Nazionale Ricerche Composizione in forma di polvere a base di microparticelle incorporanti nanoparticelle per la veicolazione di composti terapeutici/diagnostici

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050065A1 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Intraocular delivery compositions and methods
US20100086601A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Southwest Research Institute Modified Calcium Phosphate Nanoparticle Formation
WO2010085651A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 The Penn State Research Foundation In vivo photodynamic therapy of cancer via a near infrared agent encapsulated in calcium phosphate nanoparticles

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201424770A (zh) * 2003-02-14 2014-07-01 Childrens Hosp & Res Ct Oak 親脂藥物傳送媒介物及其使用方法
US7595322B2 (en) * 2003-03-27 2009-09-29 Cytokinetics, Inc. Heterocyclic sulfonamides as modulators of cardiac sarcomeres
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
US8318211B2 (en) * 2008-06-16 2012-11-27 Bind Biosciences, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles comprising vinca alkaloids and methods of making and using same
ES2557183B1 (es) * 2014-07-21 2016-11-03 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Procedimiento de obtención de nanopartículas de fosfato de calcio amorfo recubiertas de citrato y dopadas con flúor

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050065A1 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Intraocular delivery compositions and methods
US20100086601A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Southwest Research Institute Modified Calcium Phosphate Nanoparticle Formation
WO2010085651A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 The Penn State Research Foundation In vivo photodynamic therapy of cancer via a near infrared agent encapsulated in calcium phosphate nanoparticles

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