CN109843301A - 用于递送治疗剂的含金属硅酸盐的多孔硅材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于治疗剂的受控递送的组合物，以及其制备和用途。该组合物包含：可任选被氧化的多孔硅芯；位于多孔硅芯的表面的层，该层包含金属硅酸盐；以及治疗剂。该组合物可任选地还包含一种或多种靶向剂和/或细胞渗透剂，从而使颗粒能够靶向并进入接受治疗的受试者中的目的细胞或组织。

Description

用于递送治疗剂的含金属硅酸盐的多孔硅材料
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年4月14日提交的美国临时专利申请No.62/322,782的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
政府支持
本发明受到美国政府的支持，合同编号为R24EY022025-01，并且是在由国家卫生研究院授予的拨款编号NRSA 1F32CA177094-01、由国家科学基金会授予的拨款编号DMR1210417以及由国防高级研究计划署授予的协作协定编号HR0011-13-2-0017下做出的。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术
人们对开发能够提供治疗剂的持续且可靠的释放的药物递送系统非常感兴趣。这种系统被设计为将治疗剂递送至需要治疗的受试者的任何组织。根据目标组织的不同，可通过经口、粘膜、局部、注射或吸入途径施用药物递送载体。组织内来自药物递送载体的药剂释放应当足够快，从而在目标组织内实现药剂的治疗有效浓度，同时，释放不应过高以至于药剂在组织内达到毒性水平或者因降解代谢而损失。
在不稳定的治疗剂的情况中，由于稳定性问题，持续且可靠的递送更为困难。此外，治疗剂向特定组织的靶向递送是有利的，其可提高受损组织处的治疗有效性，并使未受损组织处的副作用降到最低。在药物递送系统的设计中，给定的目标组织的独特特性和环境也可提供挑战和机遇。
示例性的药物递送载体包括脂质体、有机微球、药物-聚合物缀合物、无机载体等。在无机载体中，无机纳米颗粒最近因其独特的物理化学性能(尤其是其可调节的尺寸、形状、表面反应性和溶解性)，从而成为用于药物递送系统的引人注目的候选材料。可用作药物递送载体的纳米颗粒(包括无机纳米颗粒)的实例包括磷酸钙纳米颗粒、碳纳米管、金纳米颗粒、氧化石墨烯纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、中孔二氧化硅纳米颗粒等。
例如，Xue等人，(2009)Acta Biomater.5:1686报道了将中孔硅酸钙用于蛋白质药剂的受控吸附和释放。在该研究中，由液相形成硅酸钙析出物。用酸处理析出物以在颗粒表面上产生中孔结构，由此提高颗粒的表面积，从而提高其生物活性，并增强蛋白质与表面间的相互作用。
Salinas等人(2001)J.Sol-Gel Sci.Techn.21:13通过溶胶-凝胶法制造了凝胶玻璃，包括硅酸钙凝胶玻璃。已通过使用动态检验模型在模拟体液中验证了这些材料的性质。
Wu等人(2010)Adv.Mater.22:749通过利用无表面活性剂的声化学法由液相合成出纳米结构的中孔硅酸钙水合物球粒。检验了这些材料的物理化学性能，包括作为药物载体的能力。
Li等人(2007)J.Biomed.Mater.Res.B.83B:431报道了通过使用模板路径由溶液制备中孔无定形硅酸盐。发现与常规的无定形硅酸钙相比，这些材料在体外模型中显示出高的骨形成活性。
Wu等人(2012)J.Mater.Chem.22:16801描述了将具有生物活性的中孔硅酸钙纳米颗粒用于填充牙齿的牙根尖端。该研究中所用的纳米颗粒是通过使用阳离子洗涤剂模板由溶液的沉淀而合成的。
Kokubo等人(2003)Biomaterials 24:2161评论了用作骨替代物的具有更高的机械性能的无机生物活性材料的发展。这种材料包括玻璃陶瓷，在模拟体液的存在下，其可在磷灰石的沉积过程中在其表面上形成无定形硅酸钙中间体。
尽管有上述报道，但是仍然需要研发用于治疗剂的递送、尤其是治疗剂向患病组织的靶向递送的改进的组合物、方法和系统。
发明内容
在一个方面中，本公开通过提供用于递送治疗剂的组合物从而解决了这些需求和其他需求，该组合物包含：颗粒，其包含多孔硅芯；位于芯的表面上的层，该层包含金属硅酸盐；以及治疗剂。
在一些实施方案中，通过用包含治疗剂和金属盐的水溶液处理多孔硅前体颗粒，从而在颗粒表面上形成层，更具体而言，该水溶液中金属盐的浓度为至少0.1摩尔。
在一些实施方案中，位于颗粒表面上的层包含二价金属硅酸盐，如硅酸钙。
在一些实施方案中，多孔硅芯的直径为约1nm至约1cm，更具体而言，位于多孔硅芯的表面上的层的厚度为芯的直径的1％至90％。
在实施方案中，所述颗粒为可发射500nm至1000nm范围内的光的光致发光颗粒。
在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的结晶硅材料，如经电化学蚀刻的结晶硅材料或经化学染色蚀刻的结晶硅材料。在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的微孔硅材料，如包含平均孔径为至多约1nm的多个孔的经蚀刻的微孔硅材料。在其他实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的中孔硅材料，如包含平均孔径为约1nm至约50nm的多个孔的经蚀刻的中孔硅材料。仍在其他实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的大孔硅材料，如包含平均孔径为约50nm至约1000nm的多个孔的经蚀刻的大孔硅材料。
在一些实施方案中，治疗剂为小分子药剂、维他命、显影剂、蛋白质、肽、核酸、低聚核苷酸、适体或其混合物，如带负电的治疗剂，例如低聚核苷酸。在一些实施方案中，多孔硅颗粒包含靶向剂、细胞渗透剂，或包含靶向剂和细胞渗透剂这两者。在一些实施方案中，多孔硅芯包含被氧化的多孔硅材料。
在另一方面中，本公开提供了药物组合物，其包含任何的本发明组合物以及药学上可接受的载体。
在又一方面中，本公开提供了制备用于递送治疗剂的颗粒的方法，包括以下步骤：
提供多孔硅前体颗粒；
用包含治疗剂和金属盐的水溶液处理多孔硅前体颗粒。
根据另其他方面，提供了治疗方法，包括给需要治疗的受试者施用本公开的组合物。
附图简要说明
图1为用于制备负载有siRNA的硅酸钙覆盖的多孔硅纳米颗粒(Ca-pSiNP-siRNA)的示例性方法的示意图。
图2A至2E为pSiNP(图2A)、Ca-pSiNP(图2B)和Ca-pSiNP-siRNA(图2C)制剂的透射电子显微镜(TEM)图像。比例尺为200nm。图2D示出了pSiNP和Ca-pSiNP制剂的低温氮吸附/解吸等温线。图2E示出了在pSiNP与3M或4M的CaCl2水溶液反应过程中所获得的光致发光谱(λex：365nm)，该反应用于制备Ca-pSiNP制剂。由于典型的量子限域效应，随着多孔硅芯变薄，发射光谱蓝移。随着反应的进行，观察到光致发光强度的急剧增加，这证实了电钝化表面层的生长以及非辐射复合中心的抑制。
图3示出了在用针对PPIB基因的siRNA(siPPIB)、负载有siPPIB的胺化多孔Si纳米颗粒(pSiNP)(pSiNP-siPPIB)、双重肽纳米复合物形式的pSiNP-siPPIB构建体(其制备为具有硅酸钙外壳并且外壳上同时包含细胞靶向肽和细胞渗透性肽)(Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC)、外壳上仅包含细胞渗透性肽的pSiNP-siPPIB-硅酸钙壳构建体(Ca-pSiNP-siPPIB-mTP)、外壳上仅包含细胞靶向肽的pSiNP-siPPIB-硅酸钙壳构建体(Ca-pSiNP-siPPIB-RVG)、以及包含针对荧光素酶阴性对照siRNA序列、并且外壳上同时包含细胞靶向肽和细胞渗透性肽的pSi纳米颗粒-硅酸钙壳构建体(Ca-pSiNP-siLuc-DPNC)处理神经-2a细胞之后，在该神经-2a细胞中相对PPIB基因表达的沉默。“7天”的标记表示纳米颗粒构建体在4℃的乙醇中储存7天，然后进行试验。如上文所述，细胞渗透性肽为十四烷酰化转运蛋白，细胞靶向肽为来自狂犬病毒糖蛋白肽(RVG)的域。利用Student’s t检验进行统计分析(*p<0.01，**p<0.03)。
图4A和4B示出了在静脉内注射(1)作为对照物的盐水、(2)Ca-pSiNP-siRNA-PEG和(3)Ca-pSiNP-siRNA-DPNC之后，收集器官的离体荧光图像。所有siRNA构建体均包含共价连接的dy677荧光团。图4A：通过使用红外成像系统Pearl Trilogy(Li-Cor)获得的受损脑部的荧光图像。该图像中的绿色通道对应于来自dy677的700nm发射，并且将脑组织的明场图像与700nm发射合并。图4B：利用IVIS(xenogen)成像系统在Cy5.5通道(λex/em:675/694nm)中拍摄的完整的主要器官的荧光图像。
图5A和5B示出了pSiNP(图5A)和Ca-pSiNP(图5B)的扫描电子显微镜图像和元素(EDX)数据。
图6A示出了，如上所述，pSiNP(位于下方的虚线)和Ca-pSiNP(位于上方的实线)的粉末X射线衍射谱。用密勒指数h k l标注Si纳米颗粒的衍射图案中的峰，其示出了产生衍射峰的晶体Si晶格晶面组。图6B。pSiNP(位于下方的虚线)和Ca-pSiNP(位于上方的实线)的拉曼光谱。图6C。pSiNP(位于下方的虚线)和Ca-pSiNP(位于上方的实线)的漫反射FTIR谱。为清楚起见，谱图沿y轴偏移。
图7A示出了在pH 9缓冲液(三角形虚线)和3M或4M的pH9CaCl2溶液(圆形实线)中，作为时间函数测量的pSiNP的UV-Vis吸光度强度(λ＝405nm)。吸光度损失归因于纳米颗粒中单质Si核的降解；硅强烈吸收405nm的光，而SiO2或硅酸根离子在该波长下是透明的。图7B。在37℃的PBS缓冲液中，作为时间函数的siRNA释放质量的累积百分比。首先通过使用2-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(APDMES)将胺连接至pSiNP的孔壁，然后通过暴露于溶液中2小时从而负载siRNA，由此制备pSiNP-NH2-siRNA制剂。
图8示出了作为吸光度(365nm)的积分光致发光强度，其用于计算Ca-pSiNP制剂相对于罗丹明6G标准物质的量子产率。积分光致发光表示在500nm至980nm之间积分的光致发光强度-波长曲线。使用QE-Pro(Ocean Optics)分光计测量光致发光强度，在λex＝365nm激发并使用460nm长通滤光片。
图9示出了通过钙黄绿素AM活/死试验对Ca-pSiNP构建体的细胞毒性进行定量。在96孔板中，神经2a细胞与Ca-pSiNP一起进行培育，一式三份。48小时后，用试验溶液处理各孔，并通过相对于标准物质的测量荧光强度从而对存活率进行定量。
图10示意性地示出了PEG修饰和双肽在Ca-pSiNP-siRNA上缀合的步骤。将偶联剂2-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(APDMES)连接至(硅酸钙和氧化硅)纳米颗粒的表面，从而产生悬挂的伯胺基团(Ca-pSiNP-siRNA-NH2)。然后使用马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺羧甲基酯(MAL-PEG-SCM)类物质，将官能性聚乙二醇(PEG)连接体连接至Ca-pSiNP-siRNA-NH2纳米颗粒上的伯胺。琥珀酰亚胺羧甲基酯与伯胺形成酰胺键。PEG链的末端包含第二官能基团马来酰亚胺。马来酰亚胺与半胱氨酸中的硫醇形成共价键，从而能够连接神经元靶向肽(狂犬病毒糖蛋白)和细胞渗透性肽(十四烷酰化转运蛋白)。
图11A示出了分散于乙醇中的纳米颗粒(如上文所述，pSiNP、Ca-pSiNP、Ca-pSiNP-NH2、Ca-pSiNP-siPPIB和Ca-pSiNP-siPPIB-NH2)的ζ电势。图11B。通过动态光散射(DLS)测量的pSiNP和Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC的尺寸分布。
图12示出了纳米颗粒制剂(由上至下)Ca-pSiNP-PEG、Ca-pSiNP-mTP、Ca-pSiNP-RVG和Ca-pSiNP-DPNC以及肽(mTP和FAM-RVG)的ATR-FTIR光谱。制剂的缩写如本文中所述。为清楚起见，光谱沿y轴偏移。
图13A和13B示出了在37℃下经过(A)Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC和(B)Ca-pSiNP-siPPIB-RVG处理2小时的神经2a细胞的共焦显微图像。在经Ca-pSiNP-siPPIB-RVG处理(图13B)的细胞表面和经Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理(图13A)的细胞内观察到硅纳米颗粒的固有发光(原图中的红色)，在这两幅图像的细胞核中均观察到了DAPI核染色(原图中的蓝色)，在经Ca-pSiNP-siPPIB-RVG处理(图13B)的细胞表面上，来自RVG域的FAM标记的信号(原图中的绿色)更多，而在经Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理(图13A)的细胞中，细胞内硅和FAM-RVG信号的重叠(原图中的黄色，由红色和绿色的重叠所致)更多。标尺为20μm。
图14A至14D示出了作为对照组的未经颗粒处理(图14A)、经Ca-pSiNP-siPPIB-RVG处理(图14B)、经Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理(图14C)以及经负载有Cy3标记的siRNA的Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理(图14D)的神经2a细胞的FACS分析。绘制图下方的比例表示经FAM-RVG、Cy3标记的siRNA或FAM-RVG和Cy3标记的siRNA的重叠转染的细胞的定量比例。利用Student’s t检验进行统计分析(*p<0.04)。
图15示出了用于将siRNA靶向递送至体内受损脑部的示例性试验步骤。在受损6小时后，注射Ca-pSiNP-siRNA-PEG或Ca-pSiNP-siRNA-DPNC。用dy677荧光标记物来标记各制剂中的siRNA。在循环1小时后，将小鼠处死，进行灌注，收集器官并成像。
图16示出了在4M的氯化钙、4M的氯化镁或pH 9缓冲液中超声24小时的刚刚经蚀刻的多孔硅微粒(pSiMPs)的X射线衍射谱。
图17A至17C示出了(A)使用pH 9缓冲液、4M的CaCl2和4M的MgCl2溶液的罗丹明B(RhB)和联吡啶钌(Ru(bpy))的负载效率。在pH 9缓冲液、CaCl2和MgCl2溶液中负载后，由pSiMPs释放的(B)罗丹明B和(C)Ru(bpy)的释放曲线。
图18A至18B示出了负载有(A)氯霉素或(B)万古霉素的Ca-pSiNP的负载容量、药物释放曲线和光致发光降低曲线。
具体实施方式
包含多孔硅颗粒的组合物
在一个方面中，本公开提供了可用于治疗剂的递送的组合物。这种组合物尤其可用于需要治疗剂的受控释放的疾病或其他病症的治疗中。例如，通过活性治疗剂在长时间内的稳定释放，可以有利地治疗许多疾病或病症。与可通过注射、口服制剂或其他典型的递送系统提供的效果相比，这种治疗在系统中提供了更为恒定的治疗剂浓度，从而在使治疗活性最大化的同时，将由药剂造成的可能的毒性作用降至最低。受控递送系统还通过将药剂的稳态浓度维持在所期望的较窄的治疗窗口内，从而有利地降低了给定治疗方案所需的注射频率，并且减少了昂贵治疗剂的浪费。该组合物还可用于治疗分离的细胞或组织，其中组合物可提供治疗剂的细胞内或组织内(intratissue)递送，或者在(例如)治疗过程中提供更高的药剂稳定性。
多孔硅(pSi)是指纳米结构的含硅材料，其通常通过蚀刻结晶硅晶圆或其他含硅材料而形成。例如，参见Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.60:1266，其全部内容通过引用并入本文。本文所用的含硅材料优选包括单质硅(包括结晶硅和多晶硅)，但是也可包括聚硅氧烷、硅烷、有机硅、硅氧烷或者它们的组合。多孔硅应视为包括由蚀刻工艺直接获得的纳米结构材料，以及通过对经过蚀刻的多孔硅进行进一步的化学修饰而得到的这些材料的任何衍生物，如被氧化的硅或者共价修饰的硅。
如上面所提及的，通常通过含硅材料的电化学蚀刻或化学染色蚀刻来制备多孔硅。例如在电化学蚀刻的情况中，通过控制电流密度、硅晶圆中掺杂剂的浓度、晶圆的结晶取向以及电解质浓度来控制蚀刻工艺，从而可根据需要调节孔的尺寸和形态。这种调节能够得到(例如)微孔硅、中孔硅或大孔硅。
最初开发多孔硅是在发现其光致发光性质后为了用于光电子器件中。Canham(1990)Appl.Phys.Lett.57:1046。然而，近年来，pSi作为药物的受控释放的载体受到了人们的关注。Salonen等人(2008)J.Pharm.Sci.97:632；Chhablani等人(2013)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.54:1268；Kovalainen等人(2012)Pharm.Res.29:837。常规的硅类组合物(例如，中孔二氧化硅)通过液相反应获得，例如，通过溶胶-凝胶或沉淀路线获得，对于所得产物的微结构的控制相对较少。与之相反，通过调节pSi微结构的合成中所用的电化学蚀刻参数，可有效控制pSi微结构。Martinez等人(2013)Biomaterials 34:8469；Hou等人(2014)J.Control.Release 178:46。已经将多孔硅颗粒(包括在高温下于空气中氧化的多孔硅颗粒)用于向眼睛递送治疗剂。例如，参见PCT国际公开No.WO 2006/050221 A2和WO 2009/009563 A2，其全部内容为了各种目的通过引用并入本文。在兔子的玻璃体内注射这种颗粒时，颗粒显示出在较长时间内以低毒性递送药剂。
pSi的另一有用的特征是其易于修改的表面化学。例如，可利用热氧化和热氢化硅烷化等方法，根据药物有效负载的性质使药物的负载和释放最大化。Salonen等人(2008)J.Pharm.Sci.97:632；Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.60:1266。已经观察到，某些化学机制能够减缓pSi基质的降解或者增强溶解性较差的活性药物成分(API)的释放。Salonen等人(2005)J.Control.Release 108:362；Wang等人(2010)Mol.Pharm.7:227。可通过各种方式控制pSi颗粒的表面官能化，例如，如PCT国际公开No.WO 2014/130998 Al(其全部内容通过引用并入本文)中所述，通过对内部孔壁和孔开口进行不同的修饰，从而控制表面官能化。
已知在中性pH下(例如，在正常体液中)，多孔硅通过单质Si的氧化和所得硅酸和最终的原硅酸盐的溶解的组合作用从而缓慢溶解于水溶液中。通过控制该过程的速度和程度，例如通过修饰pSi纳米颗粒的表面，可将颗粒的毒性大幅降至最低水平。例如，经玻璃体内注射的pSi纳米颗粒显示为不具有毒性，并且安全地在兔子的玻璃体内停留数月，然后完全降解并从眼睛中消失。Cheng等人(2008)Br.J.Ophthalmol.92:705；Nieto等人(2013)Exp.Eye Res.116:161。另外参见美国专利公开No.2010/0196435。
如下文中将详细描述的，本公开的颗粒和膜包括多孔硅芯，其在本文中也可被称为多孔硅“骨架”。在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的结晶硅材料，更具体而言，包含经电化学蚀刻的结晶硅材料或经化学染色蚀刻的结晶硅材料。在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的微孔硅材料，例如，包含平均孔径为至多约1nm的多个孔的材料。在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的中孔硅材料，如包含平均孔径为约1nm至约50nm的多个孔的材料。在一些实施方案中，多孔硅芯包含经蚀刻的大孔硅材料，如包含平均孔径为约50nm至约1000nm或甚至更大的多个孔的材料。
在一些实施方案中，本发明的颗粒和膜的多孔硅芯的开孔孔隙率为材料总体积的约5％至约95％。在更具体的实施方案中，多孔硅的开孔孔隙率为材料总体积的约20％至80％或者约40％至约70％。在一些实施方案中，本发明组合物的多孔硅的平均孔径为约0.1nm至约1000nm、约0.1nm至约1nm、约0.1nm至约50nm、约1nm至约50nm、约1nm至约1000nm或约50nm至约1000nm。在一些实施方案中，平均孔径为至少约0.1nm、至少约0.5nm、至少约1nm、至少约50nm或甚至更大。在一些实施方案中，平均孔径为至多约1000nm、至多约100nm、至多约50nm、至多约1nm或甚至更小。
本发明组合物的多孔硅芯可为膜或颗粒的形式。具体而言，本发明的颗粒和膜的厚度范围优选为约5nm至约1000微米、约10nm至约100微米、或约100nm至约30微米。因此，颗粒和膜的厚度可以为至少约5nm、至少约10nm、至少约100nm或甚至更厚。类似地，颗粒和膜的厚度可以为至多约1mm、至多约100微米、至多约30微米或甚至更薄。在多孔硅芯为颗粒形式的实施方案中，多孔硅芯的平均直径范围优选为约1nm至约1cm、约3nm至约1000微米、约10nm至约300微米、约10nm至约100微米、或约1微米至约50微米。在一些实施方案中，平均粒径为至少约1nm、至少约3nm、至少约10nm、至少约100nm、至少约1微米或甚至更大。在一些实施方案中，平均粒径为至多约1cm、至多约1000微米、至多约300微米、至多约100微米、至多约50微米或甚至更小。
在一些实施方案中，本发明组合物的多孔硅芯至少部分地被氧化。通过使本发明的多孔硅组合物中的单质硅氧化为二氧化硅，可提高组合物的稳定性，降低组合物的毒性，并且/或者提供更好的溶解性。在下文中的制备方法中详细提供了本发明组合物的多孔硅的示例性氧化方法。任何这些方法中的被氧化的多孔硅材料(无论是完全被氧化还是部分被氧化)均可用于本发明组合物中。在一些情况中，有利的是，通过用硝酸根、亚硝酸根、葡萄糖酸根或其他适当的阴离子置换下述制备方法中所使用的金属盐的氯离子，从而氧化多孔硅芯。由于硝酸根离子和亚硝酸根离子的氧化性质，金属硝酸盐或金属亚硝酸盐与金属氯化物相比能够更快速地氧化多孔硅。Fry等人(2014)Chem.Mater.26:2758。
应当理解的是，术语“多孔氧化硅”是指包含具有通用化学计量式SiOx的硅和氧的物质，其中x可小至0.01，并且可大至2，“多孔硅”是指由单质硅(结晶态或无定形态)构成、并且表面包含氢、氧或含碳成分的物质。此外，术语“多孔硅”或“多孔氧化硅”是指包含微孔、中孔或大孔，或者任意两种或全部三种类型的孔的组合的材料。还应当理解的是，多孔材料的表面(包括内部孔壁的表面)可包含氢、氧或含碳成分。
在(例如)美国专利公开No.2005/0042764、2005/0009374、2007/0148695、2007/0051815、2009/0208556和2010/0196435(其全部内容以引用方式并入本文)中详细描述了包含多孔硅的示例性组合物以及这些组合物的制备方法。
在一些实施方案中，本公开的多孔硅芯被共价修饰。在具体实施方案中，共价修饰位于多孔硅芯的表面。通过表面修饰(如烷基化，尤其是热氢化硅烷化)进行修饰的多孔硅的实例在Cheng等人(2008)Br.J.Ophthalmol.92:705和PCT国际公开No.WO2014/130998 Al中有所描述。发现这种材料在用作治疗剂的递送系统时，显示出了良好的生物相容性。
如上所述，已知多孔硅在中性pH下缓慢溶解于水溶液中。多孔硅的降解机制涉及硅骨架氧化形成氧化硅(eq.1)，以及所得氧化物相溶解形成水溶性原硅酸(Si(OH)4)或其同类物(eq.2)。参见Sailor,Porous silicon in practice:preparation,characterization and applications(实际应用中的多孔硅：制备、表征及应用)(JohnWiley&Sons,2012)。
已有利地发现，硅酸(其通过溶解多孔硅或多孔氧化硅而产生)与高浓度金属盐的反应会形成不溶性金属盐，该不溶性金属盐包含阴离子原硅酸根(SiO4 4-)、偏硅酸根(SiO3 2-)或它们的同类物，这里称为“硅酸盐”。不期望受到理论的约束，认为不溶性硅酸盐起到了保护壳的作用，其阻碍了多孔硅或多孔氧化硅骨架的进一步溶解。另外，不溶性盐的形成起到了堵塞材料的孔开口的作用，从而能够捕获此前负载于孔中的物质。参见图1，其示出了siRNA治疗剂。尽管此前已证实通过使多孔硅暴露于包含较低浓度的水性钙和磷酸盐会形成羟基磷灰石表面层(Li等人(1998)J.Am.Chem.Soc.120:11706)，但是尚未证实在高浓度金属盐的存在下会形成不溶性硅酸盐，也未证实这些反应在捕获大量的有效负载分子方面的惊人效用。虽然由水泥的化学反应已知，氧化钙与氧化硅反应以形成硅酸钙(Minet等人(2006)J.Mater.Chem.16:1379)，并且混合均质前体(如水性硅酸盐溶液和钙离子溶液)会产生析出物和纳米颗粒(Wu等人(2012)J.Mater.Chem.22:16801，Wu等人(2010)Adv.Mater.22:749，Li等人(2007)J.Biomed.Mater.Res.B.83B:431，Saravanapavan等人(2003)J.Noncrystalline Solids 318:1，Kokubo等人(2003)Biomaterials 24:2161，以及Salinas等人(2001)J.Sol-Gel Sci.Techn.21:13)，但是此前尚未证实水性金属盐溶液与纳米结构的多孔硅反应会产生核/壳纳米结构。此外，本发明组合物的核/壳结构显示出了区别于通过上述匀化路径制得的材料的独特性质，并且本文所述的制备方法能够有利地进行治疗剂的负载和随后的缓慢释放。此外，已证实了多孔硅的芯-壳结构能够增强来自发光硅域(luminescent silicon domain)的光致发光的强度和持久性(Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688)，并且本文中证实了这些新型的壳提供了与多孔硅的固有光致发光性质类似的改善。
因此，本公开的多孔硅颗粒和膜优选包括位于其多孔硅芯的表面上的包含金属硅酸盐的层。如上所述，在一些情况中，也可将该层称为“壳”。在一些实施方案中，金属硅酸盐为二价、三价或四价金属硅酸盐。更具体而言，金属硅酸盐为二价硅酸盐。例如，二价金属硅酸盐可为硅酸钙、硅酸镁、硅酸锰、硅酸铜、硅酸锌、硅酸镍、硅酸铂或硅酸钡。在具体实施方案中，二价金属硅酸盐为硅酸钙或硅酸镁。甚至更具体而言，二价金属硅酸盐为硅酸钙。在其他具体实施方案中，金属硅酸盐为三价或四价金属硅酸盐。可用于本公开的多孔硅颗粒和膜中的示例性的三价或四价金属硅酸盐包括硅酸锆、硅酸钛和硅酸铋。在一些实施方案中，位于多孔硅芯的表面上的层包含金属硅酸盐的组合物，该金属硅酸盐组合物包含以任意组合方式的任意上面列举的示例性金属硅酸盐。
虽然易于构造多孔硅或多孔氧化硅纳米结构以容纳治疗剂、诊断剂及或其他有益物质(也称为“有效负载”)(Salonen等人(2008)J.Pharm.Sci.97:632；Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.60:1266)，但是在施用之前或之后这些有效负载的提前释放对于预期目的而言是不利的。此外，在涉及到持续药物递送(Salonen等人(2008)J.Pharm.Sci.97:632；Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliv.Rev.60:1266)、体内或体外成像(Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688；Gu等人(2013)Nat.Commun.4:2326；Park等人(2009)Nat.Mater.8:331)和生物传感器(Jane等人(2009)Trends Biotechnol.27:230)的应用中，多孔硅或多孔氧化硅在水性条件下的降解会成为严重问题，这使得合成了各种“芯-壳”类型的结构体，其中硅或氧化硅的内芯(位于多孔骨架中)被更为稳定的氧化硅(Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688)、氧化钛(Betty等人(2011)Prog.Photovoltaics 19:266；Li等人(2014)Biosens.Bioelectron.55:372)、碳(Tsang等人(2012)ACS Nano 6:10546)或其他动力学稳定的物质(Buriak(2002)Chem.Rev.102:1271)的壳包围。在适当的条件下，壳的形成能够捕获先前负载于孔内的物质，从而提供制剂的缓慢释放(Fry等人(2014)Chem.Mater.26:2758)。在于2015年7月9日提交的美国临时专利申请No.62/190,705和PCT国际公开No.WO2017/008059 Al(其全部内容通过引用并入本文中)中描述了在包含芯-壳结构的融合脂质体包覆的多孔硅纳米颗粒中，货物分子通过物理方式被捕获于含多孔硅的芯材料中。
本发明组合物中存在金属离子(例如钙离子)时，对于组织是更为有益的，这是因为离子能够隔离可能存在于制剂中的残余氟化物离子。目标组合物中所用的多孔硅和多孔氧化硅材料通常是通过在含氟化物的电解质中的电化学蚀刻制备的，并且该工艺会在多孔基质中留下痕量的氟化物(Koynov等人(2011)Adv.Eng.Mater.13:B225)。氟化物对于组织(尤其是敏感组织，如眼睛)具有非常高的毒性。然而，由于氟化钙和其他金属氟化物在水性溶液中的溶度积极低，因此在芯-壳合成中使用高浓度的金属离子可起到与制剂中的残余氟化物反应的额外益处，从而消除氟化物及其有害的体内作用。
在一些实施方案中，位于多孔硅芯的表面上的层的厚度为芯的平均直径或厚度的1％至90％、5％至60％或10％至40％。
在优选实施方案中，位于多孔硅芯的表面上的层中的金属硅酸盐化学连接至多孔硅芯。
本公开的组合物还包含治疗剂，其优选包含于多孔硅颗粒或膜的蚀刻孔内。应当理解到，术语治疗剂应当广义地理解为包括能够对需要治疗的受试者、组织或细胞具有治疗效果的任何药剂。治疗剂包括：生物聚合物，如核酸、碳水化合物和蛋白质；以及脂质体和任何其他天然存在的分子，包括初级和次级代谢物。治疗剂还可包括提供治疗活性的上述分子的任何衍生物或其他经修饰的形式。事实上，治疗剂的结构可为部分或全部非天然的。治疗剂可由天然原料纯化，可通过使用半合成方法制备，或者可完全通过合成方式制备。治疗剂可以药学上可接受的盐的形式提供，或者可与药学上可接受的赋形剂或其他具有非治疗作用的药剂配制在一起。在一些情况中，将多于一种治疗剂组合在本公开的单个组合物中、或者甚至组合在单个多孔硅颗粒或膜内是有利的。
可有效包含于本发明组合物中的治疗剂包括(但不限于)ACE抑制剂、肌动蛋白抑制剂、镇痛药、麻醉剂、抗高血压药、抗聚合酶(antipolymerase)、抗分泌剂、抗生素、抗癌症物质、抗胆碱能剂、抗凝剂、抗惊厥剂、抗抑郁药、止吐药、抗真菌剂、抗青光眼溶质(anti-glaucoma solute)、抗组胺剂、抗高血压药剂、抗炎药(如NSAID)、抗代谢物、抗有丝分裂物、抗氧化剂、抗寄生剂、抗帕金森病药、抗增殖剂(包括抗血管生成剂)、抗原生动物溶质、抗精神病物质、解热药、抗菌剂、抗痉挛药、抗病毒剂、钙通道阻断剂、细胞响应改进剂、螯合剂、化疗剂、多巴胺激动剂、胞外基质成分、纤维蛋白溶解药剂、自由基清除剂、激素、激素拮抗剂、安眠药、免疫抑制剂、免疫毒素、表面糖蛋白受体抑制剂、微管抑制剂、缩瞳剂、肌肉收缩药、肌肉松弛药、神经毒素、神经递质、阿片类物质、前列腺素、重构抑制剂(remodelinginhibitor)、他汀类药物、类固醇、溶血栓药、安定药、血管舒张药和/或血管痉挛抑制剂。
在一些实施方案中，治疗剂为核酸或核酸类似物，例如(但不限于)脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，例如小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)、小发夹RNA(shRNA)、修饰型mRNA(mmRNA)或它们的类似物或组合物。在一些实施方案中，治疗剂为核酸类似物、例如(但不限于)反义核酸、低聚核酸或低聚核苷酸、肽核酸(PNA)、假互补PNA(pcPNA)、锁定核酸(LNA)或其类似物或组合物。在优选实施方案中，治疗剂为siRNA。
本领域技术人员将理解到，从带负电的治疗剂(例如核酸药剂)与位于本发明pSi纳米颗粒或纳米膜表面上的金属硅酸盐层的制剂的角度来看，对于本发明组合物中的这些药剂的递送是有利的。不期望受到理论的约束，组合物中的金属成分可能会中和核酸治疗剂成分的阴离子电荷，从而改善本发明材料的负载容量。
在一些实施方案中，治疗剂为蛋白质或肽，例如抗体或生物蛋白、拟肽、适体或它们的变体。
在一些实施方案中，治疗剂为抗生素，如脂肽(例如，达托霉素)、甘氨酰四环素(例如，替加环素)、唑烷酮(例如，利奈唑胺晶)、闰年霉素(例如，非达霉素)、青霉素、头孢菌素、多粘菌素、利福霉素、喹诺酮、磺胺、大环内酯、林可酰胺、四环素、糖肽(例如，万古霉素)等。
在一些实施方案中，治疗剂为小分子疏水性治疗剂。许多治疗剂(尤其是疏水性治疗剂)能够以非结晶形式(即，无定形形式)更为有效地递送至生物系统。事实上，使疏水性治疗剂成为无定形形式的制剂被视为提高溶解性从而提高生物利用度的有前景的策略。然而，由于活性药剂的无定形形式的高内部能量，纯无定形药剂常常会快速再结晶至其低能量的结晶态，该结晶态通常具有较低的溶解度。因此希望配置这样疏水性治疗剂，使得无定形状态稳定。
不期望受到理论的约束，认为本发明的多孔硅颗粒和膜(尤其是孔表面经过修饰的多孔硅材料)的孔表面可通过治疗剂和孔表面之间的强烈的分子相互作用，从而使无定形形式的治疗剂稳定。这种相互作用可防止药剂重结晶，从而能够确保药剂的有效释放和更高的生物利用度。
因此，可有效包含于本发明的颗粒和膜中的小分子治疗剂的实例包括疏水性治疗剂。在具体实施方案中，疏水性药剂为雷帕霉素、紫杉酚、柔红菌素、阿霉素或任何这些药剂的类似物。在优选实施方案中，药剂为雷帕霉素(也称为西罗莫司)或雷帕霉素类似物。雷帕霉素类似物的非限制性实例包括(例如)依维莫司、佐他莫司、比奥莫司A9、坦罗莫司、梅利霉素(myolimus)、络利莫斯(novolimus)、他克莫司或吡美莫司。
本发明的组合物中可有效包含雷帕霉素的共价修饰形式，对其没有限制。例如，美国专利No.4,316,885和5,118,678报道了雷帕霉素的氨基甲酸酯。美国专利No.4,650,803报道了雷帕霉素的水溶性前药。美国专利No.5,100,883报道了雷帕霉素的氟化酯。美国专利No.5,118,677报道了雷帕霉素的酰胺酯。美国专利No.5,130,307报道了雷帕霉素的氨基酯。美国专利No.5,346,893报道了雷帕霉素的磺酸盐和氨基磺酸盐。美国专利No.5,194,447报道了雷帕霉素的磺酰基氨基甲酸酯。美国专利No.5,446,048报道了雷帕霉素肟。美国专利No.6,680,330报道了雷帕霉素二醛化合物。美国专利No.6,677,357报道了雷帕霉素29-烯醇。美国专利No.6,440,990报道了O-烷基化雷帕霉素衍生物。美国专利No.5,955,457报道了水溶性雷帕霉素酯。美国专利No.5,922,730报道了烷基化雷帕霉素衍生物。美国专利No.5,637,590报道了雷帕霉素脒基氨基甲酸酯。美国专利No.5,504,091报道了雷帕霉素的生物素酯。美国专利No.5,567,709报道了雷帕霉素的氨基甲酸酯。美国专利No.5,362,718报道了雷帕霉素的羟基酯。这些雷帕霉素衍生物等可包含于本发明的组合物中。
本公开的组合物中治疗剂的含量取决于所期望的释放曲线、生物效应所需的治疗剂浓度、以及治疗时治疗剂的释放时间长度。除了要考虑通过注射器针头或其他适当的递送设备进行注射所能够接受的溶液或分散液粘度之外，包含在本发明组合物中的治疗剂的量没有上限。包含在本发明组合物中的治疗剂的下限取决于治疗剂的活性以及治疗所需的时间长度。具体而言，在本发明的一个实施方案中，组合物配制为提供治疗剂的一个月的释放。在这种实施方案中，存在的治疗剂优选为组合物的约0.1重量％至约50重量％，优选约2重量％至约25重量％。或者，在本公开的另一实施方案中，组合物配制为提供治疗剂的三个月的释放。在这种实施方案中，存在的治疗剂优选为组合物的约0.1重量％至约50重量％，优选约2重量％至约25重量％。或者，在本公开的另一实施方案中，组合物配制为提供治疗剂的六个月的释放。在这种实施方案中，存在的治疗剂优选为组合物的约0.1重量％至约50重量％，优选约2重量％至约25重量％。该组合物以受控速度释放包含于其中的治疗剂，直至组合物完全溶解为止。
在一些实施方案中，治疗剂未共价结合于包含多孔硅芯的颗粒或膜上。在一些实施方案中，治疗剂包含在多孔硅芯的孔内。
在一些实施方案中，本公开的用于递送治疗剂的组合物还包含靶向剂和/或细胞渗透剂。在这些实施方案中，本发明组合物的颗粒优选确定尺寸以将治疗剂由施药位置递送至需要治疗效果的位置。
适用于本公开中的靶向剂包括能够将本发明组合物的颗粒靶向至被治疗的受试者体内的特定组织的药剂。具体而言，靶向剂可(例如)包括肽或与细胞表面成分(如位于被靶向细胞上的受体或其他表面蛋白质或脂质体)结合的其他物质。适当的靶向剂的例子为短肽、蛋白质片段和完全蛋白质。理想地，靶向剂不应干扰被靶向细胞对颗粒的摄入。在一些实施方案中，靶向剂可包含不超过100个氨基酸，例如不超过50个氨基酸，不超过30个氨基酸，或者甚至不超过10个氨基酸，不超过5个氨基酸，或不超过3个氨基酸。
可选择靶向剂，以使颗粒靶向特定的细胞或组织类型，例如可使颗粒靶向肌肉、脑部、肝脏、胰腺或肺部组织，或靶向巨噬细胞或单核细胞。或者，可选择靶向剂以使颗粒靶向患病组织内的特定细胞，例如癌细胞、患病的冠状动脉细胞、受阿尔茨海默病影响的脑细胞、细菌细胞或病毒粒子。在本公开的优选实施方案中，靶向剂对于神经元组织(例如，脑组织)具有选择性。
靶向剂的具体实例包括通过目标骨骼肌的噬菌体展示发现的肌肉特异性肽(Flint等人(2005)Laryngoscope 115:1930)、连接至乙酰胆碱受体的狂犬病毒糖蛋白的29个残基片段(Lentz(1990)J.Mol.Recognit.3:82)、靶向神经生长因子的受体以靶向神经元的神经元生长因子的片段、以及结合至促胰液素受体并能够用于靶向(例如囊性纤维化的)胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞的促胰液素肽(Zeng等人(2004)J.Gene Med.6:1247和McKay等人(2002)Mol.Ther.5:447)。作为可供选择的另一种方式，可将免疫球蛋白及其变体(包括scFv抗体片段)用作与位于靶向细胞或组织的表面上的特定抗原(如VEGFR或其他表面蛋白质)结合的靶向剂。作为又另一种可供选择的方式，可将受体配体用作靶向剂，以使颗粒靶向至表达靶向受体的细胞或组织的表面。在具体实施方案中，本发明组合物的靶向剂为神经元靶向剂，例如来自狂犬病毒糖蛋白(RVG)的肽序列。
本公开的细胞渗透剂也被称为内化剂或细胞膜转导剂。在具体实施方案中，细胞渗透剂为细胞渗透性肽或蛋白质。这些渗透剂包括熟知类别的相对较短(例如，5至30个残基、7至20个残基或甚至9至15个残基)的肽，其能够使特定的细胞蛋白或病毒蛋白穿过膜，不过其他类别是已知的。例如，参见Milletti(2012)Drug Discov.Today17:850。细胞渗透性肽的最初类别中的示例性肽由于存在较高水平的精氨酸和/或赖氨酸残基(据认为，其有助于使肽通过细胞膜)而通常带有阳离子电荷。在一些情况中，肽具有5个、6个、7个、8个或者甚至更多个精氨酸和/或赖氨酸残基。示例性的细胞渗透性肽包括穿膜肽或触角足PTD及变体、TAT、SynB l、SynB3、PTD-4、PTD-5、FHB Coat-(35-49)、BMV Gag-(7-25)、HTLV-IIRex-(4-16)、D-Tat、R9-Tat、转运蛋白、MAP、SBP、FBP、MPG及变体、Pep-1、Pep-2、以及各种周期序列，包括聚精氨酸、聚赖氨酸及它们的变体。关于可用于本发明组合物中的细胞渗透性肽的其他实例，参见http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.html和http://cell-penetrating-peptides.org。
若干蛋白质、凝集素和其他大分子，例如植物和细菌蛋白质毒素，如蓖麻毒、相思豆毒素、莫迪素(modeccin)、白喉毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、不耐热毒素、铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)、或它们的片段也表现出了细胞渗透性质，并可视为用于本发明目的的细胞渗透剂。其他示例性细胞渗透剂在如下文献中有所描述：Temsamani等人(2004)DrugDiscov.Today 9:1012；De Coupade等人(2005)Biochem J.390:407；等人(2004)Bioconjug.Chem.15:1246；Zhao等人(2004)Med.Res.Rev.24:1；和Deshayes等人(2005)Cell.Mol.Life Sci.62:1839；其全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，细胞渗透剂(例如，细胞渗透性肽)可通过(例如)乙酰化、磷酸化、脂质化、聚乙二醇化和/或糖基化而衍生化，以改善渗透剂的结合亲和力、改善渗透剂跨细胞膜运输的能力、或改善稳定性。在具体实施方案中，细胞渗透剂通过十四烷酰化、棕榈酰化或连接其他脂肪酸(优选碳链长度为10至20个碳原子，如月桂酸和硬脂酸)以及香叶基化(geranylation)、香叶基香叶基化(geranylgeranylation)和其他类型的异戊二烯化而脂质化。在更具体的实施方案中，细胞渗透剂经过十四烷酰化。
在具体实施方案中，细胞渗透剂为转运蛋白(transportan)，更具体而言，为脂质化的转运蛋白。在更具体的实施方案中，细胞渗透剂为十四烷酰化的转运蛋白。
在一些实施方案中，本公开的组合物同时包含靶向剂和细胞渗透剂，而在其他实施方案中，包含靶向剂或者细胞渗透剂。例如，当将组合物用于治疗动物受试者、例如人受试者，尤其是当治疗为全身性治疗时，组合物同时包含靶向剂和细胞渗透剂是有利的。当直接向动物受试者的特定组织施用时，组合物可能不需要包含靶向剂。当将组合物用于其他目的时，例如当组合物定向至细胞外靶点时，组合物可能不需要包含细胞渗透剂。在一些情况中，例如，当组合物直接施用至分离细胞或组织时，组合物可包含靶向剂或细胞渗透剂，这些是本领域技术人员所能理解的。
根据本公开的包含多孔硅颗粒的示例性组合物在Kang等人(2016)Adv.Mater.28:7962中有所描述，其全部内容以引用方式并入本文。
制备包含金属硅酸盐层的多孔硅颗粒的方法
在另一方面中，本公开提供了制备上述多孔硅颗粒和膜的方法。具体而言，本公开提供了负载并保护位于这种材料的孔和/或表面层中的一种或多种治疗剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供多孔硅前体颗粒或膜的步骤，以及用包含治疗剂和金属盐的水溶液处理多孔硅前体颗粒或膜的步骤。在优选实施方案中，所述方法应用于多孔硅前体颗粒的处理。
本文中所用的术语“前体颗粒”或“前体膜”仅仅是用来使制备方法中所使用的颗粒和膜区别于所述方法的产物。
在具体实施方案中，本发明的制备方法中所使用的多孔硅前体材料具有上述颗粒和膜的化学特征和结构特征。例如，多孔硅前体材料的厚度范围为约5nm至约1000微米、约10nm至约100微米或约100nm至约30微米。在多孔硅前体材料为颗粒形式的实施方案中，颗粒的平均尺寸为约1nm至约1cm、约3nm至约1000微米、约10nm至约300微米、约10nm至约100微米或约1微米至约50微米。
本发明的多孔硅组合物可通过已知方法由多孔硅前体膜和前体颗粒制得。例如，大致参见Sailor,Porous silicon in practice:preparation,characterization andapplications(John Wiley&Sons,2012)和Qin等人(2014)Part.Part.Syst.Char.31:252。具体而言，可利用(例如)3:1的48％-HF:EtOH溶液以适当的电流密度对硅晶圆进行电化学蚀刻，从而获得确定的颗粒尺寸、孔隙率和孔尺寸。例如，可通过在稀释的水性HF中施加低电流密度脉冲，从而除去晶圆中的蚀刻多孔硅层。为了制备pSi纳米颗粒(pSiNP)，可在长时间的低电流蚀刻(例如，40mA/cm2,1.8秒)中通过高电流的短周期脉冲(例如，370mA/cm2,0.4秒)引入沿蚀刻平面的穿孔，由此产生交替的高孔隙率和低孔隙率的层(Qin等人(2014)Part.Part.Syst.Char.31:252)。可将多孔硅层从晶圆中除去以形成膜，并且(例如)通过进行超声过夜使独立式膜(freestanding film)破裂，从而产生单分散的pSi纳米颗粒。为了制备pSi微粒(pSiMPs)，以(例如)4秒和2.7秒每循环的周期施加(例如)20mA/cm2至100mA/cm2的蚀刻电流，以形成阻带为约450nm和560nm的复合正弦结构。可通过进行超声5至7分钟使独立式膜破裂，从而产生具有所需尺寸(例如，20x60x60μm)的pSi微粒。
对本领域技术人员显而易见的是，可使用其他的电流-时间波形以产生经电化学蚀刻的多孔硅材料。例如，在这种方法中，可在预定时间内使用单一的恒定电流，或使用正弦电流-时间波形。或者，可用化学染色蚀刻代替上述电化学蚀刻，以制造多孔硅芯。参见Sailor,Porous silicon in practice:preparation,characterization andapplications(John Wiley&Sons,2012)。在又一可替代的方式中，可通过纳米结构的氧化硅的化学还原来制造多孔硅芯。参见Batchelor等人(2012)Silicon 4:259。染色蚀刻通常使用硅粉末代替硅晶圆作为硅前体，并使用化学氧化剂代替驱动电化学反应的供电。
在一些实施方案中，多孔硅前体材料可被氧化或部分氧化。在具体实施方案中，多孔硅前体材料可被热氧化，例如在至少150℃、至少200℃、至少300℃、至少400℃、至少500℃、至少600℃、至少700℃、至少800℃或甚至更高的温度下被热氧化。在一些实施方案中，多孔硅前体材料可在约300℃至约1000℃的温度下、约400℃至约800℃的温度下或约500℃至约700℃的温度下被氧化。在优选实施方案中，在空气中进行热氧化。
在一些实施方案中，可通过(例如)将本发明方法的多孔硅前体材料悬浮于包含氧化剂的溶液中，从而将该多孔硅材料在溶液中氧化。例如，用于氧化多孔硅的溶液可包含水、硼酸盐、三(羟甲基)氨基乙烷、二甲基亚砜、硝酸盐或任何其他适合的氧化剂或试剂的组合。
如前所述，用于制备本发明组合物的溶液通常包含金属盐。在具体实施方案中，溶液包含浓度为至少0.1摩尔、0.3摩尔、0.5摩尔、1摩尔、2摩尔、3摩尔或甚至更高浓度的金属盐。在一些具体实施方案中，金属盐为二价、三价或四价金属盐。更具体而言，金属盐为二价金属盐。例如，二价金属盐可为钙盐、镁盐、锰盐、铜盐、锌盐、镍盐、铂盐或钡盐。在具体实施方案中，二价金属盐为钙盐或镁盐。甚至更具体而言，二价金属盐为钙盐。在其他具体实施方案中，金属盐为三价或四价金属盐。可用于本公开的制备方法中的示例性三价或四价金属盐包括锆盐、钛盐和铋盐。在一些实施方案中，制备方法利用金属盐的组合物，包括以任意组合方式的任意上面列举的示例性金属盐。在一些实施方案中，在同一个步骤中进行利用包含治疗剂和金属盐的水溶液处理多孔硅前体颗粒或膜的步骤。
在一些实施方案中，处理多孔硅颗粒或膜中所用的治疗剂为上面所详细描述的任何治疗剂。例如，所述治疗剂可为小分子药物、维他命、显影剂、蛋白质、肽、核酸、低聚核苷酸、适体或它们的混合物。更具体而言，治疗剂可为低聚核苷酸，如DNA、RNA、siRNA或微小RNA。在治疗剂为低聚核苷酸的实施方案中，治疗剂优选为核糖核苷酸或甚至siRNA。
制备方法还可包括使多孔硅前体颗粒或膜与靶向剂连接的步骤。更具体而言，靶向剂可为神经元靶向剂或任何上述特定的靶向剂。可供选择地或额外地，制备方法可包括使多孔硅前体颗粒与细胞渗透剂连接的步骤，更具体而言，该细胞渗透剂为脂质化肽或任何上述特定的细胞渗透剂。在具体实施方案中，制备方法还可包括使多孔硅前体颗粒与靶向剂和细胞渗透剂连接的步骤。示例性的靶向剂和细胞渗透剂已在上文中详细说明。
药物组合物
在另一方面中，本公开提供了这样的药物组合物，其包含：本公开的包含颗粒或膜的组合物；以及药学上可接受的载体。药物组合物可为单位剂型，如片剂、胶囊、喷洒胶囊、颗粒、粉剂、糖浆、栓剂、注射液等等。该组合物还可存在于经皮递送系统中，例如，皮肤帖剂。
本文所用短语“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内,适用于与动物受试者(包括人类受试者)的组织接触，且没有过度的毒性、刺激性、变应性反应和其他问题或并发症，同时具有合理的收益/风险比。
本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料，其参与将包含颗粒的目标组合物从一个器官或身体的一个部分携带或递送到另一个器官或身体的另一部分。如本领域技术人员所理解的，各载体在与制剂中其他组分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药学制剂中所采用的其他无毒性的相容物质。参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th ed.(Alfonso R.Gennaro ed.),2000。当本发明组合物的治疗剂为核酸、尤其是核糖核酸时，药学上可接受的载体应当优选基本上不含核酸酶，例如核糖核酸酶。
对于包含本公开的含颗粒组合物的药物组合物，可通过如下多种给药途径中的任意一种对受试者进行给药，这些给药途径包括(例如)：口服给药(例如，水溶液或非水溶液的顿服剂或混悬剂、片剂、大丸剂(boluses)、散剂、颗粒剂、舌用糊剂)；舌下给药；肛门给药、直肠给药或阴道给药(例如，阴道栓、膏剂或泡沫物)；肠道外给药(包括肌内给药、静脉内给药、皮下给药或鞘内给药，例如灭菌溶液或悬浮液)；鼻内给药；腹膜内给药；皮下给药；经皮给药(例如，用于皮肤的贴剂)；或局部给药(例如，施用于皮肤的膏剂、软膏或喷雾)。该组合物也可配制为用于吸入的制剂。在一些实施方案中，本公开的包含颗粒的组合物可简单地溶解或悬浮于灭菌水中。适当的给药途径以及适于这些给药途径的组合物的详细信息可在(例如)美国专利No.6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896以及本文所引用的专利中找到。
本文所用短语“肠道外给药”和“通过肠道外给药”是指除肠内给药和局部给药以外的给药模式，通常是通过注射给药，包括(但不限于)静脉内注射、肌肉内注射、动脉内注射、鞘内注射、囊内注射、眼内注射、心脏内注射、皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节内注射、囊下注射、蛛网膜下注射、脊柱内注射和胸骨内注射以及灌注。
治疗方法
本公开的组合物尤其可用于通常以受控方式递送治疗剂的方法中。例如，如上面关于药物组合物所描述的，本领域技术人员将会理解，所述方法可用于通过口服给药、舌下给药、肛门给药、直肠给药、阴道给药、肠道给药、鼻内给药、腹膜内给药、皮下给药、经皮给药、局部给药、吸入给药或通过任何其他适当的给药模式进行治疗剂的递送。在优选实施方案中，治疗方法将治疗剂靶向至神经元组织，尤其是靶向至脑部。
如上所述，本公开的组合物可以是发光的，该性质有助于对施用了这些组合物的受试者进行监测。因此，在一些实施方案中，治疗方法还包括监测受试者或从受试者中分离出的组织的步骤。鉴于一些本公开的组合物的光致发光性质，在具体实施方案中，监测步骤为光学监测步骤。
对于相关领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明或其任何实施方案的范围的前提下，可对本发明中所描述的组合物、方法和应用进行其他适当的修改和调整。现在已对本发明进行详细描述，本发明的内容在参考下列实施例后将更容易了解，这些实施例仅用来说明，而非用来限制本发明。
实施例
用于向受损脑部的靶向递送siRNA的自密封性多孔硅-硅酸钙芯-壳纳米颗粒
示出了将高浓度的siRNA同时负载并保护于多孔硅纳米颗粒(pSiNPs的单步骤操作。通过用包含siRNA和氯化钙的水溶液处理pSiNP，产生了由包覆有硅酸钙表面层的负载siRNA的pSiNP核构成的芯-壳纳米结构。壳中的硅酸盐的来源为pSi基质的局部溶解。未受任何理论的限制，可以理解的是，在含有高浓度的钙(II)离子的溶液中，Ca2SiO4的形成主要发生在纳米颗粒表面处，并且具有自限性(self-limiting)。因此，可以理解的是，不溶性的硅酸钙壳使pSiNP壳的降解减慢并延长了siRNA有效负载的递送，从而在体外和体内得到了更为有效的基因敲减(gene knockdown)。硅酸钙壳的形成使得来自多孔硅芯的光致发光外部量子产率由0.1％增加至21％，据推测这是由于硅酸盐外壳的电子钝化性所致。通过将两种功能性肽连接至Ca-pSiNP，得到了这样的构建体，该构建体在体外显示出更好的基因沉默，并且在体内显示出更好的递送，其中这两种功能性肽引入了源自狂犬病毒糖蛋白((RVG))的序列作为神经元靶向肽，并引入了十四烷酰化转运蛋白(mTP)作为细胞渗透部分。
小分子、蛋白质和核酸类治疗剂在功效方面的显著局限为生物利用度。具有低溶解度的分子在治疗有效浓度下可能不会进入血液或其他体液中(Muller等人(2001)Adv.Drug Deliver.Rev.47:3；Kataoka等人(2012)Pharm.Res.-Dordr.29:1485；Kipp(2004)Int.J.Pharm.284:109)，而溶解性更高的治疗剂可能会在到达预计目的组织之前通过各种生物过程而被快速清除出循环系统(Chonn等人(1992)J.Biol.Chem.267:18759；Pirollo等人(2008)Trends Biotechnol.26:552；Gabizon等人(1988)P.NatlAcad.Sci.USA 85:6949)。作为控制药物递送的浓度-时间关系从而改善治疗效用的方法，出现了将治疗剂负载于多孔或中空纳米结构中这种方法。Lou等人(2008)Adv.Mater.20:3987；Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliver.Rev.60:1266。关于用于药物的纳米结构载体的大量工作基于“软质”颗粒，如脂质体和聚合物缀合物(Gu等人(2011)Chem.Soc.Rev.40:3638；Nishiyama等人(2006)Pharmacol.Therapeut.112:630)，或者基于更为刚性的多孔无机材料，如中孔硅或中孔氧化硅(Park等人(2009)Nat.Mater.8:331；Wu等人(2008)ACSNano 2:2401；Godin等人(2010)J.Biomed.Mater.Res.A 94a:1236)。中孔硅和中孔氧化硅是可生物降解的无机材料，其在药物递送应用方面已经过了深入研究。Anglin等人(2008)Adv.Drug Deliver.Rev.60:1266；Meng等人(2010)J.Am.Chem.Soc.132:12690；Meng等人(2010)ACS Nano 4:4539；Patel等人(2008)J.Am.Chem.Soc.130:2382；Lu等人(2007)Small3:1341；Shabir等人(2011)Silicon-Neth.3:173；Wang等人(2010)Mol.Pharmaceut.7:2232；Kashanian等人(2010)Acta Biomater.6:3566；Canham等人，美国专利公开No.2015/0352211；Jiang等人(2009)Phys.Status Solidi.A206:1361；Fan等人(2009)Phys.StatusSolidi.A 206:1322；Salonen等人(2008)J.Pharm.Sci.US 97:632；Sailor等人(2012)Adv.Mater.24:3779；Ruoslahti等人(2010)J.Cell.Biol.188:759。
多孔硅(pSi)的降解机理可理解为涉及硅芯的氧化以形成氧化硅，随后为所得氧化物相水解为水溶性原硅酸(Si(OH)4)或其类似物。Sailor等人(2012)Adv.Mater.24:3779。为了防止pSi纳米颗粒的快速降解，已合成了多种“芯-壳”类型的结构，其中pSi的内核被更为稳定的氧化硅(Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688；Ray等人(2009)J.Appl.Phys.105:074301)、氧化钛(Betty等人(2011)Prog.Photovoltaics 19:266；Li等人(2014)Biosens.Bioelectron.55:372；Jeong等人(2014)ACS Nano 8:2977)、碳(Tsang等人(2012)ACS Nano 6:10546；Zhou等人(2000)Chem.Phys.Lett.332:215；Gao等人(2009)Phys.Chem.Chem.Phys.11:11101)或其他动力学稳定的物质(Buriak(2002)Chem.Rev.102:1271)的层或壳包围。芯-壳结构是用于缓慢释放药物递送制剂的有吸引力的平台，这是因为壳的合成可与药物负载同时进行，从而更有效地将治疗剂捕获于纳米结构中。Fry等人(2014)Chem.Mater.26:2758。此外，已经证实了芯-壳结构能够增强来自pSi中的发光硅域的光致发光的强度和持久性(Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688)，这为纳米材料增加了成像以及自我报告(self-reporting)药物递送特征。
该实施例中披露了这样的单步骤程序，其中通过在进行药物负载的同时析出硅酸钙壳，从而将高浓度的siRNA同时负载并保护于pSi纳米颗粒(pSiNP)中。尽管并不意图限制本发明，但是壳中硅酸盐的来源理解为源自于pSi基质的局部溶解，并且在含有高浓度钙(II)离子的溶液中，发现Ca2SiO4的形成主要发生在纳米颗粒表面处，并且具有自限性。如果钙离子溶液还包含siRNA，则低聚核苷酸在壳形成过程中会被捕获于多孔纳米结构中。同样的，并不意图限制本发明，不溶性硅酸钙壳理解为减慢多孔硅芯的降解以及siRNA的释放。多孔Si芯由于量子限域效应而展示出固有的光致发光，并且发现壳形成过程会使外部量子产率由0.1％增加至21％，据推测这是由于硅酸盐壳的电子钝化性所致。为了证实借助于该系统的基因递送潜力，通过硅烷醇化学修饰包覆有硅酸钙的pSiNP(Ca-pSiNP)，以结合两种功能性肽(一种用于靶向神经元，另一种用于细胞渗透)。所得构建体在体外显示出更好的基因沉默效用，并且在体内能够递送至靶向组织。
如图1所示，多孔Si颗粒的温和氧化(在水性介质中)在Si芯上产生了薄的氧化物层。随着薄氧化物层的形成，氧化物层水合并溶解，并向溶液中释放Si(OH)4。存在于水溶液中的高浓度Ca2+和siRNA扩散至孔内，在这些孔内，Ca2+离子与局部高浓度的Si(OH)4反应，从而形成析出物，这些析出物将siRNA有效负载捕获于纳米结构内。
如前所述制备平均尺寸为180±20nm(通过动态光散射法测得)的pSiNP。Qin等人(2014)Part.Part.Syst.Char.31:252。通过在包含低聚核苷酸和高浓度(3M或4M)的CaCl2的水溶液中进行搅拌，从而在一个步骤中使siRNA有效负载能够负载并密封于多孔纳米结构中。通过能量色散X射线(EDX)分析证实所得的负载siRNA的包覆有硅酸钙的pSiNP(Ca-pSiNP-siRNA)中存在硅、钙和氧(图5A和5B)。未检测到残余氯化物。通过与Ca2+溶液反应，pSiNP中测定的氧的量显著增加，这证实了pSiNP在反应中被氧化。
如下三幅透射电子显微镜(TEM)图像(图2A至2C)表明与Ca2+的反应产生了特殊的包覆层，其中这三幅图像分别为：钙离子处理之前的空的pSiNP的TEM图像；Ca2+处理之后的pSiNP(Ca-pSiNP)的TEM图像；以及负载siRNA并用Ca2+处理之后的pSiNP(Ca-pSiNP-siRNA)的TEM图像。基于元素分析并考虑到硅酸钙的低溶解性(Medinagonzales等人(1988)Fert.Res.16:3)，但是不意图受到理论的约束，提出了包覆材料(capping material)为原硅酸钙(Ca2SiO4)、或者原硅酸钙、偏硅酸盐和氧化硅的混合相。通过粉末X射线衍射(XRD)未观察到结晶的硅酸钙或氧化硅相，但是在XRD谱(图6A)、拉曼光谱(图6B，520cm-1处的特征性Si-Si晶格模式)和FTIR光谱(图6C)中观察到了残余的结晶Si。氮吸附-解吸等温分析表明，由于pSiNP向Ca-pSiNP转化，因此，总孔体积降低80％(1.36±0.03cm3/g至0.29±0.04cm3/g)(图2D)。现有研究工作显示，pSi的氧化会导致孔体积因孔壁的膨胀(由于氧被引入硅芯内)而减小，而该方法会使得有效负载被有效地捕获于孔内。Sailor等人(2012)Adv.Mater.24:3779；Fry等人(2014)Chem.Mater.26:2758。
用于测量溶液中的单质硅的量的光吸收率测量显示：当不存在钙离子时，在pH 9缓冲液中，约40％的pSiNP在80分钟内降解。然而，在3M或4M的CaCl2溶液(同样为pH 9)中，在相同时间内观察到仅约10％的降解(图7A)。硅酸钙壳也阻碍了siRNA负载的释放；在生理条件下(pH 7.4缓冲液，37℃)，与通过静电方式使siRNA保持于pSiNP中的制剂(用表面胺基团修饰的pSiNP，pSiNP-NH2，图7B)相比，Ca-pSiNP-siRNA制剂显示出释放减慢约5倍。因此，捕获反应有效地包封了siRNA有效负载，并保护pSi核以防止其在水性介质中发生随后的氧化和水解。
在pSiNP和CaCl2溶液间的反应过程中，在不同时间点处获得的光致发光谱显示出强度的逐渐升高(图2E)。此外，随着反应的进行，光致发光的峰波长发生蓝移。这两种现象(光致发光强度的增加以及光致发光谱的蓝移)表明硅纳米晶粒上的钝化表面层的生长。Joo等人(2014)Adv.Funct.Mater.24:5688；Petrovakoch等人(1992)Appl.Phys.Lett.61:943；Sa'ar(2009)J.Nanophotonics 3:032501。所观察到的蓝移是量子限域的硅纳米颗粒的典型现象，其中量子限域的硅纳米颗粒的发射波长在很大程度上取决于尺寸，并且随着量子限域的硅域变小而表现出蓝移。Joo等人(2015)ACS Nano 9:6233。pSiNP-硅酸钙芯-壳结构(Ca-pSiNP)的光致发光发射量子产率(外部)为21％(λex＝365nm，图8)。
在培养的神经-2a(小鼠成神经细胞瘤)细胞的体外细胞毒性筛选中，当纳米颗粒浓度高达50μg/mL时，Ca-pSiNP制剂没有显示出显著的细胞毒性(图9)，因此使该系统负载靶向性有效负载和治疗性有效负载，以用于基因沉默研究(在图10中示意性地描述了负载步骤)。选择能够使内源基因(肽酰脯氨酰异构酶B，PPIB)沉默的小干扰RNA(siRNA)来测试硅酸钙化学制剂在体内研究中维持、保护并递送治疗性有效负载的能力。在3M的CaCl2的存在下，使pSiNP负载针对PPIB的siRNA(siPPIB)，使得所获得的纳米颗粒(Ca-pSiNP-siRNA)中的siRNA含量为约20重量％。TEM(图2C)显示，Ca-pSiNP-siRNA构建体的形态与不含药剂的Ca-pSiNP制剂类似，不过Ca-pSiNP-siRNA的表面电荷(ζ电势，图11A)为负电荷，而非正电荷。不含药剂的Ca-pSiNP制剂的正ζ电势归因为颗粒表面多余的Ca2+离子，而带负电荷的siRNA有效负载中和了这些电荷，直至Ca-pSiNP-siRNA构建体中总体上为负的ζ电势。
为了实现siRNA治疗剂的靶向递送以及细胞内运输，随后将组织靶向肽和细胞渗透肽接合(graft)至Ca-pSiNP-siRNA构建体的硅酸钙壳。使用PEG接头连接这两种肽，以改善系统循环(图10)。首先，将化学偶联剂2-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(APDMES)接合至纳米颗粒表面，从而产生悬挂的伯胺基团(Ca-pSiNP-siRNA-NH2)。Sailor等人(2012)Adv.Mater.24:3779。由于位于纳米颗粒最外表面的伯胺基团，Ca-pSi-NH2或Ca-pSiNP-siRNA-NH2制剂在APDMES反应之后的ζ电势更偏向正电势(图11A)。然后使用马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺羧甲基酯(MAL-PEG-SCM)类物质，将官能性聚乙二醇(PEG)类物质通过这些伯胺接合至Ca-pSiNP-siRNA-NH2。Joo等人(2015)ACS Nano 9:6233。琥珀酰亚胺羧甲基酯与伯胺形成酰胺键，从而提供了方便的方式使PEG连接至胺化纳米颗粒。PEG链的末端包含第二官能基团马来酰亚胺。马来酰亚胺与硫醇形成共价键，从而能够连接靶向肽和细胞渗透性肽。准备两种肽类物质：myr-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(GGCC)(SEQ ID NO:l)，本文中称为“mTP”；以及源自狂犬病毒的肽5FAM-(CCGG)YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(SEQ ID NO:2)，其称为“FAM-RVG”，通过马来酰亚胺基团与相关肽的半胱氨酸硫醇间的反应，从而将这两种肽共轭至Ca-pSiNP-siRNA-PEG制剂。此处，“5FAM”为荧光标记5-羧基荧光素，一种常用于标记生物分子的胺反应性荧光团(λex/λem＝495/518nm)。
已发现诸如转运蛋白(TP)之类的细胞渗透性肽(CPP)是siRNA递送的有前景助剂。当将CPP引入纳米颗粒时，其在内化之后可提高内吞作用逃逸(endocytic escape)，从而提高siRNA敲减效率。然而，CPP缺少细胞类型特异性。为了克服该缺陷，将CPP与细胞特异性靶向肽组合以生成所谓的串联肽，并且这些构建体显示为非常有效的siRNA递送剂。Ren等人(2012)ACS Nano 6:8620。在本发明的实例中，将细胞渗透性转运蛋白酶连接至十四酰基(其包含疏水性的13碳脂肪链)，从而提高了肽和细胞膜的双层脂质间的疏水性相互作用(mTP)。Ren等人(2012)Sci.Transl.Med.4:147ral 12。通过来自狂犬病毒糖蛋白(RVG)的肽序列实现了细胞靶向功能，该肽序列在体外和体内展示出了有效的神经元细胞靶向效率。Alvarez-Erviti等人(2011)Nat.Biotechnol.29:341；Lentz(1990)J.Mol.Recognit.3:82；Kumar等人(2007)Nature 448:39。通过将RVG和mTP肽两者连接至Ca-pSiNP，得到了双肽纳米复合物，其称为“Ca-pSiNP-DPNC”。还制备了仅包含mTP或RVG肽的对照用纳米颗粒，在本文中将它们分别指定为Ca-pSiNP-mTP或Ca-pSiNP-RVG。
经FAM标记的相对荧光确定，约0.086mg的RVG与1mg的Ca-pSiNP-siRNA-PEG相连。在Ca-pSiNP-siRNA-DPNC构建体中，约0.037mg的RVG与相当量的mTP相连。Ca-pSiNP-DPNC的傅里叶变换红外(FTIR)谱显示了Ca-pSiNP-mTP和Ca-pSiNP-RVG的所有特征峰(图12)。Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC构建体的平均直径为220nm(DLS Z-平均值，基于强度)，其表示与pSiNP起始材料(40nm)相比，平均直径增加。在DLS数据中未观察到明显的聚集体(图11B)。
相对于未经处理的对照组，Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC构建体实现了神经-2a细胞中52.8％的PPIB基因活性的敲减(图3)。为了排除基因沉默是由纳米复合物的毒性造成的这一可能性，测试了阴性对照物：负载有针对荧光素酶基因的siRNA(siLuc)的类似制剂，其相对于未处理对照物未显示出统计学上的显著差异。作为另外的对照物，测试了仅包含细胞渗透性肽或仅包含细胞靶向肽的纳米颗粒(分别为Ca-pSiNP-siPPIB-mTP和Ca-pSiNP-siPPIB-RVG)的基因沉默效率。这两种构建体均显示出一些可观察到的PPIB基因表达敲减(相对于未处理对照物为27.1％至28.9％)，但是与包含一种肽的体系相比，具有两种肽的纳米颗粒Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC(p<0.03)的沉默效果更强。在Ca-pSiNP-siPPIB-mTP的情况中，未预期观察到的体外的基因敲减转化为体内活性，这是因为mTP的细胞渗透作用缺乏细胞类型特异性。另一方面，由于RVG序列与神经-2a细胞的特异性结合，实现了更有效的体外细胞定位，从而Ca-pSiNP-siPPIB-RVG导致基因的沉默。使用不含siPPIB(纳米颗粒中不含siPPIB)的对照物、以及siPPIB负载于空白(bare)pSiNP(无Ca包覆化学制剂(Ca cappingchemistry)、无靶向肽、无细胞渗透性肽)的对照物未显示出统计学上的显著敲减。此外，纳米构建体可分离并在4℃下储存7天，并仍维持其PPIB基因敲减效率(图3)。
与Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC制剂具有更高的敲减效率一致的是，共焦显微镜图像显示：与Ca-pSiNP-siPPIB-RVG制剂相比，Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC制剂对神经-2a细胞具有更高的亲和性(图13A和13B)。与Ca-pSiNP-siPPIB-RVG相比，Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC制剂的表面上的荧光FAM标记物分子的数目为约一半。尽管每个颗粒中的FAM荧光信号较弱，但是用Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理的神经-2a细胞显示出更强的FAM信号，这是因为与仅含RVG的制剂相比，这种双肽构建体具有更高的细胞亲和性。Ca-pSiNP在荧光显微镜图像中是可见的，这是由于来自纳米颗粒的量子限域的Si域的固有光致发光所致。在细胞被Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC处理的情况中，Si信号与来自RVG靶向肽上的FAM标记物的信号共定位，并且在胞质中看见组合信号，这显示出了细胞内化。通过荧光激活细胞分选(FACS)分析，能够更为准确地对这两种纳米颗粒构建体的细胞亲和性进行定量分析(图14A-14D)，并且数据显示：与仅包含RVG肽的纳米颗粒相比，双肽纳米颗粒在靶向神经-2a细胞方面更为有效(Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC和Ca-pSiNP-siPPIB-RVG分别为51.4％±5.6％vs 36.4％±5.6％，(P<0.04))。分别位于Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC中的PVG肽和siPPIB上的荧光标记显示，65.9±8.7％的细胞同时包含RVG和siPPIB(图14D)。该结果支持了这一假设：通过将RVG和mTP同时连接至纳米颗粒，可产生更高的细胞亲和性，进而会产生更强的基因敲减效果。
由于通过在同一纳米颗粒上同时具有细胞渗透性肽和细胞靶向肽(Ca-pSiNP-siPPIB-DPNC)产生了最强的体外基因敲减，因此测试了该组合的体内基因递送。体内模型包括小鼠的穿透性脑部损伤。在注射了Ca-pSiNP-siRNA-DPNC的小鼠中，大量的siRNA累积在脑部损伤部位(图4)。相比于注射了盐水的对照小鼠中的荧光背景，上述小鼠(n＝3)所显示的与siRNA有效负载相关的荧光强度大2倍。相比于非靶向纳米颗粒Ca-pSiNP-siRNA-PEG，双肽Ca-pSiNP-siRNA-DPNC具有更高的统计学上可观察的靶向效率(p<0.02)。与未注射的对照小鼠相比，注射了非靶向Ca-pSiNP-siRNA-PEG构建体的小鼠在脑部显示出一些siRNA荧光信号，据推测这是由于被动渗透至受损部位所致。
总之，本研究展示了能够将低聚核苷酸负载于具有生物降解性的本征光致发光纳米颗粒中的自密封化学方法。可以负载大量的siRNA(＞20质量％)，并且有效负载可保持与治疗相关的时间长度。硅酸钙壳易于被细胞靶向肽(来自狂犬病毒糖蛋白的RVG肽)和细胞渗透性肽(十四烷酰化转运蛋白)修饰，并且这两种肽的组合以及硅酸钙化学制剂保持并保护siRNA有效负载的能力改善了细胞靶向以及体外基因敲减。多价芯-壳纳米颗粒循环并将siRNA有效负载递送至活的小鼠的脑部损伤处，并且与非靶向纳米颗粒相比，双重靶向纳米颗粒在脑部损伤模型中显示出了更好的体内siRNA递送。
试验部分
多孔硅纳米颗粒的制备：按照所公布的“穿孔蚀刻”过程制备pSiNP。Qin等人(2014)Part.Part.Syst.Char.31:252。在由3:1(v:v)的48％HF:乙醇水溶液构成的电解液中，对高硼掺杂的p++型硅晶圆(电阻率约1mΩ-cm，直径为100mm，Virginia Semiconductor,Inc.)进行阳极蚀刻。蚀刻波形由方波(其中施加46mA cm-2的较低电流密度1.818秒)以及随后的高电流密度脉冲(其中施加365mA cm-2的高电流密度脉冲0.363秒)构成。该波形重复140个循环，从而产生层状多孔硅(pSi)薄膜，其具有穿过该多孔层的约每200nm循环的高孔隙率“穿孔”。在含有1:20(v:v)的48％HF:乙醇水溶液中，通过施加3.4mA cm-2的电流密度250秒从而将膜从硅衬底上除去。通过在去离子水中浸渍并超声约12小时，从而使独立式pSi膜破裂为平均(Z平均值，基于强度)直径为180nm(图11B)的纳米颗粒。
包覆有硅酸钙的负载siRNA的多孔硅纳米颗粒(Ca-pSiNP-siRNA)的制备：通过将2.25g的固体CaCl2(MW:110.98，无水，Spectrum chemicals)添加至5mL的无RNAse的水中，从而制备4M的氯化钙(CaCl2)储液。将该储液离心以除去任何沉淀物，并在使用之前于4℃下储存。对于负载低聚核苷酸，由Dharmacon Inc.合成了三种用于敲减PPIB(l)、PPIB(2)和荧光素酶的双重siRNA构建体，该双重siRNA构建体具有3'-dTdT突出端(overhang)。Ambardekar等人(2011)Biomaterials 32:1404；Waite等人(2009)BMC Biotechnol.9:38。对于针对PPIB基因的siRNA(siPPIB)，分别获得了siPPIB(l)和siPPIB(2)，并使用了1:1的siPPIB(l):siPPIB(2)混合物，以涵盖siRNA上的广泛的PPIB基因，其中用于siPPIB(l)的siRNA的有义序列为5'-CAA GUU CCA UCG UGU CAU C dTdT-3'(SEQ ID NO:3)反义序列为5'-GAU GAC ACG AUG GAA CUU G dTdT-3'(SEQ ID NO:4)、用于siPPIB(2)的有义序列为5'-GAA AGA GCA UCU AUG GUG A dTdT-3'(SEQ ID NO:5)，反义序列为5'-UCA CCA UAGAUG CUC UUU C dTdT-3'(SEQ ID NO:6)。在siRNA的有义序列5'-CUU ACG CUG AGU ACUUCG A dTdT-3'(SEQ ID NO:7)和反义序列5'-UCG AAG UAC UCA GCG UAA G dTdT-3'(SEQID NO:8)上获得针对荧光素酶基因的siRNA(siLuc)。将pSiNP(1mg)分散于低聚核苷酸溶液(150μL,150μΜ的siRNA溶液)中，并添加到CaCl2储液(850μL)中。将该混合物搅拌60分钟，并且通过在无RNAse的水、70％乙醇和100％乙醇中连续分散/离心，从而进行纯化。为了分析siRNA负载效率，从各离心步骤中收集上清液，并使用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific,ND-2000)分析游离的siRNA。作为对照组，除了未添加siRNA之外，按照与上述相同的方式制备不含siRNA的Ca-pSiNP。
肽与Ca-pSiNP的缀合：将所制备的Ca-pSiNP-siRNA、Ca-pSiNP或pSiNP样品(1mg)悬浮在无水乙醇(1mL)中，添加等分(20μL)的氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(APDMES)，将该混合物搅拌2小时。随后在无水乙醇中离心从而将胺化纳米颗粒(Ca-pSiNP-siRNA-NH2、Ca-pSiNP-NH2或pSiNP-NH2)纯化三次，以除去未连接的APDMES。将杂官能接头(hetero-functional linker)马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺羧甲基酯(MAL-PEG-SCM，MW：5,000，Laysan Bio Inc.，5mg/mL的乙醇溶液)或甲氧基-PEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB，Mw：5,000，NEKTAR，5mg/mL的乙醇溶液)的溶液(200μL)加入胺化纳米颗粒(1mg/100μL)中，并搅拌2小时。通过在乙醇中离心三次，从而除去PEG化纳米颗粒(Ca-pSiNP-siRNA-PEG或Ca-pSiNP-PEG)中的未连接PEG接的头分子。对于肽缀合制剂，使用了两种肽构建体中的一种：mTP，其由通过酰胺键共价连接至肽序列myr-GWTLNSAGYLLGKINLK ALAALAKKIL(GGCC)(SEQ ID NO:l)上的N末端甘氨酸残基的十四酰基(myr)构成；或者FAM-RVG，其由通过酰胺键连接至肽序列5-FAM(CCGG)YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(SEQ ID NO:2)上的N末端半胱氨酸残基的5-羧基荧光素(5-FAM)构成。这两种构建体均从CPC Scientific Inc.获得(1mg/mL的无RNAse水溶液)。对于Ca-pSiNP-双肽纳米复合物(Ca-pSiNP-DPNC或Ca-pSiNP-siRNA-DPNC)的合成，将50μL的各肽溶液(mTP和FAM-RVG)添加至100μL的Ca-pSiNP-PEG的乙醇溶液中，在4℃下培育4小时，通过离心纯化三次，浸入乙醇中并在使用前于4℃下储存。对于单肽缀合的Ca-pSiNP(Ca-pSiNP-siRNA-mTP或Ca-pSiNP-siRNA-RVG)对照组样品的合成，将100μL的肽溶液(mTP或FAM-RVG)分别加入100μL Ca-pSiNP-siRNA-PEG的乙醇溶液中。随后的步骤与上述关于Ca-pSiNP-siRNA-DPNC构建体的步骤相同。
表征：利用JEOL-1200EX II仪器，获得透射电子显微镜(TEM)图像。使用FEI XL30场发射仪器获得扫描电子显微镜(SEM)图像和能量分散x射线(EDX)数据。通过动态光散射(DLS，Zetasizer ZS90，Malvern Instruments)测量流体力学尺寸和ζ电位。使用OceanOptics QE-Pro分光计和460nm长通滤光片获得稳态光致发光光谱(λex:365nm)。参照罗丹明6G的乙醇标样(Q.Y.95％)进行量子产率测量。所有用于量子产率测量的溶液在λ＝365nm处的吸光度值＜0.1。将波长范围500nm至980nm内的光致发光强度进行积分，并对吸光度作图(图8)。利用Micromeritics ASAP 2020仪器，在77K的温度下获得干燥颗粒的氮吸附/解吸等温线。使用Thermo Scientific Nicolet 6700FTIR仪器，记录傅里叶变换红外(FTIR)光谱。使用Renishaw inVia Raman显微镜和532nm的激光激发源获得拉曼光谱。
体外试验：在含有10％胎牛血清(FBS)的Eagle’s最低必需培养基(EMEM)中培养小鼠神经-2a成神经细胞瘤(ATCC，CCL-131)。利用分子探针活/死存活率/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit)(Molecular Probes，Invitrogen)评价合成的纳米颗粒的细胞毒性。Yee等人(2006)Adv.Ther.23:511。该试剂盒使用了2个探针，用于活细胞染色的Calcein AM(λex/λem＝494/517nm)和用于死细胞染色的乙啶同型二聚体-1(EthD-1)(λex/λem＝528/617nm)。在96孔板中，一式三份地用纳米颗粒处理神经-2a细胞(3000细胞/孔)。在48小时后，用由4μΜEthD-1和2μΜCalcein AM的Dulbecco′s磷酸盐水缓冲液构成的试验溶液清洗并处理各孔。在试验溶液中于室温下培育45分钟后，分别使用485/538/515nm和544/612/590nm的激发波长、发射波长和截止波长，利用荧光板式读出仪(Gemini XPS spectrofluorometer，Molecular Devices,Inc.)读取孔板。每个处理组总计评价15个孔，并绘制为未处理的对照组荧光强度的百分比。
用共焦显微镜(Zeiss LSM 710NLO)并使用40倍油浸物镜来对经过纳米颗粒处理的神经-2a细胞进行成像。将细胞接种于盖玻片(BD Biocoat Collagen Coverslip,22mm)上，用纳米颗粒培育2小时，用PBS清洗三次，用4％低聚甲醛固定，用DAPI进行细胞核染色并封固(Thermo Fisher Scientific，Prolong Diamond Antifade Mountant with DAPI)。对经过纳米颗粒处理的神经-2a细胞进行定量分析，以通过FACS分析(LSR Fortessa)展示细胞亲和性和siRNA递送效率。
为了研究体外敲减效率，进行实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR，Stratagene Mx3005P qPCR系统)分析，以检查PPIB mRNA表达。在24孔板中接种神经-2a细胞(以每孔4x 104个细胞接种)，并与负载siRNA的纳米颗粒一起进行培育，浓度相当于100nM的siRNA。在48小时后，收集细胞，并按照生产商的方法(Qiagen,Valencia,CA)分离总RNA。按照生产商的方法(Bio-Rad,iScript cDNA Synthesis Kit)将分离的RNA转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix对合成的cDNA进行aPCR分析。作为目标mRNA扩增的PPIB的引物序列和作为参照mRNA扩增的HPRT的引物序列如下所述。PPIB正向引物：GGAAAGACTGTTCCAAAAACAGTG(SEQ ID NO:9)，PPIB反向引物：GTCTTGGTGCTCTCCACCTTCCG(SEQ ID NO：10)；HPRT正向引物：GTCAACGGGGGACATAAAAG(SEQ ID NO：11)，HPRT反向引物：CAACAATCAAGACATTCTTTCCA(SEQ ID NO：12)。所有操作均一式三份。
体内试验：所有动物试验均遵循由MIT实验动物管理委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committees)(IACUC)以及Sanford Burnham Prebys医学院动物安全和使用委员会通过的条款进行。本研究中实验室动物的所有住所和看护均符合NIH实验动物管理和使用指南(参见文件180F22)以及USDA所颁布的所有要求和规定，包括修订的动物福利法案(P.L.89-544)的实施规定(参见文件18-F23)。体内模型包括小鼠的穿透性脑部损伤。首先，移除小鼠颅骨的右侧半球中的直径5mm的部分。使用21号规格针以3×3的栅格点引入总计9处创伤，每处创伤的深度均为3mm。在引入损伤之后，将颅骨放回(图15)。在受伤6小时后，通过尾静脉向小鼠注射纳米颗粒构建体。为了定量向靶标损伤部位递送siRNA负载物的递送效率，将Dy677标记(λem＝700nm)的siRNA负载于Ca-pSiNP-PEG和Ca-pSiNP-DPNC中，分别将这些制剂注射至不同的小鼠中。在循环1小时后，灌注小鼠并收集器官。
使用常规的IVIS 200(xenogen)和Pearl Trilogy,Li-Cor成像系统获得收集的器官的荧光图像。
统计分析：本文中所示出的全部数据均以平均值±均值标准误差表示。使用双尾Student’s t检验进行显著性检验。除非另有说明，否则认为p<0.05具有统计显著性。
可替代的多孔硅金属硅酸盐芯-壳颗粒
另外还制备了可替代的芯-壳颗粒结构体，以供进一步研究和表征。图16示出了多孔硅微粒(pSiMP)的X射线衍射谱，该多孔硅微粒是通过在4M氯化钙、4M氯化镁和pH 9缓冲液的溶液中对经电化学蚀刻的多孔硅颗粒进行超声而生成的。经pH 9缓冲液处理的pSiMP的X射线衍射谱未显示出明显的峰，这表明pSiMP多数被氧化。由氯化镁形成的颗粒示出了很少的降解或氧化，但是却显示出了强的结晶硅的谱。该观察结果表明了很可能更强并且更稳定的镁-硅相互作用，这可能是由于金属的静电吸附或无定形硅的形成所致。由氯化钙形成的颗粒不仅显示出来自结晶硅的一些峰，而且显示出更多可能是来自结晶硅酸钙键合的峰。然而，通过与由镁形成的颗粒进行对比，这些峰的强度要小得多，这可能是由于硅基质周围所形成的壳更薄或更不均匀。
通过氮吸附-解吸等温分析对pSiMP(pH 9缓冲液)、Mg-pSiMP和Ca-pSiMP的孔结构进行表征(表1)。尽管经过热氧化的pSiMP不会发生进一步的结晶硅的氧化，但是通过孔体积的显著减小，可以观察到孔内钙层和镁层的形成。
表1由氮孔隙率测定进行的表面积、平均孔体积和平均孔径的BET和BJH计算。
如上所述，在硅酸钙形成过程中，由于有利的静电相互作用，阴离子分子(包括siRNA、微小RNA和钙黄绿素)能够以20重量％的负载效率负载于多孔硅颗粒上。还评价了阳离子或两性离子分子(如Ru(bpy)、氯霉素、万古霉素和罗丹明B)在多孔硅颗粒上的负载和释放。具体而言，两性离子(罗丹明B)分子或阳离子(Ru(bpy))分子的负载效率低于阴离子分子的负载效率，但是由于捕获机制却显示出更长的持续释放(图17A至17C)。图18A至18B示出了负载抗生素氯霉素和万古霉素的Ca-pSiNP的负载效率、释放动力学和光致发光曲线。所引入的药物分子在生理条件下逐渐释放，这与光致发光降低曲线相关，但是释放动力学在一定程度上慢于光致发光降低曲线。
本文提到的所有专利、专利出版物和其他公开的参考文献在此通过全文引用并入本文，如同其已经单独地并且特别地通过引用并入本文。
虽然已经提供了具体示例，但是以上描述为说明性的而非限制性的。先前描述的实施方案的特征的任意一者或多者可以以任意的方式与本发明中的任意其他实施方案的特征的一者或多者进行组合。此外，在阅读说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。因此，应该通过参考所附的权利要求以及它们的等同物的全部范围来确定本发明的范围。
序列表
<110> 斯宾纳克生物科学公司
加利福尼亚大学董事会
麻省理工学院
<120> 用于递送治疗剂的含金属硅酸盐的多孔硅材料
<130> 1804-00-008WO1
<150> US 62/322,782
<151> 2016-04-14
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> LIPID
<222> (1)..(1)
<223> 经十四烷酰基修饰的N-末端
<400> 1
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu Gly Gly Cys Cys
20 25 30
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 经5-羧基荧光素修饰的N-末端
<400> 2
Cys Cys Gly Gly Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Pro Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn
20 25 30
Gly
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 3
caaguuccau cgugucauct t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 4
gaugacacga uggaacuugt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 5
gaaagagcau cuauggugat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 6
ucaccauaga ugcucuuuct t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 7
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<400> 8
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 9
ggaaagactg ttccaaaaac agtg 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 10
gtcttggtgc tctccacctt ccg 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 11
gtcaacgggg gacataaaag 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (artificial sequence)
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 12
caacaatcaa gacattcttt cca 23

Claims (75)

1.一种用于递送治疗剂的组合物，包含：
含有多孔硅芯的颗粒；
位于所述多孔硅芯的表面上的层，该层包含金属硅酸盐；以及
治疗剂。
2.权利要求1所述的组合物，其中位于所述颗粒的表面上的层是通过用包含所述治疗剂和金属盐的水溶液处理多孔硅前体颗粒而形成的。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述水溶液中金属盐的浓度为至少0.1摩尔。
4.权利要求1所述的组合物，其中位于所述颗粒的表面上的层包含二价金属硅酸盐。
5.权利要求4所述的组合物，其中位于所述颗粒的表面上的所述层包含硅酸钙。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯的直径为约1nm至约1cm。
7.权利要求6所述的组合物，其中位于所述多孔硅芯的表面上的层的厚度为所述芯的直径的1％至90％。
8.权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒为光致发光颗粒。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述颗粒发射500nm至1000nm范围内的光。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经蚀刻的晶体硅材料。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经电化学蚀刻的晶体硅材料。
12.权利要求10所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经化学染色蚀刻的晶体硅材料。
13.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经蚀刻的微孔硅材料。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述经蚀刻的微孔硅材料包含平均孔径为至多约1nm的多个孔。
15.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经蚀刻的中孔硅材料。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述经蚀刻的中孔硅材料包含平均孔径为约1nm至约50nm的多个孔。
17.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含经蚀刻的大孔硅材料。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述经蚀刻的大孔硅材料包含平均孔径为约50nm至约1000nm的多个孔。
19.权利要求1所述的组合物，其中所述治疗剂为小分子药剂、维他命、显影剂、蛋白质、肽、核酸、低聚核苷酸、适体或它们的混合物。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述治疗剂为带负电的治疗剂。
21.权利要求20所述的组合物，其中所述治疗剂为低聚核苷酸。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述低聚核苷酸为DNA、RNA、siRNA或微小RNA。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述低聚核苷酸为RNA。
24.权利要求23所述的组合物，其中所述RNA为siRNA。
25.权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒包含靶向剂。
26.权利要求25所述的组合物，其中所述靶向剂为神经元靶向剂。
27.权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒包含细胞渗透剂。
28.权利要求27所述的组合物，其中所述细胞渗透剂为脂质化肽。
29.权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒包含靶向剂和细胞渗透剂。
30.权利要求1所述的组合物，其中所述多孔硅芯包含被氧化的多孔硅材料。
31.权利要求30所述的组合物，其中所述被氧化的多孔硅材料在高于150℃的温度下被氧化。
32.权利要求30所述的组合物，其中所述被氧化的多孔硅材料在空气中被氧化。
33.权利要求30所述的组合物，其中所述被氧化的多孔硅材料在溶液中通过与化学氧化剂反应而被氧化。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述化学氧化剂为水、硼酸盐、三(羟甲基)氨基乙烷、二甲基亚砜或硝酸盐。
35.一种药物组合物，包括权利要求1至34中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。
36.一种制备用于递送治疗剂的颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
提供多孔硅前体颗粒；
利用包含所述治疗剂和金属盐的水溶液处理所述多孔硅前体颗粒。
37.权利要求36所述的方法，其中所述水溶液中金属盐的浓度为至少0.1摩尔。
38.权利要求36所述的方法，其中所述金属盐为二价金属盐。
39.权利要求38所述的方法，其中所述金属盐为钙盐。
40.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒的直径为约1nm至约1cm。
41.权利要求40所述的方法，其中由所述处理形成的颗粒包括位于所述多孔硅前体颗粒的表面上的金属盐的层，该金属盐的层的厚度为所述前体颗粒的直径的1％至90％。
42.权利要求36所述的方法，其中由所述处理形成的颗粒为光致发光颗粒。
43.权利要求42所述的方法，其中由所述处理形成的颗粒发射500nm至1000nm范围内的光。
44.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经蚀刻的晶体硅材料。
45.权利要求44所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经电化学蚀刻的晶体硅材料。
46.权利要求44所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经化学染色蚀刻的晶体硅材料。
47.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经蚀刻的微孔硅材料。
48.权利要求47所述的方法，其中所述经蚀刻的微孔硅材料包含平均孔径为至多约1nm的多个孔。
49.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经蚀刻的中孔硅材料。
50.权利要求49所述的方法，其中所述经蚀刻的中孔硅材料包含平均孔径为约1nm至约50nm的多个孔。
51.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含经蚀刻的大孔硅材料。
52.权利要求51所述的方法，其中所述经蚀刻的大孔硅材料包含平均孔径为约50nm至约1000nm的多个孔。
53.权利要求36所述的方法，其中所述治疗剂为小分子药剂、维他命、显影剂、蛋白质、肽、核酸、低聚核苷酸、适体或其混合物。
54.权利要求53所述的方法，其中所述治疗剂为带负电的治疗剂。
55.权利要求54所述的方法，其中所述治疗剂为低聚核苷酸。
56.权利要求55所述的方法，其中所述低聚核苷酸为DNA、RNA、siRNA或微小RNA。
57.权利要求56所述的方法，其中所述低聚核苷酸为RNA。
58.权利要求57所述的方法，其中所述RNA为siRNA。
59.权利要求36所述的方法，还包括以下步骤：将所述多孔硅颗粒偶联至靶向剂，其中所述偶联步骤在所述处理步骤之前或之后进行。
60.权利要求59所述的方法，其中所述偶联步骤在所述处理步骤之后进行。
61.权利要求59所述的方法，其中所述靶向剂为神经元靶向剂。
62.权利要求36所述的方法，还包括以下步骤：将所述多孔硅颗粒偶联至细胞渗透剂，其中所述偶联步骤在所述处理步骤之前或之后进行。
63.权利要求62所述的方法，其中所述偶联步骤在所述处理步骤之后进行。
64.权利要求62所述的方法，其中所述细胞渗透剂为脂质化肽。
65.权利要求36所述的方法，还包括以下步骤：将所述多孔硅前体颗粒偶联至靶向剂和细胞渗透剂，其中所述偶联步骤在所述处理步骤之前或之后进行。
66.权利要求36所述的方法，其中所述多孔硅前体颗粒包含被氧化的多孔硅材料。
67.权利要求66所述的方法，其中所述被氧化的多孔硅材料在高于150℃的温度下被氧化。
68.权利要求66所述的方法，其中所述被氧化的多孔硅材料在空气中被氧化。
69.权利要求66所述的方法，其中所述被氧化的多孔硅材料在溶液中通过与化学氧化剂反应而被氧化。
70.权利要求69所述的方法，其中所述化学氧化剂为水、硼酸盐、三(羟甲基)氨基乙烷、二甲基亚砜或硝酸盐。
71.一种治疗方法，包括向有需要的受试者施用权利要求1至34中任一项所述的组合物。
72.权利要求71所述的方法，其中所述施用为肠胃外施用。
73.权利要求71所述的方法，其中所述施用靶向神经元组织。
74.权利要求71所述的方法，还包括监测所述受试者或者分离自所述受试者的组织的步骤。
75.权利要求74所述的方法，其中所述监测步骤为光学监测步骤。
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