ES2945433T3

ES2945433T3 - Coversina para el tratamiento de enfermedades ampollares autoinmunes

Info

Publication number: ES2945433T3
Application number: ES18726731T
Authority: ES
Inventors: Miles Andrew Nunn; Brihad Abhyankar; Christian David Sadik
Original assignee: Volution Immuno Pharmaceuticals SA
Current assignee: Volution Immuno Pharmaceuticals SA
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2023-07-03
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: US20240009270A1; PL3612208T3; IL269895B2; EP3612208B1; KR102656199B1; DK3612208T3; KR20190139233A; WO2018193122A1; US20200113971A1; JP2023040169A; IL269895B1; CN110896606A; IL269895A; CN110896606B; US11730792B2; EP4275696A1; JP2020517627A; CA3059657A1; EP3612208A1; DK3612208T5

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar o prevenir AIBD. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Coversina para el tratamiento de enfermedades ampollares autoinmunes

CAMP0 DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a diversos agentes que se usan en el tratamiento y la prevención de enfermedades ampollares autoinmunes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Complemento

[0002] El sistema del complemento es una parte esencial del mecanismo de defensa natural del cuerpo frente a las invasiones externas y también interviene en el proceso inflamatorio. Más de 30 proteínas del suero y de la superficie celular participan en el funcionamiento y la regulación del sistema del complemento. Recientemente se ha puesto de manifiesto que, además de los aproximadamente 35 componentes conocidos del sistema del complemento, que pueden estar asociados tanto con procesos beneficiosos como con procesos patológicos, el propio sistema del complemento interactúa con al menos 85 vías biológicas con funciones tan diversas como la angiogénesis, la activación plaquetaria, el metabolismo de la glucosa y la espermatogénesis.

[0003] El sistema del complemento se activa por la presencia de antígenos extraños. Existen tres vías de activación: (1) la vía clásica, que es activada por complejos de IgM e IgG o por el reconocimiento de carbohidratos; (2) la vía alternativa, que es activada por superficies ajenas (que carecen de moléculas reguladoras específicas) y por endotoxinas bacterianas; y (3) la vía de las lectinas, que se activa por la unión de la 'lectina de unión a manosa' (MBL) a residuos de manosa en la superficie de un patógeno. Las tres vías comprenden cascadas paralelas de eventos que dan como resultado la producción de la activación del complemento mediante la formación de convertasas C31 y C5 similares en las superficies celulares, lo que provoca la liberación de mediadores agudos de la inflamación (C3a y C5a) y la formación del complejo de ataque a membrana (MAC). 1 Es habitual referirse a los componentes de la vía del complemento con la letra 'C' seguida de un número, como '3', de modo que 'C3' se refiere al tercer componente del sistema del complemento. Algunos de estos componentes se escinden durante la activación del sistema del complemento y los productos de la escisión se indican con letras minúsculas después del número. Así, C5 se escinde en fragmentos que convencionalmente se denominan 'C5a' y 'C5b'. Las proteínas del complemento no actúan necesariamente según su orden numérico, por lo que el número no indica necesariamente el orden de acción. En la presente solicitud se utiliza esta convención de nomenclatura.

[0004] En la Figura 1 se muestran las cascadas paralelas que intervienen en la vía clásica y la vía alternativa.

[0005] En el presente documento, la vía clásica del complemento, la vía alternativa del complemento y la vía de las lectinas del complemento se denominan de manera conjunta 'vías del complemento'. C5b inicia los eventos 'tardíos' de la activación del complemento. Estos comprenden una secuencia de reacciones de polimerización en las que los componentes terminales del complemento interactúan para formar el MAC, que crea un poro en las membranas celulares de algunos patógenos que puede provocar la muerte de estos. Los componentes terminales del complemento incluyen a C5b (que inicia el ensamblaje del sistema de ataque a membrana), C6, C7, C8 y C9.

LTB4

[0006] El leucotrieno B4 (LTB4) es el eicosanoide quimiotáctico y quimiocinético más potente que se ha descrito y favorece la adhesión de los neutrófilos al endotelio vascular mediante la sobrerregulación de las integrinas [1]. También es un secretagogo completo para los neutrófilos, induce su agregación y aumenta la permeabilidad microvascular. El LTB4 recluta y activa las células asesinas naturales, los monocitos y los eosinófilos. Aumenta la formación de radicales superóxido [2] y modula la expresión génica, lo que incluye la producción de una serie de citoquinas y mediadores proinflamatorios que pueden aumentar y prolongar la inflamación tisular [3,4]. El LTB4 también desempeña diversas funciones en la inducción y la gestión de las respuestas inmunitarias adaptativas. Por ejemplo, la regulación del tráfico de células dendríticas hacia los ganglios linfáticos de drenaje [5,6], la producción de citocinas Th2 IL-13 a partir de células T pulmonares [7], el reclutamiento de células T efectoras CD8+ específicas de antígeno [8] y la activación y proliferación de linfocitos B humanos [9].

[0007] El leucotrieno B4 (LTB4) y los hidroxieicosanoides median sus efectos a través de los receptores BLT1 y BLT2 acoplados a proteínas G [10,11]. El BLT1 humano es un receptor de alta afinidad (Kd 0,39 - 1,5nM; [12]) específico para el lTB4 y sólo el 20-hidroxi LTB4 y el 12-epi LTB4 son capaces de desplazar al LTB4 en estudios de unión competitiva [13]. El BLT2 humano tiene una afinidad 20 veces menor (Kd 23nM) por el LTB4 que el BLT1 y se activa al unirse a una gama más amplia de eicosanoides, incluidos el 12-epi LTB4, el 20-hidroxi LTB4, el 12(S)- y el 15(S)-HETE y el 12(S)- y el 15(S)-HPETE [13]. El BLT2 humano tiene un 45,2 y un 44,6% de identidad aminoacídica con el BLT1 humano y de ratón, mientras que el BLT2 humano y de ratón tienen un 92,7% de identidad [11].

[0008] El BLT1 humano se expresa principalmente en la superficie de los leucocitos, aunque recientemente se ha descrito en células endoteliales y células del músculo liso vascular. El BLT2 humano se expresa en una gama más amplia de tipos de células y tejidos. Se han descrito varios antagonistas específicos de BLT1 y BLT2 que inhiben la activación, la extravasación y la apoptosis de neutrófilos humanos [14] y reducen los síntomas causados por la infiltración de neutrófilos en modelos de ratón de artritis inflamatoria [15] y reperfusión de isquemia renal [16]. Cada vez más estudios indican que tanto BLT1 como BLT2 pueden mediar efectos patológicos a través de LTB4 e hidroxieicosanoides [17], aunque indudablemente BLT1 tiene un papel dominante en algunas patologías como la artritis inducida por colágeno en ratones [18]. Los ratones con deficiencia de BLT1-/- también han puesto de manifiesto la importancia del BLT1 para dirigir la migración de neutrófilos en las respuestas inflamatorias. Más concretamente, se utilizó una cepa de ratón con deficiencia de 5L0 para demostrar que es necesaria la activación autocrina del BLT1 en los neutrófilos para su reclutamiento en las articulaciones artríticas [19].

[0009] Se comercializan diversos fármacos que actúan sobre los eicosanoides. Entre ellos se encuentran los glucocorticoides, que modulan la fosfolipasa A2 (PLA2) e inhiben así la liberación del ácido araquidónico (AA), precursor de los eicosanoides [20], los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y otros inhibidores de la C0X2 que impiden la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos [21]. También hay una serie de modificadores de LK que inhiben la enzima 5-L0 necesaria para la síntesis de lTb4 (Zileuton; [22]) o antagonizan el receptor CysLT1 que media los efectos de los cisteinil-leucotrienos (Zafirlukast y Montelukast) [23]. Los modificadores de LK están disponibles por vía oral y han sido aprobados por la FDA para su uso en el tratamiento del asma, por ejemplo. Todavía no se ha comercializado ningún fármaco que actúe específicamente sobre el LTB4 o sus receptores.

Enfermedades ampollares autoinmunes (EAAs)

[0010] La piel, el órgano más grande del cuerpo, está formada por cinco capas distintas. La epidermis es la capa protectora más externa de la piel y se adhiere a la dermis, que se encuentra entre la epidermis (con la que forma el cutis) y los tejidos subcutáneos. La dermis está formada principalmente por tejido conjuntivo denso e irregular y está estrechamente unida a la epidermis a través de una membrana basal. Se necesitan estructuras y proteínas especializadas para que la dermis y la epidermis se adhieran, y la separación de estas capas produce ampollas o flictenas.

[0011] En circunstancias normales, las ampollas se desarrollan en respuesta a una irritación o lesión de la piel, pero en las enfermedades ampollosas autoinmunes (EAAs) las ampollas surgen porque los autoanticuerpos atacan a las proteínas estructurales desmosómicas o hemidesmosómicas. Estas proteínas son esenciales para el correcto funcionamiento de la zona de la membrana basal (ZMB). En las EAAs, la adhesión de la epidermis y la dermis queda dañada como consecuencia del ataque de los autoanticuerpos a estructuras o proteínas específicas, de modo que al final la epidermis y la dermis se separan y se forman ampollas.

[0012] Las EAAs constituyen, por tanto, un grupo de trastornos autoinmunes en los que surgen lesiones ampollares -que afectan principalmente a la piel- debido a autoanticuerpos dirigidos contra antígenos de la piel. En algunas EAAs también pueden formarse ampollas en las membranas mucosas (por ejemplo, en el esófago, el ano, la boca, los conductos nasales, los genitales y la garganta).

[0013] Los factores de riesgo para el desarrollo de EAAs incluyen la edad avanzada, los tratamientos farmacológicos, las infecciones víricas y la exposición a la radiación UV o los rayos X.

[0014] Los síntomas específicos y la gravedad de las enfermedades ampollares varían de una persona a otra y, en algunos casos, las lesiones ampollares pueden cubrir una parte considerable de la piel. Las EAAs no tienen cura, pero sí que hay tratamientos. Sin dichos tratamientos, las enfermedades pueden causar complicaciones potencialmente mortales.

[0015] Existen varias categorías diferentes de EAAs, entre las que se incluyen el pénfigo, el penfigoide, las dermatosis mediadas por IgA y la epidermólisis bullosa adquirida (EBA). El pénfigo, el penfigoide y las dermatosis mediadas por IgA pueden dividirse asimismo en otros subtipos adicionales.

[0016] 'Pénfigo' es un término general para un grupo de EAAs relacionadas que están causadas por una reacción autoinmune contra las desmogleínas mediada por anticuerpos. Los dos tipos principales de pénfigo son el pénfigo vulgar y el pénfigo foliáceo.

[0017] El pénfigo vulgar es la forma más común de pénfigo y se caracteriza por sus autoanticuerpos contra la Dsg3 (aproximadamente el 50% de los pacientes también tienen autoanticuerpos contra la Dsg1) y por sus ampollas, que se rompen con facilidad y causan erosiones dolorosas. En la mayoría de los casos, el pénfigo vulgar se desarrolla primero en la boca, seguido de ampollas en la piel, aunque cualquier zona puede verse potencialmente afectada.

[0018] El pénfigo foliáceo se caracteriza por sus múltiples ampollas pequeñas que se rompen rápidamente y forman lesiones pruriginosas, escamosas y con costra que afectan a la capa más superficial de la piel. Suele afectar primero al rostro y el cuero cabelludo. Con el tiempo, puede afectar al pecho y la parte superior de la espalda. Normalmente, las lesiones no son dolorosas. Normalmente, las mucosas no se ven afectadas. Estos pacientes tienen autoanticuerpos contra la Dsg1.

[0019] Existen otros trastornos adicionales que a veces se clasifican como subtipos de pénfigo, como el pénfigo paraneoplásico (que es una EAA derivada de un tumor, con autoanticuerpos contra la Dsg1 y la Dsg3, por ejemplo) y el pénfigo IgA (con autoanticuerpos contra la desmocolina).

[0020] El término 'penfigoide' se usa para referirse a un grupo de enfermedades relacionadas que se caracterizan por sus erupciones cutáneas ampollosas. Las principales formas de penfigoide son el penfigoide ampollar, el penfigoide de las membranas mucosas y el penfigoide gestacional.

[0021] El penfigoide ampollar (PA) es una enfermedad crónica de la piel que se caracteriza por el prurito y las ampollas subepidérmicas rígidas. Se observan autoanticuerpos contra el antígeno BP180 (también llamado distonina) y su dominio NC16A (situado en el colágeno XVII). Este antígeno diana es un antígeno hemisdesmosómico. Al cabo de unas semanas, las ampollas a menudo se extienden a la ingle, la axila, el abdomen y la piel de los músculos flexores, y las lesiones pueden generalizarse hasta cubrir una parte considerable de la piel y pueden formarse ampollas dentro de la boca. En la mayoría de los casos, las mucosas no se ven afectadas y, cuando sí lo están, suelen curarse rápidamente. Las lesiones del penfigoide ampollar se asocian a menudo con un intenso picor.

[0022] El penfigoide de las membranas mucosas (PMM) (también llamado 'penfigoide cicatricial' [PC]) también se asocia con la formación de ampollas subepidérmicas y afecta principalmente a las mucosas (sobre todo la boca y los ojos, pero también pueden verse afectados la nariz, la garganta, los genitales y el ano). Los síntomas del PMM varían entre los individuos afectados dependiendo de la zona o zonas específicas afectadas y de la evolución de la enfermedad. Los autoantígenos se dirigen de nuevo contra el BP180, pero también se han identificado otros autoantígenos.

[0023] La epidermólisis bullosa adquirida es relativamente rara. En esta dolencia también se observa la separación dermoepidérmica que se observa en el PA. Los autoanticuerpos contra el colágeno de tipo VII (que forma fibrillas de anclaje que conectan la epidermis y la ZMB con la dermis papilar) son característicos de este trastorno autoinmune de la piel que normalmente afecta a personas de mediana edad y a ancianos.

[0024] La mayoría de las formas se dan en individuos de mediana edad, normalmente personas de 50 y 60 años. Sin embargo, las enfermedades ampollares autoinmunes pueden afectar a individuos de cualquier edad, incluidos los niños. La incidencia y prevalencia globales de estas afecciones varía en función de la población específica estudiada. El penfigoide ampollar, por ejemplo, es la enfermedad inmunoampollosa más común en Europa 0ccidental, con una incidencia registrada de 43 por millón al año en el Reino Unido y de 7-13 por millón al año en otras partes de Europa [24].

[0025] El diagnóstico de las EAAs se basa en la evaluación clínica y en un historial detallado del paciente, así como en la identificación de los autoanticuerpos característicos, por ejemplo en la sangre o en una biopsia de piel. El método preferido de diagnóstico son los ensayos inmunofluorescentes.

[0026] Actualmente no existe cura para estos trastornos, pero pueden controlarse, por ejemplo con corticosteroides como la prednisona. Es posible que los tratamientos no se toleren bien y conlleven toxicidad [24]. A modo de ejemplo, la terapia sistémica con corticosteroides (por ejemplo, prednisona y prednisolona) puede ser eficaz, pero no lo es en todos los casos y el tratamiento a largo plazo con altas dosis de corticosteroides puede provocar efectos secundarios graves. Los esteroides son agentes antiinflamatorios generales y no específicos. En muchas de estas enfermedades se utilizan otros inmunosupresores como 'puente', ya que los sujetos no pueden seguir recibiendo dosis altas de esteroides a largo plazo.

[0027] También se utilizan corticosteroides tópicos, pero su uso en enfermedades prolongadas puede verse limitado por factores prácticos (como la capacidad del paciente para aplicarse el tratamiento) y pueden estar asociados con una absorción sistémica y efectos adversos. También se han utilizado fármacos inmunosupresores (por ejemplo, dapsona, metilprednisolona, micofenolato, azatioprina o ciclofosfamida) y terapias biológicas inmunosupresoras (por ejemplo, rituximab e inmunoglobulina G intravenosa [IGIV]), pero estos pueden tener efectos adversos.

[0028] Por consiguiente, se necesitan nuevas terapias para tratar y prevenir las EAAs.

Inhibidores del complemento

[0029] El documento WO 2004/106369 (Evolutec Limited [25]) se refiere a los inhibidores del complemento. Un subconjunto particular de los inhibidores del complemento desvelados se dirige a C5 e impide que C5 se escinda en C5a y C5b por medio de cualquiera de las vías de activación del complemento. Un ejemplo particular de estos inhibidores de la escisión de C5 es una proteína producida por garrapatas de la especie '0rnithdoros moubata', que es una proteína que se compone de los aminoácidos 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4 del documento WO 2004/106369. En el documento WO 2004/106369, esta proteína se conoce con los nombres 'EV576' y 'proteína 0mCI' y, más recientemente, se conoce como 'Coversina' (ver, por ejemplo, Jore et. al., Nature Structural & Molecular Biology, 'Structural basis for therapeutic inhibition of complement C5', publicado online el 28 de marzo de 2016 - doi:10.1038/nsmb. 3196). En el presente documento, esta proteína se denomina 'Coversina'.

[0030] En la garrapata, la Coversina se expresa como una preproteína que tiene una secuencia líder que comprende los aminoácidos 1 a 18 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4 del documento WO 2004/106369 en el extremo N-teminal de la proteína Coversina madura. La secuencia líder se fragmenta tras la expresión. La proteína madura tiene la secuencia formada por los aminoácidos 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4 del documento WO 2004/106369 y en la Figura 2 de la presente solicitud.

[0031] La Coversina también tiene la capacidad de inhibir la actividad del leucotrieno B4 (LTB4). La capacidad de unirse al LTB4 puede demostrarse mediante ensayos 'in vitro' estándar conocidos en este campo, por ejemplo mediante un ensayo ELISA competitivo entre la Coversina y un anticuerpo anti-LTB4 que compiten por unirse al LTB4 marcado, mediante calorimetría de titulación isotérmica o mediante titulación por fluorescencia. Existen otras solicitudes de patente, como WO 2007/028968, WO 2008/029167, WO 2008/029169, WO 2011/083317 y WO 2016/198133, que se refieren al uso de la Coversina o de equivalentes funcionales de la misma en diversas aplicaciones. El documento WO 2015/185760 desvela que la Coversina y sus equivalentes estructurales son eficaces para prevenir la escisión de polimorfos de C5, por ejemplo, que reducen la eficacia terapéutica del eculizumab, un inhibidor del complemento C5 comercializado. En estas solicitudes no se desvela el uso de Coversina ni de ningún otro equivalente funcional de la misma en el tratamiento de EAAs.

[0032] Se ha analizado el papel potencial de la vía del complemento en el contexto de las EAAs, pero ningún tratamiento actual de las EAAs actúa sobre el complemento, y la fisiopatología de estas enfermedades no se comprende del todo. También hay pruebas de que la formación de ampollas puede inducirse directamente y sin activación del complemento [26], y sobre esta base se han sugerido en este campo nuevas terapias dirigidas al bloqueo de la unión de autoanticuerpos, más que a la prevención de la activación del complemento [26]. Además, la C5a exógena o la IL-17A no pueden contrarrestar la resistencia a la inflamación cutánea -similar a la enfermedad penfigoide- en ratones Ltb4r1 -/-[27].

[0033] De manera similar, se ha analizado el papel del LTB4 en las EAAs, y más específicamente en el contexto del reclutamiento de neutrófilos en estas enfermedades, pero, de nuevo, actualmente no existen tratamientos aprobados para estas afecciones que estén dirigidos a esta molécula.

[0034] Por el contrario, en los trabajos que han dado lugar a la presente invención, se ha demostrado que la molécula Coversina, que se une al LTB4 y que también inhibe la vía del complemento uniéndose a C5, tal y como se ha explicado anteriormente, reduce el área de superficie corporal afectada (ABSA) con ampollas en un modelo de ratón de EAA. La coversina tiene la capacidad de inhibir tanto el complemento (mediante la inhibición de C5) como el LTB4 y, por lo tanto, resulta particularmente ventajosa para la prevención y el tratamiento de las EAAs, ya sea sola o en combinación con otros tratamientos de EAAs.

[0035] Heimbach et al., (2011), Journal of Biological Chemistry, vol. 286, n.° 17, explican que el receptor de C5a de los mastocitos es fundamental para el penfigoide ampollar, una enfermedad ampollar autoinmune. Mihai et al., (2011), Molecular Immunology, vol. 48, n° 14, explican que la inhibición específica de la activación del complemento mejora significativamente la enfermedad ampollar autoinmune en ratones.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0036] La invención se especifica en las reivindicaciones anexas.

[0037] En el presente documento, todas las referencias a métodos de tratamiento se refieren a agentes que se usan en dichos métodos de tratamiento.

[0038] Se ha demostrado que la Coversina reduce el porcentaje de superficie corporal afectada (ABSA) en un modelo de ratón de EBA. En el Ejemplo 1, se demostró que la administración de Coversina antes y durante la inducción de la enfermedad provocaba una reducción del porcentaje de ABSA (que se estableció determinando las áreas de la piel que presentaban eritema, ampollas, erosiones, costras o alopecia y calculando el porcentaje de la superficie corporal total afectada por las lesiones cutáneas [ABSA]) en comparación con los ratones que no fueron tratados con Coversina. En comparación con otros experimentos similares en los que se habían utilizado otros agentes (Zileuton y metilprednisolona), se observó un mayor efecto con la administración de Coversina y esto resultó particularmente evidente en las concentraciones más altas (por ejemplo, 2,5 mg/kg y 0,25 mg/kg). Por consiguiente, la Coversina parece ser más eficaz que un inmunosupresor sistémico que se utiliza actualmente en el tratamiento de EAAs (metilprednisolona), y más eficaz que un inhibidor del LTB4 (Zileuton). También se ha demostrado (Ejemplo 2) que la administración de Coversina tras la inducción de la enfermedad también puede provocar una reducción del porcentaje de ABSA. Por consiguiente, la doble actividad inhibidora de la Coversina, dirigida tanto al C5 como al LTB4, parece ser particularmente ventajosa en el tratamiento de las EAAs.

[0039] Se llevaron a cabo experimentos profilácticos utilizando un polipéptido de Coversina modificado que tiene una actividad de unión al C5 reducida o nula, pero que conserva la capacidad de unión al LTB-4. También se observó una reducción del porcentaje de ABSA al utilizar este agente.

[0040] Por consiguiente, los autores de la presente invención han demostrado que la administración de la proteína de garrapata Coversina (también denominada EV576 y OmCI en la técnica y en el presente documento [25]) puede usarse para tratar o prevenir el pénfigo ampollar y la epidermólisis bullosa adquirida.

[0041] La invención proporciona un agente para su uso en un método para tratar o prevenir en un sujeto el penfigoide ampollar o la epidermólisis bullosa adquirida, de manera que el agente es una proteína, que es:

(i) una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2,

(ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une a C5 para evitar la escisión del complemento C5 -mediante la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4, de manera que el sujeto es un humano.

[0042] La invención también proporciona un agente para su uso en un método para tratar o prevenir en un sujeto el penfigoide ampollar o la epidermólisis bullosa adquirida, de manera que el agente es una molécula de ácido nucleico que codifica:

(ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une a C5 para evitar la escisión del complemento C5 -mediante la C5 convertasaen el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4, de manera que el sujeto es un humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Enfermedades

[0043] El sujeto puede tener, ser sospechoso de tener o estar en riesgo de desarrollar una EAA, que es un penfigoide ampollar (PA) o una epidermólisis bullosa adquirida (EBA).

[0044] Otras EAAs, cuyo tratamiento no forma parte de la invención, son el pénfigo, el penfigoide y las dermatosis mediadas por IgA. El pénfigo puede ser pénfigo vulgar o pénfigo foliáceo. El 'penfigoide' puede ser penfigoide ampollar, penfigoide de las membranas mucosas y/o penfigoide gestacional. El modelo de ratón que se usa en los Ejemplos es un modelo para la EBA, pero también proporciona información sobre otras EAAs, en particular sobre el penfigoide ampollar. El mecanismo causante es similar para todas las EAAs, es decir, la formación de complejos inmunitarios y la puesta en marcha de una respuesta inmunitaria con una implicación especialmente intensa de los neutrófilos y/o los eosinófilos.

[0045] La presencia de estas enfermedades puede determinarse mediante un diagnóstico rutinario bien conocido en este campo (ver, por ejemplo, [28]).

[0046] Los sujetos con riesgo de desarrollar EAAs pueden beneficiarse de la administración de los agentes que se usan de acuerdo con la invención, a fin de prevenir las EAAs. Los factores de riesgo de las EAAs, y más particularmente del penfigoide ampollar, incluyen factores genéticos y otros factores inductores [29]. Existen informes sobre la predisposición genética, y se refieren a la presencia del gen HLA-DQB1*0301 del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II) en pacientes con PA y penfigoide de las membranas mucosas. El polimorfismo en el gen de la ATP sintasa 8 codificada mitocondrialmente (MT-ATP8) puede tener una asociación con la patogénesis del PA. También se incluyen el polimorfismo del gen CYP2D6 y el polimorfismo de FC-gamma R IIIa.

[0047] Otros factores inductores incluyen:

1. Fármacos: La mayoría de los medicamentos inductores del PA contienen o liberan grupos sulfhidrilos (penicilamina, captopril, penicilina y sus derivados, furosemida y algunas cefalosporinas). También se ha señalado que inducen el PA los fármacos que contienen un anillo fenólico (algunas cefalosporinas y el ácido acetilsalicílico), los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina que son distintos al captopril, la mayoría de los antiinflamatorios no esteroideos, los inmunomoduladores como las vacunas, los inhibidores de la dipeptidil peptidasa-IV (gliptinas), especialmente la vildagliptina, y los bloqueantes del TNF-a.

2. Virus: después de la vacunación.

3. Irradiación UV o de rayos X.

[0048] Aproximadamente un tercio de los pacientes con PA padecen una enfermedad neuropsiquiátrica, ictus, demencia, Parkinson, etc.

[0049] En cuanto al tratamiento o la prevención de las EAAs, se prefieren los sujetos que presentan uno o más de estos factores de riesgo.

Resultados de la administración

[0050] Como resultado del tratamiento, el sujeto puede presentar una incidencia reducida de los síntomas, un alivio de los síntomas, una inhibición o retraso de la aparición o reaparición de los síntomas, o una combinación de estos. Preferiblemente, el tratamiento produce una reducción de los síntomas típicos de la enfermedad. Por ejemplo, esto puede manifestarse en la reducción del tamaño de las ampollas, la reducción del número de ampollas, la reducción del porcentaje de la superficie corporal afectada, la reducción del grado de supuración de las ampollas, la reducción del prurito, o la reducción de la incidencia y/o la gravedad de la infección resultante de las ampollas. Una parte de los sujetos presentará una resolución completa de los síntomas y no tendrá más recaídas.

[0051] La puntuación clínica puede obtenerse usando el índice de actividad de la enfermedad penfigoide ampollar (BPDAl) [30]. El BPDAI global se compone de 2 puntuaciones: la actividad total del BPDAI y el daño del BP^dA ⁱ. La puntuación total de la actividad del BPDAI es la suma aritmética de los 3 subcomponentes: las ampollas/erosiones cutáneas, la urticaria cutánea/el eritema cutáneo, y las ampollas/erosiones de las mucosas.

[0052] La puntuación de daño del BPDAI es la suma aritmética de los elementos valorados regionalmente para el daño causado por las propiedades más permanentes como la hiperpigmentación postinflamatoria, las cicatrices y otras. El BPDAI cuantifica el número de lesiones y los umbrales de tamaño. Las lesiones se valoran en función de las regiones afectadas. El BPDAI da más importancia a las zonas de la piel principalmente afectadas en el PA, como las extremidades, y da menos importancia al cuero cabelludo y la cara, para diferenciar mejor la respuesta clínica en el PA.

[0053] Las puntuaciones globales del BPDAI pueden ser de entre 0 y 372: hasta 360 para la actividad del BPDAI (un máximo de 240 para la actividad cutánea total [120 para las erosiones/ampollas, 120 para urticarias/eritemas] y 120 para la actividad de las mucosas), y de 0 a 12 para el daño del BPDAI, de manera que las puntuaciones más altas indican un mayor daño o una mayor actividad de la enfermedad. La puntuación global del BPDAI se usará para evaluar la inclusión de los sujetos.

[0054] El BPDAI también tiene una medida subjetiva adicional conocida como Índice de prurito del BPDAI. El componente de prurito del BPDAI se basa en una escala analógica visual que mide la gravedad del picor durante las últimas 24 h (0-10), la última semana (0-10) y el último mes (0-10), con una puntuación total de 30.

[0055] Preferiblemente, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de uno o más signos medidos por el Índice de actividad de la enfermedad penfigoide ampollar (BPDAI). Preferiblemente, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de uno o más (por ejemplo, 2 o 3) de los siguientes: las ampollas/erosiones cutáneas, las urticarias/eritemas cutáneos, y las ampollas/erosiones de las mucosas.

[0056] En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de las ampollas/erosiones cutáneas. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de la urticaria/el eritema cutáneos. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de las ampollas/erosiones de las mucosas. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de las ampollas/erosiones cutáneas y la urticaria/el eritema cutáneos. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de la urticaria/el eritema cutáneos y las ampollas/erosiones de las mucosas. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación de las ampollas/erosiones cutáneas y las ampollas/erosiones de las mucosas. En una realización, el tratamiento produce una reducción en la puntuación del índice de prurito del BPDAI.

[0057] En algunas realizaciones, los efectos pueden estar mediados por la reducción o la prevención de la participación de los neutrófilos y/o los eosinófilos.

[0058] El tratamiento también puede aumentar el período de latencia antes del inicio de una o más etapas de la enfermedad, o entre la evolución de las etapas de la enfermedad. En algunas realizaciones puede prevenirse la formación de ampollas.

[0059] El tratamiento también puede dar como resultado una reducción del título de anticuerpos autoinmunes.

[0060] El tratamiento también puede dar como resultado una reducción de la cantidad o la duración de un segundo tratamiento para la EAA que sea necesario.

[0061] El agente que se usa de acuerdo con la invención puede usarse en combinación con otros tratamientos para EAAs, tal y como se ha explicado anteriormente. La combinación del agente que se usa de acuerdo con la invención con el otro -aquí denominado 'segundo'- tratamiento para EAAs puede ser tal que la cantidad del segundo tratamiento para EAAs se reduce en comparación con la cantidad que se usa en ausencia del tratamiento con el agente que se usa de acuerdo con invención, o bien la duración del tratamiento para la segunda EAA se reduce en comparación con la duración del tratamiento que se utiliza en ausencia del tratamiento con el agente que se usa de acuerdo con la invención. Esto resulta ventajoso en vista de los efectos secundarios que conllevan algunos tratamientos conocidos -como los esteroides-, por ejemplo: infecciones, diabetes mellitus, osteoporosis, trombosis o úlceras gastrointestinales.

[0062] Preferiblemente, el segundo tratamiento para EAAs se selecciona de entre los siguientes: terapia sistémica con corticosteroides, terapia tópica con corticosteroides, terapia inmunosupresora y terapia biológica inmunosupresora.

[0063] Preferiblemente, el corticosteroide se selecciona de entre la prednisona y la prednisolona. Preferiblemente, la terapia inmunosupresora se selecciona de entre los siguientes compuestos: metilprednisolona, micofenolato, azatioprina, antibióticos antiinflamatorios (por ejemplo, dapsona) y ciclofosfamida. Preferiblemente, las terapias biológicas inmunosupresoras se seleccionan de entre el rituximab y la inmunoglobulina G intravenosa (IGIV).

[0064] Cuando se utilizan el agente que se usa de acuerdo con la invención y un segundo tratamiento para EAAs, estos pueden administrarse juntos o por separado. El agente que se usa de acuerdo con la invención puede administrarse en primer lugar y el segundo tratamiento para EAAs puede administrarse en segundo lugar, o viceversa.

[0065] Cuando el tratamiento produce una reducción de la cantidad del segundo tratamiento para EAAs, o de la duración del tratamiento para la segunda EAA, la reducción puede ser de hasta -o de al menos- un 10, un 20, un 30, un 40, un 50, un 60, un 70 o un 80% en comparación con la cantidad del segundo tratamiento para EAAs que se utiliza en ausencia del agente que se usa de acuerdo con la invención.

Sujetos

[0066] En la invención reivindicada, el sujeto es un ser humano. Los agentes preferidos para su uso de acuerdo con la invención, las dosis y otros aspectos similares son tal y como se describen en el presente documento.

[0067] Cualquier referencia a cualquier reducción o aumento es una reducción o aumento en un parámetro de la enfermedad que se compara con el mencionado sujeto en ausencia del tratamiento. Preferiblemente, el parámetro puede cuantificarse y, cuando este sea el caso, preferiblemente el aumento o la reducción son estadísticamente significativos. Por ejemplo, el aumento o la reducción pueden ser de al menos un 3, un 5, un 10, un 15, un 20, un 30, un 40, un 50% o más en comparación con el parámetro en ausencia del tratamiento (por ejemplo, antes de iniciar el mencionado tratamiento).

[0068] El sujeto a quien se le administra el agente que se usa de acuerdo con la invención durante la puesta en práctica de la invención es un ser humano. El sujeto humano a quien se le administra el agente que se usa de acuerdo con la invención está en riesgo de padecer una EAA o es un sujeto humano que padece una EAA.

[0069] Los métodos desvelados pero no reivindicados también pueden comprender uno o más pasos adicionales: (i) determinar si el sujeto está en riesgo de padecer o padece la EAA, (ii) determinar la gravedad de la EAA, lo cual puede llevarse a cabo antes y/o después de administrar la Coversina.

El agente que se usa en la invención

[0070] El agente que se usa en la invención es una proteína o una molécula de ácido nucleico que es, o codifica:

(ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une a C5 para evitar la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4.

[0071] El agente puede ser la propia Coversina o un equivalente funcional de la misma, tal y como se especifica en las reivindicaciones. En adelante, el término 'proteína de tipo Coversina' se usará como abreviación de “una proteína que comprende los aminoácidos 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), o (i) una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, o (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une a C5 para evitar la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4”.

[0072] La Coversina se aisló de las glándulas salivales de la garrapata '0rnithodoros moubata'. La coversina es un miembro periférico de la familia de las lipocalinas y es el primer miembro de la familia de las lipocalinas que, según se ha demostrado, inhibe la activación del complemento. La coversina inhibe la vía clásica del complemento, la vía alternativa del complemento y la vía de las lectinas del complemento uniéndose a C5 e impidiendo su escisión -por parte de la C5 convertasa- en C5a y C5b, inhibiendo así tanto la producción de C5a, que es un péptido activo (por ejemplo, proinflamatorio), como la formación del MAC. Se ha demostrado que la coversina se une al C5 -e impide su escisión por parte de la C5 convertasa- en el suero de rata, de ratón y de humanos con un IC₅₀de aproximadamente 0,02 mg/ml.

[0073] Por consiguiente, una proteína de tipo Coversina puede comprender o estar formada por los aminoácidos 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o por los aminoácidos 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Los primeros 18 aminoácidos de la secuencia de proteínas de la Figura 2 forman una secuencia señal que no es necesaria para la unión al C5 ni para la actividad de unión al LTB4, por lo que, opcionalmente, puede prescindirse de ella, por ejemplo para aumentar la eficacia de la producción de proteína recombinante.

[0074] Se ha demostrado que la proteína Coversina se une al C5 con una Kd de 1nM, determinada mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) [31]. Los péptidos de tipo Coversina conservan la capacidad de unirse al C5, preferiblemente con una Kd de menos de 360 nM, más preferiblemente menos de 300 nM, más preferiblemente menos de 250 nM, preferiblemente menos de 200 nM, más preferiblemente menos de 150 nM, más preferiblemente menos de 100 nM, incluso más preferiblemente menos de 50, 40, 30, 20 o 10 nM, y de manera ventajosa menos de 5nM, de manera que la mencionada Kd se determina usando resonancia de plasmón superficial, preferiblemente de acuerdo con el método descrito en [31].

[0075] La coversina inhibe la vía clásica del complemento, la vía alternativa del complemento y la vía de las lectinas del complemento. Preferiblemente, una proteína de tipo Coversina se une al C5 de tal manera que estabiliza la conformación global del C5 pero no bloquea directamente el sitio de escisión de C5 al que se dirigen las C5 convertasas de las tres vías de activación. La unión de la Coversina al C5 da como resultado la estabilización de la conformación global del C5 pero no bloquea el sitio de escisión de la(s) convertasa(s).

[0076] La enzima C5 convertasa escinde el C5 (Figura 1). Los productos de esta escisión incluyen una anafilatoxina (C5a) y un complejo lítico (C5b) que promueve la formación de un complejo de C5b, C6, C7, C8 y C9, también conocido como 'complejo de ataque a membrana' (MAC). El C5a es un péptido altamente proinflamatorio que participa en numerosos procesos inflamatorios patológicos, como la quimiotaxis de neutrófilos y eosinófilos, la activación de neutrófilos, el aumento de la permeabilidad capilar y la inhibición de la apoptosis de neutrófilos [32].

[0077] Se han desarrollado anticuerpos monoclonales y moléculas pequeñas que se unen al C5 y lo inhiben para tratar diversas enfermedades [33], en particular la HPN, la psoriasis, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico y el rechazo de trasplantes. Sin embargo, algunos de estos anticuerpos monoclonales no se unen a determinadas proteínas de C5 de sujetos con polimorfismos de C5, por lo que no resultan eficaces en estos sujetos [34]. Preferiblemente, la proteína de tipo Coversina se une e inhibe la escisión no solo del C5 de tipo natural, sino también del C5 de sujetos con polimorfismos de C5 (por ejemplo, polimorfismos de C5 que hacen que el tratamiento con eculizumab sea ineficaz, o que reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab). El término 'polimorfismo de C5' incluye cualquier versión del C5 que se haya modificado mediante inserción, deleción, sustitución de aminoácidos, cambio de marco, o truncamiento, cualquiera de los cuales puede ser único o múltiple, o una combinación de uno o más de estos cambios en comparación con el C5 de tipo natural. En un sujeto humano, se considera un C5 de tipo natural a la proteína C5 con número de acceso NP_001726.2; versión GF38016947. Los ejemplos de polimorfismos de C5 incluyen los polimorfismos en la posición de aminoácido 885, por ejemplo Arg885Cys (codificado por c.2653C>T), p.Arg885His (codificado por c.2654G>A) y Arg885Ser, que disminuyen la eficacia del mAb eculizumab [34].

[0078] La capacidad de un agente para unirse al C5, incluido el C5 de sujetos con polimorfismos de C5, por ejemplo polimorfismos de C5 que vuelven ineficaz el tratamiento con eculizumab, o reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab, puede determinarse mediante ensayos 'in vitro' estándar conocidos en este campo, por ejemplo mediante resonancia de plasmón superficial o 'western blot' tras la incubación de la proteína en el gel con el C5 marcado. Preferiblemente, la proteína de tipo Coversina se une al C5, ya sea de tipo natural y/o un C5 de sujetos con polimorfismos de C5, por ejemplo polimorfismos de C5 que hacen que el tratamiento con eculizumab sea ineficaz, o reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab, con una Kd de menos de 360 nM, más preferiblemente menos de 300 nM, más preferiblemente menos de 250 nM, preferiblemente menos de 200 nM, más preferiblemente menos de 150 nM, más preferiblemente menos de 100 nM, incluso más preferiblemente menos de 50, 40, 30, 20 o 10 nM, y de manera ventajosa menos de 5nM, de manera que la mencionada Kd se determina usando resonancia de plasmón superficial, preferiblemente de acuerdo con el método descrito en [31].

[0079] Puede mostrar una afinidad mayor, menor o igual por el C5 de tipo natural y el C5 de sujetos con polimorfismos de C5, por ejemplo polimorfismos de C5 que vuelven ineficaz el tratamiento con eculizumab, o reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab.

[0080] La capacidad de una proteína de tipo Coversina para inhibir la activación del complemento también puede determinarse midiendo la capacidad del agente para inhibir la activación del complemento en el suero. Por ejemplo, la actividad del complemento en el suero puede medirse mediante cualquier medio conocido en este campo o descrito en el presente documento.

[0081] La proteína de tipo Coversina inhibe la actividad del LTB4 y también puede conservar la capacidad de unirse al LTB4 con una afinidad similar a la de la proteína Coversina.

[0082] La capacidad de una proteína de tipo Coversina para unirse al LTB4 puede determinarse mediante ensayos 'in vitro' estándar conocidos en este campo, por ejemplo mediante un ELISA competitivo entre la Coversina y el anticuerpo anti-LTB4 que compite por unirse al LTB4 marcado, mediante calorimetría de titulación isotérmica o mediante titulación por fluorescencia. Los datos obtenidos mediante titulación por fluorescencia muestran que la Coversina se une al LTB4 con una Kd de entre 200 y 300 μM. Por ejemplo, la actividad de unión al LTB4 (Caymen Chemicals, Ann Arbor, MI, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) puede cuantificarse en un espectrofluorímetro, por ejemplo un espectrofluorímetro LS 50 B (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.). Esto puede llevarse a cabo de la siguiente manera: se aplicaron soluciones purificadas de Coversina de 100 nM en 2 mL de PBS en una cubeta de cuarzo (10 mm de longitud de paso; Hellma, Mühlheim, Alemania) equipada con un agitador magnético. La temperatura se ajustó a 20 °C y, una vez alcanzado el equilibrio, la fluorescencia de la proteína de Tyr/Trp se excitó a 280 nm (anchura de la rendija: 15 nm). La emisión de fluorescencia se midió a 340 nm (anchura de la rendija: 16 nm), correspondiente al máximo de emisión. Se añadió paso a paso una solución de ligando de 30 |jM de LTB4 en PBS, hasta un volumen máximo de 20 jL (el 1% del volumen total de la muestra), y tras 30 s de incubación se midió la fluorescencia en estado estacionario. Para calcular el valor de KD, los datos se normalizaron a una intensidad de fluorescencia inicial del 100%, el efecto del filtro interno se corrigió usando una titulación de una solución de N-acetil-triptofanamida de 3 jM y los datos se representaron gráficamente frente a la concentración del ligando correspondiente. Posteriormente, se utilizó la regresión de mínimos cuadrados no lineales basada en la ley de acción de masas para la formación de complejos bimoleculares a fin de ajustar los datos con el software 0rigin versión 8.5 (0riginLab, Northampton, MA, EE.UU.) utilizando una fórmula publicada (Breustedt et al., 2006) [35].

[0083] La coversina puede unirse al LTB4 con una Kd inferior a 1 nM, más preferiblemente inferior a 0,9 nM, más preferiblemente inferior a 0,8 nM, preferiblemente inferior a 0,7 nM, más preferiblemente inferior a 0,6 nM, más preferiblemente inferior a 0,5 nM, incluso más preferiblemente inferior a 0,4 nM, y, de manera ventajosa, inferior a 0,3 nM, de manera que la mencionada Kd se determina utilizando titulación por fluorescencia, preferiblemente de acuerdo con el método anterior. Preferiblemente, la proteína de tipo Coversina comparte estas propiedades.

[0084] Las proteínas de tipo Coversina (por ejemplo, los polipéptidos de Coversina modificados que tienen una actividad reducida de unión al C5 pero que conservan la capacidad de unión al LTB-4) pueden, por ejemplo, unirse al LTB4 con una Kd inferior a 5 nM, 2 nM o 1 nM, más convenientemente inferior a 0,9 nM, más convenientemente inferior a 0,8 nM, preferiblemente inferior a 0,7 nM, más preferiblemente inferior a 0,6 nM, más preferiblemente inferior a 0,5 nM, aún más preferiblemente inferior a 0,4 nM, y, de manera ventajosa, inferior a 0,3 nM, de manera que la mencionada Kd se determina utilizando titulación por fluorescencia, preferiblemente de acuerdo con el método anterior.

[0085] De acuerdo con una realización de la invención, la proteína de tipo Coversina puede unirse tanto al C5 de tipo natural como al C5 de sujetos con polimorfismos de C5, por ejemplo polimorfismos de C5 que vuelven ineficaz el tratamiento con eculizumab, o reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab, y también puede unirse al LTB4.

[0086] La proteína de tipo Coversina se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 por parte de la C5 convertasa en complemento C5a y complemento C5b, y también inhibe la actividad del LTB4. Resulta especialmente ventajoso utilizar un agente que se una tanto al C5 como al LTB4. Tanto el C5 como la vía de los eicosanoides pueden contribuir a la patología observada en la EAA. Por lo tanto, al utilizar un único agente que inhibe múltiples vías implicadas en la EAA se puede obtener un efecto mejorado en comparación con el uso de un agente que inhibe sólo una única vía implicada en los efectos inflamatorios de las enfermedades y trastornos mediados por el complemento. Además, la administración de una única molécula presenta ventajas prácticas.

[0087] Preferiblemente, el agente que se usa de acuerdo con la invención procede de un artrópodo hematófago. El término 'artrópodo hematófago' incluye todos los artrópodos que se alimentan de la sangre de un huésped adecuado, como insectos, garrapatas, piojos, pulgas y ácaros. Preferiblemente, el agente que se usa de acuerdo con la invención procede de una garrapata, preferiblemente la garrapata '0rnithodoros moubata'.

[0088] Los homólogos incluyen parálogos y ortólogos de la secuencia de Coversina que se identifica explícitamente en la Figura 2, lo que incluye, por ejemplo, la secuencia de la proteína Coversina de otras especies de garrapatas, incluidas las siguientes: 'Rhipicephalus appendiculatus', 'R. sanguineus', 'R. bursa', 'A. americanum', 'A. cajennense', 'A. hebraeum', 'Boophilus microplus', 'B. annulatus', 'B. decoloratus', 'Dermacentor reticulatus', 'D. andersoni', 'D. marginatus', 'D. variabilis', 'Haemaphysalis inermis', 'Ha. leachii', 'Ha. punctata', 'Hyalomma anatolicum anatolicum', 'Hy. dromedarii', 'Hy. marginatum marginatum', 'Ixodes ricinus', 'I. persulcatus', 'I. scapularis', 'I. hexagonus', 'Argas persicus', 'A. reflexus', '0rnithodoros erraticus', '0. moubata moubata', '0. m. porcinus' y '0. savignyi'. Se trata de agentes para su uso de acuerdo con la invención cuando son:

(ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une al C5 para evitar la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4.

[0089] Las secuencias equivalentes de la proteína Coversina de especies de mosquitos, incluidas las de los géneros 'Culex', 'Anopheles' y 'Aedes', en particular 'Culex quinquefasciatus', 'Aedes aegypti' y 'Anopheles gambiae'; especies de pulgas, como 'Ctenocephalides felis' (la pulga del gato); tábanos; flebotomos; moscas negras; moscas tsetsé; piojos; ácaros; sanguijuelas; y platelmintos son agentes que se usan de acuerdo con la invención cuando son:

[0090] Los métodos para la identificación de homólogos de la secuencia de Coversina que se muestra en la Figura 2 resultarán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, los homólogos pueden identificarse mediante la búsqueda de homología en bases de datos de secuencias, tanto públicas como privadas. De manera conveniente, pueden usarse bases de datos públicas, aunque las bases de datos privadas o disponibles comercialmente resultarán igualmente útiles, especialmente si contienen información que no se incluye en las bases de datos públicas. Las bases de datos primarias son los depósitos de datos de las secuencias primarias de nucleótidos o aminoácidos y pueden ser públicas o estar disponibles comercialmente. Los ejemplos de bases de datos primarias de acceso público incluyen las siguientes: la base de datos de Gen-Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), la base de datos EMBL (http://www.ebi.ac.uk/), la base de datos DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/), la base de datos de proteínas SWISS-PR0T (http://expasy.hcuge.ch/), PIR (http://pir.georgetown.edu/), TrEMBL (http://www.ebi.ac.uk/), las bases de datos TIGR (ver http://www.tigr.org/tdb/index.html), la base de datos NRL-3D (http://www.nbrfa.georgetown.edu), el Banco de Datos de Proteínas (http://www.rcsb.org/pdb), la base de datos NRDB (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README), la base de datos 0WL (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/0WL/) y las bases de datos secundarias PR0SITE (http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html), PRINTS (http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html), Profiles (http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/software/pfam), Identify (http://dna.stanford.edu/identify/) y Blocks (http://www.blocks.fhcrc.org). Los ejemplos de bases de datos disponibles comercialmente o de bases de datos privadas incluyen las siguientes: PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.) y PathoSeq (anteriormente de Incyte Pharmaceuticals Inc.).

[0091] Los homólogos que son agentes que se usan de acuerdo con la invención tienen un grado de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19-168 de SEQ ID NO:2 de al menos un 90%, un 95%, un 98% o un 99%. Tal y como se menciona en el presente documento, el porcentaje de identidad se determina mediante BLAST, versión 2.1.3, usando los parámetros predeterminados especificados por el NCBI (el Centro Nacional para la Información Biotecnológica; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ['Blosum 62 matrix'; 'gap open penalty=11' y 'gap extension penalty=1']. El porcentaje de identidad atañe a la longitud total de la secuencia de referencia relevante (aminoácidos 19-168 de SEQ ID NO:2).

[0092] Cuando la proteína de tipo Coversina comprende la mencionada secuencia, la proteína de tipo Coversina puede ser una proteína de fusión (por ejemplo, con otra proteína -por ejemplo una proteína heteróloga-). Más adelante se analizan algunas segundas proteínas adecuadas.

[0093] Un agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser o codificar una proteína que contiene sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos de la secuencia de tipo natural, por ejemplo de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 o más aminoácidos, o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 aminoácidos (por ejemplo, deleciones del extremo N- o C-terminal), con respecto a la secuencia de la proteína Coversina que se muestra en la Figura 2, siempre que las proteínas comprendan una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, o es (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, y dicha proteína o fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4. El agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser o codificar una proteína que contiene sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan de manera adversa a la función o la actividad de la proteína. Pueden usarse variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies de las que proceden las proteínas de Coversina) siempre que cumplan los requisitos estructurales y funcionales de la reivindicación 1.

[0094] Un agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser una proteína o una molécula de ácido nucleico que es o codifica un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, siempre que los mencionados fragmentos conserven la capacidad de unirse al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b y de inhibir la actividad del LTB4. Los fragmentos pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos derivados de la secuencia de la proteína Coversina (o una homóloga) que tengan menos de 150 aminoácidos, o menos de 145 aminoácidos, siempre que estos fragmentos conserven la capacidad de unirse al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasaen el complemento C5a y el complemento C5b y de inhibir la actividad del LTB4. Los fragmentos pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos derivados de la secuencia de la proteína Coversina (o una homóloga) que tengan al menos 150 aminoácidos, o al menos 145 aminoácidos, siempre que estos fragmentos conserven la capacidad de unirse al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b y de inhibir la actividad del LTB4.

[0095] Cualquier agente para su uso de acuerdo con la invención, que sea una proteína o una molécula de ácido nucleico que es o codifica (i) una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, o (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, y que preferiblemente conserve el patrón de los residuos de cisteína que presenta la Coversina. Por ejemplo, la mencionada proteína o molécula de ácido nucleico es o codifica una proteína o fragmento que comprende seis residuos de cisteína separados entre sí por una distancia de 32 aminoácidos, 62 aminoácidos, 28 aminoácidos, 1 aminoácido y 21 aminoácidos, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo de la secuencia de acuerdo con los aminoácidos 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO:2). Se desvelan fragmentos ejemplares de la proteína Coversina en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 14. El ADN que codifica los correspondientes fragmentos se desvela en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 13.

[0096] Se incluyen como tales fragmentos no solo los fragmentos de la proteína Coversina de '0. moubata' que se identifica explícitamente en la Figura 2 del presente documento, sino también los fragmentos de homólogos de esta proteína, tal y como se ha explicado anteriormente. Cuando el agente que se usa de acuerdo con la invención es o codifica un fragmento de una proteína, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y el fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4. Preferiblemente, el mencionado fragmento conservará el espaciamiento de las cisteínas que se ha mencionado anteriormente. Por supuesto, pueden diseñarse racionalmente fragmentos con propiedades mejoradas mediante la mutación o la fragmentación sistemática de la secuencia de tipo natural, seguidas de ensayos de actividad apropiados. Los fragmentos pueden presentar una afinidad similar o mayor por el C5, ya sea la variante natural o la variante polimórfica del C5 o ambas, y/o el LTB4 como Coversina. Estos fragmentos pueden tener el tamaño descrito anteriormente para los fragmentos de la proteína Coversina.

[0097] Tal y como se ha explicado anteriormente, las proteínas de tipo Coversina se unen preferentemente tanto al C5 de tipo natural y/o al C5 de sujetos con un polimorfismo de C5 (por ejemplo, polimorfismos de C5 que vuelven ineficaz el tratamiento con eculizumab, o que reducen la eficacia del tratamiento con eculizumab) como al LTB4. En la presente invención también pueden utilizarse proteínas de tipo Coversina que tienen una capacidad reducida de unión al C5 pero que impiden la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhiben la actividad del LTB4 y conservan la actividad de unión al LTB4.

[0098] Un agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser una proteína de fusión, obtenida, por ejemplo, clonando un polinucleótido -que codifica una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2- dentro del marco a las secuencias codificantes para una secuencia de proteínas heteróloga. Cuando se utiliza en el presente documento, el término 'heterólogo' designa cualquier polipéptido distinto de una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2. Los ejemplos de secuencias heterólogas, que pueden estar incluidas en las proteínas de fusión solubles en el extremo N- o C- terminal son los siguientes: dominios extracelulares de proteínas unidas a membranas, regiones constantes de inmunoglobulinas (región Fc), PAS o XTEN o polipéptidos no estructurados similares, dominios de multimerización, dominios de proteínas extracelulares, secuencias señal, secuencias de exportación o secuencias que permiten la purificación por cromatografía de afinidad. Muchas de estas secuencias heterólogas están disponibles comercialmente en plásmidos de expresión, ya que estas secuencias suelen incluirse en las proteínas de fusión a fin de proporcionar propiedades adicionales sin perjudicar significativamente a la actividad biológica específica de la proteína fusionada a ellas [36]. Algunos ejemplos de estas propiedades adicionales son una semivida más duradera en los fluidos corporales (por ejemplo, como resultado de la adición de una región Fc o pasilación [37]), la localización extracelular, o un procedimiento de purificación más fácil como el que permite una etiqueta como una histidina, GST, FLAG, avidina o etiqueta HA. De manera adicional, las proteínas de fusión pueden contener secuencias enlazadoras (por ejemplo, de 1-50 aminoácidos de longitud), de manera que los componentes estén separados por este enlazador. En todos los casos, cuando el agente que se usa de acuerdo con la invención es una proteína de fusión, dicha proteína de fusión se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4.

[0099] Por lo tanto, las proteínas de fusión son ejemplos de proteínas que comprenden una proteína de tipo Coversina, e incluyen a modo de ejemplo específico una proteína que comprende una secuencia PAS y una secuencia de proteína de tipo Coversina. Las secuencias pAs se describen, por ejemplo, en Schlapschy M, et al [37], y el documento EP 08773567.6, y en Kuhn et al [38] se describe una molécula de Coversina PASilada. La PASilación describe la fusión genética de una proteína con secuencias polipeptídicas conformacionalmente desordenadas que están compuestas por los aminoácidos Pro, Ala, y/o Ser. Se trata de una tecnología desarrollada por XL Protein (http://xl-protein.com/) y proporciona un modo sencillo de unir una cadena aleatoria solvatada con un gran volumen hidrodinámico a la proteína a la que se fusiona. La secuencia polipeptídica adopta una estructura de espiral aleatoria voluminosa. El tamaño de la proteína de fusión resultante es, por tanto, mucho mayor que el de la proteína a la que se fusiona. Se ha demostrado que esto reduce el aclaramiento en los sistemas biológicos. Se describen secuencias PAS adecuadas en el documento EP08773567.6, y también en la referencia de Schlapschy mencionada anteriormente. En la proteína de fusión puede usarse cualquier secuencia PAS adecuada. Los ejemplos incluyen una secuencia de aminoácidos que consta de al menos unos 100 residuos de aminoácidos que forman una conformación en espiral aleatoria y se componen de residuos de alanina, serina y prolina (o se componen de residuos de prolina y alanina). Esta puede comprender una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, de manera que dichas repeticiones consisten en residuos de Ala, Ser y Pro (o residuos de prolina y alanina) y de manera que no más de 6 residuos de aminoácidos consecutivos son idénticos. Los residuos de prolina pueden constituir más del 4% y menos del 40% de los aminoácidos de la secuencia. La secuencia puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 15); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 16); APSSPSPSSPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 17); SAPSSPSPSSPSSPASPS (SEQ ID NO: 18); SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 19); AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 20) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 21) o versiones circulares permutadas o multímeros de estas secuencias como un todo o como partes de estas secuencias. Por ejemplo, puede haber 5-40, 10-30, 15-25, 18-20, y preferiblemente 20-30 o 30 copias de una de las repeticiones presentes en la secuencia PAS, es decir, una de las SEQ ID NOs 15-21, preferiblemente la 15. Preferiblemente, la secuencia PAS comprende o consta de 30 copias de SEQ ID NO: 15. Preferiblemente, la secuencia PAS se fusiona al extremo N-terminal de la proteína de tipo Coversina (directamente o a través de una secuencia enlazadora) y, en algunas realizaciones preferidas, la proteína de tipo Coversina puede comprender o constar de los aminoácidos 19 168 de SEQ ID NO:2 (por ejemplo, la proteína de fusión comprende (a) una secuencia PAS formada por 30 copias de SEQ ID NO: 15 y (b) los aminoácidos 19-168 de SEQ ID NO:2, de manera que '(a)' se fusiona con el extremo N-terminal de '(b)' directamente o mediante una secuencia enlazadora).

[0100] Asimismo, las proteínas de fusión pueden contener secuencias enlazadoras (por ejemplo, de 1-50, 2-30, 3 20, o 5-10 aminoácidos de longitud), de manera que los componentes estén separados por este enlazador. En una realización, la secuencia enlazadora puede ser un solo residuo de alanina.

[0101] Los agentes proteicos que se usan de acuerdo con las reivindicaciones pueden prepararse en una forma recombinante mediante la expresión en una célula huésped. Estos métodos de expresión son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen detalladamente en [39] y [40]. Preferiblemente, las formas recombinantes de los agentes proteicos que se usan de acuerdo con las reivindicaciones son no glicosiladas. Preferiblemente, la célula huésped es 'E. coli'.

[0102] Preferiblemente, los agentes proteicos que se usan de acuerdo con la invención están en una forma aislada, por ejemplo separados de al menos un componente de la célula huésped y/o el medio de crecimiento celular en el que se expresaron. En algunas realizaciones, los agentes proteicos que se usan de acuerdo con la invención se purifican hasta al menos un 90%, un 95% o un 99% de pureza según se determine, por ejemplo, mediante electroforesis o cromatografía. Los agentes proteicos que se usan de acuerdo con la invención también pueden prepararse usando técnicas convencionales de química de proteínas. Por ejemplo, los fragmentos proteicos pueden prepararse mediante síntesis química. Los métodos para la generación de proteínas de fusión son estándares en este campo y resultarán conocidos para el lector experto. Por ejemplo, en [39] o [41] puede hallarse información sobre la biología molecular más general, la tecnología del ADN recombinante en microbiología y las técnicas inmunológicas.

[0103] De acuerdo con otra realización de la invención, el agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser (i) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, o (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, y dicha proteína o fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4. Por ejemplo, puede usarse terapia génica para llevar a cabo la producción endógena de la proteína de tipo Coversina por medio de las células pertinentes del sujeto, ya sea 'in vivo' o 'ex vivo'. Otro enfoque diferente consiste en la administración de 'ADN desnudo', de manera que el gen terapéutico se inyecta directamente en el torrente sanguíneo o en el tejido muscular.

[0104] Preferiblemente, la mencionada molécula de ácido nucleico comprende o está formada por las bases 55 a 507 de la secuencia de nucleótidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 1). Esta secuencia de nucleótidos codifica la proteína Coversina de la Figura 2 sin la secuencia señal. Las primeras 54 bases de la secuencia de nucleótidos de la Figura 2 codifican la secuencia señal que no es necesaria para la actividad inhibidora del complemento o la actividad de unión al LTB4. De manera alternativa, la molécula de ácido nucleico puede comprender o estar formada por las bases 1 a 507 de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 2, que codifica la proteína con la secuencia señal.

Modos de administración

[0105] Las proteínas de tipo Coversina no requieren un profesional médico para su administración y son moléculas que se absorben rápidamente. Por el contrario, muchos anticuerpos recombinantes se absorben muy lentamente, por lo que deben administrarse mediante infusión durante largos períodos de tiempo (por ejemplo, por vía intravenosa). Por consiguiente, la administración de estas moléculas también requiere un profesional médico. Así, además de tener la ventaja de ser más eficaces inhibiendo la activación de las vías del complemento en sujetos con un polimorfismo de C5, las proteínas de tipo Coversina también presentan la ventaja de ser más fáciles de administrar que otros agentes como los anticuerpos como el eculizumab.

[0106] El agente que se usa de acuerdo con la invención se administra en una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz. El término 'cantidad terapéuticamente eficaz' hace referencia a la cantidad de agente necesaria para tratar la EAA. En este contexto, 'tratar' incluye reducir la gravedad del trastorno.

[0107] El término 'cantidad profilácticamente eficaz' utilizado en el presente documento hace referencia a la cantidad de agente necesaria para prevenir la dolencia pertinente, por ejemplo el penfigoide ampollar o la epidermólisis bullosa adquirida. En este contexto, 'prevenir' incluye reducir la gravedad del trastorno, por ejemplo si no se detecta la presencia del trastorno antes de iniciar la administración del agente. La reducción de la gravedad del trastorno podría consistir, por ejemplo, en reducir el tamaño o el número de las ampollas de la superficie corporal afectada, tal y como se expone en otros apartados del presente documento.

[0108] La reducción o mejora se determina en comparación con el resultado sin la administración del agente que se usa de acuerdo con la invención. Los resultados se evalúan según los criterios estándar utilizados para evaluar a estos pacientes. En la medida en que esto pueda cuantificarse, se produce una reducción o mejora de al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% en los criterios relativos (por ejemplo, el tamaño o el número de ampollas o de la superficie corporal afectada).

[0109] Preferiblemente, la dosis del agente que se usa de acuerdo con la invención es suficiente para ligar la mayor cantidad posible del C5 disponible en el sujeto, y más preferiblemente, todo el C5 disponible. La dosis del agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser suficiente para ligar la mayor cantidad posible del LTB4 disponible en el sujeto, y más preferiblemente, todo el LTB4 disponible. En algunos aspectos, la dosis del agente que se usa de acuerdo con la invención es suficiente para ligar la mayor cantidad posible del C5 y el LTB4 disponibles, por ejemplo todo el C5 y el LTB4 disponibles. La dosis suministrada del agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser de al menos 1 o 1,5 veces o dos veces la dosis molar necesaria para ligar todo el C5 y/o el LTB4 disponibles en el sujeto. La dosis suministrada del agente que se usa de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, aproximadamente -o al menos- 1, 1,5, 2, 2,5 veces, 3 veces o 4 veces la dosis molar necesaria para ligar todo el C5 y/o el LTB4 disponibles en el sujeto. En todos los casos, el agente que se usa de acuerdo con la invención es una proteína o una molécula de ácido nucleico que es o codifica: (i) una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4.

[0110] Preferiblemente, la dosis es de 0,0001 mg/kg (masa del fármaco comparada con la masa del paciente) a 20 mg/kg, de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg, de 0,2 mg/kg a 0,8 mg/kg, de 0,3 mg/kg a 0,6 mg/kg, o de 0,4 mg/kg a 0,6 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 0,57 mg/kg).

[0111] Asismimo, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz puede definirse en relación con la inhibición del complemento terminal; por ejemplo, una cantidad que implique que la actividad del complemento terminal (ACT) se reduce al menos en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, en comparación con la actividad del complemento terminal en ausencia del tratamiento. La dosis y la frecuencia pueden ajustarse para mantener la actividad del complemento terminal en el nivel deseado, que puede ser, por ejemplo, de un 10% o menos, por ejemplo de un 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% o menos en comparación con la actividad del complemento terminal en ausencia del tratamiento.

[0112] Cuando se indica una dosis, esta se refiere a una dosis del agente que se usa de acuerdo con la invención y que es una proteína tal y como se especifica en la reivindicación 1. Para obtener estos niveles pueden usarse las dosis apropiadas para un agente que se usa de acuerdo con la invención y que es una molécula de ácido nucleico tal y como se especifica en la reivindicación 1.

[0113] La actividad del complemento terminal puede medirse mediante ensayos estándar conocidos en este campo, por ejemplo mediante el ensayo de hemólisis de CH⁵⁰de Quidel y el ensayo de CH⁵⁰lítico de glóbulos rojos de oveja.

[0114] La frecuencia con la que debe administrarse la dosis dependerá de la semivida del agente en cuestión. El agente proteico que se usa de acuerdo con la invención, y que es (i) una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, o (ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4, puede administrarse por ejemplo dos veces al día, una vez al día, o cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, 10, 15 o 20 días o más.

[0115] Pueden administrarse dosis únicas o múltiples. Por ejemplo, pueden administrarse al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dosis. Las dosis únicas constituyen una realización. La dosificación exacta y la frecuencia de las dosis también pueden depender del estado del paciente en el momento de la administración. Los factores que pueden tenerse en cuenta al determinar la dosificación incluyen la necesidad de tratamiento o profilaxis, la gravedad del estado de la enfermedad del paciente, la salud general del paciente, la edad, el peso, el sexo, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades a las reacciones, y la tolerancia o respuesta del paciente a la terapia. La cantidad exacta puede determinarse mediante experimentación rutinaria, pero en última instancia puede depender del criterio del médico.

[0116] El régimen de dosificación también puede consistir en una 'dosis de carga' inicial seguida de una o más 'dosis de mantenimiento' posteriores. En general, la dosis de carga será mayor que la dosis de mantenimiento. La dosis de carga puede ser 2, 5, 10 o más veces mayor que la dosis de mantenimiento. La dosis de carga puede administrarse como dosis única, o como una o más dosis en un período de tiempo determinado. Normalmente, la dosis de carga consistirá en 1, 2, 3, 4 o 5 dosis administradas en un único período de 24 horas. La dosis de mantenimiento puede ser una dosis más baja que se repite a intervalos regulares. La dosis de mantenimiento puede repetirse a intervalos, por ejemplo cada 3, 4, 6, 8, 12, 24 o 48 horas. El régimen preciso puede determinarse mediante experimentación rutinaria, pero en última instancia puede depender del criterio del médico. La dosis de mantenimiento puede ser de al menos un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de la dosis de carga inicial, o de hasta un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de la dosis de carga inicial.

[0117] En otra realización, se utiliza la misma dosis durante todo el tratamiento (por ejemplo, una vez al día o dos veces al día).

[0118] La dosis de carga puede ser de 0,0001 mg/kg (masa del fármaco comparada con la masa del paciente) a 20 mg/kg, y la dosis de mantenimiento puede ser de 0,0001 mg/kg a 20 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,05 mg/kg a 0,5 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,2 mg/kg a 0,8 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,1 mg/kg a 0,4 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,3 mg/kg a 0,7 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,1 mg/kg a 0,3 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga es de 0,4 mg/kg a 0,6 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,1 mg/kg a 0,2 mg/kg, por ejemplo cuando la dosis de carga es de 0,57 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de 0,14 mg/kg. Por ejemplo, una dosis de carga de 0,6 mg/kg-1,8 mg/kg seguida de una dosis de mantenimiento de 0,2 mg/kg-0,6 mg/kg (por ejemplo 0,3 mg/kg).

[0119] La dosis de carga puede ser de 0,0001 mg/kg (masa del fármaco comparada con la masa del paciente) a 20 mg/kg, y la dosis de mantenimiento puede ser de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,1 mg/kg a 0,8 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,1 mg/kg a 0,6 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,1 mg/kg a 0,4 mg/kg; alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser de 0,1 mg/kg a 0,2 mg/kg.

[0120] La dosis de carga puede ser de 0,0001 mg/kg (masa del fármaco comparada con la masa del paciente) a 20 mg/kg, y la dosis de mantenimiento puede ser de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,01 mg/kg a 2 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,2 mg/kg a 0,8 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,3 mg/kg a 0,6 mg/kg; alternativamente, la dosis de carga puede ser de 0,4 mg/kg a 0,6 mg/kg, o de 0,6 mg/kg a 1,8 mg/kg.

[0121] Generalmente, el agente que se usa de acuerdo con la invención se administrará junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'portador farmacéuticamente aceptable' incluye los siguientes: genes, polipéptidos, anticuerpos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y partículas víricas inactivas o, de hecho, cualquier otro agente, siempre que el portador no provoque por sí mismo efectos de toxicidad o cause la producción de anticuerpos que sean perjudiciales para el individuo que recibe la composición farmacéutica. Asimismo, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener líquidos como agua, solución salina, glicerol, etanol o sustancias auxiliares como agentes humectantes o agentes emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH y similares. Por lo tanto, el portador farmacéutico utilizado variará en función de la vía de administración. Los portadores pueden permitir que las composiciones farmacéuticas se formulen en comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, o suspensiones para facilitar la ingesta por parte del paciente. En [42] se ofrece un análisis exhaustivo de los portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, el agente que se usa de acuerdo con la invención se administra en agua o PBS.

[0122] El agente que se usa de acuerdo con la invención puede administrarse por cualquier vía de administración conocida. El agente que se usa de acuerdo con la invención puede administrarse por vía local o sistémica. El agente que se usa de acuerdo con la invención puede administrarse por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección, ya sea subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o bien administrarse en el espacio intersticial de un tejido). Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, los supositorios y las aplicaciones transdérmicas o transcutáneas, las agujas y los hipoespráis. La administración local incluye la administración tópica, es decir, la aplicación sobre la piel, por ejemplo en la zona afectada. Esto puede ser de especial utilidad en una EAA leve, por ejemplo en el PA leve.

[0123] Preferiblemente, el agente que se usa de acuerdo con la invención se administra mediante inyección subcutánea. En algunas realizaciones, se administra mediante inyección subcutánea una o dos veces al día, por ejemplo, con una dosis de carga inicial de entre 0,0001 mg/kg (masa del fármaco comparada con la masa del paciente) y 20 mg/kg, seguida de dosis de mantenimiento una vez al día de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, u otras dosis descritas en el presente documento. De manera alternativa, el agente que se usa de acuerdo con la invención puede administrarse mediante inyección subcutánea en días alternos.

[0124] En una realización preferida, el agente que se usa de acuerdo con la invención se administra mediante inyección subcutánea una vez al día con una dosis de carga inicial de 0,6 mg/kg-1,8 mg/kg (por ejemplo, 0,57 mg/kg), seguida de dosis de mantenimiento una vez al día de 0,2 mg/kg-0,6 mg/kg (por ejemplo, 0,3 mg/kg), o mediante inyección subcutánea una vez al día con una dosis de carga inicial de 0,6 mg/kg-3,6 mg/kg (por ejemplo, 1,0 mg/kg), seguida de dosis de mantenimiento una vez al día de 0,2 mg/kg-1,2 mg/kg (por ejemplo, 0,6 mg/kg).

[0125] Preferiblemente, el tratamiento se prolonga durante al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 semanas.

[0126] Es preferible continuar el tratamiento hasta que los síntomas del sujeto se hayan reducido. Así, el tratamiento puede consistir en la administración del agente que se usa de acuerdo con la invención (por ejemplo, diariamente) durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 semanas.

[0127] La dosis de mantenimiento (por ejemplo, una sola dosis de mantenimiento diaria) puede mantenerse constante durante el curso del tratamiento, o bien la dosis de mantenimiento (por ejemplo, una dosis de mantenimiento diaria) puede modificarse (por ejemplo, aumentarse o disminuirse) durante el curso del tratamiento. La dosis de mantenimiento puede modificarse a fin de mantener la actividad del complemento terminal a un nivel deseado, por ejemplo un 10% o menos en comparación con el suero del mencionado paciente en ausencia de tratamiento o en comparación con el suero de control normal. La -o cada- dosis de mantenimiento puede mantenerse durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 semanas, por ejemplo diariamente durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 semanas. La dosis de mantenimiento puede reducirse a medida que mejoren los síntomas del sujeto. La cantidad de agente que se usa de acuerdo con la invención o la frecuencia con la que se administra el agente pueden disminuirse a medida que mejoran los síntomas del sujeto.

[0128] Por lo tanto, puede haber una dosis de carga inicial, seguida de una dosis de mantenimiento inicial (por ejemplo, una dosis de mantenimiento inicial diaria) que puede ser una dosis de mantenimiento como la especificada anteriormente, y una o más dosis de mantenimiento adicionales (por ejemplo, una dosis de mantenimiento adicional diaria), por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5 dosis de mantenimiento adicionales.

[0129] Por lo tanto, la invención también comprende un agente tal y como se especifica en las reivindicaciones para su uso en un método para tratar o prevenir el penfigoide ampollar o la epidermólisis bullosa adquirida, en un sujeto humano, de manera que el método comprende administrar al sujeto una dosis de carga inicial del agente tal y como se especifica en las reivindicaciones, y después administrar dosis de mantenimiento (por ejemplo, dosis de mantenimiento diarias) del agente tal y como se especifica en las reivindicaciones, de manera que hay una dosis de mantenimiento inicial y una o más dosis de mantenimiento adicionales.

[0130] Las una o más dosis de mantenimiento adicionales pueden determinarse analizando la actividad del complemento terminal en el sujeto (por ejemplo, en una muestra biológica del sujeto) y determinando la dosis de mantenimiento adicional en función del nivel de actividad del complemento terminal y/o analizando los síntomas del sujeto y determinando la dosis de mantenimiento adicional en función de los síntomas. De manera opcional, el método también puede comprender la administración de la mencionada dosis de mantenimiento adicional. Dicha dosis adicional puede calcularse para que esté a un nivel que mantenga la actividad del complemento terminal al nivel deseado.

[0131] Cuando se toma una muestra biológica, esta puede ser sangre, por ejemplo una muestra de sangre entera o de suero. De manera opcional, el método también comprende el paso de tomar la muestra y, de manera opcional, también comprende el paso de determinar el ATC de la muestra.

[0132] Las una o más dosis de mantenimiento adicionales pueden determinarse analizando la actividad del complemento terminal en el sujeto (por ejemplo, en una muestra biológica) y determinando la dosis de mantenimiento adicional en función del nivel de actividad del complemento terminal y/o analizando los síntomas del sujeto y determinando la dosis de mantenimiento adicional en función de los síntomas. De manera opcional, el método también puede comprender la administración de la mencionada dosis de mantenimiento adicional. Dicha dosis adicional puede calcularse para que esté a un nivel que mantenga la actividad del complemento terminal al nivel deseado.

[0133] En algunos aspectos, el nivel de actividad del complemento deseado es de un 10% o menos en comparación con el suero del mencionado sujeto en ausencia de tratamiento o en comparación con el suero de control normal.

[0134] En algunos aspectos, si el ATC es superior al nivel deseado, se aumenta la dosis de mantenimiento y, opcionalmente, si el a Tc es inferior a un 5, 4, 3, 2 o 1%, la dosis se mantiene o se disminuye.

[0135] En algunos aspectos, si los síntomas empeoran, se aumenta la dosis de mantenimiento y, opcionalmente, si los síntomas mejoran, la dosis se mantiene o se disminuye.

[0136] En algunas realizaciones, se examina al sujeto en el plazo de un mes desde el inicio del tratamiento, en el plazo de dos semanas desde el inicio del tratamiento, o en el plazo de una semana desde el inicio del tratamiento. En otras realizaciones, se examina al sujeto una vez al día o al menos una vez al día, una vez a la semana o al menos una vez a la semana, una vez cada dos semanas o al menos una vez cada dos semanas, una vez al mes o una vez cada dos meses.

[0137] Preferiblemente, la dosis de carga es de 1,2 mg/kg o de aproximadamente 1,2 mg/kg de proteína y la dosis de mantenimiento es de al menos 0,6 mg/kg (por ejemplo, al menos 0,7 mg/kg, 0,8-1,5, 0,9-1,2 o 1,0-1,25 mg/kg) o es de hasta 0,3 mg/kg (por ejemplo, hasta 0,2 mg/kg, 0,15-0,4, 0,2-0,3 mg/kg) y, opcionalmente, (i) esa dosis de mantenimiento se mantiene durante al menos 2, 3, 4, 5 o 6 semanas y/o (ii) el tratamiento se mantiene durante al menos 6 semanas y/o (iii) el tratamiento se mantiene diariamente durante al menos 3, 4, 5 o 6 semanas.

[0138] Preferiblemente, la dosis de carga es de 0,6 a 1,8 mg/kg de proteína y la dosis de mantenimiento es de 0,2 a 0,6 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0,3 mg/kg, y (i) la dosis de mantenimiento se mantiene durante al menos 2, 3, 4, 5 o 6 semanas y/o (ii) el tratamiento se mantiene durante al menos 6 semanas y/o (iii) el tratamiento se mantiene diariamente durante al menos 3, 4, 5 o 6 semanas.

[0139] El régimen de dosificación también puede consistir en una dosis fija que no depende del peso del sujeto en tratamiento. La dosis fija puede administrarse como dosis única, o como una o más dosis en un intervalo de tiempo determinado. La dosis fija puede ser de 1mg-100mg de Coversina (SEQ ID NO: 4) para pacientes humanos típicos (por ejemplo, aquellos de entre 50 kg y 100 kg de peso). En algunas realizaciones, la dosis fija está entre 1mg-80mg, 1mg-50mg, 5mg-80mg, 5mg-50mg, 10mg-60mg, 10mg-50mg, 20mg-50mg, 20mg-40mg o 25mg-35mg. Preferiblemente, la dosis fija es de 30 mg de Coversina (SEQ ID NO: 4) o el equivalente molar de una proteína de tipo Coversina o un polipéptido de Coversina modificado. Típicamente, la dosis fija será de 1, 2, 3, 4 o 5 dosis administradas en un único período de 24 horas. La dosis fija puede repetirse a intervalos, por ejemplo cada 3, 4, 6, 8, 12, 24 o 48 horas. El régimen exacto puede determinarse mediante experimentación rutinaria, pero en última instancia dependerá del criterio del médico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS:

[0140]

Figura 1: Diagrama esquemático de las vías clásica y alternativa de activación del complemento. Componentes enzimáticos en gris oscuro. Las anafilatoxinas se incluyen dentro de las 'estrellas'.

Figura 2A: Secuencia primaria de la Coversina. Secuencia señal subrayada. Residuos de cisteína en negrita. El número de nucleótidos y aminoácidos se indica a la derecha.

Figura 2B: Ejemplos de variantes de Coversina.

Figura 3: La puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica demuestra una mejoría de la enfermedad en los ratones tratados con todas las dosis de Coversina en comparación con el grupo de control del vehículo y el grupo de la metilprednisolona; experimento 1.

Figura 4: La puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica demuestra una mejoría de la enfermedad en los ratones tratados con todas las dosis de Coversina en comparación con el grupo de control del vehículo y el grupo de la metilprednisolona; experimento 2. En comparación con el primer experimento, la Coversina sólo tuvo un efecto significativo en comparación con el grupo de control del vehículo con la dosis de 2,5 mg/kg. Cabe destacar que, en este experimento, varios ratones del grupo de control no desarrollaron un grado significativo de la enfermedad, lo que probablemente sea la razón de esta diferencia en comparación con el primer experimento.

Figura 5: La puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica demuestra una mejoría de la enfermedad en los ratones tratados con todas las dosis de Coversina en comparación con el grupo de control del vehículo y el grupo de la metilprednisolona; resultados combinados de los experimentos 1 y 2; el análisis ANOVA de dos vías revela una diferencia estadísticamente significativa entre el control del vehículo y la Coversina en las dosis de 250 y 2500 μg/ml. Figura 6A: La puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica y PAS-L-Coversina profiláctica demuestra una mejoría de la enfermedad en los ratones tratados con 2,5 mg/kg de Coversina (Ejemplo 4, experimento 1).

Figura 6B: La puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica y PAS-L-Coversina profiláctica demuestra una mejoría de la enfermedad en los ratones tratados con 2,5 mg/kg de Coversina (Ejemplo 4, experimento 2). En este caso, tanto la dosis de 10 mg/kg de PAS-L-Coversina como la de 2,5 mg/kg de Coversina muestran un efecto estadísticamente significativo sobre la ABSA.

Figura 6C: Puntuación clínica de la EBA experimental en el vehículo versus los ratones tratados con Coversina profiláctica y PAS-L-Coversina profiláctica. Se muestran los resultados combinados del Ejemplo 4, experimentos 1 y 2.

Figura 7: Efecto de la Coversina administrada terapéuticamente sobre el desarrollo de la inflamación cutánea similar a la enfermedad del penfigoide en el modelo de ratón de EBA pasivo (Ejemplo 2, experimento 1).

La Coversina mejoró la inflamación cutánea en función de la dosis. Los datos se presentan como medias /-SEM; N = 5 ratones por grupo; la prueba ANOVA de dos vías para la significación estadística confirma diferencias significativas entre el control del vehículo y la Coversina en todas las dosis utilizadas. El experimento se llevó a cabo exclusivamente en hembras.

Figura 8: Efecto de la Coversina administrada terapéuticamente sobre el desarrollo de la inflamación cutánea similar a la enfermedad del penfigoide en el modelo de ratón de EBA pasivo (Ejemplo 2, experimento 2). La Coversina mejoró la inflamación cutánea en función de la dosis. Los datos se presentan como medias /-SEM; N = 5 ratones por grupo; la prueba ANOVA de dos vías para la significación estadística confirma diferencias significativas entre el control del vehículo y la Coversina en todas las dosis utilizadas. El experimento se llevó a cabo exclusivamente en machos.

La Figura 9A muestra los niveles de C5a en el líquido de las ampollas de pacientes con penfigoide ampollar.

La Figura 9B muestra los niveles de LTB4 en el líquido de las ampollas de pacientes con penfigoide ampollar.

La Figura 10 muestra la secuencia de diversos polipéptidos de Coversina modificados con actividad de unión al C5 reducida o ausente, pero que conservan la capacidad de unión al LTB-4.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Efecto de la Coversina en el modelo de transferencia de EBA con Coversina administrada profilácticamente

[0141] La EBA de transferencia de anticuerpos se indujo utilizando una versión modificada del protocolo descrito por Sitaru et al., 2005 [43]. Se examinaron cinco ratones en cada grupo de tratamiento. En resumen, a los ratones se les inyectaron subcutáneamente 50 |jg de IgG anti-Col7 purificada por afinidad en los días 0, 2 y 4. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea dos veces al día tres dosis variables de Coversina, comenzando cuatro días antes de la primera inyección de IgG anti-Col7 (día -2). Esta aplicación continuó durante todo el experimento hasta su último día, el día 11. En los grupos de control, los ratones recibieron únicamente el vehículo por vía subcutánea, o 20 mg/kg de metilprednisolona una vez al día.

[0142] Para generar anticuerpos dirigidos contra el colágeno murino de tipo VII ('anti-C0L7'), se inmunizó a conejos blancos de Nueva Zelanda con 200 jg de una mezcla proteica que contenía tres proteínas recombinantes diferentes ('Col7A, B y C') derivadas del dominio no colágeno 1 (NC1) del colágeno VII junto con adyuvante incompleto de Freund. Las IgG se aislaron del suero de conejos inmunizados utilizando proteína G, y posteriormente las IgG se purificaron por afinidad con his-Col7 para obtener específicamente IgG anti-Col7 de conejo. Se verificó la calidad de los anticuerpos determinando el título y la potencia en el ensayo de criosección.

[0143] A partir del día 4, cada dos días se puntuó la extensión de las lesiones cutáneas en cada ratón. Un observador cualificado clasificó las zonas de la piel que presentaban eritema, ampollas, erosiones, costras o alopecia como 'afectadas' o 'no afectadas' [43]. Se calculó el porcentaje de la superficie corporal total afectada por lesiones cutáneas (ABSA).

[0144] Se realizaron dos experimentos independientes.

[0145] Los resultados del primer experimento se muestran en la Figura 4. Puede observarse que se redujo el porcentaje de ABSA en ratones tratados con Coversina con 25 jg/kg, y que con el tratamiento con Coversina de 2500 jg/kg y con Coversina de 250 jg/kg se redujo aún más. Hubo una diferencia de un 63% entre el vehículo y la dosis de 0,25 mg/kg. El valor P para esta diferencia mediante la prueba t de dos colas es de 0,0023. Las puntuaciones medias de ABSA para el vehículo y la dosis de 0,25 mg/kg en el día 10 fueron de 6,23+1,1 y 2,65+0,4. Los valores después de las medias son desviaciones estándar.

[0146] La Coversina redujo el porcentaje de ABSA en mayor medida que las moléculas evaluadas anteriormente. Por ejemplo, en experimentos anteriores similares se administró N-[1-(1-benzotien-2-il)etil]-N-hidroxiurea (Zileuton), que es un inhibidor oral de la inhibición de la 5-lipoxigenasa (5-L0) (una enzima importante de la cascada del ácido araquidónico y que interviene en la formación de leucotrienos (LT) bioactivos), a ratones hembra C57Bl/6J de 8 semanas de edad en un esquema de dosificación preventiva. En este experimento previo, los ratones se distribuyeron en dos grupos y recibieron en su agua de bebida 0,6-0,8 mg/por ratón/por día de Zileuton o de vehículo de control suplementado. Se indujo y se evaluó la EBA experimental [44]. Se redujo el porcentaje de ABSA y se concluyó que, "a partir del día 7 del experimento y hasta su finalización, los ratones tratados con Zileuton mostraron una reducción significativa de la gravedad de la enfermedad en comparación con el grupo de control (puntuación clínica del día 7; grupo de control: X=9,2±0,7; grupo tratado con Zileuton: X=5,9±0,5% de la superficie corporal afectada)".

[0147] En un experimento similar anterior en el que se administraron 20 mg/kg/día de Metilprednisolona en un modelo de transferencia de anticuerpos de EBA, el 7,5+0,1% de la superficie corporal estaba afectada por lesiones cutáneas en ratones de control al finalizar el experimento, pero esta gravedad de la enfermedad se redujo significativamente hasta el 4,7±0,4% en los ratones tratados con Metilprednisolona [45].

Ejemplo 2. Efecto de la Coversina en el modelo de transferencia de la EBA

[0148] El estudio incluyó los siguientes grupos experimentales, con 5 ratones en cada grupo experimental:

1. Grupo de control con vehículo (PBS)

2. 125 |jg/kg de Coversina 2 veces al día, SC

3. 2500 jg/kg de Coversina 2 veces al día, SC

[0149] Se indujo una inflamación cutánea similar a la transferencia de anticuerpos de EBA, tal y como se describe en Sezin et al [46]. En resumen, en los días 0, 2 y 4 a los ratones C57Bl/6J WT se les inyectaron por vía subcutánea (SC) 50 jg de IgG anti-Col7 purificada por afinidad.

[0150] El tratamiento de los ratones con Coversina comenzó el día 5 del experimento (Día 0 = día de la primera administración del anticuerpo anti-C0L7). Después, a los ratones se les inyectó Coversina o vehículo de control cada 12 horas SC en la región escapular hasta el final del experimento.

[0151] Se puntuó la gravedad de la enfermedad. Para puntuar la gravedad de la enfermedad, un único examinador cualificado y ciego al tratamiento clasificó como 'afectadas' las zonas de la piel que presentaban eritema, ampollas, erosiones, costras o alopecia. Se calculó el porcentaje de la superficie corporal absoluta afectada por lesiones cutáneas (ABSA). Para puntuar la enfermedad, se anestesió a los ratones cada dos días con una mezcla de ketamina/xilacina administrada i.p. a partir del día 4 del experimento.

[0152] Se realizaron dos experimentos independientes siguiendo este protocolo.

[0153] Preparación del elemento de prueba

Se reconstituyeron 18 mg de Coversina con 0,6 ml de agua esterilizada para obtener una concentración de 30 mg/ml, se alicuotaron y se almacenaron a -20°C hasta la dilución final.

[0154] Antes del inicio del experimento se calculó el peso medio de los ratones y se prepararon 2,5 mg/kg y 0,125 mg/kg del fármaco fresco hasta un volumen final de 100 j l en PBS con un pH de 7.2. El fármaco se preparó fresco dos veces al día 30 minutos antes de la inyección final en los ratones. Posteriormente, basándose en el peso medio de los ratones, el fármaco se ajustó con PBS de pH 7.2 hasta una concentración adecuada para proporcionar la dosis requerida de mg/kg en un volumen final de 100 jl. El fármaco se preparó fresco dos veces al día, 30 minutos antes de la aplicación final en los animales. Como vehículo de control, a los ratones se les inyectaron SC 100 j l de PBS con un pH de 7.2.

Análisis estadístico

[0155] El ABSA entre los grupos de tratamiento se evaluó mediante un ANOVA de dos vías que se llevó a cabo usando GraphPad Prism 7.

RESULTAD0S

Signos clínicos y eficacia del tratamiento

[0156] En el Experimento 1, la Coversina mejoró la inflamación de la piel en función de la dosis y tomando como medida el área de superficie corporal absoluta afectada (ABSA). 2,5 mg/kg de Coversina resultaron eficaces para reducir el ABSA (Figura 6). En el grupo de control negativo (vehículo), el ABSA fue de aproximadamente un 7% en el experimento 1, el cual es un valor típico que se obtiene en este modelo. Todos los ratones del grupo de control negativo mostraron una respuesta inflamatoria similar.

[0157] En el segundo experimento, 2,5 mg/kg de Coversina mejoraron significativamente (P<0,01) la inflamación cutánea medida según el (ABSA) (Figura 7). En este experimento, el ABSA en el grupo de control negativo (vehículo) alcanzó un pico medio de aproximadamente un 4%, que es un poco más bajo que el valor que se alcanza generalmente en este modelo.

[0158] No se produjo ninguna muerte durante el tratamiento de los ratones en ninguno de los dos experimentos. Se sacrificó a los ratones el día 12 tras el inicio de la transferencia pasiva de Col7 IgG.

Ejemplo 3. C5 y LTB4 en líquido de ampollas de pacientes

[0159] Se analizaron los niveles de C5a y LTB4 en el líquido de las ampollas de 4 pacientes con penfigoide ampollar. Los resultados de cada uno de los 4 pacientes se muestran en la Figura 9A (C5a) y la Figura 9B (LTB4). El líquido ampollar se aspiró con una jeringa de las ampollas de cuatro pacientes con PA ingresados en una clínica de hospitalización con PA agudo. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Los niveles de LTB4 y C5a se midieron en el líquido utilizando kits ELISA de R&D Systems.

Ejemplo 4. Comparación del efecto de doble acción y de acción simple de la Coversina

[0160] En otro experimento se evaluó el efecto de la PAS-L-Coversina. Se trató a ratones con 0,1 mg/kg, 10 mg/kg o 1 mg/kg de PAS-L-Coversina, o con 2,5 mg/kg de Coversina, de manera que el experimento se llevó a cabo tal y como se ha descrito anteriormente. La PAS-L-Coversina tiene una secuencia PAS fusionada con el extremo N-terminal de la secuencia de Coversina, que se ha mutado de tal manera que se une al LTB4 pero no se une al C5 (denominada 'L-Coversina'). La secuencia de la L-Coversina es una variante de la secuencia de Coversina madura (SEQ ID NO: 4) en la que se han modificado los siguientes residuos: Ala44 a Asn, Met116 a Gln, Leu117 a Ser, Gly121 a Ala, Leu122 a Asp, Glu123 a Ala y Asp149 a Gly (denominada variante 2, la secuencia es la siguiente: dsesdctgse pvdafqafse gkeayvlvrs tdpkardclk gepNgekqdn tlpvmmtfkn gtdwastdwt ftldgakvta tlgnltqnre vvydsqshhc hvdkvekevp dyemwQSdag ADAveveccr qkleelasgr nqmyphlkGc (SEQ ID NO: 23), de manera que los cambios con respecto a la secuencia de Coversina nativa de SEQ ID NO:4 están en mayúscula). Debido al mayor peso molecular de la PAS-L-Cov, 10 mg/kg de PAS-L-Cov se corresponden con 2,5 mg/kg de Coversina. En el primer experimento (Figura 6A), la dosis de 10 mg/kg (pero no la de 1 mg/kg o la de 0,1 mg/kg) de PAS-L-Coversina redujo el ABSA en comparación con el control. En el segundo experimento (Figura 6B), la dosis de 10 mg/kg y la dosis de 1 mg/kg (pero no la dosis de 0,1 mg/kg) de PAS-L-Coversina redujeron el ABSA en comparación con el control. La dosis de 10 mg/kg de PAS-L-Coversina no resultó tan eficaz como la dosis molar equivalente de 2,5 mg/kg de Coversina (aunque la dosis de 10 mg/kg de PAS-L-Coversina muestra un efecto estadísticamente significativo en el segundo experimento). Esto sugiere que la doble actividad inhibidora de la Coversina (inhibición del C5 y el LTB4) proporciona un mayor beneficio terapéutico en este modelo.

REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACI0NES

1. Un agente que se usa en un método para tratar o prevenir el penfigoide ampollar o la epidermólisis bullosa adquirida en un sujeto, de manera que el agente es una proteína o una molécula de ácido nucleico que es, o que codifica:

(ii) un fragmento de una proteína, de manera que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y dicha proteína o fragmento se une al C5 para impedir la escisión del complemento C5 -por parte de la C5 convertasa- en el complemento C5a y el complemento C5b e inhibe la actividad del LTB4, de manera que el sujeto es un humano.

2. El agente que se usa de acuerdo con la reivindicación 1, de manera que el agente es, o codifica, una proteína que comprende una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2.

3. El agente que se usa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de manera que el agente es, o codifica, una proteína que comprende o está formada por la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2.

4. El agente que se usa de acuerdo con la reivindicación 1, de manera que el agente es, o codifica, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, en la que se han realizado hasta 10 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos.

5. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el agente se administra por vía subcutánea.

6. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el agente se administra en una dosis suficiente para unirse a la máxima cantidad posible de C5 y/o LTB4 disponibles en el sujeto, preferiblemente a todo el C5 disponible.

7. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el agente se administra en una dosis que es 1,5 veces la dosis molar necesaria para unirse a todo el C5 y/o el LTB4 disponibles en el sujeto.

8. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el método incluye administrar al sujeto una dosis de carga inicial del agente y después administrar las dosis de mantenimiento.

9. El agente que se usa en la reivindicación 8, de manera que hay una dosis de mantenimiento inicial y una o más dosis de mantenimiento adicionales.

10. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el método también comprende la administración de un segundo tratamiento para EAAs.

11. El agente que se usa en la reivindicación 10, de manera que el segundo tratamiento para EAAs se selecciona de entre la terapia sistémica con corticosteroides, la terapia tópica con corticosteroides, la terapia inmunosupresora y la terapia biológica inmunosupresora, de manera que opcionalmente el corticosteroide se selecciona de entre la prednisona y la prednisolona, la terapia inmunosupresora se selecciona de entre la metilprednisolona, el micofenolato, la azatioprina, la dapsona y la ciclofosfamida, y la terapia biológica inmunosupresora se selecciona de entre el rituximab y la inmunoglobulina G intravenosa (IVIG).

12. El agente que se usa en la reivindicación 11, de manera que el segundo tratamiento para EAAs es prednisona o prednisolona.

13. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el método sirve para tratar o prevenir el penfigoide ampollar.

14. El agente que se usa en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el agente es una proteína de fusión que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2, y (b) una segunda secuencia.

15. El agente que se usa en la reivindicación 14, de manera que la mencionada segunda secuencia es una secuencia PAS.