CN110896606B - 用于治疗自身免疫性水疱病的coversin - Google Patents
用于治疗自身免疫性水疱病的coversin Download PDFInfo
- Publication number
- CN110896606B CN110896606B CN201880041710.5A CN201880041710A CN110896606B CN 110896606 B CN110896606 B CN 110896606B CN 201880041710 A CN201880041710 A CN 201880041710A CN 110896606 B CN110896606 B CN 110896606B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coversin
- seq
- aibd
- treatment
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 118
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 43
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 144
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 142
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 89
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 79
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N 0.000 claims description 66
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 65
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 33
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 24
- 102100031506 Complement C5 Human genes 0.000 claims description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 claims description 11
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 9
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 claims description 8
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 claims description 8
- 206010056508 Acquired epidermolysis bullosa Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 claims description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 claims description 4
- 201000011114 epidermolysis bullosa acquisita Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 4
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 4
- 108010078546 Complement C5a Proteins 0.000 claims description 3
- 108010078596 Complement C5b Proteins 0.000 claims description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N Dapsone Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 3
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000860 dapsone Drugs 0.000 claims description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 3
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 claims description 3
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 claims description 3
- 229940125379 topical corticosteroid Drugs 0.000 claims description 2
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 claims 2
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 claims 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 136
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 99
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 94
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 89
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 87
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 87
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 67
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 48
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 47
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 39
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 38
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 27
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 25
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 22
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 19
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 18
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 13
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 12
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 12
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 9
- 101100236208 Homo sapiens LTB4R gene Proteins 0.000 description 9
- 102100033374 Leukotriene B4 receptor 1 Human genes 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 9
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 8
- 208000012192 Mucous membrane pemphigoid Diseases 0.000 description 8
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 8
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- MWLSOWXNZPKENC-SSDOTTSWSA-N zileuton Chemical compound C1=CC=C2SC([C@H](N(O)C(N)=O)C)=CC2=C1 MWLSOWXNZPKENC-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 8
- 229960005332 zileuton Drugs 0.000 description 8
- 102000016574 Complement C3-C5 Convertases Human genes 0.000 description 7
- 108010067641 Complement C3-C5 Convertases Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 101100437750 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) blt1 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101001017969 Homo sapiens Leukotriene B4 receptor 2 Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N disulfiram Chemical compound CCN(CC)C(=S)SSC(=S)N(CC)CC AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 6
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000004074 complement inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 4
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 4
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 4
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 4
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 3
- 108010089414 Anaphylatoxins Proteins 0.000 description 3
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 3
- 239000005944 Chlorpyrifos Substances 0.000 description 3
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100226491 Homo sapiens FAM83A gene Proteins 0.000 description 3
- 101001017968 Homo sapiens Leukotriene B4 receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100022364 Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase Human genes 0.000 description 3
- 102100035446 Protein FAM83A Human genes 0.000 description 3
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N chlorpyrifos Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000003603 dipeptidyl peptidase IV inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 102000043426 human LTB4R2 Human genes 0.000 description 3
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 3
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- -1 12-epi LTB4 Chemical class 0.000 description 2
- VNYSSYRCGWBHLG-CBBLYLIKSA-N 12-epi-leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-CBBLYLIKSA-N 0.000 description 2
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 2
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 2
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 2
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009299 Benign Mucous Membrane Pemphigoid Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 241000284156 Clerodendrum quadriloculare Species 0.000 description 2
- 108010017377 Collagen Type VII Proteins 0.000 description 2
- 102000004510 Collagen Type VII Human genes 0.000 description 2
- 241000258924 Ctenocephalides felis Species 0.000 description 2
- 102000011799 Desmoglein Human genes 0.000 description 2
- 108050002238 Desmoglein Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100033375 Leukotriene B4 receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 2
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- UCHDWCPVSPXUMX-TZIWLTJVSA-N Montelukast Chemical compound CC(C)(O)C1=CC=CC=C1CC[C@H](C=1C=C(\C=C\C=2N=C3C=C(Cl)C=CC3=CC=2)C=CC=1)SCC1(CC(O)=O)CC1 UCHDWCPVSPXUMX-TZIWLTJVSA-N 0.000 description 2
- 241000238890 Ornithodoros moubata Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000008223 Pemphigoid Gestationis Diseases 0.000 description 2
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000256103 Simuliidae Species 0.000 description 2
- 241000258242 Siphonaptera Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N captopril Chemical compound SC[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 2
- 229960000830 captopril Drugs 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 201000010002 cicatricial pemphigoid Diseases 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N eicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 2
- 210000000301 hemidesmosome Anatomy 0.000 description 2
- 102000047628 human LTB4R Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 229960005127 montelukast Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 2
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- KVVNHTMDRVYYII-NSHDSACASA-N (2s)-n-acetyl-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanamide Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NC(=O)C)=CNC2=C1 KVVNHTMDRVYYII-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- GWNVDXQDILPJIG-CCHJCNDSSA-N 11-trans-Leukotriene C4 Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C\C=C\C=C\[C@H]([C@@H](O)CCCC(O)=O)SC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O GWNVDXQDILPJIG-CCHJCNDSSA-N 0.000 description 1
- JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 15(S)-HETE Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 0.000 description 1
- BFWYTORDSFIVKP-VAEKSGALSA-N 15(S)-HPETE Chemical compound CCCCC[C@H](OO)\C=C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O BFWYTORDSFIVKP-VAEKSGALSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001480736 Amblyomma hebraeum Species 0.000 description 1
- 101100437757 Arabidopsis thaliana BLT gene Proteins 0.000 description 1
- 108010093579 Arachidonate 5-lipoxygenase Proteins 0.000 description 1
- 241000238888 Argasidae Species 0.000 description 1
- 108010000241 Arthropod Proteins Proteins 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000197194 Bulla Species 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150010738 CYP2D6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100114362 Caenorhabditis elegans col-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241001647374 Chlamydia felis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 229940124073 Complement inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000256057 Culex quinquefasciatus Species 0.000 description 1
- 102000010918 Cysteinyl leukotriene receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050001116 Cysteinyl leukotriene receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 241001480819 Dermacentor andersoni Species 0.000 description 1
- 241000577477 Dermacentor reticulatus Species 0.000 description 1
- 102000006375 Desmocollins Human genes 0.000 description 1
- 108010019063 Desmocollins Proteins 0.000 description 1
- 229940124213 Dipeptidyl peptidase 4 (DPP IV) inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100032249 Dystonin Human genes 0.000 description 1
- 108010013976 Dystonin Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061459 Gastrointestinal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000233007 Haemaphysalis inermis Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 101000700892 Homo sapiens ATP synthase protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 241001632576 Hyacinthus Species 0.000 description 1
- 241000750137 Hyalomma anatolicum anatolicum Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 241000238889 Ixodidae Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 101150014540 Ltb4r gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100236209 Mus musculus Ltb4r gene Proteins 0.000 description 1
- 101100236212 Mus musculus Ltb4r2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000255129 Phlebotominae Species 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 206010036229 Post inflammatory pigmentation change Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037898 Rash vesicular Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241001481704 Rhipicephalus appendiculatus Species 0.000 description 1
- 241000238680 Rhipicephalus microplus Species 0.000 description 1
- 240000003516 Rumex sanguineus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255632 Tabanus atratus Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 101100357018 Trypanosoma brucei brucei RNR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- YEEZWCHGZNKEEK-UHFFFAOYSA-N Zafirlukast Chemical compound COC1=CC(C(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C)=CC=C1CC(C1=C2)=CN(C)C1=CC=C2NC(=O)OC1CCCC1 YEEZWCHGZNKEEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 239000002160 alpha blocker Substances 0.000 description 1
- 229940124308 alpha-adrenoreceptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007774 anilox coating Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001659 chemokinetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000023819 chronic asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 108010044493 collagen type XVII Proteins 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002720 complement component C5 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 description 1
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001047 desmosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000013764 eosinophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000016178 immune complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003199 leukotriene receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032027 negative regulation of neutrophil apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940046781 other immunosuppressants in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057056 paraneoplastic pemphigus Diseases 0.000 description 1
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000011295 pitch Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- 102200094439 rs373359894 Human genes 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 230000003867 tiredness Effects 0.000 description 1
- 208000016255 tiredness Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- SYOKIDBDQMKNDQ-XWTIBIIYSA-N vildagliptin Chemical compound C1C(O)(C2)CC(C3)CC1CC32NCC(=O)N1CCC[C@H]1C#N SYOKIDBDQMKNDQ-XWTIBIIYSA-N 0.000 description 1
- 229960001254 vildagliptin Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 229960004764 zafirlukast Drugs 0.000 description 1
- MWLSOWXNZPKENC-UHFFFAOYSA-N zileuton Chemical compound C1=CC=C2SC(C(N(O)C(N)=O)C)=CC2=C1 MWLSOWXNZPKENC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
本发明涉及治疗或预防AIBD的方法。
Description
发明领域
本发明涉及治疗和预防自身免疫性水疱病的方法。
本文中提到的和本说明书结尾所列的所有文献均以引用的方式并入本文中。
背景技术
补体
补体系统是身体针对外来侵袭的自然防御机制的关键部分,并且它还参与发炎过程。血清中和细胞表面上的超过30种蛋白质参与补体系统的运行和调节。最近,已变得显而易见的是,除了可与有益过程和病理过程二者相关的补体系统的大致35种已知组分之外,补体系统自身还与具有不同功能如血管生成、血小板活化、葡萄糖代谢和精子发生的至少85种生物途径相互作用。
补体系统通过外来抗原的存在而活化。存在三种活化途径:(1)经典途径,其通过IgM和IgG复合物或通过识别碳水化合物而活化;(2)旁路途径,其通过非自身表面(缺少特异性调节分子)和通过细菌内毒素而活化;和(3)凝集素途径,其通过甘露聚糖结合凝集素(MBL)与病原体表面的甘露糖残基的结合而活化。三种途径包括通过在细胞表面上形成类似C31和C5转化酶而引起产生补体活化的事件的平行级联,从而引起炎症急性介质(C3a和C5a)的释放和攻膜复合物(MAC)的形成。经典和旁路途径中涉及的平行级联显示于图1中。
经典补体途径、旁路补体途径和凝集素补体途径在本文中统称为补体途径。C5b启动补体活化的‘晚期’事件。这些‘晚期’事件包括一系列的聚合反应,其中末端(terminal)补体组分相互作用以形成MAC,MAC在一些病原体的细胞膜中产生孔,这可能导致病原体死亡。末端补体组分包括C5b(其启动攻膜系统的组装)、C6、C7、C8和C9。
LTB4
白三烯B4(LTB4)是已描述的具有最强趋化性(chemotactic)和化学增活性(chemokinetic)的类二十烷酸,并且通过上调整合素来促进嗜中性粒细胞粘附至血管内皮[1]。它还是嗜中性粒细胞的完全促泌素(secretagogue),诱导嗜中性粒细胞聚集并且增加微血管渗透性。LTB4募集和活化自然杀伤细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。LTB4增加超氧自由基形成[2]且调节基因表达,包括产生多种可加强和延长组织炎症的促炎性细胞因子和介质[3,4]。LTB4还在诱导和管理适应性免疫反应中有作用。举例来说,调节树突状细胞运输至引流淋巴结[5,6]、从肺T细胞产生Th2细胞因子IL-13[7]、募集抗原特异性效应CD8+ T细胞[8]以及人类B淋巴细胞活化和增殖[9]。
白三烯B4(LTB4)和羟基类二十烷酸通过BLT1和BLT2 G蛋白偶联受体介导其作用[10,11]。人类BLT1为特异性针对LTB4的高亲和力受体(Kd 0.39-1.5nM;[12]),其中只有20位羟基取代的LTB4和12-epi LTB4能够在竞争性结合研究中取代LTB4[13]。人类BLT2对LTB4的亲和力(Kd 23nM)比BLT1对LTB4的亲和力低20倍,且通过结合较宽范围的类二十烷酸,包括12-epi LTB4、20位羟基取代的LTB4、12(S)-和15(S)-HETE以及12(S)-和15(S)-HPETE来活化[13]。人类BLT2与人类和小鼠BLT1具有45.2%和44.6%氨基酸同一性,而人类和小鼠BLT2具有92.7%同一性[11]。
虽然最近有报道称人类BLT1也在内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达,但是它主要在白细胞表面表达。人类BLT2表达于较宽范围的组织和细胞类型中。已描述了BLT1和BLT2的多种特异性拮抗剂,其抑制人类嗜中性粒细胞的活化、外渗(extravasation)和凋亡[14],并且减少炎症性关节炎[15]和肾缺血再灌注[16]的小鼠模型中由嗜中性粒细胞浸润引起的症状。越来越多的研究表明,BLT1和BLT2均可通过LTB4和羟基类二十烷酸介导病理效应[17],当然,尽管BLT1在一些病变例如小鼠中胶原蛋白诱发的关节炎中具有主导作用[18]。BLT1-/-缺陷小鼠也已突出显示了BLT1在炎症应答中引导嗜中性粒细胞迁移中的重要性。确切地说,用5LO缺陷小鼠品系显示了需要BLT1对嗜中性粒细胞的自分泌活化以便将嗜中性粒细胞募集至关节炎关节中[19]。
有多种市售药物靶向类二十烷酸。这些药物包括调节磷脂酶A2(PLA2)并由此抑制类二十烷酸前体二十碳四烯酸(AA)释放的糖皮质激素[20]、非类固醇消炎药(NSAID)和防止前列腺素和血栓素合成的其它COX2抑制剂[21]。还存在多种LK修饰剂,其抑制LTB4合成所需的5-LO酶(齐留通(Zileuton);[22]),或拮抗介导半胱胺酰基白三烯作用的CysLT1受体(扎鲁司特(Zafirlukast)和孟鲁司特(Montelukast))[23]。LK修饰剂为口服可用的且已由FDA批准用于治疗例如哮喘。市面上还没有特定作用于LTB4或其受体的药物。
自身免疫性水疱病(AIBD)
皮肤是身体最大的器官,其由五个不同的层构成。表皮为皮肤的最外保护层,且其粘附至真皮,真皮在表皮(表皮与真皮构成皮肤)与皮下组织之间。真皮主要由致密的不规则结缔组织组成,且通过基底膜紧密地连接到表皮。真皮和表皮粘附需要专门的蛋白质和结构,且这些层的分离导致水疱或大疱(bulla)。
在正常环境下,由于皮肤刺激或损伤而产生水疱,但在自身免疫性水疱病(AIBD)中,由于自身抗体攻击桥粒(desmosomal)或半桥粒结构蛋白而产生水疱。这些蛋白质对于基底膜区的恰当功能是必需的。在AIBD中,表皮和真皮的粘附由于由针对特定结构或蛋白质的自身抗体产生的攻击而被损坏,最终使得表皮和真皮分离且形成水疱。
因此,AIBD为一组自身免疫病症,其中主要影响皮肤的水疱性损伤的原因是针对皮肤抗原的自身抗体。在一些AIBD中,水疱也可形成于粘膜上(例如食管、肛门、口腔、鼻腔通道、生殖器和喉中)。
产生AIBD的风险因素包括老龄、药物治疗、病毒感染和暴露于UV辐射或X射线。
水疱性疾病的特定症状和严重程度因人而异,且在某些情况下,水疱性损伤可覆盖皮肤的很大一部分。还没有治愈AIBD的方法,但有治疗方法。在无此类治疗的情况下,这些疾病可能引起危及生命的并发症。
有若干不同类别的AIBD,包括天疱疮、类天疱疮、IgA介导的皮肤病和获得性大疱性表皮松懈症(EBA)。天疱疮、类天疱疮和IgA介导的皮肤病可进一步分解为额外的亚型。
“天疱疮”为由抗体介导的针对桥粒芯糖蛋白(desmogleins)的自身免疫反应引起的一组相关AIBD的通用术语。两种主要类型的天疱疮为寻常型天疱疮和落叶型天疱疮。
寻常型天疱疮是最常见形式的天疱疮,其特征是针对Dsg3的自身抗体(其中约50%的患者还具有针对Dsg1的自身抗体)和易于破裂且引起疼痛性糜烂的水疱。在大多数情况下,寻常型天疱疮首先产生于口腔中,接着为皮肤起水疱,尽管可能潜在地影响任何区域。
落叶型天疱疮由快速裂解以形成影响皮肤最上层的发痒、鳞片状、结痂性损伤的多个小水疱表征。通常首先影响头皮和面部。最终,可能会影响胸部、上背。损伤通常不疼痛。粘膜通常不受影响。这些患者具有针对Dsg1的自身抗体。
其他病症有时被分类为天疱疮的亚型,包括副肿瘤性天疱疮(其为源于肿瘤的AIBD,具有针对例如Dsg1和Dsg3的自身抗体)和天疱疮IgA(具有针对桥粒胶粘蛋白(desmocollin)的自身抗体)。
“类天疱疮”是指由水疱性皮疹表征的一组相关疾病。类天疱疮的主要形式为大疱性类天疱疮、粘膜性类天疱疮和妊娠性类天疱疮。
大疱性类天疱疮为由瘙痒症和硬质表皮下水疱表征的慢性皮肤病。观察到针对抗原BP180(也被称为肌张力异常蛋白(dystonin))和其NC16A域(位于胶原蛋白XVII中)的自身抗体。此目标抗原为半桥粒抗原。在数周内,水疱通常扩散至腹股沟、腋窝、腹部和屈肌皮肤,且损伤可变得广泛分布,覆盖很大一部分皮肤且水疱可形成于口腔内部。在大多数情况下,粘膜不受影响,并且当粘膜受影响时,也倾向于快速愈合。大疱性类天疱疮的损伤通常与强烈瘙痒相关。
粘膜性类天疱疮(MMP)(也被称为瘢痕性类天疱疮(CP))也与表皮下起水疱相关,主要影响粘膜(主要是口腔和眼睛,但鼻子、喉、生殖器和肛门也可能受影响)。MMP的症状在受影响个体中各不相同,其取决于涉及的特定部位和疾病进展。自身抗原也针对BP180,但已鉴别各种其它自身抗原。
获得性大疱性表皮松懈症相对罕见。在此病况中,还可见如BP中所见的真皮表皮分离。针对VII型胶原蛋白(其形成将表皮和BMZ连接至乳头状真皮的固定原纤维)的自身抗体在通常影响中年和老年人的此自身免疫皮肤病症中为特征性的。
大部分形式发生于中年个体中,通常为50多岁和60多岁的人。但是,自身免疫性水疱病会影响任何年龄的个体,包括儿童。这些病况的总发生率和流行率随着研究的特定群体而变化。举例来说,大疱性类天疱疮为西欧最常见的免疫性大疱性疾病,其中在英国的报道发生率为43/百万/年,并且在欧洲的其它部分为7-13/百万/年[24]。
AIBD诊断是基于临床评估、详细患者病史以及(例如在血液中或皮肤活检上)鉴别特征性自身抗体。免疫荧光分析是优选的诊断方法。
目前还没有治愈这些病症的方法,但是可以用例如皮质类固醇(如泼尼松)来控制这些病症。治疗可能耐受不良且可能与毒性相关[24]。举例来说,全身性皮质类固醇疗法(例如泼尼松和泼尼龙)可能有效,但是,这并非在所有情况下有效,并且用高剂量的皮质类固醇长期治疗可造成严重副作用。类固醇为一般和非特异性的消炎剂。其它免疫抑制剂在许多此类病况中用作“桥梁”,因为受试者无法持续接受长期高剂量的类固醇。
还使用局部皮质类固醇,但其用于广泛疾病可受实际因素(患者施用该治疗的能力)限制,且其可与全身性吸收和不良事件相关。也已使用免疫抑制药物(例如氨苯砜甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤或环磷酰胺)和免疫抑制生物疗法(例如利妥昔单抗和静脉内免疫球蛋白G(IVIG)),但可能具有副作用。
因此需要用于治疗和预防AIBD的新疗法。
补体抑制剂
WO 2004/106369(Evolutec Limited[25])涉及补体抑制剂。所公开的补体抑制剂的特定亚组针对C5且防止C5通过任何一个补体活化途径裂解为C5a和C5b。C5裂解的此类抑制剂的特定实例为由蜱物种非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)产生的蛋白质,其为由WO2004/106369的图4中示出的氨基酸序列的第19至168位氨基酸组成的蛋白质。在WO 2004/106369中,此蛋白质以名称“EV576”和“OmCI蛋白质”为人所知,且最近被称为“Coversin”(参见例如Joreet al.,Nature Structural&Molecular Biology,Structural basis fortherapeutic inhibition of complement C5,published on line on 28th March,2016-doi:10.1038/nsmb.3196)。此蛋白质在本文中称为“Coversin”。
在蜱中,Coversin表达为在成熟Coversin蛋白质的N末端处具有包含WO 2004/106369的图4中示出的氨基酸序列的第1至18位氨基酸的前导序列的前蛋白。前导序列在表达之后裂解。成熟蛋白质具有由WO 2004/106369的图4和本申请的图2中示出的氨基酸序列的第19至168位氨基酸组成的序列。
Coversin还能够抑制白三烯B4(LTB4)活性。可通过本领域中已知的标准体外分析来证明结合LTB4的能力,例如借助于Coversin与抗LTB4抗体竞争结合至标记的LTB4的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定。
有多个另外的专利申请,如WO 2007/028968、WO 2008/029167、WO 2008/029169、WO 2011/083317和WO 2016/198133,涉及在各种应用中使用Coversin或其功能等效物。WO2015/185760公开了Coversin和其结构等效物有效地防止C5的多态体(polymorphs)裂解,所述C5的多态体可能例如降低市售的C5补体抑制剂依库珠单抗(eculizumab)的治疗有效性。这些申请中未公开Coversin或其任何功能等效物在治疗AIBD中的用途。
已在AIBD的情况下论述了补体途径的潜在作用,但当前没有靶向补体的AIBD治疗,且未完全理解这些疾病的病理生理学。此外,还有证据证明,可直接地且在无补体活化的情况下诱发水疱形成[26],且在此基础上,在本领域中提出以阻断自身抗体结合,而非防止补体活化为目标的新疗法[26]。此外,外源性C5a或IL-17A无法克服Ltb4r1-/-小鼠中针对类天疱疮疾病样皮肤炎症的抗性[27]。
同样,已在AIBD中,且确切地说在疾病中的嗜中性粒细胞募集的情况下,论述了LTB4的作用,但同样,当前没有以此分子为靶标的针对这些病况的被批准的治疗。
相比之下,在产生本发明的研究中已显示,如上文所论述的结合LTB4并且还通过与C5结合来抑制补体途径的分子Coversin在AIBD小鼠模型中减小具有水疱的受影响体表面积(ABSA)。Coversin能够抑制补体(通过抑制C5)以及LTB4二者,因此在单独或与其它AIBD治疗组合来预防和治疗AIBD中特别有利。
发明简述
已显示Coversin减少EBA小鼠模型中的受影响体表面积(ABSA)百分比。实施例1显示,与未接受Coversin治疗的小鼠相比,在诱发疾病之前和期间施用Coversin引起了ABSA百分比减小(如通过测定展现红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤面积和计算受皮肤损伤影响的总身体表面(ABSA)的百分比来评估)。与使用其它药剂(齐留通(Zileuton)和甲泼尼龙)的类似实验相比,可在施用Coversin的情况下观测到较大效果,且这在较高浓度(例如2.5mg/kg和0.25mg/kg)下尤其明显。因此,Coversin似乎比当前用于治疗AIBD的全身性免疫抑制剂(甲泼尼龙)更有效,且比LTB4抑制剂(齐留通)更有效。还已显示(实施例2),在诱发疾病之后施用Coversin也可引起ABSA百分比减小。因此,Coversin靶向C5和LTB4二者的双重抑制活性似乎在AIBD治疗中特别有利。
使用具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽进行预防性实验。使用此药剂也观测到ABSA百分比的减小。具有C5结合活性和LTB4结合活性的药剂为优选的,但具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力或具有减少或缺乏的LTB4结合活性但保留C5结合能力的药剂可用于本发明。
因此,本发明的发明人已证明,施用蜱蛋白质Coversin(在本领域中和本文中也称为EV576和OmCI[25])可用于治疗或预防AIBD。
因此,本发明提供治疗或预防AIBD的方法,其包括施用治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物。
本发明还提供一种药剂,其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,用于治疗或预防AIBD的方法。
本发明还提供治疗或预防AIBD的方法,其包括施用治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子。
本发明还提供一种药剂,其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子,用于治疗或预防AIBD的方法。
本发明还提供治疗或预防AIBD的方法,其包括施用(a)治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,和(b)第二AIBD治疗。
本发明还提供(a)药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,和(b)第二AIBD治疗,用于治疗或预防AIBD的方法。
本发明还提供治疗或预防AIBD的方法,其包括施用(a)治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子,和(b)第二AIBD治疗。
本发明还提供(a)药剂,所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子,和(b)第二AIBD治疗,用于治疗或预防AIBD的方法。
本发明还提供减少治疗或预防AIBD所需的第二AIBD治疗的量,或减少治疗或预防AIBD所需的第二AIBD治疗的治疗持续时间的方法,所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,或编码所述药剂的核酸分子,和所述第二AIBD治疗。
本发明还提供降低患有AIBD的受试者的自身抗体滴度的方法,所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19至168的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,或编码所述药剂的核酸分子,所述方法可任选地包括施用第二AIBD治疗。
发明详述
疾病
受试者可患有AIBD、疑似患有AIBD或可处于产生AIBD的风险下。
AIBD优选地选自天疱疮、类天疱疮、IgA介导的皮肤病和获得性大疱性表皮松懈症(EBA)。天疱疮可为寻常型天疱疮或落叶型天疱疮。“类天疱疮”可为大疱性类天疱疮、粘膜性类天疱疮和/或妊娠性类天疱疮。优选地,AIBD为EBA或大疱性类天疱疮。实施例中使用的小鼠模型为EBA模型,但也为其它AIBD,尤其是大疱性类天疱疮提供信息。所有AIBD的致病机制类似,即,尤其强烈的嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞参与的免疫复合物形成和免疫反应发展。
可通过本领域中充分理解的常规诊断来确定这些疾病的存在(参见例如[28])。
处于产生AIBD的风险下的受试者可受益于施用本文中提及的药剂,以预防AIBD。AIBD,尤其是大疱性类天疱疮的风险因素包括遗传因素和其它诱发因素[29]。有报道称,患有BP和粘膜性类天疱疮的患者中存在II类主要组织相容性复合体(MHC II)基因HLA-DQB1*0301的遗传倾向性。线粒体编码的ATP合成酶8基因(MT-ATP8)中的多态性可与BP发病机制相关联。还包括CYP2D6基因多态性和FCγR IIIa多态性。
其它诱发因素包括:
1.药物:大部分诱发BP的药物含有或释放巯基(青霉胺、卡托普利、青霉素及其衍生物、呋喃苯胺酸和一些头孢菌素)。另外,已报道以下药物诱发BP:含有酚环的药物(一些头孢菌素和乙酰水杨酸);除卡托普利以外的血管收缩素转化酶抑制剂;大部分非类固醇消炎药;免疫调节剂(如疫苗);二肽基肽酶-IV抑制剂(格列汀(gliptin)),尤其维格列汀;和TNF-α阻断剂。
2.病毒:疫苗接种后
3.UV或X射线照射
约三分之一的BP患者患有神经精神病;中风、痴呆、帕金森氏病(Parkinsons)等。
就治疗或预防AIBD来说,优选具有这些风险因素中的一个或多个因素的受试者。
施用结果
受试者可由于治疗而具有降低的症状发生率、症状缓解、症状发生或复发的抑制或延缓或其组合。优选地,治疗引起典型病况症状的减少。举例来说,这可以体现于减小水疱尺寸、减少水疱数目、减小受影响的身体表面的百分比、降低水疱渗出程度、减少搔痒症或降低由水疱产生的感染的发生率和/或严重程度。一部分受试者的症状将完全消退且不会再复发。
可使用大疱性类天疱疮疾病活动性指数(BPDAI)来进行临床评分[30]。全局BPDAI由2个评分构成:总BPDAI活动性和BPDAI损伤。总BPDAI活动性评分为3个子分量的算术总和,即,皮肤水疱/糜烂、皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂。
BPDAI损伤评分为针对由更永久特征(例如,发炎后色素沉着过度、疤痕和其它)引起的损伤的区域性评级的项的算术总和。BPDAI定量损伤数目和大小阈值。基于受影响区域对损伤进行评级。BPDAI给予在BP中主要受影响的皮肤区域(如肢体)额外权重,且较少强调头皮和面部,以更好地区分BP的临床反应。
BPDAI总评分可在0至372范围内变化。对于BPDAI活动性为至多360(对于总皮肤活动性为最大240-[对于糜烂/水疱为120、对于风疹/红斑为120],对于粘膜活动性为120),且对于BPDAI损伤为0至12,其中较高评分指示较大疾病活动性或损伤。BPDAI总评分将用于评估受试者的入组。
BPDAI还具有被称为BPDAI-瘙痒症指数的独立主观量度。BPDAI瘙痒症分量是基于视觉模拟评分,测量在过去24小时(0-10)、过去一周(0-10)和过去一个月(0-10)期间的瘙痒严重程度,其中总评分为30。
优选地,治疗引起由大疱性类天疱疮疾病活动性指数(BPDAI)测量的一种或多种病征的评分减小。优选地,治疗引起皮肤水疱/糜烂、皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂中的任何一个或多个(例如2或3个)的评分减小。
在一个实施方案中,治疗引起皮肤水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起皮肤风疹/红斑的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起皮肤水疱/糜烂和皮肤风疹/红斑的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起皮肤水疱/糜烂和粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中,治疗引起BPDAI-瘙痒症指数的评分减小。
在一些实施方案中,效应可由减少或防止嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞参与来介导。
治疗还可以使得在疾病的一个或多个分期起始之前,或在疾病分期进展之间的潜伏期延长。在一些实施方案中,可预防起水疱。
治疗还可以使得自身免疫抗体滴度降低。
治疗还可以使得所需的第二AIBD治疗的量或持续时间减少。
因此,在本发明的另一实施方案中,提供一种减小患有AIBD的受试者的水疱尺寸和/或数目,或减小患有AIBD的受试者受影响的身体表面百分比的方法,所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,或编码所述药剂的核酸分子。这可以是单独的或与第二AIBD治疗一起。
本发明还提供一种药剂,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物、编码所述药剂的核酸分子,用于减小患有AIBD的受试者的水疱尺寸和/或数目,或减小患有AIBD的受试者受影响的身体表面百分比的方法。这可以是单独的或与第二AIBD治疗一起。
如上文所论述,本发明的药剂可与其它AIBD治疗组合使用。本发明的药剂与另一(此处称为“第二”)AIBD治疗的组合可使得第二AIBD的量与不存在用本发明的药剂治疗的情况下使用的量相比减少,或第二AIBD治疗的持续时间与不存在用本发明的药剂治疗的情况下使用的治疗的持续时间相比减少。鉴于某些已知治疗(如类固醇)的副作用,例如感染、糖尿病、骨质疏松、血栓症和胃肠溃疡,这是有利的。因此,如上文所详述,本发明还提供一种减少用于治疗的第二AIBD治疗的量或减少用第二AIBD治疗的持续时间的方法。
优选地,第二AIBD治疗选自全身皮质类固醇疗法、局部皮质类固醇疗法、免疫抑制疗法和免疫抑制生物疗法。
优选地,皮质类固醇选自泼尼松和泼尼龙。优选地,免疫抑制疗法选自甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、消炎抗生素(例如氨苯砜)和环磷酰胺。优选地,免疫抑制生物疗法选自利妥昔单抗(rituximab)和静脉内免疫球蛋白G(IVIG)。
当使用本发明的药剂和第二AIBD治疗时,其可一起或分开施用。可先施用本发明的药剂,随后施用第二AIBD治疗,或反之亦然。
因此,当本发明的药剂与一种或多种其它AIBD治疗组合使用,例如用于如上文描述的方法中时,这可以描述为药剂与第二AIBD治疗一起用于治疗或预防AIBD的方法,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物,或描述为第二AIBD治疗与药剂一起用于治疗或预防AIBD的方法,所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物。
当治疗引起第二AIBD治疗的量,或用第二AIBD进行治疗的持续时间减少时,所述减少与在不存在本发明的药剂的情况下使用的第二AIBD治疗的量相比可为至多或至少10、20、30、40、50、60、70、80%。
受试者
优选的受试者、药剂、剂量等为如本文中所公开。
任何提及的任何减少或增加均为疾病参数与在不存在所述治疗的情况下的所述受试者相比的减少或增加。优选地,参数可定量且当情况如此时,所述增加或减少优选为统计学显著的。举例来说,相比于在不存在治疗的情况下(例如在所述治疗开始之前)的参数,所述增加或减少可为至少3、5、10、15、20、30、40、50%或更大。
在本发明的实践中被施用药剂的受试者优选为哺乳动物,优选地为人类。被施用药剂的受试者处于AIBD的风险下或为患有AIBD的受试者。
本发明的方法还可以包含一个或多个以下的额外步骤:(i)确定受试者是否处于AIBD的风险下或患有AIBD,(ii)确定AIBD的严重程度,其可在施用Coversin之前和/或之后进行。
用于本发明的药剂
根据本发明的一个实施方案,药剂为Coversin自身或其功能等效物。在下文中,术语“Coversin型蛋白质”用作“包含图2中示出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或其功能等效物”的简写。
Coversin分离自非洲钝缘蜱的唾液腺。Coversin为脂质运载蛋白家族的外围成员,且为第一个显示抑制补体活化的脂质运载蛋白家族成员。Coversin抑制经典、旁路和凝集素补体途径,这是通过结合至C5且防止其通过C5转化酶裂解为C5a和C5b,从而抑制C5a(其为活性(例如促炎性)肽)的产生和MAC的形成来实现的。已证明,Coversin在大鼠、小鼠和人类血清中以大致0.02mg/ml的IC50结合至C5且防止其被C5转化酶裂解。
因此,Coversin型蛋白质可包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸或包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第1至168位氨基酸或由其组成。图2中给出的蛋白质序列的前18个氨基酸形成信号序列,其对于C5结合活性或对于LTB4结合活性来说不是必需的,因此可以例如为了重组蛋白产生效率而任选地省去。
已证明,Coversin蛋白质以使用表面等离子体共振(SPR)测定的1nM的Kd结合至C5[31]。Coversin型蛋白质(例如Coversin蛋白质的功能等效物)优选地保留结合C5的能力,适宜地以小于360nM、更适宜地小于300nM、最适宜地小于250nM、优选小于200nM、更优选小于150nM、最优选小于100nM、甚至更优选小于50、40、30、20或10nM且有利地小于5nM的Kd与C5结合,其中所述Kd使用表面等离子体共振,优选地根据[31]中描述的方法测定。
Coversin抑制经典补体途径、旁路补体途径和凝集素补体途径。优选地,Coversin型蛋白质以使C5的全局构象稳定但不直接阻断由三种活化途径的C5转化酶靶向的C5裂解位点的方式结合至C5。Coversin与C5的结合使得C5的全局构象稳定,但不阻断转化酶裂解位点。Coversin的功能等效物还优选地共有这些特性。
C5被C5转化酶裂解(图1)。此裂解的产物包括过敏毒素(anaphylatoxin)C5a和裂解复合物C5b,其促进形成C5b、C6、C7、C8和C9的复合物,也称为攻膜复合物(MAC)。C5a为高度促炎性肽,其与许多病理性发炎过程有关,包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化性、嗜中性粒细胞活化、增加毛细管渗透性和抑制嗜中性粒细胞凋亡[32]。
已开发结合和抑制C5的单克隆抗体和小分子来治疗各种疾病[33],尤其是PNH、银屑病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和移植排斥反应。但是,这些单克隆抗体中的一些与某些来自具有C5多态性的受试者的C5蛋白质不结合,因此对这些受试者无效[34]。优选地,Coversin型蛋白质不仅与野生型C5结合,并且还与来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗(eculizumab)治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5结合,并且抑制所述C5的裂解。术语“C5多态性”包括C5的任何型式,与野生型C5相比,所述C5的任何型式已通过插入、缺失、氨基酸取代、框移、截短(其中的任一个可为单个或多个)或这些改变中的一个或多个的组合而发生改变。在人类受试者中,野生型C5为具有登录号NP_001726.2(GI版:38016947)的C5蛋白质。C5多形性的实例包括在第885位氨基酸的多态性,例如Arg885Cys(由c.2653C>T编码)、p.Arg885His(由c.2654G>A编码)和Arg885Ser,其降低mAb依库珠单抗的有效性[34]。
可通过本领域中已知的标准体外分析来测定药剂结合C5,包括来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5的能力,例如通过表面等离子体共振或通过在将蛋白质与标记的C5一起在凝胶上孵育后进行的蛋白质印迹法来测定。优选地,Coversin型蛋白质与C5结合的Kd小于360nM、更适宜地小于300nM、最适宜地小于250nM、优选小于200nM、更优选小于150nM、最优选小于100nM、甚至更优选小于50、40、30、20或10nM且有利地小于5nM,其中所述C5为野生型和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5,其中使用表面等离子体共振,优选地根据[31]中描述的方法测定所述Kd。
与来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5相比,其对野生型C5的亲和力更高、更低或相同。
还可通过测量药剂在血清中抑制补体活化的能力来测定Coversin型蛋白质抑制补体活化的能力。举例来说,可通过本领域中已知或本文所述的任何方法来测量血清中的补体活性。
Coversin型蛋白质还可定义为具有抑制类二十烷酸活性的功能。还已证明,Coversin结合LTB4。Coversin蛋白质的功能等效物也可保留以与Coversin蛋白质类似的亲和力结合LTB4的能力。如果Coversin型蛋白质不保留C5结合能力,则此类Coversin型蛋白质应保留显著的LTB-4结合能力。
可通过本领域中已知的标准体外分析测定Coversin型蛋白质与LTB4的结合能力,例如借助于竞争结合至标记的LTB4的Coversin与抗LTB4抗体之间的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定来测定。使用荧光滴定获得的数据显示Coversin以200至300pM的Kd结合至LTB4。举例来说,可用分光荧光计,例如LS 50B分光荧光计(Perkin-Elmer,Norwalk,CT,USA)定量磷酸盐缓冲盐水(PBS)中Coversin与LTB4(CaymenChemicals,Ann Arbor,MI,USA)的结合活性。这可以如下进行:
将2mL PBS中的纯化的Coversin的100nM溶液置于配有电磁搅拌器的石英比色杯(10mm路径长度;Hellma,Mühlheim,Germany)中。将温度调节至20℃,且在达到平衡之后,在280nm(狭缝宽度:15nm)处激发蛋白质Tyr/Trp荧光。在对应于发射最大值的340nm(狭缝宽度:16nm)处测量荧光发射。逐步添加30μM LTB4配体的PBS溶液,直至20μL的最大体积(总样品体积的1%),且在孵育30s之后测量稳态荧光。为计算KD值,将数据标准化至100%的初始荧光强度,使用3μM N-乙酰基-色氨酰胺溶液的滴定校正内滤效应,并且相对于对应配体浓度标绘数据。接着,关于双分子复合物形成的基于质量作用定律的非线性最小平方回归用于利用Origin软件版本8.5(OriginLab,Northampton,MA,USA)使用公开的公式来拟合数据(Breustedt et al.,2006)[35]。
Coversin与LTB4结合的Kd可以小于1nM、更适宜地小于0.9nM、最适宜地小于0.8nM、优选小于0.7nM、更优选小于0.6nM、最优选小于0.5nM、甚至更优选小于0.4nM且有利地小于0.3nM,其中使用荧光滴定,优选地根据上述方法测定所述Kd。Coversin型蛋白质优选地共有这些特性。
Coversin型蛋白质(例如具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽)可例如以小于5nM、2nM或1nM、更适宜地小于0.9nM、最适宜地小于0.8nM、优选小于0.7nM、更优选小于0.6nM、最优选小于0.5nM、甚至更优选小于0.4nM且有利地小于0.3nM的Kd结合LTB4,其中使用荧光滴定,优选地根据上述方法测定所述Kd。
根据本发明的一个实施方案,Coversin型蛋白质可与野生型C5和来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5以及LTB4结合。
因此,Coversin型蛋白质可用以防止补体C5被C5转化酶裂解为补体C5a和补体C5b,并且还抑制LTB4活性。使用与C5和LTB4二者结合的药剂特别有利。C5和类二十烷酸途径均可促进AIBD中观测的病理现象。因此,与使用仅抑制补体介导的疾病和病症的发炎性效应中涉及的单一途径的药剂相比,通过使用抑制AIBD中涉及的多个途径的单一药剂,可实现增强的效应。还有与施用单一分子相关的其他实际优势。
优选地,本发明的药剂衍生自吸血性节肢动物。术语“吸血性节肢动物”包括从合适的宿主吸食血液的所有节肢动物,如昆虫、蜱、虱子、跳蚤和螨虫。优选地,药剂衍生自蜱,优选地衍生自非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)。
Coversin的功能等效物可为Coversin的同源物或片段,其保留与C5结合的能力,且防止C5被C5转化酶裂解为C5a和C5b,所述C5为野生型C5或来自具有C5多态性的受试者的C5。所述同源物或片段还可保留其与LTB4结合的能力。
Coversin的功能等效物还可为分子,所述分子在结构上与Coversin类似或含有类似或相同的三级结构,尤其在结合至C5(野生型C5或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5)和/或LTB-4的Coversin的一个或多个活性位点的环境中,如合成分子。上文给出的Jore等人参考文献中描述了与C5和LTB4结合所需的Coversin中的精确氨基酸残基。
同源物包括在图2中明确鉴别的Coversin序列的旁系同源物和直系同源物,包括例如来自包括以下的其它蜱物种的Coversin蛋白质序列:附加扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、血红扇头蜱(R.sanguineus)、囊形扇头蜱(R.bursa)、美洲钝眼蜱(A.americanum)、卡延钝眼蜱(A.cajennense)、希伯来钝眼蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具环牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安氏革蜱(D.andersoni)、边缘革蜱(D.marginatus)、变异革蜱(D.variabilis)、铁角血蜱(Haemaphysalis inermis)、蓝斑血蜱(Ha.leachii)、点状血蜱(Ha.punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、嗜驼璃眼蜱(Hy.dromedarii)、边纹璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、羊硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、肩突硬蜱(I.scapularis)、六角硬蜱(I.hexagonus)、波斯隐喙蜱(Argas persicus)、卷边隐喙蜱(A.reflexus)、游走钝缘蜱(Ornithodoros erraticus)、毛白钝缘蜱(O.moubata moubata)、豚钝缘蜱(O.m.porcinus)和萨维尼钝缘蜱(O.savignyi)。
术语“同源物”还包括来自以下物种的具有与Coversin等效功能的蛋白质:蚊类,包括库蚊属(Culex)、按蚊属(Anopheles)和伊蚊属(Aedes)物种,尤其是致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae);跳蚤,如猫栉头蚤(Ctenocephalides felis)(猫蚤);马蝇;白蛉;黑蝇;采采蝇;虱子;螨虫;水蛭和扁虫。天然Coversin蛋白质被认为以约18kDa的另外三种形式存在于非洲钝缘蜱中,且术语“同源物”意在包括这些替代形式的Coversin。
本领域技术人员知道鉴别图2中给出的Coversin序列的同源物的方法。举例来说,可通过公共以及私人的序列数据库的同源性搜索来鉴别同源物。适宜地,使用公开可用的数据库,但私人的或商用的数据库将同样适用,尤其当这些数据库含有公共数据库中未呈现的数据时。主数据库为存放有一级核苷酸或氨基酸序列的站点,可以是公开可用或商用的。公开可用的主数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(参见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、蛋白质数据库(Protein Data Base)(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)和次级数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商用数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq(之前属于IncytePharmaceuticals Inc.)。
通常,两个多肽之间(优选地在指定区域,如活性位点上)大于30%的同一性被认为是功能等效,且因此表明两个蛋白质同源。优选地,同源的蛋白质与图2中鉴别的Coversin蛋白质序列(SEQ ID NO:2)具有大于60%的序列同一性程度。更优选的同源物与图2中给出的Coversin蛋白质序列(SEQ ID NO:2)分别具有大于70%、80%、90%、95%、98%或99%的同一性程度。使用BLAST版本2.1.3,使用由NCBI(美国国家生物技术信息中心;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵;空位开放罚分=11且空位扩展罚分=1]测定如本文中所提及的同一性百分比。同一性%可以是在相关参考序列(例如SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸或SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸)的全长上。
因此可通过参照与参考序列的某一氨基酸序列的同一性%来描述Coversin型蛋白质,所述参考序列为,例如图2的SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或图2的SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸,例如描述为包含与图2的SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或图2的SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸具有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列或由其组成的蛋白质,当Coversin型蛋白质包含所述序列时,所述Coversin型蛋白质可为融合蛋白(与例如另一蛋白质,例如异源蛋白质)。合适的第二蛋白质描述于下文。
图2中给出的Coversin蛋白质序列的功能等效物包括与野生型序列相比含有例如1、2、3、4、5、7、10或更多个氨基酸,或至多1、2、3、4、5、7或10个氨基酸的氨基酸取代、插入或缺失(例如从N末端或C末端的缺失)的突变体,前提是此类突变体保留与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用艾库组单抗治疗无效,或降低艾库组单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。这是相对于相关参考序列(例如SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸或SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸)。因此,突变体可包括含有保守氨基酸取代的蛋白质,所述取代不会以不利方式影响蛋白质的功能或活性。此术语还包括天然生物变体(例如衍生出Coversin蛋白质的物种内的等位基因变体或地理变异)。还可通过Coversin序列中的特定残基的系统或定向突变设计具有改进的结合野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4的能力的突变体。
Coversin的功能等效物包括Coversin蛋白质的片段,前提是此类片段保留与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。片段可包括,例如,衍生自Coversin蛋白质序列(或同源物)的多肽,所述多肽为小于150个氨基酸、小于145个氨基酸,前提是这些片段保留与补体野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。片段可包括例如衍生自Coversin蛋白质序列(或同源物)的多肽,所述多肽为至少150氨基酸、至少145个氨基酸,前提是这些片段保留与补体野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。
任何功能等效物或其片段优选地保留存在于Coversin中的半胱氨酸残基的模式(pattern)。举例来说,所述功能等效物包含六个半胱氨酸残基,其以相隔32个氨基酸、相隔62个氨基酸、相隔28个氨基酸、相隔1个氨基酸和相隔21个氨基酸的距离相对于彼此间隔开,根据图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第1至168位氨基酸的序列从氨基端到羧基端排列。Coversin蛋白质的示例性片段公开于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14中。编码对应片段的DNA公开于SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13中。
作为此类片段的不仅包括在本文于图2中明确鉴别的非洲钝缘蜱Coversin蛋白质的片段,并且还包括如上文所述的此蛋白质的同源物的片段。通常,此类同源物的片段与图2中的Coversin蛋白质序列的片段的同一性大于60%,尽管更优选的同源物片段分别与图2中的Coversin蛋白质序列的片段的同一性大于70%、80%、90%、95%、98%或99%。优选地,此类片段将保留上文提及的半胱氨酸间距。当然可以通过野生型序列的系统突变或片段化,接着进行适当活性分析而合理地设计具有改进的特性的片段。片段可展现与Coversin类似或更大的针对C5(野生型或C5的多态性变体或二者)和/或LTB4的亲和力。这些片段的尺寸可以是上文所述的Coversin蛋白质的片段的尺寸。
如上文所论述,Coversin型蛋白质优选地与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效,或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5以及LTB4结合。具有减少或缺乏的C5结合能力但保留LTB4结合活性的Coversin型蛋白质也可用于本发明中。
不保留C5结合能力但保留LTB-4结合活性的Coversin型蛋白质公开于例如2017年4月21日提交的同处在申请状态中的英国专利申请第GB 1706406.4号(申请人参考号P070475GB),以及与本申请同一天提交的国际申请第PCT/EP2018/XXXXXX号(申请人参考号P070475WO)中,所述申请的全部内容以引入的方式并入本文中。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的此类Coversin型蛋白质可用于本发明的所有方面。
具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的此类Coversin型蛋白质可包含以下序列或由以下序列组成:
SEQ ID NO:22(GB 1706406.4的SEQ ID NO:5)为修饰的Coversin的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Met114变为Gln、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Asp118变为Asn、Ala119变为Gly、Gly120变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Asp且Val124变为Lys。(Coversin变体1)
SEQ ID NO:23(GB 1706406.4的SEQ ID NO:6)为修饰的Coversin的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala且Asp149变为Gly。(Coversin变体2)
SEQ ID NO:24(GB 1706406.4的SEQ ID NO:7)为修饰的Coversin的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu122变为Asp且Asp149变为Gly。(Coversin变体3)
SEQ ID NO:25(GB 1706406.4的SEQ ID NO:8)为修饰的Coversin的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn。(Coversin变体4)
SEQ ID NO:26(GB 1706406.4的SEQ ID NO:9)为在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27(GB 1706406.4的SEQ ID NO:10)为在Coversin变体1(SEQ ID NO:22)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28(GB 1706406.4的SEQ ID NO:11)为在Coversin变体2(SEQ ID NO:23)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29(GB 1706406.4的SEQ ID NO:12)为在Coversin变体3(SEQ ID NO:24)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。
具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的Coversin型多肽可被描述为修饰的Coversin多肽(例如其展现出白三烯或羟基类二十烷酸结合活性和减少或缺乏的C5结合)。提及的“修饰的Coversin多肽”应理解为是指SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4(即在SEQ ID NO:2的N末端有或没有18个氨基酸的信号序列的Coversin多肽)的修饰的型式。
此类多肽可展现出白三烯(leukotriene)或羟基类二十烷酸(hydroxyeicosanoid)结合活性和减少或缺乏的C5结合,且可包含其中进行1至30个氨基酸取代的SEQ ID NO:4,其中
(i)在SEQ ID NO:4的第114至124位中进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个:
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换;
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换;
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换;
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro、His或Thr替换;
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换;
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换;
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换;
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换;
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换;
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换;或/且其中
(ii)SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换;
或其片段,所述片段中在所述修饰的Coversin多肽的N末端缺失至多五个氨基酸。
如本文所用的LK/E结合活性是指结合至白三烯和羟基类二十烷酸(包括但不限于LTB4、B4异白三烯及其任何羟基化衍生物、HETE、HPETE和EET)的能力。LTB4结合尤其受关注。
具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽可由SEQ ID NO:2或4组成,根据下文的描述被修饰,或可包含SEQ ID NO:2或4,根据下文的描述被修饰。
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的未修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间形成环。此环具有下文所示的序列:
-Met-Trp-Met-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Val-(SEQ ID NO:26)
第一个Met在SEQ ID NO:4的第114位,并且在SEQ ID NO:2的第132位。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个:
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln或Ala替换;
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln或Ala替换;
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换,优选地被Ser或Ala替换;
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro、His或Thr替换,优选地被Asn替换;
e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Gly或Asn替换;
f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Ser或Asn替换;
g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Ala或Asn替换;
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换,优选地被Asp或Ala替换;
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换,优选地被Asp、Ala、Gln或Asn替换;
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Lys或Ala替换。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个:
a.Met114被Gln替换;
b.Met116被Gln替换;
c.Leu117被Ser替换;
d.Asp118被Asn替换;
e.Ala119被Gly替换;
f.Gly120被Ser替换;
g.Gly121被Ala替换;
h.Leu122被Asp替换;
i.Glu123被Asp或Ala替换;
j.Val124被Lys替换。
在修饰的Coversin多肽中,存在取代(a)-(j)中的二、三、四、五、六、七、八、九或十个。优选地,存在取代(a)-(j)中的两个或更多个、五个或更多个或八个或更多个。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met114被Gln替换;
b.Met116被Gln替换;
c.Leu117被Ser替换;
d.Asp118被Asn替换;
e.Ala119被Gly替换;
f.Gly120被Ser替换;
g.Gly121被Ala替换;
h.Leu122被Asp替换;
i.Glu123被Asp替换;
j.Val124被Lys替换。
任选地,在上文提及的修饰的Coversin多肽中,Trp115未被取代。优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环,所述环具有序列Gln-Trp-Gln-Ser-Asn-Gly-Ser-Ala-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:27)。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln替换;
b.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换,优选地被Ser替换;
c.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Ala替换;
d.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换,优选地被Asp替换;
e.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换,优选地被Asp替换。
在更特定实施方案中;
a.Met116被Gln替换;
b.Leu117被Ser替换;
c.Gly121被Ala替换;
d.Leu122被Asp替换;
e.Glu123被Ala替换。
任选地,在上文提及的此修饰的Coversin多肽中,Trp 115未被取代。任选地,在此实施方案中,Met114、Trp 115、Asp118、Ala119、Gly120和Val124未被取代,或被本文中其它地方提及的保守取代基取代。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环,所述环具有序列Met-Trp-Gln-Ser-Asp-Ala-Gly-Ala-Asp-Ala-Val(SEQ ID NO:28)。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln替换;
b.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换,优选地被Asp替换;
在更特定实施方案中;
a.Met116被Gln替换;
b.Leu122被Asp替换。
任选地,在上文提及的此修饰的Coversin多肽中,Trp 115未被取代。任选地,在此实施方案中,Met114、Trp 115、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Glu123和Val124未被取代。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环,所述环具有序列Met-Trp-Gln-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Asp-Glu-Val(SEQ ID NO:29)。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。
在优选实施方案中,SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
SEQ ID NO:4的第44位(或SEQ ID NO:2的第62位)的此取代可与本文中提及的任何其它取代进行组合。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的另一修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代(a)-(j)中的一个或多个:
a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln或Ala替换,例如被Gln替换;
b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Gln或Ala替换,例如被Gln替换;
c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换,优选地被Ser或Ala替换,例如被Ser替换;
d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro、His或Thr替换,优选地被Asn替换;
e.Ala119被Gly、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Gly或Asn替换,例如被Gly替换;
f.Gly120被Ser、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Ser或Asn替换,例如被Ser替换;
g.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Ala或Asn替换,例如被Ala替换;
h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换,优选地被Asp或Ala替换,例如被Asp替换;
i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换,优选地被Asp、Ala、Gln或Asn替换,例如被Asp或Ala替换;
j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换,优选地被Lys或Ala替换,例如被Lys替换;
且另外,SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换,优选地被Asn替换。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met116被Gln替换;
b.Leu117被Ser替换;
c.Gly121被Ala替换;
d.Leu122被Asp替换;
e.Glu123被Ala替换;
且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
在此实施方案的优选方面中,对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:28中所示。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met116被Gln替换;
b.Leu122被Asp替换;
且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。
在此实施方案的优选方面中,对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:29中所示。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly、Gln、Asn、Ala、Met、Arg、Lys、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换。在一些实施方案中,Coversin多肽被修饰,使得SEQ ID NO:4的Asp149被Gly替换。SEQ ID NO:4的第149位(SEQ ID NO:2的第167位)的此取代可与本文中提及的任何其它取代进行组合。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met116被Gln替换;
b.Leu117被Ser替换;
c.Gly121被Ala替换;
d.Leu122被Asp替换;
e.Glu123被Ala替换;
SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换,并且SEQ ID NO:4的Asp149被Gly149替换。
在此实施方案的优选方面中,对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:28中所示。
在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,Coversin多肽可被修饰,使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代:
a.Met116被Gln替换;
b.Leu122被Asp替换;
SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换,并且SEQ ID NO:4的Asp149被Gly149替换。
在此实施方案的优选方面中,对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:29中所示。
在本公开的各种方面和实施方案中,具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的未修饰的Coversin多肽存在1至30个氨基酸的差异。可对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的Coversin多肽进行任何修饰,其条件是与未修饰的Coversin多肽相比,所得的修饰的Coversin多肽展现出LK/E结合活性和减少或缺乏的C5结合。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:4的第6、38、100、128、129、150位的六个半胱氨酸氨基酸被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。
在一些修饰的Coversin多肽中,SEQ ID NO:4中的Asn60和Asn84各自被Gln替换。可通过定点突变进行此修饰,从而当在酵母中表达多肽时,防止N-连接高糖基化。
在一些修饰的Coversin多肽中,认为SEQ ID NO:4中的以下氨基酸中的一个或多个参与与LTB4结合,因此可以未修饰形式保留:Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。在一些修饰的Coversin多肽中,这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未修饰形式被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,这些氨基酸中的一个或多个可被保守取代。在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,这些氨基酸中的至多五个、十个或十五个或全部在本发明的修饰的Coversin多肽中被保守取代。
SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守:5、6、11、13-15、20-21、24-27、29-32、35-41、45、47-48、50、52-60、64、66、69-81、83、84、86、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。
认为SEQ ID NO:4中以下位置处的氨基酸参与与LTB4结合和/或在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守:5、6、11、13-15、18、20-21、24-27、29-32、35-41、43、45、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。
认为SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸参与与LTB4结合和/或在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守:5、6、11、13-15、18、20-21、24-25、27、30-32、35-41、43、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、98、100、102-104、112-113、115、126、128-129、132-139、145、148和150。
因此,在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中,以上氨基酸以未修饰形式被保留。在一些实施方案中,这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未修饰形式被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。在一些实施方案中,这些氨基酸中的一个或多个可被保守取代。在一些实施方案中,这些氨基酸中的至多5、10或15、20、25、30、40、50个或全部在本发明的修饰的Coversin多肽中被保守取代。
本文中提及的修饰的Coversin多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4通常有1至30个、优选地2至25个、更优选地3至20个、甚至更优选地4至15个氨基酸的差异。通常,所述差异为5至12个或6至10个氨基酸变化。举例来说,可在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中进行1至30个,或2至25个、3至30个、4至15个、5至12个或6至10个氨基酸取代。
与SEQ ID NO:4相比,在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:27所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有10个氨基酸取代。因此,在一些实施方案中,与SEQ ID NO:4相比,本文中提及的修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:22(例如在SEQ ID NO:27的环中)所示的取代以外的1-15、2-10、3-5或至多2、3、4或5个额外取代。
与SEQ ID NO:4相比,在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:28所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有5个氨基酸取代。因此,在一些实施方案中,与SEQ ID NO:4相比,本文中提及的修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:23(例如在SEQ ID NO:28的环中)所示的取代以外的1-20、2-15、3-10或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10个额外取代。所述额外取代优选地包括如本文中其它地方描述的第44和149位的取代。
与SEQ ID NO:4相比,在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:29所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有2个氨基酸取代。因此,在一些实施方案中,与SEQ ID NO:4相比,修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:24(例如在SEQ ID NO:29的环中的取代)所示的取代以外的1-25、2-12、3-15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。所述额外取代优选地包括如本文中其它地方描述的第44和149位的取代。
与SEQ ID NO:4相比,如本文中其它地方描述的在SEQ ID NO:4的第44位具有取代的修饰的Coversin多肽优选地具有1-25、2-12、3-15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。
除了上文明确提及的取代以外的取代优选为,例如根据下表的保守取代。第二列中的相同框和优选地第三列中的相同行中的氨基酸可彼此取代:
具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽可包含SEQ ID NO:22、23、24、25中的一个所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22、23、24、25中的一个所示的氨基酸序列组成。
本发明还涵盖上文提及的具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽的片段的用途,所述片段中从修饰的Coversin多肽的N末端缺失至多五个氨基酸。所述片段可对应于来自修饰的Coversin多肽的N末端的1、2、3、4或5个缺失。如果所得多肽保留所述修饰的Coversin的LK/E结合活性且具有减少或缺乏的补体抑制剂活性,则来自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的其它位置的缺失也被认为形成为本发明的一部分。
当使用具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽时,与SEQ ID NO:2或4中未修饰的Coversin多肽展现的结合相比,C5结合可例如减少至少2、5、10、15、20、50、100倍,或消除了C5结合。与SEQ ID NO:2或4中未修饰的Coversin多肽相比,C5结合可例如减少至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。修饰的Coversin多肽可以大于1微摩尔的KD结合C5,如通过表面等离子体共振,根据Roversi et al.(2013)J BiolChem.288,18789-18802中描述的方法,或如GB1706406.4的实施例2中所示地测定。
根据本发明使用的功能等效物可以是融合蛋白,例如通过将编码Coversin蛋白质的聚核苷酸框内克隆至异源蛋白质序列的编码序列获得的融合蛋白。当用于本文中时,术语“异源”意指除Coversin蛋白质或其功能等效物以外的任何多肽。可溶性融合蛋白可在其N末端或C末端包含的异源序列的实例如下:膜结合蛋白的胞外域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、PAS或XTEN或类似的非结构化多肽、多聚化域、胞外蛋白域、信号序列、输出序列或允许通过亲和色谱法纯化的序列。这些异源序列中的许多在表达质粒中可商购,因为这些序列通常被包括于融合蛋白中以在不显著损害与其融合的蛋白质的特异性生物活性的情况下提供额外特性[36]。此类额外特性的实例为(例如由于添加Fc区或PAS化[37])而导致的体液中持续时间更长的半衰期、细胞外定位或者如由例如组氨酸、GST、FLAG、抗生物素蛋白或HA标签的标签所允许的更容易的纯化程序。融合蛋白可另外含有连接子序列(例如长度为1-50个氨基酸),使得组分被此连接子序列隔开。
因此,融合蛋白为包含Coversin样蛋白质的蛋白质的实例,且以特定实例的方式包括包含PAS序列和Coversin型蛋白质序列的蛋白质。PAS序列描述于例如Schlapschy Met al.[37]和EP 08773567.6中,且PAS化的Coversin分子描述于Kuhn et al.[38]中。PAS化描述蛋白质与由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象上无序的多肽序列的基因融合。这是由XL Protein(http://xl-protein.com/)开发的技术,它以简单的方式将具有大流体动力学体积的溶剂化无规链(solvated random chain)连接至其所融合的蛋白质。多肽序列采用大体积无规卷曲结构。因此,所得融合蛋白的尺寸比其所融合的蛋白质大得多。已显示这会降低生物系统中的清除率。EP08773567.6以及上文的Schlapschy参考文献中描述了合适的PAS序列。任何合适的PAS序列均可用于所述融合蛋白中。实例包括由至少约100个氨基酸残基组成的氨基酸序列,所述氨基酸残基形成无规卷曲构象且由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基组成(或由脯氨酸和丙氨酸残基组成)。这可包含多个氨基酸重复序列,其中所述重复序列由Ala、Ser和Pro残基(或脯氨酸和丙氨酸残基)组成且其中不超过6个连续氨基酸残基为相同的。脯氨酸残基可占序列的氨基酸的4%以上且40%以下。所述序列可包含选自以下的氨基酸序列:
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:15);
AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:16);
APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:17),
SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:18),
SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:19),
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:20),和
ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:21)
或作为这些序列的整体一或部分形式的这些序列的环形排列型式或多聚体。在PAS序列中可存在这些重复序列中的一个重复序列(即SEQ ID NO 15-21中的一个)的例如5-40个、10-30个、15-25个、18-20个,优选地20-30个或30个,优选地15个拷贝。优选地,PAS序列包含30个拷贝的SEQ ID NO:15或其由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成。优选地,PAS序列(直接或通过连接子序列)融合至Coversin型蛋白质的N末端,且在某些优选实施方案中,Coversin型蛋白质可包含SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或由其组成(例如融合蛋白包含(a)由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成的PAS序列,和(b)SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸,其中(a)直接或通过连接子序列融合至(b)的N末端)。
融合蛋白可另外含有连接子序列(例如长度为1-50、2-30、3-20、5-10个氨基酸),使得组分由此连接子序列隔开。在一个实施方案中,连接子序列可为单个丙氨酸残基。
可通过宿主细胞中的表达以重组形式制备蛋白质和其功能等效物。此类表达方法是本领域技术人员众所周知的,并且[38]和[39]也详细地描述此类表达方法。Coversin蛋白质和其功能等效物的重组形式优选为未糖基化的。优选地,宿主细胞为大肠杆菌。
Coversin蛋白质和其功能等效物优选呈分离的形式,例如与表达其的宿主细胞和/或细胞生长培养基中的至少一种组分分离。在一些实施方案中,Coversin蛋白质或其功能等效物纯化到至少90%、95%或99%纯度,如例如通过电泳或色谱测定。也可使用蛋白质化学的常规技术制备本发明的蛋白质和片段。举例来说,可通过化学合成制备蛋白质片段。产生融合蛋白的方法在本领域中是标准操作,且为熟练的读者所知。举例来说,最常见的分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫技术可见于[38]或[41]中。
根据本发明的另一实施方案,药剂可为编码Coversin型蛋白质的核酸分子。举例来说,可使用基因疗法通过受试者中的相关细胞在体内或离体实现Coversin型蛋白质的内源性产生。另一方法为施用“裸DNA”,其中直接将治疗基因注射至血流或肌肉组织中。
优选地,此类核酸分子包含图2中的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的第55至507位碱基或由其组成。此核苷酸序列编码图2中的无信号序列的Coversin蛋白质。图2中的核苷酸序列的前54个碱基编码信号序列,其对于补体抑制活性或LTB4结合活性来说是非必需的。或者,核酸分子可包含图2中编码具有信号序列的蛋白质的核酸序列的第1至507位碱基或由其组成。
施用方式
不需要医学专业人员来施用Coversin型蛋白质,且这些分子被快速吸收。相比之下,许多重组抗体的吸收极为缓慢,因此需要在长时间内输注(例如静脉内输注)。因此,施用此类分子还需要医学专业人员。因此,除了具有更有效地抑制具有C5多态性的受试者中的补体途径活化的优势外,Coversin型蛋白质还具有比其它药剂,如抗体,例如依库珠单抗更易于施用的优势。
以治疗或预防有效量施用所述药剂。术语“治疗有效量”是指治疗AIBD所需的药剂的量。在此上下文中,“治疗”包括减轻病症的严重程度。
本文所用的术语“预防有效量”是指预防相关病况,例如AIBD所需的药剂的量。在此上下文中,“预防”包括减轻病症的严重程度,例如在开始施用药剂之前存在未检测到的病症的情况下。减轻病症的严重程度可为,例如本文中其它地方所论述的,减小水疱或受影响的身体表面的尺寸或数目。
减轻或改善是与在不施用如本文所述的药剂的情况下的结果相比。根据用于评估此类患者的标准指标来评估结果。就此可定量来说,在相对指标(例如水疱或受影响的身体表面的尺寸或数目)中存在至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%的减轻或改善。
优选地,药剂的剂量足以结合受试者中尽可能多的可用的C5,更优选所有可用的C5。或者,药剂的剂量足以结合受试者中尽可能多的可用的LTB4,更优选所有可用的LTB4。在一些方面,药剂的剂量足以结合尽可能多的可用的C5和LTB4,例如所有可用的C5和LTB4。供应的药剂的剂量可为结合受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的至少1×或1.5倍或两倍。供应的药剂的剂量可例如为结合受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的大约或至少1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或4倍。
优选地,剂量为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg、0.001mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至2mg/kg、0.1mg/kg至1mg/kg、0.2mg/kg至0.8mg/kg、0.3mg/kg至0.6mg/kg、0.4mg/kg至0.6mg/kg(例如约0.57mg/kg)。
治疗或预防有效量可另外以抑制末端(terminal)补体的方式来定义,例如与在不存在治疗的情况下的末端补体活性(TCA)相比,末端补体活性减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的量。可调节剂量和频率以将末端补体活性维持在所期望水平,其可为例如,相比于在不存在治疗的情况下的末端补体活性的10%或更小,例如9、8、7、6、5、4、3、2、1%或更小。
当给出剂量时,这涉及为蛋白质或其功能等效物的药剂的剂量。为核酸分子的药剂的适当剂量可用于产生这些水平。
可通过本领域中已知的标准分析来测量末端补体活性,例如使用Quidel CH50溶血分析和绵羊红血球裂解CH50分析。
需要施用的剂量的频率将取决于涉及的药剂的半衰期。Coversin蛋白质或其功能等效物可例如每日两次、每日一次或每2、3、4、5、6、7、10、15或20天或更长时间一次地施用。
可施用单一剂量或多个剂量。举例来说,可施用至少2、3、4、5、6、7或8个剂量。单一剂量为一个实施方案。精确剂量和剂量频率还可取决于施用时患者的状态。确定剂量时可考虑的因素包括治疗或预防的需要、患者的疾病状态的严重程度、患者的一般健康状况、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者对疗法的耐受性或应答。可通过常规实验确定精确量,但可能最终取决于临床医师的判断。
给药方案还可以采取初始“负荷剂量”后跟一个或多个后续“维持剂量”的形式。一般来说,负荷剂量将大于维持剂量。负荷剂量可比维持剂量大2、5、10倍或更多倍。负荷剂量可以单一剂量形式,或以特定时间范围内的一个或多个剂量形式施用。通常,负荷剂量将为单一24小时时段内施用的1、2、3、4或5个剂量。维持剂量可为以规律时间间隔重复的较低剂量。维持剂量可以一定间隔,如每3、4、6、8、12、24或48小时重复。可通过常规实验确定精确方案,但可能最终取决于临床医师的判断。维持剂量可为初始负荷剂量的至少20、30、40、50、60、70、80、90或100%,或初始负荷剂量的至多20、30、40、50、60、70、80、90或100%。
在另一实施方案中,在整个疗程中使用相同剂量(例如每日一次或每日两次)。
负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg,且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间;或者,负荷剂量为0.001mg/kg至10mg/kg且维持剂量为0.001mg/kg至10mg/kg,或者,负荷剂量为0.01mg/kg至2mg/kg且维持剂量为0.01mg/kg至2mg/kg;或者,负荷剂量为0.1mg/kg至1mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至1mg/kg;或者,负荷剂量为0.1mg/kg至1mg/kg且维持剂量为0.05mg/kg至0.5mg/kg;或者,负荷剂量为0.2mg/kg至0.8mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.4mg/kg;或者,负荷剂量为0.3mg/kg至0.7mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.3mg/kg;或者,负荷剂量为0.4mg/kg至0.6mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.2mg/kg,例如其中负荷剂量为0.57mg/kg且维持剂量为0.14mg/kg。例如,0.6mg/kg-1.8mg/kg的负荷剂量后跟0.2mg/kg-0.6mg/kg(例如0.3mg/kg)的维持剂量。
负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg,且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间;或者,维持剂量可为0.001mg/kg至10mg/kg,或者,维持剂量可为0.01mg/kg至2mg/kg;或者,维持剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg;或者,维持剂量可为0.1mg/kg至0.8mg/kg;或者,维持剂量可为0.1mg/kg至0.6mg/kg;或者,维持剂量可为0.1mg/kg至0.4mg/kg;或者,维持剂量可为0.1mg/kg至0.2mg/kg。
负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg,且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间;或者,负荷剂量可为0.001mg/kg至10mg/kg,或者负荷剂量可为0.01mg/kg至2mg/kg;或者,负荷剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg;或者,负荷剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg;或者,负荷剂量可为0.2mg/kg至0.8mg/kg;或者,负荷剂量可为0.3mg/kg至0.6mg/kg;或者,负荷剂量可为0.4mg/kg至0.6mg/kg,或0.6mg/kg至1.8mg/kg。
药剂一般与药学上可接受的载体联合施用。如本文所用,术语“药学上可接受的载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和非活性病毒颗粒或实际上任何其它试剂,前提是载体本身不诱发毒性效应或引起产生对接受药物组合物的个体有害的抗体。药学上可接受的载体可另外含有液体,如水、生理盐水、甘油、乙醇或助剂物质,如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。因此,所用的药物载体将根据施用途径而不同。载体可使得药物组合物能够被调配成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液以有助于患者摄入。[42]中详细论述了药学上可接受的载体。在优选实施方案中,药剂在水或PBS中施用。
药剂可通过任何已知的施用途径来递送。药剂可局部或全身地递送。药剂可通过肠道外途径递送(例如通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射或递送到组织的间隙空间)。组合物也可施用至损伤处。其它施用方式包括经口和经肺施用、栓剂和透皮(transdermal)或经皮(transcutaneous)施用、针和无针注射器(hypospray)。局部(local)施用包括体表(topical)施用,例如施用至皮肤,例如感染区域中。这可能在轻度AIBD,例如轻度BP中特别有用。
优选地,经由皮下注射递送药剂。在一些实施方案中,这是经由每日一次或两次的皮下注射,例如以0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg的初始负荷剂量,接着为0.0001mg/kg至20mg/kg的每日一次的维持剂量,或本文中其它地方公开的其它剂量。或者,可每隔一天经由皮下注射递送药剂。
在优选实施方案中,药剂经由每日一次的皮下注射以0.6mg/kg-1.8mg/kg(例如0.57mg/kg)的初始负荷剂量后跟0.2mg/kg-0.6mg/kg(例如0.3mg/kg)的每日一次的维持剂量,或经由每日一次的皮下注射以0.6mg/kg-3.6mg/kg(例如1.0mg/kg)的初始负荷剂量后跟0.2mg/kg-1.2mg/kg(例如0.6mg/kg)的每日一次的维持剂量递送。
优选地,疗程持续至少1、2、3、4、5或6周。
优选地,疗程持续直至受试者的症状减轻。因此,疗程可为持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40周施用药剂(例如每日)。
可在整个疗程中保持维持剂量(例如单一每日维持剂量)恒定或可在疗程期间修改(例如增加或减少)维持剂量(例如每日维持剂量)。可修改维持剂量以将末端补体活性维持在所期望水平,例如所述水平是与来自不存在治疗的情况下的所述患者的血清相比或与正常对照血清相比的10%或更小。所述或每一维持剂量可持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周,例如每日一次持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周。维持剂量可随着受试者症状改善而减小。药剂的量或药剂施用频率可随着受试者的症状改善而减小。
因此,可存在初始负荷剂量,接着为如上文所定义的维持剂量的初始维持剂量(例如每日初始维持剂量),和一个或多个另外的维持剂量(例如每日另外的维持剂量),例如至少2、3、4、5个另外的维持剂量。
因此,本发明进一步包括在受试者中治疗或预防AIBD的方法,其包括向受试者施用如上文所定义的初始负荷剂量的药剂,且接着施用如上文所定义的维持剂量(例如每日维持剂量)的药剂,其中存在初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。
因此,本发明进一步包括如上文所定义的药剂,用于在受试者中治疗或预防AIBD的方法,所述方法包括向受试者施用如上文所定义的初始负荷剂量的药剂,且接着施用如上文所定义的维持剂量(例如每日维持剂量)的药剂,其中存在初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。
可通过测试受试者中(例如来自受试者的生物样品中)的末端补体活性来确定一个或多个另外的维持剂量,并且基于末端补体活性水平和/或测试受试者的症状确定另外的维持剂量,并基于所述症状确定另外的维持剂量。方法可任选地进一步包括施用所述另外的维持剂量。所述另外的剂量可计算为处于将末端补体活性维持在所期望水平的水平。
当获取生物样品时,所述生物样品可为血液,例如全血或血清样品。方法任选地进一步包括获取样品的步骤,并且进一步任选地包括测定样品的TCA的步骤。
可通过测试受试者中(例如生物样品中)的末端补体活性来确定一个或多个另外的维持剂量,并且基于末端补体活性水平和/或测试受试者的症状确定另外的维持剂量,并基于所述症状确定另外的维持剂量。方法可任选地进一步包括施用所述另外的维持剂量。所述另外的剂量可计算为处于将末端补体活性维持在所期望水平的水平。
在某些方面,所期望的补体活性水平为与来自不存在治疗的情况下的所述受试者的血清相比或与正常对照血清相比的10%或更小。
在某些方面,如果TCA高于所期望水平,则增加所述维持剂量,且任选地其中如果TCA小于5、4、3、2、1%,则维持或减小剂量。
在某些方面,如果症状恶化,则增加所述维持剂量,且任选地其中如果症状改善,则维持或减小剂量。
在一些实施方案中,在开始治疗的一个月内、在开始治疗的两周内、在开始治疗的一周内测试受试者。在其它实施方案中,一天一次或至少一天一次、一周一次或至少一周一次、每两周一次或至少每两周一次、一个月一次或每两个月一次地测试受试者。
优选地,负荷剂量为1.2mg/kg或约1.2mg/kg蛋白质或功能等效物,且维持剂量为至少0.6mg/kg(例如至少0.7mg/kg、0.8-1.5、0.9-1.2或1.0-1.25mg/kg)或至多0.3mg/kg(例如至多0.2mg/kg、0.15-0.4、0.2-0.3mg/kg),且任选地,(i)所述维持剂量持续至少2、3、4、5、6周,和/或(ii)治疗持续至少6周,和/或(iii)治疗每日一次地持续至少3、4、5、6周。
优选地,负荷剂量为0.6-1.8mg/kg蛋白质或功能等效物,且维持剂量为0.2-0.6mg/kg,例如约0.3mg/kg,且(i)所述维持剂量持续至少2、3、4、5、6周,和/或(ii)治疗持续至少6周,和/或(iii)治疗每日一次地持续至少3、4、5、6周。
还可以采取不取决于所治疗的受试者的体重的固定剂量形式施用给药方案。可以单一剂量形式,或以特定时间范围内的一个或多个剂量形式施用所述固定剂量。对于典型的人类患者(例如体重在50kg与100kg之间的人类患者)来说,固定剂量可为1mg-100mgCoversin(SEQ ID NO:4)。Coversin型蛋白质和修饰的Coversin多肽的分子量可用于计算功能上等效的药剂的等效固定剂量。在一些实施方案中,固定剂量为1mg-80mg、1mg-50mg、5mg-80mg、5mg-50mg、10mg-60mg、10mg-50mg、20mg-50mg、20mg-40mg或25mg-35mg。优选地,固定剂量为30mg sCoversin(SEQ ID NO:4)或摩尔等效量的Coversin型蛋白质或修饰的Coversin多肽。通常,固定剂量为单一24小时时段内施用的1、2、3、4或5个剂量。固定剂量可以一定间隔,如每3、4、6、8、12、24或48小时重复。可通过常规实验确定精确方案,但可能最终取决于临床医师的判断。
附图说明
图1:补体活化的经典和旁路途径的示意图。酶组分,深灰色。星暴状图形(starburst)内是过敏毒素。
图2A:Coversin的一级序列。加下划线的是信号序列。半胱氨酸残基呈粗体。核苷酸和氨基酸数目显示在右侧。
图2B:Coversin变体的实例。
图3:媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明,与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比,用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善,实验1。
图4:媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明,与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比,用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善,实验2。与第一个实验相比,Coversin仅在2.5mg/kg剂量处具有比媒剂对照组更显著的效果。值得注意的是,在此实验中,对照组中的若干小鼠未产生显著水平的疾病,这可能是与第一个实验相比的此差异的原因。
图5:媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明,与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比,用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善,实验1和2结果的组合,双因素方差分析(two-way ANOVA)表明,在媒剂对照与250和2500μg/ml剂量的Coversin之间具有统计学显著差异。
图6A:媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明,用2.5mg/kg Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善(实施例4,实验1)。
图6B:媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明,用2.5mg/kg Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善(实施例4,实验2)。此处,10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin和2.5mg/kg Coversin均对ABSA显示统计学显著效应。
图6C:媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分。此图显示实施例4,实验1和2的结果的组合。
图7:治疗性施用Coversin对被动EBA小鼠模型中的类天疱疮疾病样皮肤炎症的病程的影响(实施例2,实验1)。Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症。数据表示为平均值+/-SEM;N=5只小鼠/组;关于统计显著性的双因素方差分析检验证明,媒剂对照与使用的所有剂量的Coversin之间具有显著差异。实验仅在雌性中进行。
图8:治疗性施用Coversin对被动EBA小鼠模型中的类天疱疮疾病样皮肤炎症的病程的影响(实施例2,实验2)。Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症。数据表示为平均值+/-SEM;N=5只小鼠/组;关于统计显著性的双因素方差分析检验证明,媒剂对照与使用的所有剂量的Coversin之间具有显著差异。实验仅在雄性中进行。
图9A显示大疱性类天疱疮患者的水疱液中的C5a水平。
图9B显示大疱性类天疱疮患者的水疱液中的LTB4水平。
图10显示具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的某些修饰的Coversin多肽的序列。
实施例
实施例1-Coversin在预防性施用Coversin的EBA转移模型中的作用
使用由Sitaru et al.,2005[43]描述的方案的经修改版本来诱发抗体转移EBA。在每个治疗组中测试五只小鼠。简单来说,在第0、2和4天向小鼠皮下注射50μg亲和纯化的抗Col7 IgG。在第一次注射抗Col7 IgG之前四天(第-2天)开始每天两次向小鼠皮下注射三个不同剂量的Coversin。在整个实验中继续此施用直至其最后一天(第11天)。在对照组中,小鼠仅每天一次地皮下接受媒剂,或20mg/kg甲泼尼龙。
为了产生针对鼠类VII型胶原蛋白的抗体(“抗COL7”),用200μg含有衍生自胶原蛋白VII的非胶原1(NC1)域的三种不同重组蛋白(“Col7A、B和C”)以及不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant)的蛋白混合物免疫新西兰白兔。通过使用蛋白G从经免疫兔的血清分离IgG,且随后用his-Col7对IgG进行亲和力纯化以特定地获得兔抗Col7IgG。通过在冷冻切片分析中测定效价和效力来对抗体进行质量检查。
从第4天开始,每隔一天对每只单个小鼠进行皮肤损伤程度评分。经过训练的观察员将展现出红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤区域分类为“受影响”或“不受影响”[错误!未定义书签。]。计算受皮肤损伤影响的总身体表面(ABSA)的百分比。
进行两个独立实验。
第一个实验的结果显示于图4中。可以看出,用25μg/kg Coversin治疗的小鼠中的ABSA百分比减小,且用Coversin以Coversin 2500μg/kg和Coversin 250μg/kg治疗的所述百分比进一步减小。媒剂与0.25mg/kg剂量之间存在63%差异。根据双尾t检验的此差异的P值为0.0023。媒剂和0.25mg/kg剂量在第10天的平均ABSA评分为6.23+1.1和2.65+0.4。平均值之后的值为SD。
Coversin比先前测试的分子在更大程度上减小ABSA百分比。举例来说,在先前的类似实验中,以预防性给药方案向C57BL/6J 8周龄雌性小鼠施用N-[1-(1-苯并噻吩-2-基)乙基]-N-羟基脲(齐留通),其为5-脂肪加氧酶抑制(5-LO)口服抑制剂(二十碳四烯酸级联的重要酶,并且参与生物活性白三烯(LT)的形成)。在此更早实验中,将小鼠分成两组,并且接受补充至其饮用水中的0.6-0.8毫克/小鼠/天的齐留通或媒剂对照。诱发且评估实验性EBA[44]。ABSA%减小,且可得出如下结论:“从实验的第7天开始且直至其终点,用齐留通治疗的小鼠比对照组展现显著减小的疾病严重程度(第7天的临床评分;对照组:齐留通治疗组:的受影响体表面积)”。
在类似的更早实验中,在EBA的抗体转移模型中施用20毫克/千克/天的甲泼尼龙,在实验结束时,对照小鼠的7.5±0.1%的体表面积受皮肤损伤影响,但此疾病严重程度在甲泼尼龙治疗小鼠中显著减小至4.7±0.4%[45]。
实施例2 Coversin在EBA转移模型中的作用
研究包括以下实验组,其中每个实验组有5只小鼠:
1.媒剂(PBS)对照组
2. 125μg/kg Coversin,2×每日,皮下
3. 2500μg/kg Coversin,2×每日,皮下
如Sezin et al.[46]中所述诱发抗体转移EBA样皮肤炎症。简单来说,在第0、2和4天向C57BL/6J WT小鼠皮下(s.c.)注射50μg亲和纯化的抗Col7 IgG。
从实验的第5天开始用Coversin治疗小鼠(第0天=首次施用抗COL7抗体的当天)。随后,每12小时向小鼠的肩胛区皮下注射Coversin或媒剂对照,直至实验结束。
对疾病严重程度进行评分。为了对疾病严重程度进行评分,由对治疗不知情的单个经过训练的审查员将展现出红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤区域分类为“受影响”。计算受皮肤损伤影响的绝对身体表面(ABSA)的百分比。为了对疾病进行评分,从实验的第4天开始每隔一天用腹膜内施用的氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行麻醉。
根据此方案进行两个独立实验。
测试物制备
18mg的Coversin用0.6ml无菌水复原以达到30mg/ml的浓度,经等分式样且储存于-20℃下直至最终稀释。
在实验开始之前,计算小鼠的平均体重,即时制备2.5mg/kg和0.125mg/kg药物至100μl最终体积的PBS pH 7.2中。每日两次在最终注射至小鼠之前30分钟即时制备药物。此后,基于小鼠的平均体重,用PBS pH 7.2将药物调节至适合于在100μl的最终体积中提供所需的mg/kg剂量的浓度。每日两次在向动物最终施用之前30分钟即时制备药物。作为媒剂对照,向小鼠皮下注射100μl PBS pH 7.2。
统计分析
使用GraphPad Prism 7通过双因素方差分析评估治疗组之间的ABSA。
结果
临床病征和治疗功效
在实验1中,Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症,其通过受影响的绝对体表面积(ABSA)测量。2.5mg/kg Coversin有效地减小ABSA(图6)。在实验1中,阴性对照(媒剂)组中的ABSA为约7%,其为此模型中获得的典型值。阴性对照组中的所有小鼠显示类似发炎性反应。
在实验2中,2.5mg/kg Coversin显著(P<0.01)改善皮肤炎症,其通过(ABSA)测量(图7)。在此实验中,阴性对照(媒剂)组中的ABSA在约4%的平均值处达到峰值,其略低于此模型中通常获得的值。
在两个实验中,在治疗期间未发生小鼠死亡。在开始Col7 IgG被动转移之后的第12天处死小鼠。
实施例3患者的水疱液中的C5和LTB4
测试来自4名大疱性类天疱疮患者的水疱液中的C5a和LTB4的水平。图9A(C5a)和9B(LTB4)显示4名患者各自的结果。用注射器从患有急性BP的四名入院的BP患者的水疱抽吸水疱液。立即用液氮冷冻样品。使用来自R&D Systems的ELISA试剂盒测量所述液体中的LTB4和C5a水平。
实施例4比较双重作用和单一作用Coversin的效应
在另一实验中,评估PAS-L-Coversin的效应。用0.1mg/kg、10mg/kg、1mg/kg PAS-L-Coversin或2.5mg/kg Coversin治疗小鼠,其中实验如上文所述地进行。PAS-L-Coversin具有融合至Coversin序列的N末端的PAS序列,所述Coversin序列已经突变以使其结合LTB4但不结合C5(称为“L-Coversin”)。L-Coversin序列的序列为成熟Coversin序列(SEQ IDNO:4)的变体,其中以下残基已被修饰:Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala,并且Asp149变为Gly,(称为变体2,序列为dsesdctgse pvdafqafse gkeayvlvrs tdpkardclk gepNgekqdn tlpvmmtfkn gtdwastdwtftldgakvta tlgnltqnre vvydsqshhc hvdkvekevp dyemwQSdag ADAveveccr qkleelasgrnqmyphlkGc(SEQ ID NO:23),其中与SEQ ID NO:4的天然Coversin序列相比的变化呈大写字母形式)。由于PAS-L-Cov的分子量较高,因此10mg/kg PAS-L-Cov对应于2.5mg/kgCoversin。在第一个实验(图6A)中,与对照相比,10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin减小ABSA,但1mg/kg或0.1mg/kg剂量并未减小ABSA。在第二个实验(图6B)中,与对照相比,10mg/kg剂量和1mg/kg的PAS-L-Coversin减小ABSA,但0.1mg/kg剂量并未减小ABSA。10mg/kg剂量PAS-L-Coversin不如摩尔等效的2.5mg/kg剂量的Coversin有效(尽管10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin在第二个实验中显示统计学显著效应)。这表明,Coversin的双重抑制活性(C5和LTB4抑制)在此模型中提供改进的治疗益处。
参考文献:
_________________________
[1]Hoover et al,1984,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.81,2191-2193
[2]Harrison and Murphy,1995,J.Biol.Chem.270,17273-17276
[3]Ford-Hutchinson,1990,Crit.Rev.Immunol.10,1-12
[4]Showell et al.,1995,J.Pharm.Exp.Ther.273,176-184
[5]Klaas et al,2005 J.Exp.Med.201,1281-1292
[6]Del Prete et al,2007 Blood,109,626-631
[7]Miyahara et al.,2006 A llergol Int.55,91-7
[8]Taube et al.,2006 J.Immunol.176,3157-3164
[9]Yamaoka et al.,1989 Immunol.143,1996-2000
[10]Yokomizo et al.,1997 Nature 387,620-624
[11]Yokomizo et al.,2000 J.Exp.Med.192,421-432
[12]Tager and Luster,2003 Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids69,123-134
[13]Yokomizo et al.,2001,J.Biol.Chem.276,12454-12459
[14]Kim,N.D.and Luster,A.D.(2007)The Scientific World Journal 7,1307-1328
[15]Kim et al.,2006.J.Exp.Med.203,829-835
[16]Noiri et al.,2000 Proc Nat Acad Sci USA 97,823-828
[17]Lundeen et al.,2006 J.Immunol.177,3439-3447
[18]Shao et al.,2006.J.Immunol.176,6254-6261
[19]Chen et al.,2006.J.Exp.Med.203,837-842
[20]Sebaldt et al.,1990 Proc Natl Acad Sd.U.S.A.8,6974-6978
[21]Curry et al.,2005 Journal of the American Animal HospitalAssociation 41,298-309
[22]Dube et al.,1998.Zileuton:the first leukotriene inhibitor for usein the management of chronic asthma.In:Drazen JM,Dahlen S,Lee TH,eds.Five-lipoxygenase Products in Asthma.New York,NY:Marcel Dekkar,Inc
[23]Sharma and Mohammed,2006 Immunopharmacology 14,10-16
[24]Venning,V.A.,British Journal of Dermatology,Volume 167,Issue 6,pages 1200–1214,December 2012
[25]WO2004/106369
_____________________________________________________________________
[26]Ujiie,H.,et al.,J Immunol.2014 Nov 1;193(9):4415-28
[27]Sezin T et al.,The Journal of Investigative Dermatology(2017),doi:
10.1016/j.jid.2016.12.021.
[28]Schmidt,E.E.,Dtsch Arztebl Int.2011 Jun;108(23):399–405.
[29]IS,et al,Bullous pemphigoid,Autoimmun Rev(2017),http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2017.03.010
[30]Murrell et al Definitions and outcome measures for bullouspemphigoid:Recommendations by an international panel of experts.J Am AcadDermatol.2012 Mar;66(3):479-85
[31]Roversi,P et al.Journal of Biological Chemistry 2013,288(26)18789-18802
[32]Guo,R.F.and P.A.Ward,Annu Rev Immunol,2005,23:p.821-52
[33]Ricklin D and Lambris J,Nature Biotechnology,25:1265-1275(2007)
[34]Nishimura,J et al.,New Engl J.Med.,30;7:632-639(2014)
[35]Breustedt D.A.,D.L.,Skerra A.(2006)Comparative ligand-binding analysisof ten human lipocalins.Biochim Biophys Acta 1764(2):161-173。
[36]Terpe K,Appl Microbiol Biotechnol,60:523-33,2003
[37]Schlapschy M et al.Protein Eng Des Sel.2013 Aug;26(8):489-501
[38]Kuhn et al Bioconjugate Chem.,2016,27(10),pp 2359–2371
[39]Sambrook et al.(2000)
[40]Fernandez and Hoeffler(1998)
[41]Ausubel et al.(1991)
[42]Remington's Pharmaceutical Sciences;Mack Pub.Co.,N.J.1991
[43]Sitaru,C.,et al.J Clin Invest 2005;115:870-8.
[44]Sezin,T PhD thesis,Lubeck University 2016 http://www.zhb.uni-luebeck.de/epubs/ediss1702.pdf
[45]Hellberg,L.,et al Journal of Investigative Dermatology(2013)133,2390–2399.
[46]Sezin T,Krajewski M,Wutkowski A,Mousavi S,Chakievska L,Bieber K,et al.The Leukotriene B4 and Its Receptor BLT1 Act as Critical Drivers ofNeutrophil Recruitment in Murine Bullous Pemphigoid-Like EpidermolysisBullosa Acquisita.J Invest Dermatol.2017,137(5):1104-13.
Claims (16)
1.药剂在制备用于在受试者中治疗或预防自身免疫性水疱病AIBD的药物中的用途,其中所述药剂为:
(i)由图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)的第1至168位或第19至168位氨基酸组成的蛋白质,或
(ii)融合蛋白,其包含(a)由SEQ ID NO: 2的第1至168位或第19至168位氨基酸的序列组成的蛋白质,和(b)PAS序列,
其中所述蛋白质或融合蛋白结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且结合至LTB4,并且
其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的所述药物,其中所述自身免疫性水疱病AIBD为大疱性类天疱疮BP或获得性大疱性表皮松懈症EBA。
2.药剂在制备用于在受试者中治疗或预防自身免疫性水疱病AIBD的药物中的用途,其中所述药剂为编码以下的核酸分子:
(i)由图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)的第1至168位或第19至168位氨基酸组成的蛋白质,或
(ii)融合蛋白,其包含(a)由SEQ ID NO: 2的第1至168位或第19至168位氨基酸的序列组成的蛋白质,和(b)PAS序列,
其中所述蛋白质或融合蛋白结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且结合至LTB4,并且
其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的所述药物,其中所述自身免疫性水疱病AIBD为大疱性类天疱疮BP或获得性大疱性表皮松懈症EBA。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述自身免疫性水疱病AIBD为大疱性类天疱疮BP。
4.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述自身免疫性水疱病AIBD为获得性大疱性表皮松懈症EBA。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述药剂经皮下施用。
6.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述受试者为人类。
7.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述药剂以足以结合所述受试者中尽可能多的可用的C5和/或LTB4的剂量施用。
8.根据权利要求7所述的用途,其中所述药剂以足以结合所有可用的C5的剂量施用。
9.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述药剂以结合所述受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的1.5倍的剂量施用。
10.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用初始负荷剂量的所述药剂且接着施用其维持剂量。
11.根据权利要求10所述的用途,其中存在一个初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。
12.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述治疗或预防进一步包括施用第二自身免疫性水疱病AIBD治疗,其中所述第二自身免疫性水疱病AIBD治疗选自全身皮质类固醇疗法、局部皮质类固醇疗法、免疫抑制疗法和免疫抑制生物疗法。
13.根据权利要求12所述的用途,其中皮质类固醇选自泼尼松和泼尼龙,所述免疫抑制疗法选自甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、氨苯砜和环磷酰胺,且所述免疫抑制生物疗法选自利妥昔单抗和静脉内免疫球蛋白G(IVIG)。
14.根据权利要求13所述的用途,其中所述皮质类固醇为泼尼松或泼尼龙。
15.根据权利要求1或2所述的用途,其中所述药剂是融合蛋白或编码融合蛋白,所述融合蛋白包含(a)SEQ ID NO: 2的第1至168位或第19至168位氨基酸的序列,和(b)PAS序列。
16.根据权利要求15所述的用途,其中所述融合蛋白包含(a)由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成的PAS序列,和(b)SEQ ID NO: 2的第19至168位氨基酸,其中(a)融合至(b)的N末端。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1706404.9A GB201706404D0 (en) | 2017-04-21 | 2017-04-21 | Method of treatment |
GBGB1706406.4A GB201706406D0 (en) | 2017-04-21 | 2017-04-21 | Method of treatment |
GB1706406.4 | 2017-04-21 | ||
GB1706404.9 | 2017-04-21 | ||
GB1706452.8 | 2017-04-24 | ||
GBGB1706452.8A GB201706452D0 (en) | 2017-04-24 | 2017-04-24 | Method of treatment |
PCT/EP2018/060241 WO2018193122A1 (en) | 2017-04-21 | 2018-04-20 | Coversin for the treatment of autoimmune blistering diseases |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110896606A CN110896606A (zh) | 2020-03-20 |
CN110896606B true CN110896606B (zh) | 2024-07-16 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102341407A (zh) * | 2009-02-05 | 2012-02-01 | 自然环境研究会 | 作为补体抑制剂的经修饰的omci |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102341407A (zh) * | 2009-02-05 | 2012-02-01 | 自然环境研究会 | 作为补体抑制剂的经修饰的omci |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7209637B2 (ja) | 自己免疫性水疱症の治療のためのコバーシン | |
TWI784988B (zh) | 治療發炎症狀的方法 | |
CN106659767B (zh) | 用于治疗具有c5多态性的患者的补体介导的疾病的毛白钝缘蜱补体抑制剂 | |
EP3612207B1 (en) | Coversin variants lacking c5 binding | |
JP7153669B2 (ja) | 瘢痕性眼炎症障害の治療のためのコバーシン | |
JP2004527242A (ja) | ヒスチジンリッチ糖タンパク質 | |
WO2021058117A1 (en) | Method of treatment of hematopoietic stem cell transplant associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma) | |
CN110896606B (zh) | 用于治疗自身免疫性水疱病的coversin | |
WO2020216513A1 (en) | Method of treatment | |
WO2020053206A1 (en) | Coversin for use in the treatment of rheumatic diseases | |
JP7511551B2 (ja) | 改変されたMHCクラスII DRα1ドメインを含む組換えポリペプチドおよび使用方法 | |
WO2024115767A1 (en) | Nomacopan-pas fusion proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |