CN110896606A

CN110896606A - 用于治疗自身免疫性水疱病的coversin

Info

Publication number: CN110896606A
Application number: CN201880041710.5A
Authority: CN
Inventors: 迈尔斯·安德鲁·纳恩; B·阿比扬卡; C·D·萨迪克
Original assignee: Volution Immuno Pharmaceuticals SA
Current assignee: Volution Immuno Pharmaceuticals SA
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2020-03-20
Also published as: WO2018193122A1; IL269895B1; EP3612208B1; US20200113971A1; PL3612208T3; DK3612208T3; IL269895A; EP4275696A1; EP3612208A1; US11730792B2; AU2018253962A1; JP7209637B2; KR102656199B1; JP2023040169A; US20240009270A1; ES2945433T3; CA3059657A1; KR20190139233A; JP2020517627A

Abstract

本发明涉及治疗或预防AIBD的方法。

Description

用于治疗自身免疫性水疱病的COVERSIN

发明领域

本发明涉及治疗和预防自身免疫性水疱病的方法。

本文中提到的和本说明书结尾所列的所有文献均以引用的方式并入本文中。

背景技术

补体

补体系统是身体针对外来侵袭的自然防御机制的关键部分，并且它还参与发炎过程。血清中和细胞表面上的超过30种蛋白质参与补体系统的运行和调节。最近，已变得显而易见的是，除了可与有益过程和病理过程二者相关的补体系统的大致35种已知组分之外，补体系统自身还与具有不同功能如血管生成、血小板活化、葡萄糖代谢和精子发生的至少85种生物途径相互作用。

补体系统通过外来抗原的存在而活化。存在三种活化途径：(1)经典途径，其通过IgM和IgG复合物或通过识别碳水化合物而活化；(2)旁路途径，其通过非自身表面(缺少特异性调节分子)和通过细菌内毒素而活化；和(3)凝集素途径，其通过甘露聚糖结合凝集素(MBL)与病原体表面的甘露糖残基的结合而活化。三种途径包括通过在细胞表面上形成类似C3¹和C5转化酶而引起产生补体活化的事件的平行级联，从而引起炎症急性介质(C3a和C5a)的释放和攻膜复合物(MAC)的形成。经典和旁路途径中涉及的平行级联显示于图1中。

经典补体途径、旁路补体途径和凝集素补体途径在本文中统称为补体途径。C5b启动补体活化的‘晚期’事件。这些‘晚期’事件包括一系列的聚合反应，其中末端(terminal)补体组分相互作用以形成MAC，MAC在一些病原体的细胞膜中产生孔，这可能导致病原体死亡。末端补体组分包括C5b(其启动攻膜系统的组装)、C6、C7、C8和C9。

LTB4

白三烯B4(LTB4)是已描述的具有最强趋化性(chemotactic)和化学增活性(chemokinetic)的类二十烷酸，并且通过上调整合素来促进嗜中性粒细胞粘附至血管内皮[1]。它还是嗜中性粒细胞的完全促泌素(secretagogue)，诱导嗜中性粒细胞聚集并且增加微血管渗透性。LTB4募集和活化自然杀伤细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。LTB4增加超氧自由基形成[2]且调节基因表达，包括产生多种可加强和延长组织炎症的促炎性细胞因子和介质[3,4]。LTB4还在诱导和管理适应性免疫反应中有作用。举例来说，调节树突状细胞运输至引流淋巴结[5,6]、从肺T细胞产生Th2细胞因子IL-13[7]、募集抗原特异性效应CD8+ T细胞[8]以及人类B淋巴细胞活化和增殖[9]。

白三烯B4(LTB4)和羟基类二十烷酸通过BLT1和BLT2 G蛋白偶联受体介导其作用[10,11]。人类BLT1为特异性针对LTB4的高亲和力受体(Kd 0.39-1.5nM；[12])，其中只有20位羟基取代的LTB4和12-epi LTB4能够在竞争性结合研究中取代LTB4[13]。人类BLT2对LTB4的亲和力(Kd 23nM)比BLT1对LTB4的亲和力低20倍，且通过结合较宽范围的类二十烷酸，包括12-epi LTB4、20位羟基取代的LTB4、12(S)-和15(S)-HETE以及12(S)-和15(S)-HPETE来活化[13]。人类BLT2与人类和小鼠BLT1具有45.2％和44.6％氨基酸同一性，而人类和小鼠BLT2具有92.7％同一性[11]。

虽然最近有报道称人类BLT1也在内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达，但是它主要在白细胞表面表达。人类BLT2表达于较宽范围的组织和细胞类型中。已描述了BLT1和BLT2的多种特异性拮抗剂，其抑制人类嗜中性粒细胞的活化、外渗(extravasation)和凋亡[14]，并且减少炎症性关节炎[15]和肾缺血再灌注[16]的小鼠模型中由嗜中性粒细胞浸润引起的症状。越来越多的研究表明，BLT1和BLT2均可通过LTB4和羟基类二十烷酸介导病理效应[17]，当然，尽管BLT1在一些病变例如小鼠中胶原蛋白诱发的关节炎中具有主导作用[18]。BLT1-/-缺陷小鼠也已突出显示了BLT1在炎症应答中引导嗜中性粒细胞迁移中的重要性。确切地说，用5LO缺陷小鼠品系显示了需要BLT1对嗜中性粒细胞的自分泌活化以便将嗜中性粒细胞募集至关节炎关节中[19]。

有多种市售药物靶向类二十烷酸。这些药物包括调节磷脂酶A2(PLA2)并由此抑制类二十烷酸前体二十碳四烯酸(AA)释放的糖皮质激素[20]、非类固醇消炎药(NSAID)和防止前列腺素和血栓素合成的其它COX2抑制剂[21]。还存在多种LK修饰剂，其抑制LTB4合成所需的5-LO酶(齐留通(Zileuton)；[22])，或拮抗介导半胱胺酰基白三烯作用的CysLT1受体(扎鲁司特(Zafirlukast)和孟鲁司特(Montelukast))[23]。LK修饰剂为口服可用的且已由FDA批准用于治疗例如哮喘。市面上还没有特定作用于LTB4或其受体的药物。

自身免疫性水疱病(AIBD)

皮肤是身体最大的器官，其由五个不同的层构成。表皮为皮肤的最外保护层，且其粘附至真皮，真皮在表皮(表皮与真皮构成皮肤)与皮下组织之间。真皮主要由致密的不规则结缔组织组成，且通过基底膜紧密地连接到表皮。真皮和表皮粘附需要专门的蛋白质和结构，且这些层的分离导致水疱或大疱(bulla)。

在正常环境下，由于皮肤刺激或损伤而产生水疱，但在自身免疫性水疱病(AIBD)中，由于自身抗体攻击桥粒(desmosomal)或半桥粒结构蛋白而产生水疱。这些蛋白质对于基底膜区的恰当功能是必需的。在AIBD中，表皮和真皮的粘附由于由针对特定结构或蛋白质的自身抗体产生的攻击而被损坏，最终使得表皮和真皮分离且形成水疱。

因此，AIBD为一组自身免疫病症，其中主要影响皮肤的水疱性损伤的原因是针对皮肤抗原的自身抗体。在一些AIBD中，水疱也可形成于粘膜上(例如食管、肛门、口腔、鼻腔通道、生殖器和喉中)。

产生AIBD的风险因素包括老龄、药物治疗、病毒感染和暴露于UV辐射或X射线。

水疱性疾病的特定症状和严重程度因人而异，且在某些情况下，水疱性损伤可覆盖皮肤的很大一部分。还没有治愈AIBD的方法，但有治疗方法。在无此类治疗的情况下，这些疾病可能引起危及生命的并发症。

有若干不同类别的AIBD，包括天疱疮、类天疱疮、IgA介导的皮肤病和获得性大疱性表皮松懈症(EBA)。天疱疮、类天疱疮和IgA介导的皮肤病可进一步分解为额外的亚型。

“天疱疮”为由抗体介导的针对桥粒芯糖蛋白(desmogleins)的自身免疫反应引起的一组相关AIBD的通用术语。两种主要类型的天疱疮为寻常型天疱疮和落叶型天疱疮。

寻常型天疱疮是最常见形式的天疱疮，其特征是针对Dsg3的自身抗体(其中约50％的患者还具有针对Dsg1的自身抗体)和易于破裂且引起疼痛性糜烂的水疱。在大多数情况下，寻常型天疱疮首先产生于口腔中，接着为皮肤起水疱，尽管可能潜在地影响任何区域。

落叶型天疱疮由快速裂解以形成影响皮肤最上层的发痒、鳞片状、结痂性损伤的多个小水疱表征。通常首先影响头皮和面部。最终，可能会影响胸部、上背。损伤通常不疼痛。粘膜通常不受影响。这些患者具有针对Dsg1的自身抗体。

其他病症有时被分类为天疱疮的亚型，包括副肿瘤性天疱疮(其为源于肿瘤的AIBD，具有针对例如Dsg1和Dsg3的自身抗体)和天疱疮IgA(具有针对桥粒胶粘蛋白(desmocollin)的自身抗体)。

“类天疱疮”是指由水疱性皮疹表征的一组相关疾病。类天疱疮的主要形式为大疱性类天疱疮、粘膜性类天疱疮和妊娠性类天疱疮。

大疱性类天疱疮为由瘙痒症和硬质表皮下水疱表征的慢性皮肤病。观察到针对抗原BP180(也被称为肌张力异常蛋白(dystonin))和其NC16A域(位于胶原蛋白XVII中)的自身抗体。此目标抗原为半桥粒抗原。在数周内，水疱通常扩散至腹股沟、腋窝、腹部和屈肌皮肤，且损伤可变得广泛分布，覆盖很大一部分皮肤且水疱可形成于口腔内部。在大多数情况下，粘膜不受影响，并且当粘膜受影响时，也倾向于快速愈合。大疱性类天疱疮的损伤通常与强烈瘙痒相关。

粘膜性类天疱疮(MMP)(也被称为瘢痕性类天疱疮(CP))也与表皮下起水疱相关，主要影响粘膜(主要是口腔和眼睛，但鼻子、喉、生殖器和肛门也可能受影响)。MMP的症状在受影响个体中各不相同，其取决于涉及的特定部位和疾病进展。自身抗原也针对BP180，但已鉴别各种其它自身抗原。

获得性大疱性表皮松懈症相对罕见。在此病况中，还可见如BP中所见的真皮表皮分离。针对VII型胶原蛋白(其形成将表皮和BMZ连接至乳头状真皮的固定原纤维)的自身抗体在通常影响中年和老年人的此自身免疫皮肤病症中为特征性的。

大部分形式发生于中年个体中，通常为50多岁和60多岁的人。但是，自身免疫性水疱病会影响任何年龄的个体，包括儿童。这些病况的总发生率和流行率随着研究的特定群体而变化。举例来说，大疱性类天疱疮为西欧最常见的免疫性大疱性疾病，其中在英国的报道发生率为43/百万/年，并且在欧洲的其它部分为7-13/百万/年[24]。

AIBD诊断是基于临床评估、详细患者病史以及(例如在血液中或皮肤活检上)鉴别特征性自身抗体。免疫荧光分析是优选的诊断方法。

目前还没有治愈这些病症的方法，但是可以用例如皮质类固醇(如泼尼松)来控制这些病症。治疗可能耐受不良且可能与毒性相关[24]。举例来说，全身性皮质类固醇疗法(例如泼尼松和泼尼龙)可能有效，但是，这并非在所有情况下有效，并且用高剂量的皮质类固醇长期治疗可造成严重副作用。类固醇为一般和非特异性的消炎剂。其它免疫抑制剂在许多此类病况中用作“桥梁”，因为受试者无法持续接受长期高剂量的类固醇。

还使用局部皮质类固醇，但其用于广泛疾病可受实际因素(患者施用该治疗的能力)限制，且其可与全身性吸收和不良事件相关。也已使用免疫抑制药物(例如氨苯砜甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤或环磷酰胺)和免疫抑制生物疗法(例如利妥昔单抗和静脉内免疫球蛋白G(IVIG))，但可能具有副作用。

因此需要用于治疗和预防AIBD的新疗法。

补体抑制剂

WO 2004/106369(Evolutec Limited[25])涉及补体抑制剂。所公开的补体抑制剂的特定亚组针对C5且防止C5通过任何一个补体活化途径裂解为C5a和C5b。C5裂解的此类抑制剂的特定实例为由蜱物种非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)产生的蛋白质，其为由WO2004/106369的图4中示出的氨基酸序列的第19至168位氨基酸组成的蛋白质。在WO 2004/106369中，此蛋白质以名称“EV576”和“OmCI蛋白质”为人所知，且最近被称为“Coversin”(参见例如Joreet al.,Nature Structural&Molecular Biology,Structural basis fortherapeutic inhibition of complement C5,published on line on 28^th March,2016-doi:10.1038/nsmb.3196)。此蛋白质在本文中称为“Coversin”。

在蜱中，Coversin表达为在成熟Coversin蛋白质的N末端处具有包含WO 2004/106369的图4中示出的氨基酸序列的第1至18位氨基酸的前导序列的前蛋白。前导序列在表达之后裂解。成熟蛋白质具有由WO 2004/106369的图4和本申请的图2中示出的氨基酸序列的第19至168位氨基酸组成的序列。

Coversin还能够抑制白三烯B4(LTB4)活性。可通过本领域中已知的标准体外分析来证明结合LTB4的能力，例如借助于Coversin与抗LTB4抗体竞争结合至标记的LTB4的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定。

有多个另外的专利申请，如WO 2007/028968、WO 2008/029167、WO 2008/029169、WO 2011/083317和WO 2016/198133，涉及在各种应用中使用Coversin或其功能等效物。WO2015/185760公开了Coversin和其结构等效物有效地防止C5的多态体(polymorphs)裂解，所述C5的多态体可能例如降低市售的C5补体抑制剂依库珠单抗(eculizumab)的治疗有效性。这些申请中未公开Coversin或其任何功能等效物在治疗AIBD中的用途。

已在AIBD的情况下论述了补体途径的潜在作用，但当前没有靶向补体的AIBD治疗，且未完全理解这些疾病的病理生理学。此外，还有证据证明，可直接地且在无补体活化的情况下诱发水疱形成[26]，且在此基础上，在本领域中提出以阻断自身抗体结合，而非防止补体活化为目标的新疗法[26]。此外，外源性C5a或IL-17A无法克服Ltb4r1-/-小鼠中针对类天疱疮疾病样皮肤炎症的抗性[27]。

同样，已在AIBD中，且确切地说在疾病中的嗜中性粒细胞募集的情况下，论述了LTB4的作用，但同样，当前没有以此分子为靶标的针对这些病况的被批准的治疗。

相比之下，在产生本发明的研究中已显示，如上文所论述的结合LTB4并且还通过与C5结合来抑制补体途径的分子Coversin在AIBD小鼠模型中减小具有水疱的受影响体表面积(ABSA)。Coversin能够抑制补体(通过抑制C5)以及LTB4二者，因此在单独或与其它AIBD治疗组合来预防和治疗AIBD中特别有利。

发明简述

已显示Coversin减少EBA小鼠模型中的受影响体表面积(ABSA)百分比。实施例1显示，与未接受Coversin治疗的小鼠相比，在诱发疾病之前和期间施用Coversin引起了ABSA百分比减小(如通过测定展现红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤面积和计算受皮肤损伤影响的总身体表面(ABSA)的百分比来评估)。与使用其它药剂(齐留通(Zileuton)和甲泼尼龙)的类似实验相比，可在施用Coversin的情况下观测到较大效果，且这在较高浓度(例如2.5mg/kg和0.25mg/kg)下尤其明显。因此，Coversin似乎比当前用于治疗AIBD的全身性免疫抑制剂(甲泼尼龙)更有效，且比LTB4抑制剂(齐留通)更有效。还已显示(实施例2)，在诱发疾病之后施用Coversin也可引起ABSA百分比减小。因此，Coversin靶向C5和LTB4二者的双重抑制活性似乎在AIBD治疗中特别有利。

使用具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽进行预防性实验。使用此药剂也观测到ABSA百分比的减小。具有C5结合活性和LTB4结合活性的药剂为优选的，但具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力或具有减少或缺乏的LTB4结合活性但保留C5结合能力的药剂可用于本发明。

因此，本发明的发明人已证明，施用蜱蛋白质Coversin(在本领域中和本文中也称为EV576和OmCI[25])可用于治疗或预防AIBD。

因此，本发明提供治疗或预防AIBD的方法，其包括施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物。

本发明还提供一种药剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，用于治疗或预防AIBD的方法。

本发明还提供治疗或预防AIBD的方法，其包括施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子。

本发明还提供一种药剂，其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子，用于治疗或预防AIBD的方法。

本发明还提供治疗或预防AIBD的方法，其包括施用(a)治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，和(b)第二AIBD治疗。

本发明还提供(a)药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，和(b)第二AIBD治疗，用于治疗或预防AIBD的方法。

本发明还提供治疗或预防AIBD的方法，其包括施用(a)治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子，和(b)第二AIBD治疗。

本发明还提供(a)药剂，所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子，和(b)第二AIBD治疗，用于治疗或预防AIBD的方法。

本发明还提供减少治疗或预防AIBD所需的第二AIBD治疗的量，或减少治疗或预防AIBD所需的第二AIBD治疗的治疗持续时间的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，或编码所述药剂的核酸分子，和所述第二AIBD治疗。

本发明还提供降低患有AIBD的受试者的自身抗体滴度的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸19至168的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，或编码所述药剂的核酸分子，所述方法可任选地包括施用第二AIBD治疗。

发明详述

疾病

受试者可患有AIBD、疑似患有AIBD或可处于产生AIBD的风险下。

AIBD优选地选自天疱疮、类天疱疮、IgA介导的皮肤病和获得性大疱性表皮松懈症(EBA)。天疱疮可为寻常型天疱疮或落叶型天疱疮。“类天疱疮”可为大疱性类天疱疮、粘膜性类天疱疮和/或妊娠性类天疱疮。优选地，AIBD为EBA或大疱性类天疱疮。实施例中使用的小鼠模型为EBA模型，但也为其它AIBD，尤其是大疱性类天疱疮提供信息。所有AIBD的致病机制类似，即，尤其强烈的嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞参与的免疫复合物形成和免疫反应发展。

可通过本领域中充分理解的常规诊断来确定这些疾病的存在(参见例如[28])。

处于产生AIBD的风险下的受试者可受益于施用本文中提及的药剂，以预防AIBD。AIBD，尤其是大疱性类天疱疮的风险因素包括遗传因素和其它诱发因素[29]。有报道称，患有BP和粘膜性类天疱疮的患者中存在II类主要组织相容性复合体(MHC II)基因HLA-DQB1*0301的遗传倾向性。线粒体编码的ATP合成酶8基因(MT-ATP8)中的多态性可与BP发病机制相关联。还包括CYP2D6基因多态性和FCγR IIIa多态性。

其它诱发因素包括：

1.药物：大部分诱发BP的药物含有或释放巯基(青霉胺、卡托普利、青霉素及其衍生物、呋喃苯胺酸和一些头孢菌素)。另外，已报道以下药物诱发BP：含有酚环的药物(一些头孢菌素和乙酰水杨酸)；除卡托普利以外的血管收缩素转化酶抑制剂；大部分非类固醇消炎药；免疫调节剂(如疫苗)；二肽基肽酶-IV抑制剂(格列汀(gliptin))，尤其维格列汀；和TNF-α阻断剂。

2.病毒：疫苗接种后

3.UV或X射线照射

约三分之一的BP患者患有神经精神病；中风、痴呆、帕金森氏病(Parkinsons)等。

就治疗或预防AIBD来说，优选具有这些风险因素中的一个或多个因素的受试者。

施用结果

受试者可由于治疗而具有降低的症状发生率、症状缓解、症状发生或复发的抑制或延缓或其组合。优选地，治疗引起典型病况症状的减少。举例来说，这可以体现于减小水疱尺寸、减少水疱数目、减小受影响的身体表面的百分比、降低水疱渗出程度、减少搔痒症或降低由水疱产生的感染的发生率和/或严重程度。一部分受试者的症状将完全消退且不会再复发。

可使用大疱性类天疱疮疾病活动性指数(BPDAI)来进行临床评分[30]。全局BPDAI由2个评分构成：总BPDAI活动性和BPDAI损伤。总BPDAI活动性评分为3个子分量的算术总和，即，皮肤水疱/糜烂、皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂。

BPDAI损伤评分为针对由更永久特征(例如，发炎后色素沉着过度、疤痕和其它)引起的损伤的区域性评级的项的算术总和。BPDAI定量损伤数目和大小阈值。基于受影响区域对损伤进行评级。BPDAI给予在BP中主要受影响的皮肤区域(如肢体)额外权重，且较少强调头皮和面部，以更好地区分BP的临床反应。

BPDAI总评分可在0至372范围内变化。对于BPDAI活动性为至多360(对于总皮肤活动性为最大240-[对于糜烂/水疱为120、对于风疹/红斑为120]，对于粘膜活动性为120)，且对于BPDAI损伤为0至12，其中较高评分指示较大疾病活动性或损伤。BPDAI总评分将用于评估受试者的入组。

BPDAI还具有被称为BPDAI-瘙痒症指数的独立主观量度。BPDAI瘙痒症分量是基于视觉模拟评分，测量在过去24小时(0-10)、过去一周(0-10)和过去一个月(0-10)期间的瘙痒严重程度，其中总评分为30。

优选地，治疗引起由大疱性类天疱疮疾病活动性指数(BPDAI)测量的一种或多种病征的评分减小。优选地，治疗引起皮肤水疱/糜烂、皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂中的任何一个或多个(例如2或3个)的评分减小。

在一个实施方案中，治疗引起皮肤水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起皮肤风疹/红斑的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起皮肤水疱/糜烂和皮肤风疹/红斑的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起皮肤风疹/红斑和粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起皮肤水疱/糜烂和粘膜水疱/糜烂的评分减小。在一个实施方案中，治疗引起BPDAI-瘙痒症指数的评分减小。

在一些实施方案中，效应可由减少或防止嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞参与来介导。

治疗还可以使得在疾病的一个或多个分期起始之前，或在疾病分期进展之间的潜伏期延长。在一些实施方案中，可预防起水疱。

治疗还可以使得自身免疫抗体滴度降低。

治疗还可以使得所需的第二AIBD治疗的量或持续时间减少。

因此，在本发明的另一实施方案中，提供一种减小患有AIBD的受试者的水疱尺寸和/或数目，或减小患有AIBD的受试者受影响的身体表面百分比的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，或编码所述药剂的核酸分子。这可以是单独的或与第二AIBD治疗一起。

本发明还提供一种药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物、编码所述药剂的核酸分子，用于减小患有AIBD的受试者的水疱尺寸和/或数目，或减小患有AIBD的受试者受影响的身体表面百分比的方法。这可以是单独的或与第二AIBD治疗一起。

如上文所论述，本发明的药剂可与其它AIBD治疗组合使用。本发明的药剂与另一(此处称为“第二”)AIBD治疗的组合可使得第二AIBD的量与不存在用本发明的药剂治疗的情况下使用的量相比减少，或第二AIBD治疗的持续时间与不存在用本发明的药剂治疗的情况下使用的治疗的持续时间相比减少。鉴于某些已知治疗(如类固醇)的副作用，例如感染、糖尿病、骨质疏松、血栓症和胃肠溃疡，这是有利的。因此，如上文所详述，本发明还提供一种减少用于治疗的第二AIBD治疗的量或减少用第二AIBD治疗的持续时间的方法。

优选地，第二AIBD治疗选自全身皮质类固醇疗法、局部皮质类固醇疗法、免疫抑制疗法和免疫抑制生物疗法。

优选地，皮质类固醇选自泼尼松和泼尼龙。优选地，免疫抑制疗法选自甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、消炎抗生素(例如氨苯砜)和环磷酰胺。优选地，免疫抑制生物疗法选自利妥昔单抗(rituximab)和静脉内免疫球蛋白G(IVIG)。

当使用本发明的药剂和第二AIBD治疗时，其可一起或分开施用。可先施用本发明的药剂，随后施用第二AIBD治疗，或反之亦然。

因此，当本发明的药剂与一种或多种其它AIBD治疗组合使用，例如用于如上文描述的方法中时，这可以描述为药剂与第二AIBD治疗一起用于治疗或预防AIBD的方法，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，或描述为第二AIBD治疗与药剂一起用于治疗或预防AIBD的方法，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物。

当治疗引起第二AIBD治疗的量，或用第二AIBD进行治疗的持续时间减少时，所述减少与在不存在本发明的药剂的情况下使用的第二AIBD治疗的量相比可为至多或至少10、20、30、40、50、60、70、80％。

受试者

优选的受试者、药剂、剂量等为如本文中所公开。

任何提及的任何减少或增加均为疾病参数与在不存在所述治疗的情况下的所述受试者相比的减少或增加。优选地，参数可定量且当情况如此时，所述增加或减少优选为统计学显著的。举例来说，相比于在不存在治疗的情况下(例如在所述治疗开始之前)的参数，所述增加或减少可为至少3、5、10、15、20、30、40、50％或更大。

在本发明的实践中被施用药剂的受试者优选为哺乳动物，优选地为人类。被施用药剂的受试者处于AIBD的风险下或为患有AIBD的受试者。

本发明的方法还可以包含一个或多个以下的额外步骤：(i)确定受试者是否处于AIBD的风险下或患有AIBD，(ii)确定AIBD的严重程度，其可在施用Coversin之前和/或之后进行。

用于本发明的药剂

根据本发明的一个实施方案，药剂为Coversin自身或其功能等效物。在下文中，术语“Coversin型蛋白质”用作“包含图2中示出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或其功能等效物”的简写。

Coversin分离自非洲钝缘蜱的唾液腺。Coversin为脂质运载蛋白家族的外围成员，且为第一个显示抑制补体活化的脂质运载蛋白家族成员。Coversin抑制经典、旁路和凝集素补体途径，这是通过结合至C5且防止其通过C5转化酶裂解为C5a和C5b，从而抑制C5a(其为活性(例如促炎性)肽)的产生和MAC的形成来实现的。已证明，Coversin在大鼠、小鼠和人类血清中以大致0.02mg/ml的IC50结合至C5且防止其被C5转化酶裂解。

因此，Coversin型蛋白质可包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸或包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第1至168位氨基酸或由其组成。图2中给出的蛋白质序列的前18个氨基酸形成信号序列，其对于C5结合活性或对于LTB4结合活性来说不是必需的，因此可以例如为了重组蛋白产生效率而任选地省去。

已证明，Coversin蛋白质以使用表面等离子体共振(SPR)测定的1nM的Kd结合至C5[31]。Coversin型蛋白质(例如Coversin蛋白质的功能等效物)优选地保留结合C5的能力，适宜地以小于360nM、更适宜地小于300nM、最适宜地小于250nM、优选小于200nM、更优选小于150nM、最优选小于100nM、甚至更优选小于50、40、30、20或10nM且有利地小于5nM的Kd与C5结合，其中所述Kd使用表面等离子体共振，优选地根据[31]中描述的方法测定。

Coversin抑制经典补体途径、旁路补体途径和凝集素补体途径。优选地，Coversin型蛋白质以使C5的全局构象稳定但不直接阻断由三种活化途径的C5转化酶靶向的C5裂解位点的方式结合至C5。Coversin与C5的结合使得C5的全局构象稳定，但不阻断转化酶裂解位点。Coversin的功能等效物还优选地共有这些特性。

C5被C5转化酶裂解(图1)。此裂解的产物包括过敏毒素(anaphylatoxin)C5a和裂解复合物C5b，其促进形成C5b、C6、C7、C8和C9的复合物，也称为攻膜复合物(MAC)。C5a为高度促炎性肽，其与许多病理性发炎过程有关，包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化性、嗜中性粒细胞活化、增加毛细管渗透性和抑制嗜中性粒细胞凋亡[32]。

已开发结合和抑制C5的单克隆抗体和小分子来治疗各种疾病[33]，尤其是PNH、银屑病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和移植排斥反应。但是，这些单克隆抗体中的一些与某些来自具有C5多态性的受试者的C5蛋白质不结合，因此对这些受试者无效[34]。优选地，Coversin型蛋白质不仅与野生型C5结合，并且还与来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗(eculizumab)治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5结合，并且抑制所述C5的裂解。术语“C5多态性”包括C5的任何型式，与野生型C5相比，所述C5的任何型式已通过插入、缺失、氨基酸取代、框移、截短(其中的任一个可为单个或多个)或这些改变中的一个或多个的组合而发生改变。在人类受试者中，野生型C5为具有登录号NP_001726.2(GI版:38016947)的C5蛋白质。C5多形性的实例包括在第885位氨基酸的多态性，例如Arg885Cys(由c.2653C>T编码)、p.Arg885His(由c.2654G>A编码)和Arg885Ser，其降低mAb依库珠单抗的有效性[34]。

可通过本领域中已知的标准体外分析来测定药剂结合C5，包括来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5的能力，例如通过表面等离子体共振或通过在将蛋白质与标记的C5一起在凝胶上孵育后进行的蛋白质印迹法来测定。优选地，Coversin型蛋白质与C5结合的Kd小于360nM、更适宜地小于300nM、最适宜地小于250nM、优选小于200nM、更优选小于150nM、最优选小于100nM、甚至更优选小于50、40、30、20或10nM且有利地小于5nM，其中所述C5为野生型和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5，其中使用表面等离子体共振，优选地根据[31]中描述的方法测定所述Kd。

与来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5相比，其对野生型C5的亲和力更高、更低或相同。

还可通过测量药剂在血清中抑制补体活化的能力来测定Coversin型蛋白质抑制补体活化的能力。举例来说，可通过本领域中已知或本文所述的任何方法来测量血清中的补体活性。

Coversin型蛋白质还可定义为具有抑制类二十烷酸活性的功能。还已证明，Coversin结合LTB4。Coversin蛋白质的功能等效物也可保留以与Coversin蛋白质类似的亲和力结合LTB4的能力。如果Coversin型蛋白质不保留C5结合能力，则此类Coversin型蛋白质应保留显著的LTB-4结合能力。

可通过本领域中已知的标准体外分析测定Coversin型蛋白质与LTB4的结合能力，例如借助于竞争结合至标记的LTB4的Coversin与抗LTB4抗体之间的竞争性ELISA、通过等温滴定量热法或通过荧光滴定来测定。使用荧光滴定获得的数据显示Coversin以200至300pM的Kd结合至LTB4。举例来说，可用分光荧光计，例如LS 50B分光荧光计(Perkin-Elmer,Norwalk,CT,USA)定量磷酸盐缓冲盐水(PBS)中Coversin与LTB4(CaymenChemicals,Ann Arbor,MI,USA)的结合活性。这可以如下进行：

将2mL PBS中的纯化的Coversin的100nM溶液置于配有电磁搅拌器的石英比色杯(10mm路径长度；Hellma,Mühlheim,Germany)中。将温度调节至20℃，且在达到平衡之后，在280nm(狭缝宽度：15nm)处激发蛋白质Tyr/Trp荧光。在对应于发射最大值的340nm(狭缝宽度：16nm)处测量荧光发射。逐步添加30μM LTB₄配体的PBS溶液，直至20μL的最大体积(总样品体积的1％)，且在孵育30s之后测量稳态荧光。为计算K_D值，将数据标准化至100％的初始荧光强度，使用3μM N-乙酰基-色氨酰胺溶液的滴定校正内滤效应，并且相对于对应配体浓度标绘数据。接着，关于双分子复合物形成的基于质量作用定律的非线性最小平方回归用于利用Origin软件版本8.5(OriginLab,Northampton,MA,USA)使用公开的公式来拟合数据(Breustedt et al.,2006)[35]。

Coversin与LTB4结合的Kd可以小于1nM、更适宜地小于0.9nM、最适宜地小于0.8nM、优选小于0.7nM、更优选小于0.6nM、最优选小于0.5nM、甚至更优选小于0.4nM且有利地小于0.3nM，其中使用荧光滴定，优选地根据上述方法测定所述Kd。Coversin型蛋白质优选地共有这些特性。

Coversin型蛋白质(例如具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽)可例如以小于5nM、2nM或1nM、更适宜地小于0.9nM、最适宜地小于0.8nM、优选小于0.7nM、更优选小于0.6nM、最优选小于0.5nM、甚至更优选小于0.4nM且有利地小于0.3nM的Kd结合LTB4，其中使用荧光滴定，优选地根据上述方法测定所述Kd。

根据本发明的一个实施方案，Coversin型蛋白质可与野生型C5和来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5以及LTB4结合。

因此，Coversin型蛋白质可用以防止补体C5被C5转化酶裂解为补体C5a和补体C5b，并且还抑制LTB4活性。使用与C5和LTB4二者结合的药剂特别有利。C5和类二十烷酸途径均可促进AIBD中观测的病理现象。因此，与使用仅抑制补体介导的疾病和病症的发炎性效应中涉及的单一途径的药剂相比，通过使用抑制AIBD中涉及的多个途径的单一药剂，可实现增强的效应。还有与施用单一分子相关的其他实际优势。

优选地，本发明的药剂衍生自吸血性节肢动物。术语“吸血性节肢动物”包括从合适的宿主吸食血液的所有节肢动物，如昆虫、蜱、虱子、跳蚤和螨虫。优选地，药剂衍生自蜱，优选地衍生自非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)。

Coversin的功能等效物可为Coversin的同源物或片段，其保留与C5结合的能力，且防止C5被C5转化酶裂解为C5a和C5b，所述C5为野生型C5或来自具有C5多态性的受试者的C5。所述同源物或片段还可保留其与LTB4结合的能力。

Coversin的功能等效物还可为分子，所述分子在结构上与Coversin类似或含有类似或相同的三级结构，尤其在结合至C5(野生型C5或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5)和/或LTB-4的Coversin的一个或多个活性位点的环境中，如合成分子。上文给出的Jore等人参考文献中描述了与C5和LTB4结合所需的Coversin中的精确氨基酸残基。

同源物包括在图2中明确鉴别的Coversin序列的旁系同源物和直系同源物，包括例如来自包括以下的其它蜱物种的Coversin蛋白质序列：附加扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、血红扇头蜱(R.sanguineus)、囊形扇头蜱(R.bursa)、美洲钝眼蜱(A.americanum)、卡延钝眼蜱(A.cajennense)、希伯来钝眼蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具环牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安氏革蜱(D.andersoni)、边缘革蜱(D.marginatus)、变异革蜱(D.variabilis)、铁角血蜱(Haemaphysalis inermis)、蓝斑血蜱(Ha.leachii)、点状血蜱(Ha.punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、嗜驼璃眼蜱(Hy.dromedarii)、边纹璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、羊硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、肩突硬蜱(I.scapularis)、六角硬蜱(I.hexagonus)、波斯隐喙蜱(Argas persicus)、卷边隐喙蜱(A.reflexus)、游走钝缘蜱(Ornithodoros erraticus)、毛白钝缘蜱(O.moubata moubata)、豚钝缘蜱(O.m.porcinus)和萨维尼钝缘蜱(O.savignyi)。

术语“同源物”还包括来自以下物种的具有与Coversin等效功能的蛋白质：蚊类，包括库蚊属(Culex)、按蚊属(Anopheles)和伊蚊属(Aedes)物种，尤其是致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)；跳蚤，如猫栉头蚤(Ctenocephalides felis)(猫蚤)；马蝇；白蛉；黑蝇；采采蝇；虱子；螨虫；水蛭和扁虫。天然Coversin蛋白质被认为以约18kDa的另外三种形式存在于非洲钝缘蜱中，且术语“同源物”意在包括这些替代形式的Coversin。

本领域技术人员知道鉴别图2中给出的Coversin序列的同源物的方法。举例来说，可通过公共以及私人的序列数据库的同源性搜索来鉴别同源物。适宜地，使用公开可用的数据库，但私人的或商用的数据库将同样适用，尤其当这些数据库含有公共数据库中未呈现的数据时。主数据库为存放有一级核苷酸或氨基酸序列的站点，可以是公开可用或商用的。公开可用的主数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(参见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、蛋白质数据库(Protein Data Base)(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)和次级数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商用数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq(之前属于IncytePharmaceuticals Inc.)。

通常，两个多肽之间(优选地在指定区域，如活性位点上)大于30％的同一性被认为是功能等效，且因此表明两个蛋白质同源。优选地，同源的蛋白质与图2中鉴别的Coversin蛋白质序列(SEQ ID NO:2)具有大于60％的序列同一性程度。更优选的同源物与图2中给出的Coversin蛋白质序列(SEQ ID NO:2)分别具有大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性程度。使用BLAST版本2.1.3，使用由NCBI(美国国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚分＝11且空位扩展罚分＝1]测定如本文中所提及的同一性百分比。同一性％可以是在相关参考序列(例如SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸或SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸)的全长上。

因此可通过参照与参考序列的某一氨基酸序列的同一性％来描述Coversin型蛋白质，所述参考序列为，例如图2的SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或图2的SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸，例如描述为包含与图2的SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或图2的SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列或由其组成的蛋白质，当Coversin型蛋白质包含所述序列时，所述Coversin型蛋白质可为融合蛋白(与例如另一蛋白质，例如异源蛋白质)。合适的第二蛋白质描述于下文。

图2中给出的Coversin蛋白质序列的功能等效物包括与野生型序列相比含有例如1、2、3、4、5、7、10或更多个氨基酸，或至多1、2、3、4、5、7或10个氨基酸的氨基酸取代、插入或缺失(例如从N末端或C末端的缺失)的突变体，前提是此类突变体保留与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用艾库组单抗治疗无效，或降低艾库组单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。这是相对于相关参考序列(例如SEQ ID NO:2的第1-168位氨基酸或SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸)。因此，突变体可包括含有保守氨基酸取代的蛋白质，所述取代不会以不利方式影响蛋白质的功能或活性。此术语还包括天然生物变体(例如衍生出Coversin蛋白质的物种内的等位基因变体或地理变异)。还可通过Coversin序列中的特定残基的系统或定向突变设计具有改进的结合野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4的能力的突变体。

Coversin的功能等效物包括Coversin蛋白质的片段，前提是此类片段保留与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。片段可包括，例如，衍生自Coversin蛋白质序列(或同源物)的多肽，所述多肽为小于150个氨基酸、小于145个氨基酸，前提是这些片段保留与补体野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。片段可包括例如衍生自Coversin蛋白质序列(或同源物)的多肽，所述多肽为至少150氨基酸、至少145个氨基酸，前提是这些片段保留与补体野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5和/或LTB4结合的能力。

任何功能等效物或其片段优选地保留存在于Coversin中的半胱氨酸残基的模式(pattern)。举例来说，所述功能等效物包含六个半胱氨酸残基，其以相隔32个氨基酸、相隔62个氨基酸、相隔28个氨基酸、相隔1个氨基酸和相隔21个氨基酸的距离相对于彼此间隔开，根据图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第1至168位氨基酸的序列从氨基端到羧基端排列。Coversin蛋白质的示例性片段公开于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14中。编码对应片段的DNA公开于SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13中。

作为此类片段的不仅包括在本文于图2中明确鉴别的非洲钝缘蜱Coversin蛋白质的片段，并且还包括如上文所述的此蛋白质的同源物的片段。通常，此类同源物的片段与图2中的Coversin蛋白质序列的片段的同一性大于60％，尽管更优选的同源物片段分别与图2中的Coversin蛋白质序列的片段的同一性大于70％、80％、90％、95％、98％或99％。优选地，此类片段将保留上文提及的半胱氨酸间距。当然可以通过野生型序列的系统突变或片段化，接着进行适当活性分析而合理地设计具有改进的特性的片段。片段可展现与Coversin类似或更大的针对C5(野生型或C5的多态性变体或二者)和/或LTB4的亲和力。这些片段的尺寸可以是上文所述的Coversin蛋白质的片段的尺寸。

如上文所论述，Coversin型蛋白质优选地与野生型C5和/或来自具有C5多态性(例如使得用依库珠单抗治疗无效，或降低依库珠单抗的治疗功效的C5多态性)的受试者的C5以及LTB4结合。具有减少或缺乏的C5结合能力但保留LTB4结合活性的Coversin型蛋白质也可用于本发明中。

不保留C5结合能力但保留LTB-4结合活性的Coversin型蛋白质公开于例如2017年4月21日提交的同处在申请状态中的英国专利申请第GB 1706406.4号(申请人参考号P070475GB)，以及与本申请同一天提交的国际申请第PCT/EP2018/XXXXXX号(申请人参考号P070475WO)中，所述申请的全部内容以引入的方式并入本文中。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的此类Coversin型蛋白质可用于本发明的所有方面。

具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的此类Coversin型蛋白质可包含以下序列或由以下序列组成：

SEQ ID NO:22(GB 1706406.4的SEQ ID NO:5)为修饰的Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Met114变为Gln、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Asp118变为Asn、Ala119变为Gly、Gly120变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Asp且Val124变为Lys。(Coversin变体1)

SEQ ID NO:23(GB 1706406.4的SEQ ID NO:6)为修饰的Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala且Asp149变为Gly。(Coversin变体2)

SEQ ID NO:24(GB 1706406.4的SEQ ID NO:7)为修饰的Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu122变为Asp且Asp149变为Gly。(Coversin变体3)

SEQ ID NO:25(GB 1706406.4的SEQ ID NO:8)为修饰的Coversin的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4已被修饰以将Ala44变为Asn。(Coversin变体4)

SEQ ID NO:26(GB 1706406.4的SEQ ID NO:9)为在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27(GB 1706406.4的SEQ ID NO:10)为在Coversin变体1(SEQ ID NO:22)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28(GB 1706406.4的SEQ ID NO:11)为在Coversin变体2(SEQ ID NO:23)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29(GB 1706406.4的SEQ ID NO:12)为在Coversin变体3(SEQ ID NO:24)中的SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间的环的氨基酸序列。

具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的Coversin型多肽可被描述为修饰的Coversin多肽(例如其展现出白三烯或羟基类二十烷酸结合活性和减少或缺乏的C5结合)。提及的“修饰的Coversin多肽”应理解为是指SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4(即在SEQ ID NO:2的N末端有或没有18个氨基酸的信号序列的Coversin多肽)的修饰的型式。

此类多肽可展现出白三烯(leukotriene)或羟基类二十烷酸(hydroxyeicosanoid)结合活性和减少或缺乏的C5结合，且可包含其中进行1至30个氨基酸取代的SEQ ID NO:4，其中

(i)在SEQ ID NO:4的第114至124位中进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个：

a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；

b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；

c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换；

d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro、His或Thr替换；

e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；

f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；

g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；

h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换；

i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换；

j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换；或/且其中

(ii)SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换；

或其片段，所述片段中在所述修饰的Coversin多肽的N末端缺失至多五个氨基酸。

如本文所用的LK/E结合活性是指结合至白三烯和羟基类二十烷酸(包括但不限于LTB4、B4异白三烯及其任何羟基化衍生物、HETE、HPETE和EET)的能力。LTB4结合尤其受关注。

具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽可由SEQ ID NO:2或4组成，根据下文的描述被修饰，或可包含SEQ ID NO:2或4，根据下文的描述被修饰。

SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的未修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间形成环。此环具有下文所示的序列：

-Met-Trp-Met-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Val-(SEQ ID NO:26)

第一个Met在SEQ ID NO:4的第114位，并且在SEQ ID NO:2的第132位。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个：

a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln或Ala替换；

b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln或Ala替换；

c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换，优选地被Ser或Ala替换；

d.Asp118被Asn、Gln、Arg、Lys、Gly、Ala、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro、His或Thr替换，优选地被Asn替换；

e.Ala119被Gly、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Gly或Asn替换；

f.Gly120被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Ser或Asn替换；

g.Gly121被Ala、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Ala或Asn替换；

h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Ala、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换，优选地被Asp或Ala替换；

i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换，优选地被Asp、Ala、Gln或Asn替换；

j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Lys或Ala替换。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽可被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位进行以下取代(a)-(j)中的一个或多个：

a.Met114被Gln替换；

b.Met116被Gln替换；

c.Leu117被Ser替换；

d.Asp118被Asn替换；

e.Ala119被Gly替换；

f.Gly120被Ser替换；

g.Gly121被Ala替换；

h.Leu122被Asp替换；

i.Glu123被Asp或Ala替换；

j.Val124被Lys替换。

在修饰的Coversin多肽中，存在取代(a)-(j)中的二、三、四、五、六、七、八、九或十个。优选地，存在取代(a)-(j)中的两个或更多个、五个或更多个或八个或更多个。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的Coversin多肽可被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代：

a.Met114被Gln替换；

b.Met116被Gln替换；

c.Leu117被Ser替换；

d.Asp118被Asn替换；

e.Ala119被Gly替换；

f.Gly120被Ser替换；

g.Gly121被Ala替换；

h.Leu122被Asp替换；

i.Glu123被Asp替换；

j.Val124被Lys替换。

任选地，在上文提及的修饰的Coversin多肽中，Trp115未被取代。优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Gln-Trp-Gln-Ser-Asn-Gly-Ser-Ala-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:27)。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽可被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代：

a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln替换；

b.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换，优选地被Ser替换；

c.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Ala替换；

d.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换，优选地被Asp替换；

e.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换，优选地被Asp替换。

在更特定实施方案中；

a.Met116被Gln替换；

b.Leu117被Ser替换；

c.Gly121被Ala替换；

d.Leu122被Asp替换；

e.Glu123被Ala替换。

任选地，在上文提及的此修饰的Coversin多肽中，Trp 115未被取代。任选地，在此实施方案中，Met114、Trp 115、Asp118、Ala119、Gly120和Val124未被取代，或被本文中其它地方提及的保守取代基取代。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Met-Trp-Gln-Ser-Asp-Ala-Gly-Ala-Asp-Ala-Val(SEQ ID NO:28)。

a.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln替换；

b.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换，优选地被Asp替换；

在更特定实施方案中；

a.Met116被Gln替换；

b.Leu122被Asp替换。

任选地，在上文提及的此修饰的Coversin多肽中，Trp 115未被取代。任选地，在此实施方案中，Met114、Trp 115、Leu117、Asp118、Ala119、Gly120、Gly121、Glu123和Val124未被取代。具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸处在βH与α2之间具有环，所述环具有序列Met-Trp-Gln-Leu-Asp-Ala-Gly-Gly-Asp-Glu-Val(SEQ ID NO:29)。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽可被修饰，使得SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换。

在优选实施方案中，SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。

SEQ ID NO:4的第44位(或SEQ ID NO:2的第62位)的此取代可与本文中提及的任何其它取代进行组合。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的另一修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽可被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代(a)-(j)中的一个或多个：

a.Met114被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln或Ala替换，例如被Gln替换；

b.Met116被Gln、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Gln或Ala替换，例如被Gln替换；

c.Leu117被Ser、Asp、Asn、Glu、Arg、Lys、Gly、Ala或Pro替换，优选地被Ser或Ala替换，例如被Ser替换；

e.Ala119被Gly、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Gly或Asn替换，例如被Gly替换；

f.Gly120被Ser、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Ser或Asn替换，例如被Ser替换；

g.Gly121被Ala、Asp、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Ala或Asn替换，例如被Ala替换；

h.Leu122被Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、Lys、Pro或His替换，优选地被Asp或Ala替换，例如被Asp替换；

i.Glu123被Asp、Ala、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换，优选地被Asp、Ala、Gln或Asn替换，例如被Asp或Ala替换；

j.Val124被Lys、Gln、Asn、Arg、Lys、Gly、Ala、Pro、His或Thr替换，优选地被Lys或Ala替换，例如被Lys替换；

且另外，SEQ ID NO:4中的Ala44(SEQ ID NO:2中的Ala62)被Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、Pro或His替换，优选地被Asn替换。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽可被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代：

a.Met116被Gln替换；

b.Leu117被Ser替换；

c.Gly121被Ala替换；

d.Leu122被Asp替换；

e.Glu123被Ala替换；

且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。

在此实施方案的优选方面中，对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:28中所示。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽被修饰，使得在SEQ ID NO:4的第114至124位存在以下取代：

a.Met116被Gln替换；

b.Leu122被Asp替换；

且SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换。

在此实施方案的优选方面中，对应于SEQ ID NO:4的第114至124位的氨基酸残基如SEQ ID NO:29中所示。

在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，Coversin多肽可被修饰，使得SEQ ID NO:4中的Asp149被Gly、Gln、Asn、Ala、Met、Arg、Lys、Leu、Ser、Ile、Phe、Tyr、Pro、His或Thr替换。在一些实施方案中，Coversin多肽被修饰，使得SEQ ID NO:4的Asp149被Gly替换。SEQ ID NO:4的第149位(SEQ ID NO:2的第167位)的此取代可与本文中提及的任何其它取代进行组合。

a.Met116被Gln替换；

b.Leu117被Ser替换；

c.Gly121被Ala替换；

d.Leu122被Asp替换；

e.Glu123被Ala替换；

SEQ ID NO:4中的Ala44被Asn替换，并且SEQ ID NO:4的Asp149被Gly149替换。

a.Met116被Gln替换；

b.Leu122被Asp替换；

在本公开的各种方面和实施方案中，具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的未修饰的Coversin多肽存在1至30个氨基酸的差异。可对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的Coversin多肽进行任何修饰，其条件是与未修饰的Coversin多肽相比，所得的修饰的Coversin多肽展现出LK/E结合活性和减少或缺乏的C5结合。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的第6、38、100、128、129、150位的六个半胱氨酸氨基酸被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。

在一些修饰的Coversin多肽中，SEQ ID NO:4中的Asn60和Asn84各自被Gln替换。可通过定点突变进行此修饰，从而当在酵母中表达多肽时，防止N-连接高糖基化。

在一些修饰的Coversin多肽中，认为SEQ ID NO:4中的以下氨基酸中的一个或多个参与与LTB₄结合，因此可以未修饰形式保留：Phe18、Tyr25、Arg36、Leu39、Gly41、Pro43、Leu52、Val54、Met56、Phe58、Thr67、Trp69、Phe71、Gln87、Arg89、His99、His101、Asp103和Trp115。在一些修饰的Coversin多肽中，这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未修饰形式被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，这些氨基酸中的一个或多个可被保守取代。在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，这些氨基酸中的至多五个、十个或十五个或全部在本发明的修饰的Coversin多肽中被保守取代。

SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、20-21、24-27、29-32、35-41、45、47-48、50、52-60、64、66、69-81、83、84、86、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。

认为SEQ ID NO:4中以下位置处的氨基酸参与与LTB4结合和/或在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、18、20-21、24-27、29-32、35-41、43、45、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、97-104、112-113、115、125-129、132-139、145、148和150。

认为SEQ ID NO:4中的以下位置处的氨基酸参与与LTB4结合和/或在Coversin与TSGP2和TSGP3之间高度保守：5、6、11、13-15、18、20-21、24-25、27、30-32、35-41、43、47-48、50、52-60、64、66、67、69-81、83、84、86、87、89、90-94、98、100、102-104、112-113、115、126、128-129、132-139、145、148和150。

因此，在具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的一些修饰的Coversin多肽中，以上氨基酸以未修饰形式被保留。在一些实施方案中，这些氨基酸中的至少五个、十个或十五个或全部以未修饰形式被保留于本发明的修饰的Coversin多肽中。在一些实施方案中，这些氨基酸中的一个或多个可被保守取代。在一些实施方案中，这些氨基酸中的至多5、10或15、20、25、30、40、50个或全部在本发明的修饰的Coversin多肽中被保守取代。

本文中提及的修饰的Coversin多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4通常有1至30个、优选地2至25个、更优选地3至20个、甚至更优选地4至15个氨基酸的差异。通常，所述差异为5至12个或6至10个氨基酸变化。举例来说，可在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中进行1至30个，或2至25个、3至30个、4至15个、5至12个或6至10个氨基酸取代。

与SEQ ID NO:4相比，在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:27所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有10个氨基酸取代。因此，在一些实施方案中，与SEQ ID NO:4相比，本文中提及的修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:22(例如在SEQ ID NO:27的环中)所示的取代以外的1-15、2-10、3-5或至多2、3、4或5个额外取代。

与SEQ ID NO:4相比，在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:28所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有5个氨基酸取代。因此，在一些实施方案中，与SEQ ID NO:4相比，本文中提及的修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:23(例如在SEQ ID NO:28的环中)所示的取代以外的1-20、2-15、3-10或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10个额外取代。所述额外取代优选地包括如本文中其它地方描述的第44和149位的取代。

与SEQ ID NO:4相比，在SEQ ID NO:4的第114至124位氨基酸(SEQ ID NO:2的第132-142位氨基酸)处在βH与α2之间具有如SEQ ID NO:29所示的环的修饰的Coversin多肽由于存在此环而具有2个氨基酸取代。因此，在一些实施方案中，与SEQ ID NO:4相比，修饰的Coversin多肽优选地具有除SEQ ID NO:24(例如在SEQ ID NO:29的环中的取代)所示的取代以外的1-25、2-12、3-15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。所述额外取代优选地包括如本文中其它地方描述的第44和149位的取代。

与SEQ ID NO:4相比，如本文中其它地方描述的在SEQ ID NO:4的第44位具有取代的修饰的Coversin多肽优选地具有1-25、2-12、3-15或至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个额外取代。

除了上文明确提及的取代以外的取代优选为，例如根据下表的保守取代。第二列中的相同框和优选地第三列中的相同行中的氨基酸可彼此取代：

具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的优选的修饰的Coversin多肽可包含SEQ ID NO:22、23、24、25中的一个所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22、23、24、25中的一个所示的氨基酸序列组成。

本发明还涵盖上文提及的具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽的片段的用途，所述片段中从修饰的Coversin多肽的N末端缺失至多五个氨基酸。所述片段可对应于来自修饰的Coversin多肽的N末端的1、2、3、4或5个缺失。如果所得多肽保留所述修饰的Coversin的LK/E结合活性且具有减少或缺乏的补体抑制剂活性，则来自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的其它位置的缺失也被认为形成为本发明的一部分。

当使用具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的修饰的Coversin多肽时，与SEQ ID NO:2或4中未修饰的Coversin多肽展现的结合相比，C5结合可例如减少至少2、5、10、15、20、50、100倍，或消除了C5结合。与SEQ ID NO:2或4中未修饰的Coversin多肽相比，C5结合可例如减少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。修饰的Coversin多肽可以大于1微摩尔的KD结合C5，如通过表面等离子体共振，根据Roversi et al.(2013)J BiolChem.288,18789-18802中描述的方法，或如GB1706406.4的实施例2中所示地测定。

根据本发明使用的功能等效物可以是融合蛋白，例如通过将编码Coversin蛋白质的聚核苷酸框内克隆至异源蛋白质序列的编码序列获得的融合蛋白。当用于本文中时，术语“异源”意指除Coversin蛋白质或其功能等效物以外的任何多肽。可溶性融合蛋白可在其N末端或C末端包含的异源序列的实例如下：膜结合蛋白的胞外域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、PAS或XTEN或类似的非结构化多肽、多聚化域、胞外蛋白域、信号序列、输出序列或允许通过亲和色谱法纯化的序列。这些异源序列中的许多在表达质粒中可商购，因为这些序列通常被包括于融合蛋白中以在不显著损害与其融合的蛋白质的特异性生物活性的情况下提供额外特性[36]。此类额外特性的实例为(例如由于添加Fc区或PAS化[37])而导致的体液中持续时间更长的半衰期、细胞外定位或者如由例如组氨酸、GST、FLAG、抗生物素蛋白或HA标签的标签所允许的更容易的纯化程序。融合蛋白可另外含有连接子序列(例如长度为1-50个氨基酸)，使得组分被此连接子序列隔开。

因此，融合蛋白为包含Coversin样蛋白质的蛋白质的实例，且以特定实例的方式包括包含PAS序列和Coversin型蛋白质序列的蛋白质。PAS序列描述于例如Schlapschy Met al.[37]和EP 08773567.6中，且PAS化的Coversin分子描述于Kuhn et al.[38]中。PAS化描述蛋白质与由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象上无序的多肽序列的基因融合。这是由XL Protein(http://xl-protein.com/)开发的技术，它以简单的方式将具有大流体动力学体积的溶剂化无规链(solvated random chain)连接至其所融合的蛋白质。多肽序列采用大体积无规卷曲结构。因此，所得融合蛋白的尺寸比其所融合的蛋白质大得多。已显示这会降低生物系统中的清除率。EP08773567.6以及上文的Schlapschy参考文献中描述了合适的PAS序列。任何合适的PAS序列均可用于所述融合蛋白中。实例包括由至少约100个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述氨基酸残基形成无规卷曲构象且由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基组成(或由脯氨酸和丙氨酸残基组成)。这可包含多个氨基酸重复序列，其中所述重复序列由Ala、Ser和Pro残基(或脯氨酸和丙氨酸残基)组成且其中不超过6个连续氨基酸残基为相同的。脯氨酸残基可占序列的氨基酸的4％以上且40％以下。所述序列可包含选自以下的氨基酸序列：

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:15)；

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:16)；

APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:17)，

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:18)，

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:19)，

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:20)，和

ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:21)

或作为这些序列的整体一或部分形式的这些序列的环形排列型式或多聚体。在PAS序列中可存在这些重复序列中的一个重复序列(即SEQ ID NO 15-21中的一个)的例如5-40个、10-30个、15-25个、18-20个，优选地20-30个或30个，优选地15个拷贝。优选地，PAS序列包含30个拷贝的SEQ ID NO:15或其由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成。优选地，PAS序列(直接或通过连接子序列)融合至Coversin型蛋白质的N末端，且在某些优选实施方案中，Coversin型蛋白质可包含SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸或由其组成(例如融合蛋白包含(a)由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成的PAS序列，和(b)SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸，其中(a)直接或通过连接子序列融合至(b)的N末端)。

融合蛋白可另外含有连接子序列(例如长度为1-50、2-30、3-20、5-10个氨基酸)，使得组分由此连接子序列隔开。在一个实施方案中，连接子序列可为单个丙氨酸残基。

可通过宿主细胞中的表达以重组形式制备蛋白质和其功能等效物。此类表达方法是本领域技术人员众所周知的，并且[38]和[39]也详细地描述此类表达方法。Coversin蛋白质和其功能等效物的重组形式优选为未糖基化的。优选地，宿主细胞为大肠杆菌。

Coversin蛋白质和其功能等效物优选呈分离的形式，例如与表达其的宿主细胞和/或细胞生长培养基中的至少一种组分分离。在一些实施方案中，Coversin蛋白质或其功能等效物纯化到至少90％、95％或99％纯度，如例如通过电泳或色谱测定。也可使用蛋白质化学的常规技术制备本发明的蛋白质和片段。举例来说，可通过化学合成制备蛋白质片段。产生融合蛋白的方法在本领域中是标准操作，且为熟练的读者所知。举例来说，最常见的分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫技术可见于[38]或[41]中。

根据本发明的另一实施方案，药剂可为编码Coversin型蛋白质的核酸分子。举例来说，可使用基因疗法通过受试者中的相关细胞在体内或离体实现Coversin型蛋白质的内源性产生。另一方法为施用“裸DNA”，其中直接将治疗基因注射至血流或肌肉组织中。

优选地，此类核酸分子包含图2中的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的第55至507位碱基或由其组成。此核苷酸序列编码图2中的无信号序列的Coversin蛋白质。图2中的核苷酸序列的前54个碱基编码信号序列，其对于补体抑制活性或LTB4结合活性来说是非必需的。或者，核酸分子可包含图2中编码具有信号序列的蛋白质的核酸序列的第1至507位碱基或由其组成。

施用方式

不需要医学专业人员来施用Coversin型蛋白质，且这些分子被快速吸收。相比之下，许多重组抗体的吸收极为缓慢，因此需要在长时间内输注(例如静脉内输注)。因此，施用此类分子还需要医学专业人员。因此，除了具有更有效地抑制具有C5多态性的受试者中的补体途径活化的优势外，Coversin型蛋白质还具有比其它药剂，如抗体，例如依库珠单抗更易于施用的优势。

以治疗或预防有效量施用所述药剂。术语“治疗有效量”是指治疗AIBD所需的药剂的量。在此上下文中，“治疗”包括减轻病症的严重程度。

本文所用的术语“预防有效量”是指预防相关病况，例如AIBD所需的药剂的量。在此上下文中，“预防”包括减轻病症的严重程度，例如在开始施用药剂之前存在未检测到的病症的情况下。减轻病症的严重程度可为，例如本文中其它地方所论述的，减小水疱或受影响的身体表面的尺寸或数目。

减轻或改善是与在不施用如本文所述的药剂的情况下的结果相比。根据用于评估此类患者的标准指标来评估结果。就此可定量来说，在相对指标(例如水疱或受影响的身体表面的尺寸或数目)中存在至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％的减轻或改善。

优选地，药剂的剂量足以结合受试者中尽可能多的可用的C5，更优选所有可用的C5。或者，药剂的剂量足以结合受试者中尽可能多的可用的LTB4，更优选所有可用的LTB4。在一些方面，药剂的剂量足以结合尽可能多的可用的C5和LTB4，例如所有可用的C5和LTB4。供应的药剂的剂量可为结合受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的至少1×或1.5倍或两倍。供应的药剂的剂量可例如为结合受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的大约或至少1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或4倍。

优选地，剂量为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg、0.001mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至2mg/kg、0.1mg/kg至1mg/kg、0.2mg/kg至0.8mg/kg、0.3mg/kg至0.6mg/kg、0.4mg/kg至0.6mg/kg(例如约0.57mg/kg)。

治疗或预防有效量可另外以抑制末端(terminal)补体的方式来定义，例如与在不存在治疗的情况下的末端补体活性(TCA)相比，末端补体活性减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的量。可调节剂量和频率以将末端补体活性维持在所期望水平，其可为例如，相比于在不存在治疗的情况下的末端补体活性的10％或更小，例如9、8、7、6、5、4、3、2、1％或更小。

当给出剂量时，这涉及为蛋白质或其功能等效物的药剂的剂量。为核酸分子的药剂的适当剂量可用于产生这些水平。

可通过本领域中已知的标准分析来测量末端补体活性，例如使用Quidel CH₅₀溶血分析和绵羊红血球裂解CH50分析。

需要施用的剂量的频率将取决于涉及的药剂的半衰期。Coversin蛋白质或其功能等效物可例如每日两次、每日一次或每2、3、4、5、6、7、10、15或20天或更长时间一次地施用。

可施用单一剂量或多个剂量。举例来说，可施用至少2、3、4、5、6、7或8个剂量。单一剂量为一个实施方案。精确剂量和剂量频率还可取决于施用时患者的状态。确定剂量时可考虑的因素包括治疗或预防的需要、患者的疾病状态的严重程度、患者的一般健康状况、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者对疗法的耐受性或应答。可通过常规实验确定精确量，但可能最终取决于临床医师的判断。

给药方案还可以采取初始“负荷剂量”后跟一个或多个后续“维持剂量”的形式。一般来说，负荷剂量将大于维持剂量。负荷剂量可比维持剂量大2、5、10倍或更多倍。负荷剂量可以单一剂量形式，或以特定时间范围内的一个或多个剂量形式施用。通常，负荷剂量将为单一24小时时段内施用的1、2、3、4或5个剂量。维持剂量可为以规律时间间隔重复的较低剂量。维持剂量可以一定间隔，如每3、4、6、8、12、24或48小时重复。可通过常规实验确定精确方案，但可能最终取决于临床医师的判断。维持剂量可为初始负荷剂量的至少20、30、40、50、60、70、80、90或100％，或初始负荷剂量的至多20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

在另一实施方案中，在整个疗程中使用相同剂量(例如每日一次或每日两次)。

负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg，且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间；或者，负荷剂量为0.001mg/kg至10mg/kg且维持剂量为0.001mg/kg至10mg/kg，或者，负荷剂量为0.01mg/kg至2mg/kg且维持剂量为0.01mg/kg至2mg/kg；或者，负荷剂量为0.1mg/kg至1mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至1mg/kg；或者，负荷剂量为0.1mg/kg至1mg/kg且维持剂量为0.05mg/kg至0.5mg/kg；或者，负荷剂量为0.2mg/kg至0.8mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.4mg/kg；或者，负荷剂量为0.3mg/kg至0.7mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.3mg/kg；或者，负荷剂量为0.4mg/kg至0.6mg/kg且维持剂量为0.1mg/kg至0.2mg/kg，例如其中负荷剂量为0.57mg/kg且维持剂量为0.14mg/kg。例如，0.6mg/kg-1.8mg/kg的负荷剂量后跟0.2mg/kg-0.6mg/kg(例如0.3mg/kg)的维持剂量。

负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg，且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间；或者，维持剂量可为0.001mg/kg至10mg/kg，或者，维持剂量可为0.01mg/kg至2mg/kg；或者，维持剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg；或者，维持剂量可为0.1mg/kg至0.8mg/kg；或者，维持剂量可为0.1mg/kg至0.6mg/kg；或者，维持剂量可为0.1mg/kg至0.4mg/kg；或者，维持剂量可为0.1mg/kg至0.2mg/kg。

负荷剂量可为0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg，且维持剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg之间；或者，负荷剂量可为0.001mg/kg至10mg/kg，或者负荷剂量可为0.01mg/kg至2mg/kg；或者，负荷剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg；或者，负荷剂量可为0.1mg/kg至1mg/kg；或者，负荷剂量可为0.2mg/kg至0.8mg/kg；或者，负荷剂量可为0.3mg/kg至0.6mg/kg；或者，负荷剂量可为0.4mg/kg至0.6mg/kg，或0.6mg/kg至1.8mg/kg。

药剂一般与药学上可接受的载体联合施用。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和非活性病毒颗粒或实际上任何其它试剂，前提是载体本身不诱发毒性效应或引起产生对接受药物组合物的个体有害的抗体。药学上可接受的载体可另外含有液体，如水、生理盐水、甘油、乙醇或助剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。因此，所用的药物载体将根据施用途径而不同。载体可使得药物组合物能够被调配成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液以有助于患者摄入。[42]中详细论述了药学上可接受的载体。在优选实施方案中，药剂在水或PBS中施用。

药剂可通过任何已知的施用途径来递送。药剂可局部或全身地递送。药剂可通过肠道外途径递送(例如通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射或递送到组织的间隙空间)。组合物也可施用至损伤处。其它施用方式包括经口和经肺施用、栓剂和透皮(transdermal)或经皮(transcutaneous)施用、针和无针注射器(hypospray)。局部(local)施用包括体表(topical)施用，例如施用至皮肤，例如感染区域中。这可能在轻度AIBD，例如轻度BP中特别有用。

优选地，经由皮下注射递送药剂。在一些实施方案中，这是经由每日一次或两次的皮下注射，例如以0.0001mg/kg(药物质量与患者质量相比)至20mg/kg的初始负荷剂量，接着为0.0001mg/kg至20mg/kg的每日一次的维持剂量，或本文中其它地方公开的其它剂量。或者，可每隔一天经由皮下注射递送药剂。

在优选实施方案中，药剂经由每日一次的皮下注射以0.6mg/kg-1.8mg/kg(例如0.57mg/kg)的初始负荷剂量后跟0.2mg/kg-0.6mg/kg(例如0.3mg/kg)的每日一次的维持剂量，或经由每日一次的皮下注射以0.6mg/kg-3.6mg/kg(例如1.0mg/kg)的初始负荷剂量后跟0.2mg/kg-1.2mg/kg(例如0.6mg/kg)的每日一次的维持剂量递送。

优选地，疗程持续至少1、2、3、4、5或6周。

优选地，疗程持续直至受试者的症状减轻。因此，疗程可为持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40周施用药剂(例如每日)。

可在整个疗程中保持维持剂量(例如单一每日维持剂量)恒定或可在疗程期间修改(例如增加或减少)维持剂量(例如每日维持剂量)。可修改维持剂量以将末端补体活性维持在所期望水平，例如所述水平是与来自不存在治疗的情况下的所述患者的血清相比或与正常对照血清相比的10％或更小。所述或每一维持剂量可持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，例如每日一次持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周。维持剂量可随着受试者症状改善而减小。药剂的量或药剂施用频率可随着受试者的症状改善而减小。

因此，可存在初始负荷剂量，接着为如上文所定义的维持剂量的初始维持剂量(例如每日初始维持剂量)，和一个或多个另外的维持剂量(例如每日另外的维持剂量)，例如至少2、3、4、5个另外的维持剂量。

因此，本发明进一步包括在受试者中治疗或预防AIBD的方法，其包括向受试者施用如上文所定义的初始负荷剂量的药剂，且接着施用如上文所定义的维持剂量(例如每日维持剂量)的药剂，其中存在初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。

因此，本发明进一步包括如上文所定义的药剂，用于在受试者中治疗或预防AIBD的方法，所述方法包括向受试者施用如上文所定义的初始负荷剂量的药剂，且接着施用如上文所定义的维持剂量(例如每日维持剂量)的药剂，其中存在初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。

可通过测试受试者中(例如来自受试者的生物样品中)的末端补体活性来确定一个或多个另外的维持剂量，并且基于末端补体活性水平和/或测试受试者的症状确定另外的维持剂量，并基于所述症状确定另外的维持剂量。方法可任选地进一步包括施用所述另外的维持剂量。所述另外的剂量可计算为处于将末端补体活性维持在所期望水平的水平。

当获取生物样品时，所述生物样品可为血液，例如全血或血清样品。方法任选地进一步包括获取样品的步骤，并且进一步任选地包括测定样品的TCA的步骤。

可通过测试受试者中(例如生物样品中)的末端补体活性来确定一个或多个另外的维持剂量，并且基于末端补体活性水平和/或测试受试者的症状确定另外的维持剂量，并基于所述症状确定另外的维持剂量。方法可任选地进一步包括施用所述另外的维持剂量。所述另外的剂量可计算为处于将末端补体活性维持在所期望水平的水平。

在某些方面，所期望的补体活性水平为与来自不存在治疗的情况下的所述受试者的血清相比或与正常对照血清相比的10％或更小。

在某些方面，如果TCA高于所期望水平，则增加所述维持剂量，且任选地其中如果TCA小于5、4、3、2、1％，则维持或减小剂量。

在某些方面，如果症状恶化，则增加所述维持剂量，且任选地其中如果症状改善，则维持或减小剂量。

在一些实施方案中，在开始治疗的一个月内、在开始治疗的两周内、在开始治疗的一周内测试受试者。在其它实施方案中，一天一次或至少一天一次、一周一次或至少一周一次、每两周一次或至少每两周一次、一个月一次或每两个月一次地测试受试者。

优选地，负荷剂量为1.2mg/kg或约1.2mg/kg蛋白质或功能等效物，且维持剂量为至少0.6mg/kg(例如至少0.7mg/kg、0.8-1.5、0.9-1.2或1.0-1.25mg/kg)或至多0.3mg/kg(例如至多0.2mg/kg、0.15-0.4、0.2-0.3mg/kg)，且任选地，(i)所述维持剂量持续至少2、3、4、5、6周，和/或(ii)治疗持续至少6周，和/或(iii)治疗每日一次地持续至少3、4、5、6周。

优选地，负荷剂量为0.6-1.8mg/kg蛋白质或功能等效物，且维持剂量为0.2-0.6mg/kg，例如约0.3mg/kg，且(i)所述维持剂量持续至少2、3、4、5、6周，和/或(ii)治疗持续至少6周，和/或(iii)治疗每日一次地持续至少3、4、5、6周。

还可以采取不取决于所治疗的受试者的体重的固定剂量形式施用给药方案。可以单一剂量形式，或以特定时间范围内的一个或多个剂量形式施用所述固定剂量。对于典型的人类患者(例如体重在50kg与100kg之间的人类患者)来说，固定剂量可为1mg-100mgCoversin(SEQ ID NO:4)。Coversin型蛋白质和修饰的Coversin多肽的分子量可用于计算功能上等效的药剂的等效固定剂量。在一些实施方案中，固定剂量为1mg-80mg、1mg-50mg、5mg-80mg、5mg-50mg、10mg-60mg、10mg-50mg、20mg-50mg、20mg-40mg或25mg-35mg。优选地，固定剂量为30mg sCoversin(SEQ ID NO:4)或摩尔等效量的Coversin型蛋白质或修饰的Coversin多肽。通常，固定剂量为单一24小时时段内施用的1、2、3、4或5个剂量。固定剂量可以一定间隔，如每3、4、6、8、12、24或48小时重复。可通过常规实验确定精确方案，但可能最终取决于临床医师的判断。

附图说明

图1：补体活化的经典和旁路途径的示意图。酶组分，深灰色。星暴状图形(starburst)内是过敏毒素。

图2A：Coversin的一级序列。加下划线的是信号序列。半胱氨酸残基呈粗体。核苷酸和氨基酸数目显示在右侧。

图2B：Coversin变体的实例。

图3：媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明，与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比，用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善，实验1。

图4：媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明，与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比，用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善，实验2。与第一个实验相比，Coversin仅在2.5mg/kg剂量处具有比媒剂对照组更显著的效果。值得注意的是，在此实验中，对照组中的若干小鼠未产生显著水平的疾病，这可能是与第一个实验相比的此差异的原因。

图5：媒剂对比用预防性Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明，与媒剂对照组和甲泼尼龙组相比，用所有剂量的Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善，实验1和2结果的组合，双因素方差分析(two-way ANOVA)表明，在媒剂对照与250和2500μg/ml剂量的Coversin之间具有统计学显著差异。

图6A：媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明，用2.5mg/kg Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善(实施例4，实验1)。

图6B：媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分证明，用2.5mg/kg Coversin治疗的小鼠中的疾病有所改善(实施例4，实验2)。此处，10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin和2.5mg/kg Coversin均对ABSA显示统计学显著效应。

图6C：媒剂对比用预防性Coversin和预防性PAS-L-Coversin治疗的小鼠中的实验性EBA的临床评分。此图显示实施例4，实验1和2的结果的组合。

图7：治疗性施用Coversin对被动EBA小鼠模型中的类天疱疮疾病样皮肤炎症的病程的影响(实施例2，实验1)。Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症。数据表示为平均值+/-SEM；N＝5只小鼠/组；关于统计显著性的双因素方差分析检验证明，媒剂对照与使用的所有剂量的Coversin之间具有显著差异。实验仅在雌性中进行。

图8：治疗性施用Coversin对被动EBA小鼠模型中的类天疱疮疾病样皮肤炎症的病程的影响(实施例2，实验2)。Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症。数据表示为平均值+/-SEM；N＝5只小鼠/组；关于统计显著性的双因素方差分析检验证明，媒剂对照与使用的所有剂量的Coversin之间具有显著差异。实验仅在雄性中进行。

图9A显示大疱性类天疱疮患者的水疱液中的C5a水平。

图9B显示大疱性类天疱疮患者的水疱液中的LTB4水平。

图10显示具有减少或缺乏的C5结合活性但保留LTB-4结合能力的某些修饰的Coversin多肽的序列。

实施例

实施例1-Coversin在预防性施用Coversin的EBA转移模型中的作用

使用由Sitaru et al.,2005[43]描述的方案的经修改版本来诱发抗体转移EBA。在每个治疗组中测试五只小鼠。简单来说，在第0、2和4天向小鼠皮下注射50μg亲和纯化的抗Col7 IgG。在第一次注射抗Col7 IgG之前四天(第-2天)开始每天两次向小鼠皮下注射三个不同剂量的Coversin。在整个实验中继续此施用直至其最后一天(第11天)。在对照组中，小鼠仅每天一次地皮下接受媒剂，或20mg/kg甲泼尼龙。

为了产生针对鼠类VII型胶原蛋白的抗体(“抗COL7”)，用200μg含有衍生自胶原蛋白VII的非胶原1(NC1)域的三种不同重组蛋白(“Col7A、B和C”)以及不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant)的蛋白混合物免疫新西兰白兔。通过使用蛋白G从经免疫兔的血清分离IgG，且随后用his-Col7对IgG进行亲和力纯化以特定地获得兔抗Col7IgG。通过在冷冻切片分析中测定效价和效力来对抗体进行质量检查。

从第4天开始，每隔一天对每只单个小鼠进行皮肤损伤程度评分。经过训练的观察员将展现出红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤区域分类为“受影响”或“不受影响”[错误！未定义书签。]。计算受皮肤损伤影响的总身体表面(ABSA)的百分比。

进行两个独立实验。

第一个实验的结果显示于图4中。可以看出，用25μg/kg Coversin治疗的小鼠中的ABSA百分比减小，且用Coversin以Coversin 2500μg/kg和Coversin 250μg/kg治疗的所述百分比进一步减小。媒剂与0.25mg/kg剂量之间存在63％差异。根据双尾t检验的此差异的P值为0.0023。媒剂和0.25mg/kg剂量在第10天的平均ABSA评分为6.23+1.1和2.65+0.4。平均值之后的值为SD。

Coversin比先前测试的分子在更大程度上减小ABSA百分比。举例来说，在先前的类似实验中，以预防性给药方案向C57BL/6J 8周龄雌性小鼠施用N-[1-(1-苯并噻吩-2-基)乙基]-N-羟基脲(齐留通)，其为5-脂肪加氧酶抑制(5-LO)口服抑制剂(二十碳四烯酸级联的重要酶，并且参与生物活性白三烯(LT)的形成)。在此更早实验中，将小鼠分成两组，并且接受补充至其饮用水中的0.6-0.8毫克/小鼠/天的齐留通或媒剂对照。诱发且评估实验性EBA[44]。ABSA％减小，且可得出如下结论：“从实验的第7天开始且直至其终点，用齐留通治疗的小鼠比对照组展现显著减小的疾病严重程度(第7天的临床评分；对照组：

齐留通治疗组：

的受影响体表面积)”。

在类似的更早实验中，在EBA的抗体转移模型中施用20毫克/千克/天的甲泼尼龙，在实验结束时，对照小鼠的7.5±0.1％的体表面积受皮肤损伤影响，但此疾病严重程度在甲泼尼龙治疗小鼠中显著减小至4.7±0.4％[45]。

实施例2 Coversin在EBA转移模型中的作用

研究包括以下实验组，其中每个实验组有5只小鼠：

1.媒剂(PBS)对照组

2. 125μg/kg Coversin，2×每日，皮下

3. 2500μg/kg Coversin，2×每日，皮下

如Sezin et al.[46]中所述诱发抗体转移EBA样皮肤炎症。简单来说，在第0、2和4天向C57BL/6J WT小鼠皮下(s.c.)注射50μg亲和纯化的抗Col7 IgG。

从实验的第5天开始用Coversin治疗小鼠(第0天＝首次施用抗COL7抗体的当天)。随后，每12小时向小鼠的肩胛区皮下注射Coversin或媒剂对照，直至实验结束。

对疾病严重程度进行评分。为了对疾病严重程度进行评分，由对治疗不知情的单个经过训练的审查员将展现出红斑、水疱、糜烂、痂皮或秃发的皮肤区域分类为“受影响”。计算受皮肤损伤影响的绝对身体表面(ABSA)的百分比。为了对疾病进行评分，从实验的第4天开始每隔一天用腹膜内施用的氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行麻醉。

根据此方案进行两个独立实验。

测试物制备

18mg的Coversin用0.6ml无菌水复原以达到30mg/ml的浓度，经等分式样且储存于-20℃下直至最终稀释。

在实验开始之前，计算小鼠的平均体重，即时制备2.5mg/kg和0.125mg/kg药物至100μl最终体积的PBS pH 7.2中。每日两次在最终注射至小鼠之前30分钟即时制备药物。此后，基于小鼠的平均体重，用PBS pH 7.2将药物调节至适合于在100μl的最终体积中提供所需的mg/kg剂量的浓度。每日两次在向动物最终施用之前30分钟即时制备药物。作为媒剂对照，向小鼠皮下注射100μl PBS pH 7.2。

统计分析

使用GraphPad Prism 7通过双因素方差分析评估治疗组之间的ABSA。

结果

临床病征和治疗功效

在实验1中，Coversin剂量依赖性地改善皮肤炎症，其通过受影响的绝对体表面积(ABSA)测量。2.5mg/kg Coversin有效地减小ABSA(图6)。在实验1中，阴性对照(媒剂)组中的ABSA为约7％，其为此模型中获得的典型值。阴性对照组中的所有小鼠显示类似发炎性反应。

在实验2中，2.5mg/kg Coversin显著(P<0.01)改善皮肤炎症，其通过(ABSA)测量(图7)。在此实验中，阴性对照(媒剂)组中的ABSA在约4％的平均值处达到峰值，其略低于此模型中通常获得的值。

在两个实验中，在治疗期间未发生小鼠死亡。在开始Col7 IgG被动转移之后的第12天处死小鼠。

实施例3患者的水疱液中的C5和LTB4

测试来自4名大疱性类天疱疮患者的水疱液中的C5a和LTB4的水平。图9A(C5a)和9B(LTB4)显示4名患者各自的结果。用注射器从患有急性BP的四名入院的BP患者的水疱抽吸水疱液。立即用液氮冷冻样品。使用来自R&D Systems的ELISA试剂盒测量所述液体中的LTB4和C5a水平。

实施例4比较双重作用和单一作用Coversin的效应

在另一实验中，评估PAS-L-Coversin的效应。用0.1mg/kg、10mg/kg、1mg/kg PAS-L-Coversin或2.5mg/kg Coversin治疗小鼠，其中实验如上文所述地进行。PAS-L-Coversin具有融合至Coversin序列的N末端的PAS序列，所述Coversin序列已经突变以使其结合LTB4但不结合C5(称为“L-Coversin”)。L-Coversin序列的序列为成熟Coversin序列(SEQ IDNO:4)的变体，其中以下残基已被修饰：Ala44变为Asn、Met116变为Gln、Leu117变为Ser、Gly121变为Ala、Leu122变为Asp、Glu123变为Ala，并且Asp149变为Gly，(称为变体2，序列为dsesdctgse pvdafqafse gkeayvlvrs tdpkardclk gepNgekqdn tlpvmmtfkn gtdwastdwtftldgakvta tlgnltqnre vvydsqshhc hvdkvekevp dyemwQSdag ADAveveccr qkleelasgrnqmyphlkGc(SEQ ID NO:23)，其中与SEQ ID NO:4的天然Coversin序列相比的变化呈大写字母形式)。由于PAS-L-Cov的分子量较高，因此10mg/kg PAS-L-Cov对应于2.5mg/kgCoversin。在第一个实验(图6A)中，与对照相比，10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin减小ABSA，但1mg/kg或0.1mg/kg剂量并未减小ABSA。在第二个实验(图6B)中，与对照相比，10mg/kg剂量和1mg/kg的PAS-L-Coversin减小ABSA，但0.1mg/kg剂量并未减小ABSA。10mg/kg剂量PAS-L-Coversin不如摩尔等效的2.5mg/kg剂量的Coversin有效(尽管10mg/kg剂量的PAS-L-Coversin在第二个实验中显示统计学显著效应)。这表明，Coversin的双重抑制活性(C5和LTB4抑制)在此模型中提供改进的治疗益处。

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[46]Sezin T,Krajewski M,Wutkowski A,Mousavi S,Chakievska L,Bieber K,et al.The Leukotriene B4 and Its Receptor BLT1 Act as Critical Drivers ofNeutrophil Recruitment in Murine Bullous Pemphigoid-Like EpidermolysisBullosa Acquisita.J Invest Dermatol.2017,137(5):1104-13.

序列表

<110> 沃卢申伊缪诺制药公司

<120> 治疗方法

<130> P070474WO

<141> 2018-04-20

<150> GB1706404.9

<151> 2017-04-21

<150> GB1706406.4

<151> 2017-04-21

<150> GB1706452.8

<151> 2017-04-24

<160> 29

<170> SeqWin2010, version 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 1

atgctggttt tggtgaccct gattttctcc ttttctgcga acatcgcata tgctgacagc 60

gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa 120

gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagaa 180

ccagccggag aaaagcagga caacacgttg ccggtgatga tgacgtttaa gaatggcaca 240

gactgggctt caaccgattg gacgtttact ttggacggcg caaaggtaac ggcaaccctt 300

ggtaacctaa cccaaaatag ggaagtggtc tacgactcgc aaagtcatca ctgccacgtt 360

gacaaggtcg agaaggaagt tccagattat gagatgtgga tgctcgatgc gggagggctt 420

gaagtggaag tcgagtgctg ccgtcaaaag cttgaagagt tggcgtctgg caggaaccaa 480

atgtatcccc atctcaagga ctgctag 507

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 2

Met Leu Val Leu Val Thr Leu Ile Phe Ser Phe Ser Ala Asn Ile Ala

1 5 10 15

Tyr Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala

20 25 30

Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser

35 40 45

Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu

50 55 60

Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr

65 70 75 80

Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val

85 90 95

Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp

100 105 110

Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro

115 120 125

Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val

130 135 140

Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln

145 150 155 160

Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys

165

<210> 3

<211> 453

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 3

gacagcgaaa gcgactgcac tggaagcgaa cctgttgacg ccttccaagc tttcagtgag 60

ggcaaagagg catatgtcct ggtgaggtcc acggatccca aagcgaggga ctgcttgaaa 120

ggagaaccag ccggagaaaa gcaggacaac acgttgccgg tgatgatgac gtttaagaat 180

ggcacagact gggcttcaac cgattggacg tttactttgg acggcgcaaa ggtaacggca 240

acccttggta acctaaccca aaatagggaa gtggtctacg actcgcaaag tcatcactgc 300

cacgttgaca aggtcgagaa ggaagttcca gattatgaga tgtggatgct cgatgcggga 360

gggcttgaag tggaagtcga gtgctgccgt caaaagcttg aagagttggc gtctggcagg 420

aaccaaatgt atccccatct caaggactgc tag 453

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 4

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln

35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp

50 55 60

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln

85 90 95

Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr

100 105 110

Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys

115 120 125

Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr

130 135 140

Pro His Leu Lys Asp Cys

145 150

<210> 5

<211> 450

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 5

agcgaaagcg actgcactgg aagcgaacct gttgacgcct tccaagcttt cagtgagggc 60

aaagaggcat atgtcctggt gaggtccacg gatcccaaag cgagggactg cttgaaagga 120

gaaccagccg gagaaaagca ggacaacacg ttgccggtga tgatgacgtt taagaatggc 180

acagactggg cttcaaccga ttggacgttt actttggacg gcgcaaaggt aacggcaacc 240

cttggtaacc taacccaaaa tagggaagtg gtctacgact cgcaaagtca tcactgccac 300

gttgacaagg tcgagaagga agttccagat tatgagatgt ggatgctcga tgcgggaggg 360

cttgaagtgg aagtcgagtg ctgccgtcaa aagcttgaag agttggcgtc tggcaggaac 420

caaatgtatc cccatctcaa ggactgctag 450

<210> 6

<211> 149

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 6

Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala

1 5 10 15

Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro

20 25 30

Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp

35 40 45

Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala

50 55 60

Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr

65 70 75 80

Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser

85 90 95

His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu

100 105 110

Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys

115 120 125

Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro

130 135 140

His Leu Lys Asp Cys

145

<210> 7

<211> 447

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 7

gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa 60

gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagaa 120

ccagccggag aaaagcagga caacacgttg ccggtgatga tgacgtttaa gaatggcaca 180

gactgggctt caaccgattg gacgtttact ttggacggcg caaaggtaac ggcaaccctt 240

ggtaacctaa cccaaaatag ggaagtggtc tacgactcgc aaagtcatca ctgccacgtt 300

gacaaggtcg agaaggaagt tccagattat gagatgtgga tgctcgatgc gggagggctt 360

gaagtggaag tcgagtgctg ccgtcaaaag cttgaagagt tggcgtctgg caggaaccaa 420

atgtatcccc atctcaagga ctgctag 447

<210> 8

<211> 148

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 8

Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe

1 5 10 15

Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys

20 25 30

Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn

35 40 45

Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser

50 55 60

Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His

85 90 95

His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met

100 105 110

Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg

115 120 125

Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His

130 135 140

Leu Lys Asp Cys

145

<210> 9

<211> 444

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 9

agcgactgca ctggaagcga acctgttgac gccttccaag ctttcagtga gggcaaagag 60

gcatatgtcc tggtgaggtc cacggatccc aaagcgaggg actgcttgaa aggagaacca 120

gccggagaaa agcaggacaa cacgttgccg gtgatgatga cgtttaagaa tggcacagac 180

tgggcttcaa ccgattggac gtttactttg gacggcgcaa aggtaacggc aacccttggt 240

aacctaaccc aaaataggga agtggtctac gactcgcaaa gtcatcactg ccacgttgac 300

aaggtcgaga aggaagttcc agattatgag atgtggatgc tcgatgcggg agggcttgaa 360

gtggaagtcg agtgctgccg tcaaaagctt gaagagttgg cgtctggcag gaaccaaatg 420

tatccccatc tcaaggactg ctag 444

<210> 10

<211> 147

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 10

Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser

1 5 10 15

Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala

20 25 30

Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr

35 40 45

Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr

50 55 60

Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly

65 70 75 80

Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His

85 90 95

Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp

100 105 110

Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln

115 120 125

Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu

130 135 140

Lys Asp Cys

145

<210> 11

<211> 441

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 11

gactgcactg gaagcgaacc tgttgacgcc ttccaagctt tcagtgaggg caaagaggca 60

tatgtcctgg tgaggtccac ggatcccaaa gcgagggact gcttgaaagg agaaccagcc 120

ggagaaaagc aggacaacac gttgccggtg atgatgacgt ttaagaatgg cacagactgg 180

gcttcaaccg attggacgtt tactttggac ggcgcaaagg taacggcaac ccttggtaac 240

ctaacccaaa atagggaagt ggtctacgac tcgcaaagtc atcactgcca cgttgacaag 300

gtcgagaagg aagttccaga ttatgagatg tggatgctcg atgcgggagg gcttgaagtg 360

gaagtcgagt gctgccgtca aaagcttgaa gagttggcgt ctggcaggaa ccaaatgtat 420

ccccatctca aggactgcta g 441

<210> 12

<211> 146

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 12

Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu

1 5 10 15

Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg

20 25 30

Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu

35 40 45

Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp

50 55 60

Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn

65 70 75 80

Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys

85 90 95

His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met

100 105 110

Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys

115 120 125

Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys

130 135 140

Asp Cys

145

<210> 13

<211> 438

<212> DNA

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 13

tgcactggaa gcgaacctgt tgacgccttc caagctttca gtgagggcaa agaggcatat 60

gtcctggtga ggtccacgga tcccaaagcg agggactgct tgaaaggaga accagccgga 120

gaaaagcagg acaacacgtt gccggtgatg atgacgttta agaatggcac agactgggct 180

tcaaccgatt ggacgtttac tttggacggc gcaaaggtaa cggcaaccct tggtaaccta 240

acccaaaata gggaagtggt ctacgactcg caaagtcatc actgccacgt tgacaaggtc 300

gagaaggaag ttccagatta tgagatgtgg atgctcgatg cgggagggct tgaagtggaa 360

gtcgagtgct gccgtcaaaa gcttgaagag ttggcgtctg gcaggaacca aatgtatccc 420

catctcaagg actgctag 438

<210> 14

<211> 145

<212> PRT

<213> 非洲钝缘蜱

<400> 14

Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly

1 5 10 15

Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp

20 25 30

Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro

35 40 45

Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp

50 55 60

Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu

65 70 75 80

Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His

85 90 95

Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu

100 105 110

Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu

115 120 125

Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Asp

130 135 140

Cys

145

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 15

Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 16

Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Ala Pro Ser

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 17

Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala

1 5 10 15

Ser Pro Ser Ser

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 18

Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ala Ser Pro Ser

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 19

Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ser Ser Pro Ala

20

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 20

Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro

1 5 10 15

Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAS序列

<400> 21

Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala

20

<210> 22

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体1

<400> 22

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln

35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp

50 55 60

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln

85 90 95

Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr

100 105 110

Glu Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys Glu Val Glu Cys

115 120 125

Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr

130 135 140

Pro His Leu Lys Asp Cys

145 150

<210> 23

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体2

<400> 23

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln

35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp

50 55 60

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln

85 90 95

Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr

100 105 110

Glu Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val Glu Val Glu Cys

115 120 125

Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr

130 135 140

Pro His Leu Lys Gly Cys

145 150

<210> 24

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体3

<400> 24

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln

35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp

50 55 60

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln

85 90 95

Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr

100 105 110

Glu Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val Glu Val Glu Cys

115 120 125

Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr

130 135 140

Pro His Leu Lys Gly Cys

145 150

<210> 25

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体4

<400> 25

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Asn Gly Glu Lys Gln

35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp

50 55 60

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln

85 90 95

Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr

100 105 110

Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys

115 120 125

Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr

130 135 140

Pro His Leu Lys Asp Cys

145 150

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 环序列

<400> 26

Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体1的环序列

<400> 27

Gln Trp Gln Ser Asn Gly Ser Ala Asp Asp Lys

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Coversin变体2的环序列

<400> 28

Met Trp Gln Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ala Val

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Coversin变体3的环序列

<400> 29

Met Trp Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asp Glu Val

1 5 10

Claims

1.一种在受试者中治疗或预防AIBD的方法，其包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物。

2.一种药剂，其为包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物，用于在受试者中治疗或预防AIBD的方法。

3.一种在受试者中治疗或预防AIBD的方法，其包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的药剂，所述药剂为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子。

4.一种药剂，其为编码包含图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的第19至168位氨基酸的蛋白质或此蛋白质的功能等效物的核酸分子，用于在受试者中治疗或预防AIBD的方法。

5.根据权利要求1或3中任一项所述的方法或根据权利要求2或4中任一项所述用途的药剂，其中所述药剂为蛋白质或编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列具有至少90％序列同一性的序列，

且所述蛋白质结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且/或结合至LTB4。

6.根据权利要求1、3或5中任一项所述的方法或根据权利要求2、4或5中任一项所述用途的药剂，其中所述药剂为蛋白质或编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列具有至少95％序列同一性的序列，

7.根据权利要求1、3或5至6中任一项所述的方法或根据权利要求2、4或5至6中任一项所述用途的药剂，其中所述药剂为蛋白质或编码蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列或由SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列组成。

8.根据权利要求1或3中任一项所述的方法或根据权利要求2或4中任一项所述用途的药剂，其中药剂为蛋白质或编码蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列，其中已进行至多10个氨基酸取代、插入或缺失，

9.根据权利要求1或3中任一项所述的方法或根据权利要求2或4中任一项所述用途的药剂，其中所述药剂为根据权利要求4至7中任一项所述的蛋白质的片段，或编码根据权利要求4至7中任一项所述的蛋白质的片段，

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述药剂经皮下施用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述受试者为人类。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述药剂以足以结合所述受试者中尽可能多的可用的C5和/或LTB4，优选地所有可用的C5的剂量施用。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述药剂以结合所述受试者中所有可用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的1.5倍的剂量施用。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述方法包括向所述受试者施用初始负荷剂量的所述药剂且接着施用其维持剂量。

15.根据权利要求14所述的方法，其中存在一个初始维持剂量和一个或多个另外的维持剂量。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述方法进一步包括施用第二AIBD治疗。

17.根据权利要求16所述的方法或所述用途的药剂，其中所述第二AIBD治疗选自全身皮质类固醇疗法、局部皮质类固醇疗法、免疫抑制疗法和免疫抑制生物疗法。

18.根据权利要求17所述的方法或所述用途的药剂，其中皮质类固醇选自泼尼松和泼尼龙，所述免疫抑制疗法选自甲泼尼龙、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、氨苯砜和环磷酰胺，且所述免疫抑制生物疗法选自利妥昔单抗和静脉内免疫球蛋白G(IVIG)。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述AIBD为大疱性类天疱疮或EBA，优选为大疱性类天疱疮。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中包含SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的所述蛋白质的所述功能等效物为融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)与SEQ ID NO:2的第19至168位氨基酸的序列具有至少90％序列同一性的序列，和(b)第二序列，

且所述融合蛋白结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且/或结合LTB4。

21.根据权利要求20所述的方法或所述用途的药剂，其中所述第二序列为PAS序列。

22.根据权利要求20或21所述的方法或所述用途的药剂，其中所述融合蛋白包含(a)由30个拷贝的SEQ ID NO:15组成的PAS序列，和(b)(i)SEQ ID NO:2的第19-168位氨基酸，其中(a)融合至(b)的N末端。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法或所述用途的药剂，其中所述蛋白质或融合蛋白结合C5以防止补体C5通过转化酶裂解为补体C5a和补体C5b且结合LTB4。