JP4772667B2 - 補体阻害剤 - Google Patents
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Description
材料及び方法
材料
ヒツジ及びウサギの赤血球は組織培養サービス(Tissue Culture Services)から入手し、溶血素、プール正常ヒト血清(NHS)及び除去血清(depleted sera)は全てシグマ社から入手した。モルモット血清は家庭用動物から得た。不純物を含まないC3、C4、C5、C8及びC9、並びにB因子及びD因子はカルビオケム(Calbiochem)から購入した。抗ヒトC3aウサギポリクローナル抗血清はカルビオケム(Calbiochem)から入手し、コブラ毒因子(CVF)はキデル(Quidel)から入手した。C5aELISA検出キットは、イムノ−バイオロジカル研究所(Immuno-Biological Laboratories)(IBL)から購入した。
オルニトドロス・ムバータ(Ornithodorus moubata )マダニはジョーンズ(Jones)ら(1988)に従い飼育した。
唾液腺を顕微鏡下で切り取り、冷PBS緩衝液(0.O1Mリン酸緩衝液と0.15M NaCl pH7.2)中で簡単に濯ぎ、ドライアイスに入れたエッペンドルフ管に移して−20℃で凍結保存した。使用時に30対の唾液腺を解凍し、1mLダウンス(Dounce)ホモジナイザーを用いてPBS(500μL)に破壊した。ベンチトップ遠心分離機を用いて15000RPMでホモジネートを遠心分離し、上清(唾液腺抽出物(SGE)という)を回収して−70℃で保存、或いは補体阻害剤作用について試験をし、活性画分の分離に用いた。
新鮮なヒツジ血液をAlsever’s溶液に添加したもの(5mL、1:1 vol/vol)をゼラチンベロメナールバルビタール−EDTA(GVB−EDTA)(50mL)中で1回、GVB2+緩衝液(Mg2+及びCa2+を含有するGVB緩衝液)(50mL)中で3回洗浄した。この血液を1×109細胞/mLとなるように希釈した。赤血球は、文献(コリガン(Coligan)、1994)の記載に従い力価を測定したウサギ溶血素を用いて感作した。アッセイは、補体材料としてのNHS或いはモルモット血清のGVB2+希釈液(1:40)(100μL)と、2×108個の感作赤血球(EA)(100μL)とを合せた総量200μLを用いて標準的なプロトコル(ギクラス(Giclas)、1994)に従い行った。SGE、ネイティブ或いは組換えOmCI(nOmCI或いはrOmCI)、或いはPBS(1〜5μL)を最後に添加し、反応物を37℃でインキュベートした。所定の時間(〜32分)の後、全細胞を12000×gで5秒間遠沈させ、分光測定(412nm)により溶血を測定した(コリガン(Coligan)、1994)。全てのアッセイは少なくとも3回行った。
新鮮なウサギ血液をAlsever's溶液に添加したもの(5mL、1:1 vol/vol)をGVB/Mg(10mM)EGTA緩衝液(50mL)中で3回洗浄した。各洗浄の間には1500×gで10分間遠心分離を行った。このウサギ血液を、2×108細胞/mLとなるように希釈した。NHSをGVB/Mg EGTA緩衝液に希釈した。アッセイ量は、調製した血液50μLを用いて150μLとした。最後に1〜5μLのSGE、PBS、ネイティブOmCI或いは組換えOmCIを反応物に添加し、反応物を37℃でインキュベートした。所定の時間(〜60分)の後、全細胞を12000×gで5秒間遠沈させ、分光測定(412nm)により溶血を測定した(コリガン(Coligan)、1994)。全てのアッセイは少なくとも3回行った。
ヒト除去血清をメーカーの指示に従い用いたが、各反応物の総量は減らして200μLとした。90%溶解を示す不純物を含まない補体成分の量及び希釈度は経験的に決定した。反応物は37℃で30分間インキュベートした。全てのアッセイは少なくとも3回行った。
SGE(150μL)を25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)、50mM NaCl(5mL)に希釈し、1mLのQ−セファロースHP陽イオン交換カラム(ファルマシア)に流量1mL/分で通した。カラム体積の10倍量のランニングバッファで洗浄した後、結合したタンパク質を40分、0.05〜0.75M NaCl勾配を用いて流量0.5mL/分で溶離させ、280nmを観測した。1mLずつの画分として回収し、10μLをアッセイに用いて補体阻害剤作用を測定し、総量200μLのCH50アッセイを行った。代表的な活性画分及び非活性画分をセントリコン3濾過装置(アミコン)を用いて50μLに濃縮し、PBS(2mL)を添加し、画分を再度50μLに濃縮し、各1.5μLを4〜12%トリス−トリシン変性SDSゲル(インビトロジェン)上で泳動させた。活性画分及び非活性画分について1レーンあたり5μLをpH3〜7のIEFゲル(インビトロジェン)上を泳動させ、0.7%酢酸を用いてイモビロンTM−P(ImmobilonTM-P)(ミリポア)にエレクトロブロッティングした。膜をポンソーSで染色し、主要なバンドを切り取って、1分間ボルテックスし10分間15000回転で3回遠心分離をすることによって200μLの50mMトリス(pH8)、2%Triton−X100に溶出させた。Triton−X100は、上述の条件下でタンパク質をQ−セファロースHPカラムで再精製することによって除去した。セントリコン3濃縮を行い、緩衝液をPBSに交換した後、補体阻害剤活性測定のため、試料をアッセイして、4〜12%ゲル上で調べるか、HPLC分画とタンパク質配列解析に付した。
CH50/AH50アッセイは、ネイティブOmCIを含有している或いは含有していないNHS又はモルモット血清を総量200μL(最終希釈度1:80)で用いて行った。反応物を37℃とし、所定の時間に水槽から取り出し、12000gで10秒間スピンし、上清を取って続くイムノブロッティングによる分析に用いた。減少(reduced)した各上清試料(l0μL)を4〜12%ビス−トリスゲル上でMESランニングバッファ(インビトロジェン)を用いて電気泳動した後、ニトロセルロースに転写した。全てのレーンに等しくローディングされ均一に転写されていることは、ポンソー染色した血清アルブミンの強度で判断した。C3のC3a切断は抗ヒトC3aウサギ単一特異的抗血清(カルビオケム)を用いたイムノブロッティングにより検出した。ニトロセルロース膜をリン酸緩衝生理食塩水、0.1%Tween20、5%無脂肪乾燥ミルク(PBSTM)で一晩ブロッキングした。この後に行う全ての希釈及び洗浄工程は、特段の記載のないかぎりこの緩衝液を用いた。抗C3a抗血清を1:500に希釈し、膜を2時間インキュベートした。次に膜を20分間2回洗浄し、抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート(シグマ)のPBSTM希釈物(1:3000)を添加した。膜を更に2時間インキュベートした後、5分間2回洗浄し、水で簡単にすすぎ、BCIP/NBTパープルリキッドアルカリホスファターゼサブストレート(シグマ)(10mL)を添加した。
C3a検出と同様にして溶血アッセイを行った。C5aELISAキット(IBL)を用いてC5からC5aへの切断を検出した。未切断のC5との交叉反応が起こらないようにするため、キットメーカーが提供した試薬を用いて、溶血アッセイから得た上清中のC5を沈澱させた。キットの測定範囲は0.1〜10μg/Lである。検出下限は0.02μg/Lである。
ヒト血清(5μL)に0.25μgのCVF(0.25μg/μLストック)とネイティブOmCI(1μL)或いはPBS(1μL)とを添加し37℃で1時間インキュベートした。このCVF処理血清の半分量をGVB2+(97.5μL)及びEA(100μL)に添加した。37℃で20分間インキュベートした後、反応上清中のC5aの溶解率及び濃度(上を参照)を測定した。
IEF分解タンパク質から溶出した活性画分(20μL)をジュピター(Jupiter)C4カラム/150×1.0mm(0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)含有勾配10〜40%アセトニトリル(ACN)、流量1mL/分、0.5%ACN/分漸増)に通し、215nmをモニターした。約53分における4本の近接したランニングピークをイモビロン(Immobilon)−P膜に転写し、アプライドバイオシステムズミニブロット(Mini-Blott)カートリッジを用いて配列解析した。各タンパク質に対し25サイクル行った。
3回乃至4回の給餌後のO.ムバータ(O.moubata)幼虫から60対の唾液腺を上述のように切り取り、1mLのRNAlaterTM(アンビオン(Ambion))(PBSの替わり)に添加し−20℃で保存した。FastTrackTM2.0mRNA単離キット(インビトロジェン)を用いてmRNAを単離し、ストラタジーンcDNA合成キット(カタログ番号200401−5)を用いてcDNAを合成した。セファロースCL−2Bカラムを通して大きなcDNAと小さなcDNAを分画後、エタノール沈澱させた各cDNAペレットをddH2O(3.5μL)に再懸濁させた。cDNA収量は、大きな分子については約3.0ng/μL、小さな分子については5ng/μLであった。残留した大きなcDNAと小さなcDNAは全て、ストラタジーン UniZAP XRファージベクター(カタログ番号237211)を用いて連結し、Gigapack(登録商標)III Goldパッケージングエキストラクトを用いてパッケージングした。大きなcDNAのライブラリーには11500のプライマリープラークがあり、小さなcDNAのライブラリーには480500のプライマリープラークがあった。増幅後の大ライブラリー及び小ライブラリーのタイターはそれぞれ1.5×108pfu/mL及び4×109pfu/mLであった。
TA TAG 3’)プライマー及びT3(5’AAT TAA CCC TCA CT
A AAG3’)プライマーを用いてPCRにより確認する。各100μLの反応液は、
溶出されたファージ(2μL)、10mM dNTPs(2μL)、各プライマー(2μL)(0.5μg/mLのストックから)、10X REDTaq(シグマ)PCR反応緩衝液(10μL)(100mM Tris−HCl pH8.3、500mM KC1、llmM MgCl2、0.1%ゼラチン)、REDTaq(シグマ)DNAポリメラーゼ(3μL)(20mM Tris−HCI、pH8.0、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5% Tween20、0.5% Igepal CA−630、不活性染色剤、50%グリセロール中に1unit/μL)、及びddH2O(79μL )からなる。熱サイクル(Hybaid Touchdown thermal cycler)パラメータは、1×94℃ 4分、30×94℃ 1分、48.5℃ 45秒、72℃ 90秒、1×72℃ 5分とした。このPCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、大ライブラリーインサートは≧1000塩基対であり、小ライブラリーインサートは≦1000塩基対であることがわかった。
HPLCで53分に溶出された2本の主要ピークについて決定した各N末端配列を用いて、T7プライマー(UniZAP XRベクターに結合)と共に用いるための縮重(degenerate)プライマー(OF4)を設計し、補体阻害剤をコードするcDNAを増幅した。OF4の配列は、5’GTAC WSN GGN WSN GAR CCN GT3’(N=A又はC又はG又はT;R=G又はA;S=G又はC;W=A又はT)であった。100μLの反応液は、大又は小のcDNAライブラリー(3μL)、10mM dNTPs(3μL)、T7(2μL)とOF4(4μL)(0.5μg/mLのストックから)、10X REDTaq PCR反応緩衝液(10μL)、REDTaqDNAポリメラーゼ(3μL)及びdH2O(75μL)からなる。熱サイクルパラメータは1×94℃ 4分、30×94℃ l分、48.5℃ 45秒、72℃ 90秒、1×72℃ 5分であった。
TA TCC 3’)をT3プライマー(UniZAP XRベクターに連結)と共に用
いてこのcDNAの5’末端を得た。650bpのPCR産物をクローニングしてpGEM(−T Easyベクター(プロメガ)とした後、別のプライマー(OR3 5’CG
T CCA ATC GGT TGA AG 3’及びOF6 5’GAC TCG
CAA AGT CAT CAC 3’)を用いて配列解析した。
解析は、GCGの一連のプログラム(ウィスコンシン・パッケージ(Wisconsin Package)バージョン10.1、ジェネティックス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)(GCG)、ウィスコンシン州マジソン)とスイス・バイオインフォマティクス研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(http://expasy.hcuge.ch/)のExPASy(エキスパートタンパク質解析システム(Expart Protein Analysis System))プロテオミクス・サーバーとを用いて行った。配列は、BlastXプログラム(アルツシュル(Altschul)ら、1997)を用いてGenBankノンリダンダント(non-redundant)(NR)タンパク質データベースと比較し、Pfam(ベートマン(Bateman)ら、2000)タンパク質ドメインとSMART(シュルツ(Schultz)ら、2000)タンパク質ドメインとについて検索した。Clustal X(ジーンムジン(Jeanmougin)ら、1998)を用いて多重配列アラインメントを行った。
OmCIコード領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR;95℃ 30”、50℃ 30”、72℃ 30”;18サイクル)により増幅した。増幅には、フォワードプライマーとしてOM1Y(5’−ATAGAGCTCAAAATGCTGGTTTTGGTGACC−
3’)を用い、リバースプライマーとしてOR7a(タグ化産物のための5’ACTGA
GCGGCCGCCTAGTGATGGTGATGGTGAT GACCGCAGTCCTTGAGATGGGG 3’)或いはOR6(5’ACT GAGCGGCCGCCT
AGCAGTCCTTGAGATGGGG 3’ 非タグ化産物)を用いた。これらプラ
イマーは制限部位に組み込み、開始コドンの上流にSac I部位が挿入され、停止コドンの下流にNot I部位が挿入されるようにした。これをpMETαCトランスファーベクター(インビトロジェン)のSac I部位とNot I部位の間に連結した。このプラスミド(XL1−Blue細胞(ストラタジーン)において増幅)を、供給者(インビトロジェン)の指示に従いピッチア・メタノリカ(Pichia methanolica)のpMAD16株及びpMADll株に形質転換した。陽性クローンは緩衝デキストロース複合培地(Buffered Dextrose-complex Medium)BMDY中で増殖させ、タンパク質発現を緩衝メタノール複合培地(Buffered Methanol-complex Medium)中で誘起した。上清及び6種の陽性クローンにおけるタンパク質発現をCH50溶解アッセイにより24時間毎に5日間アッセイした。
モルモット血清1:40希釈物の場合に古典経路仲介細胞溶解を約90%阻害するネイティブOmCIの最小量は、全反応量100μLに対して25ngであった。熱安定性を確認するため次の処理を行った。1μLのネイティブOmCI(250ng)をPBS(9μL)に希釈した。各試料を0、3、9、27分沸騰させ、急速に氷冷し、1μL(25ng)を100μLのCH50アッセイ試料(1:40モルモット血清希釈物)に添加した。pH安定性を測定するため次の処理を行った。1μLのネイティブOmCI(250ng)を9μLの10mM酢酸ナトリウム(pH4.5及び5.5)、10mM Tris.Cl(pH7及び8.2)或いは10mM CAPS(pH10及び11)緩衝液で希釈した。37℃で30分間インキュベート後、1μL(25ng)を100μLのCH50アッセイ試料(1:40モルモット血清希釈物)に添加した。対照として、1:40血清希釈物の存在下或いは非存在下において各緩衝液1μLのみを含有する物を用いた。全てのアッセイは三連で行った。
0.5μgのネイティブOmCI及び5μgのRaHBP2を非変性SDS−PAGEに付し、ニトロセルロースに転写して、PBS、0.05%Tween20、5%無脂肪乾燥ミルク(non-fat dried milk)(PBSTM)中で一晩ブロッキングした。C3及びC5をIodogenを用いてメーカー(ピアス社)の指示に従いI125で標識した。ブロットを、PBSTM(15mL)中、I125標識C3(1440kcpm/分)(2μg)及びI125標識C5(2160kcpm/分)(2μg)を用いて室温で4時間インキュベートした。室温でPBSTMを用いて3×20分洗浄後、ニトロセルロース膜を乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。
O.ムバータ(O.moubata)SGEからの活性画分の精製及び特定
陽イオン交換クロマトグラフィー後、活性画分を0.25M NaClで溶出させた(図2a及び図2b、矢印)。活性画分と対照画分(図3a)をIEFゲル(図3b)からPVDF膜に電気ブロットし、膜をポンソーSで染色した。主要なバンドを切り取り、溶出させ、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製して、補体阻害活性をアッセイした。変性SDS PAGEの結果、阻害活性は、質量約19kDaのトリプレットのタンパク質に関連していることが分かった(図3a)。IEFの結果、阻害活性はpIが約4.2のシングルの支配的バンドに関連していることが分かった(図3b、画分17からの上方バンドキャリーオーバー)。PVDF溶出画分のHPLCでは、隣接する4本のピークを示した(図3c)。最も大きなピーク(図3c、ピークD)から獲られた17アミノ酸N末端配列(DSESDXSGSEPVDAFQA)を用いて、このN末端配列に適合するO.ムバータ(O.moubata)cDNAライブラリーからのPCR産物を精製する縮重プライマーを設計した。
完全長クローンの配列から、OmCIは168個のアミノ酸長であることが分かる(図4)。このタンパク質は最初の18個の残基からなるN末端分泌シグナルを有する。N末端配列解析によると、シグナルペプチド切断部位はAla18〜Aspl9である。成熟(mature)タンパク質の予想分子量は16.77kDaであり、等電点は4.3である。予想されるNグルコシル化部位(Asn78とAsnl02)は2箇所であり、12の潜在的リン酸化部位(Ser20、22、25、84、113、115、156、Thr90、Tyr17、43、111、130、162)が存在する。しかしながら、このような部位の出現可能性は高く(タンパク質キナーゼC部位、カゼインキナーゼII部位、チロシンキナーゼ部位)、部位予想は必ずしも真の変化(genuine modification)を示していない。
アッセイした6種の陽性酵母クローンは、様々なレベルのOmCI発現を示した(図6a及びb)。発現が検出された場合は全て、阻害活性は5日目の最終アッセイポイントまで増加し続けた。発現されたタンパク質の約90%は上清中に存在していた(図6b)。クローン13.1は、最も高い発現レベルを示したので、続く発現研究に用いた。PEG沈澱及び2回のクロマトグラフィー段階を経て一部精製された活性rOmCIは、かなりグリコシル化された形態(図7a、画分9、10及び11)とグリコシル化されていない形態(図7a、画分12及び13)で存在する。グリコシル化された形態は、PNGaseFで処理することにより、グリコシル化されていない形態に対応することが示された(図7b)。グリコシル化されたrOmCI及びネイティブOmCIと、グリコシル化されていない或いは脱グリコシル化されたrOmCI及びネイティブOmCIとは、CH50アッセイにおいていずれも等しく活性を有していた(データは示さず)。rOmCIの最終収量は約0.3μg/mL培地であった。
OmCIは両方の補体経路を阻害する。しかしながら、古典経路は完全に阻害できるが、代替経路による赤血球の溶解の阻害は、過剰量のOmCIを使用した場合であっても80%しか阻害できない(図8)。
OmCIの煮沸は、9分まで行ってもこのタンパク質の阻害活性には大きく影響しないが、27分後までには阻害活性が低減する(図13)。ネイティブOmCIは、pH11までのアルカリ性緩衝液との接触による影響を受けない(図14)。OmCIの阻害活性はpH4.5の緩衝液との接触により大きく低減する(図14)。銀染色ゲルにより、これが単にこのpHにおけるOmCIの沈澱によるものではないことが分かった。
I125標識C3及びI125標識C5のウェスタンブロッティングから、OmCIは、関連するタンパク質C3に結合するのではなくC5に直接結合することが分かる(図15)。
他の各種タンパク質と従来の補体阻害剤との関係
OmCIは、ソフトマダニであるO.サウィギニュイ(O.savignyi)(マンズ(Mans)ら、2001)のマダニ唾液腺タンパク質2及び3(TSGP2及び3)と血小板凝固阻害剤のムバチン(ワックスマン(Waxman)とコノリー(Connolly)、1993)とに最も密接に関連している。これら3種のタンパク質(図5)のいずれも補体を阻害することはこれまで示されてもいないし、示唆もされていない。これら密接に関連する各タンパク質(図5)には存在せずOmCIには存在するこの2個の小さなアミノ酸挿入は、将来、OmCIにおける補体結合部位を確定するための突然変異研究において注目される部位であることはが明らかである。
酵母に発現したグリコシル化rOmCIと脱グリコシル化rOmCIの両方とも、SGEから精製されたネイティブタンパク質と同等に強力である。昆虫細胞において発現したC末端ヒスチジンタグ化OmCIはそれ程強力ではない(データは示さず)。OmCIは、ヒトとモルモットの補体活性化の古典経路と代替経路の両方を阻害するので、恐らく他の哺乳動物の経路も同様に阻害するであろう。この性質は、どのようにOmCIが作用するかを正確に規定するのに有用であろう。また、現在のC5阻害剤の種特異性が齧歯目動物を用いたインビボ研究の妨げとなる場合には、この性質は補体仲介疾患の動物モデルの開発においては価値がないものであろう(リンク(Link)ら、1999)。
OmCIは熱安定性を有するが、27分間煮沸すると活性は失われ始める。OmCIは酸による影響は受けるが、アルカリには影響されないと考えられる。恐らく、より長時間の煮沸と酸への曝露によってこのタンパク質を不活性化する立体配置変化が起こるであろう。
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Claims (31)
- 補体古典経路C5変換酵素及び補体代替経路C5変換酵素によるC5切断を阻害することによって補体古典経路及び補体代替経路を阻害する、図4のアミノ酸配列の19番〜168番のアミノ酸を含む、マダニ由来の補体阻害剤ポリペプチド。
- C5に結合することによりC5切断を阻害する、請求項1に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- C5と複合体を形成する、請求項2に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- 前記マダニがオルニトドロス・ムバータ(Ornithodoros moubata)である、請求項1に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- 図4のアミノ酸配列の1番〜168番のアミノ酸を含む、請求項4に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- 補体古典経路及び補体代替経路を阻害するマダニ由来の補体阻害剤ポリペプチドであって、前記補体阻害剤ポリペプチドは、
a)図4のアミノ酸配列の19番〜168番のアミノ酸或いは1番〜168番のアミノ酸を含むタンパク質、
b)a)に定義したタンパク質と少なくとも90%の同一性を有する相同体、
又は
c)上のa)に定義したタンパク質或いは上のb)に定義した相同体の活性フラグメントである補体阻害剤ポリペプチド。 - C5変換酵素によるC5切断を阻害するマダニ由来の補体阻害剤ポリペプチドであって、前記補体阻害剤ポリペプチドは、
a)図4のアミノ酸配列の19番〜168番のアミノ酸或いは1番〜168番のアミノ酸を含むタンパク質、
b)a)に定義したタンパク質と少なくとも90%の同一性を有する相同体、
又は
c)上のa)に定義したタンパク質或いは上のb)に定義した相同体の活性フラグメントである補体阻害剤ポリペプチド。 - C5に直接結合することによりC5切断を阻害する、請求項7に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- C5と複合体を形成する、請求項8に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチドに結合する抗体。
- 一以上のペプチド又はポリペプチドに遺伝子工学的或いは化学的に融合した請求項1〜10のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 前記補体阻害剤ポリペプチドがマーカードメインに遺伝子工学的或いは化学的に融合した、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 前記マーカードメインが放射化学タグである、請求項12に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド又は請求項11〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 図4の核酸配列の53番〜507番のヌクレオチドを含む、請求項14に記載の核酸分子。
- 図4の核酸配列の1番〜507番のヌクレオチドを含む、請求項14に記載の核酸分子。
- 非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子。
- 請求項14〜17のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項17に記載のアンチセンス核酸分子又は請求項18に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド又は請求項11〜13に記載の融合タンパク質の調製方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項19に記載の宿主細胞を培養すること、及び産生された前記タンパク質を回収することを含む方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチドのリガンドを特定するための方法であって、
a)補体阻害剤ポリペプチドを候補リガンドに接触させる段階と、
b)リガンド−補体阻害剤ポリペプチド複合体の形成を検出する段階とを含む方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド、請求項11〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子と、医薬的に許容される担体とを含む組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項22に記載の組成物。
- 治療に使用するための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド。
- 治療に使用するための、請求項11〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 治療に使用するための、請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 補体仲介疾病或いは障害の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド、請求項11〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子の使用であって、疾病或いは障害が、アルツハイマー病、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、再潅流障害、移植拒絶、敗血病、免疫複合体病、或いは遅延型過敏症である、使用。
- マダニによって媒介される疾病或いは障害に対して動物を保護するためのワクチン製造における、請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド、請求項11〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
- マダニがO.ムバータ(O.moubata)である、請求項28に記載の使用。
- 疾病或いは障害が回帰熱、アフリカ豚コレラ、或いは西ナイル熱である、請求項29に記載の使用。
- 細胞又は組織における補体古典経路及び補体代替経路を阻害するin vitro方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の補体阻害剤ポリペプチド、請求項11〜13に記載の融合タンパク質又は請求項14〜16のいずれか一項に記載の核酸分子を前記細胞又は組織に投与することを含むin vitro方法。
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