CN1798841B - 来源于蜱的补体抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制经典和替代补体通路的补体抑制剂。具体的，本发明涉及来源于噬血节肢动物唾液腺的、抑制经典和替代补体通路的补体抑制剂，本发明也涉及这些补体抑制剂在疾病的治疗和预防中的用途。
Description
本发明涉及抑制经典和替代补体通路的补体抑制剂。具体的，本发明涉及来源于噬血节肢动物唾液腺、抑制经典和替代补体通路的补体抑制剂。本发明也涉及这些补体抑制剂在疾病的治疗和预防中的用途。
文本中提到的和本说明书结尾处列出的所有文献都引入此处作为参考。
补体蛋白形成效应物免疫系统的主要力量(Law and Reid，1995；Dodds and Sim，1997；Whaley，1993)。血清中和细胞表面上超过30种蛋白质参与补体系统功能和调节。该系统由外来抗原的存在而被激活。存在两种激活通路：(1)经典通路，被IgM和IgG复合体或被碳水化合物识别激活；和(2)替代通路，被非自身表面(缺乏特异性调节分子)和细菌内毒素激活。两种通路包含平行的级联事件，通过在细胞表面形成相似的C3和C5转化酶而导致释放急性炎症介质(C3a和C5a)并形成膜攻击复合体，从而导致产生补体激活，如图1所示。
补体激活的效应范围宽广并包括：启动炎症，具体通过释放急性介质C3a和C5a；通过沉淀C4b和C3b调理并吞噬病原体；通过募集巨噬细胞清除免疫细胞复合体；通过抗原和C3d的共价结合增加抗原提呈到B细胞受体的效率；保留抗原在生发中心；增强抗原提呈细胞对抗原的摄入；和膜攻击复合体(MAC)介导的对外来或疾病细胞(例如，细菌、寄生虫、肿瘤细胞)的破坏。
补体激活必须严谨控制，以防止对自身组织的破坏。控制由短半衰期的活化蛋白和血浆中与细胞膜上存在的控制蛋白介导。当补体控制出错时，对身体组织的破坏会引起疾病。Sahu和Lambris(2000)已经编辑了补体激活控制出错在其中起作用的29种病理状态的列表。它们包括：急性胰腺炎、阿尔茨海默病、变应性脑脊髓炎、异体移植、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、烧伤、局限性回肠炎、肾小球性肾炎、溶血性贫血、血液透析、遗传性血管性水肿、缺血再灌注损伤、多系统器官衰竭、多发性硬化、重症肌无力、心肌梗死、银屑病、类风湿性关节炎、败血症性休克、系统性红斑狼疮、中风、血管渗漏综合征和异种移植。Ward等人，2000综述了表明补体激活在这些疾病的一些中的重要作用、来源于动物模型(敲除和转基因小鼠)的数据。
补体激活中出现的组织破坏由MAC和过敏毒素C3a与C5a介导。这两种肽通过它们对嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的作用诱导损伤。过敏毒素刺激的细胞释放促炎介质、组织降解酶、氧自由基并增加粘附分子和炎性细胞因子表达(Ember et al.，1998)。这又导致产生免疫应答并激活止血机制如凝血和纤维蛋白溶解。过敏毒素在感染性和非感染性炎症中的作用近来已被Kohl(2001)综述。MAC的促炎活性主要通过引起粘附分子、组织因子和趋化因子的表达增加由诱导细胞激活而间接介导。
由于补体控制在治疗医学疾病和病症中的重要性，正在开发多种补体抑制剂用于治疗用途(表1)。尽管这些抑制剂中的一些当前处于I/II期临床试验中，但这些抑制剂仍没有在临床上使用。开发中的抑制性分子是高分子量的天然抑制剂(Hebell etal.，1991；Weisman et al.，1990)，经常被特异性工程化(Mulligan et al.，1999；Smith andSmith，2001；Zhang et al.，2001)。它们一般是针对特异性补体成分的抗体(Frei et al.，1987；Link et al.，1999)、小分子包括RNA适配子(aptamer)(Biesecker et al.，1999)或特异性靶向补体受体的分子。
表1(来自Sahu and Lambris，2000)：开发中的补体抑制剂
由于补体抑制剂在治疗各种疾病和状态中的重要性，需要更多的补体抑制剂。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供抑制经典和替代补体激活通路的补体抑制剂分子。
“抑制”意思是替代和经典的补体激活通路的作用被降低。分子降低经典补体通路和替代补体通路作用的能力可以用本领域已知的标准溶血测试来确定，如在实施例中和Giclas et al(1994)中描述的那些。与缺少补体抑制剂分子的标准测试比较，优选的，在经典和替代补体激活通路的标准溶血测试中本发明补体抑制剂分子的存在降低红细胞裂解至少20％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
优选的，本发明补体抑制剂分子抑制经典通路中C5转化酶和替代通路中C5转化酶对C5的切割。如图1所示，C5转化酶将C5转化为C5b在替代补体通路和经典补体通路中都发生。经典通路中的C5转化酶是C4b3b2a，而替代通路中的C5转化酶是C3b2Bb。抑制这两种C5转化酶切割C5因而就抑制经典和替代补体激活通路。分子抑制经典和替代通路的C5转化酶切割C5的能力可以用标准体外测试确定。与缺少补体抑制剂分子的标准测试比较，优选的，本发明补体抑制剂分子的存在降低经典和替代通路中C5转化酶切割C5至少20％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。优选的，本发明补体抑制剂分子能抑制一定范围哺乳动物物种中经典和替代通路的C5转化酶切割C5。
根据本发明的第二个方面，提供抑制C5转化酶切割C5的补体抑制剂分子。根据本发明此方面的补体抑制剂分子可以抑制经典补体激活通路中C5转化酶切割C5。作为替代方案，根据本发明此方面的补体抑制剂分子可以抑制替代补体激活通路中C5转化酶切割C5。分子抑制经典或替代通路的C5转化酶切割C5的能力可以用上述标准体外测试确定。与缺少补体抑制剂分子的标准测试比较，优选的，本发明补体抑制剂分子的存在降低经典或替代通路中C5转化酶切割C5至少20％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
通过直接结合C5或C5转化酶或同时结合C5和C5转化酶，本发明补体抑制剂分子可以抑制经典通路、替代通路或同时抑制经典和替代通路的C5转化酶切割C5。优选的，本发明补体抑制剂分子通过直接结合C5而抑制C5的切割。作为替代方案，所述补体抑制剂分子可通过结合C5和C5转化酶的复合体而抑制C5的切割。本发明进一步提供与C5形成复合体、与C5转化酶形成复合体或同时与C5和C5转化酶形成复合体的补体抑制剂分子。这些复合体中的C5转化酶可以是经典或替代通路中的C5转化酶。
优选的，所述补体抑制剂分子来源于噬血节肢动物。术语“噬血节肢动物”包括以合适宿主的血为食的所有节肢动物，如昆虫、蜱、虱、蚤和螨、
补体是吸血蜱试图进食时最先遇到的免疫防御系统之一。如果进食的蜱不迅速控制补体激活，它们会被宿主的炎症应答破坏。肩板硬蜱(Ixodes scapularis)的抑制替代补体激活通路的18.5 kDa蛋白已经被克隆并表达(Valenzuela et al.，2000)。安德逊革蜱(Dermacentor andersoni)(Ribeiro，1987)和毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata)(Astigarraga et al.，1997)唾液腺提取物中的补体抑制活性已经被描述但还没有鉴定活性成分。以前未在蜱中鉴定出同时抑制替代和经典补体通路的分子。
当本发明补体抑制剂分子来源于噬血节肢动物时，优选来源于蜱。优选的，所述补体抑制剂分子来源于毛白钝缘蜱。
优选的，来源于毛白钝缘蜱的补体抑制剂分子是包含图4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸的蛋白质或其功能等价物。具体的，所述补体抑制剂分子是包含图4中氨基酸序列的第1到168位氨基酸的蛋白质或其功能等价物。
具有图4中给出氨基酸序列的蛋白质此处也称为“OmCI蛋白”，从毛白钝缘蜱的唾液腺中分离，并已经发现其抑制经典和替代补体通路。更具体的，已经发现它同时抑制经典和替代补体激活通路的C5转化酶切割C5，靶向C5激活步骤而不影响C3激活。OmCI蛋白抑制一定范围哺乳动物中的C5转化酶切割C5。图4中给出的OmCI蛋白序列的前18个氨基酸形成补体抑制活性不需要的信号序列。如此处所用，术语“OmCI蛋白”表示具有或不具有信号序列的图4中给出的序列。
术语“功能等价物”此处用于描述OmCI蛋白的保留抑制经典和替代补体通路能力的同源物和片段。优选的，功能等价物保留抑制经典和替代通路的C5转化酶切割C5的能力。功能等价物也包括OmCI蛋白的这些同源物和片段，它们保留通过抑制经典通路的C5转化酶切割C5而抑制经典通路的能力，或保留通过抑制替代通路的C5转化酶切割C5而抑制替代补体通路的能力。
术语“同源物”意思包括图4中明确表示的OmCI序列的同种异形物和同源异种物，例如包括，来自其它种蜱的OmCI蛋白序列，所述蜱包括具尾扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、血红扇头蜱(R.sanguineus)、囊状扇头蜱(R.bursa)、美洲花蜱(A.americanum)、卡延花蜱(A.cajennense)、希伯来花蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具环牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安德逊革蜱(D.andersoni)、边缘革蜱(D.marginatus)、变异革蜱(D.variabilis，Haemaphysalis inermis)、犬血蜱(Ha.Ieachii)、长棘血蜱(Ha.punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、Hy.dromedarii、边缘璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、肩板硬蜱(I.scapularis)、六角形硬蜱(I.hexagonus)、波斯锐缘蜱(Argas persicus)、鸽锐缘蜱(A.reflexus)、乖异钝缘蜱(Ornithodoroserraticus)、毛白钝缘蜱、O.m.porcinus和萨氏钝缘蜱(O.savignyi)。术语“同源物”意思也包括来自下列物种的OmCI蛋白序列：蚊物种，包括库蚊属、按蚊属和伊蚊属，具体是致倦库蚊、埃及伊蚊和冈比亚按蚊；蚤物种，如猫栉头蚤(猫蚤)；马蝇(horseflies)；白蛉；黑蝇；采采蝇；虱；螨；水蛭和扁形虫。
鉴定与图4给出的OmCI序列的同源物的方法对本领域技术人员是清楚的。例如，可以经同源性搜索公共和私人序列数据库而鉴定同源物。方便的，可以使用公众可用的数据库，但私人或商业可用的数据库可同等使用，尤其是如果它们含有公共数据库中未示出的数据。一级数据库是一级核苷酸或氨基酸序列数据存放位点，可以公开或商业提供。公众可用的一级数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、Protein Data Base(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)和二级数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.chlsoftware/PFSCAN form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商业提供的数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq(Incyte PharmaceuticalsInc.)。
通常认为两个肽之间大于30％的一致性(优选的，在指定区域)是功能等价的迹象，因此也是两种蛋白质同源的迹象。优选的，同源蛋白与图4中确定的OmCI蛋白序列具有大于60％的序列一致程度。更优选的同源蛋白与图4中给出的OmCI蛋白序列分别具有大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列一致程度。此处所指的百分比一致性用BLAST 2.1.3版用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62 matrix；gap openpenalty＝11和gap extension penalty＝1]确定。
图4中给出的OmCI蛋白序列的同源物包括由野生型序列中含氨基酸替换、插入或缺失的突变体，前提是所述野生型蛋白序列表现的对经典或替代补体通路的抑制作用被保留。优选的，所述突变体保留同时抑制经典和替代补体通路的能力。优选的，这些突变体保留抑制经典和替代补体通路的C5转化酶切割C5的能力。那些保留抑制经典或替代补体通路能力的突变体也包括在术语同源物内，只要它们保留抑制替代通路的C5转化酶或者经典通路的C5转化酶切割C5的能力即可。因此突变体包括含保守氨基酸替换的蛋白质，这种替换不以不利方式影响所述蛋白质的功能或活性。这个术语的意思也包括天然生物学变体(例如OmCI蛋白来源物种中的等位基因变体或地理变体)。也可以通过系统性或定向突变所述蛋白质序列的特定残基，设计与野生型蛋白序列相比对经典或替代通路具有更高抑制活性的突变体。优选的，这些突变体显示对经典通路的C5转化酶或者替代通路的C5转化酶切割C5更高的抑制作用。优选的，这些突变体显示对经典和替代通路的C5转化酶切割C5更高的抑制作用。
本发明也提供OmCI蛋白和OmCI蛋白同源物的片段。这些片段不仅包括图4明确给出的毛白钝缘蜱OmCI蛋白的片段，也包括上述的该蛋白同源物的片段。同源物的这些片段与图4中OmCI蛋白序列的片段通常具有大于60％一致性，尽管同源物的更优选的片段与图4中OmCI蛋白序列的片段分别显示大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列一致程度。包含图4中序列的OmCI蛋白片段及其同源物的片段优选抑制经典和替代补体通路，优选通过抑制经典和替代通路的C5转化酶切割C5而实现。抑制经典补体通路或替代补体通路的OmCI蛋白及其同源物的片段也包括在本发明中，只要它们保留抑制经典通路的C5转化酶或者替代通路的C5转化酶切割C5的能力即可。当然可以经野生型序列的系统性突变或片段化并随后经适当的活性测试而合理设计对经典或替代补体通路具有更高抑制活性、尤其是对C5转化酶切割C5具有更高抑制活性的片段。
术语“功能等价物”也指与OmCI蛋白结构相似的分子或含有相似或一致三级结构的分子，尤其是在OmCI的活性位点环境中含有相似或一致三级结构的分子。OmCI抑制C5转化酶切割C5被认为是通过直接结合到C5或C5转化酶或C5和C5转化酶的复合体而实现。在此处实施例中显示OmCI结合C5，支持以下建议，即通过直接结合单独的C5，或C5是与C5转化酶的复合体的部分时与之结合，OmCI抑制C5转化酶切割C5。尽管申请人不希望被此理论约束，但假定OmCI与C5结合可以防止C5转化酶进入C5切割位点。因此优选的OmCI功能等价物包括保留直接结合C5能力的分子，如同源物和片段。
OmCI也被认为是内部结合小配体的lipocalin蛋白家族的成员。因此OmCI也可以通过结合小配体而间接抑制C5切割和或MAC沉积，这些小配体正常情况下结合C5、C5转化酶或MAC并且是正常功能所必需的。尽管MAC的C8γ成分是可结合小配体的lipocalin，之前并没有描述过对补体系统功能重要的小配体。因此功能等价物包括那些分子，它们含有与结合C5或C5转化酶的OmCI蛋白的活性位点或结合小配体的OmCI的活性位点相似或一致的三级结构。具体而言，设计用于模拟OmCI蛋白三级结构或活性位点的合成分子被认为是功能等价物。
本发明还提供与C5形成复合体、与C5转化酶形成复合体或与C5和C5转化酶一起形成复合体的OmCI蛋白或其片段或其功能等价物。这些复合体中的C5转化酶可以是经典或替代通路的C5转化酶。
如前面更详细的讨论，仍然需要补体抑制剂，特别是同时抑制经典和替代补体激活通路的补体抑制剂。包括OmCI蛋白及其功能等价物的本发明补体抑制剂分子将有广泛的医学应用，用于治疗、预防和诊断疾病和病症，并用于补体抑制研究，用作经典和替代补体激活通路抑制研究中有用的研究工具。对于这些应用OmCI蛋白自身将特别有用，因为它抑制多种哺乳动物物种中的补体级联。
包括OmCI蛋白及其功能等价物的本发明的补体抑制剂分子可通过在宿主细胞中表达以重组形式制备。这些表达方法对本领域技术人员是熟知的并由Sambrook等人(2000)和Fernandez & Hoeffler(1998)详细描述。也可以用常规蛋白质化学技术制备本发明的蛋白质及片段。例如可通过化学合成制备蛋白质片段。
根据另一个实施方案，本发明提供与上述补体抑制剂分子结合的抗体。具体的，本发明提供与OmCI蛋白或其功能等价物结合的抗体。可以使用补体抑制剂分子如OmCI蛋白或其功能等价物作为免疫原，用标准方法(例如见Antibodies：A LaboratoryManual ed.By Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Press，1988)制备抗血清和单克隆抗体。如此处所用，术语“抗体”包括也与补体抑制剂分子特异性结合的抗体片段。术语“抗体”还包括对本发明补体抑制剂分子具有特异性的嵌合和人源化抗体。在某些情况下，为了辅助检测，希望将标记基团连接到抗体上。优选的，所述标记物是酶、放射性标记物或荧光标签。
上述补体抑制剂分子的衍生物也作为本发明的实施方案包括在内。具体的，本发明提供OmCI蛋白或其功能等价物的衍生物。这些衍生物包括含补体抑制剂分子的融合蛋白，所述补体抑制剂分子基因水平融合或化学融合到一个或更多肽或多肽上。附加肽或多肽的目的可以是帮助检测、表达、分离或纯化所述蛋白质或提供所述蛋白质期望的其他特性。潜在融合伴侣的实例包括β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、荧光素酶、多聚组氨酸标签、T7聚合酶片段和分泌信号肽。其它潜在的融合伴侣包括潜在的生物药物，如正被开发用作治疗特定疾病的蛋白质。
所述补体抑制剂分子也可以与标记结构域融合。优选的，标记结构域是荧光标签、允许通过亲和结合纯化的表位标签、允许组化或荧光标记的酶标签或放射性化学标签。在一个优选实施方案中，标记结构域是放射性化学标签。
用于产生融合蛋白的方法是本领域的标准方法，并且对技术读者已知。例如多数常用的分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学技术可以在Sambrook et al.(2000)或Ausubel et al.(1991)中查到。一般的，可以从两个核酸序列读码框内融合在一起的核酸分子最方便地重组产生融合蛋白。这些融合蛋白将由含有所讨论的融合蛋白的相应编码序列的核酸分子编码。
根据本发明的另一方面，提供含编码根据本发明上述方面的补体抑制剂分子的核苷酸序列的核酸分子。这些分子包括单或双链DNA、cDNA和RNA，以及合成核酸。优选的，所述核酸序列包含DNA。
优选的，所述核酸分子包含编码OmCI蛋白或其功能等价物的核苷酸序列。优选的，这样的核酸分子包含图4中核苷酸序列的第53到507位碱基。该核苷酸序列编码不带信号序列的OmCI蛋白。图4中核苷酸序列的前54个碱基编码补体抑制活性不需要的OmCI信号序列。本发明也提供包含图4中核酸序列的第1到507位碱基的核酸分子，它编码带信号序列的OmCI蛋白。如此处所用，词组“编码OmCI蛋白的核酸分子”包括编码带信号序列的OmCI蛋白的核酸分子和编码不带信号序列的OmCI蛋白的核酸分子。
本发明也包括包含本发明此方面的核酸分子的克隆载体和表达载体。这些表达载体可以带有适当的转录和翻译调控序列，例如增强子元件、启动子-操纵子区、终止序列、mRNA稳定性序列、起始和终止密码子或核糖体结合位点，它们与本发明的核酸分子在读码框内连接。
另外，可以方便的使重组蛋白从某些宿主中分泌。因此，这些载体的其他成分可以包括编码分泌、信号传递和加工序列的核酸序列。
根据本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，以及其它线状或环状DNA载体，如使用转座元件或同源重组技术的那些。很多这些载体和表达系统是已知的并在本领域有记录(Fernandez & Hoeffler，1998)。特别适合的病毒载体包括基于杆状病毒、腺病毒和痘苗病毒的载体。
用于重组表达的合适宿主包括常用的原核物种，如大肠杆菌或真核酵母，它们可以表达高水平重组蛋白并能容易的大量生长。优选的，宿主细胞是真核酵母细胞。体外生长的哺乳动物细胞系也是适合的，尤其是当使用基于病毒的表达系统时。另一个合适的表达系统是使用昆虫细胞作宿主的杆状病毒表达系统。表达系统也可以组成将DNA整合入基因组中的宿主细胞。蛋白质或蛋白质片段也可以体内表达，例如在昆虫幼虫或哺乳动物组织中表达。
可使用多种技术将根据本发明的载体导入原核或真核细胞。合适的转化或转染技术在文献中很好描述(Sambrook et al，1989；Ausubel et al，1991；Spector，Goldman &Leinwald，1998)。真核细胞中，根据系统需要，表达系统可以是瞬时的(例如附加体的)或永久的(染色体整合)。
本发明也提供反义核酸分子，它们在高严谨性杂交条件下与编码所述补体抑制剂分子的核酸分子杂交。具体的，本发明提供反义核酸分子，它们在高严谨性杂交条件下与编码OmCI蛋白的核酸分子杂交。高严谨性杂交条件此处定义为在含以下成分的溶液中42℃孵育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCI，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardts溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑精DNA，随后在0.1×SSC中在65℃下洗涤滤膜。
在一个优选实施方案中，可检测的标记物与这些反义核酸分子连接。优选的，所述标记物选自放射性同位素、荧光化合物和酶。
本发明也包括含上述的核酸分子、反义核酸分子或载体的转化或转染原核或真核宿主细胞。当这些宿主细胞是原核细胞时，它们优选是大肠杆菌细胞。优选的真核宿主细胞包括真核酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明也提供制备上述补体抑制剂分子的方法，包括在表达所述蛋白质的条件下培养含根据本发明的核酸分子的宿主细胞，并回收由此生产的蛋白质。优选的，宿主细胞是酵母细胞。
如上有关功能等价物的讨论，OmCI被认为是lipocalin蛋白家族的成员，并可以通过结合未鉴定的小配体发挥其部分作用。本发明的其它补体抑制剂分子及其功能等价物也可以通过结合小配体发挥其抑制补体激活通路的作用。希望鉴定这些天然存在的小配体，因为它们自身可以作为经典和/或替代补体激活通路的激动剂或拮抗剂。这些天然存在的配体自身可用于治疗与异常高或低补体通路激活相关的疾病，或可以是开发治疗这些疾病的合成配体的出发点。作为替代方案，天然存在的配体可以是开发与之结合的其它补体抑制剂分子的有用靶点。根据本发明的另一方面，提供鉴定前述补体抑制剂分子或其功能等价物的配体的方法，包括以下步骤：(a)使补体抑制剂分子或其功能等价物与候选配体接触；和(b)检测配体-补体抑制剂分子复合体的形成。
此方法中可使用任何候选配体。例如，候选配体可以分离自细胞、无细胞制备物、化学库或天然产物混合物。一旦鉴定了所述补体抑制剂分子的天然存在的配体，就期望可以设计模拟所述天然存在配体三级结构的小合成分子。这些合成分子结合所述补体抑制剂分子的能力也可以用本发明方法测试。
用于此方法的补体抑制剂分子可以游离在溶液中、固定于固相载体上、位于细胞表面或位于细胞内。例如，所述补体抑制剂分子可以固定于固相载体上，随后加入候选配体。作为替代方案，可以将一种或更多候选配体固定于固相载体上并使之与所述补体抑制剂分子接触。
通过直接或间接与候选配体连接的标记物或在涉及与标记的竞争物竞争的测试中，进行检测候选配体和补体抑制剂分子间复合体形成的步骤。在另一个实施方案中，可以使用竞争性筛选测试，其中能结合补体抑制剂分子的中和性抗体与候选配体的结合特异性竞争。这样，所述抗体可用于检测对所述多肽具有特异性结合亲和力的任何测试化合物的存在。
本发明方法可使用本领域已知的高通量筛选技术以同时筛选与补体抑制剂分子具有结合能力的多种候选配体。例如，WO84/03564公开了在固相基质上合成大量不同候选配体的方法，然后它们可以与本发明的补体抑制剂分子反应并洗涤。然后可以用本领域公知的方法检测补体抑制剂分子是否与候选配体结合。
本发明也提供用上述方法鉴定或可鉴定的补体抑制剂分子的配体。当补体抑制剂分子是OmCI蛋白或其功能等价物时，可以推测所述配体是结合C5或C5转化酶或MAC成分的小分子。
根据本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含根据本发明上述方面的补体抑制剂分子、含补体抑制剂分子的融合蛋白、含编码补体抑制剂分子的核酸序列的核酸分子或补体抑制剂分子的配体，以及药学上可接受的递体(carrier)。具体的，提供一种组合物，其包含OmCI蛋白或其功能等价物、含编码OmCI蛋白或其功能等价物的核酸序列的核酸分子或OmCI蛋白或其功能等价物的配体，以及药学上可接受的递体。
术语“药学上可接受的递体”，如此处所用，包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸和灭活病毒颗粒或任何其它成分，只要赋形剂自身不诱导毒性作用或引起产生对接受药物组合物的个体有害的抗体即可。药学上可接受的递体可另外含有液体如水、盐水、甘油、乙醇或辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。赋形剂可以使药物组合物配成片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、悬浆(slurries)、悬液以帮助患者摄入。药学上可接受的递体的全面讨论可见Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
所述组合物可用作疫苗组合物，并因此任选地包含免疫刺激剂，例如佐剂。根据本发明另一方面，提供配制疫苗组合物的方法，包括将根据本发明上述方面的补体抑制剂分子如OmCI蛋白或其功能等价物与药学上可接受的递体，任选地与佐剂，组合。合适的佐剂在本领域公知并且包括水包油乳液制剂、皂苷佐剂、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)和用作免疫刺激剂以增强组合物效力的其它物质。
根据另一方面，本发明提供用于治疗的上述补体抑制剂分子、含补体抑制剂分子的融合蛋白、含编码补体抑制剂分子的核苷酸序列的核酸分子或补体抑制剂分子的配体。
本发明也提供治疗患补体介导疾病或病症的动物或预防动物发生补体介导疾病或病症的方法，包括以治疗或预防有效的量向所述动物施用根据本发明上述方面的补体抑制剂分子、含补体抑制剂分子的融合蛋白、含编码补体抑制剂分子的核苷酸序列的核酸分子、补体抑制剂分子的配体或药物组合物。
优选的，所述动物是哺乳动物，更优选是人。
术语“治疗有效量”表示治疗或改善靶标疾病或病症所需要的化合物量。此处所用的术语“预防有效量”表示预防靶标疾病或病症所需要的化合物量。确切剂量一般取决于给药时患者的状态。确定剂量时可以考虑的因素包括患者疾病状态的严重程度、患者的健康状况、年龄、重量、性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应灵敏度和患者对治疗的耐受或应答。可用常规试验确定精确量，但最终由临床医生判断。一般的，有效剂量将在0.01mg/kg(药物质量/患者质量)到50mg/kg，优选0.05mg/kg到10mg/kg。组合物可以单独施用于患者或可以与其它物质、药物或激素组合施用。
本发明也提供根据本发明的补体抑制剂分子、含编码补体抑制剂分子的核苷酸序列的核酸分子或补体抑制剂分子的配体在制造治疗或预防补体介导的疾病或病症的药物方面的用途。
本发明的补体抑制剂分子，具体是OmCI蛋白及其功能等价物，在治疗补体参与作用的所有病理状况中具有潜在临床用途(Sahu and Lanbris，2000)。
根据本发明优选的补体抑制剂分子如OmCI蛋白及其功能等价物，通过抑制经典和替代通路的C5转化酶切割C5而抑制经典和替代补体通路。对两种C5转化酶切割C5的特异性抑制作用阻断所有三种导致产生C5a和MAC的补体激活通路，但保留依赖于C3b的补体的免疫清除和调理功能。这样的情形(profile)可用于治疗性干预某些疾病，如阿尔茨海默病、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎和迟发型超敏疾病(Kohl，2001)。
例如，在与显著的脑部炎症相关(这可能部分由补体介导)的阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中，抑制C3增加β-淀粉样斑块沉积(Wyss-Coray et al.，2002)。因此，抑制C5而非C3可能对AD治疗有益。
对C5转化酶作用的研究显示抑制C5转化酶切割C5的本发明补体抑制剂分子，如OmCI蛋白及其功能等价物，也将可用于治疗其它各种疾病和病症。因为没有报道过C5转化酶的天然抑制剂，至今研究人员靶向此步骤是通过开发抑制性抗C5抗体、抑制性RNA适配子和靶向C5a受体的合成肽(综述见Sahu and Lambris，2000)。用抗C5 mAb BB5.1的早期研究(Frie et al.，1987)已经明确确定了C5a和MAC在多种疾病模型中的病理作用，这些模型包括免疫复合体肾炎(Wang et al.，1996)、胶原诱导的关节炎(Wang et al.，1995)、心肌缺血和再灌注(Vakeva et al.，1998)和心肺分流术患者(Rollins et al.，1998)。抗C5 mAb(18A10)已经显示可以改善大鼠神经移植物的存活(Ciccheti et al.，2002)。
通过抑制两种通路的C5转化酶切割C5而抑制经典和替代补体通路的本发明补体抑制剂分子，如OmCI蛋白及其功能等价物，因此将可用于治疗三种关键领域的这些疾病和病症：(1)控制自身免疫病如类风湿性关节炎；(2)降低手术后补体造成的组织破坏；和(3)抑制组织排斥，尤其是在转基因器官移植领域中。
自身免疫病如类风湿性关节炎和肾小球性肾炎的病理有很多诱因。由于存在自身抗体而导致在滑液和肾小球内形成IgG和IgA抗体-抗原免疫复合体(Daha，1993)从而引起不适当的补体激活和组织破坏，经典补体激活通路在两种疾病中都有作用。过表达可溶性Crry(CR1小鼠同源物)保护转基因小鼠免于发生抗体诱导的急性肾衰(Schiller et al.，2001)。由于IgM类风湿因子的存在，它可以阻碍补体介导的免疫沉淀抑制(Jarvis et al.，1993)，并且使滑膜细胞免受MAC介导的细胞作用和裂解的保护作用降低(Kontinnen，1996)，致使类风湿性关节炎免疫复合体复杂化。通过替代补体通路起作用的C5在K/BxN小鼠类风湿性关节炎模型中似乎具有关键作用(Solomonet al.，2002)。本发明的补体抑制剂，如OmCI蛋白及其功能等价物，将可用于治疗这些自身免疫病。
补体激活引起心肌功能降低和冠状动脉再灌注压力与淋巴液流速增加。很多这些变化可由MAC介导(Homeister，1992)。由重组DNA技术生产的可溶性CR1蛋白可有效抑制短时心肌缺血再灌注损伤大鼠模型中的补体激活及随后的炎症活性(Weisman et al.，1990)。Crry降低小鼠肠的缺血再灌注损伤(Rehrig el al.，2001)。对于人，单链人源化抗体h5G1.1-ScFV对C5的抑制显著减弱了心肺分流术患者的术后心肌损伤、认知缺陷和血液损失(Fitch et al.，1999)。因此抑制经典和替代通路的C5转化酶活性的本发明补体抑制剂分子将可用于预防和治疗术后心肌损伤，如再灌注损伤。
对于可用于超急性同种和异种移植器官(心和肝)排斥的经典和替代补体抑制剂有很多关注(Diamond et al.，1995；Thomas et al.，1996；Pratt et al.，1996；Tanaka et al.，1996；Fiorante et al.，2001；Bao et al.，2002)。人和猪间异种移植的主要免疫学屏障是由预先形成的天然抗体和补体介导即通过经典通路激活的快速排斥过程。异种器官移植对补体介导的损伤尤其敏感，因为正常情况下保护细胞免受损伤的补体调节蛋白在异源补体调节中的功能很差。本发明的补体抑制剂分子因此将可用于预防移植排斥。OmCI蛋白及其功能等价物将在预防移植排斥方面特别有用，因为OmCI蛋白抑制宽范围哺乳动物物种(目前验证了啮齿类和灵长类)的C5转化酶。
过敏毒素C5a在C5转化酶转化C5的过程中产生，已经发现它参与脓毒症、免疫复合体疾病和迟发型超敏反应。OmCI蛋白及其功能等价物，以及抑制C5转化酶的本发明其它补体抑制剂蛋白将可用于治疗这些疾病。已经证明通过防止C5a形成和终止MAC沉积(引起移植动物模型中组织因子和P-选择素表达上调)(Fecke et al.，2002)，OmCI蛋白及其功能等价物可用作异种移植期间的辅助治疗。
其它可能的特定用途包括：(1)防止血小板浓缩物保存期间补体激活血小板(Miletic and Popovic，1993)，(2)输血期间生物材料表面的补体激活，(3)生育能力治疗(Bedford and Witkin，1983)和(4)基因治疗期间保护基因治疗逆转录病毒载体免受天然抗体和补体的裂解(Rollins et al.，1996)。
噬血节肢动物如蜱是及其有效的疾病传播者。常规上，控制蜱种群的技术已经用化学品如杀螨剂(acaracides)治疗动物。这种策略导致产生抗性蜱，意味着必须引入新种类的化学品。另外，所述化学品很少有剩余效应，意味着它们必须频繁使用。第二种方法是培育抗蜱动物，但达到的抗性程度远不理想。
在与寄生虫传播疾病作斗争的工作中，已经有很多尝试用蜱内脏或全蜱提取物免疫动物以抗蜱。某些报道使用重组蜱蛋白(例如见国际专利申请WO88/03929)。然而，尽管有这些发展，唯一商业可用的蜱疫苗仅有抗微小牛蜱成年阶段的活性，其疗效根据该物种的地理位置而显示有变化。
根据本发明的另一方面，提供免疫接种动物抵抗噬血节肢动物传播的疾病或病症的方法，包括向所述动物施用根据本发明上述方面的补体抑制剂分子、含补体抑制剂分子的融合蛋白、编码补体抑制剂分子的核酸分子或组合物。
免疫接种的合适候选者包括人和家养动物，如牛、山羊、绵羊、狗、猫和需要对抗噬血节肢动物尤其是蜱及它们传播的感染的其它动物。所述疫苗可以单独施用，或与其它免疫原组合施用。本发明这方面的方法可用于免疫接种所述动物抵抗由噬血节肢动物传播的任何疾病或病症。优选的，所述噬血节肢动物是蜱，优选毛白钝缘蜱。由钝缘蜱属的蜱传播的疾病和病症包括人的回归热(Borreliosis)和西尼罗病毒(WestNile virus)和猪的非洲猪热病毒(African swine fever virus)。
本发明还提供根据本发明上述方面的补体抑制剂分子用作诊断工具的用途。鉴定本发明的补体抑制剂分子可以使研究人员研究同时抑制经典和替代补体通路的作用。具体而言，鉴定OmCI蛋白将使研究人员可研究通过抑制C5转化酶而同时抑制经典和替代补体通路的作用。
本发明也提供在细胞、组织或非人生物体中抑制经典和替代补体通路的方法，包括向所述细胞、组织或生物体施用根据本发明上述方面的补体抑制剂分子、含补体抑制剂分子的融合蛋白或编码所述补体抑制剂分子的核酸分子。具体而言，本发明提供在细胞、组织或非人生物体中抑制C5转化酶活性的方法，包括向所述细胞、组织或生物体施用OmCI蛋白或其功能等价物、含OmCI蛋白或其功能等价物的融合蛋白、或编码OmCI蛋白或其功能等价物的核酸分子。这种方法将使研究人员可以阐明C5在多种疾病和病症中的作用。例如已经建议C5可能在预防哮喘中起积极作用(Kohl，2000)。本发明的C5转化酶抑制剂可被用于确认是否真是如此。
将通过实施例的方式更详细描述本发明的各个方面和实施方案。应该认识到可以在不偏离本发明范围的情况下修改细节。
附图说明
图1：经典和替代补体激活通路的示意图。酶活性成分，暗灰。过敏毒素用放射状星圈起来。
图2：纯化毛白钝缘蜱补体抑制剂(OmCI)。a.阳离子交换色谱。含抑制剂的峰用箭头表示。b.经典溶血测试。样品1(黑色条)，100％溶解；样品2，0％溶解；样品3，(网线条)仅血清；样品4，血清加1μl SGE；样品5-23(灰色条)血清加10μl图a中显示的组分10-28。三次重复的平均值。
图3：通过a.变性SDS-PAGE，b.等电聚焦(IEF)和c.高压液相色谱(HPLC)分析纯化的OmCI。图a和b中的组分f15和f17相同。回收组分f15并经HPLC分析，图c。分子量标记物和等电点(pI)标记物表示在图a和b左侧。
图4：OmCI的一级序列。信号序列用下划线表示。半胱氨酸残基以黑体表示。核苷酸和氨基酸编号表示在右侧。
图5：Clustal X序列比对分析OmCI与蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)和moubatin。相同残基用灰色(半胱氨酸用黑色)突出表示并用星号标记。
图6：基因组中插入有OmCI的酵母克隆(13.1-13.5)和基因组中仅插入有载体的克隆(对照)的a.上清液和b.细胞沉淀物中的抑制活性。
图7：表达rOmCI的酵母细胞的表达(a)和去糖基化(b)。a.来自Superdex-75凝胶过滤柱的组分9-13的SDS-PAGE。b.PNGaseF处理对高度糖基化rOmCI(图a中组分9-11)迁移率的影响。箭头表示PNGaseF(向上箭头)和天然OmCI(向下箭头)。EV504与OmCI远相关并已知被糖基化。分子量标记物(kDa)表示在图左侧。
图8：不同浓度的天然OmCI对经典(CH50)和替代(AH50)补体激活通路所致溶解的抑制。4次重复的平均值。
图9：OmCI对C8和C9加入部分形成的膜攻击复合体(MAC)的影响。示出由于100％和0％溶解和缺少(PBS)和存在(SGE)抑制剂的吸光度。6次重复的平均值。
图10：表示缺少OmCI对经典通路从C3α切割C3a影响的时间过程，经以下分析：a.变性SDS-PAGE和b.用C3a抗血清的免疫印迹。a.自反应开始算起的分钟数(min)。用(OmCI)或不用(PBS)抑制剂、或存在10mM EDTA下进行反应。示出了牛血清白蛋白(BSA)和血红蛋白(HAE)的位置。分子量标记物(kDa)表示在图b左侧。图a中表示出C3a和C3α。
图11：OmCI对经典、替代和眼镜蛇毒液因子(CVF)C5转化酶从C5α切割C5a的影响，经ELISA分析。用水100％裂解绵羊红细胞、仅在GVB2+中0％裂解、和(OmCI)或不和(PBS)抑制剂反应后测量pg/μl C5a释放。4次重复的平均值。
图12：向去除C3和C5的血清中加入纯C3和C5在存在(+)和缺少(-)OmCI时对绵羊红细胞经典通路溶解的影响，所述OmCI是过量倍数的对数为1(1 log foldexcess)时完全抑制溶解的最少量OmCI。4次重复的平均值。
图13：煮沸对CH50测试中OmCI抑制活性的影响。
图14：pH处理对CH50测试中OmCI抑制活性的影响。
图15：检测与nOmCI结合的C5。转移到硝酸纤维素膜上的nOmCI和RaHBP2(对照)用I125标记的C3或C5检测然后放射自显影。蛋白质分子量标记物(kDa)在图左侧表示。
图16：通过凝胶过滤色谱检测与C5结合的nOmCI。放射性标记的nOmCI a.加或不加纯化的C3和C5(纯C3/C5)和b.加或不加NHS，和去除C3或C5的血清(ΔC3/C5)。蛋白质分子量标记物(kDa)用箭头表示。
实施例
材料和方法
材料
绵羊和兔红细胞来自Tissue Culture Services.，溶血素、收集的正常人血清(NHS)和去除后血清都来自Sigma。豚鼠血清来自饲养动物。纯C3、C4、C5、C8和C9、和因子B和D购买自Calbiochem。抗人C3a兔多克隆抗血清来自Calbiochem，眼镜蛇毒液因子(CVF)来自Quidel。C5a ELISA检测试剂盒购买自Immuno-BiologicalLaboratories(IBL)。
蜱
毛白钝缘蜱根据Jones et al.，(1988)饲养。
唾液腺样品制备和纯化
在显微镜下解剖唾液腺，在冷PBS缓冲液(0.01 M磷酸盐缓冲液和0.15 M NaCl，pH7.2)中简单漂洗，然后转移到放置于干冰中的Eppendorf管中并在-20℃冷冻保存。需要时，解冻30对唾液腺并用1ml Dounce匀浆器中在500μl PBS中破碎。匀浆液在台式离心机中15k RPM离心并收集上清液(称为唾液腺提取物，SGE)，保存于-70℃，或用于测试补体抑制活性和用于分离活性成分。
经典补体通路溶血测试(CH50)
5 ml在Alsever’s溶液中的新鲜绵羊血液(1∶1 v/v)用50ml Gelatin veronalbarbital-EDTA(GVB-EDTA)洗涤一次，并用50ml GVB2+(加Mg2+和Ca2+的GVB缓冲液)洗涤三次。血液稀释到浓度1×109细胞/ml。用兔溶血素敏化红细胞，如文献描述测定效价(Coligan，1994)。用100μl 1∶40稀释于GVB2+中的NHS或豚鼠血清作为补体来源和100μl 2×108敏化红细胞(EA)在总体积200μl中根据标准方法进行测试(Giclas，1994)。最后加入SGE、天然或重组OmCI(nOmCI或rOmCI)或PBS(1-5μl)，将反应物在37℃孵育。在时程结束时(直到32分钟)12000×g离心5秒将完整细胞离心下来并在412nm经分光光度测量溶血(Coligan，1994)。所有测试至少重复3次。替代补体通路溶血测试(AH50)
5ml在Alsever’s溶液中的新鲜兔血液(1∶1 v/v)用50ml GVB/Mg(10mM)EGTA缓冲液洗涤三次，洗涤之间1500×g离心10分钟。兔血液稀释到浓度2×108细胞/ml。将NHS稀释于GVB/Mg EGTA中。用50μl准备好的血液补充到150μl进行测试。最后加入1-5μl SGE、PBS、天然OmCI或重组OmCI，并将反应物在37℃孵育。在时程结束时(直到60分钟)12000×g离心5秒将完整细胞离心下来并在412nm经分光光度测量溶血(Coligan，1994)。所有测试至少重复3次。用去除特异性补体成分的血清进行溶血测试
根据制造商说明使用去除后的人血清，但每个反应的总体积减少到200μl。产生90％溶解的纯补体成分的体积和稀释度根据经验确定。反应物在37℃孵育30分钟。所有测试至少重复3次。
从SGE中纯化毛白钝缘蜱补体抑制剂(OmCI)
150μl SGE稀释于5ml 25mM磷酸钠缓冲液pH6.8，50mM NaCl中并以1ml/min流速加载到1ml Q-Sepharose HP阳离子交换柱(Pharmacia)上。用10个柱体积工作缓冲液洗涤之后，在0.5ml/min流速和280nm监测下用40分钟0.05-0.75M NaCl梯度洗脱结合蛋白。收集1ml组分，取10μl在200μl总体积CH50测试中测试补体抑制活性。用Centricon 3过滤装置(Amicon)浓缩代表性的活性和无活性组分到50μl，加入2ml PBS，再将组分浓缩到50μl，每种取1.5μl跑4-12％Tris-Tricine变性SDS凝胶(Invitrogen)。5μl/泳道的活性和无活性组分跑pH3-7 IEF凝胶(Invitrogen)并用0.7％乙酸电印迹到ImmobilonTM-P(Millipore)。用Ponceau-S染膜并切下主要带，并经振荡1分钟和15Krpm离心10分钟重复三次将其洗脱到200μl 50 mM Tris pH8，2％Triton-X100中。用上述条件在Q-Sepharose HP柱上再纯化所述蛋白质以除去Triton-X100。经Centricon 3浓缩和缓冲液交换成PBS后，测试样品的补体抑制活性并在4-12％凝胶上检测或经HPLC分离和蛋白质序列分析。
检测溶血测试中C3a产生
用1∶80最终稀释度的NHS或豚鼠血清在总体积200μl中进行CH50/AH50测试，加或不加天然OmCI。在指定时间点从水浴中取出放置于37℃的反应物，然后12000g离心10秒并取出上清液进行随后的免疫印迹分析。每种回收上清样品取10μl用MES跑胶缓冲液(Invitrogen)在4-12％Bis-Tris凝胶上电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。通过丽春红染色的血清白蛋白带强度判断并确认所有泳道等量上样并均匀转移。用抗人C3a兔单特异性抗血清(Calbiochem)经免疫印迹检测C3a从C3的切割。用磷酸盐缓冲液0.1％Tween20、5％脱脂干奶粉(PBSTM)过夜封闭硝酸纤维素膜。除非特别指明，该缓冲液用于所有以后的稀释和洗涤步骤。1∶500稀释抗C3a抗血清并与膜孵育2小时。然后洗膜两次20分钟，加入1∶3000稀释于PBSTM中的抗兔碱性磷酸酶偶联物(Sigma)。再孵育2小时后洗涤膜两次5分钟，简单用水漂洗，加入10ml BCIP/NBT紫色液体碱性磷酸酶底物(Sigma)。
检测溶血测试中C5a产生
如检测C3a所述进行溶血测试。用C5a ELISA试剂盒(IBL)检测C5a从C5的切割。为防止与未切割C5的交叉反应，溶血测试上清液中存在的C5用试剂盒制造商提供的试剂沉淀。试剂盒测量范围从0.1到10μg/L。检测低限是0.02μg/L。用眼镜蛇毒液因子(CVF)去除血清中补体
0.25μg CVF(0.25μg/μl贮液)和1μl天然OmCI或者1μl PBS加入到5μl人血清中并在37℃孵育1小时。取一半CVF处理的血清加入97.5μl GVB2+和100μl EA中。37℃孵育20分钟后检测反应上清液中的溶血百分比和C5a浓度(见上文)。
活性成分HPLC、蛋白质序列分析和胰酶消化
从IEF分离的蛋白中洗脱的20μl活性成分上Jupiter C4柱/150×1.0mm，运行条件为10-40％含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)梯度，流速1ml/min并每分钟增加0.5％乙腈，并在215nm下监测。将c.53min处四个接近的峰转移到Immobilon-P膜上并用Applied Biosystems Mini-Blott装置测序。每个蛋白质进行25个循环。
为对胰酶消化产物进行序列分析，53min主峰(包含第一次HPLC分离中的所有4个峰)用SpeedVac干燥并重溶于6M胍0.5M Tris pH8.0中，然后用4-乙烯基吡啶还原并烷基化。然后重新跑相同的Jupiter C4柱。注意到保留时间没有改变。在SpeedVac中干燥主峰并重溶于0.1M碳酸氢铵pH8.1中。加入10μl Pierce固定化胰酶，然后在37℃孵育混合物5小时并间或混合。在10Krpm离心混合物并将上清液加到173a微印迹HPLC(Aquapore C18柱/100×0.5mm)上。从膜上切下感兴趣峰并测序。每个蛋白质进行15个循环。
构建毛白钝缘蜱cDNA文库
如上所述切除并收集第三或第四次喂食(feed)后若虫的60对毛白钝缘蜱唾液腺，放置于1ml RNAlaterTM(Ambion)(代替PBS)中并保存于-20℃。用FastTrackTM 2.0mRNA提取试剂盒(Invitrogen)提取mRNA，并用Stratagene cDNA合成试剂盒(Cat#200401-5)合成cDNA。在sepharose CL-2B柱上分成大cDNA组分和小cDNA组分后，每个组分的乙醇沉淀cDNA重悬于3.5μl ddH2O中。大分子和小分子的cDNA产量分别为约3.0 ng/μl和5ng/μl。所有剩余大cDNA和小cDNA连接到StratageneUniZAP XR噬菌体载体(Cat.#237211)中，并用GigapackIII Gold包装提取物进行包装。大cDNA文库中有11500个原代噬斑，而小cDNA文库中有480500个原代噬斑。扩增后，大文库和小文库的滴度分别是1.5×108pfu/ml和4×109pfu/ml。
从每个文库挑取20个噬斑到0.5ml SM缓冲液(0.1M NaCl，8mM MgSO4，50mMTRIS.HCl pH 7.5，0.01％明胶)1％氯仿中并经振荡从琼脂糖块上洗脱。噬菌体插入片段大小用T7(T7 5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG 3′)和T3(5′AAT TAA CCC TCA CTAAAG 3′)引物进行PCT检测。每100μl反应物中包含2μl洗脱噬菌体、2μl10mMdNTPs、2μl每种引物(来自0.5μg/ml贮液)、10μl10×REDTaq(Sigma)PCR反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3，500mM KCl，11mM MgCl2，0.1％明胶)、3μl REDTaq(Sigma)DNA聚合酶(1U/μl溶于20mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20，0.5％Igepal CA-630，惰性染料，50％甘油)和79μl ddH2O。热循环(Hybaid Touchdown热循环仪)参数是1×94℃ 4min，30×94℃ 1min，48.5℃45s，72℃ 90s，和1×72℃5min。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示大文库插入片段≥1000碱基对，而小文库插入片段≤1000碱基对。
克隆编码补体抑制剂的cDNA
使用对HPLC 53min时洗脱的两个主峰测定的N端序列设计简并引物(OF4)，和T7引物(结合到UniZAP XR载体上)一起使用，以扩增编码所述补体抑制剂的eDNA。OF4序列是5′GTAC WSN GGN WSN GAR CCN GT 3′(其中N＝A或C或G或T；R＝G或A；S＝G或C；W＝A或T)。100μl反应体系中包含3μl大或小eDNA文库、3μl 10mM dNTPs、2μl T7和4μl OF4(来自0.5μg/ml贮液)、10μl 10×REDTaq PCR反应缓冲液、3μl REDTaq DNA聚合酶和75μl ddH2O。热循环参数是1×94℃4min，30×94℃ 1min，48.5℃45s，72℃90s，和1×72℃5min。
琼脂糖凝胶电泳显示一定范围的PCR产物。用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化来源于OF4引物的两种产物，并用ABI PRISMTM染料终止循环测序反应试剂盒(ABI PRISMTM dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)和ABI测序仪(Perkin Elmer)进行测序。
用OF4和T7引物从小cDNA文库得到的最大(约500bp)和最强PCR产物的超初步(conceptual)翻译显示：与毛白钝缘蜱血小板凝集抑制剂moubatin(Waxmanand Connolly，1993)具有显著的BlastX(Altschul et al.，1997)匹配。所述序列延伸过编码所述肽的cDNA的终止密码子。匹配所述终止密码子以外区域的反向引物(OR15′GGGAGG CTTTCT GTATCC 3′)与T3引物(结合到UniZAP XR载体上)一起使用，以获得所述cDNA的5’端。将650bp PCR产物克隆到pGEM
-T Easy载体(Promega)中，然后用另外的引物OR3 5′CGT CCA ATC GGT TGA AG 3′和OF6 5′GAC TCG CAAAGT CAT CAC 3′测序。
序列分析
用GCG程序套件(Wisconsin Package Version 10.1，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)和Swiss Institute of Bioinformatics(http://expasy.hcuge.ch/)的ExPASy(Expert Protein Analysis System)蛋白质组学服务器进行分析。用BlastX程序(Altschul et al.，1997)将序列与GenBank非冗余(NR)蛋白质数据库比较，并对Pfam(Bateman et al.，2000)和SMART(Schultz et al.，2000)蛋白质结构域进行检索。用Clustal X(Jeanmougin et al.，1998)进行多序列比对。
酵母表达和OmCI的纯化
用正向引物OM1Y(5′-ATAGAGCTCAAAATGCTGGTTTTGGTGACC-3′)和反向引物OR7a(5′ACTGAGCGGCCGCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACCGCAGTCCTTGAGATGGGG 3′用于带His标签的产物)或OR6(5′ACTGAGCGGCCGCCTAGCAGTCCTTGAGATGGGG 3′用于不带His标签的产物)，经聚合酶链式反应(PCR；95℃ 30″，50℃ 30″，72℃ 30″；18个循环)扩增OmCI编码区。引物中有内建的限制位点，如SacI位点被加到起始密码子上游，NotI位点被加到终止密码子下游。将产物连接到pMETα C转移载体(Invitrogen)的SacI和NotI位点之间。根据供应商(Invitrogen)说明，将质粒——在XL1-Blue细胞(Stratagene)中扩增——转化入甲醇毕赤酵母株pMAD16和pMAD11。阳性克隆在BufferedDextrose-complex Medium BMDY中生长，并在Buffered Methanol-complex Medium中诱导蛋白质表达。连续5天每24小时通过CH50溶血测试检测6个阳性克隆的上清液和细胞中的蛋白质表达。
96小时孵育后，500ml酵母细胞培养基在6370g离心15分钟，加入30％(w/v)PEG-8000并在冰上搅拌1小时，从上清液中沉淀抑制剂。23700g离心1小时后，蛋白质沉淀重悬于50ml 25mM磷酸钠缓冲液pH6.8，50mM NaCl中，然后6000rpm离心去除不溶性物质。澄清溶液加到1ml Q-Sepharose HP阳离子交换柱上并如上所述确定补体抑制活性组分。合并活性组分并用Centricon 3过滤装置(Amicon)交换到300μlPBS中，18900g离心10分钟，然后在0.5ml/min下用20mM Tris pH7.6，200mM NaCl作工作缓冲液加载到SuperdexTM 75柱(Phamacia)上。在280nm监测并收集0.5ml组分共30分钟。每个组分取5μl测试抑制活性，活性组分交换到PBS中，然后通过变性SDS-PAGE观察。
根据制造商说明(New England Biolabs)用肽N-糖苷酶(PNGaseF)处理纯化的rOmCI。去糖基化的rOmCI如上述通过凝胶过滤再次纯化。经CH50鉴定5个抑制性组分，每个取15μl在变性和非变性条件下跑SDS-PAGE。
天然OmCI的热稳定性和pH稳定性
在总体积100μl中，对于1∶40稀释的豚鼠血清，抑制经典通路介导的细胞溶解约90％的天然OmCI最小量确定为25ng。为检测热稳定性，将1μl天然OmCI(250ng)稀释到9μl PBS中。样品煮沸0、3、9或27分钟，迅速在冰上冷却，并取1μl(25ng)加到100/μl CH50测试(1∶40豚鼠血清稀释物)中。为检测pH稳定性，将1μl天然OmCI(250ng)稀释到9μl 10mM乙酸钠(pH4.5和5.5)、10mM Tris.Cl(pH7和8.2)或10mM CAPS(pH10和11)缓冲液中。37℃孵育30分钟后，将1μl(25ng)加到100μl CH50测试(1∶40豚鼠血清稀释物)中。对照包括存在和缺乏1∶40血清稀释物的仅1μl每种缓冲液。所有测试作三次重复。
检测与OmCI结合的C5的方法
0.5μg天然OmCI和5μg RaHBP2进行非变性SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上，并在PBS，0.05％Tween 20，5％脱脂干奶粉(PBSTM)中封闭过夜。用Iodogen根据制造商说明(Pierce)将I125标记到C3和C5上。印迹膜与2μg I125标记的C3(1440kcpm/min)和2μg I125标记的C5(2160kcpm/min)在15ml PBSTM中室温孵育4小时。室温下3×20min在PBSTM中洗涤后，干燥硝酸纤维素膜并放射自显影。
为进行凝胶过滤层析，0.07μg I125标记的OmCI(1687kcpm/min)与2μg纯C3或C5、或23.8μl NHS或去除C3或C5的血清一起孵育。加PBS到总体积100μl，混合物孵育10分钟，随后以1ml/min PBS的流速过Superose12 10/30柱进行层析。收集1ml组分并在固定距离用手持盖革计数器测量cpm。
结果
从毛白钝缘蜱SGE中纯化和鉴定活性成分
阳离子交换层析后，活性组分以0.25M NaCl(图2a和b，箭头)洗脱。将活性组分对照组分(图3a)从IEF凝胶电印迹到PVDF膜上，然后用Ponceau-S染膜。切下、洗脱、用阳离子交换层析再纯化主带，并测试其补体抑制活性。变性SDS-PAGE显示抑制活性与质量约19kDa的蛋白质三带相关(图3a)。IEF显示抑制活性与pI约4.2的单个主带相关(图3b，组分17的上带)。PVDF洗脱组分的HPLC显示4个临近的峰(图3c)。使用从最大峰获得的17氨基酸N-端序列(DSESDXSGSEPVDAFQA)设计简并引物，以从毛白钝缘蜱文库中产生与所述N-端序列匹配的PCR产物。
编码OmCI的cDNA的一级结构
全长克隆的序列显示OmCI是168个氨基酸长(图4)。所述蛋白质具有含前18个残基的N-端分泌信号。N-端序列分析表明信号肽切割位点在Ala18和Asp19之间。成熟蛋白的预测分子量是16.77kDa，等电点是4.3。有两个预测的N-糖基化位点(Asn78和Asn102)和12个潜在的磷酸化位点(Ser 20，22，25，84，113，115，156，Thr90，Tyr17，43，111，130，162)。然而，这些位点具有高发生概率(蛋白激酶C、酪蛋白激酶II和酪氨酸激酶位点)，位点预测并不一定是真实修饰。
OmCI一级序列显示与软蜱Ornithodorus savignyi的蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)(Mans et al.，2001)具有58％一致性，与毛白钝缘蜱的moubatin(Waxman andConnolly，1993)有49％一致性。所有半胱氨酸残基以及相应假定的二硫桥模式在这四种蛋白质中是保守的(图5)。序列比对显示OmCI有两个显著的短氨基酸插入：氨基端的SESD和沿成熟肽序列方向约2/3处的PD(图5)。一级序列与公共数据库中的包括I.Scapularis抗补体蛋白(Valenzuela et al.，2000)在内的任何其它序列没有显著匹配。Moubatin、TSGP2和3认为是形成β桶蛋白的lipocalin家族成员，所述lipocalin家族包括蜱特异性蛋白的组胺结合蛋白家族(Paesen et al.，2000)。
表达和纯化重组(γ)OmCI
测试的6个阳性酵母克隆表现不同水平的OmCI表达(图6a和b)。在检测到表达的所有情况下，直到第5天的最后测试点抑制活性连续增加。约90％表达蛋白在上清液中(图6b)。克隆13.1显示最高表达水平并用于以后的表达研究。PEG沉淀和两步层析步骤后，部分纯化的活性rOmCI以高度糖基化形式(图7a，组分9、10和11)和非糖基化形式(图7a，组分12和13)存在。经PNGaseF处理后糖基化形式显示对应非糖基化形式。糖基化和非糖基化或去糖基化的rOmCI和天然OmCI在CH50测试中同样有活性(数据未给出)。rOmCI的最终产率是约0.3μg/ml培养基。
OmCI作用机制
OmCI抑制两种补体通路。然而经典通路可被完全抑制，而甚至过量的OmCI抑制替代通路的红细胞溶解不超过80％(图8)。
OmCI不阻止C8和C9分别引入到预先形成的C5b-7或C5b-8(图9)。它也不影响经典或替代通路中C3α切割产生C3a的速率(图10)。OmCI阻止两种通路从C5产生C5a(图11)。在经典溶血测试中过量的纯C5而非C3与OmCI抑制剂竞争(图12)。OmCI不阻止CVF去除血清补体的作用(数据未给出)。它也不阻止由CVF C3/C5转化酶(CVFBb)产生C5a(图11)。
天然OmCI的热稳定性和pH稳定性
煮沸OmCI直到9分钟对该蛋白质的抑制活性没有显著影响，尽管到27分钟时抑制活性降低(图13)。直至pH11天然OmCI不受暴露于碱性缓冲液的影响(图14)。暴露于pH4.5的缓冲液显著降低OmCI的抑制活性(图14)。银染胶显示这不是简单的由于OmCI在该pH沉淀(数据未给出)。
检测与OmCI结合的C5
用I125标记的C3和C5进行Western印迹表明OmCI直接结合C5，而不结合相关的蛋白C3(图15)。
OmCI和C5之间直接相互作用的另外证据由凝胶过滤层析获得。在存在纯化C5而非C3的条件下观察到I125标记的nOmCI组分的表观质量迁移(mass shift)(图16a)。在存在NHS和去除C3的血清中明显观察到相似的质量迁移，但在去除C5的血清中未观察到(图16b)。在1M NaCl中维持质量迁移，但2M NaCl则不行，表明抑制剂和C5之间的强静电相互作用(数据未给出)。
讨论
与其它蛋白质和已知补体抑制剂的关系
OmCI与与软蜱即萨氏钝缘蜱的蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)(Mans et al.，2001)和血小板凝集抑制剂moubatin(Waxman and Connolly，1993)最紧密相关。没有给出或提示这三种蛋白质的任何一个(图5)抑制补体。OmCI中存在而紧密相关蛋白中不存在的两个小氨基酸插入(图5)是将来诱变研究确定OmCI补体结合位点的明显受关注位点。
TSGP2和3具有95％氨基酸一致性，并已被提出参与蜱唾液腺的颗粒生物发生(Mans et al.，2001)。TSGP2对小鼠有毒；而TSGP3无毒(Mans et al.，2002)。OmCI极不可能是毒素，因为毛白钝缘蜱是无毒的(Astigarraga et al.，1997)，而萨氏钝缘蜱在各种哺乳动物中引起sand tampan毒性(Mans et al.，2002)。另外，用100μg纯化的天然OmCI接种豚鼠，在产生抗血清的过程中，不引起明显病理生理效应(个人观察)。
OmCI可能是Lipocalin蛋白家族的成员，所述Lipocalin包括蜱特异性蛋白中的组胺结合蛋白家族(Paesen et al.，2000)。Lipocalin主要在其β桶结构中结合小的、疏水性细胞外配体。但是，具尾扇头蜱的组胺结合蛋白和正常lipocalin相比具有明显结构差异，使之结合亲水性分子(Paesen et al.，1999；Paesen et al.，2000)。尚不清楚OmCI是否可以结合小配体。
OmCI一级序列与补体控制蛋白(CCP)结构域(约60个氨基酸的多个重复)没有可检测相似性，所述CCP结构域形成很多体内自身补体抑制剂，包括因子H、C4BP、CR1、CR2、MCP和DAF)。它与公共数据库中的任何其它已知补体抑制剂也不相似，其它已知补体抑制剂包括Isac，肩板硬蜱的唾液腺补体替代通路抑制剂蛋白(Valenzuela et al.，2000)。它与毛白钝缘蜱抗原20A1的N-端序列也不相关(Barandaet al.，2000)，20A1被提议是与以前在毛白钝缘蜱和乖异钝缘蜱的SGE中观察到的强补体抑制作用相关的因子(Astigarraga et al.，1997)。
补体抑制机制
酵母表达的糖基化和去糖基化rOmCI都和从SGE纯化的天然蛋白一样强效。昆虫细胞中表达的带C-端组氨酸标签的OmCI不够强效(数据未给出)。OmCI抑制人和豚鼠的经典和替代补体激活通路，还可能抑制其它哺乳动物的经典和替代补体激活通路。这种特性在精确阐明OmCI如何工作方面应是有用的，在现有C5抑制剂的物种特异性阻碍用啮齿动物进行体内研究时(Link et al.，1999)，将对建立补体介导疾病的动物模型是无价的。
OmCI不抑制经典(C4bC2a)或替代(C3bBb)的C3转化酶，因为它对C3α的切割速率没有影响(图10)。OmCI阻止从C5产生C5a(图11)。因为过量C5与OmCI抑制剂竞争(图12)，功能性经典(C4bC2aC3b)和替代(C3b2Bb)的C5转化酶必须在存在所述蜱抑制剂时形成。OmCI不可能是转化酶催化组分C2a和Bb的直接丝氨酸蛋白酶抑制剂，否则它会同时阻止C3a和C5a产生。该抑制剂不阻止CVF C3/C5转化酶(CVFBb)产生C5a(图11)，这提示OmCI不结合C5并阻断C5a切割位点。后一种现象不排斥OmCI结合到C5上位点、阻止C5结合到正常血清C5转化酶而不结合到CVF转化酶的可能性(Sandoval et al.，2000)。
两组独立的证据提示OmCI活性由直接结合到C5所介导(图15和图16)。
尽管OmCI抑制两种补体通路，但甚至用过量抑制剂替代通路也只被抑制最多80％(图8)。这可以用经典(C4bC2aC3b)或替代(C3b2Bb)通路使用不同的C5转化酶来解释，但其机制仍有待阐明。
总的来说，OmCI可能结合C5并阻止它与C5转化酶相互作用，或者结合C5转化酶和C5并阻止C5切割。当前我们没有令人心服的证据支持一种可能而反对其它可能。
天然OmCI的热稳定性和pH稳定性
OmCI是热稳定的，但活性在煮沸27分钟后开始丧失。OmCI看起来对酸敏感而对碱不敏感。长时间煮沸和暴露于酸都可能诱导灭活该蛋白质的构象变化。
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Claims (28)
1.通过抑制经典和替代的C5转化酶切割C5来抑制经典和替代补体通路的补体抑制剂分子，其来源于蜱，其中所述补体抑制剂分子是由图4中氨基酸序列的第19至168位氨基酸或者第1至168位氨基酸组成的蛋白质。
2.根据权利要求1的补体抑制剂分子，其通过与C5结合而抑制C5的切割。
3.根据权利要求2的补体抑制剂分子，其与C5形成复合体。
4.根据权利要求1到3中任一项的补体抑制剂分子，其中所述蜱是毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata)。
5.抑制经典补体通路和替代补体通路的补体抑制剂分子，其中所述补体抑制剂是由图4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸或第1到168位氨基酸组成的蛋白质。
6.抑制C5转化酶切割C5的补体抑制剂分子，其中所述补体抑制剂是由图4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸或第1到168位氨基酸组成的蛋白质。
7.根据权利要求6的补体抑制剂分子，其通过直接结合C5而抑制C5的切割。
8.根据权利要求7的补体抑制剂分子，其与C5形成复合体。
9.一种抗体，其结合权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子。
10.一种融合蛋白，其包含与一个或多个肽或多肽基因融合或化学融合的权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子。
11.根据权利要求10的融合蛋白，其中所述补体抑制剂分子与标记结构域基因融合或化学融合。
12.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述标记结构域是放射性化学标签。
13.一种核酸分子，其由编码权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子或权利要求10到12中任意一项所述的融合蛋白的核苷酸序列组成。
14.根据权利要求13的核酸分子，其由图4中核苷酸序列的第53到507位核苷酸组成。
15.根据权利要求13的核酸分子，其由图4中核苷酸序列的第1到507位核苷酸组成。
16.一种载体，其包含权利要求13到权利要求15中任意一项所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子或权利要求16所述的载体。
18.制备权利要求1到8中任意一项所述补体抑制剂分子或权利要求10到12所述融合蛋白的方法，包括在表达所述蛋白质的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞并回收由此生产的所述蛋白质。
19.鉴定权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子的配体的方法，包括以下步骤：
(a)使所述补体抑制剂分子与候选配体接触，和
(b)检测配体-补体抑制剂分子复合体的形成。
20.一种组合物，包含权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子、权利要求10到12中任意一项所述的融合蛋白或权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子以及药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20的组合物，其还含有佐剂。
22.用于治疗用途的权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子、权利要求10到12中任意一项所述的融合蛋白或权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子。
23.权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子、权利要求10到12中任意一项所述的融合蛋白或权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗或预防补体介导的疾病或病症。
24.根据权利要求23的用途，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、再灌注损伤、移植排斥、脓毒症、免疫复合体疾病或迟发型超敏反应。
25.权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂分子、权利要求10到12中任意一项所述的融合蛋白或权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子用于制造疫苗的用途，所述疫苗用于保护动物抵抗噬血节肢动物传播的疾病或病症。
26.根据权利要求25的用途，其中所述噬血节肢动物是毛白钝缘蜱。
27.根据权利要求26的用途，其中所述疾病或病症是回归热、非洲猪热或西尼罗热。
28.抑制细胞或组织中经典和替代补体通路的体外方法，包括向所述细胞或组织施用权利要求1到8中任意一项所述的补体抑制剂、权利要求10到12所述的融合蛋白或权利要求13到15中任意一项所述的核酸分子。
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