ES2942783T3 - Microorganismo recombinante para producir citidina difosfato y método para producir citidina difosfato - Google Patents

Microorganismo recombinante para producir citidina difosfato y método para producir citidina difosfato Download PDF

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Abstract

Se proporciona un microorganismo recombinante para producir difosfato de citidina y un método para producir difosfato de citidina utilizando el microorganismo recombinante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo recombinante para producir citidina difosfato y método para producir citidina difosfato
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la biotecnología, y, en particular, se refiere a un microorganismo recombinante para producir citicolina, producción de citicolina utilizando el microorganismo recombinante, y producción de citicolina mediante un método biológico utilizando el microorganismo recombinante.
Antecedentes de la técnica
La citicolina (CDP-colina, CDPC abreviado) es un derivado de nucleósido, que se sintetiza a partir de ácido 5'-citidina y fosfocolina, y tiene una fórmula molecular de C14H26N4O11P2, un peso molecular relativo de 488,323962 y un punto de ebullición de 851,4 °C. La citicolina es un intermedio en la generación de fosfatidilcolina a partir de colina, que está presente en todas las células y es una coenzima principal para la síntesis de fosfolípidos. La citicolina mejora las funciones cerebrales al promover la síntesis de lecitina, y se usa para tratar el traumatismo craneoencefálico agudo y la alteración de la conciencia posterior a la cirugía cerebral.
Existen principalmente dos métodos para producir citicolina: un método químico y un método biológico. En el método de síntesis química, la citicolina sódica se genera bajo la acción de N-dimetilformamida utilizando ácido citidílico y fosfocolina como sustratos y cloruro de toluenosulfonilo como agente de condensación. Sin embargo, este método tiene una tasa de conversión de reacción baja, produce muchos subproductos, requiere altos costos, y genera mucha contaminación.
El método biológico para producir citicolina tiene una historia relativamente larga e incluye principalmente un método de catálisis de una sola enzima/múltiples enzimas o un método de conversión de una sola bacteria/múltiples bacterias. En 1975, Shoji Shirota et al. estudió la síntesis de citicolina usando levadura y factores influyentes en la síntesis (Shoji Shirota 1975, Agr Biol Chem, 35(3):1469-1474.). En 1982, Isao Takata et al. biosintetizaron CDPC utilizando el compuesto K2 carragenano para inmovilizar la enzima fumarasa (Takata J 1982, Ferment Technol, 60(5):431-437.). Desde 1992 hasta 2002, Qiu Weiran et al. produjo citicolina utilizando células de levadura inmovilizadas (Qiu Weiran 1992, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 62(4):37-39.; Yu Dongsheng 2002, Journal of Wuxi University of Light Industry, 21(3):277-280.). En los últimos años, el uso de levaduras, Brevibacterium ammoniagenes, o similares para producir citicolina mediante fermentación, utilizando ácido orótico y fosfocolina como sustratos y la adición de glucosa para producir ATP, todavía tiene problemas tales como altos costos y una baja tasa de conversión (Ying Hanjie 2015, GENETICALLY ENGINEERED BACTERIUM STRAIN EXPRESSING CHOLINE KINASE AND PHOSPHOCHOLINE CYTIDYLYLTRANSFERASE AND CONSTRUCTION METHOD AND APPLICATION THEREOF, 201510184705.8), que no permiten la producción y aplicación industrial a gran escala.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un método simple de síntesis de citicolina, no contaminante y de bajo coste, mediante el cual puede implementarse de manera efectiva la producción industrial a gran escala de citicolina, reduciendo de este modo los costes de producción de citicolina y reduciendo la contaminación.
En la actualidad, solo en China, la demanda anual de citicolina alcanza las 1.000 toneladas, mientras que actualmente solo se pueden proporcionar alrededor de 50 toneladas de citicolina. La presente invención satisface los requisitos anteriores y tiene ventajas relacionadas.
El documento CN 102 605 025 A divulga un método de bioingeniería para la producción de citicolina. El método comprende las siguientes etapas: producir una cepa de Escherichia coli que contiene colina fosfato citidililtransferasa por recombinación a través de un método de ingeniería genética; utilizar la cepa modificada para realizar cultivos de alta densidad a gran escala, así como la separación y purificación, obteniendo así colina fosfato citidililtransferasa; utilizar la colina fosfato citidililtransferasa para realizar la síntesis de catálisis enzimática en condiciones apropiadas para obtener la citicolina; y añadir resina de intercambio catiónico a un sistema de síntesis de catálisis enzimática de la citicolina para permitir que la citicolina se adsorba constantemente sobre la resina en el proceso de síntesis.
El documento CN 104 774 799 A divulga una bacteria modificada genéticamente para expresar colina cinasa y fosfocolina citidilciltransferasa. La cepa es una bacteria modificada genéticamente en la que se importa un gen CCT (colina fosfato citidililtransferasa) y un plásmido coexpresado del gen CKI de la colina cinasa.
Bulawa C.E. y Raetz C.R.H., The Journal of Biological Chemistry, 1984, 259, 11257-11264, muestra que las actividades hidrolasa y citidililtransferasa en E. coli están codificadas por un solo locus, cdh.
En Kakehi M. et al., Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2007, 13, 96-104, se hace un intento de interrumpir completamente la actividad de la 5'-nucleotidasa periplásmica en E. coli para probar si puede absorber y excretar nucleótidos de purina.
Sumario de la invención
Los objetivos de la presente invención son diseñar y producir un microorganismo recombinante capaz de producir, sintetizar y acumular una cantidad relativamente grande de citicolina, y lograr una producción biológica de alto rendimiento de citicolina usando el microorganismo recombinante usando cloruro de colina como sustrato. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. El resto de la divulgación sirve para una mejor comprensión de la invención.
Soluciones técnicas:
1. Eliminación de genes codificantes de enzimas que utilizan y degradan la citicolina
En primer lugar, los genes codificantes de las enzimas que utilizan y degradan la citicolina en una célula se inactivan o bloquean, de manera que el microorganismo pueda acumular citicolina (CDPC). Estas enzimas comprenden: citidina-5'-difosfato-diacilglicerol pirofosfatasa (Cdh) y UDP-azúcar hidrolasa (UshA), que pueden catalizar la citicolina para generar citosina y fosfocolina.
2. Síntesis de citicolina a partir de la acilación de citidina de fosfocolina
En los organismos naturales, existe la citidililtransferasa (EC2.7.7, denominada en conjunto CTasa) que puede desfosforilar la citidina trifosfato (CTP) y generar citicolina y pirofosfato con fosfocolina (PC), por ejemplo, PCT1 (Tsukagoshi Y 1991, J Bacteriol. 173(6): 2134-6.), CDS1 (Carter 1966, J Lipid Res 7(5);678-83.), y ECT1 (Visedo Gonzalez 1989, Biochem J 260(1); 299-301.) derivada de Saccharomyces cerevisiae; CdsA (Carter 1966, J Lipid Res 7(5); 678-83.), IspD (Rohdich 1999, Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96(21); 11758-63.), MocA (Neumann 2009, J Biol Chem 284(33); 21891-8.), KdsB (Ghalambor 1966, J Biol Chem 1966; 241(13); 3216-21.) y Cca (Shi 1998, EMBO J 17(11); 3197-206.) derivada de Escherichia coli; LicC (Denapaite D 2010 PLoS One. 5(2):e9426.) derivada de Streptococcus mitis B6; Pcytla (ID del gen: 13026) y Pcyt1b (ID del gen: 236899) derivada de Mus musculus; PAS_chr2-2_0401 (ID del gen: 8199108) derivada de Komagataella phaffiiGS115; CD36_40620 derivada de Candida dubliniensis CD36; Cct 1 (ID del gen: 117353) y Cct2 (ID del gen: 38180) derivadas de moscas de la fruta y similares.
Los genes codificantes de estas CTasas específicas de CTP y/o enzimas homólogas de las mismas pueden obtenerse mediante un método de síntesis de ADN, o pueden obtenerse directamente mediante un método de PCR utilizando ARNm extraído de los organismos correspondientes como molde. Por lo tanto, cuando alguno de los genes obtenidos anteriormente se exprese en una célula recombinante, la CTasa expresada con éxito puede producir CDPC utilizando CTP y PC como sustratos en la célula recombinante, aumentando significativamente el rendimiento de CDPC.
Con el fin de obtener además cierta CTasa con mayor especificidad, se pueden usar técnicas de ingeniería de proteínas para obtener un mutante de CTasa con alta especificidad para CTP, para producir así una gran cantidad de CDPC en la célula recombinante (por ejemplo, la ingeniería de proteínas se usa para mejorar la termoestabilidad de la pululanasa en Bacillus (Chang 2016, MPLoS One. 11(10):e0165006.)).
3. Incremento del suministro de colina y fosfocolina en una célula
Para obtener más fosfocolina, el cloruro de colina debe suministrarse más rápidamente. Para aumentar el depósito de cloruro de colina en una célula, se expresa la proteína transportadora de colina BetT, para obtener así más proteína transportadora.
La mayoría de los organismos de tipo silvestre pueden producir varias fosforilasas, tales como la fosforilasa ácida y la fosforilasa alcalina. Por ejemplo, Escherichia coli produce fosforilasa ácida (AphA) y fosforilasa alcalina (PhoA) (consultar http: //ecocyc.org/). La fosfocolina intracelular es propensa a ser hidrolizada en colina y fosfato por estas fosfatasas. La colina se deshidrogena aún más para generar glicina betaína. Las deshidrogenasas capaces de degradar la colina comprenden las colina deshidrogenasas BetA y BetB de Escherichia coli (Gadda 2003, Appl Environ Microbiol 69(4); 2126-32.) y las glicolato oxidasas GlcD, GlcE y GlcF (Lord 1972, Biochim Biophys Acta 1972; 267(2); 227-37.).
Como precursor de CDPC, el suministro continuo de fosfocolina es muy importante. Con este fin, 1) la proteína transportadora de colina se expresa o se sobreexpresa en una célula recombinante para acelerar la entrada de colina en la célula; 2) la célula es necesariamente deficiente en fosforilasas para lograr un suministro sostenido y estable de fosfocolina; y 3) la colina cinasa (CKasa) se expresa o se sobreexpresa en la célula recombinante, acelerando de este modo la fosforilación de la colina para generar fosfocolina. La colina cinasa relacionada puede no estar presente en todas las células no modificadas genéticamente. Las colina cinasas que actualmente se sabe que son capaces de catalizar la fosforilación de la colina comprenden CKI1 (EC2.7.1.32 https://www.biocyc.org/gene?orgid=YEAST&id=YLR133W-MONOMER) (Wittenberg 1953, Biol. Chem, 431-44) y EKI1 (etanolamina cinasa, https://biocyc.org/gene?orgid=YEAST&id=YDR147W) (SUNG1967, Biochem. J. 105,497) derivada de Saccharomyces cerevisiae; Chka (ID del gen: 12660) y Chkb (ID del gen: 12651) derivada de Mus musculus; CHKA (ID del gen: 1119) y CHKB (ID del gen: 1120) derivada de Homo sapiens; CK1 (ID del gen: 843500) derivada de Arabidopsis thaliana; Cka-1 (ID del gen: 177807), Cka-2 (ID del gen: 180703), Ckb-1 (ID del gen: 181904), Ckb-2 (ID del gen: 175565), y Ckb-4 (ID del gen: 184864) derivada de Caenorhabditis elegans, y similares. 3). Dado que en la presente invención, se añade un sustrato (cloruro de colina) durante la fermentación, para evitar la degradación del sustrato, debe bloquearse una enzima capaz de degradar la colina o debe inactivarse su gen codificante.
4. Aumento de la concentración de un precursor CTP de CDPC
La CTP intracelular es un producto intermedio de una vía de síntesis de pirimidinas y se genera a partir de la uridina trifosfato (UTP) bajo la acción de la citidina trifosfato sintetasa PyrG. Sin embargo, la PyrG está sujeta a la inhibición de retroalimentación de un producto CDP de la misma. Las mutaciones de ácido aspártico a ácido glutámico (D160E) en la posición 160, de ácido glutámico a alanina (E162A) en la posición 162, o de ácido glutámico a lisina en la posición 168 (E168K) de dicha enzima pueden eliminar eficazmente el efecto de inhibición de retroalimentación de la CDP sobre la misma (Iyengar A 2003, Biochem J. 369 (Pt 3): 497-507). La citidina monofosfato (CMP) puede generarse a partir de CTP bajo la acción de la 5-hidroxi-CTP pirofosfatasa NudG. La inactivación o el bloqueo de un gen que codifica NudG puede prevenir eficazmente la derivación de CTP para acumular CTP en una concentración más alta, aumentando de este modo el rendimiento de CDPC.
5. Bloqueo de la vía de hidrólisis de la uridina monofosfato UMP
En una vía de síntesis de pirimidinas de Escherichia coli, la UMP, que es un producto intermedio en la síntesis de citicolina, no solo se utiliza para sintetizar citicolina a partir de CTP, sino que también se utiliza para generar uridina con la catálisis de varias 5'-nucleotidasas. El bloqueo o inactivación de umpG y umpH, que se sabe que codifican genes de 5'-nucleotidasas, puede eliminar la derivación de UMP, por lo que u Mp se utiliza exclusivamente para la síntesis de CDPC.
6. Eliminación de la inhibición de retroalimentación y la represión de retroalimentación en la síntesis de nucleósidos de pirimidina y aumento del flujo metabólico de la síntesis de nucleósidos de pirimidina y el rendimiento de CDPC
Una primera etapa de la catálisis en una vía de síntesis de nucleótidos de pirimidina es catalizar la síntesis de carbamoil fosfato por la carbamoil fosfato sintetasa (CarAB). Dicha enzima está sujeta respectivamente a la represión de retroalimentación impuesta por productos metabólicos finales tales como purina, pirimidina y arginina (Devroede N 2006, J Bacteriol. 188(9): 3236-45.), y las proteínas represoras correspondientes son respectivamente PurR, PepA, y ArgR (Kim 2015, Microb Cell Fact 14:98). En la presente invención, la inhibición de la transcripción de los genes a carAB se elimina inactivando los genes purR, pepA y argR acelerando de este modo la síntesis de carbamoil fosfato. Asimismo, dicha enzima está además sujeta a inhibición de retroalimentación impuesta por la UMP. De acuerdo con una referencia bibliográfica (Delannay S 1999, J Mol Biol. 286(4): 1217-28), una mutación de serina (que es un aminoácido en la posición 948) a fenilalanina (S948F) de una subunidad (CarB) de dicha enzima puede eliminar efectivamente el efecto de inhibición de la UMP. En la presente invención, una cepa recombinante que lleva un gen que codifica la mutación CarB (S948F) se obtiene realizando una mutación en el gen carB en un cromosoma.
Una segunda etapa de la catálisis en la vía de síntesis de nucleótidos de pirimidina es catalizar la síntesis de carbamoil aspartato por la aspartato carbamiltransferasa. Dicha enzima consiste en una subunidad reguladora (PyrI) y una subunidad catalítica (PyrB). Cuando la concentración de CTP es alta, la CTP se combina con PyrI, reduciendo así la actividad de la enzima. Si se destruye la subunidad reguladora que codifica la aspartato carbamiltransferasa, por ejemplo, se inactiva un gen codificante de la misma, se elimina el efecto de inhibición de retroalimentación del producto final CTP sobre la enzima (Coudray L 2009, Bioorg Med Chem. 17(22): 7680-9).
En la vía de síntesis de nucleótidos de pirimidina, pyrE codifica la orotato fosforribosiltransferasa, para catalizar el ácido orótico para sintetizar orotato monofosfato, y hay una mutación por desplazamiento de marco cerca de un codón de terminación de un gen rph en dirección 5' del gen pyrE en la bacteria hospedadora Escherichia coli W3110 (Kaj Frank Jensen 1993, Journal Of Bacteriology, 3401-3407.), provocando la transcripción de algunos genes rph incapaces de detenerse, afectando de este modo a la expresión de los genes pyrE en dirección 3' y conduciendo a la acumulación de ácido orótico en la bacteria hospedadora. La acumulación del subproducto ácido orótico puede reducirse efectivamente a cero mediante la corrección de pyrE en un genoma, o mediante la sobreexpresión de pyrE bajo el control de un promotor activo como el promotor trc (J. Brosius, M. Erfle, J. Storella Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter Effect on its in vivo activity, J. Biol. Chem., 260 (1985), 3539-3541), el promotor del bacteriófago A pR (Walz, A., Pirrotta, V. Sequence of the PR promoter of phage A. Nature 254, 118-121 (1975)).
Asimismo, en la síntesis de nucleótidos de pirimidina, la ribosa se combina en nucleósido usando fosforribosilpirofosfato como precursor, y la fosforribosilpirofosfato cinasa (Prs) cataliza una reacción entre la 5-fosfato ribosa y ATP para sintetizar fosforribosilpirofosfato PRpP. Sin embargo, la fosforribosilpirofosfato cinasa derivada de Escherichia coli está sujeta a la inhibición de retroalimentación impuesta por la ADP. Una mutación, como de ácido glutámico a la alanina en la posición 128 (D128A) en Prs puede eliminar eficazmente el efecto de inhibición de retroalimentación de la ADP en Prs (Shimaoka 2007 J Biosci Bioeng 103(3): 255-61). La UMP cinasa codificada por un gen pyrH cataliza la fosforilación de UMP para sintetizar uridina difosfato UDP, pero dicha enzima está sujeta a la inhibición de retroalimentación impuesta por su producto UDP. En algunas referencias bibliográficas se describe que una mutación de ácido aspártico a alanina en la posición 93 (D93A) en dicha enzima puede eliminar efectivamente el efecto de inhibición de retroalimentación correspondiente (Meyer P 2008, J Biol Chem. 283(51): 36011-8.).
Efectos beneficiosos: la presente invención tiene las siguientes ventajas: en comparación con la técnica anterior, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante para producir citicolina y un método de producción que implementa un rendimiento simple y alto de citicolina mediante un método biológico que usa el microorganismo recombinante, desarrollando de este modo un método de síntesis de citicolina no contaminante y de bajo coste, que tiene los siguientes efectos beneficiosos: durante un proceso de fermentación microbiana, una cierta cantidad de citidina trifosfato se acumula en una célula usando glucosa y colina, se establece un microorganismo recombinante mediante el uso de un material biológico manipulado genéticamente, el microorganismo se modifica mediante ingeniería metabólica, la reserva de citidina trifosfato, que es un precursor de la citicolina, se enriquece en la célula mediante un método de fermentación microbiana, y finalmente, la citicolina se sintetiza y se acumula en un medio de crecimiento de la misma, implementando efectivamente la producción industrial a gran escala de citicolina, reduciendo de este modo los costes de producción de citicolina y reduciendo la contaminación; por lo tanto, el método es respetuoso con el medio ambiente y tiene un alto valor de promoción y aplicación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquemático de una vía metabólica de citicolina en Escherichia coli; y
la Figura 2 es un espectrograma de HPLC de detección de la citicolina.
Fosfato de carbamoílo: Fosfato de carbamoílo; aspartato de carbamoílo: Aspartato de carbamoílo; orotato: Orotato; OMP: Orotato-5'-monofosfato; UMP: Uridina-5'-monofosfato; UDP: Uridina -5'-difosfatasa; UTP: Uridina-5'-trifosfato; UdR: Uridina; CdR: Citidina; CTP: Citidina-5'-trifosfato; CDP: Citidina-5'-difosfato; CMP: Citidina-5'-monofosfato; CDPC: Citicolina; PC: Fosfocolina; Colina: Colina; glicina betaína: Glicina betaína; PyrA: Carbamato fosfato sintetasa; PyrB/I: Aspartato carbamiltransferasa; PyrE: Orotato fosforribosiltransferasa; PyrF: Uridina-5' fosfato descarboxilasa; PyrH: Uridina-5'-monofosfato cinasa; PyrG: Citidina trifosfato sintetasa; Cmk: Citidina-5'-monofosfato cinasa; CTasa: Citidililtransferasa; CKasa: Colina cinasa; Ndk: Nucleósido difosfato cinasa; NudG: 5-hidroxicitidina trifosfato difosfatasa; UMP: Uridina-5'-monofosfato; UmpG: enzima nucleótido no específica/polifosfatasa; UmpH: Uridina 5'-difosfatasa; BetA: Colina deshidrogenasa; BetB: Betaína aldehído deshidrogenasa; AphA: Fosfatasa ácida; PhoA: fosfatasa alcalina; UshA: UDP-azúcar hidrolasa; Cdh: Citidina difosfato-diacilglicerol pirofosfatasa.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente invención se ilustrará más adelante por medio de varios ejemplos específicos, que son solo para fines de ilustración en lugar de limitación.
Ejemplo 1: Método para inactivar un gen en Escherichia coli
En la presente invención, se usó el método de Datsenko para inactivar un gen en Escherichia coli (Datsenko KA 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97 (12): 6640-6664), y para un cebador de inactivación del gen correspondiente, se hace referencia a Baba T. 2006, Mol Syst Biol 2(1),0008.
Ejemplo 2: Método de verificación de una cepa recombinante mediante fermentación en matraz agitado
En un medio de fermentación para verificar la producción de citicolina por la cepa recombinante mediante fermentación en matraz agitado, cada litro del medio incluye específicamente 100 ml de una solución de YC, 20 g de glucosa, 200 ml de una solución salina quíntuple, 1 ml de una solución de TM2, 10 mg de citrato férrico, 120 mg de sulfato de magnesio anhidro, 111 mg de cloruro de calcio y 1 ug de tiamina, usándose agua desionizada para conseguir el volumen requerido de la mezcla, en donde la solución salina quíntuple consiste en 30 g de hidrógeno fosfato disódico por litro, 15 g de dihidrógeno fosfato de potasio por litro, 2,5 g de cloruro de sodio por litro y 5,0 g de cloruro de amonio por litro, usándose agua ionizada para conseguir el volumen requerido de la mezcla; y la solución de TM2 consiste en 2,0 g de cloruro de zinc tetrahidratado por litro, 2,0 g de cloruro de calcio hexahidratado por litro, 2,0 g de molibdato de sodio deshidratado por litro, 1,9 g de sulfato de cobre pentahidratado por litro, 0,5 g de ácido bórico por litro y 100 ml de ácido clorhídrico por litro. Una solución de YC en el medio de fermentación M9 es 100 ml de agua desionizada; y una solución de YC en el medio de fermentación MS3.2 consiste en 4 g de peptona, 4 g de levadura en polvo, 10 g de cloruro de sodio y 100 ml de agua desionizada. Las soluciones anteriores se esterilizaron a 121 °C durante 20-30 minutos.
Un proceso de fermentación en matraz agitado es el siguiente: en primer lugar, la cepa recombinante se inoculó en un medio LB de cierta cantidad y que contenía antibióticos (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, escrito por [EE. UU.] J. Sambrook, traducido por Huang Peitang, 2002, 1595), el medio sembrado se colocó en un agitador a 34 °C para una incubación durante la noche a 250 rpm; se tomaron 100 pl del cultivo de siembra anterior de la noche y se transfirieron a 2 ml de medio LB que contenía antibióticos, y a continuación se colocaron en un agitador a 34 °C para incubación durante 4 a 6 h a 250 rpm, hasta un valor DO600 de aproximadamente 1,5; después de esto, los 2 ml de un cultivo de siembra secundario se transfirieron por completo a un matraz agitado precargado con 18 ml del medio de fermentación y se colocaron en un agitador a 34 °C para su incubación a 250 rpm. Cuando el valor DO600 del cultivo llegó a 1, se le añadió IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM, a continuación, se agregó cloruro de colina hasta una concentración final de 4 mM, la incubación continuó durante aproximadamente 20 horas, y se tomó un caldo de fermentación para la detección por centrifugación, en donde para un método de detección específico, se hace referencia al Ejemplo 4.
Ejemplo 3: Método de producción de citicolina por fermentación utilizando una cepa recombinante en un termentador de 5 l
En un medio de fermentación para verificar la producción de citicolina por la cepa recombinante mediante fermentación en un fermentador, cada litro del medio incluye específicamente 2 g de sulfato de amonio, 8 g de cloruro de sodio, 2 g de dihidrógeno fosfato de potasio, 1,65 g de cloruro de magnesio hexahidratado, 10 g de glucosa, 105 mg de cloruro de calcio, 10 mg de cloruro de zinc, 1 ml de una solución de oligoelementos TM2, 94 mg de citrato de hierro, 6 g de peptona y 6 g de levadura en polvo, usándose agua desionizada para conseguir el volumen requerido de la mezcla. La solución de oligoelementos TM2 consiste en 1,31 g de cloruro de zinc por litro, 1,01 g de cloruro de calcio por litro, 1,46 g de molibdato de amonio tetrahidratado por litro, 1,9 g de sulfato de cobre por litro, 0,5 g de ácido bórico por litro y 10 ml de ácido clorhídrico por litro, usándose agua desionizada para conseguir el volumen requerido de la mezcla. Un medio suplementario contiene 600 g de glucosa, 40 g de peptona y 40 g de levadura en polvo por litro.
Un proceso de fermentación es el siguiente: en primer lugar, se preparó un cultivo de siembra, se recogió un cultivo monoclonal de una placa con LB y se transfirió a un tubo con LB que contenía antibióticos para su incubación durante la noche a 34 °C, el cultivo obtenido se incubó, a un volumen de inoculación del 1 %, en un matraz agitado de 500 ml cargado con 100 ml de LB para incubación a 34 °C durante 4 horas, hasta que el valor de la DO fue de 1,5-2; a continuación, el cultivo obtenido se incubó, a un volumen de inoculación del 5 %, en un fermentador de 5 l cargado con 1,5 l de medio de fermentación MF1.32 para incubación a 37 °C, se ajustó un valor de pH a 6,9 con agua amoniacal, la disolución de oxígeno se acopló a una velocidad de rotación para mantener el oxígeno disuelto al 30 %, después de 3 horas de fermentación, se alimentó medio adicional a razón de 8 g/l/h, después de 5 horas de fermentación, el valor DO600 fue 16-25, la temperatura se redujo a 32 °C, Se añadió IPTG de manera que la concentración final fuese 0,5 mmol/l para la inducción, después de 10 horas de fermentación, la velocidad de rotación se fijó en 1000 rpm, y cuando el oxígeno disuelto era superior al 40 %, se inició la alimentación de acoplamiento, para mantener el oxígeno disuelto en 30 %-45 %. El muestreo y la detección se realizaron después de 27 horas de fermentación, y para un método de detección, se hace referencia al Ejemplo 4.
Ejemplo 4: Medición de citicolina y subproductos relacionados en un caldo de fermentación mediante HPLC
Se extrajeron con precisión 200 ul de un caldo de fermentación, y se añadieron a 800 ul de agua desionizada, al que se le añade 1 ml de etanol absoluto, la mezcla obtenida se sometió a agitación en vórtex durante 5 min (a 10.000 rpm), después de la centrifugación, se tomó un sobrenadante y se filtró en un filtro de membrana de 0,22 um, y se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la detección, con los siguientes parámetros de HPLC: Se utiliza una columna Agilent SB C184,6*150 mm 5 um; las fases móviles son metanol y PBS 10 mM (pH 4,0); la proporción entre las fases móviles es la siguiente: en 0,01-4,00 minutos, la proporción del metanol es del 2%, en 4,00-5,00 minutos, la proporción del metanol se eleva del 2 % al 10 %, en 4,00-5,00 minutos, la proporción del metanol se reduce del 10 % al 2 %, y en 5,10-10,0 minutos, la proporción del metanol es del 2 %; un detector ultravioleta detecta una longitud de onda de 272 nm; el caudal de la fase móvil fue de 0,8 ml/min, la cantidad de carga del caldo de fermentación es de 5 pl y la temperatura de la columna es de 30 °C. El tiempo pico de CDPC es de 2,745 minutos y el espectrograma es como se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 5: Construcción de Escherichia coli recombinante incapaz de degradar y utilizar CDPC
Como se muestra en la Figura 1, en Escherichia coli, la CDPC es catalizada por la UDP-azúcar hidrolasa (UshA) y la CDP-diacilglicerol pirofosfatasa (Cdh) para generar CMP y fosfocolina. En la presente invención, se usó Escherichia coli WJ2* (ATCC27325AlacI entDT5) como cepa original, y los genes codificantes de UshA y Cdh se inactivaron de WJ2 para obtener bacterias recombinantes. La capacidad de estas cepas para utilizar y degradar CDPC se debilitó gradualmente, en donde una cepa recombinante HQ24 (WJ2AushAAumpGAumpHApyrIAcdh) no puede utilizar ni degradar CDPC en la fermentación en matraz agitado. Por ejemplo, cuando se añaden 2,0 g/l de citicolina dicolina al medio de fermentación, los restos de CDPC en WJ2* y WJ3* (WJ2AushA) detectados después de 24 h son 0,15 g/l y 1,02 g/l. [Resultado de SQ150916: 0.311.92] indica que la inactivación de ushA redujo significativamente la degradación de CDPC. Cuando se añade 1 g/l de citicolina difosfato al medio de fermentación, los restos de CDPC en HQ19* (WJ2AushAAumpGAumpH Apyrl), HQ24* (HQ19Acdh), HQ25* (HQ19AmazG) y HQ26* (HQ19AnudF) detectados después de 24 h son 0,5 g/l, 1,0 g/l, 0,45 g/l y 0,46 g/l. Esto indica que la inactivación de cdh podría eliminar por completo la degradación de CDPC. HQ24/pY022 (pHS01-PCT1-CKI1-pyrE-prs128), una cepa de ejemplo de acuerdo con la invención, alcanzó alrededor de 17 g/l después de la fermentación en un fermentador durante 26 h.
* Cepas comparativas.
La cepa recombinante HQ24/pY022 se depositó el 26 de junio de 2017 en el Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China del Comité de Gestión de Conservación de Microbios de China, Dirección: NO. 3, NO. 1 Courtyard West Beichen Road, Chaoyang District, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Código postal: 100101, Número de conservación: CGMCC N.° 14277.
Ejemplo 6: Construcción de Escherichia coli recombinante incapaz de degradar colina
En la presente invención, para la producción metabólica de citicolina por Escherichia coli, se usó cloruro de colina añadido exógenamente como sustrato como precursor para la síntesis de citicolina. Bajo la acción de la colina deshidrogenasa, el sustrato colina se oxida a betaína aldehido y luego a glicina betaína bajo la acción de la betaína aldehído deshidrogenasa.
Para evitar la degradación del sustrato y del producto intermedio, en la presente invención, los genes betA/B que codifican la colina deshidrogenasa fueron inactivados en la cepa HQ34.
se usaron respectivamente HQ33 (HQ24ApurRAfhuA::Ptrc-pyrE, carB948) y HQ34 (HQ33AbetAB) como hospedadores para expresar el plásmido pY012. Tras la fermentación en fermentador durante 43 h, los rendimientos detectados de Cd PC fueron 18,40 g/l para HQ33/pY012 y 20,87 g/l para HQ34/pY012. Esto indica que la inactivación de la colina deshidrogenasa podría bloquear la degradación del sustrato cloruro de colina, aumentando de este modo el rendimiento de CDPC.
Ejemplo 7: Construcción de Escherichia coli recombinante incapaz de degradar fosfocolina
En la presente invención, para la producción de citicolina, se usó cloruro de colina agregado exógenamente como sustrato, que es catalizado por la colina cinasa para generar un producto intermedio, es decir, fosfocolina. Sin embargo, la fosfocolina en Escherichia coli es propensa a la hidrólisis a colina por la fosfatasa ácida o la fosfatasa alcalina presente en una célula.
Para evitar la degradación del producto intermedio fosfocolina, en la presente invención, los genes codificadores de AphA phoA fueron inactivados en HQ35 y HQ36, respectivamente.
Se usaron HQ33 (HQ24ApurRAfhuA::Ptrc-pyrE, carB948), HQ35 (HQ33AaphA), y HQ36 (HQ33AphoA) como hospedadores para expresar el plásmido pY012. Después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación, los rendimientos detectados de CDPC en las cepas anteriores fueron de 1,82 g/l, 1,86 g/l y 1,87 g/l, respectivamente. Esto indica que la inactivación de la fosfatasa podría reducir o bloquear la degradación del producto intermedio fosfocolina, de tal manera que se podría usar más fosfocolina para la síntesis del producto, aumentando de este modo el rendimiento de CDPC.
Ejemplo 8: Sobreexpresión de citidililtransferasa y/o colina cinasa para aumentar el rendimiento de CDPC
Cuando se inactivan los genes de degradación de la citicolina y del sustrato colina y el producto intermedio fosfocolina del mismo, el rendimiento de CDPC es muy bajo, lo que indica una expresión insuficiente de una enzima intracelular clave para catalizar la colina para generar CDPC. Para aumentar el rendimiento de CDPC en una célula, en la presente invención, se expresaron apropiadamente la CTasa y la CKasa en el proceso de síntesis de CDPC. Cuando los plásmidos que expresan diferentes genes que codifican CTasa y/o CKasa se transformaron en hospedadores de expresión de Escherichia coli, el rendimiento de CDPC aumentó en diversos grados. Por ejemplo, cuando los plásmidos pHS01* (pCL1920 PLAc:: Ptrc, véase la patente LS9 US20130029395A1), pY008 (pHS01-PCT1-CKI1) y pY012 (pHS01-PCT1-CKI1-licC) se expresan en HQ33, después del cultivo de fermentación en matraz agitado durante 24 horas, los rendimientos de CDPC son respectivamente 0 g/l, 1,44 g/l y 1,55 g/l.
*Cepa comparativa
Ejemplo 9: Sobreexpresión de la proteína transportadora de colina para aumentar el rendimiento de CDPC
BetT es una proteína transportadora de colina activada por iones de hidrógeno y pertenece a la familia de transportadores de betaína/colina BCCT. Dicha proteína se expresa en condiciones aerobias y es inducida por presión osmótica. La presión osmótica alta puede potenciar la transcripción de BetT, y la adición de colina puede potenciar aún más la transcripción. Para obtener más CDPC, el cloruro de colina debe suministrarse más rápidamente. Para aumentar la entrada del cloruro de colina en una célula, que es una etapa limitante de la velocidad, se sobreexpresó BetT, para obtener más proteína transportadora en caso de que la presión osmótica no aumentase. Se usó HQ33 como hospedador para expresar respectivamente pY012 y pY012-betT, y después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación durante 24 h, el rendimiento detectado de CDPC en el primer caso fue 2,36 veces mayor que en el último caso. Esto indica que la sobreexpresión de betT podría aumentar significativamente el rendimiento de CDPC.
Ejemplo 10: Inactivación de un gen que codifica la enzima degradante UMP para aumentar el rendimiento de CDPC
La uridina monofosfato UMP es un producto intermedio de la vía de síntesis de pirimidinas, puede generar uridina difosfato UDP bajo la acción de la uridina 5'-monofosfatasa a través de una vía de reposición, y puede degradarse además en uridina bajo la acción de la 5'-nucleotidasa. Para obtener una mayor cantidad del producto CDPC, en la presente invención, los genes que codifican umpG y umpH de la 5'-nucleotidasa fueron inactivados en HQ18. Se utilizaron WJ3 y HQ18 (WJ3AumpGAumpH) como hospedadores para transformar el plásmido pY022 (pY008-pyrE-prs128), y después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación durante 24 h, los rendimientos detectados de CDPC fueron 1,9 g/l y 1,92 g/l, respectivamente. Para una cepa HQ18/pY022, un rendimiento podría llegar a 8,93 g/l después de la fermentación en un fermentador de 5 litros durante 26 h.
Ejemplo 11: Sobreexpresión de PyrE para aumentar el rendimiento de CDPC
La sobreexpresión del gen pyrE en un plásmido y un genoma podría eliminar el defecto causado por una mutación de cambio de marco del gen rph en dirección 5', aumentando de este modo el rendimiento de CDPC. Por ejemplo, cuando HQ04 (W3110 (AdeoA Aung ApurR AushA AbetABI, Ptrc-betT )) se usa como hospedador para expresar pY008 y pY009 (pY008-pyrE), respectivamente, y después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación, el rendimiento de CDPC aumenta de 0,67 g/l a 0,80 g/l. Esto indica que la sobreexpresión de pyrE podría aumentar el rendimiento de citicolina.
Ejemplo 12: Sobreexpresión de Prs128 para aumentar el rendimiento de CDPC
En la vía de síntesis de pirimidinas de Escherichia coli, bajo la acción de la orotato fosforribosiltransferasa (PyrE), los grupos fosfato en el fosforribosilpirofosfato (PRPP) se transfieren al orotato, generando de este modo orotato monofosfato (OMP). La insuficiencia de PRPP puede formar una etapa limitante de la velocidad en la vía de síntesis de pirimidina, dando como resultado un rendimiento relativamente bajo de citicolina y la acumulación de un subproducto de ácido orótico. La fosforribosilpirofosfato cinasa (Prs) cataliza una reacción entre 5-fosfato ribosa y ATP para sintetizar PRPP. Sin embargo, Prs está sujeta a la inhibición de retroalimentación impuesta por ADP y otros, y una mutación de ácido aspártico a alanina en la posición 128 en Prs para obtener Prs128 podría eliminar la inhibición de retroalimentación. Por ejemplo, cuando WJ3 se utiliza como hospedador para expresar respectivamente pY017 (pY009-prs) y pY022 (pY009-prs128), y después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación, el rendimiento de Cd Pc aumenta de 1,80 g/l a 1,96 g/l.
Ejemplo 13: Inactivación de un gen que codifica PyrI para aumentar el rendimiento de CDPC
Una segunda etapa de la catálisis en la vía de síntesis de nucleótidos de pirimidina es catalizar la síntesis de carbamoil aspartato por la aspartato carbamiltransferasa. Dicha enzima consiste en una subunidad reguladora (PyrI) y una subunidad catalítica (PyrB). Cuando la concentración de CTP es alta, la CTP se combina con PyrI, reduciendo así la actividad de la enzima. En la presente invención, el gen que codifica PyrI fue inactivado, para eliminar así el efecto de inhibición de retroalimentación del producto final CTP en la enzima. Por ejemplo, cuando pY022 se expresa en HQ18 y HQ19 (HQ18ApyrI), que se utilizan como hospedadores, y después de la fermentación en matraz agitado en un medio de fermentación, el rendimiento de CDPC se incrementa de 1,74 g/l en HQ18 a 1,92 g/l en HQ19. Esto indica que la inactivación del gen de pyrI podría eliminar la inhibición de retroalimentación sobre la aspartato carbamiltransferasa impuesta por CTP, acelerando de este modo la síntesis de la vía de síntesis de pirimidinas y aumentando el rendimiento de CDPC.
Ejemplo 14: Inactivación de genes codificantes de proteínas represoras PurR y ArgR para aumentar el rendimiento de CDPC
Una primera etapa de la vía de síntesis de nucleótidos de pirimidina es catalizar la síntesis de carbamoil fosfato por la carbamoil fosfato sintetasa. El gen que codifica carAB de dicha enzima está sujeto a un efecto de represión de retroalimentación de productos finales metabólicos como purina, pirimidina y arginina. Asimismo, el nucleótido purina es inhibido por la proteína represora codificada por el gen purR, y la arginina es inhibida por la proteína represora codificada por el gen argR. En la presente invención, la inhibición de la transcripción a carAB se eliminó inactivando purR y argR, acelerando de este modo la síntesis de carbamoil fosfato. Por ejemplo, cuando pY022 se expresa respectivamente en HQ19, HQ22 (HQ19ApurR), HQ20 (HQ18ApurR) y HQ21 (HQ20AargR), y después de la fermentación en matraz agitado en el medio de fermentación MS3.2, los rendimientos de CDPC son 1,25 g/l y 1,54 g/l; y 1,15 g/l y 1,34 g/l, respectivamente. Esto indica que la inactivación del gen purR o argR podría eliminar la represión de retroalimentación a carAB, promoviendo de este modo la síntesis de la vía de las pirimidinas y aumentando el rendimiento de CDPC.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo recombinante para producir citicolina, microorganismo recombinante, en el cual:
- las enzimas implicadas en la reutilización de la citicolina están inactivadas, en donde tanto la UDP-azúcar hidrolasa como la citidina-5'-difosfato-diacilglicerol pirofosfatasa están inactivadas;
- la colina cinasa para catalizar el cloruro de colina para generar fosfocolina está sobreexpresada con respecto a un microorganismo de tipo silvestre, en donde la colina cinasa comprende CKI1 o EKI1 derivadas de Saccharomyces cerevisiae; y
- la citidililtransferasa para catalizar la fosfocolina para generar citicolina está sobreexpresada con respecto al microorganismo de tipo silvestre, en donde la citidililtransferasa comprende PCT1, CDS1 y/o ECT1, derivadas de Saccharomyces cerevisiae; o CdsA, IspD, MocA, KdsB y/o Cca, derivadas de Escherichia coli; o LicC, derivada de Streptococcus; o CD36_40620 derivada de Candida dubliniensis.
2. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante comprende además una o ambas de las siguientes características:
- inactivación de enzimas implicadas en la reutilización de colina y/o de fosfocolina, en donde las enzimas implicadas en la reutilización de colina comprenden colina deshidrogenasa; y las enzimas implicadas en la reutilización de fosfato colina comprenden fosfatasa alcalina y fosfatasa ácida; y
- sobreexpresión de la proteína transportadora de colina con respecto al microorganismo de tipo silvestre, para transportar cloruro de colina a una célula, en donde la proteína transportadora de colina comprende BetT, derivada de Escherichia coli.
3. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 2, en donde el microorganismo recombinante comprende Escherichia coli.
4. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con la reivindicación 3, en el que, en una vía de síntesis de pirimidinas de Escherichia coli, las uridina-5'-monofosfato fosforilasas para degradar la uridina-5'-monofosfato en uridina están inactivadas; y las uridin-5'-monofosfato fosforilasas inactivadas comprenden UmpH, UmpG, PhoA, AphA y/o YjjG.
5. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con la reivindicación 3, en el que un gen que codifica una proteína represora de una vía de síntesis de pirimidinas del microorganismo recombinante está inactivado y/o se elimina la inhibición de retroalimentación de un producto final en la vía de síntesis de pirimidinas.
6. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el gen que codifica la proteína represora de la vía de síntesis de pirimidinas de Escherichia coli está inactivado y/o se elimina la inhibición de retroalimentación en la vía de síntesis de pirimidinas por medio de uno o de una pluralidad de los siguientes procesos:
1 ) inactivación de un gen que codifica la proteína represora de la inhibición de la transcripción de un gen que codifica la carbamoil fosfato sintetasa;
2) expresión de un mutante S948F de la carbamoil fosfato sintetasa;
3) inactivación de un gen que codifica una subunidad pyrl de la aspartato carbamiltransferasa;
4) expresión de la fosforribosilpirofosfato cinasa o de un mutante D128A de la misma;
5) expresión de la uridina-5'-monofosfato cinasa o de un mutante D93A de la misma; y
6) expresión de la citidina trifosfato sintetasa o de los mutantes D160E, ES 162A, E168K de la misma.
7. El microorganismo recombinante para producir citicolina de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el gen que codifica la proteína represora de la inhibición de la transcripción del gen que codifica la carbamoil fosfato sintetasa comprende uno o una pluralidad de purR, pepA y argR.
8. Un método para producir citicolina usando un microorganismo recombinante, en el que la citicolina se obtiene mediante fermentación, utilizando el microorganismo recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con cloruro de colina añadido como sustrato.
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