ES2937959T3 - Antígenos de citomegalovirus y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Esta descripción proporciona proteínas gL de citomegalovirus (CMV) modificadas y complejos que comprenden proteínas gL. Las proteínas gL modificadas permanecen intactas y pueden formar complejos con otras proteínas del CMV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Antígenos de citomegalovirus y usos de los mismos
LISTA DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 14 de enero de 2016, se denomina VN056504WO_SL.txt y tiene un tamaño de 26.466 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención pertenece al campo de los antígenos de citomegalovirus (CMV) que pueden usarse para vacunas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Citomegalovirus es un género de virus que pertenece a la familia de virus conocida como Herpesviridae o herpesvirus. La especie que infecta a los seres humanos se conoce comúnmente como citomegalovirus humano (HCMV) o herpesvirus humano-5 (HHV-5). Dentro de Herpesviridae, HCMV pertenece a la subfamilia Betaherpesvirinae, que también incluye citomegalovirus de otros mamíferos.
Aunque pueden encontrarse por todo el cuerpo, las infecciones por HCMV se asocian frecuentemente con las glándulas salivales. El HCMV infecta entre el 50% y el 80% de los adultos en los Estados Unidos (el 40% en todo el mundo), tal como se indica por la presencia de anticuerpos en gran parte de la población general. La infección por HCMV normalmente pasa desapercibida en personas sanas, pero puede ser potencialmente mortal para personas inmunodeprimidas, tal como personas infectadas por VIH, receptores de trasplantes de órganos o recién nacidos. El HCMV es el virus que se transmite con mayor frecuencia a un feto en desarrollo. Después de la infección, el HCMV tiene la capacidad de permanecer latente dentro del cuerpo durante la vida del huésped, con reactivaciones ocasionales de la latencia. Dada la gravedad e importancia de esta enfermedad, la obtención de una vacuna eficaz se considera una prioridad máxima de salud pública (Sung, H., et al., (2010) Expert review of vaccines 9, 1303-1314; Schleiss, Expert Opin Ther Pat. abril de 2010; 20(4): 597-602).
Se han secuenciado los genomas de más de 20 cepas diferentes de HCMV, incluyendo los de cepas de laboratorio y aislados clínicos. Por ejemplo, se han secuenciado las siguientes cepas de HCMV: Towne (GL239909366), AD169 (GI:219879600), Toledo (GL290564358) y Merlin (GI: 155573956). Las cepas de HCMV AD169, Towne y Merlin pueden obtenerse de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC VR538, ATCC VR977 y ATCC VR1590, respectivamente).
El citomegalovirus contiene un número desconocido de complejos próticos de membrana. De las aproximadamente 30 glicoproteínas conocidas en la envoltura viral, gH y gL han surgido como particularmente interesantes debido a su presencia en varios complejos diferentes: dimérico gH/gL, trimérico gH/gL/gO (también conocido como el complejo gCIII) y el pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 (pUL131 también se denomina “pUL131A”, “pUL131a” o “UL131A”; las subunidades pUL128, pUL130 y pUL131 a veces también se denominan UL128, UL130, UL131). Se cree que el CMV usa los complejos pentaméricos para entrar en las células epiteliales y endoteliales por endocitosis y fusión dependiente de pH bajo, pero se cree que entra en los fibroblastos por fusión directa en la membrana plasmática en un proceso que implica gH/gL o posiblemente gH/gL/gO. El/los complejo(s) gH/gL y/o gH/gL/gO es/son suficiente(s) para la infección de fibroblastos, mientras que el complejo pentamérico se requiere para infectar células endoteliales y epiteliales.
El complejo pentamérico se considera un objetivo importante para la vacunación frente al CMV. Los genes virales de UL128, u L130 y UL131 son necesarios para la entrada endotelial (Hahn, Journal of Virology 2004; 78:10023-33). Las cepas trópicas no endoteliales adaptadas a fibroblastos contienen mutaciones en al menos uno de estos tres genes. La cepa Towne, por ejemplo, contiene una inserción de dos pares de bases que provoca un cambio de marco en el gen de UL130, mientras que AD169 contiene una inserción de un par de bases en el gen de UL131. Tanto Towne como AD169 pudieron adaptarse para crecer en células endoteliales y, en ambos casos, se repararon las mutaciones de cambio de marco en los genes de UL130 o UL131.
El documento US7704510 da a conocer que se requiere pUL131A para el tropismo de células epiteliales. El documento US7704510 también da a conocer que pUL128 y pUL130 forman un complejo con gH/gL, que se incorpora en los viriones. Este complejo se requiere para infectar células endoteliales y epiteliales, pero no fibroblastos. Se encontró que los anticuerpos anti-CD46 inhibían la infección por HCMV de células epiteliales.
Las vacunas frente al CMV probadas en ensayos clínicos incluyen la vacuna de Towne, las quimeras Towne-Toledo, un replicón de virus alfa con gB como antígeno, la vacuna de gB/MF59, una vacuna de gB producida por GlaxoSmithKline y una vacuna de ADN que usa gB y pp65. pp65 es una proteína viral que es un potente inductor de
respuestas CD8+ dirigidas contra CMV. Todas estas vacunas son malos inductores de anticuerpos que bloquean la entrada viral en células endoteliales/epiteliales (Adler, S. P. (2013), British Medical Bulletin, 107, 57-68. doi:10.1093/bmb/ldt023).
Los estudios preclínicos en animales en vacunas frente al CMV incluyen una cepa AD169 inactivada que se ha reparado en el gen de UL131, una vacuna de ADN que usa un gen de UL130 de tipo natural y vacunas peptídicas que usan péptidos procedentes de pUL130 y 131 (Sauer, A, et al., Vaccine 2011 ;29:2705-1, doi:10.1016).
El antígeno gB del CMV se considera un mal inductor de anticuerpos que bloquea la entrada en células endoteliales/epiteliales. En un ensayo clínico de fase II, la vacuna de gB/MF59 solo fue eficaz en un 50% para prevenir la infección primaria entre mujeres jóvenes con un hijo (Pass, RF, et al., N Engl J Med 2009;360:1191 -9).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar vacunas frente al CMV que comprendan otras dianas antigénicas, tales como gH/gL, gH/gL/gO o el complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Tal como se da a conocer y se ejemplifica en el presente documento, los inventores descubrieron que cuando el antígeno gL de citomegalovirus se expresa de manera recombinante y se purifica a partir de un huésped mamífero (tal como una célula CHO o una célula HEK), se escinde una parte significativa de gL. Para mejorar la expresión recombinante y la purificación de la proteína gL intacta, se introdujeron mutaciones para reducir la escisión por proteasa de gL. Los mutantes muestran una resistencia aumentada a la escisión por proteasa durante la producción de recombinación.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una proteína gL de CMV recombinante, o (i) un fragmento de formación de complejo dimérico gH/gL de la misma, (ii) un fragmento de formación de complejo trimérico gH/gL/gO de la misma, o (iii) un fragmento de formación de complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 de la misma, en la que dicha proteína gL o fragmento comprende una mutación en los residuos 91-102 del sitio de reconocimiento de proteasa numerados según SEQ ID NO: 1, en la que dicha mutación reduce la escisión por proteasa en dicho sitio de reconocimiento de proteasa, en comparación con un control, en la que dicha mutación se selecciona de: a) adición de F, Q, FQ o QF entre los residuos N97 y S98;
b) deleción de un residuo seleccionado del grupo que consiste en: A95, A96, N97, y una combinación de los mismos; c) sustitución de A96 por un residuo no polar o por un residuo que comprende una cadena lateral grande;
d) sustitución de A95 por R, L, E o N;
e) sustitución de N97 por un residuo polar o un residuo no polar;
f) sustitución de S98 por un residuo de aminoácido con una cadena lateral pequeña;
g) sustitución de V99 por I;
h) sustitución de L100 por F o V;
i) sustitución de L101 por V o I;
o una combinación de los mismos.
También se proporciona en el presente documento un complejo proteico de CMV que comprende la proteína gL de CMV recombinante, o fragmento, de la invención.
También se proporciona en el presente documento un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para la proteína gL de CMV recombinante, o fragmento, de la invención.
La invención también proporciona una célula huésped, preferiblemente una célula huésped de mamífero, que comprende el ácido nucleico de la invención.
La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende la proteína gL recombinante, o fragmento, de la invención, o el complejo proteico de CMV de la invención.
También se proporciona la composición inmunogénica de la invención para su uso en la inducción de una respuesta
inmunitaria frente a CMV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1A muestra la alineación parcial de secuencias de proteínas gL de diferentes virus del herpes cerca del sitio de reconocimiento de proteasa (s Eq ID NOS 12-15, respectivamente, en orden de aparición). La figura 1B muestra la estructura secundaria del complejo gH/gL de HSV-2 y VZV. La flecha indica el sitio de escisión.
La figura 2A muestra las secuencias parciales de mutantes de gL (SEQ ID NOS 15-26, respectivamente, en orden de aparición). La figura 2B muestra el resultado de la inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos anti-gL. La figura 2C muestra el resultado de la inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos anti-His.
La figura 3 muestra el análisis de inmunotransferencia de tipo Western del pentámero WT (de tipo natural) y mutante LSG usando muestras de proteína o bien no reducidas (NR) o bien reducidas y hervidas (RB).
La figura 4 muestra el análisis de inmunotransferencia de tipo Western del pentámero WT y mutante IDG usando muestras de proteína o bien no reducidas (NR) o bien reducidas y hervidas (RB).
La figura 5A muestra el pentámero WT purificado y el pentámero mutante IDG y LSG. La figura 5B muestra el título de anticuerpos de neutralización (NAB) de suero de ratón inmunizado con pentámero WT, mutante LSG o mutante IDG con adyuvante de MF59.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
1. VISIÓN GENERAL
Tal como se da a conocer y se ejemplifica en el presente documento, los inventores descubrieron que cuando el antígeno gL de citomegalovirus se expresa de manera recombinante y se purifica a partir de un huésped mamífero (tal como una célula CHO o una célula HEK), se escinde una parte significativa de gL (también denominado “corte de gL”) por una proteasa desconocida. De hecho, se observó que se producía corte de gL durante la expresión recombinante y la purificación de tres complejos de CMV diferentes: complejo gH/gL, complejo gH/gL/gO y complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. El corte de gL producía falta de homogeneidad en la producción de antígenos y pérdida potencial de sitios neutralizantes en antígenos basados en gL.
Usando inmunotransferencia de tipo Western y secuenciación N-terminal, los inventores identificaron y mapearon el sitio de escisión para el enlace peptídico entre los residuos 97 y 98 de gL de la cepa Merlin (SEQ ID NO: 1) (figura 1). Para resolver el problema del corte, los inventores estudiaron las características estructurales de las proteínas gL de varios virus del herpes relacionados, incluyendo HSV1, HSV2 y VZV. Las proteínas gL de HSV1, HSV2 y VZV no parecen tener problemas de corte. Basándose en los estudios estructurales, los inventores descubrieron que pueden introducirse mutaciones en el sitio de reconocimiento de proteasa, que comprende los residuos de aminoácido 91 y 102, para reducir la escisión por proteasa de gL expresada de manera recombinante.
Por ejemplo, tal como se ejemplifica en el presente documento, la triple mutación A96L/N97S/S98G (el mutante “LSG”) y la triple mutación A96I/N97D/S98G (el mutante “IDG”) eliminaron sustancialmente el problema del corte de gL. Otros dos mutantes, la deleción del residuo Asn97 (delta Asp97) y A96S/N97S/S98T (el mutante “SST”), también mostraron un corte de gL drásticamente disminuido cuando se coexpresaron gH y gL.
Basándose en el análisis estructural de las proteínas gL de otros virus del herpes (figura 1), parece que el sitio de reconocimiento de proteasa adopta, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, una posible hélice a corta (91VTPE94) (SEQ ID NO: 27), un bucle corto (95AA96) y una estructura de cadena b conservada (97NSVLLD102) (SEC ID NO: 7). La escisión se produce en el extremo N-terminal de la cadena b (figura 1). Una cadena p es una unidad estructural de láminas p en proteínas. Esta es una extensión amplia de la cadena polipeptídica, normalmente de 3 a 10 aminoácidos de largo, que forma enlaces de hidrógeno con otras cadenas p en la misma lámina p. Tal como se muestra en la figura 1, esta cadena p (p4 en la figura 1) junto con las cadenas p5 y p6 de gL, así como las cadenas p de gH, forman una lámina p. Por tanto, en realizaciones preferidas, la mutación debe mantener la estructura secundaria de la parte C-terminal del sitio de reconocimiento de proteasa (es decir, se conserva la conformación de cadena p, tal como las interacciones entre p4 y otras cadenas p que se mantienen sustancialmente). El mantenimiento de la estructura de cadena p puede reducir potencialmente cualquier impacto negativo en el ensamblaje de complejos de CMV (tal como los complejos pentaméricos) y también puede preservar potencialmente epítopos inmunogénicos importantes. Por ejemplo, uno o más residuos del sitio de reconocimiento de proteasa pueden sustituirse por un residuo correspondiente de otro virus del herpes (tal como HSV-1, HSV-2 o VZV). Tal como se muestra en la figura 1, el análisis estructural y de secuencia muestra que la sustitución de un residuo de CMV por un residuo de HSV-1, HSV-2 o VZV correspondiente no cambia la conformación de la cadena p, mientras que puede reducirse la escisión por proteasa. Opcionalmente también puede mantenerse la estructura de bucle corto que precede inmediatamente a la
cadena p (95AA96 en la figura 1).
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación describe una proteína gL de citomegalovirus (CMV) recombinante, o un fragmento de formación de complejo de la misma, en el que dicha proteína gL o fragmento comprende una mutación en el sitio de reconocimiento de proteasa, en el que dicha mutación reduce la escisión por proteasa en dicho sitio de reconocimiento de proteasa, en comparación con un control. El sitio de reconocimiento de proteasa se refiere a los residuos 91-102 (numeración basada en SEQ ID NO: 1). Preferiblemente, la mutación reduce la escisión por proteasa en comparación con un control, sin cambiar la estructura de la cadena p en la parte C-terminal del sitio de reconocimiento de proteasa.
También se describen en el presente documento complejos de CMV que comprenden las proteínas gL o fragmentos descritos en el presente documento. Tales complejos pueden ser el complejo gH/gL, el complejo gH/gL/gO y el complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.
También se describen en el presente documento células huésped para la expresión recombinante de proteínas gL o fragmentos descritos en el presente documento, y complejos de CMV que comprenden proteínas gL o fragmentos descritos en el presente documento. Tal como se indicó, se observó corte de gL en células huésped de mamífero durante el procedimiento de producción recombinante. Por tanto, las mutaciones dadas a conocer en el presente documento son particularmente adecuadas para la producción recombinante de vacunas frente al CMV en huéspedes mamíferos (que son huéspedes preferidos para muchos productos biológicos). Por ejemplo, las células HEK-293 y CHO se han usado durante mucho tiempo para la producción comercial de producción biológica. Por tanto, la incorporación de mutaciones que reducen la escisión de gL puede mejorar la eficacia y el rendimiento de producción, y reducir la formación de productos contaminantes parcialmente degradados.
2. DEFINICIONES
El término “fragmento de formación de complejo” de una proteína de citomegalovirus (CMV) (tal como gL) se refiere a cualquier parte o porción de la proteína que conserva la capacidad de formar un complejo con otra proteína de CMV. Tales complejos incluyen, por ejemplo, complejo dimérico gH/gL, complejo trimérico gH/gL/gO o complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Un “fragmento de formación de pentámero” de una proteína de CMV (tal como gL) se refiere a cualquier parte o porción de la proteína que conserva la capacidad de formar el complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.
Tal como se usa en el presente documento, “complejo pentamérico” o “pentámero” se refiere a un complejo de CMV que comprende cinco subunidades diferentes: gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131. Aunque generalmente se denomina pentámero gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 (o complejo pentamérico que comprende gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131) en la memoria descriptiva, no es necesario que cada una de las cinco subunidades sea de longitud completa; el término también abarca pentámeros formados por fragmentos de formación de complejo de gH, gL, pUL128, pUL130 ypUL131.
El término “mutación” se refiere a la adición, deleción o sustitución de un residuo de aminoácido. El término también incluye modificaciones que introducen un aminoácido que no se produce de manera natural o un análogo de aminoácido en una cadena polipeptídica.
Los residuos de aminoácido cargados incluyen: D, E, K, R y H. Los residuos polares no cargados incluyen: S, T, C, Y, N y Q. Los residuos no polares o hidrófobos incluyen: A, V, L, I, M, W, F y P.
Los residuos de aminoácido que comprenden una cadena lateral grande incluyen: W, F, M, Y, Q, R, E, H y K. Los residuos de aminoácido que carecen de una cadena lateral o que comprenden una cadena lateral pequeña incluyen: G, A, V , S, T, C, D y N.
Un residuo de aminoácido comprende una “cadena lateral voluminosa” cuando la cadena lateral comprende un sustituyente ramificado o cíclico. Los ejemplos de residuos de aminoácido con una cadena lateral voluminosa incluyen triptófano, tirosina, fenilalanina, homofenilalanina, leucina, isoleucina, histidina, 1 -metiltriptófano, a-metiltirosina, ametilfenilalanina, a-metileucina, a-metilisoleucina, a-metilhistidina, ciclopentilalanina , ciclohexilalanina, naftilalanina, etc.
Aunque la presente descripción es aplicable a las proteínas gL que se originan a partir de cualquier cepa de CMV, para facilitar su comprensión, cuando se hace referencia a las posiciones de aminoácido en la presente memoria descriptiva, la numeración se da en relación con la secuencia de aminoácidos de la proteína gL de SEQ ID NO: 1 que se origina a partir de la cepa Merlin, a menos que se indique lo contrario. Sin embargo, la presente divulgación no se limita a la cepa Merlin. Usando las enseñanzas de la presente divulgación, los expertos habituales en la técnica pueden determinar posiciones de aminoácido comparables en una proteína gL de cualquier otra cepa de CMV alineando las secuencias de aminoácidos usando algoritmos de alineación fácilmente disponibles y bien conocidos (tales como
BLAST, que usa configuraciones predeterminadas; ClustalW2, que usa configuraciones predeterminadas; o el algoritmo dado a conocer por Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16(22):10881-10890, que usa parámetros predeterminados). Por consiguiente, cuando se hace referencia a una “proteína gL de CMV”, ha de entenderse como una proteína gL de CMV de cualquier cepa (además de la cepa Merlin). El número real puede tener que ajustarse para las proteínas gL de otras cepas dependiendo de la alineación de la secuencia real.
Por ejemplo, “sitio de reconocimiento de proteasa” se define como que consiste en los residuos de aminoácido 91 102, en particular que consiste en los residuos 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 y 102. Estos números son en relación con la secuencia de aminoácidos de la proteína gL de SEQ ID NO: 1. El sitio de reconocimiento de proteasa de las proteínas gL de otras cepas de CMV, u otros mutantes o variantes de gL, o fragmentos de gL puede determinarse usando programas de alineación de secuencias convencionales que alinean una secuencia de consulta con SEQ ID NO: 1 e identifica residuos que coinciden con 91-102 de SEQ ID NO: 1.
Las posiciones de residuos de aminoácido específicos también se numeran según SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, “S98” se refiere a la posición 98 de SEQ ID NO: 1 (que es una S), así como los residuos correspondientes de otras secuencias de gL (o variantes o fragmentos) que coinciden con S98 de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia está alineada con SEQ ID NO: 1. Por motivos de simplicidad, cualquier residuo de una secuencia de gL (o variante o fragmento) que corresponda a S98 de SEQ ID NO: 1 se denomina S98, aunque la posición real de ese residuo puede ser o no 98, y el residuo real puede ser o no S. Por ejemplo, una sustitución conservativa (por ejemplo, T) puede alinearse con S98 de SEQ ID NO: 1. Una sustitución conservativa normalmente se identifica como “positiva” o “+” mediante BLAST 2.
De manera similar, las mutaciones también se identifican según la numeración de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, S98G significa que cualquier residuo de una secuencia de gL (o variante o fragmento) que corresponde a S98 de SEQ ID NO: 1 está mutado a G.
Un residuo de aminoácido de una secuencia de consulta “corresponde a” una posición designada de una secuencia de referencia (por ejemplo, S98 de SEQ ID NO: 1) cuando, al alinear la secuencia de aminoácidos de consulta con la secuencia de referencia, la posición del residuo coincide con la posición designada. Tales alineaciones pueden realizarse a mano o usando programas de alineación de secuencias bien conocidos como ClustalW2 o “BLAST 2 Sequences” usando parámetros predeterminados.
Un “ “ se refiere a una secuencia que tiene al menos 10 residuos de aminoácido de longitud y es al menos idéntica en el 50% a la SEQ ID NO: 5. Tal como se muestra en la figura 1, para gL de tipo natural de la cepa Merlin, se ha identificado un fragmento de 17 residuos exclusivo para gL de CMV, en comparación con HSV1, HSV2 y VZV (mostrado como “r|1”). Preferiblemente, la región de inserción comprende al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 residuos, y/ o es idéntica en al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% a SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos de la divulgación, la región de inserción comprende una secuencia en la que de uno a ocho residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 5 están sustituidos de manera conservativa.
“Sustituido de manera conservativa” significa que un residuo es reemplazado por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos incluyen la sustitución de residuos de aminoácido con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos. Un ejemplo de sustituciones de aminoácido conservativas incluye las de la siguiente tabla 1 y sustituciones análogas del residuo original por alfa-aminoácidos no naturales que tienen características similares.
Tabla 1
A menos que se especifique lo contrario, el porcentaje de identidad de dos secuencias se determina sobre la longitud total de la más corta de las dos secuencias.
3. PROTEÍNAS GL DE CMV MODIFICADAS Y COMPLEJOS
A. Proteínas gL modificadas
En un aspecto, la divulgación describe una proteína gL de CMV modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, que reduce el corte (escisión) en el enlace peptídico entre los residuos N97 y S98.
La glicoproteína L (gL) del CMV humano está codificada por el gen UL115. Se cree que gL es esencial para la replicación viral y todas las propiedades funcionales conocidas de gL están asociadas directamente con su dimerización con gH. El complejo gH/gL se requiere para la fusión de las membranas viral y plasmática que conduce a la entrada del virus en la célula huésped. Se ha notificado que gL de la cepa Merlin de HCMV (GI:39842115, SEQ ID NO: 1) y la cepa Towne de HCMV (GI:239909463, SEQ ID NO: 2) tienen 278 aminoácidos de longitud. Se ha notificado que gL de la cepa AD169 de HCMV (GI: 2506510, SEQ ID NO: 3) tiene una longitud de 278 aminoácidos, incluye una secuencia señal en su extremo N-terminal (residuos de aminoácido 1-35), tiene dos sitios de N-glicosilación (en los residuos 74 y 114) y carece de un dominio TM (Rigoutsos, I, et al., Journal of Virology 77 (2003): 4326-44). Se predice que la secuencia señal N-terminal en SEQ ID NO: 1 comprende los residuos de aminoácido 1 30. SEQ ID NO: 2 comparte una identidad de aminoácidos del 98% con SEQ ID NO: 1. La secuenciación del gen de gL de longitud completa de 22 a 39 aislados clínicos, así como de las cepas de laboratorio AD169, Towne y Toledo reveló una variación de menos del 2% en las secuencias de aminoácidos entre los aislados (Rasmussen, L, et al., Journal of Virology 76 (2002): 10841 -10888).
Normalmente la secuencia señal N-terminal de las proteínas gL se escinde por una peptidasa señal de la célula huésped para producir proteínas gL maduras. Las proteínas gL en los complejos de membrana de HCMV de la divulgación pueden carecer de secuencias señal N-terminal. Un ejemplo de proteína gL que carece de secuencias señal N-terminal es SEQ ID NO: 4, que carece de una secuencia señal N-terminal y consiste en los residuos de aminoácido 31-278 de SEQ ID NO: 1.
Aunque se cree que gL es esencial para la replicación viral, todas las propiedades funcionales conocidas de gL están asociadas directamente con su dimerización con gH.
Las proteínas gL de la divulgación pueden ser variantes de gL que tienen diversos grados de identidad con SEQ ID NO: 1, tal como idénticas en al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia citada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Las proteínas gL de la divulgación pueden tener diversos grados de identidad con SEQ ID NO: 4 tal como idénticas en al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la secuencia citada en SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos de la divulgación, las proteínas variantes de gL: (i) forman parte del complejo dimérico gH/gL; (ii) forman parte del complejo trimérico gH/gL/gO; (iii) forman parte del
complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131; (iv) comprenden al menos un epítopo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o (v) puede provocar anticuerpos in vivo que reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de CMV.
También se engloban en la divulgación fragmentos de formación de complejo de las proteínas gL descritas en el presente documento. Un fragmento de formación de complejo de gL puede ser cualquier parte o porción de la proteína gL que conserva la capacidad de formar un complejo con otra proteína de CMV. En determinadas realizaciones, un fragmento de formación de complejo de gL forma parte del complejo dimérico gH/gL. En determinadas realizaciones, un fragmento de formación de complejo de gL forma parte del complejo trimérico gH/gL/gO. En determinadas realizaciones, un fragmento de formación de complejo de gL forma parte del complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Un fragmento de formación de complejo de gL puede obtenerse o determinarse mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como el ensayo de co-inmunoprecipitación, entrecruzamiento o co-localización mediante tinción fluorescente, etc. En algunos aspectos de la divulgación, el fragmento de formación de complejo de gL también (i) comprende al menos un epítopo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o (ii) puede provocar anticuerpos in vivo que reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de CMV.
La proteína gL descrita en el presente documento, o un fragmento de formación de complejo de la misma, comprende una mutación en el sitio de reconocimiento de proteasa (residuos 91 -102), en la que dicha mutación reduce la escisión por proteasa en dicho sitio de reconocimiento de proteasa, en comparación con un control.
Pueden usarse una variedad de controles. Puede usarse como control el nivel de escisión por proteasa (en el enlace peptídico entre los residuos 97 y 98) de una gL de tipo natural correspondiente sustancialmente en las mismas condiciones. Alternativamente, un control puede ser un nivel predeterminado o un nivel de umbral (por ejemplo, el 20%, el 25% o el 30% de la proteína gL total). El porcentaje se refiere al porcentaje molar.
Por ejemplo, la mutación puede dar como resultado una reducción en la escisión por proteasa en el enlace peptídico entre los residuos 97 y 98 de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% etc., en comparación con la de tipo natural, cuando se expresa de manera recombinante en una célula huésped de mamífero en condiciones de cultivo convencionales para esa célula huésped.
Alternativamente o además, la escisión por proteasa se reduce al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 75 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces o al menos 100 veces, en comparación con la de tipo natural, cuando se expresa de manera recombinante en una célula huésped de mamífero en condiciones de cultivo convencionales para esa célula huésped.
Alternativamente o además, la mutación puede ser una en la que no más de aproximadamente el 35% de las moléculas de gL, o fragmento de formación de complejo de las mismas, se escinde en un enlace peptídico entre los residuos 97 y 98, cuando se expresan de manera recombinante en una célula huésped de mamífero en una condición de cultivo convencional para esa célula huésped. Por ejemplo, la mutación puede dar como resultado que no más de aproximadamente el 35%, no más de aproximadamente el 30%, no más de aproximadamente el 25%, no más de aproximadamente el 20%, no más de aproximadamente el 15%, no más de aproximadamente el 10%, no más de aproximadamente el 9%, no más de aproximadamente el 8%, no más de aproximadamente el 7%, no más de aproximadamente el 6%, no más de aproximadamente el 5%, no más de aproximadamente el 4%, no más de aproximadamente el 3%, no más de aproximadamente el 2%, o no más de aproximadamente el 1% de las moléculas de gL, o fragmento de formación de complejo de las mismas, se escinden en el enlace peptídico entre los residuos 97 y 98, cuando se expresa de manera recombinante en una célula huésped de mamífero en condiciones de cultivo convencionales para esa célula huésped. El porcentaje se refiere al porcentaje molar.
Se conocen las condiciones de cultivo convencionales para las células huésped de mamífero usadas habitualmente. Por ejemplo, para una célula CHO, una condición de cultivo convencional puede ser una temperatura de 36,5°C en un medio de pH 7,0, con <10% de CO2. En un ejemplo específico, se transfectaron células Expi293 para expresar el complejo pentamérico (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131) a 37°C y en pH 7,0 con un 8% de CO2 durante tres días, y los sobrenadantes del cultivo celular se purificaron por afinidad y se analizaron con inmunotransferencias de tipo Western, tal como se muestra en los ejemplos a continuación.
La mutación comprende adición, deleción, sustitución, o una combinación de las mismas, de un residuo de aminoácido. Preferiblemente, la mutación conserva sustancialmente la estructura secundaria de la parte C-terminal del sitio de reconocimiento de proteasa. En particular, tal como se muestra en la figura 1, los residuos de la parte C-terminal de dicho sitio de reconocimiento de proteasa forman una cadena p, que se cree que interacciona con otras cadenas p para formar una lámina p. Preferiblemente, dicha mutación mantiene esta conformación de cadena p. Las posibles ventajas de mantener la estructura secundaria incluyen, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de complejos que
contienen gL (por ejemplo, gH/gL, gH/gL/gO o gH/gL/pIL128/pUL130/pUL131) y mantener epítopos inmunogénicos clave. Opcionalmente, también se conserva la estructura de bucle corto que precede inmediatamente a la cadena p.
Muchos programas informáticos y algoritmos están disponibles para predecir la estructura secundaria, incluyendo I-TASSER, HHpred, RaptorX, MODELLER, SWISS-MODEL, Robetta Beta, SPARKSx, PEP-FOLD, Phyre y Phyre2, RAPTOR, QUARK, Abalone, Foldit, etc. Si una mutación cambia la estructura secundaria del sitio de reconocimiento de proteasa, puede analizarse usando estas herramientas.
En algunos aspectos de la divulgación, la mutación comprende la adición de uno o más residuos de aminoácido. Por ejemplo, la mutación puede comprender la adición de dos a cinco residuos de aminoácido. Los dos a cinco residuos de aminoácido pueden comprender tanto residuos polares como residuos no polares.
En aspectos adicionales de la divulgación, la mutación comprende la adición de uno o más residuos entre los residuos N97 y S98. Tal como se muestra en los ejemplos, el enlace peptídico entre N97 y S98 se escinde por una proteasa; por tanto, la introducción de uno o más residuos adicionales entre N97 y S98 puede dar como resultado una gL mutante (o fragmento) que es más resistente a la escisión. En una realización a modo de ejemplo, la mutación comprende la adición de F, Q, o una combinación de los mismos, entre los residuos 97 y 98. En una realización a modo de ejemplo, la mutación comprende la adición de FQ o QF entre los residuos 97 y 98.
En aspectos adicionales de la divulgación, la mutación comprende la deleción de uno o más residuos de aminoácido, tal como la deleción de uno a tres residuos de aminoácido. La mutación puede comprender la deleción de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: V91, T92, P93, E94, A95, A96, N97, S98, V99, L100, L101, D102, y una combinación de los mismos. La mutación puede comprender la deleción de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: E94, A95, A96, N97, S98, V99, L100, L101, D102 y una combinación de los mismos. En una realización a modo de ejemplo, la mutación comprende la deleción de al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en: A96, N97, S98, y una combinación de los mismos. La mutación puede comprender la deleción de N97.
La mutación puede comprender sustituir un residuo por un residuo correspondiente de la proteína gL de otro virus del herpes. La familia del virus del herpes (Herpesviridae) incluye, por ejemplo, los virus del herpes simple 1 y 2 (HSV-1 o HHV-1, HSV-2 o HHV-2), el virus de la varicela-zóster (v Zv o HHV-3), el virus de Epstein-Barr (EBV o HHV-4), el virus del herpes humano 6 (HHV-6), el virus del herpes humano 7 (HHV-7) y el virus del herpes asociado con el sarcoma de Kaposi (HHV-8). En determinadas realizaciones, la proteína gL de otro virus del herpes es la proteína gL de HSV1, HSV2, VZV, EBV, PrV o el virus del herpes bovino 5.
Una posible ventaja de sustituir un residuo de CMV por un residuo correspondiente de otro virus del herpes es que probablemente se conservará la estructura secundaria del sitio de reconocimiento de proteasa. Tal como se muestra en la figura 1, HSV-1, HSV-2 y VZV comparten sustancialmente la misma estructura secundaria, especialmente la parte C-terminal de los sitios de reconocimiento de proteasa adopta una estructura de cadena p.
Si se realizan múltiples sustituciones, no es necesario que procedan del mismo virus del herpes. Por ejemplo, puede sustituirse un primer residuo de CMV por el residuo correspondiente de HSV-1, un segundo residuo por el residuo correspondiente de HSV-2 y/o un tercer residuo de CMV por el residuo correspondiente de VZV, etc. Por tanto, la mutación puede comprender un primer residuo de aminoácido sustituido por un residuo correspondiente de una primera proteína gL de otro virus del herpes, y un segundo residuo de aminoácido sustituido por un residuo correspondiente de una segunda proteína gL de otro virus del herpes, y/o un tercer residuo de aminoácido sustituido por un residuo correspondiente de una tercera proteína gL de otro virus del herpes, etc.
La mutación puede comprender sustituir E94 por A.
La mutación puede comprender sustituir A95 por R, L o N.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir A96 por un residuo no polar o por un residuo que comprende una cadena lateral grande, tal como W, F o M. En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir A96 por I, L o S.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir N97 por un residuo polar o un residuo no polar. El residuo polar puede comprender una cadena lateral pequeña o una cadena lateral grande. La mutación puede comprender sustituir N97 por S, D, E, A o Y.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir S98 por un residuo de aminoácido con una cadena lateral pequeña, tal como G, A, V, S, T, C, D o N. En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir S98 por G, T, V o I.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir V99 por I.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir L100 por F o V.
En determinadas realizaciones, la mutación comprende sustituir L101 por V.
La adición, deleción y sustituciones descritas en el presente documento pueden usarse individualmente, o en cualquier combinación. Por ejemplo, el mutante de gL puede comprender una adición en una posición, una deleción en una segunda posición, y una sustitución en una tercera posición.
En el presente documento también se describe una proteína gL o un fragmento que comprende una región de inserción en el extremo N-terminal del sitio de reconocimiento de proteasa. Tal como se muestra en la figura 1, en comparación con las proteínas gL de HSV-1, HSV-2 y ZVZ, la proteína gL de CMV comprende un elemento de inserción adicional de 17 residuos. Tal como se muestra en los ejemplos, cuando este elemento de inserción de 17 residuos se delecionó parcial o totalmente, la proteína gL se volvió más propensa a la escisión por proteasa. Por tanto, el elemento de inserción de 17 residuos parece bloquear al menos parcialmente el acceso de la proteasa al sitio de reconocimiento de proteasa. Por tanto, puede ser deseable mantener una región de inserción en el extremo N-terminal del sitio de reconocimiento de proteasa. Una “región de inserción” debe tener al menos 10 residuos de aminoácido de largo y ser idéntico en al menos el 50% a SEQ ID NO: 5 (que es el fragmento original de 17 residuos exclusivo para gL de CMV, en comparación con HSV1, HSV2 y VZV).
La mutación puede comprender introducir un residuo de aminoácido que no se produce de manera natural, que se cree que reduce la escisión por proteasa.
La mutación puede comprender introducir un residuo de aminoácido que comprende una cadena lateral voluminosa, que se cree que bloquea al menos parcialmente el acceso de la proteasa al sitio de reconocimiento de proteasa y reduce la escisión por proteasa.
B. Complejos proteicos de CMV
En otro aspecto, la invención proporciona un complejo que comprende la proteína gL de CMV modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, de la invención. Tales complejos pueden incluir, por ejemplo, (i) complejos diméricos aislados que comprenden: la proteína gL modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, descrita en el presente documento, y proteínas gH de CMV o un fragmento de formación de complejo de las mismas; (ii) complejo trimérico aislado que comprende la proteína gL modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, descrita en el presente documento, y proteínas gH de CMV o un fragmento de formación de complejo de las mismas, y gO o un fragmento de formación de complejo de la misma; y (iii) complejos pentaméricos aislados que comprenden la proteína gL modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, descrita en el presente documento, y proteínas pUL128 de CMV o un fragmento de formación de complejo de las mismas, pUL130 o un fragmento de formación de complejo de la misma, pUL131 o un fragmento de formación de complejo de la misma, y gH o un fragmento de formación de complejo de la misma. También puede incluirse cualquier otro complejo que comprende gL (o un fragmento de formación de complejo de la misma) como componente.
Aunque gH, gL, gO, pUL128, pUL130, pUL131 pueden denominarse glicoproteínas, no debe considerarse que esta nomenclatura significa que estas proteínas deben estar glicosiladas cuando se usan con la invención. Por el contrario, uno o más polipéptidos pueden no estar glicosilados. Sin embargo, habitualmente uno o más (o todos) los polipéptidos en un complejo de la descripción están glicosilados. Uno o más (o todos) los polipéptidos en un complejo de la divulgación se glicosilan mediante mutantes de glicosilación de células cultivadas, tales como células de mamífero mutadas. Tales mutantes de glicosilación producen un patrón de glicosilación de polipéptido que difiere de un patrón de glicosilación de tipo natural, es decir, las glicoformas polipeptídicas resultantes difieren de las glicoformas de tipo natural.
El patrón de glicosilación de gL (o un fragmento de formación de complejo de la misma) o un complejo que comprende gL (o un fragmento de formación de complejo de la misma) puede tener un patrón de glicosilación de mamífero; y/o puede no tener un patrón de glicosilación de células de insecto. Una o más de las proteínas del complejo contienen cadenas laterales unidas a N complejas con una penúltima galactosa y ácido siálico terminal.
Para la producción recombinante de complejos proteicos (tales como complejos pentaméricos), puede ser deseable que el complejo sea soluble. Basándose en el análisis de secuencias, la proteína gH de CMV comprende un dominio transmembrana (TM), pero gL, gO, pUL128, pUL130 y pUL131 no tienen dominios transmembrana. Por tanto, para producir un complejo soluble (por ejemplo, un complejo pentamérico), la subunidad gH del complejo pentamérico puede carecer del dominio TM. Por ejemplo, puede usarse un fragmento de gH que comprende la secuencia señal N-terminal y el ectodominio, pero no el dominio TM, de gH.
La gH de la cepa Towne de CMV se muestra como SEQ ID NO: 6 (GI:138314, 742 residuos de aminoácido). gH de Towne se ha caracterizado por tener: (i) seis sitios de N-glicosilación (en los residuos 55, 62, 67, 192, 641 y 700); (ii) una secuencia señal hidrófoba en su extremo N-terminal (residuos de aminoácido 1 -23); (iii) un ectodominio (residuos 24-717) que sobresale fuera de la célula hacia el espacio extracelular; (iv) un dominio transmembrana (TM) hidrófobo (residuos 718-736); y (v) un dominio citoplasmático C-terminal (residuos 737-742). Los dominios TM de las proteínas gH de otras cepas, o de otras variantes y fragmentos de gH, pueden identificarse según el alineamiento de secuencias.
Para facilitar la producción, el complejo de CMV producido de manera recombinante (tal como el complejo pentamérico) puede secretarse desde la célula huésped al medio de cultivo.
Dicho complejo pentamérico se secreta desde la célula huésped. Se ha notificado que la presencia de las cinco subunidades, gH, gL, pUL128, pUL131 y pUL131, es suficiente para el ensamblaje del complejo pentamérico en el RE antes de exportarse al aparato de Golgi. Véase, Ryckman etal., J Virol. enero de 2008; 82(1): 60-70. Alternativamente o además, puede usarse un péptido señal apropiado en una o más de las cinco subunidades (por ejemplo, obteniendo una proteína de fusión con una señal secretora). Las secuencias señal (y el casete de expresión) para producir proteínas secretoras se conocen en la técnica anterior. En general, los péptidos líder tienen una longitud de 5 a 30 aminoácidos y normalmente están presentes en el extremo N-terminal de una proteína recién sintetizada. El núcleo del péptido señal generalmente contiene una extensión larga de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una sola hélice alfa. Además, muchos péptidos señal comienzan con una extensión corta de aminoácidos cargados positivamente, lo que puede ayudar a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido señal, normalmente hay una extensión de aminoácidos que la peptidasa señal reconoce y escinde. La peptidasa señal puede escindirse o bien durante o bien después de la finalización de la translocación para generar un péptido señal libre y una proteína madura.
C. Ácido nucleico que codifica para proteínas gL modificadas y complejos
En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para la proteína gL modificada, o un fragmento de formación de complejo de la misma, de la invención. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN.
El ácido nucleico puede ser ADN. Los sistemas de expresión basados en ADN para la expresión y purificación de proteínas recombinantes se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el sistema de expresión puede ser un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la gL modificada o el fragmento de gL que se describe en el presente documento, que se une operativamente a una secuencia de control de expresión que regula la expresión de la gL modificada o fragmento de gL en una célula huésped, tal como una célula huésped de mamífero, una célula huésped bacteriana o una célula huésped de insecto. La secuencia de control de expresión puede ser un promotor, un potenciador, un sitio de entrada al ribosoma o una secuencia de poliadenilación, por ejemplo. Otras secuencias de control de expresión descritas en la divulgación incluyen intrones y secuencias 3’ UTR.
La proteína gL modificada expresada de manera recombinante o un fragmento de la misma, o un complejo que comprende la proteína gL modificada o un fragmento de la misma, puede purificarse usando métodos descritos en el presente documento, tales como los métodos de purificación dados a conocer en el documento WO 2014/005959, u otros métodos conocidos en la técnica.
La molécula de ácido nucleico puede ser un vector derivado de un adenovirus, un virus adenoasociado, un lentivirus o un alfavirus. La molécula de ácido nucleico es un vector viral de replicación deficiente.
El ácido nucleico puede ser ARN. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARN autorreplicante, tal como un replicón de ARN derivado de un alfavirus.
Las moléculas de ARN autorreplicantes se conocen bien en la técnica y pueden producirse usando elementos de replicación derivados de, por ejemplo, alfavirus, y sustituyendo las proteínas virales estructurales por una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de interés. Una molécula de ARN autorreplicante normalmente es una molécula de cadena positiva que puede traducirse directamente después la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que entonces produce transcritos tanto antisentido como sentido a partir del ARN administrado. Por tanto, el ARN administrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos ARN hijos, así como los transcritos subgenómicos colineales, pueden traducirse para proporcionar la expresión in situ de un antígeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar la expresión in situ del antígeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es una enorme amplificación en el número de ARN replicones introducidos y, por tanto, el antígeno codificado se convierte en un producto polipeptídico principal de las células. Las células transfectadas con ARN autorreplicante producen brevemente antígeno antes de sufrir una muerte apoptótica. Esta muerte es un resultado probable de los productos intermedios de ARN bicatenarios (bc) requeridos, que también se ha demostrado que superactivan células dendríticas. Por tanto, la inmunogenicidad mejorada del ARN
autorreplicante puede ser el resultado de la producción de ARNbc proinflamatorio, que imita una infección de las células huésped por un virus ARN.
Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación de esta manera es usar un replicón basado en alfavirus. Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos por artrópodos relacionados genética, estructural y serológicamente de la familia Togaviridae. Se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos dentro del género alfavirus, incluyendo el virus Sindbis, el virus del bosque Semliki, el virus del río Ross y el virus de la encefalitis equina venezolana. Como tal, el ARN autorreplicante de la divulgación puede incorporar una ARN replicasa derivada del virus del bosque Semliki (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus del río Ross (RRV), el virus de la encefalitis equina del este u otros virus que pertenecen a la familia de los alfavirus.
En la invención pueden usarse vectores de expresión de “replicón” basados en alfavirus. Los vectores de replicón pueden utilizarse en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partículas de replicón recombinantes. Tales vectores de replicón se han derivado de alfavirus que incluyen, por ejemplo, el virus Sindbis (Xiong et al. (1989) Science 243: 1188 1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), el virus del bosque Semliki (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9: 1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), y el virus de la encefalitis equina venezolana (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). Los replicones derivados de alfavirus generalmente son bastante similares en las características generales (por ejemplo, estructura, replicación), los alfavirus individuales pueden mostrar alguna propiedad particular (por ejemplo, unión al receptor, sensibilidad al interferón y perfil de enfermedad) que es única. Por tanto, también pueden ser útiles los replicones de alfavirus quiméricos obtenidos a partir de familias de virus divergentes.
Las proteínas gL de CMV (o fragmentos de las mismas) descritas en el presente documento pueden administrarse usando partículas de replicón de alfavirus (VRP). Una “partícula de replicón de alfavirus” (VRP) o “partícula de replicón” es un replicón de alfavirus empaquetado con proteínas estructurales de alfavirus.
Los usos del replicón de ARN basado en alfavirus se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, el documento WO 2013006837, párrafos [0155] a [0179]. El replicón de ARN puede administrarse sin necesidad de purificación de la proteína codificada en el mismo.
La molécula de ácido nucleico puede formar parte de un vector derivado de un adenovirus. El genoma de adenovirus es una molécula de ADN bicatenaria lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases con la proteína terminal de 55 kDa unida covalentemente al extremo 5’ de cada cadena. El ADN adenoviral (“Ad”) contiene repeticiones terminales invertidas (“ITR”) idénticas de aproximadamente 100 pares de bases con la longitud exacta dependiendo del serotipo. Los orígenes virales de replicación se encuentran dentro de las ITR exactamente en los extremos del genoma. Los vectores adenovirales pueden derivarse de cualquiera de los diversos serotipos adenovirales incluyendo, sin limitación, cualquiera de las más de 40 cepas de serotipos de adenovirus, tales como los serotipos 2, 5, 12, 40 y 41.
La molécula de ácido nucleico puede formar parte de un vector derivado de un virus adenoasociado (AAV). El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenaria lineal que contiene aproximadamente 4681 nucleótidos. El genoma de AAV comprende generalmente un genoma interno sin repetición flanqueado en cada extremo por repeticiones terminales invertidas (ITR). Las ITR tienen aproximadamente una longitud de 145 pares de bases (pb). Las ITR tienen múltiples funciones, incluyendo la de servir como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el genoma viral. AAV es un virus dependiente de virus auxiliar; es decir, requiere la coinfección con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus o vaccinia) con el fin de formar viriones de AAV en estado natural. En ausencia de coinfección con un virus auxiliar, AAV establece un estado latente en el que el genoma viral se inserta en el cromosoma de una célula huésped, pero no se producen viriones infecciosos. La infección posterior por un virus auxiliar rescata el genoma integrado, permitiendo que se replique y que empaquete su genoma para dar viriones de AAV infecciosos. Aunque AAV puede infectar células de diferentes especies, el virus auxiliar debe ser de la misma especie que la célula huésped. Así, por ejemplo, el AAV humano se replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino.
La molécula de ácido nucleico puede formar parte de un vector derivado de retrovirus. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la técnica. El virus recombinante puede aislarse y administrarse entonces a las células del sujeto o bien in vivo o bien ex vivo. Se han descrito varios sistemas retrovirales. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n°. 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-90; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1 :5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-52; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-37; Boris-Lawrie y Temin (1993) Curr. Opin. Genet. Develop. 3 : 102-09.
La divulgación también describe células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico dadas a conocer en el presente documento. Se conocen en la técnica las células huésped adecuadas para albergar las moléculas de ácido nucleico y/o para expresar proteínas recombinantes y los métodos de introducción de un ácido nucleico en una célula huésped adecuada.
4. PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE PROTEÍNAS GL Y COMPLEJOS
La invención también proporciona una célula huésped que comprende los ácidos nucleicos que codifican para la proteína gL y fragmento de la misma, de la invención.
Preferiblemente, las células huésped son células de mamífero (por ejemplo, ser humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato y roedor (por ejemplo, hámster)) y células de aves (por ejemplo, pollo, pato y ganso). Las células de mamífero incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (células HEK-293, normalmente transformadas por ADN de adenovirus tipo 5 cizallado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa , células PERC.6 (número de depósito de ECACC, 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células de pulmón de feto de macaco (ATCC CL-160), células de riñón bovino Madin-Darby (“MDBK”), células de riñón canino Madin-Darby (“MDCK”) (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células de riñón de hámster recién nacido (BHK), tales como Bh K21-F, células HKCC y similares.
La célula huésped puede ser una célula HEK-293. La célula huésped puede ser una célula CHO. El polinucleótido que codifica para la proteína gL (o fragmento de la misma) descrito en el presente documento puede integrarse en el ADN genómico de la célula CHO. Para la producción recombinante de un complejo proteico de CMV, la secuencia de nucleótidos que codifica otras subunidades del complejo también debe integrarse en el ADN genómico de la célula CHO.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la célula huésped comprende una o más secuencias de polinucleótido que codifican para el complejo pentamérico de CMV, comprendiendo dicho complejo pentamérico: gH o un fragmento de formación de pentámero de la misma, gL o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL128 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL130 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, y pUL131 o un fragmento de formación de pentámero de la misma. En algunos aspectos de la divulgación, la una o más secuencias de polinucleótido que codifican para el complejo pentamérico de CMV se integran en el ADN genómico de dicha célula huésped. En algunos aspectos de la divulgación, la célula huésped, cuando se cultiva en una condición adecuada, expresa dicho complejo pentamérico de CMV (que preferiblemente es soluble y/o se secreta a partir de la célula huésped).
En la tabla 2 se enumeran las líneas de células CHO a modo de ejemplos disponibles en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Puede usarse cualquier célula CHO enumerada en la tabla 2.
Tabla 2
También están disponibles diversas líneas de células CHO de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), tal como las líneas de células CHO hCBE11 (ATCC® PTA-3357™), E77.4 (ATCC® PTA-3765™), hLT-B: R-hG1 CHO #14 (ATCC® CRL-11965™), MOR-CHO- MORAb-003-RCB (ATCC® PTA-7552™), AQ.C2 clon 11B (ATCC® PTA-3274™), AQ.C2 clon 11 B (ATCC® PTA-3274™), hsAQC2 en CHO-DG44 (ATCC® PTA-3356™), xrs5 (ATCC® CRL-2348™), CHO-K1 (ATCC® CCL-61™), Lec1 [denominado originalmente Pro-5WgaRI3C] (ATCC® CRL-1735™), Pro-5 (ATCC® CRL-1781™), ACY1-E (ATCC® 65421™), ACY1-E (ATCC® 65420™), pgsE-606 (ATCC® CRL-2246™), CHO-CD36 (ATCC® CRL-2092™), pgsC-605 (ATCC® CRL-2245™), MC2/3 (ATCC® CRL-2143™), CHO-ICAM-1 (ATCC® CRL-2093™), y pgsB-618 (ATCC® CRL-2241™). Puede usarse cualquiera de estas líneas de células CHO.
Otras líneas de células CHO disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, las células CHO Freestyle™ y la línea de células CHO Flp-En™ de Life Technologies.
Otras células huésped adecuadas incluyen, por ejemplo, una célula CHO en la que se reduce el nivel de expresión o la actividad de la proteína C12orf35, en comparación con un control (véase, por ejemplo, el documento WO2015/092735, que proporciona una descripción detallada de células de mamíferos en las que el nivel de expresión o la actividad de la proteína C12orf35 se reduce en comparación con un control), una célula CHO en la que el nivel de expresión o la actividad de la proteína FAM60A se reduce en comparación con un control (véase, por ejemplo, el documento WO2015/092737, que proporciona una descripción detallada de células de mamíferos en las que se reduce el nivel de expresión o la actividad de la proteína FAM60A); una célula CHO en la que se reduce el nivel de expresión o la actividad de matriptasa, en comparación con un control (solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/985.589, presentada el 29 de abril de 2014, y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/994.310, presentada el 16 de mayo de 2014, proporciona una descripción detallada de células de mamíferos en las que se reduce el nivel de expresión o la actividad de matriptasa).
Se han descrito en general métodos para expresar proteínas recombinantes en células CHO. Véase, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.° 4.816.567 y n.° 5.981.214.
La solicitud de patente europea EP14191385,5 presentada el 31 de octubre de 2014 da a conocer células huésped de mamífero, en particular, células CHO, en las que la(s) secuencia(s) que codifica(n) para las proteínas gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 de CMV (o un fragmento de formación de complejo de las mismas) están integradas de manera estable en el genoma.
También se describe en el presente documento un cultivo celular que comprende la célula huésped descrita en el presente documento. El cultivo celular puede ser a gran escala, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 L, al menos aproximadamente 20 L, al menos aproximadamente 30 L, al menos aproximadamente 40 L, al menos aproximadamente 50 L, al menos aproximadamente 60 L, al menos aproximadamente 70 L, al menos aproximadamente 80 L, al menos aproximadamente 90 L, al menos aproximadamente 100 L, al menos aproximadamente 150 L, al menos aproximadamente 200 L, al menos aproximadamente 250 L, al menos aproximadamente 300 L, al menos aproximadamente 400 L, al menos aproximadamente 500 L, al menos aproximadamente 600 L, al menos aproximadamente 700 L, al menos aproximadamente 800 L, al menos aproximadamente 900 L, al menos aproximadamente 1000 L, al menos aproximadamente 2000 L, al menos aproximadamente 3000 L, al menos aproximadamente 4000 L, al menos aproximadamente 5000 L, al menos aproximadamente 6000 L, al menos aproximadamente 10.000 L, al menos aproximadamente 15.000 L, al menos aproximadamente 20.000 L, al menos aproximadamente 25.000 L, al menos aproximadamente 30.000 L, al menos aproximadamente 35.000 L, al menos aproximadamente 40.000 L, al menos aproximadamente 45.000 L, al menos aproximadamente 50.000 L, al menos aproximadamente 55.000 L, al menos aproximadamente 60.000 L, al menos aproximadamente 65.000 L, al menos aproximadamente 70.000 L, al menos aproximadamente 75.000 L, al menos aproximadamente 80.000 L, al menos aproximadamente 85.000 L, al menos aproximadamente 90.000 L, al menos
aproximadamente 95.000 L, al menos aproximadamente 100.000 L, etc.
En algunos aspectos de la divulgación, el rendimiento del complejo de CMV (tal como el complejo pentamérico) es de al menos aproximadamente 0,01 g/L, al menos aproximadamente 0,02 g/L, al menos aproximadamente 0,03 g/L, al menos aproximadamente 0,05 g/L, al menos aproximadamente 0,06 g/L, al menos aproximadamente 0,07 g/L, al menos aproximadamente 0,08 g/L, al menos aproximadamente 0,09 g/L, al menos aproximadamente 0,1 g/L, al menos aproximadamente 0,15 g/L, al menos aproximadamente 0,20 g/L, al menos aproximadamente 0,25 g/L, al menos aproximadamente 0,3 g/L, al menos aproximadamente 0,35 g/L, al menos aproximadamente 0,4 g/L, al menos aproximadamente 0,45 g/L, al menos aproximadamente 0,5 g/L, al menos aproximadamente 0,55 g/L, al menos aproximadamente 0,6 g/L, al menos aproximadamente 0,65 g/L, al menos aproximadamente 0,7 g/L, al menos aproximadamente 0,75 g/L, al menos aproximadamente 0,8 g/L, al menos aproximadamente 0,85 g/L, al menos aproximadamente 0,9 g/L, al menos aproximadamente 0,95 g/L, o al menos aproximadamente 1,0 g/L.
También se describe en el presente documento un procedimiento para producir una proteína gL de citomegalovirus (CMV), o un fragmento de la misma, o un complejo que comprende dicha proteína gL o fragmento, que comprende: (i) poner en cultivo la célula huésped descrita en el presente documento en condiciones adecuadas, expresando de ese modo dicha proteína gL, o fragmento de la misma; y (ii) recoger dicha proteína gL, o fragmento de la misma, o el complejo que comprende dicha proteína gL o fragmento, del cultivo.
En algunos aspectos de la divulgación, se purifica la proteína gL (o fragmento de la misma), o el complejo que comprende un complejo que comprende dicha proteína gL o fragmento descrito en el presente documento. La proteína gL (o un fragmento de la misma) puede purificarse usando cualquier método adecuado, tal como HPLC, diversos tipos de cromatografía (tal como de interacción hidrófoba, de intercambio iónico, de afinidad, de quelación y de exclusión molecular), electroforesis, centrifugación en gradiente de densidad, extracción con disolvente, o similar.
Por ejemplo, puede usarse intercambio iónico para purificar la proteína gL (o fragmento de la misma), o un complejo que comprende un complejo que comprende dicha proteína gL o fragmento. Los ejemplos de materiales útiles en la cromatografía de intercambio iónico incluyen DEAE-celulosa, QAE-celulosa, DEAE-cefalosa, QAE-cefalosa, DEAE-Toyopearl, QAE-Toyopearl, Mono Q, Mono S, Q sepharose, SP sepharose, etc. En un aspecto de la divulgación, el método usa una columna Mono S. En otro aspecto, el método usa una columna Mono Q.
Alternativamente o además, puede usarse la purificación basada en afinidad. Los ejemplos de etiquetas de purificación por afinidad incluyen, por ejemplo, etiqueta de His (se une a un ion metálico), un anticuerpo (se une a la proteína A o a la proteína G), proteína de unión a maltosa (MBP) (se une a amilosa), glutatión-S-transferasa (GST) (se une a glutatión), etiqueta FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO: 8) (se une a un anticuerpo anti-etiqueta), etiqueta Strep (se une a estreptavidina o a un derivado de la misma).
Un aspecto a modo de ejemplo de la divulgación es la etiqueta Strep (o etiqueta de afinidad por estreptavidina), una etiqueta que se une a estreptavidina o a un derivado de la misma, tal como Strep-Tactin. La etiqueta Strep comprende un péptido de nueve aminoácidos: Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 9), u ocho aminoácidos (también denominada etiqueta Strep II): Trp- Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ Id NO: 10). La elución de una proteína unida a una etiqueta Strep de la columna puede realizarse usando biotina o un derivado u homólogo de la misma, tal como destiobiotina.
La etiqueta de purificación por afinidad puede unirse mediante cualquier medio adecuado y puede unirse directa o indirectamente. Por ejemplo, la etiqueta puede unirse covalentemente al extremo N-terminal de la secuencia polipeptídica, o al extremo C-terminal de la secuencia polipeptídica. Esto puede lograrse mediante la expresión recombinante de una proteína de fusión que comprende el polipéptido y la etiqueta, o mediante técnicas de conjugación convencionales que unen el polipéptido a la etiqueta. La etiqueta puede unirse al grupo funcional de cadena lateral de un residuo de aminoácido del polipéptido usando técnicas de conjugación convencionales. Alternativamente, la etiqueta puede unirse de manera no covalente.
La unión de la etiqueta puede ser directa o indirecta (a través de un ligador). Los ligadores adecuados los conocen los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ligadores de carbono de cadena lineal o ramificada, ligadores de carbono heterocíclicos, ligadores de hidratos de carbono y ligadores de polipéptidos.
En algunos aspectos de la descripción, pueden usarse ligadores escindibles para unir la molécula de interés a la etiqueta. Esto permite que la etiqueta se separe del complejo purificado, por ejemplo, mediante la adición de un agente capaz de escindir el ligador. Los expertos en la técnica conocen una serie de ligadores escindibles diferentes. Tales ligadores pueden escindirse, por ejemplo, por irradiación de un enlace fotolábil o hidrólisis catalizada por ácido. También existen ligadores polipeptídicos que incorporan un sitio de reconocimiento de proteasa y que pueden escindirse mediante la adición de una enzima proteasa adecuada.
Cuando se purifica un complejo que comprende la proteína gL (o un fragmento de la misma), la etiqueta puede unirse
a otro(s) constituyente(s) del complejo. Por ejemplo, cuando se purifica el complejo pentamérico de CMV, puede unirse una etiqueta a pUL128, pUL130 o pUL131.
5. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN
La divulgación también describe composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas, los complejos y los ácidos nucleicos de CMV descritos en el presente documento. La divulgación también describe composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos que codifican para proteínas, complejos y ácidos nucleicos de CMV descritos en el presente documento.
Las proteínas, los complejos y los ácidos nucleicos de CMV descritos en el presente documento pueden incorporarse en una composición inmunogénica o una composición de vacuna. Tales composiciones pueden usarse para generar anticuerpos en un mamífero (por ejemplo, un ser humano).
La descripción describe composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas, los complejos y los ácidos nucleicos de CMV descritos en el presente documento, y procedimientos para obtener una composición farmacéutica que implican combinar las proteínas, los complejos y los ácidos nucleicos de CMV descritos en el presente documento con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación normalmente incluyen un portador farmacéuticamente aceptable, y una discusión detallada de tales portadores está disponible en Remington: The Science and Practice of Pharmacy.
El pH de la composición habitualmente es de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 11, tal como entre aproximadamente 5 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10,5, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 10,5, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10,5, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9,5, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 9,5, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9,5, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10, aproximadamente 10,5, aproximadamente 11, etc. El pH estable puede mantenerse mediante el uso de un tampón, por ejemplo un tampón Tris, un tampón citrato, un tampón fosfato o un tampón de histidina. Por tanto, una composición generalmente incluirá un tampón.
Una composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.
Una composición comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de su(s) antígeno(s). Una “cantidad inmunológicamente eficaz” es una cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para provocar una respuesta de anticuerpos contra el antígeno. Esta cantidad puede variar dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que va a tratarse, de su edad, de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación de la situación médica por parte del médico que trata y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. El contenido de antígeno de las composiciones de la divulgación se expresará generalmente en términos de masa de proteína por dosis. Puede ser útil una dosis de 10-500 mg (por ejemplo, 50 mg) por antígeno.
Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un adyuvante inmunológico. Los adyuvantes a modo de ejemplo incluyen composiciones que contienen minerales; emulsiones de aceite; formulaciones de saponina; virosomas y partículas similares a virus; derivados bacterianos o microbianos; bioadhesivos y mucoadhesivos; liposomas; formulaciones de polioxietilén éter y éster de polioxietileno; polifosfaceno (pcpp); péptidos de muramilo; compuestos de imidazoquinolona; compuestos de tiosemicarbazona; compuestos de triptantrina; inmunomoduladores humanos; lipopéptidos; benzonaftiridinas; micropartículas; polinucleótido inmunoestimulador (tal como ARN o ADN; por ejemplo, oligonucleótidos que contienen CpG).
Por ejemplo, la composición puede incluir un adyuvante de sal de aluminio, una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, tal como MF59 o AS03), un agonista de TLR7 (tal como imidazoquinolina o imiquimod), o una combinación de los mismos. Las sales de aluminio adecuadas incluyen hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de Vaccine Design (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), o mezclas de los
mismos. Las sales pueden adoptar cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), siendo un ejemplo la adsorción del antígeno a la sal. La concentración de Al+3 en una composición para administración a un paciente puede ser menor de 5 mg/ml, por ejemplo <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es de entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis. Los adyuvantes de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio son adecuados para su uso con la invención.
Un adyuvante inmunológico adecuado comprende un compuesto de fórmula (I) tal como se define en el documento WO2011/027222, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, adsorbido en una sal de aluminio. Pueden usarse muchos adyuvantes adicionales, incluyendo cualquiera de los dados a conocer en Powell & Newman (1995).
Las composiciones pueden incluir un agente antimicrobiano, en particular, cuando se envasan en formato de dosis múltiples. Los agentes antimicrobianos tales como timerosal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en vacunas, pero a veces puede ser deseable usar o bien un conservante libre de mercurio o bien ningún conservante en absoluto.
Las composiciones pueden comprender detergente, por ejemplo un polisorbato, tal como polisorbato 80. Los detergentes generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo <0,01%.
Las composiciones pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Es típica una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.
En otro aspecto, la divulgación describe un método de inducción de una respuesta inmunitaria frente a citomegalovirus (CMV), que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica descrita en el presente documento, que comprende proteínas, moléculas de ADN, moléculas de ARN ( por ejemplo, moléculas de ARN autorreplicantes) o VRP, tal como se describió anteriormente.
En algunos aspectos de la divulgación, la respuesta inmunitaria comprende la producción de anticuerpos neutralizantes frente a CMV. En algunos aspectos adicionales, los anticuerpos neutralizantes son independientes del complemento.
La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria mediada por células o ambas. En algunos aspectos de la divulgación, se induce una respuesta inmunitaria frente a cada proteína de CMV administrada. Una respuesta inmunitaria mediada por células puede comprender una respuesta de células T cooperadoras (Th), una respuesta de células T citotóxicas (CTL) CD8+, o ambas. En algunos aspectos adicionales, la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria humoral, y los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes bloquean la infección viral de las células. El CMV infecta células epiteliales y también fibroblastos. En algunos aspectos adicionales, la respuesta inmunitaria reduce o impide la infección de ambos tipos de células. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes pueden ser dependientes de complemento o independientes de complemento. En algunos aspectos adicionales, la respuesta de anticuerpos neutralizantes es independiente de complemento. En algunos aspectos adicionales, la respuesta de anticuerpos neutralizantes es de neutralización cruzada; es decir, un anticuerpo generado frente a una composición administrada neutraliza un virus CMV de una cepa distinta de la cepa usada en la composición.
Una medida útil de la potencia de los anticuerpos en la técnica es el “título de neutralización del 50%”. Para determinar el título de neutralización del 50%, se diluye el suero de animales inmunizados para evaluar en qué grado de dilución puede mantenerse el suero y todavía conservar la capacidad de bloquear la entrada del 50% de los virus en las células. Por ejemplo, un título de 700 significa que el suero conserva la capacidad de neutralizar el 50% del virus después de diluirse 700 veces. Por tanto, títulos más altos indican respuestas de anticuerpos neutralizantes más potentes. En algunos aspectos de la divulgación, este título está en un intervalo que tiene un límite inferior de aproximadamente 200, aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500, aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500, o aproximadamente 7000. El intervalo de título de neutralización del 50% puede tener un límite superior de aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500, aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500, aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, aproximadamente 9000, aproximadamente 10000, aproximadamente 11000, aproximadamente 12000, aproximadamente 13000, aproximadamente 14000, aproximadamente 15000, aproximadamente 16000, aproximadamente 17000, aproximadamente 18000, aproximadamente 19000, aproximadamente 20000, aproximadamente 21000, aproximadamente 22000, aproximadamente 23000, aproximadamente 24000, aproximadamente 25000, aproximadamente 26000, aproximadamente 27000, aproximadamente 28000, aproximadamente 29000, o aproximadamente 30000. Por ejemplo, el título de neutralización del 50% puede ser de aproximadamente 3000 a aproximadamente 25000. “Aproximadamente” significa más o menos el 10% del valor indicado.
Las composiciones descritas en la divulgación generalmente pueden administrarse directamente a un sujeto. La administración directa puede lograrse mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido) o por cualquier otra vía adecuada. Por ejemplo, puede usarse administración intramuscular, por ejemplo, al muslo o a la parte superior del brazo. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección sin aguja. Un volumen de dosificación intramuscular típico es de aproximadamente 0,5 ml.
La dosificación puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Pueden usarse dosis múltiples en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiple, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo de la mucosa, un cebado de la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).
El sujeto puede ser un animal, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un mamífero. El sujeto a modo de ejemplo incluye, por ejemplo, un ser humano, una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, ya que los patógenos cubiertos en el presente documento pueden constituir un problema en una amplia variedad de especies. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé), un adolescente o un adulto; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc.
Las vacunas descritas en la divulgación pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir enfermedades) o terapéuticas (es decir, para reducir o eliminar los síntomas de una enfermedad). El término profiláctico puede considerarse como la reducción de la gravedad o la prevención de la aparición de un estado particular. Para evitar dudas, el término vacuna profiláctica también puede referirse a vacunas que mejoran los efectos de una infección futura, por ejemplo, al reducir la gravedad o la duración de dicha infección.
Las proteínas, los complejos y los ácidos nucleicos de CMV aislados y/o purificados descritos en el presente documento pueden administrarse solos o como cebado o refuerzo en regímenes de modalidad mixta, tal como un cebado de ARN seguido de un refuerzo de proteína. Los beneficios de la estrategia de cebado de ARN - refuerzo de proteína, en comparación con una estrategia de cebado de proteína - refuerzo de proteína incluyen, por ejemplo, títulos de anticuerpos aumentados, un perfil de subtipo IgG1:IgG2a más equilibrado, inducción de respuesta inmunitaria mediada por células T CD4+ tipo TH1 que era similar a la de las partículas virales y producción reducida de anticuerpos no neutralizantes. La cebado de ARN puede aumentar la inmunogenicidad de las composiciones independientemente de que contengan o no un adyuvante.
En la estrategia de cebado de ARN - refuerzo de proteína, el ARN y la proteína se dirigen al mismo antígeno diana. Los ejemplos de modos adecuados de administración de ARN incluyen partículas de replicón similares a virus (VRP), ARN de alfavirus, replicones encapsulados en nanopartículas lipídicas (LNP) o ARN formulados, tales como replicones formulados con nanoemulsiones catiónicas (CNE). Se dan a conocer nanoemulsiones de aceite en agua catiónicas adecuadas en el documento WO2012/006380, por ejemplo, que comprende un núcleo de aceite (por ejemplo, que comprende escualeno) y un lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP, DMTAP, DSTAP, DC-colesterol, etc.).
El documento WO2012/051211 da a conocer que se producen anticuerpos frente al complejo pentamérico en ratones que se han inmunizado con VRP y ARN formulados (CNE y LNP) que codifican para los constituyentes proteicos del complejo pentamérico. Se ha encontrado que estos anticuerpos pueden neutralizar la infección por CMV en células epiteliales. El régimen de cebado de ARN - refuerzo de proteína puede implicar realizar primero (por ejemplo, en las semanas 0-8) una o más inmunizaciones de cebado con ARN (que podría administrarse como VRP, lNp , CNE, etc.) que codifica para uno o más de los componentes de proteína de un complejo proteico de CMV descrito en el presente documento y luego realizar una o más inmunizaciones de refuerzo más adelante (por ejemplo, en las semanas 24-58) con: un complejo proteico de CMV aislado descrito en el presente documento, opcionalmente formulado con un adyuvante o un complejo proteico de CMV purificado descrito en el presente documento, formulado opcionalmente con un adyuvante.
En algunos aspectos de la divulgación, la molécula de ARN está encapsulada, unida o adsorbida en un lípido catiónico, un liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulante, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilamelar, una vesícula multilamelar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico, una nanoemulsión catiónica o combinaciones de los mismos.
También se describen en el presente documento kits para la administración de ácido nucleico (por ejemplo, ARN), proteínas purificadas y complejos purificados descritos en el presente documento e instrucciones para su uso. La
divulgación también describe un dispositivo de administración precargado con una composición o una vacuna dada a conocer en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, pero sin limitarse a, antibióticos o agentes antibacterianos, agentes antieméticos, agentes antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes inmunomoduladores, citoquinas, antidepresivos, hormonas, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, inhibidores de la topoisomerasa, agentes citostáticos, agentes antiinvasión, agentes antiangiogénicos, inhibidores de la función del factor de crecimiento, inhibidores de la replicación viral, inhibidores de enzimas virales, agentes anticancerígenos, interferones a, interferones b, ribavirina, hormonas y otros moduladores de receptores de tipo Toll, inmunoglobulinas (Ig) y anticuerpos que modulan la función de Ig (tales como anti-IgE (omalizumab)).
En algunos aspectos de la divulgación, las composiciones dadas a conocer en el presente documento pueden usarse como medicamento, por ejemplo, para su uso en la inducción o potenciación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite, tal como un mamífero.
En algunos aspectos de la divulgación, las composiciones dadas a conocer en el presente documento pueden usarse en la fabricación de un medicamento para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite, como un mamífero.
Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección por patógenos después de la administración de las composiciones o vacunas dadas a conocer en el presente documento. Otra forma de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar las respuestas inmunitarias, de manera sistémica (tal como monitorizar el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o a nivel de mucosa (tal como monitorizar el nivel de producción de IgA) contra el antígeno. Normalmente, las respuestas de anticuerpos séricos específicos de antígeno se determinan después de la inmunización pero antes de la exposición, mientras que las respuestas de anticuerpos a nivel de la mucosa específicos de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la exposición.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Materiales y métodos
Análisis de secuencias y estructuras. Se alinearon secuencias de gL de CMV, VZV y HSV1 y HSV2 usando CLUSTALW (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_clustalw.html) y se ajustaron manualmente para alinear los residuos que contribuían a las cadenas p conservadas en VZV y HSV2.
Expresión de pentámetro y complejo gH/gL. Se expresaron el complejo pentamérico de tipo natural (WT) (“pentámero”) o pentámero con mutaciones de gL (mutante “LSG” e “IDG”) usando un sistema de dos vectores con gH y gL en un vector y tres UL en el otro. La secuencia de IRES (sitio de entrada al ribosoma interno) separa diferentes genes en cada vector. gH tiene una etiqueta 6xHis C-terminal (SEQ ID NO: 11), y UL130 tiene una etiqueta Strep C-terminal escindible. Se transfectó el ADN de los dos vectores con 1 mg de ADN total por cada litro de cultivo en células Expi293 usando el kit de transfección Expifectamine (Life Technologies) siguiendo el protocolo de fabricación. Se hicieron crecer las células hasta ~2,5 x 106 células/ml el día de la transfección con una viabilidad >97% en matraces con agitación. Las células transfectadas se hicieron crecer durante tres días hasta ~8 x 106 células/mL con una viabilidad ~60% en una estufa de incubación con agitación que se hizo funcionar a 37°C, 150 rpm y el 8% de CO2. Los sobrenadantes de los medios de expresión se recogieron mediante centrifugación a 4200 rpm durante 30 minutos.
Se expresaron gH/gL de tipo natural (WT) o gH/gL con mutaciones en gL usando el vector que contenía tanto gH como gL de la misma manera que se describió anteriormente.
Secuenciación N-terminal. Se usó la secuenciación N-terminal para identificar bandas desconocidas visibles mediante SDS page e inmunotransferencias de tipo Western (WB) de pentámeros WT purificado por afinidad. Los pentámeros en SDS page se transfirieron a una membrana de PVDF activada con etanol, que se tiñó con azul brillante de Coomassie al 0,02% en metanol al 40%, luego se lavó en agua destilada varias veces antes de secarla completamente al aire. Se cortaron las bandas de interés y se enviaron a Protein Core Facility de la Universidad Tufts para su secuenciación.
Purificación y análisis de inmunotransferencia de tipo western. El sobrenadante recogido se concentró y el tampón se intercambió por tampón de unión de columna de afinidad (Hepes 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM y EDTA 1 mM) usando un sistema KrosFlo Research II TFF y un cartucho de fibras huecas (Spectrumlabs). El sobrenadante concentrado se cargó en un cartucho StrepTrap HP (Ge Life Sciences) y se eluyó con tampón de elución (Hepes 50 mM, pH 7,0, NaCl
150 mM, destiobiotina 2,5 mM y EDTA 1 mM). Se analizaron las fracciones picos del eluato mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos frente a o bien gL o bien la etiqueta de His ubicada en el extremo C-terminal de gH.
Estudios de inmunización en ratones. Se inmunizaron diez ratones por grupo con complejo pentamérico purificado WT o mutante gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 adyuvado con MF59 en las tres dosis diferentes de 0,03 mg, 0,1 mg y 1 mg con tres inyecciones a intervalos de tres semanas. Las muestras de suero se inactivaron con calor a 56°C durante 30 min, se diluyeron en etapas dobles (dos réplicas por dilución), se mezclaron con un volumen igual de virus HCMV diluido hasta una concentración objetivo de 200-250 células infectadas/campo de recuento en medio ± 10% de complemento de cobaya (Cedarlane Labs, Burlington, NC, EE. UU.), y se incubaron durante 2 h a 37°C/el 5% de CO2. Estas muestras de suero/virus se añadieron a células ARPE-19 o células MRC-5 preparadas en placas de cultivo celular de semiárea de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.). Las monocapas infectadas se incubaron durante 48 horas (± 8 h) a 37°C/el 5%de CO2, se fijaron con formalina tamponada al 10% (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE. UU.) durante una hora y se lavaron tres veces con tampón de lavado. (PBS/Tween-20 al 0,05%), bloqueado con PBS/suero bovino fetal al 2,5%, saponina al 0,5%, azida sódica al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces, se secaron con cinta adhesiva y se incubaron en una estufa de incubación en húmedo a 25°C durante una hora. Entonces se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-HCMV IE1 derivado del hibridoma L14 (diluido en tampón de saponina). Las placas se lavaron tres veces y se incubaron durante una hora con IgG anti-ratón conjugada con AlexaFluor 488 (diluido en tampón de saponina), y luego se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,05%. Se contaron las células fluorescentes usando un analizador Immunospot S5 UV (Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, EE. UU.), y se calculó el título de neutralización del 50%, definido como el recíproco de la dilución de suero que produce una reducción del 50% en el recuento de células infectadas (en relación con el recuento de células infectadas en diluyente más pocillos de control de virus), mediante interpolación de regresión lineal entre las dos diluciones con pocillos que producían recuentos de células infectadas promedio por encima y por debajo del valor del 50%.
EJEMPLO 2: Resultados
1. El corte de gL se produce junto a una cadena p conservada
La secuenciación N-terminal determinó que una banda identificada mediante inmunotransferencia de tipo western usando un anticuerpo frente a gL comienza con el residuo 97 de gL. Por tanto, el complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 expresado en células de mamífero contiene una población de proteínas gL cortadas entre los residuos Asn97 y Ser98 de gL. La alineación de secuencias basada en la estructura dio a conocer además que el sitio de corte está en una región de bucle junto a una cadena p conservada en las estructuras gH/gL tanto de VZV como de HSV-2 (figura 1).
Diversas mutaciones introducidas en la secuencia de gL en las proximidades de este sitio de corte dieron como resultado una reducción en la cantidad de corte de gL. Las mutaciones de adición insertaron entre dos y cinco residuos con una mezcla de residuos polares y no polares en el sitio de escisión. Las mutaciones de deleción delecionaron de desde uno hasta tres residuos alrededor del sitio de escisión. Las mutaciones de sustitución cambiaron Ala96 por residuos hidrófobos o residuos con cadenas laterales grandes; cambiaron Asn97 por residuos polares con cadenas laterales o bien más pequeñas o bien más grandes, o por residuos no polares; o cambiaron Ser98 por residuos con cadenas laterales pequeñas que tienen un carácter o bien polar o bien no polar.
2. Comparación de diversos mutantes de gH/gL con gH/gL de tipo natural
La figura 2A muestra diversas proteínas gL mutantes que se sometieron a prueba. Los complejos gH/gL que contenían diversas mutaciones de gL se expresaron en células Expi293 y se compararon con gH/gL WT. Las mutaciones en el sitio de reconocimiento de proteasa redujeron el corte de gL en los complejos gH/gL expresados. Por ejemplo, una inmunotransferencia de tipo Western anti-gL del sobrenadante sin procesar WT mostró una banda claramente visible del fragmento gL con el residuo 98 en su extremo N-terminal, según lo determinado por la secuenciación N-terminal. En cambio, no se detectó una banda similar en el mutante “LSG” y no se detectó ni se redujo significativamente en los mutantes “delta Asn97” y “SST” (figura 2).
Las tres variantes de residuos introducidas en las proximidades del sitio de corte redujeron el corte en mayor medida que una sola variante de residuo en las proximidades del sitio de corte. El mutante “LSG” redujo la intensidad de la banda de corte de gL de la manera más significativa en la inmunotransferencia de tipo western anti-His. Además, la eliminación de la inserción de 17 residuos mejoró la intensidad de la banda de corte de gL observada mediante la inmunotransferencia de tipo Western, gH/gL(N), lo que sugiere que esta inserción puede proteger el sitio de escisión (figura 2C).
3. Comparación de los pentámeros mutantes “LSG” e “IDG” con el pentámero de tipo natural
Para analizar si los mutantes “LSG e “IDG” también eliminaban o reducían el corte de gL en el pentámero gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131, se analizaron el pentámero WT y el mutante purificados por afinidad mediante inmunotransferencias de tipo Western anti-His y anti-gL. En la inmunotransferencia de tipo Western anti-His del pentámero WT, hay una banda pronunciada con un peso molecular más pequeño que el gH/gL de longitud completa, compatible con un complejo de gH y la región N-terminal de gL después del corte. Obsérvese que este fragmento terminal de gL no se reconoce por el anticuerpo anti-gL. En la inmunotransferencia de tipo western anti-gL, la región C-terminal de gL, comenzando con el residuo 98, tal como se determina por la secuenciación N-terminal, forma un complejo con UL128 en una muestra no reducida. El mismo fragmento C-terminal de gL se observó por sí mismo en una muestra reducida. En comparación, las bandas resultantes del corte de gL no se detectaron en ninguno de los pentámeros mutantes “LSG” o “IDG” (figuras 3 y 4). Tanto los mutantes “LSG” como “IDG” produjeron pentámero que se comportó de manera similar al complejo pentamérico WT. Por tanto, esas mutaciones no afectan el ensamblaje del complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131, pero eliminaron el corte proteolítico de la proteína gL (figura 5A).
El análisis de inmunogenicidad mostró que los mutantes LSG e IDG no comprometieron la inmunogenicidad del complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 (figura 5B).
El fragmento de gL que resultó del corte se detectó durante la expresión de los complejos gH/gL, gH/gL/gO (datos no mostrados) y gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Los sitios de corte en estos tres complejos son idénticos, entre los residuos de gL 97 y 98. Por tanto, las mutaciones que impiden el corte de gL durante la expresión de gH/gL también impiden el corte de gL durante la expresión de los complejos pentaméricos gH/gL/gO y gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.
Con tan solo tres sustituciones de residuos o una sola deleción, el corte de gL puede eliminarse o reducirse respectivamente de manera significativa. No se espera que la ubicación de estas mutaciones afecte la estructura secundaria conservada en sus proximidades. Esto permite la producción del pentámero gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 homogéneo con su estructura tridimensional y la antigenicidad/inmunogenicidad no afectada en gran medida. Se concluye que la estrategia de mutar la secuencia en las proximidades del sitio de corte con una secuencia homóloga demostró ser eficaz.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. El término “que comprende” abarca “que incluye”, así como “que consiste en”, por ejemplo, una composición que “comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X Y.
El término “que consiste esencialmente en” significa que la composición, el método o la estructura puede incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los componentes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicados. El término “que consiste en” se entiende en general como que la invención tal como se reivindica se limita a los elementos citados específicamente en la reivindicación (y puede incluir sus equivalentes, en la medida en que sea aplicable la doctrina de los equivalentes).
Secuencias
SEQ ID NO: 1 (gL de la cepa Merlin de HCMV = GI:39842115)
MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVT
GRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVY
TCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNA
VKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO: 2 (gL de la cepa Towne de HCMV = GI:239909463)
MCRRPDCGFSFSPGPVALLWCCLLLPIVSSATVSVAPTVAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNVT
RRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVY
TCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNA
VKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO: 3 (gL de la cepa AD169 de HCMV = GI:2506510)
MCRRPDCGFSFSPGPWLLWCCLLLPIVSSVAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLWVT
RRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVY
TCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNA
VKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO: 4 (proteína madura gL que consiste en los residuos de aminoácido 31-278 de SEQ ID NO: 1)
AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFL
DTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFE
LVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELK
QTRVNLPAHSRYGPQAVDAR SEQ ID NO: 5 (elemento se inserción de 17 residuos de gL de la cepa Merlin de HCMV) GRDGPLSQLIRYRPVTP SEQ ID NO: 6 (gH de la cepa Towne de HCMV = GI:138314)
MRPGLPSYLIVLAVCLLSHLLSSRYGAEAISEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENAI
SFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQP
TTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKIT
LTEDFFWTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDF
NYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFM
ITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLA
SFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSL
ERLTRLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYWTNQYLIKGISYPVSTTV
VGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNE
VWSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVWDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC SEQ ID NO: 7 (elemento de inserción de 6 residuos de gL de la cepa Merlin de HCMV)
NSVLLD SEQ ID NO: 8 (etiqueta FLAG)
DYKDDDDK SEQ ID NO: 9 (etiqueta Strep)
AWRHPQFGG SEQ ID NO: 10 (etiqueta Strep II)
WSHPQFEK SEQ ID NO: 11 (etiqueta His) HHHHHH
Claims (14)
1. Proteína gL de citomegalovirus recombinante, o (i) un fragmento de formación de complejo dimérico gH/gL de la misma, (ii) un fragmento de formación de complejo trimérico gH/gL/gO de la misma, o (iii) un fragmento de formación de complejo pentamérico gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 de la misma, en la que dicha proteína gL o fragmento comprende una mutación en los residuos 91-102 del sitio de reconocimiento de proteasa numerados según SEQ ID NO: 1, en la que dicha mutación reduce la escisión por proteasa en dicho sitio de reconocimiento de proteasa, en comparación con un control, en la que dicha mutación se selecciona de: a) adición de F, Q, FQ o QF entre los residuos N97 y S98;
b) deleción de un residuo seleccionado del grupo que consiste en: A95, A96, N97, y una combinación de los mismos;
c) sustitución de A96 por un residuo no polar o por un residuo que comprende una cadena lateral grande; d) sustitución de A95 por R, L, E o N;
e) sustitución de N97 por un residuo polar o un residuo no polar;
f) sustitución de S98 por un residuo de aminoácido con una cadena lateral pequeña;
g) sustitución de V99 por I;
h) sustitución de L100 por F o V;
i) sustitución de L101 por V o I;
o una combinación de los mismos.
2. Proteína gL, o fragmento, según la reivindicación 1, en la que la sustitución de A96 en c) es por I, L, V o S.
3. Proteína gL, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la sustitución de N97 en e) es por un residuo polar que comprende una cadena lateral pequeña.
4. Proteína gL, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la sustitución de N97 en e) es por un residuo polar que comprende una cadena lateral grande.
5. Proteína gL, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la sustitución de S98 en f) es por G, T, V o I.
6. Proteína gL, o fragmento, según la reivindicación 1, en la que dicha mutación es la triple mutación A96L/N97S/S98G.
7. Proteína gL, o fragmento, según la reivindicación 1, en la que dicha mutación es la triple mutación A96I/N97D/S98G.
8. Complejo proteico de citomegalovirus que comprende la proteína gL recombinante, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Complejo según la reivindicación 8, en la que dicho complejo es un complejo pentamérico que comprende además: gH o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL128 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL130 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, y pUL131 o un fragmento de formación de pentámero de la misma.
,
10. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para la proteína gL de citomegalovirus recombinante, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7.
11. Célula huésped, preferiblemente una célula huésped de mamífero, que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 10.
12. Célula huésped según la reivindicación 11, en la que dicha célula huésped comprende además una o más
secuencias de polinucleótido que codifican para gH o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL128 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, pUL130 o un fragmento de formación de pentámero de la misma, y pUL131 o un fragmento de formación de pentámero de la misma.
13. Composición inmunogénica que comprende la proteína gL de citomegalovirus recombinante, o fragmento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, o el complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, y que comprende opcionalmente un adyuvante.
14. Composición inmunogénica según la reivindicación 13, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria frente a citomegalovirus.
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