ES2921605T3 - Vacuna contra el virus de la encefalitis equina basada en el virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante - Google Patents

Vacuna contra el virus de la encefalitis equina basada en el virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante Download PDF

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Abstract

La presente invención se relaciona con el virus de vacunación modificado recombinante ankara (MVA) y con los métodos de uso de los mismos. En particular, la invención se relaciona con MVA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de un virus de la encefalitis equina (EEV) excluyendo la codificación para una proteína cápsida del EEV, una composición en particular una composición farmacéutica, una vacuna o kit que comprende el MVA recombinante, usos y métodos de los mismos, por ejemplo, adecuados para tratar y/o prevenir un virus de la encefalitis equina occidental, venezolano y/o oriental causó enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el virus de la encefalitis equina basada en el virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una vacuna contra el virus de la encefalitis equina (VEE) basada en el virus de la variolovacuna modificado Ankara (basada en VMA) recombinante, en particular a infección por los virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO), venezolana (VEEV) y/o del este (VEEE) y a productos, métodos y usos relacionados. Específicamente, la presente invención se refiere a vectores de VMA (recombinante) genéticamente manipulados que comprenden proteínas estructurales de los virus, en particular que comprenden E3, E2, 6k y E1, excluyendo secuencias que codifican una proteína de la cápside. La invención también se refiere al vector de VMA para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad causada por VEE.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), del este (VEEE) y del oeste (VEEO), miembros del género Alfavirus en la familia de Togaviridae, son agentes causantes de la encefalitis deliberativa, aguda y algunas veces mortal (Spurgers K. B. y Glass P. J. (2011), J Bioterr. & Biodef S1:001 -9). Estos virus se mantienen en la naturaleza en ciclos alternos entre vectores de mosquito y el reservorio natural de aves salvajes, mientras que se vuelven ocasionalmente zoonóticos y se transmiten por mosquitos a los seres humanos y caballos, que son hospedadores finales de muerte tangencial. Las enfermedades humanas naturales son raras, pero, al igual que las cepas aisladas del VEEE de América del Norte, son altamente virulentas, que son el patógeno transmitido por mosquitos más letal en América del Norte con un índice de letalidad estimado del 35 al 75 % (Yu et al. (2015), Genome Announc. 3: e00243-15). Se ha estimado que el índice de letalidad de los casos para VEEO es aproximadamente del 10 % para seres humanos y del 20 % para equinos. En seres humanos, el VEEE y el VEEO son virus neurotrópicos que producen viremia limitada, seguido por infección del SNC a través del endotelio vascular cerebral o el epitelio olfativo, mientras que el VEEV causa encefalitis en menos del 5 % y muestra un índice de letalidad de aproximadamente el 1 % (Nagata et al. (2013), Future Virol. 8:661-674). Debido a su potencial para ser convertidos en un arma, los VEEO, VEEE y VEEV son clasificados como patógenos de la categoría B por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Hasta la fecha solo se usan preparaciones de vacunas de alfavirus inactivadas para controlar las infecciones por animales en áreas endémicas y están en uso vacunas en fase de investigación sin licencia para la protección de personas de riesgo que incluyen personal de laboratorio. No están disponibles vacunas autorizadas para la vacunación general contra la infección por VEEO, VEEV o VEEE.
Las vacunas en fase de investigación incluyen TC-83 y C-84 (Spurgers K. B. y Glass P. J. (2011), J Bioterr. & Biodef. S1:001-9). TC-83 es un virus atenuado vivo generado por pases en serie de la cepa del VEEV Trinidad (TrD) en células de corazón de cobaya. El personal en riesgo de exposición al VEEV se inmuniza con TC-83 atenuado vivo como un fármaco en investigación, seguido de vacunación de refuerzo con C-84 inactivado por formol si se requiere (Nagata et al. (2013), Future Virol. 8:661-674). La vacuna TC-83 es solo inmunogénica en aproximadamente el 80 % de los receptores humanos y aproximadamente el 40 % de los sujetos inmunizados desarrollan síntomas moderados de tipo gripe. Sin embargo, la preocupación por los efectos secundarios y la reversión a la virulencia de virus naturales es una carga para el tratamiento humano. También están en uso vacunas de virus inactivados para VEEE y VEEO, pero al igual que C-84, son poco inmunogénicas y requieren refuerzos frecuentes.
Basándose en los datos de primates no humanos, TC-83 y C-84, así como casos humanos de infección por el VEEV en individuos previamente vacunados, ninguna de las presentes vacunas ofrece una buena protección contra la exposición a aerosoles (Reed et al. (2014), Journal of Virology 88:12077-12086).
Se han usado varios enfoques para desarrollar vacunas más seguras y más eficientes. V3526, que alberga una deleción del sitio de escisión de furina y una mutación secundaria en el codón 253 de E1, ha demostrado ser altamente eficiente, pero se ha detenido el desarrollo clínico debido a signos clínicos inaceptables en seres humanos (Spurgers K. B. y Vidrio P. J. (2011), J Bioterr. & Biodef. S1:001 -9).
Otros enfoques se refirieron a vacunas quiméricas basadas en un esqueleto del virus de Sindbis (SINV) que produce candidatos a vacuna de virus atenuado vivo SINV/VEEO. Sin embargo, a pesar de los prometedores resultados de la vacunación, algunas quimeras fueron altamente patógenas cuando se administraron a ratones lactantes, dejando dudas sobre la seguridad de la vacuna.
Se ha analizado otro enfoque de vacunación con ADN, que requiere la inyección de ADN de plásmido que codifica proteínas, pero es menos adecuado para vacunación humana. Nagata et al. han mostrado que la vacuna de ADN pVHX6 no solo protegió del 50 al 62 % en ratones contra Fleming y CBA87 como cepa de exposición por la vía intranasal (Nagata et al. (2005), Vaccine 23:2280-3, la patente de EE. UU. N.° 6.800.289 y 7.223.409). Además, se requirieron tres inyecciones y la administración con una pistola de genes. Gauci et al. probaron diferentes porciones de las proteínas estructurales del VEEO para su eficacia en un modelo de ratón (Gauci et al. (2010), Clinical and Vaccine Immunology 17:176-179).
Se han analizado vacunas de ADN contra el VEEV contra la exposición a aerosol en macados cangrejeros y/o ratones por electroporación intramuscular (Dupuy et al. (2011), Vaccine Immunol. 18:707-716; Dupuy et al. (2010), Vaccine 28:7345-7350; documento de patente w O 2013/151567).
Se han usado ampliamente vectores víricos de varios tipos manipulados para expresar un transgén de interés tras la transducción de células diana. Varios estudios han demostrado protección de vectores basados en adenovirus contra la exposición a VEEO en ratones (Wu et al. (2007), Vaccine 25:4368-4375; Barabé et al. (2007), Vaccine 25:6271-6276; Swayze et al. (2011), Vaccine 29: 813-820). En el documento de patente WO 2008/101349, proteínas de la envoltura del VEEO 71V-1658 en Ad5 tanto solas como tras la co-administración de Ad5-mIFNa y Ad5-VEEO han mostrado protección. Sin embargo, la inmunidad preexistente al vector de adenovirus en la población humana podría reducir la eficacia de la vacuna y es así una carga importante para una utilidad generalizada de este enfoque. Un vector de adenovirus que expresa proteínas estructurales E3-E2-6K de VEEV usadas en un modelo de exposición i.n. mostró protección contra la exposición homóloga a aerosoles, pero solo protegió parcialmente contra cepas enzoóticas (Phillpotts et al. (2005), Vaccine 23:1615-1623).
También se ha usado el virus recombinante de la variolovacuna como una vacuna para expresar proteínas estructurales de VEEV (Kinney et al. (1988), J. Virol. 62:4697-4702; Mathews et al. (1994), Vaccine 12:620-624; Bennett et al. (1998), Viral. Immunol. 11:109-117; Phillpotts R.J, Lescott T.L., Jacobs S.C. (2000), Acta Virol. 44:233-239; patente de EE. UU. N.° 6.565.853; documento de patente WO 99/50292). Aunque estas vacunas son eficaces en ratones contra infección periférica, dejan de ofrecer protección completa contra la exposición al VEEV intranasal o en aerosol. La patente de EE. UU. N.° 6.936.257 (documento de patente WO 99/63098) desvela un virus de la variolovacuna que expresa una proteína estructural modificada del VEEV que solo protegió a hasta el 60 % de los ratones.
Se han descrito vacunas de partículas de replicón vírico (VRP), pero se requirieron dosis muy altas para proteger NHP (Reed et al. (2014), J Virol. 88:12077-86).
Una preocupación adicional de la vacuna de alfavirus es la interferencia cruzada con otras vacunas de alfavirus y la interferencia entre vacunas de VEEO, VEEV y VEEE, así el desarrollo de vacunas que confieren protección sin interferencia inmunitaria es un objetivo de las estrategias de vacunas de alfavirus (Phillips et al. (2014), J Virol.
88:1771-1780).
En ausencia de una vacuna adecuada, existe una necesidad de vencer las desventajas de desarrollar vacunas y terapéuticos seguros y más eficaces que protejan contra la infección por el VEEO, VEEV y/o VEEE y/o protección de seres humanos para ser eficaces en un escenario de defensa biológica, en particular contra una vía de exposición respiratoria o a aerosol.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la presente invención proporciona un virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de un promotor de poxvirus unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de un virus de la encefalitis equina (VEE) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el VMA recombinante de la presente invención y un vehículo, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna, y/o célula que comprende el VMA recombinante de la presente invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el VMA recombinante, y/o la composición farmacéutica, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención en un primer vial o envase para una primera administración (primovacunación) y en un segundo vial o envase para una segunda administración (refuerzo).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un VMA recombinante de la presente invención, y/o a la composición farmacéutica, y/o a la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención para su uso como un medicamento o vacuna.
Estos y otros objetos de la invención se describirán con más detalle a propósito de la descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones de la invención y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.
La Figura 1 ilustra el diseño de VMA recombinante de la invención que expresa las poliproteínas estructurales del VEE E3-E2-6k-E1. Como sitios de inserción se usaron IGR 44/45 (VEEE) y IGR 88/89 (VEEO y VEEV) según la posición que se describe en el documento de patente WO 03/097845.
La Figura 2 muestra la eficacia del VMA recombinante en un modelo de exposición murina letal como se describe en el Ejemplo 5 a dosis baja (1.000 ufp) y alta (10.000 ufp). 5 ratones por grupo recibieron una primovacunación/refuerzo (d0, d28); 1x108 TCID50 de VMA-VEEV (VMA-mBN395A), Vm A-VEEO (VMA-mBN394A) o VMA-VEEE (VMA-mBN393A); s.c. (VEEO y VEEE), i.m. (Ve EV). La exposición se hizo en el día 42 a 1.000 o 10.000 ufp (i.n.), seguimiento de 14 días. Figura 2A: Exposición a Ve EO (71V-1658), 2B: Exposición a VEEE (PE-6), 2C: Exposición a VEEV (TrD). El diagrama superior muestra los datos de supervivencia con 1.000 ufp, el diagrama en la parte inferior muestra los datos de supervivencia con 10.000 ufp.
La Figura 3 representa la expresión antigénica para la expresión monovalente y trivalente del VEE (Ejemplo 4). A: Expresión del antígeno de superficie de VMA recombinante que contiene solo un único casete de expresión sobre la superficie de células HeLa transducidas según el Ejemplo 4. VEEE (VMA-mBN393A, GFP), VEEO (VMA-mBN394A, GFP), VEEE (VMA-mBN395A, GFP). La expresión específica para cada construcción se indica respectivamente por puntas de flecha. Control: vector de VMA vacío y como área gris sin a-VEE (RFP) B: Expresión del antígeno de superficie de VMA trivalente (VMA-VEEE/VEEO/VEEV, VMA-mBNB396A, GFP/RFP, indicada por puntas de flecha) en comparación con VMA recombinante monovalente que contiene un único casete de expresión para VEEE (VMA-mBN393A), VEEO (VMA-mBN394A) o VEEV (VMA-mBN395A) como se describe en los ejemplos. Todas las vacunas (trivalentes y monovalentes) contienen los antígenos de superficie (E3-E2-6k-E1) de los virus respectivos. Control: sin a-VEE (RFP), área gris.
La Figura 4 muestra una visión general esquemática del ensayo de valoración por neutralización de anti-alfavirus en suero como se describe en Ejemplo 7.
La Figura 5 muestra los resultados de los títulos neutralizantes anti-alfavirus como se determina según el Ejemplo 7 después de la vacunación con VMA-mBN393A, VMA-mBN394A, VMA-mBN395A o una mezcla de las tres vacunas (VMA-mBN393A, VMA-mBN394A y VMA-mBN395A) según el protocolo de vacunación que se describe en el Ejemplo 5. El título neutralizante se define como el recíproco de la mayor dilución de suero capaz de neutralizar 100 TCID50 del virus respectivo. 5A: 100 TCID50 TrD, VMA-BN-VEEV (VMA-mBN395A), 5B: Fleming y 71V(71V-1658), VMA-BN-VEEO (VMA-mBN394A), 5C: PE6, VMA-BN-VEEE (VMA-mBN393A). Control: VMA-BN.
La Figura 6 muestra las tasas de supervivencia de estudios en animales en ratones BALB/c vacunados con VMA-BN-VEEE (VMA-mBN393A), VMA-BN-VEEO (VMA-mBN394A), VMA-BN-VEEV (VMA-mBN395A) o una mezcla de las tres vacunas (VMA-mBN393A, VMA-mBN394A y VMA-mBN395A) para las que se muestran los títulos neutralizantes en la Figura 5. Los ratones recibieron 1 x 108 TCID50 por dosis en el día 0 y a los 28 días, excepto VMA-BN trivalente (VMA-mBN396A) administrado en dosis de 3,6 x 107 TCID50. La exposición se hizo 42 días con el virus como se indica.
La Figura 7 muestra un resumen de las tasas de supervivencia de estudios repetidos en animales en ratones BALB/c vacunados con construcciones y dosis como se describe para la Figura 6 según los detalles dados en los ejemplos. ** indica una exposición heteróloga (la cepa de exposición fue diferente en comparación con la cepa de vacuna usada).
DEFINICIONES
La presente invención se describe con detalle a continuación. La terminología usada en el presente documento es con el fin de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que comúnmente son entendidos por un experto habitual en la técnica.
Se debe observar que, como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, referencia a "una proteína estructural" incluye una o más proteínas estructurales y referencia a "el método" incluye referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos habituales en la técnica que se podrían modificar o sustituir por los métodos descritos en el presente documento.
A menos que se indique lo contrario, el término "al menos" precediendo a una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más de experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Dichos equivalentes pretenden estar englobados por la presente invención.
El término "aproximadamente", cuando se usa a propósito de un valor numérico, se indica para englobar valores numéricos dentro de un intervalo que tiene un límite inferior que es el 5 % más pequeño que el valor numérico indicado y que tiene un límite superior que es el 5 % mayor que el valor numérico indicado, a menos que el contexto indique claramente de otro modo.
Como se usa en el presente documento, se entiende que el término conjuntivo "y/o" entre múltiples elementos citados engloba tanto opciones individuales como combinadas. Por ejemplo, donde dos elementos se unen conjuntamente por "y/o", una primera opción se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción se refiere a la aplicabilidad del primer y segundo elementos juntos. Se entiende que una cualquiera de estas opciones entra dentro del significado y, por lo tanto, cumplirá el requisito del término "y/o" como se usa en el presente documento. La aplicabilidad simultánea de más de una opción también se entiende que entra dentro del significado y, por lo tanto, cumple el requisito del término "y/o".
En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero o etapa establecido o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualesquiera otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa. Cuando se usa en el presente documento, el término "que comprende" se puede sustituir con el término "que contiene" o "que incluye", o algunas veces cuando se usa en el presente documento con el término "que tiene". Cualquiera de los términos anteriormente mencionados (que comprende, que contiene, que incluye, que tiene), siempre que se use en el presente documento en el contexto de un aspecto o realización de la presente invención, se puede sustituir con el término "que consiste en", aunque es menos preferido.
Cuando se usa en el presente documento, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, "que consiste esencialmente en" no excluye los materiales ni las etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.
Un "adyuvante" significa un vehículo para potenciar la antigenicidad. Un adyuvante puede incluir: (1) suspensiones de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio y/o fosfato) sobre las que se adsorbe un antígeno; (2) emulsiones de agua en aceite en las que una disolución de antígeno se emulsiona en aceite mineral (adyuvante incompleto de Freund), algunas veces con la inclusión de micobacterias destruidas (adyuvante completo de Freund) para potenciar más la antigenicidad inhibiendo la degradación de antígeno y/o causando una entrada de macrófagos; (3) sustancias inmunoestimulantes que incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos tales como, por ejemplo, los que incluyen un motivo CpG también se pueden usar como adyuvantes (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. N.° 6.194.388; y la patente de EE. UU. N.° 6.207.646); y (4) proteínas purificadas o recombinantes, tales como moléculas coestimulantes (por ejemplo, B7-1, ICAM-1, LFA-3 y GM-CSF).
Como se usa en el presente documento, "que afecta a una respuesta inmunitaria" incluye el desarrollo, en un sujeto, de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a una proteína y/o polipéptido producido por el VMA recombinante y/o composiciones y/o vacunas que comprenden el VMA recombinante de la invención. Una respuesta inmunitaria "humoral", como este término se conoce bien en la técnica, se refiere a una respuesta inmunitaria que comprende anticuerpos, mientras que la respuesta inmunitaria "celular", ya que este término es bien conocido en la técnica, se refiere a una respuesta inmunitaria que comprende linfocitos T y otros glóbulos blancos, especialmente la respuesta específica de inmunogén por linfocitos T citolíticos restringidos por HLA, es decir, "CTL". Una respuesta inmunitaria celular ocurre cuando los inmunógenos procesados, es decir, los fragmentos de péptido, se presentan junto con el complejo mayor de histocompatibilidad.
Como se usa en el presente documento, el término "alfavirus" tiene su significado convencional en la técnica, e incluye las diversas especies de virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO) y virus de la encefalitis equina del este (VEEE). El "virus de la encefalitis equina (VEE)" como se usa en el presente documento incluye VEEV, VEEO y VEEE, y sus cepas y cepas aisladas.
Por "animal" está previsto mamíferos, aves y similares. Animal u hospedador incluye mamíferos y seres humanos. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros grandes felinos, y otros felinos que incluyen guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado vacuno), porcinos (por ejemplo, cerdos), caprinos (por ejemplo, cabras), aves (por ejemplo, pollos, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios), primates (por ejemplo, prosimios, tarseros, monos, gibones, simios) y peces.
Los polinucleótidos de la divulgación incluyen secuencias que están degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, uso de codones optimizados o adaptación del uso de codones para la expresión en un hospedador específico, en particular para la expresión en mamífero. Como se usa en el presente documento, "optimizado" u "optimización" se refiere a un polinucleótido que está manipulado genéticamente para aumentar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifiquen polipéptidos del VEE, la secuencia de ADN del gen de la proteína del VEE se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A+T o G+C en composición de bases nucleotídicas con respecto al sustancialmente encontrado en dichas especies; 3) formar una secuencia de inicio de dichas especies; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme de ARN. La elevada expresión de proteína del VEE en dichas especies se puede lograr utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferido" se refiere a la preferencia presentada por una célula hospedadora específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la divulgación, en tanto que la secuencia de aminoácidos del polipéptido del VEE codificado por la secuencia de nucleótidos no cambie funcionalmente.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que tiene "esencialmente el mismo nivel de expresión (por ejemplo, nivel transcripcional y/o de proteína)" como se mide por la cantidad de ARNm (nivel de transcripción) y/o proteína recombinante (nivel de proteína) significa al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 % cuando se compara entre la expresión de al menos dos secuencias codificantes de interés, por ejemplo, envoltura, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales de la presente invención. Como un ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la poliproteína sin la proteína de la cápside del VEEV, VEEO y/o VEEE se expresa a esencialmente el mismo nivel de expresión que se determina, por ejemplo, después de la transducción de células Vero o HeLa con el VMA recombinante o VMA recombinantes de la presente invención. Si una secuencia en cuestión tiene o no "esencialmente el mismo nivel de expresión" se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la técnica usando métodos para la cuantificación de ARNm y/o proteína, por ejemplo, RT-PCR, FACS o transferencia Western, o cualquier otro método bien conocido por el experto. Un ejemplo de cómo determinar la expresión se da en el Ejemplo 4 de la presente invención.
El término "excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE", como se usa en el presente documento, se puede usar de forma intercambiable con "con la condición de que el VMA recombinante no comprenda o contenga una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de un VEE. La proteína de la cápside del término también incluye cualquier fragmento de la proteína de la cápside del VEE. Por lo tanto, ni una proteína de la cápside de longitud completa ni un fragmento de la misma está codificado por el VMA recombinante de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, los términos "expresado", "expresar", "expresión" y similares, que se pueden usar de forma intercambiable, indican la transcripción sola, así como tanto la transcripción como la traducción de una secuencia de interés. Por lo tanto, con referencia a la expresión de una secuencia de nucleótidos presentes en forma de ADN, el producto resultante de esta expresión puede ser cualquiera de ARN (resultante de la transcripción sola de la secuencia a expresar) o una secuencia de polipéptidos (resultante de tanto la transcripción como la traducción de la secuencia a expresar). Por lo tanto, el término "expresión" también incluye la posibilidad de que tanto el producto de ARN como de polipéptido resulten de dicha expresión y sigan juntos en el mismo medio compartido. Por ejemplo, este es el caso cuando el ARNm persiste tras su traducción en producto de polipéptido.
Como se usa en el presente documento, el término "casete de expresión" se define como una parte de un vector o virus recombinante usado normalmente para clonación y/o transformación. Un casete de expresión comprende normalmente a) una o más secuencias codificantes (por ejemplo, marco de lectura abierto (ORF), genes, ácidos nucleicos que codifican una proteína y/o antígeno), y b) secuencias que controlan la expresión de una o más secuencias codificantes (por ejemplo, un promotor). Además, un casete de expresión puede comprender una región no traducida 3' (por ejemplo, un terminador transcripcional, tal como un terminador transcripcional de la variolovacuna). "Casete de expresión" se puede usar de forma intercambiable con el término "unidad transcripcional".
"Formulación" se refiere a una composición que contiene un principio activo farmacéutico o ingrediente biológico, por ejemplo, un VMA recombinante de la presente invención, junto con uno o más componentes adicionales. El término "formulación" se usa indistintamente con los términos "composición farmacéutica", "composición de vacuna" y "formulación de vacuna" en el presente documento. Las formulaciones pueden ser líquidas o sólidas (por ejemplo, liofilizadas).
El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado a una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en una secuencia genómica, o solo las secuencias codificantes como en ADNc o ARN víricos y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
Como se usa en el presente documento, un gen "heterólogo", ácido nucleico, antígeno, o proteína, se entiende que es una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que no está presente en el genoma poxvírico no mutante (por ejemplo, VMA o VMA-BN). El experto entiende que un "gen heterólogo", cuando está presente en un poxvirus, tal como VMA o VMA-BN, se va a incorporar en el genoma poxvírico de tal forma que, tras la administración del poxvirus recombinante a una célula hospedadora, se exprese como el producto de gen heterólogo correspondiente, es decir, como el "antígeno heterólogo" y/o la "proteína heteróloga". La expresión se logra normalmente uniendo operativamente el gen heterólogo con elementos reguladores que permiten la expresión en la célula infectada por el poxvirus. Preferentemente, los elementos reguladores incluyen un promotor de poxvirus natural o sintético.
El término "composición inmunogénica" o "composición inmunológica" cubre una composición que causa una respuesta inmunitaria contra un antígeno de interés expresado del VMA. El término "vacuna o composición de vacuna" cubre cualquier composición que induzca una respuesta inmunitaria protectora contra los antígenos de interés, o que proteja eficazmente contra el antígeno de interés; por ejemplo, después de la administración o la inyección en el animal o humano causa una respuesta inmunitaria protectora contra el antígeno o proporciona protección eficaz contra el antígeno expresado del vector de VMA. La composición se puede administrar sola, o se puede administrar sucesivamente con otras composiciones o composiciones terapéuticas, proporcionándose así una composición de combinación, un cóctel o mezcla multivalente de dos o más, preferentemente tres, cuatro, cinco o seis composiciones.
El término "ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos", "secuencia de ácido nucleico" y "polinucleótido" se pueden usar de forma intercambiable y se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, mono- o bicatenario, o un híbrido del mismo. El término también engloba híbridos de ARN/ADN. Lo siguiente son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación, con un componente de marca. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son caperuzas, sustitución de uno o más de los nucleótidos que existen de forma natural con un análogo, e introducción de medios para la unión del polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marca, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivar de un microorganismo.
El término "marco de lectura abierto" (ORF) se refiere a una secuencia de nucleótidos, que puede ser traducida en aminoácidos. Normalmente, dicho ORF contiene un codón de iniciación, una región posterior que tiene normalmente una longitud que es un múltiplo de 3 nucleótidos, pero no contiene un codón de terminación (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA o UGA) en el marco de lectura dado. Normalmente, los ORF ocurren naturalmente o se construyen artificialmente, es decir, por medios de tecnología de genes. Un ORF codifica una proteína donde los aminoácidos en los que se pueden traducir forman una cadena unida por péptidos. Como se usa en el presente documento, el término "ORF esencial" significa un ORF que cuando se deleciona experimentalmente parcialmente o completamente, por ejemplo, en VMA, se reducen la replicación del virus VMA, el crecimiento, o tanto la replicación como el crecimiento (por ejemplo, en al menos 15 veces en el mutante en comparación con el VMA sin deleción). Los métodos de determinación de la replicación del virus VMA y el crecimiento del virus se conocen bien por el experto. Por ejemplo, los métodos se describen en Vaccinia Virus and Poxvirology, Methods and Protocols, Volume 269 Ed. por Stuart N. Isaacs (Humana Press (2004), véase, por ejemplo, el Capítulo 8, Growing Poxviruses and determining Virus Titer, Kotwal and Abrahams). Las tasas de crecimiento vírico del VMA se pueden determinar por fluorescencia de GFP como se describe, por ejemplo, en Orubu et al. (2012) PLOS One 7 :e40167 usando, por ejemplo, células CEF o el método que se describe en Hornemann et al. (2003), Journal of Virology 77:8394-8407.
Como se usa en el presente documento, "operativamente unidos" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su modo previsto, por ejemplo, un promotor transcribe el ácido nucleico a expresar. Una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se pone en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido con una secuencia codificante si el promotor se pone en una posición donde pueda dirigir la transcripción directa de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, si es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, en el mismo marco de lectura.
El "porcentaje (%) de homología de secuencias o identidad" con respecto a las secuencias del ácido nucleico descritas en el presente documento se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de referencia (es decir, la secuencia del ácido nucleico de la que deriva), después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de nucleótidos u homología se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible, tal como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluye cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, un alineamiento apropiado para secuencias del ácido nucleico se proporciona por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482-489. Este algoritmo se puede aplicar a secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE. UU., y normalizada por Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763. Una implementación a modo de ejemplo de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona por el Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicación de utilidad "BestFit". Los parámetros por defecto para este método se describen en el manual del programa del Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 (1995) (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Un método preferido de establecimiento del porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH protegido por derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif). A partir de este paquete de aplicaciones se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman, donde se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, penalización por abertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor "Match" refleja "identidad de secuencia". Lo mismo aplica al "porcentaje (%) de identidad de aminoácidos", cambiando lo que haya que cambiar. En general, se conocen en la técnica otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTp se pueden usar usando los siguientes parámetros por defecto: código genético=estándar; filtro=ninguno; cadena=ambas; corte=60; esperanza=10; matriz=BLOSUM62; descripciones=50 secuencias; clasificado por=PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos=no redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de internet: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
Los términos "fármaco", "composición farmacéutica" y "medicamento" se usan indistintamente en el presente documento con referencia a una sustancia y/o una combinación de sustancias que se usa para la prevención o el tratamiento de una enfermedad.
"Farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo o excipiente, a las dosis y concentraciones empleadas, no causará ningún efecto perjudicial no deseado en el (los) sujeto(s) al (a los) que se administra(n).
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000). Describen composiciones y formulaciones que usan vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales adecuados para la administración de los vectores y las composiciones desveladas en el presente documento. En general, la naturaleza del vehículo usado depende del modo particular de administración que se emplea. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables, tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares, como vehículo. Para composiciones sólidas (tales como polvos, píldoras, comprimidos o cápsulas), vehículos sólidos no tóxicos convencionales incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como humectantes o emulsionantes, conservantes, agentes de tamponamiento del pH y similares, tales como, por ejemplo, acetato sódico o monolaurato de sorbitano.
Como se usa en el presente documento, "previenen", "prevenir", "prevención" o "profilaxis" de una enfermedad o infección significa prevenir que dicha enfermedad ocurra en el sujeto (por ejemplo, ser humano o animal).
El término "vacunación por primovacunación-refuerzo" se refiere a una estrategia de vacunación usando una primera inyección de primovacunación de una vacuna que se dirige a un antígeno específico seguida en intervalos por una o más inyecciones de refuerzo de la misma vacuna. La vacunación por primovacunación-refuerzo puede ser homóloga o heteróloga. Una vacunación por primovacunación-refuerzo homóloga usa una vacuna que comprende el mismo inmunogén y vector para tanto la inyección de primovacunación como la una o más inyecciones de refuerzo. Una vacunación por primovacunación-refuerzo heteróloga usa una vacuna que comprende el mismo inmunogén para tanto la inyección de primovacunación como la una o más inyecciones de refuerzo, pero diferentes vectores para la inyección de primovacunación y la una o más inyecciones de refuerzo. Por ejemplo, una vacunación por primovacunaciónrefuerzo homóloga puede usar un vector de VMA recombinante que comprende los mismos ácidos nucleicos que expresan antígenos de alfavirus para tanto la inyección de primovacunación como la una o más inyecciones de refuerzo. A diferencia, una vacunación por primovacunación-refuerzo heteróloga puede usar un vector de VMA recombinante que comprende ácidos nucleicos que expresan una proteína de alfavirus para la inyección de primovacunación y otro vector de VMA recombinante que expresa una segunda proteína de alfavirus no contenida en la inyección de primovacunación o viceversa. La vacunación de primovacunación-refuerzo heteróloga también engloba diversas combinaciones, tales como, por ejemplo, el uso de un plásmido que codifica un inmunogén en la inyección de primovacunación y el uso de un VMA recombinante que codifica el mismo inmunogén en la una o más inyecciones de refuerzo, o el uso de un inmunogén de proteína recombinante en la inyección de primovacunación y el uso de un vector de VMA recombinante que codifica la misma proteína inmunogén en la una o más inyecciones de refuerzo.
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" indica una región reguladora de ácido nucleico, normalmente ADN, situada en la dirección 5’ de la secuencia de un ácido nucleico a expresar, que contiene elementos de secuencia de ADN específicos, que son reconocidos y unidos, por ejemplo, por factores de transcripción de proteína y polimerasas responsables de sintetizar el ARN de la región codificante del gen que se promueve. Como los promotores están normalmente inmediatamente adyacentes al gen en cuestión, las posiciones en el promotor se designan con respecto al sitio de iniciación de la transcripción, donde la transcripción de ADN empieza para un gen particular (es decir, las posiciones en la dirección 5’ son números negativos contando hacia atrás desde -1, por ejemplo -100 es una posición 100 pares de bases en la dirección 5’). Por lo tanto, la secuencia promotora puede comprender nucleótidos hasta esa posición -1. Sin embargo, los nucleótidos desde la posición 1 no son parte del promotor, es decir, a este respecto se debe tener en cuenta que el codón de iniciación de la traducción (ATG o AUG) no es parte del promotor. Por lo tanto, SEQ ID NO: 7 u 8 son polinucleótidos que comprenden promotores de la invención. Un "promotor de poxvirus natural" como se usa en el presente documento significa un promotor endógeno del genoma del poxvirus. Un "promotor de poxvirus sintético" significa un promotor manipulado recombinante activo para dirigir la transcripción del ácido nucleico a expresar por un poxvirus (por ejemplo, VMA en células CEF). El término "promotor 26S" es bien conocido por el experto y se refiere a un promotor subgenómico de un ARN 26S de un alfavirus que normalmente está contenido en un único marco de lectura abierto (por ejemplo, de cápside-E3-E2-6K-E1 del VEEV). El ARNm que codifica las proteínas estructurales de VEE, por ejemplo, VEEV se transcribe normalmente de un producto intermedio de replicación y un promotor de ARN subgenómico 26S.
Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con una marca o componente bioactivo.
El término "recombinante", cuando se aplica a un ácido nucleico, vector, por ejemplo, VMA y similares, se refiere a un ácido nucleico, vector, o fabricado por una combinación artificial de dos o más segmentos por lo demás heterólogos de secuencia de ácido nucleico, o a un ácido nucleico, vector o que comprende dicha combinación artificial de dos o más segmentos por lo demás heterólogos de secuencia de ácido nucleico. La combinación artificial se realiza más comúnmente por manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, usando técnicas de ingeniería genética bien establecidas. En general, un VMA "recombinante" como se describe en el presente documento se refiere a VMA que se producen por métodos habituales de ingeniería genética, es decir, los VMA de la presente invención son, por lo tanto, VMA genéticamente manipulados o genéticamente modificados. Por lo tanto, el término "VMA recombinante" incluye VMA (por ejemplo, VMA-BN) que han integrado establemente ácido nucleico recombinante, preferentemente en forma de una unidad transcripcional, en su genoma. Una unidad transcripcional puede incluir un promotor, potenciador, terminador y/o silenciador. Los VMA recombinantes de la presente invención pueden expresar determinantes antigénicos heterólogos, polipéptidos o proteínas (antígenos) tras la inducción de los elementos reguladores.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunidad protectora" o "respuesta inmunitaria protectora" significa que el sujeto vacunado es capaz de controlar una infección con el agente patógeno contra el que se hizo la vacunación. Normalmente, el sujeto que ha desarrollado una "respuesta inmunitaria protectora" desarrolla solo síntomas clínicos de leves a moderados o ningún síntoma en absoluto. En los casos en los que cabría esperar que la infección fuera mortal sin contramedida, un sujeto que tiene una "respuesta inmunitaria protectora" o "inmunidad protectora" contra un cierto agente no morirá como resultado de la infección con dicho agente.
El término "muestra de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que se analiza de un modo sustancialmente idéntico a la muestra de interés y cuya información se compara con la de la muestra de interés. Por lo tanto, una muestra de referencia proporciona un patrón que permite la evaluación de la información obtenida de la muestra de interés. Una muestra de referencia puede ser idéntica a la muestra de interés, excepto por un componente que se puede intercambiar, que falta o se añade.
Como se usa en el presente documento, "únicamente E3, E2, 6k y E1" se refiere a proteínas estructurales o a poliproteína estructural que no comprende la proteína de la cápside. En un ejemplo no limitante, únicamente E3, E2, 6k y E1 pueden ser las proteínas estructurales E3, E2, 6K y E1 de un virus de la encefalitis equina, por ejemplo, de FL93-939 o VEEE V105-00210 excluyendo proteína(s) estructural(es) adicional(es) del mismo virus o cualquier otro virus de la encefalitis equina.
El término "proteína estructural" de un VEE se refiere a una proteína/poliproteína estructural codificada por el ARN de un VEE (por ejemplo, cualquiera de los VEEO, VEEV o VEEE que se describen en el presente documento). La proteína estructural se produce normalmente por el virus como una poliproteína estructural de cinco proteínas, es decir, C, E3, E2, 6k y E1 y se representa, en general, en la bibliografía como C-E3-E2-6k-E1. E3 y 6k también se describen como señales de translocalización/transporte de membrana para las dos glucoproteínas, E2 y E1. Secuencias de nucleótidos que codifican "proteínas estructurales" como se usa en el presente documento significa una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas que se requieren para la encapsidación (por ejemplo, empaquetamiento) del genoma vírico, e incluyen la proteína de la cápside, glucoproteína E1 y glucoproteína E2. "Poliproteína estructural" del VEE se refiere a la poliproteína C-E3-E2-6k-E1 de un VEE.
Un "sujeto" significa organismos vertebrados pluricelulares vivos, que incluyen, por ejemplo, seres humanos, mamíferos no humanos y aves. El término "sujeto" se puede usar indistintamente con el término "animal" en el presente documento.
El término "nivel de transcripción" o "nivel de proteína" relacionado con un promotor específico, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de gen/producto de ácido nucleico presente en el cuerpo o una muestra en un cierto momento de tiempo. El nivel de transcripción o de proteína (por ejemplo, transcripción de ácido nucleico como cantidad de ARNm o proteína traducida del ARNm) se puede, por ejemplo, determinar, medir o cuantificar por medio del ARNm o proteína expresada del gen/polinucleótido, por ejemplo, como se codifica por el VMA recombinante de la presente invención. La expresión génica puede dar como resultado la producción de la proteína, por transcripción del gen por ARN polimerasa para producir un ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma información que codifica la proteína y traducción del ARNm por ribosomas para producir la proteína. El término "transcrito" o "transcripción" se refiere al proceso de copia de una secuencia de ADN del gen por ARN polimerasa en el ARNm, usando el ADN como plantilla. El término "traducido" o "traducción" se refiere al proceso por el que la información contenida en el ARNm se usa como prototipo para sintetizar la proteína. El nivel de transcripción o de proteína se puede cuantificar, por ejemplo, normalizando la cantidad ARNm o de proteína de interés presente en una muestra con la cantidad total de producto génico de la misma categoría (ARNm o proteína total) en la misma muestra o una muestra de referencia (por ejemplo, tomada al mismo tiempo de la misma muestra). La transcripción se puede medir o detectar por medio de cualquier método que se conoce en la técnica, por ejemplo, métodos para la detección indirecta y la medición del producto génico de interés que normalmente funcionan por la unión del producto génico de interés con una o más moléculas diferentes o medios de detección (por ejemplo, cebador(es), sondas, anticuerpos, armazones de proteína) específicos para el producto génico de interés. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, RT-PCR y/o PCR cuantitativa. La determinación del nivel de proteína se puede medir o detectar por medio de cualquier método conocido como conoce el experto, por ejemplo, transferencia Western, ELISA o espectrometría de masas.
Como se usa en el presente documento, el "terminador transcripcional" comprende unas secuencias de ADN que participa en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. El virus de la variolovacuna que incluyen ARN polimerasa de VMA termina la transcripción en la dirección 3’ de una señal de ARN (UUUUUNU, TTTTTNT o T5NT al nivel de ADN) en el ARN naciente (Earl et al. (1990), J. Virol. 64:2448-2451). El "terminador transcripcional" se denomina algunas veces una "señal de terminación" en la bibliografía y, por lo tanto, se puede usar de forma intercambiable.
Como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad significa la prevención, la reducción, la mejoría, el alivio parcial o completo, o la cura de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad causada por el VEE. Puede ser uno o más de reducir la intensidad de la enfermedad, limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos de la enfermedad que está tratándose, inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos de la enfermedad que está tratándose, limitar o prevenir la reaparición de la enfermedad en un sujeto que ha tenido previamente la enfermedad, y limitar o prevenir la reaparición de síntomas en los sujetos.
Como se usa en el presente documento, "trivalente" en combinación con vacuna o VMA recombinante significa que la vacuna o VMA recombinante tiene una valencia contra tres virus diferentes y genera una respuesta inmunitaria protectora contra antígenos (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de los diferentes virus. Por lo tanto, en el contexto de una vacuna trivalente de VMA de la invención, trivalente significa una valencia contra tres virus diferentes cuyos antígenos están codificados por la vacuna de VMA o vacuna que comprende un VMA recombinante que expresa los ácidos nucleicos que codifican los antígenos, por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales de VEEV, VEEO y VEEE. Otro ejemplo de trivalente que también está cubierto por el significado de trivalente es que los tres virus diferentes son cepas de virus diferentes, por ejemplo, dos cepas de VEEO tales como por ejemplo 71V-1658 y Fleming, además de una cepa de VEEV o VEEE. En el último caso, el VMA recombinante de la presente invención comprende, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas (por ejemplo, proteína estructural, poliproteína estructural, proteína de la envoltura) de 71V-1658 del VEEO, Fleming del VEEO y de una cepa de VEEE, por ejemplo, V105-00210 del VEEE. En comparación, “monovalente” significa que la vacuna o VMA recombinante tiene una valencia contra solo un virus de una especie particular, tal como solo VEEV, solo VEEO o solo VEEE, y genera una respuesta inmunitaria protectora contra solo una proteína estructural o poliproteína estructural de un virus. Sin embargo, no excluye la generación de respuestas inmunitarias protectoras contra varios subtipos de virus estrechamente relacionados. Por lo tanto, "divalente" significa que la vacuna o VMA recombinante tiene una valencia contra dos virus.
Un "vector" se refiere a un ADN recombinante o plásmido o virus de ARN que comprende un polinucleótido heterólogo que se va a administrar a una célula diana, tanto in vitro como in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los fines de prevención o terapia, y puede estar opcionalmente en forma de un casete de expresión. Como se usa en el presente documento, un vector no necesita ser capaz de replicación en la célula diana o sujeto definitivo. El término incluye vectores de clonación y vectores víricos.
El término "replicón vírico", como se usa en el contexto de la presente invención, se usa para referirse a ARN o ADN que comprende porciones del ARN genómico vírico 49S que son esenciales para la transcripción y para la amplificación citoplásmica del ARN transportado y para la expresión del ARN subgenómico de una secuencia del ácido nucleico heteróloga. Por lo tanto, el replicón codifica y expresa proteínas no estructurales víricas necesarias para la amplificación citoplásmica del ARN de virus.
En el contexto de la presente invención, el término "virus" o "virus recombinante" se refiere a un virus infeccioso o no infeccioso que comprende un genoma vírico. En este caso, los ácidos nucleicos, promotores, proteínas recombinantes y/o casetes de expresión, como se mencionan en el presente documento, son parte del genoma vírico del virus recombinante respectivo. El genoma vírico recombinante se encapsida y los virus recombinantes obtenidos se pueden usar para la infección de células y estirpes celulares, en particular para la infección de animales vivos que incluyen a los seres humanos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ahora se hará referencia con detalle a realizaciones a modo de ejemplo de la invención, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos.
En un aspecto, la presente invención proporciona un virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural, preferentemente una poliproteína estructural, de un virus de la encefalitis equina (VEE) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE.
En realizaciones particulares de la invención, el VEE se selecciona del grupo del virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y/o de la encefalitis equina del este (VEEE).
Como se muestra en el presente documento por primera vez, un VMA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína estructural del virus de la encefalitis equina (VEE) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE proporciona una vacuna que protege contra VEEO, VEEV y/o VEEE en sujetos. Esto fue sorprendente, ya que el estado de la técnica usando vectores basados en el virus de la variolovacuna que codifica proteínas estructurales del VEEV fueron incapaces de proteger contra la exposición transmitida por el aire y dejaron de ofrecer protección completa contra la exposición al VEEV respiratorio, incluso cuando se vacuna con virus de la variolovacuna recombinante E3-E2-6k-E1 (Phillpotts et al. (2000) como se citó anteriormente). Es el primer informe que muestra que el poxvirus recombinante, tal como VMA, puede inducir una respuesta inmunitaria protectora en ratones en un estudio de exposición a VEEO y VEEE. Se pudieron lograr resultados de eficacia e inmunogenicidad similares para los tres alfavirus, aunque existen diferencias entre ellos. VEEO y VEEE son virus neurotrópicos que producen viremia limitada, en donde el VEEV produce una enfermedad febril sistémica (Nagata et al. (2013), Future Virol. 8:661 -674). A diferencia del VEEV, el VEEE se replica mal en linfocitos y deja de replicarse en células dendríticas y macrófagos. También se pudo demostrar que una aplicación combinada de VMA recombinante que comprende secuencias de nucleótidos que codifican antígenos contra el VEEO, el VEEV y el VEEE ofrece protección contra la exposición a los tres alfavirus por exposición respiratoria en ratones. Una ventaja adicional es que el VMA recombinante se puede administrar por una vía mucosa que provoca una protección contra la exposición a aerosoles.
En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural o poliproteína estructural deriva de uno o más de los virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO), preferentemente que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda o tercera proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y/o del este (VEEE).
En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica la poliproteína estructural deriva de uno o más virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), preferentemente que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda o tercera proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO) y/o del este (VEEE).
En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica la poliproteína estructural deriva de uno o más virus de la encefalitis equina del este (VEEE), preferentemente que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda o tercera proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y/o del oeste (VEEO).
En realizaciones particulares, el VMA recombinante comprende una, dos o tres secuencias de nucleótidos que comprenden cada una un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier proteína estructural o cualquier poliproteína estructural del VEE como se describe en el presente documento, excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE. Ninguna de las secuencias de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales o poliproteínas estructurales que se describe en el presente documento codifica una proteína de la cápside del VEE.
Las secuencias de VEE, tales como virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), del este (VEEE) y del oeste (VEEO), y cepas de los mismos (por ejemplo, Trinidad Donkey, Fleming), así como las proteínas codificadas por ellas (por ejemplo, E3, E2, 6k, E1), están disponibles para el experto en bases de datos públicas, tales como la base de datos de secuencias GenBank proporcionada por el centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI).
Virus, proteínas y secuencias de nucleótidos del VEE
Los VEE son alfavirus que pertenecen a la familia de Togaviridae. Los VEE son virus de ARN pequeños y envueltos de hebra positiva bien conocidos en la técnica. La nucleocápside vírica está rodeada por las membranas lipídicas derivadas del hospedador en las que se incorporan un trímero de proteínas de la envoltura de heterodímeros E1 y E2. La nucleocápside consiste en una proteína de la cápside (C) rodeada del genoma de ARN monocatenario. El genoma de ARN (ARN 49S) de virus VEE tiene aproximadamente 11-12 kb de longitud y contiene una caperuza en 5' y una cola de poliadenilación en 3' y se traduce inmediatamente tras la entrada en la célula. La región 5' del genoma codifica cuatro proteínas no estructurales (NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4). La región 3' del genoma codifica cinco proteínas estructurales (C, E3, E2, 6k, E1) que se expresan como una poliproteína estructural de ARN 26S subgenómico. El ARNm que codifica las proteínas estructurales se transcribe de un producto intermedio de replicación y un promotor subgenómico de 26S. La escisión por proteasas de la poliproteína produce las proteínas estructurales maduras C, E3, E2, 6k, E1. La proteína de la nucleocápside (C) posee actividad auto-proteolítica que escinde la proteína C de la proteína precursora poco después de que el ribosoma entre en la unión entre la secuencia codificante de la proteína C y E3. Posteriormente, las glucoproteínas de la envuelta E2 y E1 derivan por escisión proteolítica y forman heterodímeros. E2 aparece inicialmente en la célula infectada como un precursor, pE2, que consiste en E3 y E2. Después de la glucosilación y el tránsito a través del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, E3 se escinde de E2 por actividad de proteasa de tipo furina en un sitio de escisión.
En ciertas realizaciones de la invención, la proteína estructural o poliproteína estructural comprende o consiste en menos de 5 proteínas estructurales, preferentemente 4 proteínas estructurales.
En ciertas realizaciones de la invención, la proteína estructural o poliproteína estructural comprende E2 y E1.
En ciertas realizaciones de la invención, la(s) proteína(s) estructural(es) o la poliproteína estructural comprende o consiste únicamente en E3, E2, 6k y E1.
El experto conoce diversas cepas y subtipos del VEE, tales como los virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), del este (VEEE) y del oeste (VEEO), y están englobados por las realizaciones de la invención. En realizaciones particulares de la presente invención, el VEEO puede ser uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) de las cepas del VEEO o cepas aisladas seleccionadas del grupo de Fleming, McMillan, 71V-1658, CBA87, California, Mn520, Mn548 y B-11 del VEEO, preferentemente Fleming, 71V-1658 y CBA87 del VEEO. Los VEe E se describen, por ejemplo, en Nagata et al. (2006), Journal of General Virology 87:2353-61. Por lo tanto, en una realización preferida, el VEEO puede ser una o más (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) de las cepas del VEEO seleccionadas del grupo de Fleming, McMillan, 71V-1658, CBA87, California, Mn520, Mn548 y B-11 del VEEO, seleccionadas preferentemente del grupo de Fleming, 71V-1658 y CBA87 del VEEO, lo más preferentemente 71V-1658 del VEEO.
En realizaciones particulares de la presente invención, el VEEV es uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) seleccionados del grupo de subtipo IAB, IC, IE, IF, Everglades, Mucambo, Pixuna, Cabassou y Rio Negro. Everglades, Mucambo, Pixuna, Cabassou y Rio Negro se han descrito previamente como el subtipo II a VI, es decir, Everglades (antiguamente II), Mucambo (antiguamente III), Pixuna (antiguamente IV), Cabassou (antiguamente V) y Rio Negro (antiguamente VI) (King et al. (2012), Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Eds., King AMG, et al. San Diego, CA, Elsevier Academic Press). Preferentemente, el VEEV de cualquiera de las realizaciones en el presente documento es uno o dos VEEV seleccionados del grupo de subtipo IAB y IC.
En realizaciones particulares, el VEEV de cualquiera de las realizaciones en el presente documento puede ser una o más (por ejemplo, dos o tres) de las cepas o cepas aisladas del VEEV seleccionadas del grupo de Trinidad Donkey (TrD), INH-9813 y INH-6803 del VEEV, seleccionadas preferentemente del grupo de Trinidad Donkey (TrD) y INH-9813 del VEEV, lo más preferentemente Trinidad Donkey (TrD) del VEEV.
En realizaciones particulares, el VEEE de cualquiera de las realizaciones en el presente documento es un VEEE de América el Norte y caribeño (VEEE AN) y/o de América del Sur (VEEE AS). El de América del Sur (VEEE AS) se ha vuelto a clasificar como el virus de Madariaga (MADV II-IV) como se describe en King et al. (King et al. (2012), Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Eds., King AMG, et al. San Diego, CA, Elsevier Academic Press).
En aun otras realizaciones, el VEEE de cualquiera de las realizaciones en el presente documento puede ser uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) de las cepas de VEEE o cepas aisladas seleccionadas del grupo de New Jersey 60, NJ 1959, 82V-2137, FL93-939, FL-91-4679, PE6 y V105-00210 del VEEE, seleccionadas preferentemente del grupo de FL93-939, FL-91 -4679, PE6 y V105-00210, más preferentemente una o más (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro) seleccionadas del grupo de FL93-939, PE6 y V105-00210, más preferentemente V105-00210 del VEEE.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEEO, VEEV y/o v Ee E se selecciona de la cepa CBA87, 71V-1658, FL93-939, Fleming, TrD, INH-9813, INH-6803, 71V-1658, PE-6, FL91 -4679 y/o V105-00210, preferentemente FL93-939, TrD, Fleming y/o V105-00210.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEEO, VEEV y/o VEEE se selecciona de la cepa CBA87, 71V-1658, FL93-939 y/o Fleming.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEEO, VEEV y/o VEEE codifica el aminoácido de la proteína estructural o poliproteína estructural seleccionado de la cepa CBA87, 71V-1658, FL93-939, Fleming, TrD, INH-9813, INH-6803, 71V-1658, PE-6, FL91-4679 y/o V105-00210, preferentemente FL93-939, TrD, Fleming y/o V105-00210, excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del virus.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEEO, VEEV y/o VEEE codifica el aminoácido de la proteína estructural o poliproteína estructural seleccionado de la cepa CBA87, 71V-1658, FL93-939 y/o Fleming, excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del virus.
Se debe entender que también está englobada cualquier combinación de VEEO, VEEE y/o VEEV como se ha mencionado anteriormente con cualquiera de las realizaciones como se describe en el presente documento.
La(s) secuencia(s) de nucleótido(s) que codifican una proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE como se mencionó en el presente documento se refieren a secuencias de nucleótidos (por ejemplo, secuencias genómicas o genes), que codifican la proteína correspondiente de cualquier cepa o cepa aislada del VEE, aun cuando la secuencia exacta y/o la localización genómica del gen se pueda diferenciar entre las cepas o cepas aisladas. Asimismo, las proteínas estructurales o poliproteínas estructurales del VEE mencionadas en el presente documento se refieren a proteínas o variantes de las mismas, codificadas y expresadas por la secuencia de nucleótidos genómica correspondiente. A modo de ejemplo, la proteína estructural o poliproteína estructural del VEEO comprende un marco de lectura abierto que engloba los nucleótidos 7497-11207 (puntos extremos incluidos) como se numera en el N.° de acceso de GenBank GQ287645.1. Una secuencia de nucleótidos de la proteína estructural o poliproteína estructural de dicho VEEO, excluyendo la codificación de la proteína de la cápside, se expone en SEQ ID NO:4 empezando en la posición 3 de SEQ iD NO:4. La posición 1 a 3 de SEQ ID NO:4 codifica una metionina. La secuencia de aminoácidos correspondiente se expone en SEQ ID NO:1.
Una poliproteína estructural del VEEV a modo de ejemplo se proporciona en N.° de acceso de GenBank LO1442.2. Una poliproteína estructural de VEEO comprende un marco de lectura abierto que abarca los nucleótidos 7562-11329 (puntos extremos incluidos) como se numera en N.° de acceso de GenBank LO1442.2. La secuencia de nucleótidos de la proteína estructural o poliproteína estructural de dicho VEEV, excluyendo la codificación de la proteína de la cápside expuesta en SEQ ID NO:5 que empieza en la posición 3 de SEQ ID NO:5. La posición 1 a 3 de SEQ ID NO:5 codifica una metionina. La secuencia de aminoácidos correspondiente se expone en SEQ ID NO:2.
Un polipéptido estructural del VEEE a modo de ejemplo se proporciona en N.° de acceso de GenBank EF151502.1. Una poliproteína estructural del VEEE comprende un marco de lectura abierto que abarca los nucleótidos 7595-11323 (puntos extremos incluidos) como se numera en N.° de acceso de GenBank EF151502.1. La secuencia de nucleótidos de la proteína estructural o poliproteína estructural de dicho VEEE, excluyendo la codificación de la proteína de la cápside, se expone en SEQ ID NO:6 que empieza en la posición 3 de SEQ ID NO:6. La posición 1 a 3 de SEQ ID NO:3 codifica una metionina. La secuencia de aminoácidos correspondiente se expone en SEQ ID NO:3.
En realizaciones particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE, excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE, codifica una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en SEQ ID NO: 1,2 y/o 3 o una variante de la misma.
En realizaciones particulares, dicha variante tiene al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína o polipéptido referenciado al nivel de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1,2 o 3.
En realizaciones particulares adicionales, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural de un VEE excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE comprende o consiste en SEQ ID NO: 4, 5 y/o 6 o una variante de la misma.
En realizaciones particulares, dicha variante tiene al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencias de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos referenciada, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, 5 y/o 6, preferentemente en donde la variante no cambia la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, 5 y/o 6.
Virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA)
El virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) se ha generado por más de 570 pases sucesivos en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa de la variolovacuna Ankara dérmica (virus de la variolovacuna corioalantoidea Ankara, VCA; para una revisión véase Mayr et al. (1975), Infection 3:6-14) que se mantuvo en el Vaccination Institute, Ankara, Turquía, durante muchos años y se usó como base para la vacunación de seres humanos. Sin embargo, debido a las complicaciones frecuentemente graves posteriores a la vacunación asociadas a los virus de la variolovacuna, hubo varios intentos por generar una vacuna antivariólica más atenuada y más segura.
Durante el periodo de 1960 a 1974, el Prof. Anton Mayr logró atenuar el VCA mediante más de 570 pases continuos en células CEF (Mayr et al. (1975)). Se mostró en una variedad de modelos animales que el VMA resultante era avirulento (Mayr, A. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Stand. 41:225-234). Como parte del desarrollo inicial del VMA como una pre-vacuna antivariólica, hubo ensayos clínicos que usaron VMA-517 en combinación con Lister Elstree (Stickl (1974), Prev. Med. 3:97-101; Stickl y Hochstein-Mintzel (1971), Munch. Med. Wochenschr. 113: 1149-1153) en sujetos en riesgo de reacciones adversas de la variolovacuna. En 1976, el VMA derivado de la reserva de inóculos en cultivos celulares VMA-571 (correspondiente al pase 571) se registró en Alemania como la primera vacuna en un programa de vacunación contra la viruela parenteral de dos etapas. Posteriormente, se usó VMA-572 en aproximadamente 120.000 individuos caucásicos, la mayoría niños entre 1 y 3 años de edad, sin efectos secundarios graves notificados, aun cuando muchos de los sujetos estaban entre la población de alto riesgo de complicaciones asociadas a la variolovacuna (Mayr et al. (1978), Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390). VMA-572 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales como ECACC V94012707.
Como resultado de los pases usados para atenuar el VMA, hay varias cepas o cepas aisladas diferentes, dependiendo del número de pases realizados en células CEF. Por ejemplo, se usó VMA-572 en una pequeña dosis como pre­ vacuna en Alemania durante el programa de erradicación de la viruela, y VMA-575 se usó ampliamente como vacuna veterinaria. El VMA, así como VMA-BN, carece de aproximadamente el 15 % (31 kb de seis regiones) del genoma en comparación con el virus VCA ancestral. Las deleciones afectan a varios genes de virulencia y del intervalo de hospedador, así como al gen para los cuerpos de inclusión de tipo A.
Aun cuando Mayr et al. demostraron durante el año 1970 que el VMA estaba altamente atenuado y era avirulento en seres humanos y mamíferos, ciertos investigadores han informado que el VMA no está completamente atenuado en las estirpes de células de mamífero y humanas, puesto que podría ocurrir replicación residual en estas células (Blanchard et al. (1998), J. Gen. Virol. 79:1159-1167; Carroll & Moss (1997), Virology 238:198-211; patente de EE. UU. N.° 5.185.146; Ambrosini et al. (1999), J. Neurosci. Res. 55:569). Se asume que los resultados informados en estas publicaciones han sido obtenidos con diversas cepas del VMA conocidas, puesto que los virus usados se diferencian esencialmente en sus propiedades, particularmente en su comportamiento de crecimiento en diversas estirpes celulares. Dicha replicación residual no se desea por diversos motivos, que incluyen cuestiones de seguridad a propósito de su uso en seres humanos.
Una cepa del VMA que tiene perfiles de seguridad potenciados para el desarrollo de vacunas o productos farmacéuticos ha sido desarrollada por Bavarian Nordic: el VMA fue sometido a más pases por Bavarian Nordic y se designa VMA-BN, depositada el 30 de agosto de 2000 en la Colección Europea de Cultivos celulares (ECACC) con el número V00083008.
El VMA-BN se puede fijar a y entrar en células humanas donde genes víricamente codificados se expresan muy eficientemente. El VMA-BN se adapta fuertemente a células primarias de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y no se replica en células humanas. En células humanas, se expresan genes víricos, y se produce virus no infeccioso. Se han administrado preparaciones de VMA-BN y derivados a muchos tipos de animales, y a más de 2000 sujetos humanos, que incluyen individuos inmunodeficientes. Todas las vacunaciones han demostrado ser, en general, seguras y bien toleradas. A pesar de su elevada atenuación y reducida virulencia en estudios preclínicos, se ha mostrado que VMA-BN provoca respuestas celulares tanto humorales como inmunitarias a la variolovacuna y a productos de genes heterólogos codificados por genes clonados en el genoma del VMA (E. Harrer et al. (2005), Antivir. Ther. 10:285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22:21-9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14:1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10:5381-5390).
Aunque se prefiere el VMA-BN por su mayor seguridad (menos competente en la replicación), todos los VMA y los específicamente descritos en el presente documento son adecuados para cualquiera de las realizaciones de la presente invención.
Los ejemplos de cepas de virus VMA que son útiles en la práctica de la presente invención y que se han depositado en cumplimiento con los requisitos del Tratado de Budapest son las cepas VMA 572, depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animal (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG, Reino Unido, con el número de depósito ECACC 94012707 el 27 de enero de 1994, y VMA 575, depositada con ECACC 00120707 el 7 de diciembre de 2000, VMA-BN, depositada el 30 de agosto de 2000 en la Colección Europea de Cultivos celulares (ECACC) con el número V00083008, y sus derivados, son cepas adicionales a modo de ejemplo.
"Derivados" o "variantes" del VMA o VMA-BN se refieren a virus que presentan esencialmente las mismas características de replicación que el VMA que se describe en el presente documento, pero que presentan diferencias en una o más partes de sus genomas. El VMA-BN, así como un derivado o variante del VMA-BN, deja de replicarse de forma reproductiva in vivo en seres humanos y ratones, incluso en ratones gravemente inmunodeprimidos. Más específicamente, el VMA-BN o un derivado o variante del VMA-BN también tiene preferentemente la capacidad de replicación reproductora en fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero no la capacidad de replicación reproductora en la estirpe celular humana de queratinocitos HaCat (Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771), la estirpe celular de osteosarcoma de hueso humano 143B (depósito de ECACC N.° 91112502), la estirpe celular 293 de riñón de embrión humano (depósito de ECACC N.° 85120602) y la estirpe celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa (depósito de ATCC N.° CCL-2). Además, un derivado o variante de VMA-BN tiene una relación de amplificación vírica de al menos dos veces menos, más preferentemente tres veces menos, que VMA-575 en células Hela y estirpes celulares HaCaT. Las pruebas y ensayos de estas propiedades de variantes del VMA se describen en el documento de patente WO 02/42480 (solicitud de patente de EE. UU. N.° 2003/0206926) y el documento de patente WO 03/048184 (solicitud de patente de EE. UU. N.22006/0159699).
El término "no es capaz de replicación reproductora" o "sin capacidad de replicación reproductora" se describe, por ejemplo, en el documento de patente WO 02/42480, que también enseña cómo obtener VMA que tiene las propiedades deseadas como se ha mencionado anteriormente. El término se aplica a un virus que tiene una relación de amplificación de virus 4 días después de la infección de menos de 1 usando los ensayos descritos en el documento de patente WO 02/42480 o en la patente de EE. UU. N.° 6.761.893.
El término "deja de replicarse de forma reproductiva" se refiere a un virus que tiene una relación de amplificación de virus 4 días después de la infección inferior a 1. Los ensayos descritos en el documento de patente WO 02/42480 o en la patente de EE. UU. N.° 6.761.893 son aplicables a la determinación de la relación de amplificación de virus.
La amplificación o replicación de un virus se expresa normalmente como la relación entre el virus producido a partir de una célula infectada (salida) y la cantidad originalmente usada para infectar la célula en primer lugar (entrada), denominada la "relación de amplificación". Una relación de amplificación de "1" define un estado de amplificación donde la cantidad de virus producida a partir de las células infectadas es la misma que la cantidad inicialmente usada para infectar las células, que significa que las células infectadas son permisivas para la infección y la reproducción del virus. A diferencia, una relación de amplificación inferior a 1, es decir, una disminución en la salida en comparación con el nivel de entrada, indica una falta de replicación reproductora y, por lo tanto, la atenuación del virus.
Para la generación de un VMA recombinante como se describe en el presente documento, se puede usar cualquiera de los VMA anteriores. En una realización preferida, el VMA usado para generar el virus recombinante es VMA o un derivado o variante del mismo (en particular VMA-BN o un derivado o variante del mismo), que tiene preferentemente la capacidad de replicación reproductora in vitro en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero sin la capacidad de replicación reproductora en la estirpe celular de queratinocitos humanos HaCat.
En otras realizaciones, el VMA usado para generar el virus recombinante es VMA o un derivado o variante del mismo (en particular, el VMA-BN o un derivado o variante del mismo) que tiene la capacidad de replicación reproductora in vitro en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero sin la capacidad de replicación reproductora en la estirpe celular de queratinocitos humanos HaCat, la estirpe celular de osteosarcoma de hueso humano 143B y/o la estirpe celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa.
En otra realización, el VMA usado para generar el virus recombinante es VMA o un derivado o variante del mismo (en particular VMA-BN o un derivado o variante del mismo) que tiene la capacidad de replicación reproductora in vitro en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero sin la capacidad de replicación reproductora en la estirpe celular de queratinocitos humanos HaCat, la estirpe celular de osteosarcoma de hueso humano 143B, la estirpe celular de riñón de embrión humano 293 y/o la estirpe celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa.
En otro aspecto, un VMA usado para generar el virus recombinante puede ser VMA-572, VMA-575, Acamb3000 VMA, VMA-BN como se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animal (ECACC) con el número de acceso V00083008, o cualquier cepa del VMA similarmente atenuada.
En otra realización, el VMA usado para generar el VMA recombinante es VMA-BN como se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animal (ECACC) con el número de acceso V00083008.
El VMA útil para la presente invención se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los descritos en los documentos de patente WO 2002/042480 y WO 2002/24224.
Sitios de integración en VMA
Las secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE se pueden insertar en cualquier parte adecuada del virus o vector vírico, en particular el genoma vírico del VMA recombinante. Las partes adecuadas del VMA recombinante son partes no esenciales del genoma del VMA. Las partes no esenciales del genoma del VMA pueden ser regiones intergénicas o los sitios de deleción conocidos 1 -6 del genoma del VMA. Alternativamente o, además, partes no esenciales del VMA recombinante pueden ser una región codificante del genoma del VMA que no es esencial para el crecimiento vírico. Sin embargo, los sitios de inserción no están limitados a estos sitios de inserción preferidos en el genoma del VMA, puesto que está dentro del alcance de la presente invención que el promotor, casete de expresión y/o nucleótido que codifica una, dos tres o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE como se describe en el presente documento se puedan insertar en cualquier parte en el genoma vírico en tanto que sea posible obtener recombinantes que se pueden amplificar y propagar en al menos un sistema de cultivo celular, tales como fibroblastos de embrión de pollo (células CEF). Preferentemente, las secuencias de nucleótidos que codifican una, dos, tres o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE se pueden insertar en una o más regiones intergénicas (IGR) del VMA. El término "región intergénica" se refiere preferentemente a las partes del genoma vírico localizadas entre dos marcos de lectura abiertos (ORF) adyacentes del genoma del virus del VMA, preferentemente entre dos ORF esenciales del genoma del virus del v Ma . En ciertas realizaciones, el IGR se selecciona de IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 y IGR 148/149. En ciertas realizaciones, menos de 5, 4, 3 o 2 IGR del VMA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE. El número de sitios de inserción del VMA que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos se insertan en 4, 3, 2 o menos sitios de inserción. Preferentemente, se usan dos sitios de inserción, preferentemente IGR 44/45 e IGR 88/89. En ciertas realizaciones, se usan tres sitios de inserción. Preferentemente, el VMA recombinante comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes insertados en 2 o 3 sitios de inserción.
Las secuencias de nucleótidos se pueden insertar, adicionalmente o alternativamente, en uno o más de los sitios de deleción conocidos, es decir, los sitios de deleción I, II, III, IV, V o VI del genoma de VMA. El término "sitio de deleción conocido" se refiere a las partes del genoma del VMA que se delecionaron mediante pases continuos en células CEF caracterizadas en el pase 516 con respecto al genoma del virus parental del que deriva el VMA, en particular el virus de la variolovacuna corioalantoideo Ankara (VCA) parental, por ejemplo, como se describe en Meisinger-Henschel et al. (2007), Journal of General Virology 88:3249-3259. En ciertas realizaciones, menos de 5, 4, 3 o 2 de los sitios de deleción conocidos del VMA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una, dos, tres o más proteínas (por ejemplo, proteínas estructurales o poliproteínas estructurales) de un VEE como se describe en el presente documento.
Los virus VMA recombinantes proporcionados en el presente documento se pueden generar por métodos rutinarios conocidos en la técnica. Los métodos de obtención de VMA recombinantes o de inserción de secuencias codificantes exógenas en un genoma del VMA se conocen bien por el experto en la técnica. Por ejemplo, los métodos de técnicas habituales de biología molecular, tales como técnicas de clonación de ADN, aislamiento de ADN y ARN, análisis de transferencia Western, RT-PCR y amplificación por PCR se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), y técnicas para el manejo y la manipulación de virus se describen en Virology Methods Manual (B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)). Similarmente, técnicas y conocimiento para el manejo, la manipulación y la ingeniería genética de VMA se describen en Molecular CloningMolecular Cloning, A Laboratory Manual Molecular Virology: A Practical Approach (A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press en Oxford University Press, Oxford, GB (1993), véase, por ejemplo, Capítulo 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors) y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998), véase, por ejemplo, el Capítulo 16, Sección IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector).
Para la generación de los diversos VMA recombinantes desvelados en el presente documento, se pueden aplicar diferentes métodos conocidos por el experto en la técnica. La secuencia de ADN a insertar en el virus se puede poner en una construcción de plásmido de E. coIí en la que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del VMA. Por separado, la secuencia de ADN a insertar se puede ligar a un promotor. El enlace promotor-gen se puede situar en la construcción de plásmido de manera que el enlace promotor-gen esté flanqueado en ambos extremos por el ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región de ADN del VMA que contiene un sitio no esencial. La construcción de plásmido resultante se puede amplificar por propagación dentro de bacterias de E. coIí y aislar. El plásmido aislado que contiene la secuencia del gen de ADN que va a insertarse se puede transfectar en un cultivo celular, por ejemplo, de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), al mismo tiempo el cultivo se infecta con VMA. La recombinación entre ADN del VMA homólogo en el plásmido y el genoma vírico, respectivamente, puede generar un VMA modificado por la presencia de secuencias de ADN extraño.
Según una realización preferida, una célula de un cultivo celular adecuado como, por ejemplo, células CEF, se puede infectar con el VMA. La célula infectada puede ser, posteriormente, transfectada con un primer vector plasmídico que comprende un gen o genes extraños o heterólogos, preferentemente bajo el control de la transcripción de un elemento de control de la expresión. Como se ha explicado anteriormente, el vector plasmídico también comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia exógena en una parte seleccionada del genoma del VMA. Opcionalmente, el vector plasmídico también contiene un casete que comprende un marcador y/o gen de selección operativamente unido a un promotor de poxvirus. El marcador o genes de selección adecuados son, por ejemplo, los genes que codifican la proteína verde fluorescente, p-galactosidasa, neomicina-fosforribosiltransferasa u otros marcadores. El uso casetes de selección o marcadores simplifica la identificación y el aislamiento del VMA recombinante generado.
Sin embargo, un VMA recombinante también se puede identificar por tecnología de PCR. Posteriormente, se puede infectar una célula adicional con el VMA recombinante obtenido, como se ha descrito anteriormente, y transfectar con un segundo vector que comprende un segundo gen o genes extraños o heterólogos. En caso de que este gen se deba introducir en un sitio de inserción diferente del genoma de VMA, el segundo vector también se diferencia en las secuencias homólogas del VMA que se dirigen a la integración del segundo gen o genes extraños en el genoma del VMA. Después de que haya ocurrido la recombinación homóloga, se puede aislar el virus recombinante que comprende dos o más genes extraños o heterólogos. Para introducir genes extraños adicionales en el virus recombinante, las etapas de infección y transfección se pueden repetir usando el virus recombinante aislado en etapas previas para la infección y usando un vector adicional que comprende un gen o genes extraños adicionales para la transfección.
Alternativamente, las etapas de infección y transfección como se han descrito anteriormente son intercambiables, es decir, una célula adecuada puede ser transfectada primero por el vector plasmídico que comprende el gen extraño y, luego se infecta con el VMA. Como alternativa adicional, también es posible introducir cada gen extraño en diferentes virus, co-infectar una célula con todos los virus recombinantes obtenidos y seleccionar un recombinante que incluye todos los genes extraños. Una tercera alternativa es la unión del genoma de ADN y secuencias extrañas in vitro y la reconstitución del genoma de ADN del virus de la variolovacuna recombinado usando un virus auxiliar. Una cuarta alternativa es la recombinación homóloga en E. coli u otra especie bacteriana entre un genoma del virus de la variolovacuna como cromosoma artificial bacteriano (BAC) y una secuencia extraña lineal flanqueada con secuencias de ADN homólogo y secuencias que flanquean el sitio de integración deseado en el genoma del virus de la variolovacuna.
Expresión de proteínas del VEE
En ciertas realizaciones, la expresión de una, más, todas las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína (por ejemplo, una proteína estructural o poliproteína estructural de cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento) del virus VEE de cualquiera de los VEE preferidos (por ejemplo, VEEO, VEEV, VEEE) que se describen en el presente documento está bajo el control de uno o más promotores de poxvirus. El promotor según la presente invención puede ser cualquier promotor de poxvirus sintético o natural. En ciertas realizaciones, el promotor de poxvirus es un promotor Pr13.5, un promotor PrHyb, un promotor Pr7.5, un promotor híbrido temprano/tardío, un promotor PrS, un promotor PrS5E, un promotor sintético o natural temprano o tardío, o un promotor ATI del virus de la viruela vacuna. Los promotores adecuados se describen además en los documentos de patente WO 2010/060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611 y WO 2014/063832.
En ciertas realizaciones, el promotor de poxvirus se selecciona del grupo que consiste en el promotor PrHyb (SEQ ID NO:8) y el promotor Pr13.5 (SEQ ID NO:7).
Una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína del VEE se puede expresar como una única unidad transcripcional. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína del VEE (por ejemplo, proteína estructural o poliproteína estructural) puede estar operativamente unida a un promotor de poxvirus y/o ligada a un terminador transcripcional de poxvirus (por ejemplo, virus de la variolovacuna).
En ciertas realizaciones, la unidad transcripcional se inserta por sí misma en un sitio de inserción en el genoma del VMA. En ciertas realizaciones, la unidad transcripcional se inserta con otra(s) unidad(es) transcripcional(es) en un sitio de inserción en el genoma del VMA. La unidad transcripcional no existe de forma natural (es decir, es heteróloga, exógena o extraña) en el genoma del VMA y es capaz de transcribirse en células infectadas.
Preferentemente, el VMA recombinante comprende 1, 2, 3, 4, 5 o más unidades de transcripción insertadas en el genoma del VMA. En ciertas realizaciones, el VMA recombinante expresa establemente secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una, más, o todas las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína estructural o proteínas estructurales (por ejemplo, una proteína estructural o poliproteína estructural de cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento) de un virus VEE de cualquiera de los VEE preferidos (por ejemplo, VEEO, VEEV, VEEE) codificados por 1, 2, 3, 4, 5 o más unidades de transcripción. En ciertas realizaciones, el VMA recombinante comprende 2, 3, 4, 5, o más unidades de transcripción insertadas en el genoma del VMA en 1, 2, 3 o más sitios de inserción en el genoma del VMA. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural o poliproteínas estructurales se transcriben a un nivel de transcripción similar y/o se traducen a un nivel de proteína similar, por ejemplo, como se determina en células HeLa o Vero.
En realizaciones adicionales, el VMA recombinante de la invención comprende una secuencia de nucleótidos para un terminador de la transcripción, preferentemente un terminador transcripcional temprano de la variolovacuna, preferentemente una secuencia T5NT, más preferentemente una secuencia de nucleótidos de TTTTTAT.
Realizaciones adicionales se refieren al VMA recombinante que comprende una, dos o tres secuencias de nucleótidos que comprende cada una un promotor de poxvirus (preferentemente un promotor de poxvirus seleccionado del grupo de Pr13.5 y PrHyb) operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEE excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE, en donde las secuencias de nucleótidos (preferentemente las dos o tres secuencias de nucleótidos) que codifican la proteína estructural o poliproteínas estructurales se transcriben a esencialmente el mismo nivel de transcripción y/o se traducen a esencialmente el mismo nivel de proteína.
Realizaciones adicionales se refieren al VMA recombinante que comprende una, dos o tres secuencias de nucleótidos que comprende cada una un promotor de poxvirus (preferentemente un promotor de poxvirus seleccionado del grupo de Pr13.5 y PrHyb) operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEE excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE, en donde las secuencias de nucleótidos (preferentemente las dos o tres secuencias de nucleótidos) que codifican las proteínas estructurales o poliproteínas estructurales tienen esencialmente el mismo nivel de expresión.
En ciertas realizaciones, el VMA recombinante no contiene un replicón vírico, en particular un replicón vírico de un alfavirus, por ejemplo, de un VEE. En ciertas otras realizaciones, el VMA recombinante no contiene un replicón vírico seleccionado del grupo de VEEO, VEEE y/o VEEV.
En otras realizaciones, el VMA recombinante no contiene un promotor 26S, preferentemente un promotor 26S de un alfavirus, más preferentemente un promotor 26S de un virus de la encefalitis equina, lo más preferentemente un promotor 26S de VEEO, VEEE y/o VEEV.
Composición, composiciones farmacéuticas y vacunas
Puesto que los virus VMA recombinantes descritos en el presente documento están altamente restringidos en la replicación en mamíferos, que incluye VMA-BN que también es incompetente en la replicación en estirpes celulares humanas, son candidatos ideales para el tratamiento de una amplia variedad de mamíferos que incluyen seres humanos e incluso seres humanos inmunodeprimidos. Por tanto, en el presente documento se proporcionan composiciones (preferentemente composiciones farmacéuticas o inmunogénicas) y vacunas que comprenden los VMA recombinantes según la presente invención, por ejemplo, para su uso como sustancias farmacéuticas activas, todas previstas para inducir una respuesta inmunitaria en un cuerpo animal vivo, que incluye un ser humano. La composición, vacuna y composición farmacéutica como se usa en el presente documento puede comprender un soporte, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la vacuna es di- o trivalente. En ciertas realizaciones, la vacuna, preferentemente la vacuna farmacéutica, comprende uno, dos, o más VMA recombinantes que comprende cada uno un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural del VEE que se describe en el presente documento, excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE, preferentemente en donde cada VMA recombinante codifica un VEE diferente seleccionado del grupo de VEEO, VEEE y VEEV.
Para esto, el VMA recombinante, la vacuna o la composición farmacéutica/inmunogénica se puede formular en disolución en un intervalo de concentración de 104 a 109 TCIÜ50/ml, 105 a 5x108 TCIÜ50/ml, 106 a 108 TCIDsw 'ml, o 107 a 108 TCID50/ml. Una dosis de vacunación preferida para seres humanos comprende entre 106 y 109 TCID50, que incluye una dosis de 106 TCID50, 107 TCID50 o 108 TCID50. Preferentemente, la dosis para los seres humanos comprende al menos 2 x 107 TCID50, al menos 3 x 107 TCID50, al menos 5 x 107 TCID50, al menos 1 x 108 TCID50, al menos 2 x 108 TCID50, preferentemente en un volumen de 0,1 a 0,5 ml.
Las composiciones farmacéuticas/inmunogénicas proporcionadas en el presente documento pueden incluir, en general, uno o más vehículos, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y/o autorizados. Dichas sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH, o similares. Los vehículos adecuados normalmente son moléculas grandes que son metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados de lípidos, o similares.
Para la preparación de vacunas y composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), los virus VMA recombinantes proporcionados en el presente documento se pueden convertir en una forma fisiológicamente aceptable. Esto se puede hacer basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus usadas para la vacunación contra la viruela como se describe por H. Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99:2386-2392 (1974).
Por ejemplo, los virus purificados se pueden almacenar a -80 °C con un título de 5x108 TCIDsü/ml formulados en aproximadamente Tris 10 mM, NaCl 140 mM a pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, por ejemplo, se pueden liofilizar 102-108 o 102-109 partículas del virus en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de 2 % de peptona y 1 % de albúmina humana en una ampolla, preferentemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, la dosis de vacuna se puede producir por liofilización escalonada del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos, tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona, u otros adyuvantes tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo, albúmina de suero humano) adecuados para administración in vivo. Un virus típico que contiene una formulación adecuada para liofilización comprende tampón Tris 10 mM, NaCl 140 mM, 18,9 g/l de dextrano (MW 36.000-40.000), 45 g/l de sacarosa, 0,108 g/l de la sal de monopotasio hidratada de ácido L-glutámico, pH 7,4. La ampolla de vidrio se cierra entonces y se puede almacenar a entre 4 °C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, en tanto que no haya necesidad, la ampolla se almacena preferentemente a temperaturas de -20 °C o inferiores.
Para la vacunación o terapia, el liofilizado se puede disolver en una disolución acuosa (por ejemplo, 0,1 a 0,5 ml), preferentemente agua para inyectables, solución salina fisiológica o tampón Tris, y se administra ya sea por vía sistémica o por vía local, es decir, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal, o cualquier otra vía de administración conocida por el médico habitual. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la técnica de una manera conocida.
Las vacunas, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar como parte de un régimen de primovacunación-refuerzo homólogo. En la primovacunación-refuerzo homólogo, se administra una primera vacunación de primovacunación, seguida de una o más vacunaciones de refuerzo posteriores. Las vacunaciones de refuerzo se configuran para reforzar la respuesta inmunitaria generada en la primera vacunación por administración del mismo poxvirus recombinante que se usó en la primera vacunación.
En una realización a modo de ejemplo, se puede emplear un régimen de primovacunación-refuerzo homólogo en donde un vector de VMA vírico como se define en el presente documento se administra en una primera dosis. Una o más administraciones posteriores de un vector de VMA vírico como se define en el presente documento pueden ser administradas para reforzar la respuesta inmunitaria proporcionada en la primera administración. Preferentemente, el uno o más antígenos suministrados por el VMA recombinante son los mismos o similares a los de la primera administración.
Kits que comprenden VMA recombinante
En el presente documento también se proporcionan kits que comprenden el VMA recombinante, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, en un primer vial o envase para una primera administración (primovacunación) y en un segundo vial o envase para una segunda administración (refuerzo).
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el VMA recombinante, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, en un primer vial o envase para primovacunar una respuesta inmunitaria y en un segundo vial o envase para reforzar la respuesta inmunitaria.
El kit puede comprender uno o múltiples envases o viales del VMA recombinante, junto con instrucciones para la administración del VMA recombinante a un sujeto en riesgo de una infección por VEE, preferentemente una infección por VEEO, VEEV y/o VEEE. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Las instrucciones pueden indicar que el VMA recombinante se administra al sujeto en una dosis única, o en múltiples dosis (es decir, 2, 3, 4, etc.).
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el VMA recombinante de la presente invención, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, que comprende al menos dos viales o envases en donde cada vial comprende un VMA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o poliproteína estructural diferente del virus de la encefalitis equina (VEE) seleccionada del grupo de VEEO, VEEV y VEEE.
El kit también puede comprender el VMA recombinante en un tercer, cuarto vial o envase o vial o envase adicional para una tercera, cuarta administración o administración adicional.
Método y usos del VMA recombinante
En el presente documento también se proporcionan VMA recombinantes, composiciones, y/o vacunas que comprenden el VMA recombinante para su uso como un medicamento o vacuna.
Una divulgación adicional de la presente invención se refiere al VMA recombinante de la presente invención, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, para la fabricación de una vacuna para tratar y/o prevenir una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al VMA recombinante de la presente invención, la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este.
En realizaciones preferidas, el VMA recombinante para su uso como un medicamento o vacuna o para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina (preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este), la composición, o la vacuna, se administra una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces.
Además, se desvela el uso del VMA recombinante, la composición, o la vacuna que comprende el VMA recombinante, como se proporciona en el presente documento, para la fabricación de una vacuna para tratar y/o prevenir una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los VMA recombinantes, la vacuna o la composición farmacéutica que comprende el VMA recombinante como se proporciona en el presente documento se administra al sujeto en dosis de 106 a 109 TCID50, en dosis de 106 a 5x108 TCID50, o 107 a 108 TCID50. Los VMA recombinantes proporcionados en el presente documento también se pueden administrar al sujeto en dosis de 106 , 107 TCID50, 108, o 5x108 TCID50. En ciertas realizaciones, cualquiera de los VMA recombinantes proporcionados en el presente documento se administra a un sujeto humano en dosis de 107 TCID50, 108TCID50 o 5x108 TCID50.
Los VMA recombinantes, la vacuna o la composición farmacéutica que comprende el VMA recombinante proporcionado en el presente documento se pueden administrar al sujeto en una dosis única, o en múltiples dosis (es decir, 2, 3, 4, etc.). En ciertas realizaciones, los VMA recombinantes se pueden administrar en una primera administración (primovacunación) y segunda (refuerzo). En ciertas realizaciones, la primera dosis comprende 107 a 108 TCID50 de virus VMA recombinante y la segunda dosis comprende 107 a 108 TCID50 de virus VMA recombinante.
Los VMA recombinantes, la vacuna o la composición farmacéutica que comprende el VMA recombinante se pueden administrar por vía sistémica o por vía local, por vía parenteral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular o por vía intranasal, preferentemente por vía intramuscular o por vía intranasal.
Ciertas divulgaciones se refieren al uso del VMA recombinante, la composición, o la vacuna que comprende el VMA recombinante como se proporciona en el presente documento, para la fabricación de una vacuna para tratar y/o prevenir una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este.
En el presente documento se desvela un método para afectar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el VMA recombinante de la presente invención, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, preferentemente en donde el VMA recombinante se administra una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces.
En el presente documento se desvela un método de tratamiento y/o prevención en un sujeto de una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina del oeste, venezolana y/o del este en un sujeto que comprende administrar al sujeto el VMA recombinante de la presente invención, y/o la composición, y/o la vacuna que comprende el VMA recombinante de la presente invención, preferentemente en donde el VMA recombinante se administra una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces.
EJEMPLOS
Los ejemplos detallados que siguen pretenden contribuir a un mejor entendimiento de la presente invención. Sin embargo, la invención no está limitada por los ejemplos. Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención desvelada en el presente documento.
Ejemplo 1: Virus y ratones
Se usaron los siguientes virus en los estudios: VEEV subtipo IAB (cepa TrD), VEEO (cepa Fleming, 71V-1658), VEEE (cepa PE-6). La cepa 71V-1658 del VEEO contenida en una suspensión al 10 por ciento de cerebro de ratón lactante se proporcionó como se describe previamente en el documento de patente WO 2008/101349 por Nick Karabatsos (CDC, Fort Collins, CO). La cepa Fleming se compró de ATCC. La reserva de inóculos de VEEO se hizo por la inoculación de células Vero con la suspensión de cerebro de ratón a una multiplicidad de infección (MOI) inferior a 0,1. El sobrenadante de las células infectadas se recogió, se separó en alícuotas y se guardó a -80 grados centígrados para su uso posterior en los estudios de exposición animal y los ensayos de neutralización por reducción en placa. La cepa PE-6 del VEEE (Platteborze (2005), Dn A Seq. 16:308-20; Maire et al. (1970), The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 19:119-22) fue proporcionada amablemente por George Ludwig (USAMRIID, Frederick, MD) como un lisado de células Vero. La reserva de inóculos de PE-6 del VEEE se hizo por la inoculación de células Vero con el lisado a una multiplicidad de infección (MOI) inferior a 0,1. El sobrenadante de las células infectadas se recogió, se separó en alícuotas y se guardó a -80 grados centígrados para su uso posterior en estudios de exposición animal y ensayos de neutralización por reducción en placa. TrD del VEEV (Kinney at al. (1989), Virology 170:19-30) se compró de ATCC como una alícuota liofilizada. Después de la rehidratación, la reserva de inóculos de TrD del VEEV se hizo por la inoculación de células Vero con el lisado a una multiplicidad de infección (MOI) inferior a 0,1. El lisado se usó entonces para inocular los cerebros de ratones lactantes (10 gl por cerebro de ratón), y se recogió una suspensión al 10 % de cerebro de ratón lactante, se clarificó, se separó en alícuotas y se guardó a -80 grados centígrados para su uso posterior en estudios de exposición animal y ensayos de neutralización por reducción en placa. Para exposiciones, los virus se diluyeron hasta la concentración apropiada en HBSS.
Se compraron ratones BALB/c hembra (15-18 g) de Charles River Canada. Todos los procedimientos para los experimentos en ratones fueron autorizados por el comité para animales en DRDC Suffield y cumplieron las pautas expuestas por el Canadian Council on Animal Care.
Ejemplo 2: Secuencias usadas para la generación de vacunas
Las cepas víricas usadas para el desarrollo de vacunas fueron FL93-939 (NA) que codifica la secuencia de aminoácidos de la secuencia EF151502,1 (VEEE), Trinidad (TrD) que codifica la secuencia de aminoácidos de secuencia L01442.2 (VEEV), 71V-1658 que codifica la secuencia de aminoácidos de secuencia GQ287645.1 (VEEO). Se diseñaron los transgenes usados para VEEE, VEEV y VEEO, tal como para codificar las proteínas estructurales (E3, E2, 6K y E1, SEQ ID NO: 1,2 y 3) que no incluyen la proteína de la cápside (CP) que encapsida el ARN genómico para formar el núcleo de la nucleocápside, ya que se puede considerar que son las dianas primarias para la inmunidad adaptativa y para evitar interferir con los mecanismos de defensa de los hospedadores.
Los genes que codifican las proteínas estructurales E3-E2-6K-E1 se optimizaron usando GeneOptimizer™ (Genart GmbH; Regensburg). Esto incluye el uso de adaptación y optimización de codones para la expresión en mamífero. Además, las secuencias se optimizaron para reducir la homología entre los diferentes transgenes.
Ejemplo 3: Virus VMA que expresa antígenos del VEEO, VEEV y VEEE
Todos los vectores de virus recombinante usados para los estudios que se describen en el presente documento se basaron en VMA-BN® desarrollado por Bavarian Nordic que está depositado en la Colección Europea de Cultivos celulares (ECACC) (V00083008). La generación de recombinantes del VMA se llevó a cabo según un método recientemente descrito (documento de patente WO 2012/048817). Sin embargo, el método que se describe en Baur et al. y Lauterbach et al. también es adecuado para generar los virus recombinantes de la presente invención (Baur et al. (2010), J. Virol 84:8743-8752; Lauterbach et al. (2013), Front Immunol. 4:251).
Se prepararon construcciones de VMA para expresar las secuencias optimizadas bajo el control del promotor Pr13.5 (SEQ ID NO:7) o PrHyb (SEQ ID NO:8) como se describe en el documento de patente WO 2014/063832 o Baur et al. (Baur et al. (2010), J. Virol 84:8743-8752), seguido por un terminador transcripcional del virus de la variolovacuna T5AT (TTTTTAT).
Para la inserción de genes extraños en el genoma del VMA se generaron varios plásmidos de recombinación que se dirigen a regiones intergénicas (IGR) del genoma de VMA. Para generar productos recombinantes del VMA, se insertaron secuencias de interés extrañas en cualquiera de estos vectores básicos, por ejemplo, pBNX202 que se dirige a IGR 88/89 que consiste en uno cualquiera o ambos casetes de expresión (véase la Figura 1) de SEQ ID NO:1 para la secuencia codificante del VEEO con un promotor Pr13.5 en la dirección 5’ (SEQ ID NO:7) y SEQ ID NO:2 para la secuencia codificante del VEEV con el promotor en la dirección 5' PrHyb (SEQ ID NO:8) directamente en la dirección 5’ del primer "ATG" y un terminador transcripcional de la variolovacuna TTTTTAT o pBNX208 que se dirige a IGR 44/45 que consiste en un casete de expresión de Pr13.5 (SEQ ID NO:7) seguido por la secuencia codificante del VEEE (SEQ ID NO:3) y un terminador transcripcional del virus de la variolovacuna (TTTTTAT) usando enzimas de restricción comúnmente disponibles y técnicas de biología molecular convencionales.
Para insertar los transgenes del VEE en VMA, se infectaron células CEF con VMA y posteriormente se transfectaron con los plásmidos de recombinación. Durante la recombinación homóloga, las secuencias derivadas del VMA dentro del plásmido, que flanquean las secuencias de transgenes (denominadas regiones flanqueantes), se recombinan con sus secuencias homólogas en el genoma del VMA que se dirigen a y que insertan los transgenes en su IGR específica dentro del virus (por ejemplo, IGR 44/45 o IGR 88/89 del genoma de VMA). Después de la amplificación y la purificación en placa en condiciones selectivas (ácido micofenólico/xantina e hipoxantina o Geneticin), se obtuvieron los productos de VMA recombinante designados VMA PreMaster que contenían los genes individuales para VEE. Los pases y clones intermedios, así como la reserva de virus VMA PreMaster recombinante, se examinaron para la eliminación de VMA (pureza), para la secuencia correcta de los genes insertados junto con las regiones flanqueantes de inserción (por secuenciación) y para la presencia (por PCR específica de genes del VEE) y el tamaño correcto de los insertos (usando cebadores específicos para las secuencias genómicas del VMA que flanquean la IGR usada durante la inserción de los genes extraños del VEE).
Se produjo producto de calidad para investigación en células CEF y se purificó y concentró en un procedimiento de centrifugación con cojín de sacarosa de dos etapas normalizado. El producto final se formuló en solución salina Tris tamponada, TBS.
Ejemplo 4: Expresión de antígenos (FACS)
Se analizó la expresión de las proteínas estructurales de los virus VMA recombinantes en células HeLa (ATCC, pase <50) por análisis FACS usando métodos convencionales. En resumen, se infectó células HeLa con 10 TCID50 por célula; la tinción superficial se realizó 20 h p.i. con anticuerpos que fueron específicos para los antígenos de vacuna respectivos (VEEO, VEEE o VEEV, respectivamente). El anti-VEEE policlonal de ratón (de ascitis de ratón, ATCC VR1242AF, por NIAID, EE. UU.) se purificó por afinidad con la proteína G según las instrucciones del fabricante. Después de la purificación y la combinación de las fracciones que contenían el anticuerpo, el anticuerpo (1:500) se usó para detectar la expresión de proteínas estructurales sobre la superficie de células infectadas con VMA recombinante que contenía un casete de expresión de la(s) proteína(s) E3-E2-6k-E1 del VEEE. Se usó el anticuerpo monoclonal anti-VEEO de ratón (clon 11 D2, DRDC, purificado con proteína G, 1:2000) contra E1 de la cepa B11 del VEEO para detectar la expresión de la proteína E1 expresada de VMA recombinante que contenía un casete de expresión de la(s) proteínas E3-E2-6k-E1 del VEEO. Este anticuerpo monoclonal anti-VEEV de ratón (clon 1A4A1, DRDC, 1:2000) contra la proteína E2 se usó para detectar la expresión de la proteína E2 expresada a partir de VMA recombinante que contenía un casete de expresión de la(s) proteína(s) E3-E2-6k-E1 del VEEV. Se usó un anticuerpo conjugado con APC anti-ratón de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., 115­ 136-146, 1:500) como anticuerpo de detección secundaria. Las células HeLa infectadas se tiñeron además con DAPI para la discriminación vivas/muertas. Las células teñidas se seleccionaron en células vivas e infectadas (células RFP+ o GFP+). El análisis de FACS se realizó en un FACS LSR II (Becton Dickinson). Los resultados de FACS se muestran en la Figura 3A y 3B.
Ejemplo 5: Protocolo del estudio e inmunización (modelo de exposición i.n. murina letal)
Para evaluar la eficacia protectora contra VEEE, VEEV y VEEO en un modelo de exposición letal, se inmunizó a ratones BALB/c hembra (5 por grupo) con dos dosis (1 x 108 TCID50 por dosis) a los 0 y 28 días usando la vía de inoculación subcutánea (VEEV, VEEO, VEEE o inmunización triple con VEEV, VEEo y VEEE) y la vía de administración intramuscular (VEEV). Se administró un mínimo de 50 pl (máx. 150 pl) por ratón, si fuera necesario la vacuna se diluyó con HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Gibco 14175-095). Para cada cepa de virus probada, se expuso un grupo de control de HBSS, un grupo de VMA y un grupo de VMA-VEEE, VMA-VEEO o VMA-VEEV a la misma cepa del virus, 71V-1658, Fleming del VEEO, PE-6 del VEEE o TrD del VEEV, respectivamente. Se sacaron muestras de sangre por muestreo por la vena de la cola en el día -1, 14 días y 41 días después de la inoculación. La exposición se hizo 42 días después de la inoculación por administración i.n. (intranasal) de 1.000 / 5.000 / 10.000 ufp de VEEO (Fleming o 71V-1658), VEEE (PE-6) o VEEV (TrD).
Para la exposición al virus, se administró i.p. pentobarbital sódico a 50 mg/kg diluido en PBS estéril. La suspensión de virus de 71V-1658 del VEEO, PE-6 del VEEE o TrD del VEEV (1.000, 5.000 y 10.000 ufp) se aplicó a los orificios nasales del ratón inconsciente usando una micropipeta en un volumen total de 50 pl de HBSS. Los ratones se monitorizaron diariamente para signos y síntomas durante 14 días. Los animales fueron seguidos para pérdida de peso y puntuación de enfermedad. Se sacrificaron los ratones que mostraron fuertes signos de morbilidad.
Se diseñó un protocolo similar como se diseñó para la inmunización trivalente con una mezcla de tres VMA monovalentes diferentes para el análisis de una única construcción multivalente VMA-VEEE/VEEO/VEEV (VMA-mBN396A) que expresaba las tres proteínas estructurales del VEEE, VEEO y VEEV como se usa para las construcciones individuales en un VMA (Figura 1). Los animales se vacunaron según el mismo protocolo que se ha mencionado anteriormente con una dosis de 3,6 x 107 TCID50 (Figura 6) o 1 x 108 TCID50 en un volumen de 150 pl de VMA-mBN396A trivalente.
Para los resultados véase el Ejemplo 6, Figura 2, 6 y 7.
Ejemplo 6: Tasas de supervivencia
Se observó la supervivencia completa con la administración de la dosis más alta (10.000 ufp), así como la dosis más baja (1.000 ufp), de exposición a virus después de la inmunización con VMA-VEEV y VMA-VEEO y la exposición (exposición intranasal) a TrD del VEEV o 71V-1658 del VEEO, pero también con la menor dosis de 1.000 ufp de PE-6 del VEEE (100 %) con una disminución dependiente de la dosis en la supervivencia observada a mayores dosis con 5.000 ufp de PE-6 del VEEE (80 %) o 10.000 ufp (75 %). Los resultados a modo de ejemplo se muestran en la Figura 2A-C. En un estudio repetido, se pudo observar un 100 % (5/5) de supervivencia con 5.000 ufp de exposición a PE-6 del VEEE (Figura 6). Para VMA-VEEV, se compararon las vías de inmunización SC e IM. No se observó diferencia significativa entre las dos vías de administración. Ambas dieron 100 % de protección contra una dosis de exposición incluso mayor de VEEV (104 ufp).
Los beneficios de estas inmunizaciones fueron significativos por encima de los estudios previos mostrados para virus de la variolovacuna que expresan proteínas estructurales del VEEV con solo protección parcial contra la exposición respiratoria al VEEV virulento. Además, se pudo mostrar protección completa contra el virus neurotrópico de la encefalitis equina del oeste incluso a alta exposición al virus con 71V-1658 del VEEO (10.000 ufp). Como el virus de exposición de VEEE se diferenció del usado para clonar las proteínas estructurales (FL93-939 (NA)), estos datos mostraron inmunidad protectora cruzada contra una cepa heteróloga del VEEE (PE-6). Estos interesantes resultados permitieron el desarrollo adicional de una vacuna trivalente contra alfavirus. Puesto que las tres vacunas individuales expresaron los transgenes E3-E2-6K-E1 de VEEE, VEEO y VEEV, respectivamente, en cantidades equivalentes por análisis de FACS, se comparó una mezcla de tres vacunas con la vacuna individual contra el alfavirus VMA para examinar si la mezcla triple reduciría la eficacia eficaz. Por lo tanto, para la evaluación de la vacunación trivalente, se inmunizaron ratones con dos dosis de vacuna (1 x 108 TCID50 por dosis) a los 0 y 28 días, usando la vía de inoculación subcutánea en un volumen total de 150 pl con HBSS como diluyente (cada grupo 5 ratones BALB/c). Se evaluó una mezcla de las tres vacunas (VMA-mBN393A, VMA-mBN394A y VMA-mBN395A, mezcla triple) contra las vacunas monovalentes contra el VMA. Se usó un vector de VMA sin inserciones como control para cada de las cepas de virus de exposición, y se añadieron los grupos de control de HBSS para evaluar la estimulación inmunitaria del vector solo. Se sacaron muestras de sangre por muestreo por la vena de cola en el día -1 día, 27 días y 41 días después de la inoculación para PRNT. La exposición se hizo 42 días después de la inoculación por administración respiratoria (es decir, intranasal). Para la exposición al virus se usó el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente para la construcción individual, pero usando 5.000 ufp de la cepa de exposición respectiva. Se tomaron muestras de sangre a los 14 y 41 días. No hubo diferencia entre la supervivencia de los ratones entre el VMA monovalente y la mezcla triple de las tres vacunas cuando se expusieron a VEEO 71V-1658. Se logró protección completa contra la exposición a TrD del VEEV (5/5, 100 %) y Fleming del VEEO (5/5, 100 %) en el grupo de mezcla triple de VMA-VEEE/VMA-VEEO/VMA-VEEV, por lo que se indica que no existe interferencia negativa entre VEEV y VEEO cuando se usa VMA recombinante como vacuna. Estos datos también demostraron protección cruzada completa contra la cepa heteróloga altamente virulenta Fleming, que se diferencia en 21 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la cepa del VEEO homóloga 71V-1658, tras la administración de la mezcla triple de VMA-VEEE/VMA-VEEO/VMA-VEEV en comparación con el 90 % (9/10) tras la inmunización individual con VMA-VEEO a 5.000 ufp. Para VEEE, 3 de los 5 animales sobrevivieron (60 %) frente a la exposición heteróloga a PE-6 del VEEE.
En conclusión, se encontró de la vacuna monovalente, cuando se administra como una mezcla triple que codifica proteínas estructurales del VEEE/VEEO/VEEV que excluye la proteína de la cápside, proporcionó elevada protección contra los tres subtipos en ratones BALB/c. Los ratones inmunizados mostraron sólidos niveles de protección contra dosis intranasales bastante significativas del virus de exposición apropiado (1.000 a 10.000 ufp por ratón). Los ratones que sobrevivieron no mostraron síntomas de infectividad ni pérdida de peso. Se detectaron anticuerpos neutralizantes antes de la exposición a los virus VEEO, VEEE y VEEV respectivos, pero puede no ser el único mecanismo de protección.
En la Figura 6 y 7 se muestran los resultados usando la construcción multivalente individual VMA-VEEE/VEEO/VEEV (VMA-mBN396A) que expresa las tres proteínas estructurales del VEEE, VEEO y VEEV. El uso de solo un tercio de la dosis de VMA recombinante (3,6 x 107 TCID50) como se usa para el VMA monovalente ya proporcionó el 80 % de protección contra la cepa TrD altamente virulenta (Figura 6 y 7). Dicha VMA-VEEE/VEEO/VEEV multivalente (VMA-mBN396A) proporciona la ventaja de expresar los tres antígenos en una construcción usando un único VMA recombinante en lugar de mezclar los tres recombinantes o aplicar tres construcciones individualmente para proteger contra los tres virus de la encefalitis equina, que simplifica la producción del producto y reduce los costes de producción. Además, permite la inmunización contra los alfavirus y los poxvirus al mismo tiempo, que permite la inmunización tetravalente sin inmunodominancia de uno o más de los antígenos o el vector.
Estos resultados sugieren que el VMA recombinante que expresa proteínas estructurales de uno, dos o tres VEE (es decir, VEEE/VEEO/VEEV) podría servir de vacuna profiláctica contra una única infección o simultánea del VEEE, VEEO y VEEV en seres humanos.
Ejemplo 7: Títulos neutralizantes anti-alfavirus
Para investigar el mecanismo de eficacia protectora de las vacunas de alfavirus basadas en VMA, se evaluaron para títulos neutralizantes anti-alfavirus las muestras de suero de ratones vacunados. Las muestras de suero se incubaron durante 30 min a 56 °C. Se hizo una serie de diluciones en placas de 96 pocillos. Se añadió 10 pl de cada muestra al primer pocillo de 190 pl de DMEM 5 % de FBS para obtener una dilución inicial de 1:20. Se hicieron diluciones triples pipeteando 100 pl de cada pocillo al siguiente (200 pl de 5 % de DMEM) y se transfirieron 50 pl a una placa nueva. Se añadió 50 pl de virus (100 TCID50) a cada pocillo. Por lo tanto, se incubaron triplicados de muestras reunidas de suero (12 diluciones sucesivas) de ratones (n=5) tratados con VMA recombinante, VMA o HBSS como control mezclado con 50 pl de virus (100 TCID50) por pocillo a 37 °C durante 1 hora. Se inocularon 10.000 células Vero (104 por pocillo) en DMEM 5 % de FBS con 50 pl de suero prediluido en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C 5 % de CO2 durante 5 días (Figura 4). Se examinaron los efectos citopáticos (CPE) bajo el microscopio. El título neutralizante se definió como la inversa de la mayor dilución de suero capaz de neutralizar 100 TCID50 del virus, por ejemplo, TrD, Fleming, 71V-1658 o PE6. Los resultados se muestran en las Figuras 5A-5C.
En general, las vacunas de alfavirus individuales basadas en VMA produjeron anticuerpos neutralizantes anti-alfavirus. Una inmunización-refuerzo aumentó los títulos de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, la mezcla triple de tres vacunas solo produjo anticuerpos neutralizantes contra Fleming del VEEO y PE6 del VEEE, no contra TrD del VEEV, pero, sin embargo, protegió contra TrD. Aunque los anticuerpos neutralizantes desempeñan una función esencial en la eficacia protectora contra el alfavirus in vivo, es todavía discutible la función de anticuerpos no neutralizantes in vivo. Algunos estudios mostraron que los anticuerpos no neutralizantes tenían eficacia anti-patógenos in vivo. Por otra parte, el VMA es bueno en generar inmunidades tanto humorales como mediadas por células. Los presentes inventores no pueden descartar la posibilidad de que anticuerpos no neutralizantes o la inmunidad celular pudieran desempeñan una función esencial en las vacunas de alfavirus basadas en VMA contra infecciones por alfavirus y los anticuerpos neutralizantes pudieran desempeñar una función limitada.
Ejemplo 8: Vacunación en macacos cangrejeros por exposición a aerosoles
Para analizar la eficacia de los VMA recombinantes se ha descrito previamente un modelo establecido de primates no humanos (macacos cangrejeros) (Reed et al. (2007), J. Infect. Dis.196:441-50; Reed et al. (2005), J. Infect. Dis.
192:1173-82; Steele and Twenhafel (2010), Vet. Pathol. 47:790-805). Antes del análisis se seleccionarán muestras de sangre para PRNT para cualquier evidencia de una exposición previa a VEEV, VEEO o VEEE. La exposición en este modelo es aplicar el material del estudio como una inoculación i.m. de la vacuna o control 2 veces separados por 28 días con una dosis de 5x108 TCID50. En los días 0, 7, 28, 35 y 49 se aíslan CMSP. Se recogen muestras de sangre en el día 0, 28 y 49 para el análisis de anticuerpo y PRNT. Después de 60 días se anestesia a los macacos por inyección de 6 mg/kg de telazol y son expuestos durante 10 min al aerosol como se describe por Reed et al. (Reed et al. (2004), J. Infect. Dis. 189:1013-1017) que contiene la exposición al virus en dosis suficientes como para causar una enfermedad (por ejemplo, 1 x 108 ufp). Después de la exposición de los animales se monitorizan diariamente para cualquier signo de síntomas y enfermedades.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un virus de la variolovacuna modificado Ankara (VMA) recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de un virus de la encefalitis equina (VEE) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE.
2. El VMA recombinante de la reivindicación 1, en donde el VEE es el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina venezolana o el virus de la encefalitis equina del oeste.
3. El VMA recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural deriva del virus de la encefalitis equina del este.
4. El VMA recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural deriva del virus de la encefalitis equina venezolana.
5. El VMA recombinante de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural deriva del virus de la encefalitis equina del oeste.
6. El VMA recombinante de la reivindicación 3, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEEV, o que codifica una proteína estructural del virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEEO.
7. El VMA recombinante de la reivindicación 4, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural del virus de la encefalitis equina del oeste (VEEO) excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEEO.
8. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una poliproteína estructural que comprende únicamente E3, E2, 6k y E1.
9. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural o poliproteína estructural codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural o poliproteína estructural de la cepa CBA87, 71V-1658, FL93-939, Fleming, TrD, INH-9813, INH-6803, 71V-1658, PE-6, FL91 -4679 o V105-00210, preferentemente FL93-939, TrD, Fleming o V105-00210.
10. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural codifica la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1,2 o 3.
11. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural es según SEQ ID NO: 4, 5 o 6.
12. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el promotor de poxvirus se selecciona del grupo que consiste en Pr13.5 y PrHyb.
13. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la secuencia de nucleótidos se inserta en una región intergénica (IGR), preferentemente IGR 44/45 o 88/89.
14. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el VMA usado para generar el VMA recombinante es VMA-BN como se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número de acceso V00083008.
15. Un VMA recombinante, que comprende tres secuencias de nucleótidos que comprende cada una un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de un VEE excluyendo la codificación de una proteína de la cápside del VEE.
16. El VMA recombinante de la reivindicación 15, en donde las tres secuencias de nucleótidos que comprenden cada una un promotor de poxvirus operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales del virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina venezolana y el virus de la encefalitis equina del oeste.
17. Una composición farmacéutica que comprende el VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un soporte, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Un kit que comprende el VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 en un primer vial o envase para una primera administración y en un segundo vial o envase para una segunda administración.
19. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso como un medicamento o vacuna.
20. El VMA recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina, preferentemente una enfermedad causada por el virus de la encefalitis equina venezolana, del oeste y/o del este.
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