ES2926384T3 - Métodos para mejorar la eficacia de células inmunitarias terapéuticas - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método de uso de un receptor (p. ej., receptor de antígeno quimérico - CAR) que activa una respuesta inmunitaria al unirse a un ligando de células cancerosas junto con una molécula de unión a diana que se dirige a una proteína o molécula para su eliminación o neutralización para generar células inmunes anticancerígenas mejoradas. La presente invención también se refiere a células inmunitarias modificadas genéticamente que tienen una eficacia terapéutica mejorada y usos de las mismas. (No figura adecuada para acompañar el resumen para su publicación) (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para mejorar la eficacia de células inmunitarias terapéuticas
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las células inmunitarias pueden ser "fármacos vivos" potentes y específicos. Las células inmunitarias tienen el potencial de dirigirse a las células tumorales sin afectar los tejidos normales; varias observaciones clínicas indican que pueden tener una importante actividad anticancerígena. Por tanto, en pacientes que reciben trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT), la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) mediada por células T (Weiden, PL et al., N Engl. J. Med. 1979;300(19):1068-1073, Appelbaum, FR Nature, 2001, 411(6835):385-389, Porter, DL et al., N Engl. J. Med. 1994, 330(2):100-106, Kolb, HJ et al. Blood. 1995; 86(5):2041-2050; Slavin, S. et al., Blood. 1996; 87(6):2195-2204), y aloreactividad de células asesinas naturales (NK) del donante (Ruggeri L, et al. Science. 2002;295(5562):2097-2100; Giebel S, et al. Blood. 2003;102(3):814-819; Cooley S, et al. Blood. 2010; 116(14):2411-2419) están inversamente relacionados con la recurrencia de la leucemia. Además del contexto de HSCT, la administración de anticuerpos que liberan células T de señales inhibdtoras (Sharma P, et al., Nat Rev Cáncer. 2011; 11(11):805-812.; Pardoll DM., Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264), o formar puentes con células tumorales (Topp MS, et al. J. Clin. Oncol. 2011; 29(18):2493-2498) produjo respuestas clínicas importantes en pacientes con tumores sólidos o leucemia. Finalmente, la infusión de linfocitos T autólogos modificados genéticamente indujo una remisión completa y duradera en pacientes con leucemia y linfoma refractarios (Maude SL, et al. N Engl J Med. 2014; 371(16):1507-1517).
No obstante, hay una necesidad significativa de mejorar la terapia con células inmunitarias ampliando su aplicabilidad y mejorando su eficacia.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a células inmunitarias manipuladas que tienen una eficacia terapéutica mejorada para, por ejemplo, la terapia contra el cáncer. De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula inmunitaria manipulada que comprende un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado con un dominio de localización en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRp, TCR7, TCR6, CD36, CD37, o CD3Z; o
un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de una proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula inmunitaria manipulada de la presente invención para tratar el cáncer en un sujeto con necesidad de ello.
En varias realizaciones, la presente invención también proporciona un método in vitro para producir una célula inmunitaria manipulada, el método comprendiendo introducir en una célula inmunitaria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de activación inmunitario, y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado a un dominio de localización, en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRp, TCR7, TCR6, CD36, CD37, o CD3Z; o un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de una proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4),
inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y
en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor, produciendo así una célula inmunitaria manipulada.
Las células inmunitarias manipuladas pueden poseer una eficacia terapéutica mejorada como resultado de una o más de la reducción de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) en un huésped, reducción o eliminación del rechazo por parte de un huésped, supervivencia prolongada en un huésped, inhibición reducida por el tumor en un huésped, autodestrucción reducida en un huésped, cascada inflamatoria reducida en un huésped o transducción de señales mediada por receptor natural/artificial sostenida (por ejemplo, mediada por CAR) en un huésped.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Lo anterior será evidente a partir de la siguiente descripción más particular de realizaciones ejemplares de la invención, como se ilustra en los dibujos acompañantes en los que caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar las realizaciones de la presente invención.
Las FIGS. 1A-1B son una representación esquemática de una estrategia empleada en la presente invención. La FIG. 1A es un mecanismo general de muerte mediada por CAR de células cancerosas. La FIG.
1Bmuestra la expresión combinada de CAR con diferentes formatos de scFv dirigido por compartimentos (un ejemplo de una molécula de unión a objetivo unida a un dominio de localización) y ejemplos de posibles objetivos. El CAR puede ser reemplazado por otros receptores que pueden mejorar la capacidad de las células inmunitarias.
La FIG. 2 es un diagrama esquemático de constructos que contienen scFv junto con dominios que los localizan en compartimentos celulares específicos. Abreviaturas: p2M, microglobulina p-2; SP, péptido señal; VL, cadena ligera variable; VH, cadena pesada variable; TM, dominio transmembrana; HA, hemaglutinina de gripe humana. Los constructos adicionales que no se enumeran en la figura incluyen myc EEKKMP unido a membrana (mb), mb myc KKTN, mb myc YQRL, dominio citoplásmico mb TGN38, mb myc RNiKc D, mb EEKKMP conector (20-aminoácidos), así como variantes de constructos sin péptido de señalización y con un número variable de aminoácidos en el dominio transmembrana de CD8. La secuencia de nucleótidos del conector de 10 aminoácidos es GGTGGT GGCGGCAGTGGT GGCGGT GGCTCA (SEQ ID NO: 61); la secuencia de aminoácidos es GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 62). La secuencia de nucleótidos del conector de 20 aminoácidos es GGTGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGTGGCTCAGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGT GGCTCT (SEQ ID NO: 63); la secuencia de aminoácidos es GGGGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41). Varios dominios de localización se indican bajo el encabezado "Dominios de localización" y representan conectores en algunos ejemplos, como se indica. Los constructos “myc KDEL” y “PEST KDEL” muestran el uso de más de un dominio de localización en un único constructo.
Las FIGS. 3A-3C muestran la regulación por disminución de CD3/TCR en células T mediante el direccionamiento de scFv de CD3e. La FIG. 3A muestra la expresión de CD3e de superficie en células Jurkat, transducidas o con un vector retroviral que contiene solo proteína verde fluorescente (GFP) ("simulada") o un vector que contiene GFP más diferentes constructos, como se indica. La expresión de CD3e en la membrana celular se comparó con la de células transducidas simuladas 1 semana después de la transducción usando un anticuerpo anti-CD3 conjugado con aloficocianina (BD Biosciences). Todas las comparaciones se realizaron después de activar las células positivas para GFP. La FIG. 3B representa experimentos similares realizados con linfocitos T de sangre periférica expandidos con perlas anti-CD3/CD28 (Lifesciences). La tinción se realizó 1 semana después de la transducción. La FIG. 3C muestra gráficos de citometría de flujo que ilustran la regulación por disminución de CD3e de membrana en células Jurkat después de la transducción con los constructos indicados. Los rectángulos discontinuos en el cuadrante superior derecho de cada gráfico encierran las células GFP+ CD3+.
La FIG. 4 muestra la regulación por disminución de CD3e y TCRap en la membrana celular en células T Jurkat tras la transducción con anti-CD3£ scFv-KDEL o -PEST, o -mb EEKKMP. La expresión del marcador de membrana se midió 1 semana después de la transducción usando un anticuerpo anti-CD3 conjugado con aloficocianina (BD Biosciences) o un anti-TCRap conjugado con ficoeritrina (Biolegend). Las líneas etiquetadas como "Control" representan el marcado de células transducidas de manera simulada. La línea vertical discontinua representa el límite superior de la tinción obtenida con un anticuerpo no reactivo del mismo isotipo.
La FIG. 5 muestra que anti-scFv y CAR pueden expresarse simultáneamente. Los diagramas de puntos de citometría de flujo representan la tinción de células Jurkat (fila superior) o linfocitos de sangre periférica (fila inferior) con anticuerpo de aloficocianina anti-CD3 y biotina Fab2 antiratón de cabra más estreptavidina conjugada con ficoeritrina (para detectar el CAR). Las células se transdujeron con el constructo anti-CD3 scFv-myc KDEL, el constructo anti-CD19-4-1BB-CD3Z o ambos. Después de activar en las células positivas para g Fp , aquellas transducidas con anti-CD3 scFv-myc KDEL regularon por disminución CD3 (columna izquierda, cuadrantes inferiores izquierdos) y aquellas transducidas con el constructo anti-CD19-4-1BB-CD3Z expresaron CAR (columna central, cuadrantes superiores derechos). Una proporción sustancial de las células transducidas con ambos constructos eran negativas para CD3 y positivas para CAR (columna derecha, cuadrantes superiores izquierdos).
La FIG. 6 ilustra que el CAR anti-CD19 desencadena la activación y desgranulación de las células T independientemente de la regulación por disminución de CD3/TCR. Las células Jurkat se transdujeron con el constructo anti-CD3 scFv-myc KDEL, el constructo anti-CD19-4-1BB-CD3Z o ambos. La activación y desgranulación de las células T se comparó con la de las células transducidas de manera simulada. Las células se cocultivaron solas o con la línea celular de leucemia CD19+ OP-1 en una proporción de 1:1. Después de 18 horas, se analizó la expresión de CD69 y CD25 mediante citometría de flujo usando anticuerpos específicos (de BD Biosciences); se probó la expresión de CD107a después de 6 horas (anticuerpo de BD Biosciences). En presencia de células OP-1, se produjo la expresión de CD69 y CD25 en células que expresan CAR independientemente de si las células también se transdujeron con scFv-KDEL anti-CD3; no se produjo ninguna activación en células transducidas scFv
myc KDEL simuladas o anti-CD3, o en ausencia de células OP-1. La estimulación con CAR mejoró la expresión de CD107 que no se vio afectada por la regulación por disminución de CD3/TCR.
La FIG. 7 muestra que el CAR anti-CD19 expresado en células T provoca la proliferación de células T independientemente de la regulación por disminución de CD3/TCR. Los linfocitos T de sangre periférica se transdujeron tanto con el constructo anti-CD3 scFv-myc KDEL como con el constructo anti-CD19-4-1BB-CD3Z. Los linfocitos T transducidos se cocultivaron con células OP-1 tratadas con Streck (Omaha, NE) para inhibir su proliferación durante el tiempo indicado. Se comparó la expansión de linfocitos T CD3 positivos y CD3 negativos que expresaban el CAR anti-CD19 con la de las células T transducidas de manera simulada. Cada símbolo muestra el recuento celular medio de dos cultivos paralelos. La célula T CAR se expandió igualmente bien independientemente de la expresión de CD3/TCR.
La FIG. 8 muestra la expresión de CD7 en la membrana de los linfocitos T de sangre periférica transducidos con un vector retroviral que contiene solo GFP ("simulado") o un vector que contiene GFP plus y un constructo anti-CD7 scFv-myc KDEL. La expresión de CD7 en la membrana celular se comparó con la de las células transducidas de manera simulada 1 semana después de la transducción usando un anticuerpo anti-CD7 conjugado con ficoeritrina (BD Biosciences). Los rectángulos discontinuos en el cuadrante superior derecho de cada gráfico encierran células GFP+ CD7+.
La FIG. 9 representa la regulación por disminución de HLA Clase I en las células T mediante el direccionamiento de scFv de p2-microglubulina. Las células T Jurkat se transdujeron con anti-p2M scFv-myc KDEL. La expresión de HLA-ABC en la membrana celular se comparó con la de las células transducidas de manera simulada 1 semana después de la transducción usando un anticuerpo anti-HLA-ABC conjugado con ficoeritrina (BD Biosciences). También se muestra la tinción con un anticuerpo de control de isotipo coincidente. El análisis se realizó después de activar las células positivas para GFP.
La FIG. 10 representa la regulación por disminución del receptor tipo inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1 y KIR2DL2/DL3 en células NK humanas mediante scFv de direccionamiento de KIR2DL1 y KIR2DL2/DL3. Las células NK, expandidas ex vivo y seleccionadas para la expresión de KIR2DL1, se transdujeron con conector scFV anti-KIR2DL1-KIR2DL2/DL3 (20) AEKDEL o -EEKKMP. La expresión de KIR correspondiente en la membrana celular se comparó con la de las células transducidas de manera simulada 8 días después de la transducción usando un anticuerpo anti-KIR2DL1 conjugado con aloficocianina (R&D Systems) o un anticuerpo anti-KIR2DL2/DL3 conjugado con ficoeritrina (BD Biosciences). También se muestra la tinción con un anticuerpo de control de isotipo coincidente. El análisis se realizó después de activar las células positivas para GFP.
La FIG. 11 representa la regulación por disminución de NKG2A en células NK humanas mediante el direccionamiento de scFv. Las células NK, expandidas ex vivo, se transdujeron con anti-NKG2A scFv-EEKKMP. La expresión de NKG2A en la membrana celular se comparó con la de las células transducidas de manera simulada 8 días después de la transducción usando un anticuerpo NKG2A conjugado con ficoeritrina (Beckman Coulter). También se muestra la tinción con un anticuerpo de control de isotipo coincidente. El análisis se realizó después de activar las células positivas para GFP.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Sigue una descripción de realizaciones ejemplares de la invención.
En los últimos años, los avances en el conocimiento de las vías moleculares que regulan las células inmunitarias han ido acompañados de una notable evolución en la capacidad de manipularlas ex vivo, incluyendo su expansión y la ingeniería genética. Ahora es posible preparar de manera fiable productos de células inmunitarias de grado clínico altamente sofisticados en el momento oportuno. Un excelente ejemplo de cómo la actividad anticancerígena de las células inmunitarias puede ser dirigida y magnificada por ingeniería celular ex vivo es el desarrollo de células T de receptores de antígenos quiméricos (cAr ) (Eshhar, Z. et al., PNAS. 1993; 90(2):720-724).
Los CAR son proteínas multimoleculares artificiales, que se han descrito con anterioridad (Geiger TL, et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens RJ, et al., NatMed. 2003;9(3):279-286; Cooper LJ, et al., Blood.
2003;101(4):1637-1644). Los CAR comprenden un dominio extracelular que se une a un objetivo específico, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. El dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden derivarse de cualquier fuente deseada para tales dominios, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 8.399.645. Brevemente, un CAR puede diseñarse para contener una región variable de cadena sencilla (scFv) de un anticuerpo que se une específicamente a un objetivo. El scFv puede enlazarse a una molécula de señalización asociada al receptor de células T (TCR), como c D3Z, a través de dominios transmembrana y bisagra. La ligadura de scFv al antígeno afín desencadena la transducción de señales. Por tanto, los CAR pueden redirigir instantáneamente los linfocitos T citotóxicos hacia las células cancerosas y provocar la lisis de las células tumorales (Eshhar, Z. et al., PNAS. 1993;90(2):720-724; Geiger TL, et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens RJ et al., NatMed. 2003;9(3):279-286; Cooper LJ et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644; Imai C, et al., Leukemia. 2004; 18:676-684). Como la señalización de CD3Z por sí sola no es suficiente para activar de manera duradera las células
T (Schwartz RH. Annu Rev Immunol. 2003;21:305-334; Zang X and Allison JP. Clin Cáncer Res. 2007;13(18 Pt 1):5271 -5279), se han incorporado moléculas coestimuladoras como CD28 y 4-1BB (o CD137) en constructos de CAR para potenciar la transducción de señales. Este diseño de señalización dual ("CAR de segunda generación") es útil para provocar una actividad antitumoral efectiva de las células T (Imai C, et al.,Leukemia. 2004; 18:676-684; Campana D, et al., Cáncer J. 2014; 20(2):134-140).
Se ha descrito un CAR específico, CAR anti-CD19, que contiene tanto 4-1BB como CD3Z en la Patente de Estados Unidos N° 8.399.645. La infusión de células T autólogas que expresan un CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z resultó en respuestas clínicas espectaculares en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) (Porter DL, et al., Chimeric antigen receptor-modified T cells in Chronic Lymphoid Leukemia; 2011: N Engl J Med. 2011; 365(8):725-733; Kalos M, et al., SciTransIMed. 2011; 3(95):95ra73), y leucemia linfoblástica aguda (ALL) (Grupp SA, et al., N Engl J Med. 2013, 368(16):1509-1518, Maude SL, et al., N Engl J Med. 2014, 371 (16):1507-1517). Estos estudios, y estudios con CAR que llevan diferentes módulos de señalización (Till BG, et al., Blood. 2012; 119(17):3940-3950; Kochenderfer JN, et al., Blood. 2012; 119(12):2709-2720; Brentjens RJ et al., Blood. 2011; 118(18):4817-4828; Brentjens RJ et al., Sci Transl Med. 2013; 5(177):177ra138), proporcionan una demostración convincente del potencial clínico de esta tecnología y de la inmunoterapia en general.
La US 2007/036773 A1 enseña a expresar un CAR y regula por diminución proteínas endógenas a través de ácidos nucleicos inhibidores.
Los métodos descritos en la presente permiten la eliminación o inactivación rápida de proteínas específicas en células inmunitarias redirigidas por un receptor natural o artificial, por ejemplo, CAR, ampliando por tanto el potencial de aplicación y mejorando significativamente la función de las células manipuladas. El método se basa, en parte, en un único constructo o múltiples constructos que contienen un receptor de activación inmunitario, por ejemplo, un CAR (que comprende un dominio extracelular (por ejemplo, un scFv) que se une a un objetivo específico, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico) junto con una molécula de unión al objetivo que se une a un objetivo (por ejemplo, una proteína) para eliminarlo o neutralizarlo; la molécula de unión al objetivo está enlazada a un dominio (es decir, un dominio de localización) que la dirige a compartimentos celulares específicos, como el aparato de Golgi o el retículo endoplásmico, el proteasoma o la membrana celular, dependiendo de la aplicación. Por simplicidad, a veces se hace referencia en la presente a una molécula de unión a objetivo unida a un dominio de localización (LD) como "molécula de unión a objetivo enlazada a LD".
Como será evidente a partir de las enseñanzas de la presente, una variedad de receptores de activación inmunitaria pueden ser adecuados para los métodos de la presente invención. Es decir, cualquier receptor que comprenda una molécula que, al unirse (ligarse) a un ligando (por ejemplo, péptido o antígeno) expresado en una célula cancerosa, sea capaz de activar una respuesta inmunitaria puede usarse de acuerdo con los presentes métodos. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, el receptor de activación inmunitario puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR); en la técnica se conocen métodos para diseñar y manipular un CAR (ver, Geiger TL, et al., J Immunol. 1999; 162(10):5931-5939; Brentjens RJ, et al., NatMed. 2003; 9(3):279-286; Cooper LJ, et al., Blood. 2003; 101(4):1637-1644). Además, pueden usarse receptores con capacidad de unión a anticuerpos (por ejemplo, receptor CD16-4-1BB-CD3zeta - Kudo K, et al. Cancer Res. 2014; 74(1):93-103), que son similares a los CAR, pero con el scFv reemplazado por una molécula de unión a anticuerpos (por ejemplo, CD16, CD64, CD32). Además, de acuerdo con los presentes métodos también pueden usarse los receptores de células T que comprenden las cadenas alfa y beta del receptor de células T que se unen a un péptido expresado en una célula tumoral en el contexto del HLA de la célula tumoral. Además, también pueden usarse otros receptores que contienen moléculas que activan una respuesta inmunitaria al unirse a un ligando expresado en una célula cancerosa, por ejemplo, el receptor NKG2D-DAP10-CD3zeta, que se une al ligando NKG2D expresado en las células tumorales (ver, por ejemplo, Chang YH, et al., Cancer Res. 2013; 73(6):1777-1786). A todos estos receptores adecuados colectivamente, como se usan en la presente, se hace referencia como "receptor de activación inmunitario" o "receptor que activa una respuesta inmunitaria tras unirse a un ligando de células cancerosas". Por lo tanto, un receptor de activación inmunitario que tiene una molécula activada por un ligando de células cancerosas puede expresarse junto con una molécula de unión a objetivo enlazada a LD de acuerdo con los presentes métodos.
Los presentes métodos amplían significativamente las aplicaciones potenciales de inmunoterapias basadas en la infusión de células inmunitarias redirigidas por receptores artificiales. El método descrito es práctico y puede incorporarse fácilmente en un procesamiento celular de grado clínico. Por ejemplo, puede prepararse un único constructo bicistrónico que contiene, por ejemplo, un CAR y una molécula de unión al objetivo enlazada a LD, por ejemplo, scFv-myc KDEL (o PEST o transmembrana) mediante la inserción de un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) o un sitio de la región que codifica el péptido 2A entre los 2 ADNc que codifican el CAR y la molécula de unión al objetivo enlazada a LD. También debería ser factible el diseño de sistemas de administración tricistrónicos para eliminar más de un objetivo. Alternativamente, podrían realizarse transducciones separadas de los 2 genes (simultánea o secuencialmente). En el contexto de la terapia de células cancerosas, el CAR podría reemplazarse por un receptor de señalización de unión a anticuerpo (Kudo K, et al., Cancer Res. 2014; 74(1):93-103), un receptor de células T dirigido contra una combinación de HLA-péptido específica, o cualquier receptor activado por contacto con células cancerosas (Chang YH, et al., Cancer Res. 2013; 73(6):1777-1786). Los resultados de los estudios descritos en la presente con anti-CD19-4-1BB-CD3Z CAR y anti-CD3a scFv-KDEL simultáneos demuestran que no se vio
afectada la capacidad de señalización del CAR.
Tanto el anti-CD3s scFv-KDEL (y -PEST) probados en la presente regulan por disminución establemente la expresión de CD3 así como de TCR. Las células T CD3+ residuales podrían eliminarse usando perlas CD3, un enfoque que también está disponible en un formato de grado clínico. La capacidad de generar células CD3/TCR negativas que respondan a la señalización de CAR representa un avance importante. Los estudios clínicos con células T CAR generalmente se han realizado usando células T autólogas. Por tanto, la calidad del producto celular varía de un paciente a otro y las respuestas son heterogéneas. La infusión de células T alogénicas es actualmente imposible ya que tiene un riesgo inaceptablemente alto de GvHD potencialmente fatal, debido a la estimulación del TCR endógeno por los antígenos tisulares del receptor. La regulación por disminución de CD3/TCR abre la posibilidad de infundir células T alogénicas porque la falta de TCR endógeno elimina la capacidad de GvHD. Los productos alogénicos podrían prepararse con la composición celular óptima (por ejemplo, enriquecidos en células T altamente citotóxicas, desprovistos de células T reguladoras, etc.) y seleccionarse de tal manera que las células infundidas tengan una alta expresión de CAR y potencia funcional. Además, los productos completamente estandarizados podrían criopreservarse y estar disponibles para su uso independientemente del estado de las células inmunitarias del paciente y su aptitud para someterse a aféresis o extracciones de sangre extensas. La eliminación de la expresión de TCR se ha abordado usando herramientas de edición de genes, como las nucleasas (Torikai H, et al. Blood, 2012; 119(24):5697-5705). Aunque este es un enfoque eficaz, es difícil de implementar en un entorno clínico, ya que requiere varias rondas de selección y expansión celular, con cultivo prolongado. Los métodos descritos en la presente tienen considerables ventajas prácticas.
Además, de acuerdo con la presente invención puede usarse una molécula de unión a objetivo enlazada a LD (por ejemplo, scFv-myc KDEL, scFv-EEKKMP o scFv-PEST, en donde scFv se dirige a una proteína/molécula específica) para eliminar moléculas HLA de Clase I, reduciendo la posibilidad de rechazo de células alogénicas. Aunque la infusión de células T alogénicas es un objetivo futuro de la terapia con células CAR T, la infusión de células asesinas naturales (NK) alogénicas ya se usa para tratar pacientes con cáncer. Un factor clave que determina el éxito de la terapia basada en células NK es que las células NK deben persistir en cantidades suficientes para lograr una relación efector: objetivo que probablemente produzca citorreducción tumoral (Miller J S. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013; 2013:247-253). Sin embargo, cuando se infunden células alogénicas, su persistencia es limitada. La quimioterapia inmunosupresora administrada al paciente permite el injerto transitorio de las células NK infundidas, pero estas son rechazadas en el plazo de 2-4 semanas desde la infusión (Miller JS, et al. Blood. 2005; 105:3051-3057; Rubnitz JE, et al., J Clin Oncol. 2010; 28(6):955-959). A diferencia del trasplante de órganos, la inmunosupresión continua no es una opción porque los fármacos inmunosupresores también suprimen la función de las células NK. Como el rechazo está mediado principalmente por el reconocimiento de las moléculas HLA Clase I por parte de los linfocitos T CD8+ del receptor, la eliminación de las moléculas HLA Clase I de las células NK (o células T) infundidas disminuirá o anulará la tasa de rechazo, extenderá la supervivencia de las células alogénicas y por tanto su capacidad antitumoral.
Además, puede usarse una molécula de unión a objetivo enlazada a LD de acuerdo con la presente invención para dirigirse a receptores de inhibidores. Específicamente, la administración de anticuerpos que liberan las células T de las señales inhibidoras, como anti-PD1 o anti-CTLA-4, ha producido respuestas clínicas espectaculares (Sharma P, et al., Nat Rev Cancer. 2011; 11(11 ):805-812). Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012; 12(4):252-264). Las células CAR-T, en particular las dirigidas contra tumores sólidos, podrían inhibirse mediante mecanismos similares. Por tanto, la expresión de una molécula de unión al objetivo (por ejemplo, scFv o ligandos) contra PD1, CTLA-4, Tim3 u otros receptores inhibidores evitaría la expresión de estas moléculas (si se enlaza a, por ejemplo, KDEL (SEQ ID NO: 4), EEKKMP (SEQ ID NO: 64) o el motivo PEST SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (SEQ ID NO: 7)) o evitar la unión de los receptores a sus ligandos (si están enlazados a un dominio transmembrana) y mantener la transducción de señales mediada por CAR. En las células NK, los ejemplos de receptores de inhibidores incluyen receptores similares a inmunoglobulinas asesinas (KIR) y NKG2A (Vivier E, et al., Science, 2011; 331 (6013): 44-49).
Los métodos de la presente invención también permiten la selección de un mayor número de objetivos susceptibles de terapia de células T dirigida por CAR. Una de las principales limitaciones de la terapia dirigida por CAR es la escasez de antígenos específicos expresados por las células tumorales. En el caso de enfermedades malignas hematológicas, como leucemias y linfomas, las moléculas que no se expresan en células no hematopoyéticas podrían ser objetivos potenciales pero no pueden usarse como objetivos de CAR porque también se expresan en células T y/o células n K. Expresar tales CAR en las células inmunitarias llevaría probablemente a la desaparición de las propias células inmunitarias mediante un mecanismo "fratricida", anulando su capacidad anticancerígena. Si la molécula objetivo puede eliminarse de las células inmunitarias sin efectos funcionales adversos, entonces puede expresarse el CAR con la especificidad correspondiente. Esto abre muchas oportunidades nuevas para dirigirse a enfermedades malignas hematológicas. Los ejemplos de posibles objetivos incluyen CD38 expresado en mieloma múltiple, CD7 expresado en leucemia y linfoma de células T, Tim-3 expresado en leucemia aguda, CD30 expresado en enfermedad de Hodgkin, CD45 y CD52 expresados en todas las enfermedades malignas hematológicas. Estas moléculas también se expresan en una proporción sustancial de células T y células NK.
Además, se ha demostrado que la secreción de citoquinas por parte de las células inmunitarias activadas desencadena el síndrome de liberación de citoquinas y el síndrome de activación de macrófagos, lo que presenta efectos adversos graves de la terapia con células inmunitarias (Lee DW, et al., Blood. 2014; 124(2):188-195). Por tanto, la molécula de unión a objetivo enlazada a LD puede usarse de acuerdo con la presente invención para bloquear citoquinas como IL-6, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15., IL-18, IL-21, IL-27, IL-35, interferón (IFN)-y, IFN-p, IFN-a, factor de necrosis tumoral (TNF)-a y factor de crecimiento transformante (TGF)-p, lo que puede contribuir a tal cascada inflamatoria.
Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a una célula inmunitaria manipulada que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado a un dominio de localización,
en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRP, TCR7, TCRó, CD3ó, CD37, o CD3Z; o
un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de una proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor.
Como se usa en la presente, una célula inmunitaria "manipulada" incluye una célula inmunitaria que ha sido modificada genéticamente en comparación con una célula inmunitaria de origen natural. Por ejemplo, una célula T manipulada producida de acuerdo con los presentes métodos lleva un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que no se produce de manera natural en una célula T de la que se deriva. La célula inmunitaria manipulada de la presente invención incluye un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una molécula de unión a objetivo enlazada a un dominio de localización (molécula de unión a objetivo enlazada a LD). En una realización particular, la célula inmunitaria manipulada de la presente invención incluye un CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z y un scFv anti-CD3 enlazado a un dominio de localización.
En la divulgación, la célula inmunitaria manipulada es una célula T manipulada, una célula asesina natural (NK) manipulada, una célula NK/T manipulada, un monocito modificado, un macrófago modificado o una célula dendrítica manipulada.
En la divulgación, un "receptor de activación inmunitario" como se usa en la presente se refiere a un receptor que activa una respuesta inmunitaria tras unirse a un ligando de células cancerosas. En la divulgación, el receptor de activación inmunitario comprende una molécula que, al unirse (ligarse) a un ligando (por ejemplo, péptido o antígeno) expresado en una célula cancerosa, es capaz de activar una respuesta inmunitaria. En la divulgación, el receptor de activación inmunitario es un receptor de antígeno quimérico (CAR); los métodos para diseñar y manipular un CAR son conocidos en la técnica. En la divulgación, el receptor de activación inmunitario es un receptor de unión a anticuerpos, que es similar a un CAR, pero con el scFv reemplazado por una molécula de unión a anticuerpo (por ejemplo, CD16, CD64, CD32) (ver, por ejemplo, CD16-4-1BB-CD3zeta receptor - Kudo K, et al., Cáncer Res.2014; 74(1):93-103). En la divulgación, también pueden usarse de acuerdo con los presentes métodos los receptores de células T que comprenden las cadenas alfa y beta del receptor de células T que se unen a un péptido expresado en una célula tumoral en el contexto del HLA de la célula tumoral. En la divulgación, también pueden usarse otros receptores que portan moléculas que activan una respuesta inmunitaria al unirse a un ligando expresado en una célula cancerosa, por ejemplo, el receptor NKG2D-DAP1O-CD3zeta, que se une al ligando n Kg 2D expresado en células tumorales (ver, por ejemplo, Chang YH et al., Cáncer Res. 2013; 73(6):1777-1786). A todos estos receptores adecuados capaces de activar una respuesta inmunitaria tras unirse (ligarse) a un ligando (por ejemplo, péptido o antígeno) expresado en una célula cancerosa se hace referencia colectivamente como "receptor de activación inmunitario". Como apreciarán los expertos en la técnica, un receptor de activación inmunitario no necesita contener un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv); más bien, la parte del receptor de activación inmunitario que se une a una molécula objetivo puede derivarse, por ejemplo, de un receptor en una pareja receptor-ligando, o de un ligando en una pareja receptor-ligando.
En la divulgación, el receptor de activación inmunitario se une a moléculas expresadas en la superficie de las células tumorales incluyendo, pero no limitadas a, CD20, CD22, CD33, CD2, CD3, Cd4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD52, CD38, CS -1, TIm 3, CD123, mesotelina, receptor de folato, HER2-neu, receptor del factor de crecimiento epidérmico y receptor del factor de crecimiento epidérmico. En algunas realizaciones, el receptor de activación inmunitario es un CAR (por ejemplo, CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z). En la divulgación, el receptor de activación inmunitario comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, scFv) que se une a moléculas expresadas en la superficie de células tumorales incluyendo, pero no limitadas a, CD20, CD22, CD33, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD52, CD38, CS-1, TIM3, CD123, mesotelina, receptor de folato, HER2-neu, receptor del factor de crecimiento epidérmico y receptor del factor de crecimiento epidérmico. Los anticuerpos contra dichas moléculas expresados en la superficie de las células tumorales son conocidos y están disponibles en
la técnica. A modo de ejemplo, los anticuerpos contra CD3 y CD7 están disponibles comercialmente y son conocidos en la técnica. En la presente invención pueden usarse tales anticuerpos, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv) derivados de los mismos, como se ejemplifica en la presente. Además, los métodos para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos contra una proteína objetivo son bien conocidos y rutinarios en la técnica.
El dominio transmembrana de un receptor de activación inmunitario de acuerdo con la divulgación (por ejemplo, CAR) puede derivarse de una proteína de membrana de un solo paso, que incluye, pero no se limita a, CD8a, CD8p, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcsRIy, CD16 (por ejemplo, CD16A o CD16B), OX40, CD3Z, CD3s, CD3y, CD36, TCRa, CD32 (por ejemplo, CD32A o CD32B), CD64 (por ejemplo, CD64A, CD64B o CD64C), VEGFR2, FAS y FGFR2B. En algunos ejemplos, la proteína de membrana no es CD8a. El dominio transmembrana también puede ser un segmento de proteína hidrófoba que no se produce de forma natural.
El dominio bisagra del receptor de activación inmunitario (por ejemplo, CAR) puede derivarse de una proteína como CD8a o IgG. El dominio bisagra puede ser un fragmento del dominio transmembrana o bisagra de CD8a, o un péptido de origen no natural, como un polipéptido que consta de residuos hidrófilos de longitud variable, o un polipéptido (GGGGS)n (SEQ ID NO: 8), en el que n es un número entero de, por ejemplo, 3-12, ambos inclusive.
El dominio de señalización del receptor de activación inmunitario (por ejemplo, CAR) puede derivarse de CD3Z, FcsRIy, DAP10, DAP12 u otras moléculas que se sabe que suministran señales de activación en las células inmunitarias. Por lo menos un dominio de señalización coestimulador del receptor puede ser una molécula coestimuladora como 4-1BB (también conocida como CD137), CD28, variante c D28ll^ gg, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1 o CD2. Tales moléculas están fácilmente disponibles y son conocidas en la técnica.
Como apreciarán los expertos en la técnica, los componentes de un receptor de activación inmunitario pueden diseñarse para que comprendan una serie de combinaciones funcionales, como se describe en la presente, para producir un resultado deseado. Usando el CAR particular anti-CD19-4-1BB-CD3Z como ejemplo, el anticuerpo (por ejemplo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como un scFv) que se une a una molécula puede sustituirse por un anticuerpo que se une a una molécula diferente, como se describe en la presente (por ejemplo, anti-CD20, anti-CD33, anti-CD123, etc., en lugar de anti-CD19). En la divulgación, la molécula coestimuladora (4-1BB en este ejemplo específico) también se puede variar con una molécula coestimuladora diferente, por ejemplo, CD28. En la divulgación, la molécula estimuladora (CD3Z en este ejemplo específico) puede sustituirse por otra molécula estimuladora conocida. En la divulgación, el dominio transmembrana del receptor también puede variarse según se desee. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el diseño, la producción y la prueba de la funcionalidad de tales receptores de activación inmunitarios. De manera similar, el diseño, la administración a las células y la expresión de ácidos nucleicos que codifican tales receptores de activación inmunitarios son fácilmente conocidos y están disponibles en la técnica.
Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" se refiere a un polímero que comprende múltiples monómeros de nucleótidos (por ejemplo, monómeros de ribonucleótidos o monómeros de desoxirribonucleótidos). “Ácido nucleico” incluye, por ejemplo, moléculas de ADN genómico, ADNc, ARN e híbridas de ADN-ARN. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de origen natural, recombinantes o sintéticas. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser de cadena sencilla, de cadena doble o de cadena triple. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse. En el caso de un polímero de cadena doble, "ácido nucleico" puede referirse a una o ambas cadenas de la molécula.
El término "secuencia de nucleótidos", en referencia a un ácido nucleico, se refiere a una serie contigua de nucleótidos que están unidos por enlaces covalentes, como enlaces de fósforo (por ejemplo, enlaces fosfodiéster, alquilo y aril-fosfonato, fosforotioato, fosfotriéster) y/o enlaces que no son de fósforo (por ejemplo, enlaces peptídicos y/o de sulfamato). En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica, por ejemplo, una molécula de unión al objetivo unida a un dominio de localización es una secuencia heteróloga (por ejemplo, un gen que es de una especie diferente o un origen de tipo celular).
Los términos "nucleótido" y "monómero de nucleótido" se refieren a monómeros de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de origen natural, así como derivados de origen no natural y análogos de los mismos. Por consiguiente, los nucleótidos pueden incluir, por ejemplo, nucleótidos que comprenden bases de origen natural (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, inosina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina o desoxicitidina) y nucleótidos que comprenden bases modificadas conocidas en la técnica.
Como apreciarán los expertos en la técnica, en algunos aspectos, el ácido nucleico comprende además una secuencia plasmídica. La secuencia plasmídica puede incluir, por ejemplo, una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste de una secuencia promotora, una secuencia marcadora de selección y una secuencia dirigida al locus.
Como se usa en la presente, al gen que codifica una molécula de unión a objetivo enlazada a un dominio de localización a veces se hace referencia como "molécula de unión a objetivo enlazada a LD".
Como se usa en la presente, "anticuerpo" significa un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno que ha sido modificado o manipulado, o que es un anticuerpo humano. Los ejemplos de anticuerpos que se han modificado o manipulado son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos multiparatópicos (por ejemplo, anticuerpos biparatópicos) y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab') , Fv, anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, scFv), minicuerpos y diacuerpos.
Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.
Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen unidos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.
Un "fragmento Fab' " contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de tal manera que puede formarse un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.
Un “fragmento F(ab')2 ” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2 , de tal manera que se forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.
La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes.
En una realización particular, la molécula de unión al objetivo es un anticuerpo Fv de cadena sencilla ("anticuerpo scFv"). scFv se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, consultar Pluckthun (1994) The Pharmacology Of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269 315. Ver también, la Publicación de PCT N° WO 88/01649 y las Patentes de Estados Unidos N° 4.946.778 y 5.260.203. A modo de ejemplo, el conector entre los dominios VH y VL de los scFv divulgados en la presente comprende, por ejemplo, GGGGGSGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41) o GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 43). Como apreciarán los expertos en la técnica, pueden diseñarse y probarse varios conectores adecuados para una función óptima, como se proporciona en la técnica y como se divulga en la presente.
El scFv que forma parte de la molécula de unión al objetivo enlazada a LD no es necesariamente el mismo que el scFv que se produce en el contexto de, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de señalización de unión a anticuerpos similar. En algunas realizaciones, el scFv que forma parte de la molécula de unión al objetivo enlazada a LD es el mismo que el scFv que se produce en el contexto de, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de señalización de unión a anticuerpo similar.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión al objetivo (por ejemplo, un scFv en el contexto de una molécula de unión al objetivo enlazada a LD) comprende una o más secuencias que tienen por lo menos un 80%, por lo menos un 85%%, por lo menos un 88%, por lo menos un 90%, por lo menos un 92%, por lo menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99% o nu 100% identidad de secuencia con una o más de las SEQ ID NO: 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 o 39.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, cuando están alineadas de manera óptima, como por los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten por lo menos, por ejemplo, un 70% de identidad de secuencia, o por lo menos un 80% de identidad de secuencia, o por lo menos un 85% de identidad de secuencia, o por lo menos un 90% de identidad de secuencia, o por lo menos un 95% de identidad de secuencia o más. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia (por ejemplo, secuencia original), con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Luego el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa designados.
El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software genético Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (ver en general Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (accesible públicamente a través del servidor de Internet de NCBI de los Institutos Nacionales de Salud). Típicamente, pueden usarse los parámetros de programa predeterminados para realizar la comparación de secuencias, aunque también pueden usarse parámetros personalizados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTp usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, scFv) comprende la VH y la VL que tienen secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 12 y 13, respectivamente; SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente; SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente; SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente; SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente; SEQ ID NO: 32 y 33, respectivamente; o SEQ ID NO: 36 y 37, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, scFv) comprende la VH y la VL que tienen una secuencia que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia, por lo menos un 91% de identidad de secuencia, por lo menos un 92% de identidad de secuencia, por lo menos un 93% de identidad de secuencia, por lo menos un 94% de identidad de secuencia, por lo menos un 95% de identidad de secuencia, por lo menos un 96% de identidad de secuencia, por lo menos un 97% de identidad de secuencia, por lo menos un 98% de identidad de secuencia, por lo menos un 99% de identidad de secuencia o un 100% de identidad de secuencia con las secuencias de VH y VL expuestas en las SEQ ID NO: 12 y 13, respectivamente; SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente; SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente; SEQ ID NO: 24 y 25, respectivamente; SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente; SEQ ID NO: 32 y 33, respectivamente; o SEQ ID NO: 36 y 37, respectivamente.
Un “diacuerpo” es un fragmento pequeño de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno. Los fragmentos comprenden una región variable de cadena pesada (VH) conectada a una región variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos de patente EP 404.097; WO 93/11161; y Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un triacuerpo o un tetracuerpo. Los métodos para diseñar y producir triacuerpos y tetracuerpos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Todorovska et al., J. Immunol. Methods 248(1-2):47-66, 2001.
Un "fragmento de anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con un conector peptídico para crear un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse a antígenos iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se modifica o manipula. Los ejemplos de anticuerpos modificados o diseñados incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiparatópicos (por ejemplo, anticuerpos biparatópicos) y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos).
Como se usa en la presente, "anticuerpo multiparatópico" significa un anticuerpo que comprende por lo menos dos anticuerpos de dominio único, en el que por lo menos un anticuerpo de dominio único se dirige contra un primer determinante antigénico en un antígeno y por lo menos otro anticuerpo de dominio único se dirige contra un segundo determinante antigénico en el mismo antígeno. Así, por ejemplo, un anticuerpo "biparatópico" comprende por lo menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra un primer determinante antigénico en un antígeno y por lo menos otro anticuerpo de dominio único dirigido contra un segundo determinante antigénico en el mismo antígeno.
Como se usa en la presente, "anticuerpo multiespecífico" significa un anticuerpo que comprende por lo menos dos anticuerpos de dominio único, en el que por lo menos un anticuerpo de dominio único se dirige contra un primer antígeno y por lo menos otro anticuerpo de dominio único se dirige contra un segundo antígeno (diferente del primer antígeno). Así, por ejemplo, un anticuerpo "biespecífico" es uno que comprende por lo menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra un primer antígeno y por lo menos otro anticuerpo de dominio único dirigido contra un segundo antígeno, por ejemplo, diferente del primer antígeno.
En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados en la presente son anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.
En varias realizaciones, la molécula de unión al objetivo en el contexto de una molécula de unión al objetivo enlazada a LD es un receptor o un ligando que se une a una molécula objetivo. Por ejemplo, esa molécula de unión al objetivo puede ser un ligando que se une a PD-1 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Por tanto, como apreciarán los expertos en la técnica, la molécula de unión al objetivo puede ser un anticuerpo o un ligando/receptor que se une a una molécula objetivo.
Como se usa en la presente, "enlazado" en el contexto de una molécula de unión a objetivo enlazada a LD se refiere a un gen que codifica una molécula de unión al objetivo directamente en el marco (por ejemplo, sin un conector) adyacente a uno o más genes que codifican uno o más dominios de localización. Alternativamente, el gen que codifica una molécula de unión al objetivo puede estar conectado a uno o más genes que codifican uno o más dominios de localización a través de una secuencia conectora, como se describe en la presente. Pueden usarse varios conectores adecuados conocidos en la técnica para anclar la molécula de unión al objetivo a un dominio de localización. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención pueden usarse péptidos de origen no natural, como un polipéptido que consiste de residuos hidrófilos de longitud variable, o un (GGGGS)n (SEQ ID NO: 8), en el que n es un número entero de, por ejemplo, 3-12, ambos incluidos. En realizaciones particulares, el conector comprende, por ejemplo, GGGGGGGGGS (s Eq ID NO: 62). En algunas realizaciones, el conector comprende, por ejemplo, GGGGGSGGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41). En diversas realizaciones, en la presente invención pueden usarse conectores peptídicos que tienen longitudes de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 aminoácidos, ambos incluidos. En ciertas realizaciones, en la presente invención pueden usarse conectores peptídicos que tienen longitudes de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 aminoácidos, ambos incluidos. En algunas realizaciones, en la presente invención pueden usarse conectores peptídicos que tienen longitudes de por lo menos 5 aminoácidos, por lo menos 10 aminoácidos, por lo menos 15 aminoácidos, por lo menos 20 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos, por lo menos 30 aminoácidos, por lo menos 35 aminoácidos, o por lo menos 40 aminoácidos. Como apreciarán los expertos en la técnica, en la técnica se conocen tales secuencias conectoras así como variantes de tales secuencias conectoras. Los métodos para diseñar constructos que incorporan secuencias conectoras, así como métodos para evaluar la funcionalidad, están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, la molécula de unión a objetivo enlazada a LD se une a un objetivo expresado en la superficie de una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, la molécula de unión a objetivo enlazada a LD inhibe la actividad o función de la molécula objetivo. A modo de ejemplo, como se divulga en la presente, la molécula de unión al objetivo enlazada a LD puede diseñarse para unirse, por ejemplo, a CD3, CD7, CD45, hB2MG, KIR2DL1, KIR2DL2/DL3 o NKG2A, regulando por disminución de este modo la expresión de la superficie celular de tales moléculas. La regulación por disminución de tales moléculas puede lograrse, por ejemplo, localizando/dirigiendo las moléculas para la degradación y/o la internalización. En otras realizaciones, la molécula de unión al objetivo enlazada a LD inactiva al objetivo (por ejemplo, el objetivo ya no puede interactuar y/o unirse a su ligando o receptor afín).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o el scFv de la presente invención que se une a CD3s comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12, y un cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o el scFv de la presente invención que se une a NKG2A comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 32, y un cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 33.
En algunas realizaciones, las células inmunitarias manipuladas de la presente invención tienen una eficacia terapéutica mejorada. Como se usa en la presente, "eficacia terapéutica mejorada" se refiere a uno o más de la reducción de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) en un huésped, reducción o eliminación del rechazo por parte de un huésped, supervivencia prolongada en un huésped, inhibición reducida por parte del tumor en un huésped, reducción de la autodestrucción en un huésped, reducción de la cascada inflamatoria en un huésped o transducción sostenida de señales mediada por CAR en un huésped.
En la divulgación, la molécula de unión al objetivo en el contexto de una molécula de unión al objetivo enlazada a LD se une a una molécula en un complejo CD3/receptor de células T (TCR), una citoquina, una molécula de clase I de antígeno leucocitario humano (HLA), o un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria.
En ciertas realizaciones, una molécula en un complejo CD3/TCR puede ser CD3s, TCRa, TCRp, TCRy, TCR6, CD36, CD3y o CD3A. En una realización particular, la molécula es CD3s.
En otra realización, la molécula de HLA Clase I es microglobulina beta-2, microglobulina a l, microglobulina a2 o microglobulina a3.
En la presente invención, un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria se selecciona de, por ejemplo, PD-1, CTLA-4, Tim3, receptores similares a inmunoglobulinas asesinas (KIR, por ejemplo, KIR2DL1 (también conocido como CD158a), KIR2DL2/DL3 (también conocido como como CD158b)), Cd94 o NKG2A (también conocida como CD159a), proteínas tirosina fosfatasas como la fosfatasa que contiene el dominio de la región 2 de homología Src (SHP)-1 y SHP-2. Por tanto, tales receptores pueden ser dirigidos por una molécula de unión al objetivo enlazada a LD de la fracción, como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o el scFv de la presente invención que se une a KIR2DL1 y KIR2DL2/DL3 comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36, y un cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 37.
En varias realizaciones, los ejemplos de citoquinas que pueden ser dirigidas con moléculas de unión al objetivo enlazadas a LD de la fracción incluyen, por ejemplo, interleuquina (IL)-6, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, IL-35, interferón (IFN)-y, IFN-p, IFN-a, factor de necrosis tumoral (TNF)-a o factor de crecimiento transformante (TGF)-p.
En la divulgación, la molécula de unión a objetivo enlazada a LD se une a una molécula seleccionada de, por ejemplo, CD2, CD4, CDS, CD7, CD8, CD30, CD38, CD45, CD52 o CD127.
Los métodos para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de los mismos contra cualquier proteína objetivo son bien conocidos y rutinarios en la técnica. Además, como se ejemplifica en la presente, pueden usarse anticuerpos comercialmente disponibles contra varios objetivos, por ejemplo, CD3 y CD7, para generar una molécula de unión al objetivo enlazada a LD, como se ejemplifica en la presente. En la presente invención pueden usarse anticuerpos conocidos en la técnica, así como los fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv) derivados de los mismos, como se ejemplifica en la presente.
En otros aspectos, el dominio de localización de la molécula de unión al objetivo enlazada a LD comprende una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) KDEL (SEQ ID NO: 4), u otras secuencias de retención de ER o Golgi como KKXX (SEQ ID NO: 9), KXD/E (s Eq ID NO: 10) (donde X puede ser cualquier aminoácido; ver Gao C, et al., Trends in Plant Science 19: 508-515, 2014) y YQRL (SEQ ID NO: 11) (ver Zhan J, et al., Cáncer Immunol Immunother 46:55-60, 1998); una secuencia dirigida al proteosoma que comprende, por ejemplo, el motivo "PEST" - SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (SEQ ID NO: 7); y/o una secuencia que dirige la molécula de unión al objetivo a la membrana celular, como el dominio transmembrana de CD8a, o la transmembrana de otra proteína de membrana de un solo paso, como se describe en la presente (por ejemplo, CD8a, CD8p, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcsRIy, CD16 (como CD16A o CD16B), OX40, CD3Z, CD3s, CD3y, CD3Ó, TCRa, CD32 (como CD32A o CD32B), CD64 (como CD64A, CD64B o CD64C), VEGFR2, FAS o FGFR2B). Los ejemplos de dominios de localización particulares (secuencias) ejemplificados en la presente se muestran en la FIG.
2. Se conocen y están disponibles en la técnica varias otras secuencias de localización.
Como se muestra en la FIG. 2, las moléculas de unión al objetivo unidas a LD de la presente invención pueden comprender uno o más dominios de localización. Por ejemplo, la molécula de unión al objetivo enlazada a LD puede tener por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez dominios de localización enlazados entre sí. Cuando se usa más de un dominio de localización en una molécula de unión a objetivo enlazada a LD dada, cada dominio de localización puede unirse con o sin ningún conector intermedio. A modo de ejemplo, como se muestra en la FIG. 2, pueden usarse los dominios de localización CD8 TM, el motivo PEST y EEKKMP en una única molécula de unión al objetivo enlazada a LD. Aunque este constructo particular muestra los dominios de localización sin conectores intermedios, pueden incorporarse varios conectores intermedios entre algunos o todos los dominios de localización. Otros ejemplos se muestran en la FIG. 2.
Como apreciarán los expertos en la técnica, el receptor de activación inmunitario y/o la molécula de unión al objetivo enlazada a LD pueden diseñarse para que se unan a los objetivos divulgados en la presente, así como a variantes de los objetivos divulgados en la presente. A modo de ejemplo, puede diseñarse un receptor de activación inmunitario y/o la molécula de unión al objetivo enlazada a LD para que se unan a una molécula en un complejo CD3/TCR, o una variante de su molécula de origen natural. Tales variantes de origen natural pueden tener la misma función que la forma de tipo salvaje de la molécula. En otras realizaciones, la variante puede tener una función que está alterada con respecto a la forma de tipo salvaje de la molécula (por ejemplo, confiere un estado de enfermedad).
Como apreciarán los expertos en la técnica, los varios componentes de los constructos de moléculas de unión a objetivo enlazadas a LD que se muestran en la FIG. 2 pueden sustituirse en diferentes combinaciones (por
ejemplo, para que contengan un conector diferente, una secuencia de localización diferente, un scFv diferente, etc.), siempre que la combinación produzca una molécula de unión al objetivo enlazada a LD funcional. Los métodos para evaluar la funcionalidad de un constructo particular están dentro del ámbito de los expertos en la técnica, como se divulga en la presente.
En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a células inmunitarias manipuladas de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una célula inmunitaria manipulada que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) enlazados a un dominio de localización para tratar el cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéutica de la célula inmunitaria manipulada a un sujeto con necesidad de ello.
En otros aspectos, la presente divulgación se refiere al uso de una célula inmunitaria manipulada que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de activación inmunitario y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión al objetivo (por ejemplo, scFv) enlazados a un dominio de localización para tratar un trastorno autoinmune, que comprende administrar una cantidad terapéutica de la célula inmunitaria manipulada a un sujeto con necesidad de ello.
En otros aspectos, la presente divulgación también se refiere al uso de una célula inmunitaria manipulada que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de activación inmunitario, y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión al objetivo (por ejemplo, scFv) enlazados a un dominio de localización para tratar una enfermedad infecciosa, que comprende administrar una cantidad terapéutica de la célula inmunitaria manipulada a un sujeto con necesidad de ello.
En varias realizaciones, el receptor de activación inmunitario es un CAR (por ejemplo, CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z).
En otras realizaciones, el fragmento variable de cadena sencilla (scFv) enlazado a un dominio de localización se selecciona de uno o más de los constructos que se muestran en la FIG. 2.
En algunos aspectos, la célula inmunitaria manipulada se administra por infusión al sujeto. Los métodos de infusión de células inmunitarias (por ejemplo, células inmunitarias alogénicas o autólogas) son conocidos en la técnica. Se administra un número suficiente de células al receptor para mejorar los síntomas de la enfermedad. Típicamente, se infunden dosificaciones de 107 a 1010 células en un único entorno, por ejemplo, dosificaciones de 109 células. Las infusiones se administran como dosis únicas de 109 células o divididas en varias dosificaciones de 109 células. La frecuencia de las infusiones puede ser cada 3 a 30 días o incluso intervalos más largos si se desea o está indicado. La cantidad de infusiones es generalmente de por lo menos 1 infusión por sujeto y preferiblemente de por lo menos 3 infusiones, según se tolere, o hasta que los síntomas de la enfermedad hayan mejorado. Las células pueden infundirse por vía intravenosa a una velocidad de 50-250 ml/h. Otros modos adecuados de administración incluyen infusión intraarterial, inyección directa en el tumor y/o perfusión del lecho tumoral después de la cirugía, implantación en el sitio del tumor en un andamiaje artificial, administración intratecal y administración intraocular. Los métodos para adaptar la presente invención a tales modos de administración están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.
En ciertos aspectos, el cáncer a tratar es un tumor sólido o una enfermedad maligna hematológica. Los ejemplos de enfermedades malignas hematológicas incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, mielodisplasia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, tumor cerebral.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para producir una célula inmunitaria manipulada de la presente invención, el método comprendiendo introducir en una célula inmunitaria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado a un dominio de localización, en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRp, TCR7, TCRó, CD3Ó, CD37, o CD3Z; o
un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de una proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a
inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y
en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor, produciendo de este modo una célula inmunitaria manipulada.
En algunas realizaciones, una "célula inmunitaria" incluye, por ejemplo, una célula T, una célula asesina natural (NK), una célula NK/T, un monocito, un macrófago o una célula dendrítica.
El ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se va a introducir puede ser un constructo bicistrónico individual que contiene un receptor de activación inmunitario descrito en la presente y una molécula de unión al objetivo (por ejemplo, scFv) enlazada a un dominio de localización. Como se describe en la presente, un constructo bicistrónico individual puede prepararse insertando un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) o un sitio de la región codificante del péptido 2a entre los 2 ADNc que codifican el receptor de activación inmunitario como se describe en la presente (por ejemplo, CAR) y la molécula de unión al objetivo (por ejemplo, scFv). También debería ser factible el diseño de sistemas de administración tricistrónicos para eliminar más de un objetivo. Alternativamente, podrían realizarse transducciones separadas (simultánea o secuencialmente) de los constructos individuales (por ejemplo, CAR y molécula de unión a objetivo enlazada a LD).
Como se usa en el presente, los artículos indefinidos “un” y “uno" deben entenderse como “por lo menos uno” a menos que se indique claramente lo contrario.
EJEMPLIFICACIÓN
Métodos
Clonación de scFv de hibridoma anti-CD3 humano de ratón
Se cultivaron células de hibridoma PLU4 que secretan un anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano (isotipo IgG2a; Creative Diagnostics, Shirley, NY) en medio IMDM más GlutaMAX (Life Technologies, Carlsbad, CA) con suero fetal bovino al 20% (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y antibióticos. El ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Life Technologies) y el ADNc se sintetizó mediante la transcriptasa inversa M-MLV (Promega, Madison, WI) y el cebador Oligo(dT)15 (Promega). Se usó el conjunto de cebadores de la biblioteca de IgG de ratón de BioGenomics (US Biological, Salem, MA) para amplificar la región variable de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL); los productos de PCR se clonaron en el kit de clonación TOPO TA para secuenciación (Life Technologies). Los genes de VH y VL se ensamblaron en scFv mediante una secuencia conectora flexible que codifica (Gly4er)4 usando corte y empalme por superposición de extensión-PCR. El dominio del péptido señal de CD8a se subclonó mediante PCR usando ADNc derivado de células T activadas humanas de un donante sano y se conectó al extremo 5' del fragmento VL. Se añadió la etiqueta Myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 1) al extremo C terminal de VH mediante PCR usando el cebador sentido: 5-ATATATGAATTCGGCTTCCACCATGGCCTTACCAGTGACC-3' (SEQ ID NO: 2) y el cebador inverso: 5'-CAGATCTTCTTCAGAAATAAGTTTTTGTTCCGGCTGAGGAGACTGTGAGAG-3' (SEQ ID NO: 3). También se generó la secuencia de codificación KDEL (SEQ ID NO: 4) después de la etiqueta Myc mediante el cebador de sentido: 5'-ATATATGAATTCGGCTTCCACCATGGCCTTACCAGTGACC-3' (SEQ ID NO: 5) y el cebador inverso: 5'-T AT AT ACTCGAGTT ACAACTCGTCCTT CAGATCTT CTT CAGAAAT AAG-3' (SEQ ID NO: 6). El gen sintetizado que consiste del péptido señal CD8, scFv contra CD3 humano, etiqueta Myc y la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 4) se subclonó en sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP. También se hicieron constructos en los que myc-KDEL se reemplazó por otras secuencias como se enumera en la FIG. 2.
La secuencia del motivo "PEST" - SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (SEQ ID NO: 7) correspondiente a los aminoácidos 422-461 de la ornitina descarboxilasa de ratón se obtuvo de GenBank (número de registro NM_013614.2). La optimización de codones y la síntesis de genes se realizaron mediante GenScript (Piscataway, NJ) y se subclonaron en el extremo 3' de VH mediante PCR. Los constructos se subclonaron en sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP.
Clonación de scFv contra CD7 humano
La secuencia scFv derivada del anticuerpo murino TH69 (anti-CD7) se obtuvo de la bibliografía (Peipp et al., Cancer Res 2002 (62): 2848-2855). Después de la optimización de codones, el gen sintetizado que consiste del péptido señal CD8, scFv contra CD7 humano, etiqueta Myc y secuencia KDEL (SEQ ID NO: 4) se subclonó en sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP. También se hicieron constructos en los que myc-KDEL se reemplazó por otras secuencias como se enumera en la FIG. 2.
Clonación de scFv contra microglobulina Beta-2 humana (hB2MG)
La secuencia scFv derivada del anticuerpo IgG2b murino BBM.1 (anti-hB2MG) se obtuvo de la bibliografía (Grovender, E.A. et al., Kidney Int. 2004; 65(1):310-322). Después de la optimización de codones, el gen sintetizado consistía del péptido señal CD8, scFv contra B2MG humano, la etiqueta Myc y la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 4) se subclonó en los sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP.
Clonación de scFv frente a KIR2DL1 y KIR2DL2/DL3 humanos
La secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal humano I-7F9 (anti-KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3) se derivó de la Solicitud de Patente Internacional publicada WO2006003179 A2 de Moretta et al. Después de la optimización de codones, la secuencia de scFv se diseñó conectando la región ligera variable (VL) y la región pesada variable (VH) con la secuencia conectora. El gen sintetizado que consiste del péptido señal CD8, scFv contra KIR humanos (KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3), dominio transmembrana y bisagra de CD8 y la secuencia KKMP se subclonó en sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP. Los constructos en los que se reemplazó KKMP por otras secuencias también se hicieron como se enumera en la FIG. 2.
Clonación de scFv contra NKG2A humano
La secuencia del anticuerpo murino Z199 (anti-NKG2A) se derivó de la patente publicada de Spee et al. (EP2247619 A1). Después de la optimización de codones, la secuencia de scFv se diseñó conectando la región ligera variable (VL) y la región pesada variable (VH) con la secuencia conectora. El gen sintetizado que consiste del péptido señal CD8, scFv contra NKG2A humano, bisagra y transmembrana de CD8 y secuencia KKMP se subclonó en sitios EcoRI y XhoI del vector MSCV-IRES-GFP. Los constructos en los que se reemplazó KKMP por otras secuencias también se hicieron como se enumera en la FIG. 2. La información de secuencia para los scFv generados en la presente se muestra en la Tabla 1. La información de secuencia para los varios componentes representados en la FIG. 2 se muestra en la Tabla 2.
CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z
Este CAR se generó como se ha descrito con anterioridad (Imai, C. et al., Leukemia. 2004; 18:676-684; Imai, C. et al., Blood 2005; 106:376-383).
Transducción de genes, expansión celular, análisis de citometría de flujo y estudios funcionales
Estos se realizaron como se ha descrito con anterioridad (Kudo, K et al., Cáncer Res. 2014; 74(1):93-103).
Resultados
Generación de constructos de scFv
En la FIG. 1 se describe un esquema de la tecnología. En la FIG. 2 se muestra una representación esquemática de los constructos inhibidores que generamos. La porción scFv puede derivarse clonando ADNc que codifica las regiones de la cadena de inmunoglobulina ligera variable (VL) y pesada variable (VH) de una línea celular de hibridoma productora de anticuerpos o de las secuencias publicadas correspondientes. VL y VH se enlazan con una secuencia peptídica corta ("conector") de acuerdo con técnicas estándar para hacer un scFv completo. Para ser expresado, el scFv se une a un péptido señal en el extremo N-terminal; se requiere el péptido señal para que se exprese el scFv, como se confirmó en experimentos preliminares. Las proteínas que contienen scFv más péptido señal generalmente se liberan en el medio celular. Por ejemplo, en experimentos preliminares (no mostrados), se detectó en el sobrenadante del cultivo celular un scFv anti-CD3s más péptido señal expresado en células T Jurkat. Dirigiendo el scFv a compartimentos específicos y evitando su secreción, se evitan posibles efectos sobre otras células. Para dirigirlo al retículo endoplásmico (ER), se utilizó el motivo KDEL (SEQ ID NO: 4) (que retiene proteínas en el ER) (Strebe N. et al., J Immunol Methods. 2009; 341(1-2):30-40). Para promover la degradación de la proteína objetivo, la enlazamos a un motivo PEST dirigido al proteasoma (Joshi, S.N. et al., MAbs.
2012; 4(6):686-693). El scFv también puede dirigirse a la membrana celular enlazándolo al dominio transmembrana y bisagra de CD8a u otra proteína transmembrana.
Regulación por disminución del receptor de células T en linfocitos T que expresan CAR anti-CD19-BB-Z
Para determinar si podría aplicarse la estrategia propuesta para generar células inmunitarias que expresen CAR y carezcan de uno o más marcadores, se reguló por disminución la expresión del receptor de células T (TCR) en células T CAR anti-CD19.
Para ser expresado en la membrana celular, el complejo CD3/TCR requiere el ensamblaje de todos sus componentes (TCRa, TCRp, CD3ó, CD3s, CD3y, CD3Z). La falta de un componente evita la expresión de CD3/TCR y, por lo tanto, el reconocimiento del antígeno. En estudios preliminares, el scFv de un hibridoma anti-CD3s (adquirido de Creative Diagnostics, Shirley, NY) se clonó y generó los constructos que contenían KDEL (SEQ ID NO: 4), PEST, dominio transmembrana de CD8a u otros, como se muestra en la FIG. 2.
Los constructos divulgado en la presente se transdujeron en la línea de células Jurkat CD3/TCR+ usando un vector retroviral de virus de células madre murinas (MSCV) que contenía proteína fluorescente verde (GFP). El porcentaje de células GFP+ después de la transducción fue >90% en todos los experimentos. La FIG. 3A muestra los resultados de la tinción con anticuerpo anti-CD3s entre células GFP+, medida por citometría de flujo. La tinción de anticuerpos de CD3s disminuyó en un grado variable en las células transducidas con los constructos enumerados. Se obtuvo una regulación por disminución similar de CD3s con linfocitos T de sangre periférica humana (FIG. 3B). La FIG. 3C muestra diagramas de puntos de citometría de flujo ilustrativos de la expresión de CD3s en células Jurkat positivas para GFP después de la transducción con diferentes constructos génicos en comparación con células transducidas con un vector que contenía solo GFP. La regulación por disminución de CD3 no afectó al crecimiento de las células Jurkat ni a la expresión de todos los demás marcadores celulares probados, incluyendo CD2, CD4, CD8, CD45, CD25, CD69. La inhibición de la expresión de CD3 persistió durante más de 3 meses. Se podría lograr un enriquecimiento adicional de las células negativas para CD3 mediante el agotamiento de las células T CD3+ con perlas magnéticas anti-CD3 (Dynal, Life Technologies, Carlsbad, CA).
La tinción con anticuerpo anti-TCRap de células Jurkat o linfocitos T de sangre periférica humana mostró que la regulación por disminución de la expresión de CD3s estaba asociada con la regulación por disminución de la expresión de TCRap (FIG. 4).
Luego, se determinó si el scFv-myc KDEL anti-CD3 podía expresarse simultáneamente con un CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z. Como se muestra en la FIG. 5, esto dio como resultado que las células T carecieran de expresión de CD3 mientras expresaban el CAR anti-CD19. TCR también estuvo ausente en estas células (no mostrado).
Para evaluar si CAR podía señalar en células Jurkat con CD3/TCR regulado por disminución, se probó la expresión de los marcadores de activación CD69 y CD25, y se midió la exocitosis de los gránulos líticos mediante la expresión de CD107a en células Jurkat cocultivadas con la línea celular de leucemia CD19+ OP-1. Como se muestra en la FIG. 6, la regulación por disminución de CD3/TCR con el constructo scFv-myc KDEL anti-CD3 no disminuyó la capacidad del CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z para activar las células Jurkat. Para explorar más a fondo los efectos de la deleción de CD3/TCR sobre la señalización de CAR, se determinó si los linfocitos T negativos para CD3 que expresan CAR podrían estimularse mediante su ligadura. Como se muestra en la FIG. 7, el cocultivo de
linfocitos T que expresan CAR anti-CD19 con células leucémicas CD19+ llevó a la proliferación de células T independientemente de si CD3 estaba regulado por disminución o no, lo que indica que la regulación por disminución de CD3/TCR no disminuyó el estímulo proliferativo de CAR.
Por consiguiente, CD3/TCR puede regularse por disminución de manera efectiva en las células T-CAR usando el constructo scFv-myc KDEL anti-CD3 sin afectar a la activación, desgranulación y proliferación de las células T impulsadas por CAR.
Regulación por disminución de CD7
Se determinó si la estrategia que moduló con éxito la expresión de CD3/TCR podría aplicarse a otras moléculas de superficie. Para este propósito, se moduló la expresión de CD7. La secuencia de scFv se derivó de la publicada por Peipp et al. (Cancer Res 2002 (62): 2848-2855), que se enlazó al péptido señal CD8 y la secuencia myc-KDEL como se ilustra en la FIG. 2. Usando el vector retroviral MSCV, se transdujo el constructo anti-CD7-myc KDEL en linfocitos de sangre periférica, que tienen una alta expresión de CD7 detectada por un anticuerpo anti-CD7 conjugado con ficoeritrina (BD Bioscience). Como se muestra en la FIG. 8, se anuló virtualmente CD7 en linfocitos T transducidos con el constructo.
Regulación por disminución de HLA-Clase I
Luego se aplicó la estrategia para regular por disminución otra molécula de superficie, HLA clase I.
HLA de clase I consiste de cadenas polimórficas ay una cadena no polimórfica denominada microglobulina p2. El silenciamiento de la última subunidad da como resultado la anulación de la expresión de HLA de Clase I (MHC en el ratón) (Koller, BH et al., Science. 1990; 248(4960):1227-1230). Se usó un scFv que reaccionaba con microglobulina p2 para suprimir la expresión de HLA Clase I en células inmunitarias.
La secuencia de scFv se derivó de la publicada por Grovender et al. (Kidney Int. 2004; 65(1):310-322), que se enlazó al péptido señal CD8 y la secuencia myc KDEL como se ilustra en la FIG. 2. Usando el vector retroviral MSCV, el constructo anti-p2M-myc KDEL se transdujo en células Jurkat, que tienen una alta expresión de HLA de Clase I detectada por un anticuerpo anti-HLA-ABC conjugado con ficoeritrina (BD Pharmingen). Como se muestra en la FIG. 9, las células Jurkat transducidas con el constructo tenían una regulación por disminución sustancial de la expresión de HLA-ABC. Las células mantuvieron su morfología y capacidad de crecimiento.
Regulación por disminución de los receptores inhibidores en las células NK
Para determinar si la estrategia descrita anteriormente también se aplicaría a las moléculas de superficie expresadas en otras células inmunitarias, se probó la regulación por disminución de la función del receptor inhibidor KIR2DL1, KIR2DL2/DL3 y NKG2A en células NK.
Para regular por disminución los receptores de MR, se usó un scFv que reaccionaba con KIR2DL1 y KIR2DL2/DL3 para suprimir su expresión en las células NK. La secuencia de scFv se derivó de la publicada por Moretta et al. (patente WO2006003179 A2), que se enlazó al péptido señal CD8 y las secuencias de retención de ER como se ilustra en la FIG. 2. Usando el vector retroviral MSCV, los constructos se transdujeron en células NK expandidas a partir de sangre periférica humana y se seleccionaron para la expresión de KIR2DL1. Estas células tenían una alta expresión de KIR2DL1 detectada por un anticuerpo anti-KIR2DL1 conjugado con aloficocianina (R&D Systems) y también una alta expresión de KIR2DL2/DL3 detectada por un anticuerpo anti-KIR2DL2/DL3 conjugado con ficoeritrina (BD Bioscience). La FIG. 10 muestra los resultados obtenidos con scFv-conector(20) AEKEDL y scFv-EEKKMP, con regulación por disminución sustancial de los KIR objetivo.
Para regular por disminución NKG2A, se usó un scFv que reaccionaba con NKG2A para suprimir su expresión en las células NK. La secuencia scFv, que se derivó de la Solicitud de Patente Europea publicada N° EP2247619 A1 de Spee et al. se enlazó al péptido señal CD8 y las secuencias de retención de ER como se ilustra en la FIG. 2. Usando el vector retroviral MSCv , los constructos se transdujeron en células NK expandidas a partir de sangre periférica humana, que tenían una alta expresión de NKG2A detectada por un anticuerpo anti-NKG2A conjugado con ficoeritrina (Beckman Coulter). La FIG. 11muestra una regulación por disminución sustancial de NKG2A obtenida con scFv-EEKKMP.
Claims (13)
1. Una célula inmunitaria manipulada que comprende un primer ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado a un dominio de localización,
en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRp, TCR7, TCR6, CD36, CD37, o CD3Z; o
un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y
en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor.
2. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, en donde la célula inmunitaria manipulada es una célula T manipulada, una célula asesina natural (NK) manipulada, una célula NK/T manipulada, un monocito manipulado, un macrófago manipulado, o una célula dendrítica manipulada.
3. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, en donde el CAR es un CAR anti-CD19-4-1BB-CD3Z
4. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv).
5. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o scFv que se une a CD3s comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12, y una cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13.
6. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1 o 4, en donde el anticuerpo o el scFv que se une a NKG2A comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 32, y una cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 33.
7. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1 o 4, en donde el anticuerpo o el scFv que se une a KIR2DL1 y KIR2DL2/DL3 comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 36, y un cadena ligera variable (VL) que comprende por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 37.
8. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, en donde el dominio de localización comprende una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) o de Golgi; una secuencia de localización de proteosoma; una secuencia de dominio transmembrana derivada de CD8a, CD8p, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FceRIy, CD16, OX40, CD3Z, CD3s, CD3y, CD36, TCRa, CD32, CD64, VEGFR2, FAS y FGFR2B.
9. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 8, en donde la secuencia de retención de ER o Golgi comprende la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO: 4) KKXX (SEQ ID NO: 9), KXD/E (SEQ ID NO: 10), o YQRL (SEQ ID NO: 11), en donde X es cualquier aminoácido o la secuencia de localización de proteosoma comprende un motivo PEST.
10. La célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
11. La célula inmunitaria manipulada para el uso de la reivindicación 10, en donde la célula es adecuada para ser administrada a un sujeto mediante infusión intravenosa, infusión intraarterial, inyección directa al tumor y/o perfusión del lecho del tumor después de la cirugía, implantación en un sitio tumoral en un andamiaje artificial, administración intratecal, o administración intraocular.
12. La célula inmunitaria manipulada para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer es un tumor sólido o una enfermedad maligna hematológica.
13. Un método in vitro para producir una célula inmunitaria manipulada de la reivindicación 1, el método comprendiendo:
introducir en una célula inmunitaria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
un receptor de antígeno quimérico y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo enlazado con un dominio de localización, en donde el anticuerpo se une a:
un factor en un complejo CD3/receptor de células T (TCR) seleccionado del grupo que consiste de CD3s, TCRa, TCRp, TCR7, TCR6, CD36, CD37, o CD3Z; o
un receptor que regula por disminución la respuesta inmunitaria seleccionado del grupo que consiste de proteína 1 de la muerte celular programada (PD-1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), inmunoglobulina de células T y dominio 3 que contiene mucina (Tim3), receptor similar a inmunoglobulina asesina (KIR) 2DL1, KIR2DL2/DL3, y NKG2A, y
en donde el anticuerpo enlazado al dominio de localización regula por disminución la expresión de superficie celular del factor o receptor,
produciendo de este modo una célula inmunitaria manipulada.
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2023
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