ES2913291T3 - Anticuerpos anti-FGFR2IIIB afucosilados - Google Patents

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Abstract

Una célula hospedadora que comprende ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FGFR2IIIb, en la que la célula hospedadora carece de un gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) funcional, y en la que el anticuerpo anti- FGFR2IIIb comprende regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, en la que la región variable de la cadena pesada comprende: (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y la región variable de la cadena ligera comprende: (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-FGFR2IIIB afucosilados
Campo de la invención
Anticuerpos anti-FGFR2IIIB afucosilados.
Antecedentes de la invención
Los miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) se unen a cuatro tirosina cinasas receptoras conocidas, los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos 1-4 (FGFR1-4) y sus isoformas, uniéndose los diversos Fg F a los diferentes FGFR en grados variables (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281: 15694, 2006). Se proporciona una secuencia proteínica de FGFR2 humano en, por ejemplo, GenBank Locus AF487553. Cada FGFR consiste en un dominio extracelular (ECD) que comprende tres dominios similares a inmunoglobulina (Ig) (D1, D2 y D3), una sola hélice transmembranaria y un dominio de cinasa catalítica intracelular (Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16: 107, 2005). Hay un tramo contiguo de aminoácidos ácidos en el conector entre D1 y D2 denominado "secuencia ácida" (AB). Se cree que la región que contiene D1 y AB está implicada en la autoinhibición del receptor, que se libera por unión al ligando. Los FGF se unen a los receptores principalmente a través de regiones en D2 y D3 de los receptores. Los FGFR se caracterizan por múltiple empalme alternativo de sus ARNm, dando lugar a una diversidad de isoformas (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271: 15292, 1996; véase también Swiss-Prot P21802 y las isoformas P21802-1 a -20 para secuencias de FGFR2 y sus isoformas). De forma notable, hay formas que contienen los tres dominios de Ig (isoforma a) o solamente los dos dominios de Ig D2 y D3 sin el dominio D1 (isoforma p). En FGFR1 - FGFR3, todas las formas contienen la primera mitad de D3 indicada IIIa, pero pueden utilizarse dos exones alternativos para la segunda mitad de D3, dando lugar a las formas IIIb y IIIc. Para FGFR2, estas se indican respectivamente FGFR2IIIb y FGFR2IIIc (o solamente FGFR2b y FGFR2c); las formas beta correspondientes se indican FGFR2(beta)IIIb y FGFR2(beta)IIIc. La forma FGFR2IIIb de FGFR2 (también indicada K-sam-II) es un receptor de alta afinidad para miembros tanto de la familia de FGF1 como de la de KGF (FGF7, FGF10 y FGF22), mientras que FGFR2IIIc (también indicado K-sam-I) se une bien tanto a FGF1 como a FGF2, pero no se une a los miembros de la familia de KGF (Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 246, 1992). De hecho, FGFR2IIIb es el único receptor para miembros de la familia de KGF (Ornitz et al., 1996, op. cit.) y, por lo tanto, también se denomina KGFR.
Los FGFR y sus isoformas se expresan de manera diferencial en diversos tejidos. FGFR2IIIb (y las formas IIIb de FGFR1 y FGFR3) se expresa en tejidos epiteliales, mientras que FGFRIIIc se expresa en tejidos mesenquimatosos (Duan et al., J. Biol. Chem. 267: 16076, 1992; Ornitz et al., 1996, op. cit.). Determinados ligandos Fg F de estos receptores tienen un patrón opuesto de expresión. Por tanto, los miembros de la subfamilia de KGF, incluyendo FGF7 (KGF), FGF10 y FGF22, se unen solamente a FGFRIIIb (Zhang et al., op. cit.) y se expresan en tejidos mesenquimatosos de modo que pueden ser efectores paracrinos de células epiteliales (Ornitz et al., 1996, op. cit.). En contraste, los miembros de la subfamilia de FGF4, FGF4-6, se unen a FGFR2IIIc y se expresan tanto en linajes epiteliales como mesenquimatosos de modo que pueden tener funciones autocrinas o paracrinas. Debido a los patrones de expresión de las isoformas de FGFR2 y sus ligandos, FGFR2 desempeña una función en las interacciones epiteliales-mesenquimatosas (Finch et al., Dev. Dyn. 203: 223, 1995), de modo que no es sorprendente que la supresión de FGFR2IIIb en ratones de lugar a defectos embrionarios graves y letalidad (De Moerlooze et al., Development 127: 483, 2000).
KGF (FGF7) y KGFR (FGFR2IIIb) se sobreexpresan en muchos cánceres pancreáticos (Ishiwata et al., Am. J. Pathol.
153: 213, 1998), y su coexpresión se correlaciona con un mal pronóstico (Cho et al., Am. J. Pathol. 170: 1964, 2007). Se encontraron mutaciones somáticas del gen de FGFR2 en un 12 % de un panel grande de carcinomas endometriales (uterinos), y en varios casos ensayados eran necesarias para la supervivencia de las células tumorales (Dutt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 8713, 2008). En dos tumores, se encontró que la mutación de FGFR2 era la misma sustitución S252W asociada con síndrome de Apert. La amplificación y sobreexpresión de FGFR2 están asociadas con el tipo indiferenciado, difuso, de cáncer gástrico, que tiene un pronóstico particularmente malo, y la inhibición de la actividad de FGFR2 por compuestos micromoleculares inhibía de forma potente la proliferación de dichas células cancerosas (Kunii et al., Cancer Res. 68: 2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131: 1530, 2006).
El documento WO 2010/0054265 divulga anticuerpos monoclonales contra FGFR2 y composiciones farmacéuticas relacionadas y métodos de tratamiento.
Sumario de la invención
Se divulgan anticuerpos y composiciones que comprenden anticuerpos, pero no se reivindican explícitamente. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb, en el que la región variable de la cadena pesada comprende: (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y la región variable de la cadena ligera comprende: (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 9; (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; en el que el anticuerpo está afucosilado. En algunas realizaciones, el anticuerpo carece de fucosa en Asn297. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos anti-FGFR2IIIb, en las que la región variable de la cadena pesada de cada anticuerpo anti-FGFR2IIIb en la composición comprende: (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y la región variable de la cadena ligera de cada anticuerpo anti-FGFR2IIIb en la composición comprende: (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; en las que al menos un 95 % de los anticuerpos en la composición están afucosilados. En algunas realizaciones, la composición puede ser un sobrenadante de una línea celular productora de anticuerpos. En algunas realizaciones, la composición puede ser una composición tamponada. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados, en la que los anticuerpos compiten por la unión a FGFR2IIIb con un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos quiméricos. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los anticuerpos pueden comprender una región constante de la cadena ligera k . En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los anticuerpos pueden comprender una región constante de la cadena pesada de IgG1.
En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen actividad ADCC potenciada in vitro en comparación con anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados que tienen la misma secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados provocan lisis específica que es al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 70 o al menos 75 puntos porcentuales mayor que la lisis específica con anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, la actividad ADCC se determina usando células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb como células diana y PBMC humanos aislados como células efectoras.
En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA en comparación con anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados que tienen la misma secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados se unen a Fc gamma RIIIA con al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 20 veces mayor afinidad que los anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, la afinidad por Fc gamma RIIIA se determina usando resonancia de plasmones superficiales. En algunas realizaciones, Fc gamma RIIIA se selecciona de Fc gamma RIIIA(V158) y Fc gamma RIIIA(F158). En algunas realizaciones, Fc gamma RIIIA es Fc gamma RIIIA(V158).
En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, los anticuerpos pueden unirse a FGFR2IIIb, pero no a FGFR2IIIc.
En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados comprende al menos un 95 % de anticuerpos afucosilados. En cualquiera de las realizaciones descritas en este documento, una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados puede tener fucosilación indetectable. En algunas realizaciones, la presencia de fucosa puede determinarse mediante un método que comprende cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), electroforesis capilar o espectrometría de masas MALDI-TOF.
De acuerdo con la invención, como se define en las reivindicaciones, se proporcionan células hospedadoras que comprenden ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FGFR2IIIb descrito en este documento, en las que la célula hospedadora carece de un gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) funcional. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula CHO.
También de acuerdo con la invención, como se define en las reivindicaciones, se proporcionan métodos para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. En algunas realizaciones, un método comprende cultivar una célula hospedadora en condiciones adecuadas para expresar ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FGFR2IIIb, en el que la célula hospedadora carece de un gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) funcional. En algunas realizaciones, un método para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado. En algunas realizaciones, el método comprende además recuperar el anticuerpo anti-FGFR2IIIb producido por la célula hospedadora. En algunas realizaciones, menos de un 5 % de los anticuerpos anti-FGFR2IIIb producidos por la célula hospedadora comprenden fucosa. En algunas realizaciones, al menos un 95 % de los anticuerpos anti-FGFR2IIIb producidos por la célula hospedadora carecen de fucosa (es decir, están afucosilados). En algunas realizaciones, la fucosa es indetectable en los anticuerpos anti-FGFR2IIIb producidos por la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la presencia de fucosa se detecta mediante un método que comprende HPLC, electroforesis capilar o espectrometría de masas MALDI-TOF.
Se divulgan composiciones farmacéuticas, pero no se reivindican explícitamente, en las que la composición farmacéutica comprende anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se divulgan métodos de tratamiento del cáncer, pero no se reivindican explícitamente. En algunas realizaciones, un método comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático y cáncer esofágico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la amplificación de FGFR2 comprende una relación de FGFR2:CEN10 (centrómero del cromosoma 10) de >3. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la expresión o sobreexpresión de FGFR2IIIb se determina por IHC. En algunas realizaciones, una tinción 1+, 2+ o 3+ de las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una tinción 2+ o 3+ en las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, la tinción IHC se puntúa como se describe en el ejemplo 6.
En algunas realizaciones, un método de tratamiento del cáncer comprende además administrar al menos un agente terapéutico adicional seleccionado de un agente de platino, paclitaxel, ABRAXANE®, docetaxel, gemcitabina, capecitabina, irinotecán, epirrubicina, FOLFOX, FOLFIRI, leucovorina, fluorouracilo, mitomicina C y clorhidrato de doxorrubicina. En algunas realizaciones, el agente de platino se selecciona de cisplatino, oxaliplatino y carboplatino. En algunas realizaciones, un método de tratamiento del cáncer comprende además administrar paclitaxel. En algunas realizaciones, un método de tratamiento del cáncer comprende además administrar cisplatino y/o 5-FU.
Se divulgan usos de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable, pero no se reivindican explícitamente. En algunas realizaciones, dicho uso es para tratar el cáncer en un individuo con cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático o cáncer esofágico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la amplificación de FGFR2 comprende una relación de FGFR2:CEN10 (centrómero del cromosoma 10) de >3. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la expresión o sobreexpresión de FGFR2IIIb se determina por IHC. En algunas realizaciones, una tinción 1+, 2+ o 3+ de las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una tinción 2+ o 3+ en las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, la tinción IHC se puntúa como se describe en el ejemplo 6.
Se divulgan composiciones farmacéuticas para tratar el cáncer, pero no se reivindican explícitamente, en las que la composición farmacéutica comprende anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático o cáncer esofágico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la amplificación de FGFR2 comprende una relación de FGFR2:CEN10 (centrómero del cromosoma 10) de >3. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, el cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la expresión o sobreexpresión de FGFR2IIIb se determina por IHC. En algunas realizaciones, una tinción 1+, 2+ o 3+ de las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una tinción 2+ o 3+ en las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, la tinción IHC se puntúa como se describe en el ejemplo 6.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A a 1C muestran la actividad ADCC de aFGFR2bA afucosilado y aFGFR2bF fucosilado contra células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb, como se analiza en el ejemplo 3. En las leyendas, "aFGFR2bF/FGFR2b" indica que el anticuerpo aFGFR2bF fucosilado se ensayó contra células diana Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb.
La figura 2A a 2D muestran la eficacia de aFGFR2bA afucosilado y aFGFR2bF fucosilado en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M, a (A y B) 10 mg/kg y (C y D) 3 mg/kg, como se analiza en el ejemplo 4.
La figura 3A y 3B muestran la eficacia dependiente de la dosis de aFGFR2bA afucosilado en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M, como se analiza en el ejemplo 4.
La figura 4A y 4B muestran la eficacia de politerapia con aFGFR2bA afucosilado y paclitaxel en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M, como se analiza en el ejemplo 4.
La figura 5A y 5B muestran la eficacia de politerapia con aFGFR2bA afucosilado y 5-FU/cisplatino en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M, como se analiza en el ejemplo 4.
La figura 6A y 6B muestran la eficacia de aFGFR2bA afucosilado en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MFM-223, como se analiza en el ejemplo 4.
La figura 7 muestra el perfil de glucanos de anticuerpo aFGFR2b producido en (A) células CHOK1SV Potelligent® y (B) células CHOK1 SV, como se describe en el ejemplo 1.
La figura 8 muestra diagramas esquemáticos de glucanos ligados a N típicamente encontrados en anticuerpos.
La figura 9 muestra ADCC de células Ba/F3 FGF2b con concentraciones crecientes de aFGFR2bA o aFGFR2bF. Se realizaron ensayos con PBMC humanos normales a una relación de E:T de 25:1, como se describe en el ejemplo 5. Los datos se representan como la liberación de LDH.
La figura 10 muestra ADCC de células OCUM-2M con concentraciones crecientes de aFGFR2bA o aFGFR2bF. Se realizaron ensayos con PBMC humanos normales a una relación de E:T de 25:1, como se describe en el ejemplo 5. Los datos se representan como porcentaje de lisis específica.
La figura 11A a 11F muestran la detección de FGFR2IIIb en muestras de tejido tumoral usando inmunohistoquímica, como se describe en el ejemplo 6.
Descripción detallada de la invención
Se divulgan anticuerpos afucosilados que se unen a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, también se divulgan cadenas pesadas y cadenas ligeras de anticuerpo afucosilado que pueden formar anticuerpos que se unen a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, se divulgan anticuerpos afucosilados, cadenas pesadas y cadenas ligeras que comprenden una o más regiones hipervariables (HVR) particulares. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen actividad ADCC potenciada con respecto a anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA con respecto a anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(V158) con respecto a anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(F158) con respecto a anticuerpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados no se unen a FGFR2IIIc.
Se divulgan polinucleótidos que codifican anticuerpos que se unen a FGFR2IIIb. También se divulgan polinucleótidos que codifican cadenas pesadas o cadenas ligeras de anticuerpo. Se proporcionan células hospedadoras que expresan anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. Se divulgan métodos de tratamiento usando anticuerpos afucosilados contra FGFR2IIIb. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, métodos de tratamiento del cáncer, tal como cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático y cáncer esofágico.
Los títulos de las secciones usados en este documento son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
Las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en este documento en general están bien comprendidos y se emplean normalmente usando metodología convencional por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologías utilizadas ampliamente descritas en Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTiCa L APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); y versiones actualizadas de los mismos.
I. Definiciones
Salvo que se definan de otro modo, los términos científicos y técnicas usados en relación con la presente invención tendrán los significados que comprenden normalmente los expertos en la materia. Además, salvo que el contexto lo requiera de otro modo o se indique expresamente, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritas en este documento incluyen aspectos y realizaciones "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en". Como se usa en este documento, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales salvo que se indique de otro modo.
En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" salvo que se indique o entienda expresamente por un experto en la material. En el contexto de una reivindicación dependiente múltiple, el uso de "o" se refiere a que hace referencia a más de una reivindicación independiente o dependiente precedente.
Como entienden los expertos en la materia, una referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en este documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, una descripción que se refiera a "aproximadamente X" incluye una descripción de "X".
Las expresiones "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" y "polinucleótido" pueden usarse indistintamente, y se refiere a un polímero de nucleótidos. Dichos polímeros de nucleótidos pueden contener nucleótidos naturales y/o no naturales, e incluyen, aunque sin limitación, ADN, ARN y APN. "Secuencia de ácido nucleico" se refiere a la secuencia lineal de nucleótidos que comprende la molécula de ácido nucleico o polinucleótido.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos aminoacídicos, y no están limitados a una longitud mínima. Dichos polímeros de residuos aminoacídicos pueden contener residuos aminoacídicos naturales o no naturales, e incluyen, aunque sin limitación, péptidos, oligopéptidos, dímeros, trímetros y multímeros de residuos aminoacídicos. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están englobados por la definición. Las expresiones también incluyen modificaciones tras la expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adicionales y sustituciones (en general de naturaleza conservadora), en la secuencia natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como través de mutaciones de hospedadores que producen las proteínas o errores debidos a amplificación por PCR.
"FGFR2IIIb" o "FGFR2b" se usan indistintamente para referirse a la forma de empalme IlIb del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2. Un FGFR2IIIb humano ejemplar se muestra en el n.° de acceso a GenBank NP_075259.4, con fecha de 7 de julio de 2013. Una secuencia de aminoácidos de FGFR2IIIb humano maduro ejemplar no limitante se muestra en SEQ ID NO: 1.
"FGFR2IIIc" o "FGFR2c" se usan indistintamente para referirse a la forma de empalme lllc del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2. Un FGFR2IIIc humano ejemplar se muestra en el n.° de acceso a GenBank NP_000132.3, con fecha de 7 de julio de 2013. Una secuencia de aminoácidos de FGFR2IIIc maduro ejemplar no limitante se muestra en SEQ ID NO: 12.
El término "epítopo" se refiere a un sitio en una molécula diana (por ejemplo, un antígeno, tal como una proteína, ácido nucleico, carbohidrato o lípido) en el que se une una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o regiones de unión de anticuerpo que contienen proteína estructural). Los epítopos a menudo consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, polipéptidos o cadenas laterales glucídicas y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden formarse a partir de residuos contiguos o no contiguos yuxtapuestos (por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, glúcidos, resto lipídico) de la molécula diana. Los epítopos formados a partir de residuos contiguos (por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, glúcidos, resto lipídico) típicamente se conservan al exponerse a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados a partir de plegamiento terciario típicamente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo puede incluir, aunque sin limitación, al menos 3, al menos 5 o 8-10 residuos (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos). En algunos ejemplos, un epítopo es de menos de 20 residuos (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos) de longitud, menos de 15 residuos o menos de 12 residuos. Dos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo dentro de un antígeno si muestra unión competitiva por el antígeno.
Un "epítopo no lineal" o "epítopo conformacional" comprende polipéptidos, aminoácidos y/o glúcidos no contiguos dentro de la proteína antigénica a la que se une un anticuerpo específico contra el epítopo.
Un "epítopo lineal" comprende polipéptidos, aminoácidos y/o glúcidos contiguos dentro de la proteína antigénica a la que se une un anticuerpo específico contra el epítopo.
El término "anticuerpo" en este documento se usa en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que muestran la actividad de unión al antígeno deseada.
El término anticuerpos incluye, aunque sin limitación, fragmentos que pueden unirse al antígeno, tales como Fv, Fv monocatenario (scFv), Fab, Fab' y (Fab')2. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún puede reticular el antígeno. El término anticuerpo también incluye, aunque sin limitación, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos de diversas especies tales como ratón, ser humano, macaco cangrejero, etc.
La expresión "región variable de la cadena pesada" se refiere a una región que comprende HVR1 de la cadena pesada, región flanqueante (FR) 2, HVR2, FR3 y HVR3. En algunas realizaciones, una región variable de la cadena pesada también comprende al menos una parte de una FR1 y/o al menos una parte de una FR4.
La expresión "región constante de la cadena pesada" se refiere a una región que comprende al menos tres dominios constantes de la cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Regiones constantes de la cadena pesada ejemplares no limitantes incluyen y , 5 y a. Regiones constantes de la cadena pesada ejemplares no limitantes también incluyen £ y g. Cada región constante pesada corresponda a un isotipo de anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región constante y es un anticuerpo IgG, un anticuerpo que comprende una región constante S es un anticuerpo IgD, y un anticuerpo que comprende una región constante a es un anticuerpo IgA. Además, un anticuerpo que comprende una región constante g es un anticuerpo IgM, y un anticuerpo que comprende una región constante £ es un anticuerpo IgE. Determinados isotipos pueden subdividirse adicionalmente en subclases. Por ejemplo, los anticuerpos IgG incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos IgG1 (que comprende una región constante Y1), IgG2 (que comprende una región constante Y2), IgG3 (que comprende una región constante Y3) e IgG4 (que comprende una región constante Y4); los anticuerpos IgA incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos IgA1 (que comprende una región constante a 1) e IgA2 (que comprende una región constante a2); y los anticuerpos IgM incluyen, aunque sin limitación, IgM1 e IgM2.
La expresión "cadena pesada" se refiere a un polipéptido que comprende al menos una región variable de la cadena pesada, con o sin una secuencia líder. En algunas realizaciones, una cadena pesada comprende al menos una parte de una región constante de la cadena pesada. La expresión "cadena pesada de longitud completa" se refiere a un polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada y una región constante de la cadena pesada, con o sin una secuencia líder.
La expresión "región variable de la cadena ligera" se refiere a una región que comprende HVR1 de la cadena ligera, región flanqueante (FR) 2, HVR2, FR3 y HVR3. En algunas realizaciones, una región variable de la cadena ligera también comprende una FR1 y/o una FR4.
La expresión "región constante de la cadena ligera" se refiere a una región que comprende un dominio constante de la cadena ligera, Cl. Regiones constantes de la cadena ligera ejemplares no limitantes incluyen A y k .
La expresión "cadena ligera" se refiere a un polipéptido que comprende al menos una región variable de la cadena ligera, con o sin una secuencia líder. En algunas realizaciones, una cadena ligera comprende al menos una parte de una región constante de la cadena ligera. La expresión "cadena ligera de longitud completa" se refiere a un polipéptido que comprende una región variable de la cadena ligera y una región constante de la cadena ligera, con o sin una secuencia líder.
La expresión "región hipervariable" o "HVR" se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpo naturales de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en el Vh (H1, H2, H3), y tres en el Vl (L1, L2, L3). Las HVR en general comprenden residuos aminoacídicos de las regiones hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de máxima variabilidad de secuencia y/o implicadas en el reconocimiento del antígeno. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol.
196: 901 -917 (1987)). Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las expresiones regiones hipervariables (HVR) y regiones determinantes de la complementariedad (CDR), se usan en este documento indistintamente en referencia a partes de la región variable que forman las regiones de unión al antígeno.
Una "región flanqueante humana aceptadora" para los propósitos de este documento es una región flanqueante que comprende la secuencia de aminoácidos de una región flanqueante del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región flanqueante del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región flanqueante de inmunoglobulina humana o una región flanqueante consenso humana, como se define a continuación. Una región flanqueante humana aceptadora derivada de una región flanqueante de inmunoglobulina humana o una región flanqueante consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios aminoacídicos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas realizaciones, la región flanqueante humana aceptadora VL es de secuencia idéntica a la secuencia de la región flanqueante de inmunoglobulina humana Vl o la secuencia de la región flanqueante consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la sima total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). En algunas realizaciones, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y en general puede representarse por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en este documento.
Un anticuerpo de "afinidad madurada" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) y/o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, provocando dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en que una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que comprende al menos una región variable de una primera especie (tal como ratón, rata, macaco cangrejero, etc.) y al menos una región constante de una segunda especie (tal como ser humano, macaco cangrejero, etc.). En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico comprende al menos una región variable de ratón y al menos una región constante humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico comprende al menos una región variable de macaco y al menos una región constante humana. En algunas realizaciones, todas las regiones variables de un anticuerpo quimérico son de una primera especie y todas las regiones constantes del anticuerpo quimérico son de una segunda especie.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en que al menos un aminoácido en una región flanqueante de una región variable no humana se ha remplazado con el correspondiente aminoácido de una región variable humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprende al menos una región constante humana o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado es un Fab, un scFv, un (Fab')2 , etc.
Un "anticuerpo con injerto de HVR" se refiere a un anticuerpo humanizado en que una o más regiones hipervariables (HVR) de una primera especie (no humana) se han injertado en las regiones flanqueantes (FR) de una segunda especie (humana).
Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen unión al receptor de Fc; unión a C1q; CDC; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras en general requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos.
Una "región Fc de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia natural incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia natural (alotipos no A y A); región Fc de IgG2 humana de secuencia natural; región Fc de IgG3 humana de secuencia natural; región Fc de IgG4 humana de secuencia natural, así como variantes de origen natural de las mismas.
Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia natural como consecuencia de al menos una modificación aminoacídica.
"Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcyR es un FcR humano natural. En algunas realizaciones, un FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y, como alternativa, formas empalmadas de esos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyIIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel etal., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas etal., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos por identificar en el futuro, están englobados por el término "FcR" en este documento.
La expresión "receptor de Fc" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Los métodos de medición de la unión a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).
"Funciones efectoras" se refiere a actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: Unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En determinadas realizaciones, las células expresan al menos FcyRIII y realizan una o más funciones efectoras ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, macrófagos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente natural, por ejemplo, de la sangre.
"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida en receptores de Fc (FcR) presente en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos NK, neutrófilos y macrófagos) posibilita que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar la ADCC, los linfocitos NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos n.° 5.500.362 o 5.821.337 o patente de Estados Unidos n.° 6.737.056 (Presta). Células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen PBMC y linfocitos NK. Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656 (1998). Se describen anticuerpos adicionales con secuencias de aminoácidos de la región Fc alterada y actividad ADCC aumentada o disminuida, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7.923.538 y patente de Estados Unidos n.° 7.994.290.
Un anticuerpo que tiene una "actividad ADCC potenciada" se refiere a un anticuerpo que es más eficaz en mediar ADCC in vitro o in vivo en comparación con el anticuerpo precursor, en el que el anticuerpo y el anticuerpo precursor difieren en al menos un aspecto estructural, y cuando las cantidades de dicho anticuerpo y anticuerpo precursor usados en el ensayo son esencialmente iguales. En algunas realizaciones, el anticuerpo y el anticuerpo precursor tienen la misma secuencia de aminoácidos, pero el anticuerpo está afucosilado mientras que el anticuerpo precursor está fucosilado. En algunas realizaciones, la actividad ADCC se determinará usando el ensayo de ADCC in vitro como se divulga en este documento, pero se contemplan otros ensayos o métodos para determinar la actividad ADCC, por ejemplo, en un modelo animal, etc. En algunas realizaciones, un anticuerpo con actividad ADCC potenciada tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA. En algunas realizaciones, un anticuerpo con actividad ADCC potenciada tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (V158). En algunas realizaciones, un anticuerpo con actividad ADCC potenciada tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (F158).
Un anticuerpo con actividad de unión a FcR o actividad ADCC "alterada" es uno que tiene actividad de unión a FcR y/o actividad ADCC potenciada o disminuida en comparación con un anticuerpo precursor, en el que el anticuerpo y el anticuerpo precursor difieren en al menos un aspecto estructural. Un anticuerpo que "presenta unión aumentada" a un FcR se une a al menos un FcR con mejor afinidad que el anticuerpo precursor. Un anticuerpo que "presenta unión disminuida" a un FcR se une a al menos un FcR con menor afinidad que un anticuerpo precursor. Dichos anticuerpos que presentan unión disminuida a un FcR pueden poseer poca o ninguna unión apreciable a un FcR, por ejemplo, unión de un 0-20 % al FcR en comparación con una región Fc de IgG de secuencia natural.
"Afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA" se refiere a un anticuerpo que tiene mayor afinidad por Fc gamma RIIIA (también denominado, en algunos casos, CD16a) que un anticuerpo precursor, en el que el anticuerpo y el anticuerpo precursor difieren en al menos un aspecto estructural. En algunas realizaciones, el anticuerpo y el anticuerpo precursor tienen la misma secuencia de aminoácidos, pero el anticuerpo está afucosilado mientras que el anticuerpo precursor está fucosilado. Puede usarse cualquier método adecuado para determinar la afinidad por Fc gamma RIIIA. En algunas realizaciones, la afinidad por Fc gamma RIIIA se determina mediante un método descrito en este documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo con afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA tiene actividad ADCC potenciada. En algunas realizaciones, un anticuerpo con afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(V158). En algunas realizaciones, un anticuerpo con afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(F158).
Anticuerpo "afucosilado" o un anticuerpo "que carece de fucosa" se refiere a un anticuerpo de isotipo IgG 1 o IgG3 que carece de fucosa en su glucosilación de la región constante. La glucosilación de IgG 1 o IgG3 humana se produce en Asn297 como glucosilación con oligosacárido complejo biantenario fucosilado central terminada con hasta 2 residuos de Gal. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado carece de fucosa en Asn297. Estas estructuras se denominan G0, G1 (a1,6 o a1,3) o residuos de glucano G2, dependiendo de la cantidad de residuos de Gal terminales. Véase, por ejemplo, Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003). La glucosilación de tipo CHO de Fc de anticuerpo se describe, por ejemplo, en Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997). En algunas realizaciones, al menos un 85 % de un lote de anticuerpos expresados de forma recombinante en células hospedadoras CHO no glucomodificadas se fucosilan en Asn297. Cuando se hace referencia a una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos, los anticuerpos se consideran afucosilados si <5 % de los anticuerpos en la composición comprenden fucosa en Asn297. Los métodos para medir la fucosa incluyen cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, la fucosa se detecta por el método descrito en el ejemplo 1. En algunas realizaciones, la fucosa es indetectable en una composición que comprende una pluralidad de anticuerpos afucosilados. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado tiene actividad ADCC potenciada. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(V158). En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(F158).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro etal., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Se describen secuencias de aminoácidos de la región Fc alterada y la capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6.194.551 B1, patente de Estados Unidos n.° 7.923.538, patente de Estados Unidos n.° 7.994.290 y documento WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", como se usa en este documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos o más valores numéricos, de modo que un experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos o más valores de poca o ninguna significación biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dicho valor. En algunas realizaciones, los dos o más valores sustancialmente similares difieren en no más de aproximadamente uno cualquiera de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 50 %.
La expresión "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en este documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos, de modo que un experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores de significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores. En algunas realizaciones, los dos valores numéricos sustancialmente diferentes difieren en más de aproximadamente uno cualquiera de un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %.
Las expresiones "secuencia líder" y "secuencia señal" se usan indistintamente para referirse a una secuencia de residuos aminoacídicos localizados en el extremo N de un polipéptido que facilita la secreción de un polipéptido desde una célula de mamífero. Una secuencia líder puede escindirse tras exportarse el polipéptido desde la célula de mamífero, formando una proteína madura. Las secuencias líder pueden ser naturales o sintéticas, y pueden ser heterólogas u homólogas a la proteína a la que se fijan.
Un polipéptido de "secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido encontrado en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen natural de cualquier mamífero. Dicho polipéptido de secuencia natural puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por un medio recombinante o sintético. La expresión polipéptido de "secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de empalme alternativo) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido.
Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden o eliminan uno o más residuos aminoacídicos en el extremo N o C del polipéptido. En algunas realizaciones, una variante tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante tendrá al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, una variante tendrá al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural.
Como se usa en este documento, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y "homología" con respecto a una secuencia de péptido, polipéptido o anticuerpo se definen como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia de péptido o polipéptido específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que pertenecen a las habilidades de la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o MEGALIGNTM (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se estén comparando.
Una sustitución aminoacídica puede incluir, aunque sin limitación, el remplazo de un aminoácido en un polipéptido con otro aminoácido. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares", y como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de cadenas aminoacídicas. Pueden introducirse sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribarse los productos por una actividad deseada, por ejemplo, unión conservada/mejorada al antígeno, inmunogenia disminuida o ADCC o CDC mejorada.
Tabla 1
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Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
El término "vector" se usa para describir un polinucleótido que puede manipularse para que contenga un polinucleótido o polinucleótidos clonados que puedan propagarse en una célula hospedadora. Un vector puede incluir uno o más de los siguientes elementos: un origen de replicación, una o más secuencias reguladoras (tales como, por ejemplo, promotores y/o potenciadores) que regulan la expresión del polipéptido de interés, y/o uno o más genes marcadores de selección (tales como, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y genes que pueden usarse en ensayos colorimétricos, por ejemplo, p-galactosidasa). La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que se usa para expresar un polipéptido de interés en una célula hospedadora.
Una "célula hospedadora" se refiere a una célula que puede ser o ha sido destinataria de un vector o polinucleótido aislado. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas o células eucariotas. Células eucariotas ejemplares incluyen células de mamífero, tales como células animales de primate o no de primate; células fúngicas, tales como levaduras; células vegetales; y células de insecto. Células de mamífero ejemplares no limitantes incluyen, aunque sin limitación, células NSO, células PER.C6® (Crucell), y células 293 y CHO, y sus derivados, tales como células 293-6E y DG44, respectivamente.
El término "aislada" se refiere a una molécula que se ha separado de al menos algunos de los componentes con que se encuentra típicamente en la naturaleza o se produce. Por ejemplo, un polipéptido se denomina "aislado" cuando se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en que se produjo. Cuando se secreta un polipéptido mediante un célula después de la expresión, la separación física del sobrenadante que contiene el polipéptido de la célula que lo produce se considera que es "aislar" el polipéptido. Asimismo, un polinucleótido se denomina "aislado" cuando no es parte del polinucleótido más grande (tal como, por ejemplo, ADN genómico o ADN mitocondrial, en el caso de un polinucleótido de ADN) en que se encuentra típicamente en la naturaleza, o se separa de al menos algunos de los componentes de la célula en que se produjo, por ejemplo, en el caso de un polinucleótido de ARN. Por tanto, un polinucleótido de ADN que está contenido en un vector dentro de una célula hospedadora puede denominarse "aislado".
Los términos "individuo" o "sujeto" se usan indistintamente en este documento para hacer referencia a un animal; por ejemplo un mamífero. Métodos de tratamiento de mamíferos incluyen, aunque sin limitación, seres humanos, roedores, simios, felinos, caninos, equinos, bovines, porcinos, ovinos, caprinos, animales mamíferos de laboratorio, animales mamíferos de granja, animales mamíferos deportivos y mascotas mamíferas. En algunos ejemplos, un "individuo" o "sujeto" se refiere a un individuo o sujeto que necesita tratamiento para una enfermedad o trastorno.
Una "enfermedad" o "trastorno" se refiere a una afección donde se necesita tratamiento.
El término "cáncer" se refiere a un trastorno proliferativo maligno asociado con proliferación celular incontrolada, crecimiento celular no restringido y muerte celular disminuida mediante apoptosis. Cánceres ejemplares no limitantes incluyen cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático y cáncer esofágico. En algunas realizaciones, un cáncer comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la amplificación de FGFR2 comprende una relación de FGFR2:CEN10 (centrómero del cromosoma 10) de >3. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende una amplificación del gen de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, un cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende una amplificación del gen de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2MIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la sobreexpresión es sobreexpresión de ARNm. En algunas realizaciones, la sobreexpresión es sobreexpresión de proteína.
El término "tumor" se usa en este documento para hacer referencia a un grupo de células que muestran niveles anómalamente altos de proliferación y crecimiento. Un tumor puede ser benigno, premaligno o maligno; las células tumorales malignas son cancerosas. Las células tumorales pueden ser células de tumor sólido o células tumorales leucémicas. La expresión "crecimiento tumoral" se usa en este documento para hacer referencia a la proliferación o crecimiento mediante una célula o células que comprenden un tumor que da lugar a un aumento correspondiente en el tamaño del tumor.
Como se usa en este documento, "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. "Tratamiento", como se usa en este documento, cubre cualquier administración o aplicación de un agente terapéutico para una enfermedad en un mamífero, incluyendo un ser humano. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, aunque sin limitación, uno cualquiera o más de: alivio de uno o más síntomas, disminución del grado de la enfermedad, prevención o retardo de la propagación (por ejemplo, metástasis, por ejemplo, metástasis al pulmón o al ganglio linfático) de la enfermedad, prevención o retardo de recidiva de la enfermedad, retardo o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora del estado patológico, inhibición de la enfermedad o progresión de la enfermedad, inhibición o ralentización de la enfermedad o su progresión, detención de su desarrollo, y remisión (ya sea parcial o total). También se engloba mediante "tratamiento" una reducción de la consecuencia patológica de una enfermedad proliferativa. Los anticuerpos producidos por las células hospedadoras y los métodos de la invención pueden usarse en uno cualquiera o más de estos aspectos de tratamiento.
En el contexto de cáncer, el término "tratar" incluye alguno o todos de: inhibición del crecimiento de células tumorales o células cancerosas, inhibición de la replicación de células tumorales o células cancerosas, atenuación de la carga tumoral global y mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad.
Los términos "inhibición" o "inhibir" se refieren a una disminución o cese de cualquier característica fenotípica o a la disminución o cese en la incidencia, grado o probabilidad de esa característica. "Reducir" o "inhibir" es disminuir, reducir o detener una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En determinadas realizaciones, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad de provocar una disminución global de un 20 % o mayor. En otra realización, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad de provocar una disminución global de un 50 % o mayor. En otra realización más, por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad de provocar una disminución global de un 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor.
Una "referencia", como se usa en este documento, se refiere a cualquier muestra, patrón o nivel que se usa con propósitos de comparación. Una referencia puede obtenerse de una muestra sana y/o sin enfermedad. En algunos ejemplos, puede obtenerse una referencia de una muestra sin tratar. En algunos ejemplos, se obtiene una referencia de una muestra sin enfermedad sin tratar de un sujeto individual. En algunos ejemplos, una referencia se obtiene de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente.
Como se usa en este documento, "retardar el desarrollo de una enfermedad" significa aplazar, impedir, ralentizar, retrasar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como cáncer). Este retardo puede ser de cantidades variables de tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o del individuo que se esté tratando. Como es evidente para un experto en la materia, un retardo suficiente o significativo puede abarcar, en efecto, prevención, porque el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, puede retardarse un cáncer en estadio tardío, tal como desarrollo de metástasis.
"Prevenir", como se usa en este documento, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o reaparición de una enfermedad en un sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero aún no se ha diagnosticado con la enfermedad.
Como se usa en este documento, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad en comparación con condiciones por lo demás iguales excepto por una condición o parámetro de interés o, como alternativa, en comparación con otra condición. Por ejemplo, un anticuerpo que suprime el crecimiento tumoral reduce la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia del anticuerpo.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, edad, sexo y pero del individuo, y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula, agonista o antagonista se compensa mediante los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una cantidad terapéuticamente eficaz pueden suministrarse en una o más administraciones.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes de o en un estadio anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Las expresiones "formulación farmacéutica" y "composición farmacéutica" se refieren a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica del uno o más ingredientes activos sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Dichas formulaciones pueden ser estériles.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un relleno, diluyente, material encapsulante, auxiliar de formulación o vehículo sólido, semisólido o líquido, atóxico, convencional en la técnica para su uso con un agente terapéutico que conjuntamente comprenden una "composición farmacéutica" para administración a un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es atóxico para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El vehículo farmacéuticamente aceptable es apropiado para la formulación empleada.
Una formulación "estéril" es aséptica o está esencialmente libre de microorganismos vivos y sus esporas.
Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva o secuencial en cualquier orden.
El término "simultáneamente" se usa en este documento para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración solapa en el tiempo o donde la administración de un agente terapéutico está dentro de un corto periodo de tiempo con respecto a la administración del otro agente terapéutico. Por ejemplo, los dos o más agentes terapéuticos se administran con una separación de tiempo de no más de aproximadamente 60 minutos, tal como no más de aproximadamente cualquiera de 30, 15, 10, 5 o 1 minuto.
El término "secuencialmente" se usa en este documento para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos donde la administración de uno o más agentes continúa después de interrumpir la administración de uno o más agentes distintos. Por ejemplo, la administración de los dos o más agentes terapéuticos se administra con una separación de tiempo de más de aproximadamente 15 minutos, tal como aproximadamente cualquiera de 20, 30, 40, 50 o 60 minutos, 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas o 1 mes, o más tiempo.
Como se usa en este documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Por tanto, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.
El término "prospecto" se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas normalmente en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contiene información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
Un "artículo de fabricación" es cualquier producto fabricado (por ejemplo, un envase o recipiente) o kit que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer), o una sonda para detectar específicamente un biomarcador descrito en este documento. En determinadas realizaciones, el producto fabricado o kit se promociona, distribuye o vende como una unidad para realizar los métodos descritos en este documento.
II. Anticuerpos anti-FGFR2IIIb
La invención proporciona células hospedadoras y métodos para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. Debe entenderse que esta sección se refiere a los anticuerpos que están codificados por el ácido nucleico que las células hospedadoras de la invención comprenden, y/o a los anticuerpos producidos por los métodos de la invención. La invención proporciona un anticuerpo afucosilado dirigido contra FGFR2IIIb. Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de ratón y anticuerpos que comprenden las HVR de la cadena pesada y/o cadena ligera (por ejemplo, CDR) analizadas en este documento. En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos afucosilados aislados que se unen a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado modula la actividad de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado tiene actividad ADCC potenciada. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(V158). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(F158).
Se pretende que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb denominado "aFGFR2b" descrito en este documento en los ejemplos y la lista de secuencias tenga la misma secuencia de aminoácidos que el anticuerpo HuGAL-FR21 de la patente de Estados Unidos n.° 8.101.723 B2, presentado el 24 de enero de 2012. Las figuras 13 y 14 de la patente de Estados Unidos n.° 8.101.723 B2 muestran las secuencias de aminoácidos de las regiones variables y cadenas de anticuerpo maduras de longitud completa de HuGAL-FR21. Además, las secuencias HVR del anticuerpo HuGAL-FR21 están subrayadas en la figura 13 de la patente de Estados Unidos n.° 8.101.723 B2.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR (por ejemplo, CDR) seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende al menos una cadena pesada que comprende una región variable de la cadena pesada y al menos una parte de una región constante de la cadena pesada, y al menos una cadena ligera que comprende una región variable de la cadena ligera y al menos una parte de una región constante de la cadena ligera. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende dos cadenas pesadas, en el que cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada y al menos una parte de una región constante de la cadena pesada, y dos cadenas ligeras, en el que cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera y al menos una parte de una región constante de la cadena ligera. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que comprende seis HVR que comprenden (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende las seis HVR como se describe anteriormente y se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende las seis HVR como se describe anteriormente, se une a FGFR2IIIb y tiene al menos una actividad seleccionada de actividad ADCC potenciada y afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (tal como Fc gamma RIIIA(V158) y/o Fc gamma RIIIA(F158)). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFRIIIb afucosilado no se une a FGFR2IIIc.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que compite con un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende seis HVR que comprenden (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 7; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo afucosilado que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo afucosilado que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de Vl seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, un anticuerpo afucosilado de la invención comprende (a) un dominio Vh que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de Vh seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8; y (b) un dominio Vl que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada (Vh) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, una secuencia de Vh que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o eliminaciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vh de SEQ ID NO: 5, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el Vh comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (Vl) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En determinadas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 5. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vl de SEQ ID NO: 4, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada (Vh) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de la cadena ligera (Vl) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En determinadas realizaciones, una secuencia de Vh que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, y una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 5. En determinadas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o eliminaciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vh de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de Vl de SEQ ID NO: 5, incluyendo modificaciones postraduccionales de una o ambas secuencias. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y el Vl comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado, en el que el anticuerpo comprende un Vh como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un Vl como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de Vh y Vl de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o eliminaciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, la cadena pesada del anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vh de SEQ ID NO: 2, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la cadena pesada comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, la cadena ligera del anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vl de SEQ ID NO: 3, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la cadena ligera comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-FGFR2IIIb que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a FGFR2IIIb. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo anti-FGFR2IIIb conserva la capacidad de unirse selectivamente a FGFR2IIIb sin unirse a FGFR2IIIc. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, se ha sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o eliminaciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, la cadena pesada del anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vh de SEQ ID NO: 2, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia y la cadena ligera del anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado comprende la secuencia de Vl de SEQ ID NO: 3, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, la cadena pesada comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y la cadena ligera comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
Anticuerpos quiméricos ejemplares
En determinadas realizaciones, un anticuerpo, tal como un anticuerpo afucosilado, proporcionado en este documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en que la clase o subclase se ha cambiado con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Anticuerpos quiméricos afucosilados ejemplares no limitantes incluyen anticuerpos quiméricos que comprenden las secuencias de HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena pesada, y/o HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena ligera descritas en este documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico afucosilado comprende las regiones variables descritas anteriormente y se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico afucosilado comprende las regiones variables descritas anteriormente, se une a FGFR2IIIb y tiene al menos una actividad seleccionada de actividad ADCC potenciada y afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (tal como Fc gamma RIIIA(V158) y/o Fc gamma RIIIA(F158)). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFRIIIb quimérico afucosilado no se une a FGFR2IIIc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico afucosilado comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 4, en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico afucosilado comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5, en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico afucosilado comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 4; y una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5; en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb.
Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb quiméricos afucosilados ejemplares también incluyen anticuerpos quiméricos que compiten por la unión a FGFR2IIIb con un anticuerpo o fragmento del mismo descrito en este documento. Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico que compite por la unión a FGFR2IIIb con un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el anticuerpo compite por la unión a FGFR2IIIb, pero no se une a FGFR2IIIc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico descrito en este documento comprende una o más regiones constantes humanas. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada humana es de un isotipo seleccionado de IgA, IgG e IgD. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena ligera humana es de un isotipo seleccionado de k y A. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico descrito en este documento comprende una región constante de IgG humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico descrito en este documento comprende una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico descrito en este documento comprende una región constante de IgG4 humana y una cadena ligera k humana.
Como se indica anteriormente, que una función efectora sea deseable o no puede depender del método particular de tratamiento pretendido para un anticuerpo. Por tanto, en algunas realizaciones, cuando una función efectora es deseable, se selecciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico que comprende una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana o una región constante de la cadena pesada de IgG3 humana. En algunas realizaciones, cuando una función efectora no es deseable, se selecciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb quimérico que comprende una región constante de la cadena pesada de IgG4 o IgG2 humana.
Anticuerpos humanizados ejemplares
En algunas realizaciones, se proporcionan anticuerpos humanizados afucosilados que se unen a FGFR2IIIb. Los anticuerpos humanizados son útiles como moléculas terapéuticas porque los anticuerpos humanizados reducen o eliminan la respuesta inmunitaria humana contra anticuerpos no humanos (tal como la respuesta de anticuerpo humano antirratón (HAMA)), que puede provocar una respuesta inmunitaria contra un anticuerpo terapéutico, y eficacia disminuida del producto terapéutico.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenia contra seres humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en que las HVR, por ejemplo, CDR (o partes de las mismas) se obtienen de un anticuerpo no humano, y las FR (o partes de las mismas) se obtienen de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se obtienen los residuos HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y métodos para generarlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; patentes de Estados Unidos n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36: 25-34 (que describe injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498 (que describe "rechapado"); Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36: 43-60 (que describe "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., (2005) Methods 36: 61-68 y Klimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83: 252-260 (que describe la estrategia de "selección guiada" para reordenamiento de FR).
Las regiones flanqueantes humanas que pueden usarse para humanización incluyen, aunque sin limitación: regiones flanqueantes seleccionadas usando el método "de mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol.
151: 2296); regiones flanqueantes derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; y Presta et al. (1993) J. Immunol, 151: 2623); regiones flanqueantes maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones flanqueantes de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633); y regiones flanqueantes derivadas de cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 y Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 22611-22618).
Anticuerpos humanizados ejemplares no limitantes incluyen aFGFR2b, descritos en este documento. Anticuerpos humanizados afucosilados ejemplares no limitantes incluyen aFGFR2bA, descrito en este documento, que tiene las mismas secuencias de aminoácidos que aFGFR2b que comprende fucosa (también denominado aFGFR2bF). Anticuerpos humanizados afucosilados ejemplares no limitantes también incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena pesada de aFGFR2b y/o una región variable de la cadena ligera de aFGFR2b. Anticuerpos humanizados afucosilados ejemplares no limitantes incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y/o una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5. Anticuerpos humanizados ejemplares también incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos humanizados que comprenden HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena pesada, y/o HVR1 , HVR2 y HVR3 de la cadena ligera de aFGFR2b. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado comprende las HVR descritas anteriormente (es decir, (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11) y se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado comprende las HVR descritas anteriormente, se une a FGFR2IIIb y tiene al menos una actividad seleccionada de actividad ADCC potenciada y afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (tal como Fc gamma RIIIA(V158) y/o Fc gamma RIIIA(F158)). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFRIIIb humanizado afucosilado no se une a FGFR2IIIc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena pesada y/o HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena ligera de aFGFR2b. Anticuerpos anti-FGFR2IIIb humanizados afucosilados ejemplares no limitantes incluyen anticuerpos que comprenden conjuntos de HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena pesada expuestos en SEQ ID NO: 6, 7 y 8. Anticuerpos anti-FGFR2IIIb humanizados afucosilados ejemplares no limitantes también incluyen anticuerpos que comprenden conjuntos de HVR1, HVR2 y HVR3 de la cadena ligera expuestos en SEQ ID NO: 9, 10 y 11.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 4, y en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5, en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 4; y una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable que es al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5; en el que el anticuerpo se une a FGFR2IIIb.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende al menos una de las HVR analizadas en este documento. Es decir, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende al menos una HVR seleccionada de una HVR1 de la cadena pesada analizada en este documento, una HVR2 de la cadena pesada analizada en este documento, una HVR3 de la cadena pesada analizada en este documento, una HVR1 de la cadena ligera analizada en este documento, una HVR2 de la cadena ligera analizada en este documento y una HVR3 de la cadena ligera analizada en este documento. Además, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende al menos una HVR mutada basada en una HVR analizada en este documento, en el que la HVR mutada comprende 1,2, 3 o 4 sustituciones aminoacídicas con respecto a la HVR analizada en este documento. En algunas realizaciones, una o más de las sustituciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas conservadoras. Un experto en la materia puede seleccionada una o más sustituciones aminoacídicas conservadoras adecuadas para una secuencia de HVR particular, en la que las sustituciones aminoacídicas conservadoras adecuadas no está previsto que alteren significativamente las propiedades de unión del anticuerpo que comprende la HVR mutada.
Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb humanizados afucosilados ejemplares también incluyen anticuerpos humanizados que compiten por la unión a FGFR2IIIb con un anticuerpo o fragmento del mismo descrito en este documento. Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado que compite por la unión a FGFR2IIIb con aFGFR2b. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado que compite por la unión a FGFR2IIIb con aFGFR2b y tiene al menos una actividad seleccionada de actividad ADCc potenciada y afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (tal como Fc gamma RIIIA(V158) y/o Fc gamma RIIIA(F158)). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFRIIIb humanizado afucosilado no se une a FGFR2IIIc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado comprende una o más regiones constantes humanas. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada humana es de un isotipo seleccionado de IgA, IgG e IgD. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena ligera humana es de un isotipo seleccionado de k y A.
En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG humana. En algunas realizaciones, cuando una función efectora es deseable, se selecciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb humanizado afucosilado que comprende una región constante de la cadena pesada de IgG 1 humana o una región constante de la cadena pesada de IgG3 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG1 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG1 humana, en el que N297 no está fucosilada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humano afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG1 humana y una cadena ligera k humana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado afucosilado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado afucosilado comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y cualquier modificación postraduccional, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y cualquier modificación postraduccional.
Regiones constantes de anticuerpo ejemplares
En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado descrito en este documento comprende una o más regiones constantes humanas. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada humana es de un isotipo seleccionado de IgA, IgG e IgD. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena ligera humana es de un isotipo seleccionado de k y A.
En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG humana. En algunas realizaciones, cuando una función efectora es deseable, se selecciona un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que comprende una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana o una región constante de la cadena pesada de IgG3 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG 1 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG 1 humana, en el que N297 no está fucosilada. En algunas realizaciones, un anticuerpo afucosilado descrito en este documento comprende una región constante de IgG1 humana y una cadena ligera k humana.
En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, salvo que se indique explícitamente o sea conocido por un experto en la materia, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU IgG 1 humano.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región Fc variante que tiene al menos una sustitución aminoacídica en comparación con la región Fc de una IgG de tipo silvestre o un anticuerpo de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la región Fc variante tiene dos o más sustituciones aminoacídicas en la región Fc del anticuerpo de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la región Fc variante tiene tres o más sustituciones aminoacídicas en la región Fc del anticuerpo de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la región Fc variante tiene al menos una, dos o tres o más sustituciones aminoacídicas en la región Fc descritas en este documento. En determinadas realizaciones, la región Fc variante de este documento tendrá al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un anticuerpo precursor. En determinadas realizaciones, la región Fc variante de este documento tendrá al menos aproximadamente un 90 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un anticuerpo precursor. En determinadas realizaciones, la región Fc variante de este documento tendrá al menos aproximadamente un 95 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un anticuerpo precursor.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en este documento se altera para aumentar o disminuir el grado al que el anticuerpo está glucosilado. La adición o eliminación de sitios de glucosilación de un anticuerpo puede conseguirse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o elimine uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato fijado al mismo puede alterarse. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que en general se fija mediante un enlace en N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunas realizaciones, pueden hacerse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.
En una realización, se proporcionan anticuerpos que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa fijada (directamente o indirectamente) a una región Fc (es decir, anticuerpos afucosilados). Por ejemplo, la cantidad de fucosa en una composición que comprende una pluralidad de dichos anticuerpos puede ser de un 0 % a aproximadamente un 5 %. En algunas realizaciones, una composición que comprende una pluralidad de dichos anticuerpos comprende al menos un 95 % de anticuerpos afucosilados. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido de manosa). Métodos ejemplares no limitantes de detección de fucosa en un anticuerpo incluyen espectrometría de masas MALDI-TOF (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/077546), medición por HPLC de oligosacáridos marcados de manera fluorescente liberados (véase, por ejemplo, Schneider et al., "N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection," Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996)), medición por electroforesis capilar de oligosacáridos marcados de manera fluorescente liberados (véase, por ejemplo, Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185­ 5192 (1999)), y HPLC con detección amperométrica por impulsos para medir la composición de monosacáridos (véase, por ejemplo, Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)). Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar localizada aproximadamente ± 3 aminoácidos anterior o posterior de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de secuencia en los anticuerpos. En el anticuerpo aFGFR2b descrito en este documento, Asn297 se encuentra en la secuencia QYNST, y está en negrita y subrayada en la tabla de secuencias mostrada a continuación, SEQ ID NO: 2. Las variantes de fucosilación pueden tener función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones referidas a anticuerpos "afucosilados" o "deficientes de fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos afucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2003/0157108 A 1 , Presta, L; y documento w O 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11), y líneas celulares de supresión, tales como líneas celulares que carecen de un gen de alfa-1,6fucosiltransferasa funcional, FUT8, por ejemplo, células CHO de supresión (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); y documento WO 2003/085107).
Además se proporcionan anticuerpos con oligosacáridos divididos, por ejemplo, en que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo está dividido por GlcNAc. Dichos anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Ejemplos de dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de Estados Unidos n.° 6.602.684 (Umana et al.); y documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichos anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
También se proporcionan anticuerpos con extensiones de líder aminoterminales. Por ejemplo, uno o más residuos aminoacídicos de la secuencia líder aminoterminal están presentes en el extremo amínico de una cualquiera o más de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo. Una extensión de líder aminoterminal ejemplar comprende o consiste en tres residuos aminoacídicos, VHS, presentes en una o ambas cadenas ligeras de un anticuerpo.
La semivida in vivo o en suero de polipéptidos que se unen con alta afinidad a FcRn humano puede ensayarse, por ejemplo, en ratones transgénicos, en seres humanos o en primates no humanos a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. Véase también, por ejemplo, Petkova et al. International Immunology 18(12): 1759-1769 (2006).
En algunas realizaciones de la invención, un anticuerpo afucosilado media ADCC en presencia de células efectoras humanas de manera más eficaz que un anticuerpo precursor que comprende fucosa. En general, la actividad ADCC puede determinarse usando el ensayo de ADCC in vitro como se divulga en este documento, pero se contemplan otros ensayos o métodos para determinar la actividad ADCC, por ejemplo, en un modelo animal etc.
En determinadas realizaciones, la "Kd", "Kd", "Kd" o "valor de Kd" del anticuerpo se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de inyección a un caudal de 5 pl/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de polipéptido, por ejemplo, anticuerpo de longitud completa, en PBS con tensioactivo TWEEN-20™ (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las tasas de asociación (kon) y disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir simple uno-a-uno (BIACORE® Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación de koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M-1s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la tasa de asociación puede determinarse usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con flujo detenido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ 8000-series (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "tasa de asociación" o "kon" del anticuerpo puede determinarse también como se describe anteriormente usando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.).
En determinadas realizaciones, la diferencia entre dichos dos valores (por ejemplo, valores de Kd) es sustancialmente igual, por ejemplo, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 % y/o menos de aproximadamente un 10 % como una función de valor de referencia/comparador.
En determinadas realizaciones, la diferencia entre dichos dos valores (por ejemplo, valores de Kd) es sustancialmente diferente, por ejemplo, mayor de aproximadamente un 10 %, mayor de aproximadamente un 20 %, mayor de aproximadamente un 30 %, mayor de aproximadamente un 40 % y/o mayor de aproximadamente un 50 % como una función del valor para la molécula de referencia/comparadora.
Secuencias líder ejemplares
Para que algunas proteínas secretadas se expresen y secreten en grandes cantidades, puede ser deseable una secuencia líder de una proteína heteróloga. En algunas realizaciones, emplear secuencias líder heterólogas puede ser ventajoso porque una polipéptido maduro resultante puede permanecer inalterado según se retira la secuencia líder en el RE durante el proceso de secreción. Puede requerirse la adición de una secuencia líder heteróloga para expresar y secretar algunas proteínas.
Se describen determinadas secuencias líder ejemplares, por ejemplo, en la Base de datos de Secuencias Líder en línea mantenida por el Departamento de Bioquímica, Universidad Nacional de Singapur. Véase, Choo et al., BMC Bioinformatics, 6: 249 (2005); y publicación PCT n.° WO 2006/081430.
III. Propiedades de anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen actividad ADCC potenciada in vitro y/o in vivo. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen actividad ADCC potenciada in vitro. En algunas realizaciones, la actividad ADCC in vitro se determina mediante un método descrito en este documento, por ejemplo, en el ejemplo 3. En resumen, células que expresan FGFR2IIIb se ponen en contacto con PBMC humanos recién aislados a una relación de 25:1 de células efectoras (PBMC) a diana, en presencia de anticuerpo fucosilado o anticuerpo afucosilado. En algunas realizaciones, se usan células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb como células diana. En algunas realizaciones, la citotoxicidad se determina cuantificando la liberación de LDH usando el CytoTox NonRadioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI). En algunas realizaciones, la lisis máxima se determina usando Triton X-100 al 5 % y la liberación espontánea se determina en ausencia de anticuerpo. En algunas realizaciones, el porcentaje de lisis específica puede determinarse usando la fórmula: (liberación experimental - espontánea) / (liberación máxima - espontánea) x 100 = % de lisis específica. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que tiene actividad ADCC potenciada provoca lisis específica que es al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 70 o al menos 75 puntos porcentuales mayor que la lisis específica con la misma cantidad de un anticuerpo fucosilado, a al menos una concentración de anticuerpo ensayado. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado que tiene actividad ADCC potenciada provoca lisis específica que es al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 70 o al menos 75 puntos porcentuales mayor que la lisis específica con un anticuerpo fucosilado, donde cada anticuerpo está a una concentración entre 0,01 y 1 pg/ml y las células diana son células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, los anticuerpos se ensayan a una concentración de 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml o 1 pg/ml.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(V158). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados tienen afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA(F158). En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo por Fc gamma RIIIA se determina usando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, como se describe en este documento en el ejemplo 2, y/o como sigue, que se describe con referencia a Fc gamma RIIIA(V158), pero que también es adecuado para determinar la afinidad por Fc gamma RIIIA(F158). En resumen, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado o afucosilado se captura en un chip de dextrano recubierto de proteína A. Se inyecta Fc gamma RIIIA (V158) (disponible en, por ejemplo, R&D Systems) a diversas concentraciones. La constante de asociación, la constante de disociación y la afinidad de Fc gamma RIIIA (V158) por anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado y afucosilado pueden determinarse, por ejemplo, usando el programa informático proporcionado con el sistema de resonancia de plasmones superficiales (por ejemplo, modelo de unión 1:1 de Biacore T200 Evaluation Software). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado con afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA (tal como Fc gamma RIIIA(V158) o Fc gamma RIIIA(F158)) se une a Fc gamma RIIIA con al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 20 veces mayor afinidad que un anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado. Por ejemplo, si un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se une a Fc gamma RIIIA (V158) con una afinidad (Kd) de 9,2 nM y un anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado se une a Fc gamma RIIIA (V158) con una afinidad (Kd) de 207 nM, entonces el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se une a Fc gamma RIIIA (V158) con 207/9,2 = 22,5 veces mayor afinidad que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado.
IV. Expresión y producción de anticuerpo anti-FGFR2IIIb
Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-FGFR2IIIb
La invención proporciona células hospedadoras y métodos para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. En esta sección, referencias a moléculas de ácido nucleico de la invención o proporcionadas por la invención deben entenderse como referencias a ácido nucleico que las células hospedadoras de la invención comprenden. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden polinucleótidos que codifican una o más cadenas de anticuerpos anti-FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico comprende tanto un polinucleótido que codifica una cadena pesada como un polinucleótido que codifica una cadena ligera, de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una primera molécula de ácido nucleico comprende un primer polinucleótido que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico comprende un segundo polinucleótido que codifica una cadena ligera.
En algunas de dichas realizaciones, la cadena pesada y la cadena ligera se expresan a partir de una molécula de ácido nucleico, o a partir de dos moléculas de ácido nucleico separadas, como dos polipéptidos separados. En algunas realizaciones, tal como cuando un anticuerpo es un scFv, un solo polinucleótido codifica un solo polipéptido que comprende tanto una cadena pesada como una cadena ligera ligadas juntas.
En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica una cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder que, cuando se traduce, se localiza en el extremo N de la cadena pesada o cadena ligera. Como se analiza anteriormente, la secuencia líder puede ser la secuencia líder de la cadena pesada o ligera natural, o puede ser otra secuencia líder heteróloga.
Pueden construirse moléculas de ácido nucleico usando técnicas de ADN recombinante convencionales en la técnica. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico es un vector de expresión que es adecuado para su expresión en una célula hospedadora seleccionada.
Vectores
La invención proporciona células hospedadoras y métodos para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. En esta sección, referencias a vectores de la invención o proporcionados por la invención deben entenderse como referencias a vectores que las células hospedadoras de la invención pueden comprender. Se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos que codifican cadenas pesadas anti-FGFR2IIIb y/o cadenas ligeras anti-FGFR2IIIb. También se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos que codifican cadenas pesadas anti-FGFR2IIIb y/o cadenas ligeras anti-FGFR2IIIb. Dichos vectores incluyen, aunque sin limitación, vectores de ADN, vectores fágicos, vectores víricos, vectores retrovíricos, etc. En algunas realizaciones, un vector comprende una primera secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada y una segunda secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera. En algunas realizaciones, la cadena pesada y la cadena ligera se expresan a partir del vector como dos polipéptidos separados. En algunas realizaciones, la cadena pesada y la cadena ligera se expresan como parte de un solo polipéptido, tal como, por ejemplo, cuando el anticuerpo es un scFv.
En algunas realizaciones, un primer vector comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y un segundo vector comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera. En algunas realizaciones, el primer vector y el segundo vector se transfieren a células hospedadoras en cantidades similares (tales como cantidades molares similares o cantidades másicas similares). En algunas realizaciones, se transfecta una relación molar o másica entre 5:1 y 1:5 del primer vector y el segundo vector a las células hospedadoras. En algunas realizaciones, se usa una relación másica entre 1:1 y 1:5 para el vector que codifica la cadena pesada y el vector que codifica la cadena ligera. En algunas realizaciones, se usa una relación másica de 1:2 para el vector que codifica la cadena pesada y el vector que codifica la cadena ligera.
En algunas realizaciones, se selecciona un vector que está optimizado para la expresión de polipéptidos en células CHO o derivadas de CHO, o en células NSO. Vectores ejemplares de este tipo se describen, por ejemplo, en Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20: 880-889 (2004).
Células hospedadoras
En diversas realizaciones, pueden expresarse cadenas pesadas anti-FGFR2IIIb y/o cadenas ligeras anti-FGFR2IIIb en células procariotas, tales como células bacterianas; o en células eucariotas, tales como células fúngicas (tales como levaduras), células vegetales, células de insecto y células de mamífero. Dicha expresión puede realizarse, por ejemplo, de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Células eucariotas ejemplares que pueden usarse para expresar polipéptidos incluyen, aunque sin limitación, células COS, incluyendo células COS 7; células 293, incluyendo células 293-6E; células CHO, incluyendo células CHO-S, DG44. Lec13 CHO y células FUT8 CHO; células PER.C6® (Crucell); y células NSO. En algunas realizaciones, las cadenas pesadas anti-FGFR2IIIb y/o cadenas ligeras anti-FGFR2IIIb pueden expresarse en levaduras. Véase, por ejemplo, la publicación de Estados Unidos n.° US 2006/0270045 A1. En algunas realizaciones, se selecciona una célula hospedadora eucariota particular basándose en su capacidad de generar modificaciones postraduccionales deseadas a las cadenas pesadas anti-FGFR2IIIb y/o cadenas ligeras anti-FGFR2IIIb. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células CHO producen polipéptidos que tienen un mayor nivel de sialilación que el mismo polipéptido producido en células 293.
La introducción de uno o más ácidos nucleicos en una célula hospedadora deseada puede conseguirse mediante cualquier método incluyendo, aunque sin limitación, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, etc. Métodos ejemplares no limitantes se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Los ácidos nucleicos pueden transfectarse de forma transitoria o estable en las células hospedadoras deseadas, de acuerdo con cualquier método adecuado.
En algunas realizaciones, se producen anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados en células que pueden producir anticuerpos afucosilados, tales como células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch.
Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11), y líneas celulares de supresión, tales como líneas celulares que carecen de un gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa funcional, FUT8, por ejemplo, células CHO de supresión (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); y documento WO 2003/085107). En algunas realizaciones, se producen anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados en células CHO que carece de un gen de FUT8 funcional. En algunas realizaciones, se producen anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados en células CHOK1SV Potelligent® (BioWa/Lonza, Allendale, NJ).
Purificación de anticuerpos anti-FGFR2IIIb
Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb pueden purificarse mediante cualquier método adecuado. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, el uso de matrices de afinidad o cromatografía de interacción hidrófoba. Los ligandos de afinidad adecuados incluyen el ECD de FGFR2IIIb y ligandos que se unen a las regiones constantes del anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse una columna de proteína A, proteína G, proteína A/G o una de afinidad por anticuerpo para unir la región constante y purificar un anticuerpo anti-FGFR2IIIb. También puede ser adecuada la cromatografía de interacción hidrófoba, por ejemplo, una columna de butilo o fenilo, para purificar algunos polipéptidos. Muchos métodos de purificación de polipéptidos son conocidos en la técnica.
Producción sin células de anticuerpos anti-FGFR2IIIb
En algunas realizaciones, se produce un anticuerpo anti-FGFR2IIIb en un sistema sin células. Se describen sistemas sin células ejemplares no limitantes, por ejemplo, en Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
V. Composiciones terapéuticas y métodos
Métodos de tratamiento de enfermedades usando anticuerpos anti-FGFR2IIIb
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Los anticuerpos producidos por las células hospedadoras o métodos de la invención, y composiciones que comprenden dichos anticuerpos, pueden usarse en métodos de tratamiento para seres humanos o animales. También se divulgan métodos de tratamiento de enfermedad que comprenden administrar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados. Enfermedades ejemplares no limitantes que pueden tratarse con anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados incluyen, aunque sin limitación, cáncer. En algunas realizaciones, se divulgan métodos de tratamiento de cáncer, que comprenden administrar un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático o cáncer esofágico. En algunas realizaciones, se divulgan métodos de tratamiento de cáncer gástrico, que comprenden administrar un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado.
En algunas realizaciones, un cáncer comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende una amplificación del gen de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, un cáncer sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico comprende una amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende una amplificación del gen de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende amplificación de FGFR2 sobreexpresa FGFR2IIIb a un grado mayor que FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico que comprende amplificación de FGFR2 expresa FGFR2IIIb a un nivel normalizado que es más de 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayor que el nivel normalizado de expresión de FGFR2IIIc. En algunas realizaciones, los niveles de expresión se normalizan a GUSB. En algunas realizaciones, un cáncer gástrico sobreexpresa FGFR2IIIb, pero no comprende amplificación del gen de FGFR2. En algunas realizaciones, la sobreexpresión es sobreexpresión de ARNm. En algunas realizaciones, la sobreexpresión es sobreexpresión de proteína.
La amplificación del gen de FGFR2IIIb puede determinarse mediante cualquier método adecuado en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, hibridación in situ (ISH). En algunas realizaciones, la amplificación de FGFR2 comprende una relación de FGFR2:CEN10 (centrómero del cromosoma 10) de >3.
La sobreexpresión del ARNm de FGFR2IIIb puede determinarse mediante cualquier método adecuado en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, métodos que comprenden PCR cuantitativa (qPCR). La expresión "sobreexpresión de ARNm de FGFR2IIIb" significa niveles elevados de ARNm de FGFR2IIIb, independientemente de la causa de dichos niveles elevados (es decir, que los niveles elevados sean un resultado de transcripción aumentada y/o degradación disminuida de ARNm, otro mecanismo o una combinación de mecanismos).
La sobreexpresión de la proteína FGFR2IIIb puede determinarse mediante cualquier método adecuado en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, métodos basados en anticuerpos tales como inmunohistoquímica (IHC). En algunas realizaciones, la tinción de IHC se puntúa de acuerdo con métodos en la técnica. La expresión "sobreexpresión de la proteína FGFR2IIIb" significa niveles elevados de proteína FGFR2IIIb, independientemente de la causa de dichos niveles elevados (es decir, que los niveles elevados sean un resultado de traducción aumentada y/o degradación disminuida de proteína, otro mecanismo o una combinación de mecanismos). En algunas realizaciones, una tinción 1+, 2+ o 3+ de las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, una tinción 2+ o 3+ de las células tumorales por IHC indica sobreexpresión de FGFR2IIIb. En algunas realizaciones, la tinción IHC se puntúa como se describe en el ejemplo 6.
Composiciones farmacéuticas
En diversas realizaciones, se divulgan composiciones que comprenden anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados en formulaciones con una amplia diversidad de vehículos farmacéuticamente aceptables (véase, por ejemplo, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20.a ed. (2003); Ansel etal., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.a ed., Lippencott Williams y Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3.a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Están disponibles diversos vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, adyuvantes y diluyentes. Además, también están disponibles diversas sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares. Vehículos ejemplares no limitantes incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
En diversas realizaciones, pueden formularse composiciones que comprenden anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados para inyección, incluyendo administración subcutánea, disolviendo, suspendiendo o emulsionándolos en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites, glicéricos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes. En diversas realizaciones, las composiciones pueden formularse para inhalación, por ejemplo, usando propulsores aceptables presurizados tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las composiciones también pueden formularse, en diversas realizaciones, en microcápsulas de liberación mantenida, tal como con polímeros biodegradables o no biodegradables. Una formulación biodegradable ejemplar no limitante incluye polímero de poli(ácido láctico-glicólico). Una formulación no biodegradable ejemplar no limitante incluye un éster de ácido graso de poliglicerina. Determinados métodos de generación de dichas formulaciones se describen, por ejemplo, en el documento EP 1125584 A1.
Vías de administración
Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse in vivo mediante diversas vías incluyendo, aunque sin limitación, oral, intraarterial, parenteral, intranasal, intramuscular, intracardiaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, rectal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o de otro modo por implante o inhalación. Las presente composiciones pueden formularse en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa; incluyendo, aunque sin limitación, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhalantes y aerosoles. La formulación y vía de administración apropiadas pueden seleccionarse de acuerdo con la aplicación pretendida.
Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento o profilaxis del cáncer, tal como cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático o cáncer esofágico. La cantidad terapéuticamente eficaz típicamente depende del peso del sujeto que se esté tratando, su estado físico o de salud, la extensión de la afección a tratar o la edad del sujeto que se esté tratando. En general, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis.
Las composiciones de anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado pueden administrarse según lo necesario a los sujetos. La determinación de la frecuencia de administración pueden hacerla los expertos en la materia, tal como un médico a cargo basándose en consideraciones de la afección que se esté tratando, la edad del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, el estado general de salud del sujeto que se esté tratando y similares. En algunas realizaciones, una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra a un sujeto una o más veces. En diversas realizaciones, una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes, tal como, por ejemplo, cada dos meses o cada tres meses. En otras realizaciones, una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra menos de una vez al mes, tal como, por ejemplo, cada dos semanas o cada semana. Una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra al sujeto al menos una vez. En algunas realizaciones, la dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado puede administrarse múltiples veces, incluyendo durante periodos de al menos un mes, al menos seis meses o al menos un año.
Politerapia
Los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados pueden administrarse en solitario o con otros modos de tratamiento. Pueden proporcionarse antes, de forma sustancialmente simultánea con o después de otros modos de tratamiento, por ejemplo, cirugía, quimioterapia o radioterapia. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra junto con otro agente antineoplásico. Agentes antineoplásicos ejemplares no limitantes que pueden administrarse con un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado incluyen agentes de platino (tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino), paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas manipuladas con albúmina de paclitaxel (a BrAXa Ne®), docetaxel (TAXOTERE®), gemcitabina (GEMz Ar®), capecitabina (XELODA®), irinotecán (CAMPTOSAR®), epirrubicina (ELLENCE®, PHARMORUBICIN®), FOLFOX (oxaliplatino combinado con 5-FU y leucovorina), FOLFIRI (combinación de leucovorina, 5-FU e irinotecán), leucovorina, fluorouracilo (5-FU, EFUDEX®), mitomicina C (MITOZYTREX™, MUTAMYCIN®) y clorhidrato de doxorrubicina (adriamicina PFS, adriamicina Rd F, RUBEX®). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra junto con paclitaxel. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra junto con cisplatino y/o 5-FU. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra junto con cisplatino y 5-FU. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se administra junto con FOLFOX (oxaliplatino, 5-FU y leucovorina).
Kits/artículos de fabricación
También se divulgan kits, medicinas, composiciones y formas de dosificación unitaria para su uso en cualquiera de los métodos descritos en este documento.
Los kits incluyen uno o más recipientes que comprenden un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado (o formas de dosificación unitaria y/o artículos de fabricación). En algunas realizaciones, se proporciona una dosificación unitaria en la que la dosificación unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende un anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado, con o sin uno o más agentes adicionales. En algunas realizaciones, dicha dosificación unitaria se suministra en una jeringa prellenada de un solo uso para inyección. En diversas realizaciones, la composición contenida en la dosificación unitaria puede comprender solución salina, sacarosa o similares; un tampón, tal como fosfato, o similares; y/o formularse dentro de un intervalo de pH estable y eficaz. Como alternativa, en algunas realizaciones, la composición puede proporcionarse como un polvo liofilizado que puede reconstituirse tras la adición de un líquido apropiado, por ejemplo, agua estéril. En algunas realizaciones, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación de proteínas incluyendo, aunque sin limitación, sacarosa y arginina. En algunas realizaciones, una composición comprende heparina y/o un proteoglucano.
En algunas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones para su uso en el tratamiento de, por ejemplo, cáncer (tal como cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer pancreático o cáncer esofágico) de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en este documento. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo adecuado o tratamiento. Las instrucciones aportadas en los kits típicamente son instrucciones por escrito en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables instrucciones legibles a ordenador (por ejemplo, instrucciones portadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico). En algunas realizaciones, el kit comprende además otro agente terapéutico.
Los kits están en envasado adecuado. El envasado adecuado incluye, aunque sin limitación, viales, frascos, tarros, envasado flexible (por ejemplo, bolsas Mylar o de plástico selladas), y similares. Los kits opcionalmente pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. La presente solicitud, por tanto, también proporciona artículos de fabricación, que incluyen viales (tales como viales sellados), frascos, tarros, envasado flexible y similares.
Ejemplos
Los ejemplos analizados a continuación están destinados a ser simplemente ejemplares de la invención y no debe considerarse que limiten la invención de ninguna manera. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. No se pretende que los ejemplos representen que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos por garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados Celsius y la presión no está en o cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1: Producción de anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado.
Construcción de vector de expresión. Se clonaron secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) del anticuerpo monoclonal aFGFR2b en el sistema de expresión génica GS (Lonza, Basilea, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sistema genera un vector génico doble (DGV) que contiene los casetes de expresión tanto para la cadena ligera como para la cadena pesada.
Elección de la línea de células hospedadoras. Para generar anticuerpo monoclonal afucosilado aFGFR2bA (la denominación "A" después de aFGFR2b se refiere a "afucosilado"), se eligieron las células CHOK1SV Potelligent® (BioWa/Lonza, Allendale, NJ) como línea de células hospedadoras. Las células CHOK1SV Potelligent® carecen del gen FUT8 (a1,6-fucosiltransferasa) y, por lo tanto, producen anticuerpos sin fucosa (anticuerpos afucosilados).
Construcción de línea celular estable para la producción de anticuerpo aFGR2bA afucosilado: El vector de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo aFGFR2b descrito anteriormente se transfectó en células CHOK1SV Potelligent® por electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células electroporadas se sembraron en una placa de 96 pocillos a aproximadamente 10000 células/50 pl/pocillo en medio CD CHO sin L-glutamina. Se añadió medio CD CHO selectivo que contenía L-metionina sulfoximina (MSX, SIGMA n.° cat. M5379, St. Louis, MO) 67 pM el siguiente día a 150 pl/pocillo. Se controló el crecimiento celular y la formación de clones con un IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Después de 4-6 semanas, se cribaron las colonias supervivientes por la expresión de anticuerpo aFGFR2bA usando un ensayo basado en fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) frente a curvas patrón generadas con anticuerpo aFGFR2b purificado, usando proteína A conjugada con XL665 e IgG de conejo policlonal conjugado con criptato (Cisbio, Bedford, MA). Los clones de máxima expresión se expandieron a través de una serie de procesos de producción de escala creciente, incluyendo placas de 24 pocillos, tubos de centrifugación, matraces de agitación, biorreactores a escala de sobremesa, y finalmente un proceso de producción en plataforma. En cada etapa, solamente un subconjunto que comprende los clones de máxima expresión se llevaron al siguiente proceso. El clon de producción final se seleccionó basándose en la evaluación de los valores cuantitativos de producto proteínico, las características de crecimiento celular, calidad del producto, estabilidad, así como capacidad de cambio de escala en biorreactores. La línea de producción final tenía un nivel de expresión de aproximadamente 3,5 g/l para aFGFR2bA. La ausencia de fucosilación en aFGFR2bA producido en la línea celular de producción final se confirmó usando cromatografía de HPLC en fase normal (N-HPLC).
El anticuerpo aFGFR2bA se purificó por cromatografía en columna y ultrafiltración para concentrar el material purificado, después diafiltración para intercambio a tampón de formulación (histidina 20 mM, L-arginina 150 mM, polisorbato 20 al 0,01 %, pH 6,0). El anticuerpo se almacenó por debajo de -70 °C.
El análisis de glucanos de aFGFR2bA se realiza liberando los glucanos de la proteína, marcando los glucanos con ácido antranílico (2-AA), y después purificando los glucanos marcados. Se usa HPLC en fase normal con detección fluorescente para separar los glucanos y medir la cantidad relativa de cada glucano en el anticuerpo. La figura 7 muestra que aFGFR2b derivado de la línea celular CHOK1SV Potelligent® y aFGFR2b producido a partir de CHOK1SV tenían dos distribuciones de glucanos diferentes. (A) La distribución de glucanos de aFGFR2b derivado de la línea celular CHOK1SV Potelligent® muestra que el anticuerpo carece de fucosa ("G0"). (B) La distribución de glucanos de aFGFR2b derivado de la línea celular CHOK1 SV muestra que el anticuerpo contiene fucosa ("G0F").
Los picos de glucano de la separación por HPLC en fase normal se identificaron usando dos métodos ortogonales. En primer lugar, el aFGFR2b producido por CHOK1SV Potelligent® se marcó y separó usando el método de HPLC en fase normal. Después de la detección fluorescente, los glucanos se pasaron a través de un espectrómetro de masas QT rap. La masa de cada pico se determinó y se usó para identificar positivamente cada glucano, y se muestra en la tabla 2.
Tabla 2: Picos de masa de glucano
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La masa de cada forma fucosilada de los glucanos (G0F, GIF y G2F) también se buscó en el aFGFR2b producido por CHOK1SV Potelligent® y no se observó. La figura 8 muestra diagramas esquemáticos de las estructuras de glucano G0, G1, G2, G0F, GIF, G2F y manosa-5 (o Man-5) típicamente observadas en anticuerpos.
Las identidades de los picos a partir del ensayo de HPLC también se confirmaron usando patrones de glucanos adquiridos de Prozyme y emparejando el tiempo de retención entre los patrones y los perfiles de aFGFR2 tanto de la línea celular CHOK1SV Potelligent® como de la línea celular CHOK1SV. Estos patrones pudieron identificar G0, G0F, Man5, G1, G1F y G2F.
Los resultados del ensayo de HPLC, así como los datos de caracterización confirmaron la ausencia de fucosilación en aFGFR2 derivado de la línea celular CHOK1 SV Potelligent®.
Ejemplo 2: Afinidad de unión de anticuerpo anti-FGFR2b afucosilado.
Las afinidades de unión de aFGFR2bA y aFGFR2bF (la denominación "F" después de aFGFR2b se refiere a "fucosilado") por Fc gamma RIIIA(V158) se determinaron por resonancia de plasmones superficiales. En resumen, se fijó covalentemente proteína A a un chip de dextrano usando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) y etilendiamina 100 mM (Sigma) en tampón de borato de sodio 100 mM, pH 8,0 (Sigma, St. Louis, MO) como reactivo de bloqueo. Se capturaron aproximadamente 600-800 UR de aFGFR2bA y aFGFR2bF en cubetas de lectura separadas y una cubeta de lectura derivatizada con proteína A (Pierce) sirvió como control de referencia. Se diluyó Fc gamma RIIIA (V158) (R&D Systems, Mineápolis, MN) en tampón de migración HBS-P+ (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se inyectó a 5 concentraciones (0 nM, 12,3 nM, 37 nM, 111 nM, 333 nM y 1000 nM) por duplicado. La constante de asociación, la constante de disociación y la afinidad por aFGFR2bA se calcularon usando el modelo de unión 1:1 de Biacore T200 Evaluation Software. La constante de afinidad para la unión de aFGFR2bF se determinó usando el modelo de afinidad en equilibrio de Biacore T200 Evaluation Software. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: Afinidad de anticuerpos aFGFR2bA y aFGFR2bF por Fc gamma RMIA(V158)
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Como se muestra en la tabla 3, Fc gamma RIIIA(V158) se unió a aFGFR2bA con más de 20 veces mayor afinidad de lo que se unión a aFGFR2bF.
Ejemplo 3: Actividad ADCC de anticuerpo anti-FGFR2b afucosilado.
Se realizaron ensayos in vitro para determinar la actividad ADCC de anticuerpo aFGFR2bA frente a anticuerpo aFGFR2bF. Se produjeron células diana que expresan Ba/F3 FGFR2IIIb como sigue. Células Ba/F3 adquiridas de Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, n.° cat. ACC300, Braunschweig, Alemania) se mantuvieron en RPMI (Mediatech, n.° cat. 10-041-CV, Manassas, VA), complementado con suero bovino fetal al 10 % (Mediatech, n.° cat. 35-010-CV), 1 ng/ml de IL-3 murina (Peprotech, n.° cat. 213-13, Rocky Hill, NJ), BME 1X (Invitrogen, n.° cat. 1047574, Grand Island, NY) y penicilina-estreptomicina 1X (Mediatech n.° cat. 30-002-Cl). Las células Ba/F3 se transfectaron con un vector de expresión que expresa FGFR2IIIb, pBNewhFGFR2b, usando Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza, n.° cat. VCA-1003) siguiendo el protocolo del fabricante. El vector pBNew contiene un promotor de CAG con un intrón de p-actina de pollo y genes de selección de crecimiento en ampicilina y puromicina. Las células transfectadas se incubaron en medio de crecimiento completo durante 3 días, después se trataron con 2 pg/ml de puromicina (InVivoGen, n.° cat. ant-pr-1, San Diego, CA). La selección con puromicina se mantuvo durante todo el cultivo. Para generar clones estables individuales, se sembraron células a una densidad de 1 célula por 3 pocillos. Se usó clasificación celular activada fluorescente (FACS) con un anticuerpo anti-FGFR2IIIb para seleccionar los clones con el máximo nivel de expresión de FGFR2IIIb.
Se obtuvieron células MFM-223 de la Health Protection Agency, Reino Unido; se obtuvieron células OCUM-2M de la Osaka City University, Osaka, Japón; y se obtuvieron células KATO III de la ATCC, Rockville, MD. Todas las células se cultivaron usando métodos convencionales. Se obtuvieron PBMC recién aislados de donadores sanos de AllCells, Emeryville, CA.
Los ensayos de ADCC se realizaron usando células efectoras de 3 donadores independientes en 3 días diferentes. El ensayo de ADCC se realizó usando PBMC humanos recién aislados como células efectoras a una relación de célula efectora a diana (E/T) de 25:1. Las células diana se incubaron durante 16 horas en presencia de efectores y concentraciones crecientes de anticuerpo. El ensayo de ADCC se validó usando 2 anticuerpos de control positivo, HERCEPTIN® en células diana SKOV-3 y RITUXIN® en células diana Raji. Se usó un anticuerpo de control negativo IgG1 completamente humano (Eureka Therapeutics, Catálogo ET901, Emeryville, CA) para citotoxicidad celular no específica. La citotoxicidad se determinó cuantificando la liberación de LDH según las instrucciones del fabricante (CytoTox Non Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, Madison, WI).
Se determinó la lisis máxima en presencia de Triton X-100 al 5 %, y se determinó la liberación espontánea en ausencia de anticuerpo. Se calculó el porcentaje de lisis específica como sigue, como un porcentaje de lisis máxima menos liberación espontánea:
(experimental - spontaneous release) / (maximal - spontaneous release) x 100 = % specific lysis
Los resultados para las células Ba/F3 se muestran en la figura 1. El anticuerpo aFGFR2bA afucosilado indujo mayor lisis específica que el anticuerpo aFGFR2bF fucosilado en células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb. En células OCUM-2M, m Fm 223 y KATO III, aFGFR2bA mostró mayor actividad ADCC a concentraciones menores que aFGFR2bF, aunque la lisis específica máxima de los anticuerpos fue comparable en células OCUM-2M y MFM 223 (datos no mostrados). Además, aFGFR2b mostró de poca a ninguna actividad ADCC en células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIc. Véase la figura 1 A.
Ejemplo 4: Actividad de anticuerpo anti-FGFR2b afucosilado en modelos de xenoinjerto de cáncer gástrico y cáncer de mama.
Se adquirieron ratones CB17 SCID hembra de seis semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se aclimataron durante 1 semana antes del inicio del estudio. Se usó la línea celular de carcinoma gástrico humano OCUM-2M o la línea celular de carcinoma de mama MFM-223 como modelos de tumor. OCUM-2M se adquirió de la Public University Corporation Osaka City University (OCU, Osaka, Japón), y MFM-223 se adquirió de Culture Collections, Public Health England (98050130, HPA Culture Collections, Salisbury, Reino Unido). Las células se cultivaron durante hasta tres pases en medio de cultivo completo para expandirlas para implante. Las células OCUM-2M y MFM-223 se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) y medio esencial mínimo (MEM), respectivamente. Todo el medio se complementó con suero bovino fetal (FBS) inactivado con calor al 10 %, L-glutamina 2 mM y solución de penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %.
Cuando las células cultivadas alcanzaron un 85-90 % de confluencia, las células se recolectaron y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+ fría, que contenía Matrigel al 50 % (BD BioSciences, San José, CA). Las células OCUM-2M se implantaron de forma subcutánea sobre el flanco derecho de los ratones a 5 x 105 células/100 pl/ratón. Las células MFM-223 se implantaron de forma subcutánea sobre el flanco derecho de los ratones a 5 x 105 células/100 pl/ratón, y se inocularon gránulos de 0,72 mg de 17-p estradiol de liberación en 90 días (Innovative Research of America, Sarasota, FL) de forma subcutánea en el flanco derecho. Los ratones se controlaron dos veces a la semana después del implante de las células para el crecimiento del tumor. El tamaño del tumor se midió de acuerdo con la fórmula: Tamaño del tumor (mm3) = (anchura (mm) x longitud (mm)2)/2. Cuando los tumores MFM-223 alcanzaron 80 mm3, los ratones se clasificaron y asignaron aleatoriamente (n = 10), y se inició el tratamiento. Para tumores OCUM-2M, se inició monoterapia con anti-FGFR2b una vez que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3, y se inició politerapia una vez que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 250 mm3.
El anticuerpo humanizado anti-FGFR2IIIb (afucosilado, aFGFR2bA; fucosilado, aFGFR2bF) o albúmina como control negativo se administró a dosis que varían de 1 a 10 mg/kg mediante inyección intraperitoneal dos veces a la semana como se especifica en las leyendas de la figura. Se administraron agente quimioterápicos mediante inyección intraperitoneal dos veces a la semana a 12 mg/kg para paclitaxel, 2,3 mg/kg para fluorouracilo (5-FU) y 33 mg/kg para cisplatino. Tras el inicio del tratamiento, se midieron los tamaños de los tumores en cada ratón dos veces a la semana. La longitud y la anchura de cada tumor se midió usando calibres y el tamaño del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula anterior. Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes de los tumores subcutáneos excedieron 2000 mm3 o cuando los tumores se volvieron excesivamente necróticos.
Las comparaciones del volumen del tumor como consecuencia se determinaron estadísticamente significativas si P < 0,05. Los valores de P se calcularon usando análisis de ensayo de la t bilateral para datos independientes de los volúmenes del tumor calculados en el día final tras el que se midieron los tumores.
La figura 2 muestra la eficacia de aFGFR2bA y aFGFR2bF a (A y B) 10 mg/kg y (C y D) 3 mg/kg en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano OCUM-2M con amplificación de FGFR2. (A) A 10 mg/kg, tanto el anticuerpo fucosilado como el afucosilado indujeron regresión tumoral inmediata. Sin embargo, aFGFR2bA afucosilado indujo una respuesta más duradera que aFGFR2bF fucosilado. (B) El aFGFR2bA afucosilado redujo significativamente el tamaño del tumor OCUM-2M final en comparación con aFGFR2bF fucosilado (p = 0,0153). Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes. (C) Cuando se dosificó a 3 mg/kg, el aFGFR2bA afucosilado redujo el crecimiento tumoral en comparación con aFGFR2bF fucosilado. De hecho, el aFGFR2bA afucosilado indujo mayor regresión tumoral y respuesta duradera en comparación con aFGFR2bF fucosilado (nota: un animal se retiró del grupo de aFGFR2bF en aproximadamente el día 42, provocando un desplazamiento en la curva). (D) El aFGFR2bA afucosilado a 3 mg/kg en comparación con aFGFR2bF fucosilado redujo de forma notable el tamaño del tumor OCUM-2M final (p = 0,0767). Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes.
Las figura 3 muestra la inhibición del tumor dependiente de la dosis por aFGFR2bA. (A) Ratones SCID que portan xenoinjertos OCUM-2M subcutáneos se trataron con 1, 1,5, 2, 3 o 5 mg/kg de aFGFR2bA afucosilado cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó aproximadamente 100 mm3. Aunque todas las dosis de aFGFR2bA afucosilado inhibieron el crecimiento del tumor, la máxima supresión y respuesta duradera se observaron con 3 y 5 mg/kg, con supresión del crecimiento reducida observada con 2, 1,5 y 1 mg/kg de aFGFR2bA. (B) El aFGFR2bA afucosilado redujo el tamaño del tumor OCUM-2M final, mostrando mayores dosis una supresión del crecimiento más potente. La supresión del crecimiento tumoral fue estadísticamente significativa para todas las dosis (5 mg/kg, p <0,0001; 3 mg/kg, p <0,0001; 2 mg/kg, p <0,0001; 1,5 mg/kg, p = 0,0003; 1 mg/kg, p = 0,0013). Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes.
La figura 4 muestra la potenciación de la actividad antitumoral de paclitaxel en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M mediante la administración con aFGFR2bA afucosilado. (A) Ratones SCID que portan xenoinjertos OCUM-2M subcutáneos se trataron con aFGFR2bA afucosilado (5 mg/kg), paclitaxel (12 mg/kg) o una combinación de los dos cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó aproximadamente 285 mm3. La combinación de aFGFR2bA afucosilado con paclitaxel redujo el tamaño del tumor en comparación con aFGFR2bA o paclitaxel en solitario. (B) La politerapia con aFGFR2bA/paclitaxel redujo significativamente el tamaño del tumor OCUM-2M final en comparación con paclitaxel (p = 0,0005) o aFGFR2bA (p = 0,0009) en solitario. Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes.
La figura 5 muestra la potenciación de la actividad antitumoral de cisplatino/5-FU en un modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico OCUM-2M mediante la administración con aFGFR2bA afucosilado. (A) Ratones SCID que portan xenoinjertos OCUM-2M subcutáneos se trataron con aFGFR2bA afucosilado (5 mg/kg), fluorouracilo (5-FU) más cisplatino (2,3 y 33 mg/kg, respectivamente) o una combinación de los tres cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó aproximadamente 260 mm3. La combinación de aFGFR2bA afucosilado con 5-FU/cisplatino redujo el tamaño del tumor en comparación con aFGFR2bA o 5-FU/cisplatino en solitario. (B) La politerapia con aFGFR2bA/5-FU/cisplatino redujo significativamente el tamaño del tumor OCUM-2M final en comparación con 5-FU/cisplatino (p = 0,0003). La reducción aumentada en el tamaño del tumor mediante politerapia con aFGFR2bA/5-FU/cisplatino en comparación con aFGFR2bA en solitario fue notable, pero no estadísticamente significativa. Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes.
La figura 6 muestra la eficacia de aFGFR2bA en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano MFM-223. (A) MFM-223, una línea celular de carcinoma de mama humano con amplificación de FGFR2, se implantó de forma subcutánea en ratones SCID, y se inició tratamiento con aFGFR2bA afucosilado cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó aproximadamente 80 mm3. El aFGFR2bA afucosilado (5 mg/kg) redujo drásticamente el crecimiento de tumores MFM-223 en comparación con control de albúmina (5 mg/kg). (B) El aFGFR2bA afucosilado redujo significativamente el tamaño del tumor MFM-223 final en comparación con control de albúmina (p = 0,0008). Se determinó la significación estadística mediante ensayo de la t bilateral para datos independientes.
Ejemplo 5: El anticuerpo anti-FGFR2b afucosilado media mayor ADCC que el anticuerpo anti-FGFR2b fucosilado.
Se realizaron ensayos in vitro para determinar la actividad ADCC de anticuerpo aFGFR2bA frente a anticuerpo aFGFR2bF. Se generaron células diana Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb como se describe anteriormente. Se obtuvieron células OCUM-2M de Osaka City University, Osaka, Japón. Todas las células se cultivaron usando métodos convencionales. Se obtuvieron PBMC recién aislados de donadores sanos de AllCells, Emeryville, CA.
Los ensayos de ADCC se realizaron usando PBMC humanos recién aislados como células efectoras a una relación de célula efectora a diana (E:T) de 25:1. Las células diana se incubaron durante 16 horas en presencia de efectores y concentraciones crecientes de anticuerpo. Todas las condiciones se ensayaron por triplicado. Se determinó la citotoxicidad cuantificando la liberación de LDH según las recomendaciones del fabricante (CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay de Promega). Para las células OCUM-2M, se determinó la lisis máxima en presencia de Triton X-100 al 5 %, y se determinó la liberación espontánea en ausencia de anticuerpo. Se calculó el porcentaje de lisis específica como un porcentaje de lisis máxima menos liberación espontánea, como sigue: (liberación experimental -espontánea) / (liberación máxima - espontánea) x 100 = % de lisis específica. Se usó análisis de ajuste a curva del programa informático GraphPad para obtener valores de CE50.
Los resultados para las células Ba/F3 se muestran en la figura 9. El anticuerpo aFGFR2bA afucosilado mostró mayor potencia (mayor actividad ADCC a concentraciones menores) que el anticuerpo aFGFR2bF fucosilado en células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb. Se muestran resultados similares para células OCUM-2M en la figura 10. La tabla 4 muestra el aumento factorial de la potencia del anticuerpo anti-FGFRb afucosilado en comparación con anticuerpo anti-FGFR2b fucosilado en las dos diferentes líneas celulares mostradas en las figuras 9 y 10.
Tabla 4: Aumento factorial de la potencia de anticuerpo anti-FGFR2b afucosilado frente a fucosilado
Figure imgf000032_0001
Ejemplo 6: Detección inmunohistoquímica de la proteína FGFR2IIIb en tejido tumoral.
Se usó el anticuerpo aFGFR2b murino que comprende las regiones variables murinas de GAL-FR21 (véase la patente de Estados Unidos n.° 8.101.723 B2) y una región constante de IgG2a murina para detectar la proteína FGFR2IIIb en tejido de tumor gástrico incrustado en parafina fijado con formol (FFPE). El tejido tumoral FFPE se desparafinizó con lavados sucesivos de xilenos y concentraciones decrecientes de etanol, y se rehidrató con agua durante cinco minutos. Las secciones de tejido montadas en portaobjetos se sumergieron en tampón citrato 0,1 mM (pH 6,0) calentado hasta 95 °C-99 °C durante 15 minutos. Las secciones de tejido se enfriaron y se pusieron en contacto con H2O2 al 3 % durante 5 minutos a temperatura ambiente, y después se lavaron dos veces en TBST (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05 %) y se bloquearon en tampón de bloqueo (suero de caballo normal al 2,5 % en TBST) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de tejido entonces se incubaron con 5 pg/ml de anticuerpo aFGFR2b en tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tiempos de incubación entre 30 minutos y 2 horas produjeron intensidades de tinción similares. Después de tres lavados con tampón TBST, se incubaron las secciones de tejido con anticuerpo de caballo antirratón listo para su uso (RTU - ready-to-use) secundario biotinilado (diluido a 10 pg/ml en tampón de bloqueo (Vector Laboratories, Burlingame, CA; n.° cat. PK-7200) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se lavaron dos veces con tampón TBST, y se incubaron con estreptavidina-peroxidasa de rábano rusticano RTU (HRP; Vector Laboratories, n.° cat. PK-7200) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección se realizó usando sustrato 3',3'-diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories, n.° cat. PK-4105) durante diez minutos a temperatura ambiente según las instrucciones del fabricante. Las secciones de tejido entonces se contratiñeron con hematoxilina (Dako North America, Carpinteria, CA, n.° cat. K-8008) según las instrucciones del fabricante. Las secciones de tejido se deshidrataron usando lavados sucesivos con concentraciones crecientes de etanol y xilenos, y después se cubrieron con un cubreobjetos.
Se encontraron concentraciones de tinción de 0,1 a 5 mg/ml de anticuerpo aFGFR2b particularmente eficaces para la detección de proteína.
La tinción se puntuó como sigue:
0 Sin tinción con anticuerpo aFGFR2b observada
1+ Se observa tinción débil en muestras teñidas con el anticuerpo aFGFR2b. La tinción está ausente en las secciones correspondientes teñidas con el anticuerpo de control negativo.
2+ La tinción de membrana-citoplasmática específica para anticuerpo aFGFR2b es más prevalente en las secciones.
3+ Tinción específica fuerte con anticuerpo aFGFR2b con localización de membrana distinta en al menos un subconjunto de células tumorales teñidas.
La figura 11 muestra tinción 0 (A), 1+ (B, C), 2+ (D) y 3+ (E, F) ejemplar de tejidos tumorales. En la figura 11A, las células ductales y células tumorales intercaladas muestran ausencia de tinción usando el anticuerpo aFGFR2b. En la figura 11B, que muestra una muestra de tumor gástrico de tipo intersticial, las células tumorales (flechas) muestran algo de tinción usando el anticuerpo aFGFR2b, mientras que las células ductales circundantes no muestran tinción. En la figura 11C, que muestra una muestra de tumor gástrico de tipo difuso, las células tumorales (flechas) muestran algo de tinción usando el anticuerpo aFGFR2b, mientras que las células estromales circundantes (puntas de flecha) no muestran tinción. En la figura 11D, las células tumorales (flechas) muestran tinción intermedia usando el anticuerpo aFGFR2b, mientras que las células estromales circundantes (puntas de flecha) no muestran tinción. En la figura 11E, las células tumorales (flechas) muestran alta tinción localizada en membrana usando el anticuerpo aFGFR2b, mientras que las células estromales circundantes (puntas de flecha) no muestran tinción. En la figura 11F, las células tumorales (flechas) muestran alta tinción de membrana/citoplasmática usando el anticuerpo aFGFR2b, mientras que las células estromales circundantes (puntas de flecha) no muestran tinción.
Tabla de secuencias
Figure imgf000033_0001

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una célula hospedadora que comprende ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FGFR2IIIb, en la que la célula hospedadora carece de un gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) funcional, y en la que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb comprende regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, en la que la región variable de la cadena pesada comprende:
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y
(iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
y la región variable de la cadena ligera comprende:
(iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;
(v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y
(vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, que es una célula CHO.
3. Un método para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados, comprendiendo dicho método cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 1 o reivindicación 2 en condiciones adecuadas para expresar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FGFR2IIIb.
4. Un método para generar anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 1 o reivindicación 2, o un sistema de expresión sin células que comprende dicho ácido nucleico, en condiciones adecuadas para producir anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados.
5. El método de la reivindicación 3 o reivindicación 4, que comprende además recuperar el anticuerpo anti-FGFR2IIIb producido por la célula hospedadora o sistema de expresión sin células.
6. El método de la reivindicación 5, que comprende además formular el anticuerpo anti-FGFR2IIIb con un vehículo farmacéuticamente aceptable como una composición farmacéutica.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb se formula para inyección, o para inhalación, o en una microcápsula de liberación mantenida.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que al menos un 95 % de los anticuerpos anti-FGFR2IIIb producidos por la célula hospedadora o sistema de expresión sin células están afucosilados.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la fucosa es indetectable en los anticuerpos anti-FGFR2IIIb producidos por la célula hospedadora o sistema de expresión sin células.
10. El método de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en el que la fucosa se detecta mediante un método que comprende HPLC, electroforesis capilar o espectrometría de masas MALDI-TOF.
11. La célula hospedadora o método de cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y/o el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
12. La célula hospedadora o método de la reivindicación 11, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
13. La célula hospedadora o método de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG 1 humano y carece de fucosa en la posición Asn297.
14. La célula hospedadora o método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y/o la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
15. La célula hospedadora o método de la reivindicación 14, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
16. La célula hospedadora o método de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo:
(i) es un anticuerpo monoclonal; y/o
(ii) es un anticuerpo quimérico; y/o
(iii) es un anticuerpo humanizado; y/o
(iv) carece de fucosa en Asn297; y/o
(v) comprende una región constante de la cadena ligera k; y/o
(vi) comprende una región constante de la cadena pesada de IgG1.
17. La célula hospedadora o método de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo afucosilado tiene actividad ADCC potenciada in vitro en comparación con un anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado que tiene la misma secuencia de aminoácidos,
en el que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado opcionalmente provoca lisis específica que es al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 70 o al menos 75 puntos porcentuales mayor que la lisis específica con el anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado,
y
en el que la actividad ADCC se determina opcionalmente usando células Ba/F3 que expresan FGFR2IIIb como células diana y PBMC humanos aislados como células efectoras.
18. La célula hospedadora o método de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo afucosilado tiene afinidad potenciada por Fc gamma RIIIA en comparación con un anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado que tiene la misma secuencia de aminoácidos,
en el que los anticuerpos anti-FGFR2IIIb afucosilados opcionalmente se unen a Fc gamma RIIIA con al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 20 veces mayor afinidad que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb fucosilado, y
en el que la afinidad por Fc gamma RIIIA se determina opcionalmente usando resonancia de plasmones superficiales, y
en el que Fc gamma RIIIA se selecciona opcionalmente de Fc gamma RIIIA(V158) y Fc gamma RIIIA(F158).
19. La célula hospedadora o método de la reivindicación 18, en el que Fc gamma RIIIA es Fc gamma RIIIA(V158).
20. La célula hospedadora o método de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo anti-FGFR2IIIb afucosilado se une a FGFR2IIIb, pero no se une a FGFR2IIIc.
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