ES2898875T3 - Dispositivo de preparación de muestras - Google Patents

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Daniel Haworth
John Palmer-Felgate
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Abbott Diagnostics Scarborough Inc
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Abbott Diagnostics Scarborough Inc
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Abstract

Un dispositivo de cromatografía (20) operado manualmente para preparar una muestra líquida para la amplificación isotérmica de ácido nucleico, comprendiendo el dispositivo (20): una cámara de muestra (146) para recibir un líquido, una bomba que tiene una válvula dosificadora, y un elemento de cromatografía, caracterizado porque la bomba comprende una primera parte (20a, 141) y una segunda parte separada (20b, 142) recibible en la primera parte, donde la primera parte (141) y la segunda parte separada (142) se acoplan para formar la válvula dosificadora, y donde la primera parte (141) comprende una cámara de dosificación (144) para recibir el líquido de la cámara de muestra (146), un elemento dosificador móvil (143) y un canal de liberación de presión, donde la cámara de dosificación (144) tiene una parte superior (1414) y una parte inferior (1413) separadas por el elemento dosificador móvil (143), donde la parte superior (1414) y la parte inferior (1413) de la cámara de dosificación están selectivamente en comunicación fluida a través del canal de liberación de presión, donde el elemento dosificador (143) se puede mover desde una posición inicial a una posición posterior donde, en la posición inicial, la parte superior y la parte inferior de la cámara de dosificación no están en comunicación fluida, donde, en la posición posterior, (i) el canal de liberación de presión proporciona comunicación fluida entre la parte inferior (1413) y la parte superior (1414) de la cámara de dosificación (144) y (ii) la presión en la parte inferior (1413) ) de la cámara de dosificación (144) aumenta de manera que el aire de la parte inferior de la cámara de dosificación (144) se mueve a través del canal de liberación de presión y desplaza un volumen predeterminado de líquido (1412) en la parte superior de la cámara de dosificación (144), donde la segunda parte (20b) comprende un accionador (25, 148) dispuesto para mover operativamente el elemento dosificador móvil (22, 143) desde la posición inicial a la posición posterior cuando la segunda parte se recibe en la primera parte, y donde la bomba es accionada por la segunda parte (20b, 142) del dispositivo acoplando operativamente la primera parte (20a, 141) del dispositivo (20) y donde en uso la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido (1412) desde la cámara de muestra (146) al elemento de cromatografía.

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo de preparación de muestras
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la preparación de muestras para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. En particular, a dispositivos de cromatografía operados manualmente para preparar muestras para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, kits para realizar amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y procedimientos para realizar amplificación isotérmica de ácidos nucleicos.
Antecedentes de la invención
Muchas pruebas de diagnóstico que involucran reacciones biológicas deben ser realizadas en laboratorios por técnicos capacitados y/o equipos complejos. Dichos laboratorios pueden estar sujetos a regulaciones gubernamentales. Los costos del cumplimiento de tales regulaciones pueden aumentar los costos de las pruebas de diagnóstico para los pacientes y los contribuyentes de la atención médica y excluir tales pruebas de los centros de atención médica.
El documento WO2013/041713 describe un sistema de punto de atención útil en la realización de amplificaciones isotérmicas de ácidos nucleicos. El documento WO 95/27199 A1 describe un sistema de cromatografía líquida con medios para suministrar un volumen predeterminado de muestra a un disco cromatográfico.
Sin embargo, se ha descubierto que, en determinadas circunstancias, para analizar determinados fluidos, como orina, sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido lagrimal y sudor, o eluir de una vía vaginal, nasal, de garganta, frotis peneano, anal o cutáneo, es posible que la muestra sin procesar deba someterse a una serie de etapas de preparación antes de su análisis en ensayos de amplificación de ácido nucleico conocidos.
Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de dispositivos, procedimientos y kits que permitan la preparación en el punto de atención de las muestras para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y otras pruebas. Dichos dispositivos deben ser fáciles de usar y económicos de producir.
La presente invención aborda estos y otros problemas de la técnica anterior.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de cromatografía como se define en la reivindicación 1.
El dispositivo se acciona manualmente. El dispositivo comprende una cámara para recibir una muestra líquida, una bomba con una válvula dosificadora y un elemento de cromatografía. Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de cromatografía de exclusión por tamaño y el elemento de cromatografía es un elemento de cromatografía de exclusión por tamaño: se prefieren particularmente los elementos de cromatografía de filtración en gel. En uso, la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido desde la cámara de muestra al elemento de cromatografía. Típicamente, la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido desde la cámara de muestra a través del elemento de cromatografía. Preferiblemente, la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido desde la cámara de muestra a través del elemento cromatográfico hasta un recipiente de recogida de muestras. Preferiblemente, el dispositivo es de un solo uso.
También se pueden emplear elementos de cromatografía en fase estacionaria alternativos en el dispositivo de la invención. Los elementos de cromatografía de fase estacionaria alternativos adecuados incluyen, pero no se limitan a, elementos de cromatografía de intercambio iónico, incluidos elementos de cromatografía de intercambio de cationes y aniones, elementos de cromatografía de fase inversa y elementos de cromatografía de afinidad. Por consiguiente, el dispositivo de la invención puede usarse para cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa y cromatografía de afinidad.
Preferiblemente, el dispositivo se puede accionar mediante un solo movimiento, típicamente un solo empuje o rotación. Típicamante, en uso, la bomba y/o el bombeo es neumático. Esto es ventajoso porque significa que el rendimiento de separación del dispositivo es sustancialmente independiente de la fuerza y la velocidad con la que se acciona el dispositivo. Esencialmente, la velocidad a la que la muestra líquida pasa a través del elemento cromatográfico es sustancialmente independiente de la fuerza aplicada por el usuario.
Preferiblemente, el procesamiento de la muestra líquida se completa dentro de un período de tiempo predeterminado de al menos aproximadamente 30 segundos, al menos aproximadamente 1 minuto, al menos aproximadamente 2 minutos, al menos aproximadamente 3 minutos, al menos aproximadamente 4 minutos, al menos aproximadamente 5 minutos, al menos aproximadamente 6 minutos, al menos aproximadamente 7 minutos, al menos aproximadamente 8 minutos, al menos aproximadamente 9 minutos, al menos aproximadamente 10 minutos. Preferiblemente, menos de aproximadamente 10 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 8 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 7 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 6 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 5 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 4 minutos. Preferiblemente, el procesamiento de la muestra líquida se completa dentro de un período de tiempo predeterminado de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos, se prefiere particularmente de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 3 minutos.
En las realizaciones, el volumen predeterminado de fluido es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 10 ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml. Preferiblemente, el volumen predeterminado de fluido es al menos aproximadamente 100 pl, al menos aproximadamente 200 pl, al menos aproximadamente 300 pl, al menos aproximadamente 400 pl, al menos aproximadamente 500 pl, al menos aproximadamente 600 pl, al menos aproximadamente 700 pl, al menos aproximadamente 800 pl, al menos aproximadamente 900 pl, al menos aproximadamente 1 ml, al menos aproximadamente 2 ml, al menos aproximadamente 3 ml, al menos aproximadamente 4 ml, al menos aproximadamente 5 ml.
En todos los aspectos de la invención, la muestra a analizar, es decir, la muestra líquida o sin procesar, será típicamente un fluido biológico, como orina, sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido lagrimal o eluido de una vagina, nasal, de garganta, frotis peneano, anal o cutáneo.
Se ha descubierto que las muestras sin procesar de determinados fluidos, como los indicados anteriormente, pueden contener agentes que en algunas circunstancias influyen negativamente en el rendimiento de los ensayos y, en particular, contienen agentes que interfieren negativamente con el rendimiento de los ensayos de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. La interferencia negativa puede adoptar la forma de inhibir la amplificación del ácido nucleico en sí y/o agentes que emiten fluorescencia de tal manera que la amplificación no puede detectarse de forma fiable. Se descubrió que estos agentes de interferencia del ensayo tienden a tener un peso molecular más bajo que los ácidos nucleicos diana y, por lo tanto, pueden eliminarse mediante una cromatografía de exclusión por tamaño. La presente invención permite realizar la cromatografía de exclusión por tamaño en un procedimiento simple de una etapa, en un entorno de punto de atención. Por lo tanto, permite que las pruebas se realicen más rápidamente y que cualquier tratamiento requerido se implemente más rápidamente, lo que proporciona beneficios tanto para los pacientes como para los profesionales de la salud. Se reconoce, que no se eliminan todos los agentes de interferencia de ácido nucleico/ensayo; sin embargo, se eliminará una cantidad suficiente para permitir que se realice y se mida la amplificación del ácido nucleico. Típicamente, se eliminan sustancialmente todos los agentes de interferencia de amplificación de ácidos nucleicos. Típicamente, los agentes de interferencia de amplificación de ácidos nucleicos serán sales y moléculas de bajo peso molecular, tales como proteínas o lípidos, presentes en la muestra líquida, típicamente con un peso molecular de menos de aproximadamente 5000 kDa. Típicamente, el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño elimina moléculas con un peso molecular de menos de aproximadamente 5000 kDa. El experto en la materia apreciará que el límite de peso molecular puede aumentarse o disminuirse seleccionando diferentes resinas cromatográficas.
Los ensayos de amplificación de ácido nucleico isotérmicos con los que se puede utilizar la invención incluyen amplificación de polimerasa recombinasa (RPA), reacción de amplificación de extensión y corte (NEAR), amplificación por desplazamiento de cadena y amplificación isotérmica mediada por bucle.
Las reacciones de amplificación de extensión y corte se analizan en detalle en el documento WO2009/012246 . Las reacciones de amplificación de la recombinasa polimerasa se analizan en detalle en los documentosWO2003/072805, WO2005/118853, WO2010/141940, WO2008/035205, WO2007/096702, WO2011/038197 y WO2012/138989.
Además de los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos, la invención también se puede utilizar para preparar muestras líquidas para un inmunoensayo, ensayos de espectrofotometría de masas y ensayos de reacción en cadena de la polimerasa.
En realizaciones de la invención, el dispositivo comprende una primera parte y una segunda parte a recibir en la primera parte. La primera parte y la segunda parte se acoplan operativamente para mover un volumen predeterminado de fluido desde la cámara de muestra al elemento cromatográfico. La bomba es accionada por la segunda parte del dispositivo que se acopla de manera operativa a la primera parte del dispositivo. Asimismo, la válvula dosificadora es accionada por la segunda parte del dispositivo que se acopla de manera operativa a la primera parte del dispositivo. La válvula dosificadora comprende una cámara de dosificación con una parte superior y una parte inferior separadas por un elemento dosificador móvil. Por lo tanto, las partes superior e inferior de la cámara de dosificación son de volumen variable. Típicamente, el elemento dosificador y la cámara de dosificación tendrán secciones transversales asimétricas coincidentes. Típicamente, la pared interior de la cámara de dosificación tendrá una sección transversal en forma de D. De manera similar, la pared exterior del elemento dosificador tendrá típicamente una sección transversal en forma de D, que se puede recibir en la cámara de dosificación. Típicamente, el elemento dosificador formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos, con la pared interior de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa.
La parte superior y la parte inferior de la cámara de dosificación están selectivamente en comunicación fluida. Es decir, pueden estar en configuraciones donde están en comunicación fluida y otras configuraciones donde no lo están. La válvula dosificadora comprende una derivación de fluido o un canal de liberación de presión para proporcionar comunicación fluida entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. El movimiento del elemento dosificador con respecto al canal de derivación de fluido permite la comunicación de fluido selectiva entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. Si el elemento dosificador está por encima del canal de derivación de fluido, no hay comunicación de fluido entre las dos partes de la cámara de dosificación. Sin embargo, el elemento dosificador puede bajarse para exponer el canal de derivación de fluido. El canal de derivación de fluido es un canal de liberación de presión. El canal de derivación de fluido libera aire a presión desde la parte inferior de la dosificación a la parte superior de la cámara.
En realizaciones, el dispositivo comprende un agente líti
elemento cromatográfico. La exposición de la muestra a un agente lítico provoca una rápida lisis de cualquier célula presente en la muestra líquida, liberando ácido nucleico intracelular para la prueba. Típicamente, un agente lítico se encuentra en la cámara de dosificación. El agente lítico se seleccionará preferiblemente de entre el grupo que consiste en un tensioactivo o una base. Las bases preferidas incluyen hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Se prefiere particularmente al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, típicamente mantenida en su lugar por una malla. Los tensioactivos preferidos pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, Triton®, Tween®, Brij®, bromuro de cetiltrimetilamonio y combinaciones de los mismos. Típicamente, el agente lítico estará seco.
Es ventajoso lisar el contenido de la muestra líquida antes de la cromatografía de modo que también se eliminen los agentes inhibidores de la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos producidos durante la lisis celular.
Típicamente, el elemento de cromatografía comprende una cámara de separación que contiene un sustrato de cromatografía. Preferiblemente, el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño comprende una cámara de separación que contiene una suspensión de gel de cromatografía de exclusión por tamaño. Preferiblemente, el elemento de cromatografía, preferiblemente el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño, comprende una solución que comprende un tampón para un ensayo, preferiblemente para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, preferiblemente acetato de magnesio. Preferiblemente, el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño comprende una solución que comprende un tampón para una amplificación isotérmica de ácido nucleico con partículas de cromatografía de filtración en gel suspendidas en el mismo.
La concentración del agente tampón en el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño se selecciona de modo que la concentración de tampón en la muestra procesada esté en el nivel deseado. Las concentraciones típicas para el tampón en el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. Preferiblemente, el pH de la muestra procesada es de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9. Estos pH y concentraciones preferidos se aplican a todos los aspectos de la invención. La concentración específica y el pH seleccionados dependerán de la aplicación, por ejemplo, RPA o NEAR.
Tales disposiciones son ventajosas porque entonces la muestra procesada recogida en el recipiente de recogida está inmediatamente lista para la prueba, lo que reduce el número de etapas del procedimiento.
Las partículas de filtración en gel preferidas útiles en todos los aspectos de la invención tienen un intervalo de tamaño de partícula de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm, más preferiblemente de aproximadamente 15 pm a aproximadamente 88 pm y, preferiblemente, un intervalo de fraccionamiento de 1000 a 5000 Da para péptidos y proteínas globulares. Preferiblemente, las partículas comprenden dextrano reticulado con epiclorhidrina. Alternativamente, el experto en la materia puede elegir geles de cromatografía en función de las características de los agentes que deben eliminarse de la muestra.
Un aspecto fuera del alcance de la presente invención proporciona un dispositivo para preparar una muestra para un ensayo, preferiblemente para amplificación isotérmica de ácido nucleico, que comprende una primera parte y una segunda parte separada que se puede recibir en la primera parte, donde la primera parte comprende una recipiente para recibir la muestra y la segunda parte comprende un elemento de separación para eliminar los agentes que interfieren en el ensayo, preferiblemente agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes, de la muestra. Cuando la segunda parte se recibe en la primera parte, la primera y la segunda partes se acoplan operativamente para mover la muestra desde la cámara de muestra al elemento de separación. Preferiblemente, el dispositivo es de un solo uso. Preferiblemente, el dispositivo se acciona manualmente, preferiblemente el dispositivo se puede accionar mediante un solo empuje o rotación aplicada por el usuario.
Típicamente, la primera parte comprende una válvula dosificadora para medir un volumen predeterminado de muestra de la cámara de muestra y puede ser accionada por la segunda parte del dispositivo acoplando la primera parte del dispositivo.
En uso, el dispositivo normalmente bombeará un volumen predeterminado de fluido desde la cámara de muestra a través del elemento de separación. Preferiblemente, la bomba mueve un volumen predeterminado de fluido desde la cámara de muestra a través del elemento de separación hasta un recipiente de recogida de muestras. Preferiblemente, el volumen predeterminado de fluido es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 10 ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 ml. Preferiblemente, la bomba es neumática.
La válvula dosificadora comprenderá típicamente una cámara de dosificación con una parte superior y una parte inferior separadas por un elemento dosificador móvil.
Típicamente, la válvula dosificadora comprende una cámara de dosificación con una parte superior y una parte inferior separadas por un elemento dosificador móvil. Por lo tanto, las partes superior e inferior de la cámara de dosificación son de tamaño variable. Típicamente, la pared interior de la cámara de dosificación tendrá una sección transversal en forma de D. De manera similar, la pared exterior del elemento dosificador tendrá típicamente una sección transversal en forma de D, que se puede recibir en la cámara de dosificación. Típicamente, el elemento dosificador formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos, con la pared interior de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa.
En las realizaciones, la parte superior y la parte inferior de la cámara de dosificación están selectivamente en comunicación fluida. Es decir, pueden estar en configuraciones donde están en comunicación fluida y otras configuraciones donde no lo están. La válvula dosificadora puede comprender, por ejemplo, un canal de derivación de fluido para proporcionar comunicación fluida entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. El movimiento del elemento dosificador con respecto al canal de derivación de fluido puede permitir la comunicación de fluido selectiva entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. Típicamente, el canal de derivación de fluido es un canal de liberación de presión.
En otras realizaciones, el dispositivo comprende un agente líti
mueva al elemento de separación. Típicamente, un agente lítico se encuentra en la cámara de dosificación. El agente lítico se seleccionará preferiblemente de entre el grupo que consiste en un tensioactivo o una base. Las bases preferidas incluyen hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Se prefiere particularmente el uso de una malla de material dopada con hidróxido de potasio o al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, preferiblemente mantenida en su lugar por una malla. Los tensioactivos preferidos pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, Triton®, Tween®, Brij®, bromuro de cetiltrimetilamonio y combinaciones de los mismos.
Como se analizó anteriormente, es ventajoso realizar la lisis antes de la separación porque los agentes que interfieren en el ensayo producidos durante la lisis también pueden eliminarse.
El elemento de separación típicamente comprende una suspensión de cromatografía de exclusión por tamaño. Preferiblemente, el elemento de separación comprende una solución que comprende un tampón para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, preferiblemente tampones de acetato de magnesio, Tris o fosfato.
En realizaciones alternativas, el elemento de separación puede comprender un filtro o un elemento de cromatografía de fase estacionaria adecuado seleccionado de entre el grupo de elementos de cromatografía de intercambio iónico, incluidos elementos de cromatografía de intercambio catiónico y aniónico, elementos de cromatografía de fase inversa y elementos de cromatografía de afinidad. Por consiguiente, el dispositivo de la invención puede usarse para cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa y cromatografía de afinidad.
Un aspecto adicional fuera del alcance de la presente invención proporciona un dispositivo para preparar una muestra para una amplificación de ácido nucleico isotérmica que comprende un elemento lítico y un elemento de separación para eliminar agentes inhibidores de la amplificación de ácido nucleico y/o agentes fluorescentes del lisado.
Típicamente, el elemento lítico comprende un agente lítico. El agente lítico se seleccionará preferiblemente de entre el grupo que consiste en un tensioactivo o una base. Las bases preferidas incluyen hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Se prefiere particularmente una malla de material dopada con hidróxido de potasio; más preferido es el uso de al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, típicamente mantenida en su lugar por una malla. Los tensioactivos preferidos pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, Triton®, Tween®, Brij®, bromuro de cetiltrimetilamonio y combinaciones de los mismos.
También se describe en esta invención una válvula dosificadora que contiene una cámara de dosificación que comprende un agente lítico seco.
El agente lítico se seleccionará preferiblemente de entre el grupo que consiste en un tensioactivo o una base. Las bases preferidas incluyen hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Se prefiere particularmente una malla de material dopada con hidróxido de potasio; más preferido es el uso de al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, típicamente mantenida en su lugar por una malla. Los tensioactivos preferidos pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, Triton®, Tween®, Brij®, bromuro de cetiltrimetilamonio y combinaciones de los mismos.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico en una muestra. El kit comprenderá, en combinación con el dispositivo de cromatografía de la invención, un dispositivo de transferencia de líquido, que preferiblemente comprende una carcasa que tiene una punta de pipeta y un conjunto de émbolo; una cámara de reacción que contiene reactivos para una reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica; un depósito de muestra; y un dispositivo de preparación de muestras que comprende un elemento de separación capaz de eliminar agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes de la muestra antes de realizar la amplificación isotérmica del ácido nucleico.
En las realizaciones del kit, el recipiente de reacción contiene los reactivos para una amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA), como una recombinasa, una proteína de unión de una sola hebra y una polimerasa. La recombinasa puede seleccionarse de entre T4 UvsX, T6 UvsX o RecA. La ADN polimerasa puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, la polimerasa de B. stearothermophilus (Bst), la polimerasa de B. subtilis Phi-29, la polimerasa I de B. subtilis (Bsu). La proteína de unión de una sola hebra es típicamente gp32.
Los reactivos para una amplificación de la polimerasa recombinasa que típicamente también incluyen un agente de aglomeración, ATP (trifosfato de adenosina) o un análogo de ATP, dNTP(s) o bacteriófago T4 UvsY. Los agentes de aglomeración preferidos se pueden seleccionar de entre el grupo que comprende (preferiblemente que consiste en) polietilenglicol (PEG), dextrano, polivinilalcohol (PVA), polivinipirrolidona (PVP) o Ficoll.
Cuando está presente, el PEG es preferiblemente PEG1450, PEG3000, PEG8000 o PEG10000. El PEG tendrá preferiblemente un peso molecular entre aproximadamente 15000 y aproximadamente 20000.
Cuando está(n) presente(s), el (los) dNTP se selecciona(n) preferiblemente de entre el grupo que consiste en dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
Cuando está presente, el ATP o análogo de ATP se selecciona típicamente de entre ATP, ATP-y-S, ATB-p-S, ddATP o una combinación de los mismos.
Alternativamente, el recipiente de reacción puede contener los reactivos para una reacción de amplificación de extensión y corte (NEAR). Los reactivos NEAR comprenden típicamente una enzima de corte, un ácido nucleico molde directo, un ácido nucleico molde inverso y una polimerasa.
Los reactivos están típicamente en forma seca o liofilizada, pero pueden estar en forma líquida.
El kit puede comprender además un recipiente de recogida de pacientes y una pasta para transferir fluido desde el recipiente de recogida de pacientes al dispositivo de preparación de muestras.
Preferiblemente, el dispositivo de preparación de muestras contiene un agente lítico al que se expone la muestra antes de que el elemento de separación elimine los agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes del lisado. Se prefiere particularmente el uso de al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, típicamente mantenida en su lugar por una malla.
Típicamente, el elemento de separación comprende una cámara de separación que contiene una suspensión de gel de cromatografía de exclusión por tamaño. Preferiblemente, el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño comprende una solución que comprende un tampón para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, preferiblemente acetato de magnesio. Preferiblemente, el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño comprende una solución que comprende un tampón para una amplificación isotérmica de ácido nucleico y una suspensión de partículas de cromatografía de filtración en gel.
En realizaciones no reivindicadas, el elemento de separación puede comprender un filtro.
El dispositivo de preparación de muestras puede ser un dispositivo según cualquiera de los aspectos anteriores de la invención.
Específicamente, el dispositivo de preparación de muestras puede ser un dispositivo de cromatografía de exclusión por tamaño accionado manualmente. El dispositivo comprende una cámara para recibir una muestra líquida, una bomba con una válvula dosificadora y un elemento de cromatografía de exclusión por tamaño. En uso, la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido desde la cámara de muestra al elemento de cromatografía de exclusión por tamaño. Típicamente, la bomba mueve un volumen predeterminado de fluido desde la cámara de muestra a través del elemento de cromatografía de exclusión por tamaño. Preferiblemente, la bomba mueve un volumen predeterminado de fluido desde la cámara de muestra a través del elemento de cromatografía de exclusión por tamaño hasta un recipiente de recogida de muestras. Preferiblemente, el dispositivo es de un solo uso. Preferiblemente, el dispositivo se puede accionar mediante un solo empuje o rotación hacia abajo. Típicamente, la bomba es neumática. Alternativamente, el dispositivo de preparación de muestras puede ser un dispositivo para preparar una muestra para la amplificación isotérmica de ácido nucleico que comprende una primera parte y una segunda parte separada que se puede recibir en la primera parte, donde la primera parte comprende un recipiente para recibir la muestra y la segunda parte comprende un elemento de separación para eliminar agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes de la muestra, donde cuando la segunda parte se recibe en la primera parte, la primera y la segunda parte se acoplan operativamente para mover la muestra desde la cámara de muestra al elemento de separación.
Alternativamente, el dispositivo de preparación de muestras puede comprender un elemento lítico y un elemento de separación para eliminar los agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes del lisado.
En realizaciones, la carcasa del dispositivo de transferencia de líquido está configurada para acoplarse herméticamente con la cámara de reacción. En algunas realizaciones, la carcasa del dispositivo de transferencia de líquido puede incluir un componente de sellado configurado para acoplarse herméticamente con la cámara de reacción. En algunas realizaciones, la cámara de reacción puede incluir un componente de sellado configurado para acoplarse herméticamente con el dispositivo de transferencia de líquido. Los sistemas pueden incluir además un depósito de fluido, y la cámara de reacción puede configurarse opcionalmente para acoplarse de forma bloqueable con el depósito de fluido.
Preferiblemente, el dispositivo de preparación de muestras puede acoplarse de manera extraíble con el depósito de fluido. Preferiblemente, el dispositivo de preparación de muestras se acciona mientras está posicionado en el depósito de fluido, preferiblemente empujando el dispositivo contra el depósito de fluido. Típicamente, la muestra preparada se recoge en el depósito de fluido.
El dispositivo de transferencia de líquido puede configurarse para acoplarse de forma bloqueable con la cámara de reacción, por ejemplo, sin dispensar, antes de dispensar y/o después de dispensar una muestra de líquido. En algunas realizaciones, la cámara de reacción incluye uno o más componentes de una reacción biológica.
El dispositivo de transferencia de líquido puede incluir una carcasa que tiene una punta de pipeta; y un conjunto de émbolo dispuesto dentro de la carcasa y la punta de pipeta, donde una parte del conjunto del émbolo está configurada para acoplarse a un depósito de fluido de manera que el conjunto del émbolo permanece estacionario con respecto al depósito de fluido y la carcasa se mueve en relación con el conjunto del émbolo.
Típicamente, el movimiento de la carcasa con respecto al conjunto del émbolo da como resultado la creación de un vacío dentro de la punta de pipeta y, opcionalmente, el conjunto del émbolo se puede configurar para bloquearse en una posición que da como resultado la creación de un vacío. La carcasa puede configurarse para moverse en relación con el conjunto del émbolo empujando la carcasa hacia abajo sobre el depósito de fluido. El dispositivo se puede configurar además para proporcionar una indicación auditiva y/o visual de que el conjunto del émbolo está en una posición que resulta en la creación del vacío.
El kit puede incluir el dispositivo de transferencia de líquido y uno o más de un depósito de fluido y una cámara de reacción. La cámara de reacción se puede configurar para desbloquear el conjunto del émbolo cuando el dispositivo de transferencia de líquido y la cámara de reacción están interconectados.
El dispositivo de transferencia de líquido puede configurarse para extraer una muestra de un depósito de fluido empujando el dispositivo contra el depósito y sistemas que incluyen el dispositivo de transferencia de líquido y uno o ambos de una cámara de reacción y un depósito de fluido.
En los sistemas descritos anteriormente, los cuatro dispositivos de transferencia de líquido, la cámara de reacción el dispositivo de preparación de muestras y el depósito de fluido pueden tener secciones transversales asimétricas compatibles.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un sistema para realizar amplificación isotérmica de ácido nucleico que comprende un kit según el aspecto anterior de la invención y un dispositivo de detección.
El dispositivo de detección incluirá típicamente una primera estación adaptada para sujetar de forma segura la cámara de recogida de muestras y una segunda estación adaptada para sujetar de forma segura la cámara de reacción. Cuando está en uso, el dispositivo de preparación de muestras se coloca en la cámara de recogida de muestras. Típicamente, la primera parte del dispositivo se colocará en la cámara de recogida de muestras. A continuación, se coloca una muestra sin procesar en la cámara de dosificación del dispositivo. A continuación, la segunda parte del dispositivo se inserta en la primera parte del dispositivo. A continuación, se empuja la segunda parte del dispositivo hacia la primera parte, típicamente hasta que se emite una señal audible o visual, y se recoge una muestra preparada en el recipiente de recogida de muestras. A continuación, se retira y se desecha el dispositivo de preparación de muestras.
El dispositivo de transferencia se puede mover entre la cámara de recogida en la primera estación y la cámara de reacción en la segunda estación.
El dispositivo de detección incluye una tapa que puede cerrarse cuando el dispositivo de detección está en funcionamiento o para almacenamiento.
Una interfaz de usuario de pantalla táctil puede estar presente para introducir datos y mostrar información sobre el ensayo. La segunda estación puede incluir un lector de código de barras o dispositivo similar para detectar automáticamente un código de barras o código similar presente en la cámara de amplificación. Las estaciones primera y segunda pueden adaptarse para calentar o enfriar el contenido de la cámara de recogida de muestras y la cámara de reacción. La segunda estación también se puede adaptar para proporcionar monitorización óptica, de fluorescencia u otra y/o agitar el microtubo.
En algunas realizaciones, un dispositivo de transferencia de líquido o una punta de pipeta descritos en esta invención pueden configurarse para recoger y dispensar un volumen entre 1 pl y 5 ml (por ejemplo, entre dos de 1 pl, 2 pl, 5 pl, 10 pl, 20 pl, 50 pl, 100 pl, 200 pl, 500 pl, 1 ml, 2 ml y 5 ml).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una muestra líquida sin procesar para análisis; procesar la muestra líquida sin procesar para eliminar los agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes; realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico en la muestra procesada; y monitorizar el ácido nucleico amplificado, donde la etapa de procesamiento se realiza con un dispositivo de cromatografía de la invención.
Un aspecto fuera del alcance de la presente invención proporciona una composición para su uso en cromatografía de filtración en gel que comprende una solución acuosa que comprende un tampón de amplificación de ácido nucleico isotérmico y una dispersión de partículas de cromatografía de filtración en gel. Típicamente, el tampón se selecciona de entre el grupo que consiste en acetato de magnesio o acetato de Tris; preferiblemente acetato de magnesio. Las partículas de filtración en gel preferidas tienen un intervalo de tamaño de partícula de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm, más preferiblemente de aproximadamente 15 pm a aproximadamente 88 pm y, preferiblemente, un intervalo de fraccionamiento de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 Da para péptidos y proteínas globulares. Preferiblemente, las partículas comprenden dextrano reticulado con epiclorhidrina. El experto en la materia puede elegir geles de cromatografía de exclusión por tamaño alternativos.
En esta invención también se describe el uso de tales composiciones en la preparación de una muestra para la amplificación isotérmica de ácido nucleico.
El dispositivo de la presente invención incluye una válvula dosificadora para una bomba. La válvula dosificadora comprenderá una cámara de dosificación que tiene una parte superior y una parte inferior separadas por un elemento dosificador móvil; y un canal de liberación de presión.
El elemento dosificador y el canal de liberación de presión están dispuestos de manera que el elemento dosificador se pueda mover desde una posición inicial en la que el elemento dosificador separa la parte superior de la parte inferior a una posición posterior en la que el canal de liberación de presión proporciona una comunicación fluida entre la parte inferior de la cámara de dosificación y la parte superior de la cámara de dosificación.
Por tanto, a medida que desciende el elemento dosificador, reduciendo así el volumen de la parte inferior de la cámara de dosificación, la presión aumenta en la parte inferior de la cámara de dosificación. Una vez que el elemento dosificador ha avanzado una distancia predeterminada, el canal de liberación de presión puede proporcionar comunicación fluida entre las partes inferior y superior de la cámara de dosificación. Una vez en comunicación fluida, el aire de la parte inferior de la cámara de dosificación se moverá a lo largo del canal de liberación de presión y desplazará el fluido en la parte superior de la cámara de dosificación.
Típicamente, se proporciona un canal de salida de fluido. Preferiblemente, el fluido se desplaza a lo largo del canal de salida y, por lo tanto, sale de la válvula dosificadora. En una realización preferida de la invención, el canal de salida de fluido está ubicado dentro de un accionador móvil para la válvula dosificadora. En tales realizaciones, el accionador móvil se acopla de manera operativa al elemento dosificador, de modo que el movimiento del accionador mide un volumen predeterminado de muestra y bombea el volumen predeterminado fuera del canal de salida.
Típicamente, el elemento dosificador formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos, con la pared interior de la cámara de dosificación. La pared interior de la cámara de dosificación puede tener una sección transversal asimétrica, preferiblemente una sección transversal en forma de D. De manera similar, la pared exterior del elemento dosificador puede tener una sección transversal asimétrica, típicamente una sección transversal en forma de D, que se adapta a la sección transversal de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa. Típicamente, el accionador móvil se acopla de forma operativa al suelo interior de la copa.
Típicamente, la cámara de dosificación tendrá una sola abertura para recibir una muestra de líquido a medir y el accionador móvil. Típicamente, el perímetro de la abertura de la cámara de dosificación formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos con una pared exterior del accionador móvil cuando se reciba dentro de la abertura.
También se describe en esta invención un procedimiento de fabricación de una válvula dosificadora de un solo uso. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una cámara de dosificación con una primera abertura y una segunda abertura y un canal de liberación de presión que se extiende parcialmente a lo largo de una pared interna de la cámara, típicamente en una dirección axial; proporcionar un elemento dosificador que se puede recibir en la cámara de dosificación para separar la cámara de dosificación en una primera parte y una segunda parte; ubicar el elemento dosificador en la cámara de dosificación de manera que el canal de liberación de presión no proporcione comunicación fluida entre la primera parte y la segunda parte, y sellar una abertura de la cámara de dosificación con un sello. Típicamente, el elemento dosificador se puede mover dentro de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador se desliza a su posición a través de la abertura a sellar y, preferiblemente, la otra abertura no está sellada.
En realizaciones del procedimiento, se evita que el elemento dosificador se mueva a través de la primera abertura, preferiblemente mediante un tope, preferiblemente un tope anular, más preferiblemente mediante un tope anular en la primera abertura.
Típicamente, el elemento dosificador se introduce en la cámara de dosificación a través de la segunda abertura y se hace avanzar a lo largo de la cámara de dosificación hasta que el elemento dosificador se acopla a un tope, típicamente un tope anular.
Preferiblemente, el elemento dosificador forma un ajuste de interferencia con la cámara de dosificación, preferiblemente un ajuste de interferencia estano a los fluidos. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa. El dispositivo de la presente invención incluye además una bomba accionada manualmente que comprende una primera parte y una segunda parte separada que se puede recibir operativamente en la primera parte. La primera parte y la segunda parte se acoplan para formar una válvula dosificadora, la primera parte comprende una cámara de dosificación para recibir una muestra de líquido, un elemento dosificador móvil y un canal de liberación de presión, y la segunda parte comprende un accionador dispuesto para acoplar operativamente el elemento dosificador cuando la segunda parte se recibe en la primera parte. En uso, la segunda parte avanza hacia la primera parte y un volumen predeterminado de fluido sale de la bomba a través de un canal de salida, dicho volumen predeterminado de fluido comprenderá típicamente un volumen predeterminado de la muestra de líquido y un volumen predeterminado de aire. Típicamente, el canal de salida se proporciona en la segunda parte. En una realización preferida de la invención, el canal de salida de fluido está ubicado dentro del accionador. La bomba suele ser de un solo uso.
Típicamente, la cámara de dosificación tendrá una sola abertura para recibir una muestra de líquido a medir y el accionador. Típicamente, el perímetro de la abertura de la cámara de dosificación formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos con una pared exterior del accionador cuando se reciba dentro de la abertura.
Típicamente, el elemento dosificador tendrá un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos, con la pared interior de la cámara de dosificación. El elemento dosificador separa de ese modo la cámara de dosificación en una parte superior e inferior. La pared interior de la cámara de dosificación puede tener una sección transversal asimétrica, preferiblemente una sección transversal en forma de D. De manera similar, la pared exterior del elemento dosificador puede tener una sección transversal asimétrica, típicamente una sección transversal en forma de D, que se adapta a la sección transversal de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa. Típicamente, el accionador móvil se acopla de forma operativa al suelo interior de la copa.
En uso, el volumen de fluido, típicamente aire, desplazado por el accionador a medida que avanza hacia la cámara de dosificación da como resultado un aumento de presión dentro de una parte superior de la cámara de dosificación y, por lo tanto, mueve el volumen predeterminado de fluido a través del canal de salida. La selección del desplazamiento de volumen correcto es competencia del experto.
El canal de liberación de presión proporciona una comunicación fluida selectiva entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. Cuando el elemento dosificador está en su posición inicial, las partes superior e inferior de la cámara de de dosificación están separadas, es decir, no están en comunicación fluida. A medida que el accionador mueve el elemento dosificador a lo largo de la cámara de dosificación, el canal de liberación de presión queda expuesto y se consigue la comunicación fluida entre las partes superior e inferior de la cámara de dosificación. En una realización preferida de la invención, el canal de liberación de presión está ubicado en una pared de la cámara de dosificación. El canal de liberación de presión puede tener la forma de una ranura abierta o un conducto cerrado. Típicamente, el canal de liberación de presión se extenderá desde o cerca de la base de la cámara de dosificación hasta una ubicación debajo de la parte superior del elemento dosificador en su posición inicial.
Preferiblemente, la cámara de dosificación comprende un agente lítico. Los agentes líticos adecuados se han analizado anteriormente en la presente descripción.
Un aspecto fuera del alcance de la presente invención proporciona una bomba, preferiblemente una bomba accionada manualmente, para medir un volumen predeterminado de líquido que comprende: un recipiente que comprende una cámara de muestra y una cámara de dosificación; un accionador que contiene un canal de salida de fluido con una abertura en una parte distal del accionador, donde el accionador se puede mover desde una primera posición, en la que el extremo distal del accionador está ubicado en la cámara de muestra, a una segunda posición, en la que la abertura del canal de salida de fluido está ubicada en la cámara de dosificación, y donde cuando el accionador está en la primera posición, la cámara de muestra está en comunicación fluida con la cámara de dosificación, y cuando el accionador está en la segunda posición, la cámara de muestra está separada de la cámara de dosificación; donde la cámara de dosificación está dividida en una parte superior y una parte inferior por un elemento dosificador móvil y donde la cámara de dosificación comprende además un canal de liberación de presión; y donde el elemento dosificador, el canal de liberación de presión y el accionador están dispuestos de tal manera que cuando el accionador se mueve desde su primera posición a su segunda posición, el elemento dosificador se mueve desde una posición inicial en la que el elemento dosificador separa la parte superior de la parte inferior a una posición posterior en la que el canal de liberación de presión proporciona una comunicación fluida entre la parte inferior de la cámara de dosificación y la parte superior de la cámara de dosificación.
Típicamente, el elemento dosificador formará un ajuste de interferencia, preferiblemente un ajuste de interferencia estanco a los fluidos, con la pared interior de la cámara de dosificación. El elemento dosificador separa de ese modo la cámara de dosificación en una parte superior y una parte inferior. La pared interior de la cámara de dosificación puede tener una sección transversal asimétrica, preferiblemente una sección transversal en forma de D. De manera similar, la pared exterior del elemento dosificador puede tener una sección transversal asimétrica, típicamente una sección transversal en forma de D, que se adapta a la sección transversal de la cámara de dosificación. Preferiblemente, el elemento dosificador es una copa. Típicamente, el accionador móvil se acopla de forma operativa al suelo interior de la copa.
En uso, el volumen de fluido, típicamente aire, desplazado por el accionador a medida que avanza hacia la cámara de dosificación da como resultado un aumento de presión dentro de una parte superior de la cámara de dosificación y, por lo tanto, mueve el volumen predeterminado de fluido a través del canal de salida del fluido. El volumen de la parte superior de la cámara de dosificación desplazado por el accionador debe ser preferiblemente mayor que el volumen de la muestra de líquido que se va a mover, de modo que cuando el accionador desplace completamente al elemento dosificador, toda la muestra de líquido en la parte superior de la cámara de dosificación se expulsa de la cámara de dosificación. Un exceso de volumen asegura que un volumen de aire también pase a través de la segunda parte del dispositivo para evitar goteos y garantizar la uniformidad de la dosis. La selección del volumen correcto de la cámara de dosificación a desplazar por el accionador es competencia del experto.
En una realización preferida de la invención, el canal de liberación de presión está ubicado en una pared de la cámara de dosificación. El canal de liberación de presión puede tener la forma de una ranura abierta o un conducto cerrado. Típicamente, el canal de liberación de presión se extenderá desde o cerca de la base de la cámara de dosificación hasta una ubicación debajo de la parte superior del elemento dosificador en su posición inicial.
Preferiblemente, la cámara de dosificación y/o la cámara de muestra comprende un agente lítico. Los agentes líticos adecuados se han descrito anteriormente en esta descripción.
La bomba suele ser de un solo uso. A los efectos de la invención, un solo uso significa que en uso normal la bomba no se puede reiniciar y reutilizar.
Las bombas y válvulas dosificadoras según estos aspectos se contemplan específicamente para su uso en los dispositivos según los aspectos de la invención descritos anteriormente.
A los efectos de la invención, accionado manualmente tiene su significado normal. Es decir, que los dispositivos, bombas y válvulas dosificadoras sean accionables manualmente. Todos los dispositivos, bombas y válvulas dosificadoras de la invención se pueden accionar manualmente, aunque se contempla que determinados aspectos y realizaciones de la invención también se pueden accionar por medios alternativos.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un sistema de la técnica anterior.
La figura 2 es una vista despiezada de un dispositivo ejemplar.
La figura 3 muestra una primera parte ejemplar del dispositivo antes de su uso.
La figura 4 muestra una primera parte ejemplar del dispositivo con la tapa de la cámara de muestra retirada.
La figura 5 muestra una segunda parte ejemplar del dispositivo.
La figura 6 muestra la segunda parte acoplándose a la primera parte y midiendo un volumen de la muestra sin procesar. La figura 7 muestra la segunda parte que ha desplazado el elemento dosificador.
La figura 8 muestra la segunda parte completamente deprimida.
La figura 9 a la figura 11 muestra un dispositivo ejemplar in situ en un dispositivo para realizar y monitorizar la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos.
La figura 12 muestra la muestra preparada que se transporta a una cámara de reacción.
La figura 13a a la figura 13e proporcionan una representación esquemática de la cámara de dosificación durante el uso.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la preparación de muestras para su uso en ensayos y en particular en la preparación de muestras para su uso en la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. En particular, a dispositivos de cromatografía operados manualmente para preparar muestras para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, kits para realizar amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y procedimientos para realizar amplificación isotérmica de ácidos nucleicos.
La figura 1 muestra un recipiente de reacción (200), un depósito de recogida de muestras (300) y un dispositivo de transferencia de líquido (100) adecuados para su uso en el sistema ilustrado en la figura 13. Cada subconjunto puede tener una sección transversal en forma de D o de otro modo asimétrica (105, 205, 305) que sea compatible con los otros dos subconjuntos, de modo que los subconjuntos sólo puedan acoplarse entre sí en una orientación.
La cámara de reacción 200 incluye un microtubo 220 mantenido dentro de una abertura en el fondo del cuerpo del recipiente de reacción.
La figura 1 muestra el dispositivo de transferencia 100 y el recipiente de reacción 200 como se describió anteriormente con una punta de pipeta 120 y un microtubo 220. Sin embargo, el dispositivo de transferencia puede tener dos o más puntas de pipeta y el recipiente de reacción puede tener dos o más microtubos.
Estos conjuntos se analizan en detalle en el documentoWO2013/041713 que se incorpora en esta invención como referencia.
La figura 2 muestra una vista despiezada de un dispositivo (20) según la invención. El dispositivo comprende una primera parte (20a) y una segunda parte (20b). La segunda parte (20b) se puede recibir en la primera parte (20a). También se muestra un depósito de muestra (210). La primera parte (20a) se puede recibir en el depósito de recogida de muestras (210).
La primera parte (20a) comprende un cuerpo principal (21). El cuerpo principal (21) comprende una cámara de muestra (no mostrada) y una cámara de dosificación (211). La cámara de dosificación (211) y la cámara de muestra están en comunicación fluida. El elemento dosificador (22) tiene la forma de un elemento en forma de copa con una sección transversal en forma de D. La cámara de dosificación (211) también tiene una sección transversal en forma de D. El elemento dosificador (22) típicamente contendrá un agente lítico deshidratado. Típicamente, al menos una pastilla de agente lítico (221), típicamente hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, se mantiene en su lugar con una gasa (222). El hidróxido de potasio/hidróxido de sodio está presente para causar una rápida lisis del material celular en el fluido de muestra, liberando así ácido nucleico intracelular que debe detectarse mediante amplificación isotérmica de ácido nucleico.
El elemento dosificador (22) se puede recibir de forma móvil en la cámara de dosificación (211). En uso, el elemento dosificador (22) divide la cámara de dosificación en una parte superior y una parte inferior. El elemento dosificador (22) forma un ajuste de interferencia estanco a los fluidos con la pared interior de la cámara de dosificación (211). Una membrana estanca al gas (23) cierra el extremo de la cámara de dosificación. En la fabricación, el elemento dosificador (22) se inserta en la base de la cámara de dosificación (211) y se empuja hacia arriba hasta que se asiente justo debajo del sello anular (no visible) que separa la cámara de dosificación de la cámara receptora de la muestra. A continuación, se sella térmicamente una membrana estanca al gas (23) sobre la base de la cámara de dosificación (211).
La segunda parte (20b) comprende un cuerpo principal (24) que comprende un accionador (25) que se puede recibir en la cámara de muestra de la primera parte (20a). En uso, el accionador (25) se acopla de manera operativa con el elemento dosificador (22). El accionador (25) tiene un extremo distal (215) y un extremo proximal (216). Una abertura (214) está ubicada en el extremo distal del accionador (25). La abertura (214) está en comunicación fluida con una cámara de separación (no mostrada) que contiene una solución acuosa que comprende un tampón de amplificación isotérmica de ácido nucleico y una dispersión de partículas de cromatografía de filtración en gel. Las partículas de filtración en gel adecuadas se venden bajo el nombre comercial Sephadex G-25 Superfine por GE Healthcare, otros sustratos de cromatografía adecuados son conocidos por el experto en la materia. Un canal de microfluidos (no mostrado) proporciona comunicación fluida entre la cámara de separación y la abertura de salida (217) en el extremo distal de la pata de retorno (26). Se inserta un inserto (27) en la pata de retorno (26) y cierra la cámara de separación. La pared exterior del accionador (25) comprende un hombro (213) para acoplar la primera parte. Hay un canal (212) en el hombro (213). En uso, el canal (213) permite que el exceso de líquido escape de la cámara de dosificación antes de que se selle.
Se proporcionan sellos despegables (223, 224) en la primera parte y la segunda parte.
La figura 3 muestra la primera parte del dispositivo (32) antes de su uso. Un sello despegable (31) cubre la cámara de muestra (no mostrada). El sello despegable (31) protege el contenido de la primera parte (32) de la contaminación y al agente lítico seco de la humedad, antes de su uso. Un sello despegable intacto (31) también indica al usuario que el dispositivo no se ha utilizado antes. La primera parte del dispositivo (32) se acopla con un depósito de muestra (33). La figura 4 muestra la primera parte del dispositivo (42) con el sello despegable retirado. Ahora se puede acceder a la cámara de muestra (41). De nuevo, la primera parte del dispositivo (42) se acopla con un depósito de muestra (43). La figura 5 muestra una segunda parte del dispositivo (60). La segunda parte del dispositivo (60) comprende una primera pata de accionador (63) y una segunda pata de retorno (62). Se fija un tapón (61) en su lugar. Un sello despegable (64) cubre las aberturas ubicadas en los extremos distales de la pata del accionador y la pata de retorno para evitar la contaminación y/o fuga de fluido dentro del accionador.
En uso, el sello despegable (64) se retira antes de que la segunda parte se acople con la primera parte. El sello despegable (64) evita la contaminación y las fugas. Un sello despegable intacto (64) indica al usuario que el dispositivo no se ha utilizado antes.
Una vía de microfluidos (no visible) se extiende desde la parte superior de la pata del accionador (63) y baja por el interior de la pata de retorno (62), a través de la cual, en uso, fluye el líquido procesado.
La segunda parte del dispositivo (60) se realiza en dos piezas mediante moldeo por inyección: una pared exterior (65) y un inserto (66). El inserto llena la mayor parte de la pata de retorno (62) e incluye la parte circular (66) visible en la superficie superior de la segunda parte (60). Hay una ranura en la parte de la pata de retorno del inserto (no mostrada) que forma un canal cerrado cuando se inserta en la pata de retorno (62). Como se muestra mejor en la figura 2, en la pata del accionador (25), el inserto (27) comprime la frita superior (218) hacia abajo sobre la matriz (219) y la frita inferior (220) e incluye una abertura y una ranura (no mostrada) que permite que el fluido procesado se mueva a través de la pata de retorno (26).
La figura 6a muestra el dispositivo de la invención con la segunda parte (71) insertada en la primera parte (72). De nuevo, la primera parte del dispositivo (72) se acopla con un depósito de recogida de muestras (73).
La figura 6b muestra una sección a través de la primera (72) y la segunda (71) partes del dispositivo y el depósito de muestra (73) mostrado en la figura 7a.
La sección transversal en la figura 6b revela la cámara de separación (76) que contiene la matriz de cromatografía de exclusión por tamaño (75). La cámara (76) que contiene la matriz, está equipada con fritas superior (77) e inferior (78) para mantener la matriz (75) en su lugar. También hay elementos recortados (formas cruzadas) en el plástico moldeado que permiten que el fluido se esparza y entre en la cámara de separación (75).
En uso, se indica al usuario que introduzca la segunda parte (71) en la primera parte (72). El dispositivo tiene una forma tal que es evidente que la pata del accionador (79) es la que se introduce en la cámara (711) en la que se añade la muestra sin procesar.
Siempre que se haya agregado suficiente muestra de líquido para llenar la parte superior (712) de la cámara de dosificación, cuando está en su posición original, y preferiblemente permitir que el líquido se asiente sobre el sello anular (713) que separa la cámara de dosificación de la cámara de muestra (711), se logrará el volumen deseado de muestra procesada.
A medida que se inserta la segunda parte (71), la parte más estrecha de la pata del accionador sobresale inicialmente a través del sello anular (713) y entra en la cámara de dosificación (714). El diámetro de la pata del accionador es inicialmente más pequeño que el del sello anular (713), por lo que el líquido puede escapar alrededor de los bordes de la pata del accionador (79) hacia la cámara de muestra (711) de arriba a medida que el accionador (79) desplaza el líquido de la parte superior de la cámara de dosificación (712).
En las figuras 6a y 6b, la segunda parte (71) se ha empujado, a mano, dentro de la primera parte (72) de manera que el hombro (715) se acopla con un sello anular (713) colocado entre la cámara de muestra (711) y el cámara de dosificación (714). En esta posición, la ranura (no mostrada) en el hombro (715) proporciona comunicación fluida entre la cámara de dosificación (714) y la cámara de muestra (711). El extremo distal (718) del accionador acaba de acoplarse con el elemento dosificador (717). El volumen de la parte superior de la cámara de dosificación que rodea al accionador define el volumen de muestra sin procesar que pasará a través del gel de cromatografía de exclusión por tamaño (75). El gel de cromatografía de exclusión por tamaño (75) se suspende en una solución que comprende un tampón adecuado para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, típicamente acetato de magnesio. La concentración del tampón en la cámara de separación (76) será tal que esté presente en la concentración correcta en la muestra procesada.
En la posición mostrada en la figura 6b, el elemento dosificador (717) está por encima del extremo superior del canal de liberación de presión (719). Esto significa que el canal de liberación de presión (719) no proporciona comunicación fluida entre las partes superior (712) e inferior (720) de la cámara de dosificación (714). Por tanto, a medida que el accionador desciende más, avanza el elemento dosificador (717) y aumenta la presión del aire en la cámara inferior (720).
Las figuras 7a y 7b muestran el dispositivo con la segunda parte (81) empujada más hacia adentro de la primera parte (82). En esta posición, el hombro del accionador (84) ha descendido por debajo del sello anular (85) que ahora está acoplado con la pared exterior del accionador (86), sellando así la cámara de dosificación (87) de la cámara de muestra (88). El accionador (86) ha empujado el elemento dosificador (89) a una posición inferior de manera que el extremo superior del canal de liberación de presión (810) queda ahora expuesto por encima del elemento dosificador (89). El canal de liberación de presión (810) proporciona comunicación fluida entre la parte inferior (811) de la cámara de dosificación (87) y la parte superior (812) de la cámara de dosificación (87) y porque la presión es mayor en la parte inferior (811) de la cámara que la parte superior (812) de la cámara, el aire viaja a lo largo del canal de liberación de presión (810) desde la parte inferior (811) de la cámara a la parte superior (812) de la cámara formando una región de alta presión por encima del elemento dosificador en forma de copa (89) que contiene la muestra de líquido como resultado de una contracción en el volumen interno de la parte superior (812) provocada por la presencia del accionador (86) en la misma. A su vez, la muestra de líquido es forzada a través del orificio (814) en el extremo distal del accionador (86) y hacia la cámara de cromatografía de exclusión por tamaño/separación (815) para su tratamiento. Una parte de la muestra sin procesar permanece sellada en la cámara de muestra (88). Esto se puede eliminar con el dispositivo.
A medida que la segunda parte (81) del dispositivo se empuja más hacia la primera parte (82), el accionador (86) mueve el elemento dosificador (89) más hacia abajo dentro de la cámara de dosificación (87), forzando el aire de la parte inferior (811) a la parte superior (812) a lo largo del canal de liberación de presión (810) y, por lo tanto, haciendo avanzar la muestra a través del gel de cromatografía de exclusión por tamaño en la cámara de separación (815), a lo largo del canal de microfluidos (no mostrado) en la parte superior horizontal de la segunda parte (81) del dispositivo, y a lo largo de un canal en la pata de retorno (817) de la segunda parte (81), antes de salir de la segunda parte (81) y gotear en el depósito de recogida de muestras (818).
El gel de cromatografía de exclusión por tamaño elimina los agentes inhibidores de la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes de la muestra. Por tanto, la muestra tratada que se recoge en el depósito de recogida de muestras (818) está suficientemente libre de dichos agentes inhibidores/fluorescentes como para que una amplificación isotérmica de ácido nucleico pueda realizarse con éxito en el ácido nucleico presente en la muestra y a continuación detectarse. Además, debido a que el gel de cromatografía de exclusión por tamaño se suspende en una solución que comprende un tampón para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico. La muestra tratada recogida en el depósito de recogida de muestras (818) tiene el pH correcto para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico. Típicamente, el pH es de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Esto evita la necesidad de realizar más etapas de preparación de la muestra.
Las figuras 8a y 8b muestran la segunda parte completamente insertada (91) en la primera parte (92). Una indicación audible, típicamente un clic, indica al usuario que se ha logrado la inserción completa y, por lo tanto, que se tratará el volumen correcto de muestra. En uso, el usuario típicamente realizará un solo empuje con el dedo o el pulgar hasta que se escuche el clic. El elemento responsable del clic audible será típicamente un pestillo, que también bloquea la segunda parte (91) en la primera parte (92). Esto también significa que la muestra sin procesar se almacena de manera segura para su eliminación. Preferiblemente, se crea un sello estanco a los fluidos entre la parte superior de la segunda parte (91) y la cámara de muestra (94) para contener de ese modo el exceso de fluido de muestra sin procesar (93) y evitar el derrame de la muestra sin procesar cuando se desecha el dispositivo.
Cuando está completamente insertado, el aire de la parte inferior (95) de la cámara de dosificación (96) continúa fluyendo hacia la parte superior (97) de la cámara de dosificación (96) hasta que la presión en las dos cámaras es igual. Como se muestra en la figura 8b, la muestra procesada permanece en la cámara de dosificación (96). Además, un pequeño volumen de aire viaja a través de la segunda parte (91) del dispositivo y sale a través del orificio (98) al final de la pata de retorno (99). Esto expulsa el líquido presente en el canal y evita cualquier goteo. También permite que se disipe cualquier gas comprimido residual en el lado de la muestra del dispositivo. Además, evita que el fluido residual sea empujado a través de la columna después de que el dispositivo haya sido retirado del recipiente de recogida de muestras (910) para evitar que el exceso de fluido gotee potencialmente fuera de la pata de retorno (99) y contamine el área de trabajo.
Esto se logra asegurando que cuando el accionador está completamente insertado, el volumen de la cámara de dosificación desplazado por el accionador sea mayor que el volumen de muestra sin procesar que se mide para el tratamiento.
Por lo general, habrá una demora entre el clic audible y toda la muestra tratada que llega al depósito de recogida de muestras (910). Esto es causado por un efecto de amortiguación al comprimir el aire en la parte inferior (95) de la cámara de dosificación (96), y esa presión se libera a través del dispositivo. Este efecto de amortiguación, causado por la resistencia fluídica, es ventajoso porque ralentiza el caudal de la muestra que se está procesando y asegura que la muestra sea tratada adecuadamente por el gel de cromatografía de exclusión por tamaño. Si la muestra viajara a través del gel demasiado rápido, se produciría la eliminación insuficiente de los agentes inhibidores de la amplificación de ácido nucleico/fluorescentes y el dispositivo no lograría su función deseada. Lograr el nivel correcto de amortiguación es competencia del experto.
En la posición que se muestra en la figura 8b, el depósito de recogida de muestras (910) contendrá una muestra tratada lista para su uso en una amplificación isotérmica de ácido nucleico. La muestra tratada se tampona al pH requerido y está suficientemente libre de agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y agentes fluorescentes para que se realice y detecte la amplificación. Se usa un dispositivo de transferencia de líquido (no mostrado) para pipetear una parte de la muestra tratada desde el recipiente de recogida de muestras (910) a un dispositivo de prueba para realizar un ensayo de amplificación de ácido nucleico isotérmico.
Las figuras 9 a 12 muestran un dispositivo (10) según la invención in-situ en un dispositivo de procesamiento de muestras (101) para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico. En la figura 9, una primera parte (102) del dispositivo según la invención está ubicada en un recipiente de recogida de muestras (103) que, a su vez, es recibido en el dispositivo de procesamiento de muestras (101). Los dispositivos de procesamiento de muestras adecuados están disponibles en Alere Inc. bajo la marca Alere i.
En la figura 9, un recipiente de reacción (103) está in situ en el dispositivo de procesamiento de muestras. El dispositivo de procesamiento de muestras se puede utilizar con recipientes de reacción configurados para realizar amplificaciones isotérmicas de ácidos nucleicos NEAR y/o RPA. Por consiguiente, las cámaras de reacción pueden contener los reactivos necesarios para realizar NEAR y/o RPA sobre muestras introducidas en dichas cámaras. Los recipientes de reacción adecuados (105) están disponibles en Alere Inc.
En la figura 9 se ha retirado la película protectora despegable que cubre la cámara de muestra (104). En esta posición, la muestra sin procesar se introduce en la cámara de muestra usando una pasta, típicamente se introducirán 1,5 ml de muestra si procesar.
La figura 10 muestra un sistema de la invención (11) con la segunda parte (113) del dispositivo insertada parcialmente en la primera parte (112) del dispositivo (111). Mientras que la figura 11 muestra un sistema de la invención (12) con la segunda parte (123) del dispositivo (121) completamente hundida en la primera parte (122) del dispositivo (121). Una vez que la muestra se ha procesado y recogido en el depósito de recogida de muestras (124), el dispositivo (121) para preparar la muestra puede retirarse y desecharse. A continuación se usa un dispositivo de transferencia de líquido para transferir una parte de la muestra procesada al recipiente de reacción (125) para su análisis.
La figura 12 muestra un dispositivo de transferencia de líquido (100), un recipiente de reacción (200) y un depósito de recogida de muestras (300), junto con un dispositivo de procesamiento de muestras (400). En uso, la pantalla (440) proporciona instrucciones paso a paso al usuario y muestra los resultados de la prueba de amplificación de ácido nucleico isotermica. La invención contempla kits que comprenden un recipiente de reacción (200), un dispositivo de transferencia de líquido (100), una cámara de recogida de muestras (300) y un dispositivo de preparación de muestras, y sistemas que incluyen el kit y un dispositivo de procesamiento de muestras (400).
La figura 12 muestra el sistema con un dispositivo de detección ejemplar (400). El dispositivo de detección (400) incluye una primera estación (410) adaptada para sujetar de forma segura el recipiente de recogida de muestras (300) y una segunda estación (420) adaptada para sujetar de forma segura la cámara de reacción (200). Cuando está en uso, el dispositivo de transferencia (100) se mueve entre el recipiente de recogida de muestras (300) en la primera estación (410) y la cámara de reacción (200) en la segunda estación (420). El dispositivo de detección incluye una tapa (430) que puede cerrarse cuando el dispositivo de detección (400) está en funcionamiento o para almacenamiento. Una interfaz de usuario de pantalla táctil (440) está presente para introducir datos y mostrar información sobre el ensayo. La segunda estación (420) puede incluir un lector de código de barras o dispositivo similar para detectar automáticamente un código de barras o código similar presente en la cámara de reacción (200). Las estaciones primera (410) y segunda (420) pueden adaptarse para calentar o enfriar el contenido del recipiente de recogida de muestras (300) y la cámara de reacción (200). La segunda estación (420) también se puede adaptar para proporcionar monitorización óptica, de fluorescencia u otra y/o agitar el microtubo (220).
Las figuras 13a a 13e proporcionan una representación esquemática del dispositivo durante su uso.
La figura 13 a muestra el dispositivo antes de su uso con la segunda parte (142) insertada en la primera parte (141). El elemento dosificador en forma de copa (143) está en la parte superior de la cámara de dosificación (144) apoyado contra el sello anular (145) que separa la cámara de muestra (146) de la cámara de dosificación (144).
En la figura 13b, la muestra de líquido sin procesar (147) se ha introducido en la cámara de muestra (146) y el elemento dosificador en forma de copa (143) en la cámara de dosificación (144). Preferiblemente, el nivel del líquido está por encima del sello anular (145).
En la figura 13c, el accionador móvil (148) se ha bajado a través de la cámara de muestra (146) y dentro de la cámara de dosificación (144), de manera que un extremo distal del mismo se ha acoplado al elemento dosificador (143) y el hombro (1410) del accionador móvil (148) está a punto de acoplarse con el sello anular (145). El volumen de líquido en el elemento dosificador en forma de copa (143) cuando el sello anular (145) se acopla a la pared exterior (1411) del accionador (148) distal al hombro (1410) es el volumen predeterminado de líquido dosificado para el tratamiento (1412) como en la figura 13d.
En la figura 13d, el accionador móvil (148) ha movido el elemento dosificador (143) a lo largo de la cámara de dosificación (144), reduciendo el volumen de la parte inferior (1413) de la cámara de dosificación (144) y aumentando el volumen de la parte superior (1414). Las partes inferior y superior de la cámara de dosificación (144) están en comunicación fluida por medio de un canal de liberación de presión (1415) en la pared de la cámara de dosificación. A medida que el accionador móvil (148) avanza hacia la cámara de dosificación (144), el volumen interno de la cámara de dosificación (144) se reduce, aumentando así la presión del aire contenido en la misma. Este aumento en la presión de aire dentro de la cámara de dosificación (144) a su vez fuerza a la muestra de líquido dosificado (1412) fuera de la cámara de dosificación (144) a través de un canal de salida (no mostrado) ubicado en el accionador móvil (148). Cuando el accionador móvil (148) está completamente presionado, como se ilustra en la figura 13e, el volumen de aire en la cámara de dosificación (144) desplazado por el accionador móvil (148) es mayor que el volumen de la muestra dosificada de líquido de modo que sustancialmente todo el líquido sea expulsado de la cámara de dosificación (144) a través del canal de salida (no mostrado). La muestra sin procesar (1416) se almacena en la cámara de muestras (146) para su eliminación segura.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de cromatografía (20) operado manualmente para preparar una muestra líquida para la amplificación isotérmica de ácido nucleico, comprendiendo el dispositivo (20):
una cámara de muestra (146) para recibir un líquido,
una bomba que tiene una válvula dosificadora, y
un elemento de cromatografía,
caracterizado porque la bomba comprende una primera parte (20a, 141) y una segunda parte separada (20b, 142) recibible en la primera parte, donde la primera parte (141) y la segunda parte separada (142) se acoplan para formar la válvula dosificadora, y
donde la primera parte (141) comprende una cámara de dosificación (144) para recibir el líquido de la cámara de muestra (146), un elemento dosificador móvil (143) y un canal de liberación de presión,
donde la cámara de dosificación (144) tiene una parte superior (1414) y una parte inferior (1413) separadas por el elemento dosificador móvil (143),
donde la parte superior (1414) y la parte inferior (1413) de la cámara de dosificación están selectivamente en comunicación fluida a través del canal de liberación de presión,
donde el elemento dosificador (143) se puede mover desde una posición inicial a una posición posterior donde, en la posición inicial, la parte superior y la parte inferior de la cámara de dosificación no están en comunicación fluida,
donde, en la posición posterior, (i) el canal de liberación de presión proporciona comunicación fluida entre la parte inferior (1413) y la parte superior (1414) de la cámara de dosificación (144) y (ii) la presión en la parte inferior (1413) ) de la cámara de dosificación (144) aumenta de manera que el aire de la parte inferior de la cámara de dosificación (144) se mueve a través del canal de liberación de presión y desplaza un volumen predeterminado de líquido (1412) en la parte superior de la cámara de dosificación (144),
donde la segunda parte (20b) comprende un accionador (25, 148) dispuesto para mover operativamente el elemento dosificador móvil (22, 143) desde la posición inicial a la posición posterior cuando la segunda parte se recibe en la primera parte, y
donde la bomba es accionada por la segunda parte (20b, 142) del dispositivo acoplando operativamente la primera parte (20a, 141) del dispositivo (20) y donde en uso la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido (1412) desde la cámara de muestra (146) al elemento de cromatografía.
2. El dispositivo (20) según la reivindicación 1, donde el elemento de cromatografía es un elemento de cromatografía de exclusión por tamaño.
3. El dispositivo (20) según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la bomba comprende un canal de salida a través del cual el volumen predeterminado de líquido sale de la bomba.
4. El dispositivo (20) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el canal de salida se proporciona en la segunda parte, opcionalmente dentro del accionador (25).
5. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la cámara de dosificación tiene una única abertura para recibir (i) el líquido de la cámara de muestra y (ii) el accionador (25).
6. El dispositivo (20) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, en uso, la bomba mueve un volumen predeterminado de líquido desde la cámara de muestra a través del elemento cromatográfico, preferiblemente a un recipiente de recogida de muestras (210).
7. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dispositivo es de un solo uso.
8. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bomba es neumática.
9. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el volumen predeterminado de líquido es de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 10 ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml.
10. El dispositivo (20) según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde el dispositivo comprende un agente lítico (221) para tratar la muestra antes de que la muestra alcance el elemento de cromatografía de exclusión por tamaño, preferiblemente donde se localiza el agente lítico (221) en la cámara de dosificación (211).
11. El dispositivo según la reivindicación 10, donde el agente lítico se selecciona de entre el grupo que consiste en un tensioactivo o una base.
12. El dispositivo según la reivindicación 11, donde el agente lítico comprende una base, preferiblemente hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, preferiblemente al menos una pastilla de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio, o material dopado con hidróxido de potasio.
13. El dispositivo según la reivindicación 11, donde el agente lítico comprende un tensioactivo seleccionado de entre el grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, bromuro de cetiltrimetilamonio y combinaciones de los mismos.
14. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el elemento cromatográfico comprende una cámara de separación.
15. El dispositivo según la reivindicación 14, donde la cámara de separación tiene un volumen de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml; preferiblemente de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 10 ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,5 ml, preferiblemente de aproximadamente 1 ml.
16. El dispositivo según la reivindicación 14 o 15, donde la cámara de separación contiene un gel de cromatografía de exclusión por tamaño.
17. El dispositivo según la reivindicación 16, donde el gel de cromatografía de exclusión por tamaño comprende una solución acuosa que contiene un tampón para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, preferiblemente acetato de magnesio.
18. El dispositivo (20) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, en uso, el dispositivo mueve un volumen predeterminado de aire al elemento cromatográfico después del volumen predeterminado de líquido.
19. Un kit para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico en una muestra líquida que comprende: a. un dispositivo de cromatografía (20) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el elemento de cromatografía es capaz de eliminar agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes de una muestra líquida sin eliminar el ácido nucleico para la amplificación,
b. un depósito de muestra (300) para recibir la muestra preparada,
c. una cámara de reacción (200) que contiene reactivos para una amplificación isotérmica de ácido nucleico, d. un dispositivo de transferencia de líquido (100) para mover la muestra preparada desde el depósito de la muestra a la cámara de reacción, que comprende preferiblemente una carcasa que tiene una punta de pipeta y un conjunto de émbolo.
20. Un procedimiento para realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico que comprende:
a. suministrar una muestra líquida sin procesar para análisis;
b. procesar la muestra líquida sin procesar para eliminar los agentes inhibidores de la amplificación de ácidos nucleicos y/o agentes fluorescentes;
c. realizar una amplificación isotérmica de ácido nucleico en la muestra procesada; y
d. monitorizar el ácido nucleico amplificado;
donde la etapa de procesamiento se realiza con un dispositivo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
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